CN118021836A - 一种用于治疗癌症的含硒物质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗癌症的含硒物质，具体地，本发明提供了硒代氨基酸的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗癌症，本发明首次发现，硒代氨基酸可有效预防和/或治疗癌症。

Description

一种用于治疗癌症的含硒物质
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及一种用于治疗癌症的含硒物质。
背景技术
肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症，5年期生存率低于20％。它分为不同的组织学亚型，包括腺癌，鳞癌和大细胞癌(通常称为非小细胞肺癌) 和小细胞肺癌。NSCLC(LUAD)是非小细胞肺癌(NSCLC)中最常见的组织学亚型，约占肺恶性肿瘤的40％。LUAD最大的致病风险因素是吸烟，其他已报道风险因素主要有长期氡暴露、致癌物、空气污染等。近年来，非吸烟相关的 LUAD患病率呈逐年上升趋势。尽管近年来癌症治疗有所改善，但NSCLC患者的总体生存率仍然很低。免疫疗法和化疗是治疗癌症的两种最广泛使用的选择。虽然许多癌症类型最初对这些治疗有反应，但耐药性的发展是不可避免的。耐药性的快速发展主要是NSCLC的特征。因此寻找新的治疗药物亟待解决。
调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是一类具有显著免疫抑制作用的T 细胞，是以Foxp3、CD25、CD4为其细胞表型特征的T细胞亚群。已知Treg细胞可以通过与各种免疫细胞亚群进行细胞间接触和分泌抑制性细胞因子，从而对机体免疫反应起到负性调控作用，并抑制机体免疫反应且对自身抗原主动耐受。然而，在肿瘤中，Treg细胞通过此免疫抑制作用，使机体对肿瘤细胞产生抗原耐受，使得肿瘤细胞发生免疫逃逸，因此增强肿瘤细胞的增殖以及浸润能力，并获得逃脱机体免疫杀伤作用，因此Treg被视为是帮助肿瘤幸存并促进肿瘤生长的免疫细胞类型。近年来，如何降低Treg细胞的功能在肿瘤治疗中是重要方向。
因此，本领域迫切需要开发一种具有抑制Treg细胞的有效硒化合物，从而实现抗肿瘤免疫治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抑制Treg细胞的有效硒化合物，从而实现抗肿瘤免疫治疗效果。
本发明的另一目的在于提供一种有效改善肿瘤免疫抑制特征的有效含硒物质，对非小细胞肺癌起到有效免疫治疗的效果。
在本发明第一方面，提供了一种硒代氨基酸的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗癌症。
在另一优选例中，所述硒代氨基酸包括硒代蛋氨酸。
在另一优选例中，所述硒代氨基酸包括L-硒代氨基酸。
在另一优选例中，所述硒代蛋氨酸包括硒L-硒代蛋氨酸。
在另一优选例中，所述癌症包括肺癌。
在另一优选例中，所述肺癌选自下组：腺癌、鳞癌、大细胞癌(通常称为非小细胞肺癌)、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：
(a)抑制肿瘤的生长；
(b)改善抑制性的肿瘤抑制性免疫细胞状态；
(c)增加硒蛋白的水平；
(d)减少肿瘤中浸润的Treg细胞数量；
(e)增强肿瘤微环境的免疫响应。
在另一优选例中，所述硒蛋白包括SOD1、SOD2、GPX1、GPX2、GPX4、 Sephs2、Sepx1、SelS、SelP、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3。
在另一优选例中，所述肿瘤包括肺癌。
在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物含有(a)硒代氨基酸；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组合物还包括其他的预防和/或治疗癌症的药物。
在另一优选例中，所述其他的预防和/或治疗癌症的药物包括PD-1抗体。
在另一优选例中，所述组合物或制剂在预防和/或治疗癌症的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它预防和/或治疗癌症的药物联合使用。
本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括：
(a1)用于预防和/或治疗癌症的第一活性成分，所述第一活性成分包括：硒代氨基酸；
(a2)任选的，预防和/或治疗癌症的第二活性成分，所述第二活性成分包括：其他的用于预防和/或治疗癌症的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a1)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a2)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为1:100至 100：1，较佳地为1:10至10：1。
在另一优选例中，所述其他的预防和/或治疗癌症的药物包括PD-1抗体。
在另一优选例中，所述药物组合物中可以是单一化合物，也可以是多个化合物的混合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗或预防癌症的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。
在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。
在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。
在另一优选例中，所述的活性成分(a1)和活性成分(a2)的总含量为组合物总重的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
本发明第三方面提供了一种药盒，包括：
(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a1)硒代氨基酸，或含有活性成分(a)的药物；和
(ii)任选的第二容器，以及位于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗癌症的药物,或含有活性成分(a2)的药物。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含硒代氨基酸的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他的用于预防和/或治疗癌症的药物的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a1)和活性成分(a2)从而预防和/或治疗癌症的说明。
在另一优选例中，所述含有活性成分(a1)硒代氨基酸或含有(a2)其他的用于预防和/或治疗癌症的药物的制剂的剂型分别包括胶囊、片剂、栓剂、或静脉注射剂。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述药盒的用途，用于制备用于预防和/或治疗癌症的药物。
本发明第五方面提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括步骤：
给需要的对象，施用硒代氨基酸、本发明第二方面所述的药物组合物、或本发明第三方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述的施用包括口服。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述硒代氨基酸的施用频率为每周连续1-7天，较佳地，每周连续2-5天，更佳地，每周连续2-3天。
在另一优选例中，所述L-硒代氨基酸的施用时间为1-20周，较佳地，2-12 周，更佳地，4-8周。
本发明第六方面提供了一种筛选预防和/或治疗癌症的候选药物的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试物质的存在下，培养表达硒蛋白的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的硒蛋白的表达量E1和/或活性A1；
并且在不存在所述测试物质且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中硒蛋白的表达量E2和/或活性A2；
(b1)对E1和E2进行比较，如果E1显著高于E2，则表示所述测试物质是预防和/或治疗癌症的候选药物；和/或
(b2)对A1和A2进行比较，如果A1显著高于A2，则表示所述测试物质是预防和/或治疗癌症的候选药物。
在另一优选例中，所述硒蛋白包括SOD1、SOD2、GPX1、GPX2、GPX4、Sephs2、 Sepx1、SelS、SelP、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞包括肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞选自下组：LLC、HTB-182、CRL-5803、A549、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥ 4。
在另一优选例中，所述所述“显著高于”指A1/A2≥2，较佳地，≥3，更佳地，≥4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选药物施用于非人哺乳动物，从而测定其对非人哺乳动物的癌症的影响。
在另一优选例中，所述测试物质选自下组：小分子化合物、抗体、多肽、核酸、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示的是SeMet对小鼠LLC细胞皮下移植瘤有较好的治疗效果。图1A：实验模式图，首先对小鼠进行LLC细胞皮下移植瘤的注射(2*10^5细胞/只)，在成瘤14天后，对小鼠进行两周的SeMet治疗，腹腔注射SeMet，用量为2mg/kg，一周5次；图1B：小鼠肿瘤生长统计曲线；图1C：小鼠肿瘤照片代表性结果。
图2显示的是SeMet治疗后LLC移植瘤RNA-Seq的测序结果图。图2A-C：比对KEGG/Reactome/GO三大数据库分析发现，硒处理后信号转导方面和免疫系统方面发生显著变化。图2D：SeMet治疗后LLC移植瘤RNA-Seq测序获得的功能富集弦图，说明硒处理后免疫积极调控和细胞因子刺激发生显著变化。预示硒处理后肿瘤免疫微环境得到了积极的改变。
图3显示的是SeMet治疗后增加了LLC移植瘤中硒蛋白的表达，意味着硒补充的有效性。图3A-L：qPCR检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中硒蛋白 SOD1、SOD2、GPX1、GPX2、GPX4、Sephs2、Sepx1、SelS、SelP、Txnrd1、 Txnrd2、Txnrd3在mRNA水平的表达情况；图3M：WB检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中SOD1和GPX1蛋白表达情况；图3N：qPCR检测SeMet治疗后皮下肿瘤中不同硒蛋白基因的相对表达情况。
图4显示的是SeMet治疗后增加了LLC移植瘤中PD-L1的表达。图4A：qPCR 检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中PD-L1在mRNA水平的表达情况；图4B：WB检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中PD-L1蛋白的表达情况；图4C：免疫荧光检测对照组和SeMet治疗组皮下肿瘤中PD-L1的蛋白表达情况；图4D:图4C 的量化统计图。
图5显示的是SeMet和PD-1抗体对小鼠LLC细胞皮下移植瘤的治疗效果。图5A：实验模式图，首先对小鼠进行LLC细胞皮下移植瘤的注射(2*10^5细胞/只)，在成瘤14天后，对小鼠进行为期两周的腹腔注射SeMet和PD-1抗体单独或者联合治疗。SeMet用量为2mg/kg，一周5次；PD-1抗体用量为200μg/ 只，一周两次。图5B：小鼠肿瘤生长统计曲线；图5C:小鼠肿瘤和体重的比值。图5D：小鼠肿瘤照片代表性结果。
图6显示的是SeMet治疗后增加了LLC移植瘤中硒蛋白的表达。图6A-M： qPCR检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中硒蛋白GPX1、GPX2、SOD1、SOD2、 Sephs2、Sepx1、SelS、Txnrd1、Txnrd2、SelF、Selk、SelW、MT2在mRNA水平的表达情况。
图7显示的是SeMet治疗抑制了LLC移植瘤中Treg细胞的表达。图7A：qPCR 检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中CD4和Foxp3在mRNA水平的表达情况。图 7B：流式细胞术检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中CD45+免疫细胞的百分比。图7C：对图7B中CD45+免疫细胞百分比的量化统计结果图。图7D：流式细胞术检测对照组和SeMet治疗组移植瘤中CD25+FOXP3+细胞的百分比。图 7E：对图7D中百分比的量化统计结果图。图7F：流式细胞术检测对照组和SeMet 治疗组移植瘤中IL17a+细胞的百分比。图7G：对图7F中百分比的量化统计结果图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，硒代氨基酸(比如 L-硒代氨基酸，较佳地，L-硒代甲硫氨酸)可显著抑制肿瘤的生长，并可有效预防和/或治疗癌症。
具体地，本发明首次发现，在NSCLC皮下移植瘤模型中，L-SeMet的补充可以显著抑制肿瘤的生长，通过比对其与特异性PD-1抗体的治疗效果，结果说明在该模型中其作用与PD-1疗效类似。具体体现在，相比于对照组，L-SeMet 补充后，肿瘤体积、质量都显著减少，具体数据和PD-1组结果没有显著性差异，提示其作用效果类似。由此我们进一步进行RNA-seq检测，具体分析数据显示L-SeMet治疗后，比对KEGG/Reactome/GO三大数据库分析发现，进行 L-SeMet治疗后肿瘤免疫系统方面发生了显著变化。L-SeMet治疗改善肺癌的主要的免疫机制可能包括：对免疫抑制信号的正向调控作用以及关键免疫通路的调控，具体通过促TH17分化及对抑制性的Treg细胞发挥免疫调节作用。根据这些结果分析得到的功能富集弦图则说明硒处理后免疫积极调控和细胞因子刺激发生显著变化。预示硒处理后肿瘤免疫微环境得到了积极的改变。
此外，申请人进一步提取NSCLC组织其硒蛋白水平发现L-SeMet治疗后，主要的硒蛋白水平包括GPX1，GPX4等主要硒蛋白水平均有显著增加。申请人进一步提取相关的治疗组织，按照常规方法提取免疫细胞并进行流式分选，证实L-SeMet治疗后肿瘤中浸润的Treg细胞数量明显减少。肿瘤浸润的Treg群体往往通过抑制攻击肿瘤的免疫细胞的功能，从而在肿瘤免疫逃避中发挥关键作用。由此证实Treg细胞数量的减少促进了肿瘤免疫反应的加强，从而显著阻止皮下NSCLC的进展。因此L-SeMet可作为有效有机物通过显著改善抑制性的肿瘤抑制性免疫细胞状态，从而抑制NSCLC生长。在此基础上，本发明人完成了本发明。
肺癌
肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症，5年期生存率低于20％。它分为不同的组织学亚型，包括腺癌，鳞癌和大细胞癌(通常称为非小细胞肺癌) 和小细胞肺癌。NSCLC(LUAD)是非小细胞肺癌(NSCLC)中最常见的组织学亚型，约占肺恶性肿瘤的40％。LUAD最大的致病风险因素是吸烟，其他已报道风险因素主要有长期氡暴露、致癌物、空气污染等。近年来，非吸烟相关的 LUAD患病率呈逐年上升趋势。尽管近年来癌症治疗有所改善，但NSCLC患者的总体生存率仍然很低。免疫疗法和化疗是治疗癌症的两种最广泛使用的选择。虽然许多癌症类型最初对这些治疗有反应，但耐药性的发展是不可避免的。耐药性的快速发展主要是NSCLC的特征。因此寻找新的治疗药物亟待解决。
硒代氨基酸
硒是一种人体必需的重要微量元素。已知硒可以通过硒蛋白改善免疫功能、提高机体抗肿瘤氧化能力、阻断肿瘤血管生成等途径抑制肿瘤生长。硒的特殊代谢产物通过不同途径会改变肿瘤免疫微环境，从而抑制肿瘤的进一步发展。硒能够增强树突状细胞、T淋巴细胞、NK细胞等多种免疫细胞的功能，但补硒作为一种提高人群免疫力的方法，广泛使用硒作为补充剂来提高普通人群，而其对肿瘤患者的免疫治疗效力的具体机制多年来一直缺乏明确的证据。有研究者发现高硒的摄入可增强T细胞及B细胞的活化和功能，且对Th4细胞簇的增殖和分化具有积极作用，以增强病毒抗原疫苗的免疫效果。同时也有研究者探究发现，在人和啮齿动物模型中，硒蛋白的表达往往与HCC患者的生存成正相关，并且与M1巨噬细胞极化等免疫应答的途径相关。
在本发明中，硒代氨基酸指蛋氨酸分子中S被Se取代后的含硒氨基酸，主要包括L-硒代氨基酸。
在本发明中，L-硒代氨基酸包括L-硒代蛋氨酸。
本发明首次发现，L-硒代氨基酸可显著抑制肿瘤的生长，并可有效预防和 /或治疗癌症。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明的硒代氨基酸(比如L-硒代氨基酸)；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明硒代氨基酸(比如L-硒代氨基酸)的剂量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明的硒代氨基酸(比如L-硒代氨基酸)。此外，本发明的硒代氨基酸(比如L-硒代氨基酸)可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为静脉用药制剂或瘤内用药注射剂。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
例如，眼部滴眼液的配制可这样进行：将本发明的硒代氨基酸(比如L- 硒代氨基酸)与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明的硒代氨基酸 (比如L-硒代氨基酸)可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明的硒代氨基酸(比如L-硒代氨基酸)的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，硒代氨基酸(比如L-硒代氨基酸，较佳地L-硒代甲硫氨酸)可显著抑制肿瘤的生长，并可有效预防和/或治疗癌症。
(2)本发明首次发现，L-SeMet的补充可以显著抑制肿瘤的生长，通过比对其与特异性PD-1抗体的治疗效果，结果说明在该模型中其作用与PD-1疗效类似。具体体现在，相比于对照组，L-SeMet补充后，肿瘤体积、质量都显著减少，具体数据和PD-1组结果没有显著性差异，提示其作用效果类似。由此我们进一步进行RNA-seq检测，具体分析数据显示L-SeMet治疗后，比对 KEGG/Reactome/GO三大数据库分析发现，进行L-SeMet治疗后肿瘤免疫系统方面发生了显著变化。L-SeMet治疗改善肺癌的主要的免疫机制可能包括：对免疫抑制信号的正向调控作用以及关键免疫通路的调控，具体通过促TH17分化及对抑制性的Treg细胞发挥免疫调节作用。根据这些结果分析得到的功能富集弦图则说明硒处理后免疫积极调控和细胞因子刺激发生显著变化。预示硒处理后肿瘤免疫微环境得到了积极的改变。
(3)本发明首次发现，主要的硒蛋白水平包括GPX1，GPX4等主要硒蛋白水平均有显著增加。申请人进一步提取相关的治疗组织，按照常规方法提取免疫细胞并进行流式分选，证实L-SeMet治疗后肿瘤中浸润的Treg细胞数量明显减少。肿瘤浸润的Treg群体往往通过抑制攻击肿瘤的免疫细胞的功能，从而在肿瘤免疫逃避中发挥关键作用。由此证实Treg细胞数量的减少促进了肿瘤免疫反应的加强，从而显著阻止皮下NSCLC的进展。因此L-SeMet可作为有效有机物通过显著改善抑制性的肿瘤抑制性免疫细胞状态，从而抑制NSCLC生长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞系
NSCLC细胞系LLC购自于中国科学院细胞库。
1.1.2试剂和耗材
DMEM培养基和RPMI-1640培养基购自Thermo公司；胎牛血清 (FBS)购自BI；胰酶(Trypsin-EDTA)和双抗(Penicillin-streptomycin)均购自Gibco公司；山羊血清购自LifeTechnology公司。细胞培养所使用的各类离心管，冻存管、培养皿和移液管购自Corning公司。0.22μm、70μm 的过滤器购自Millipore公司；进口EP管和枪头购自Axygen公司。多聚甲醛、二甲基亚砜(DMSO)、聚凝胺(Polybrene)、嘌呤霉素(Puromycin)、胃酶抑素(Pepstatin)、PMSF、抑肽酶(Aprotinin)、钒酸盐(Vanadate)、亮抑酶肽(Leupeptin)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、等均购自Sigma公司。TRIzol RNA提取试剂购自于 Invitrogen公司。RT-qPCR试剂盒、PrimerSTAR Max DNA Polymerae试剂盒购自Takara公司。荧光素定量试剂SYRB Premix Ex TaqTM来自翊圣生物科技公司。蛋白定量试剂盒BCA assay kit购自Thermofisher公司。Western所用PVDF膜、ECL化学发光试剂盒购自Millipore公司。无水乙醇、异丙醇、甲醇、三氯甲烷、十二烷基硫酸钠SDS、甘油、三羟甲基氨基甲烷Tris、甘氨酸Glycine、巯基乙醇、牛血清白蛋白BSA、Tween-20、氯化钾、氯化钠、叠氮化钠、溴酚蓝等试剂均购自上海鼎国生物科技有限公司。30％聚丙烯酰胺、 10×PBS磷酸缓冲液均购自生工生物技术有限公司。所用引物均为上海捷瑞生物工程有限公司合成,肿瘤细胞分离试剂盒购买自Miltenyi Biotec，抗体 CD45、CD3、CD4、CD25、Foxp3、IL-17A购买自invitrogen公司。固定破膜剂购买自BD公司。
1.1.3主要实验仪器
相差显微镜，37℃CO2细胞培养箱(Thermo Fisher)，超净台工作台 (Heraus)，移液枪(Eppendorf)，移液器(Thermo Fisher)，电热恒温鼓风干燥箱(恒科)，恒温水浴锅(精宏)，金属浴(卫星)，水平摇床(其林贝尔)，涡旋振荡器(其林贝尔)，温控摇床(培英)，蛋白电泳仪(Bio-Rad)，高速台式低温离心机(Eppendorf)，低温冰箱，超低温冰箱，扫描仪(惠普)，化学成像发光仪(BioRad)，，正倒置一体荧光显微镜(ECHO)，Olympus 激光扫描共聚焦显微镜，全自动样品快速研磨仪(上海净信科技)，荧光定量PCR仪QuantStudio 6(ThermoFisher)，蛋白煮样器(卫星)、超微量核酸蛋白测定仪Nano Drop(Thermo FisherScientific)、分析型流式细胞仪 CytoFlex LX(Beckman Coulter)。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养及传代
小鼠肺癌细胞系LLC用DMEM(含10％FBS及1％青霉素及链霉素双抗)培养。细胞传代以10cm dish为例，1比3传代。细胞长至90％以上，弃去培养基，用适量PBS洗涤一次，加1ml胰酶消化若干分钟，待细胞完全变圆后，加2ml完全培养基终止消化，将细胞从皿上吹下来转移至15ml 离心管，900rpm，3min离心。离心后弃上清，加1ml培养基悬浮，取330μl 于新的10cm dish中，加10ml DMEM培养基混匀。培养全部在37℃，5％CO2培养箱中进行。
1.2.2蛋白抽提与免疫印迹
首先配制含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(于RIPA lysis中按比例加蛋白酶抑制剂，分别是1000×Aprotinin，1000×Leupeptin，1000×PepstainA，1000 ×Sodium orthovanadate，100×PMSF)细胞培养或处理后，小心弃去培养基，用冰PBS洗涤一次，加一定体积的蛋白裂解液，用细胞刮刮下来。若是组织蛋白的提取，则取20-30mg组织，加钢珠和1ml蛋白裂解液，60赫兹、2min 磨成蛋白匀浆。裂解液在冰上放置30min，13200rpm，4℃离心15min。将蛋白上清液转移至干净的EP管中。此时配制BCA试剂(A液：B液＝1： 50)，于96孔板中加2μL蛋白样，每个样3个复孔，及2mg/ml的标准品0，2，4，6，8，10μL。每孔加200μL BCA试剂，37℃孵育30min。酶标仪562nm检测OD值，计算蛋白浓度，用RIPAlysis稀释成统一浓度，加5×loading(含β-巯基乙醇)，100℃煮沸10min。-20℃保存。
配制一定浓度的SDS-PAGE蛋白胶，1×Running buffer，1×Transfer buffer(4℃预冷)。蛋白样室温融化混匀。将配好的SDS-PAGE蛋白胶固定在电泳装置上，加入1×Running buffer，每孔上样20-30μg蛋白，接通电源。80 V电压跑至分离胶后调至120V，一直跑到底。待溴酚蓝出来后，取下胶。将裁剪好的PVDF膜用甲醇激活。转膜夹浸泡在Transferbuffer中，打开转膜夹，黑色面在下，白色面向上。用工具切去蛋白胶的浓缩胶部分，小心在transfer buffer中移出蛋白胶，按照黑色面-滤纸-蛋白胶-PVDF膜-滤纸-白色面的顺序排放，合上转膜夹，一定要注意排出胶与PVDF膜之间的气泡。转膜夹放置在电泳槽中，加入适量的transfer buffer及冰盒，240mA电流恒流转膜120-150 min。转膜结束后，蛋白从胶上转移到PVDF膜中，取下PVDF膜，朝胶的那一面向上，为正面。根据所需的蛋白分子量裁剪条带，用5％脱脂牛奶封闭条带，室温孵育1-2h，封闭结束后用TBST洗涤数次，加入3％ BSA稀释后的抗体，4℃孵育过夜。次日回收一抗，用TBST洗涤3次，每次10min。加入5％牛奶稀释的二抗，室温孵育1-2h。TBST洗涤3次，每次10min。用ECL发光液显色。
1.2.3免疫荧光
取石蜡包埋的组织切片，65℃烘箱孵育30min-1h，经二甲苯孵育10min 两次，进行脱蜡，随后无水乙醇5min——95％乙醇5min——80％乙醇5min ——70％乙醇5min水化。ddH2O洗涤5min共两次。用含3％过氧化氢的甲醇溶液避光处理15min，灭活组织内过氧化物酶。PBS洗涤5min三次。用高压锅在0.01M，pH6.0的柠檬酸钠缓冲溶液中高压修复2min。随后缓慢降压降温，PBST洗涤5min，三次，用10％goat serum+0.01％Triton X-100的 PBS溶液室温封闭1h，封闭结束后根据抗体说明书用封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜。次日用PBST洗涤10min，三次。
1：200稀释荧光二抗，室温避光孵育1h。PBST洗涤10min，三次。随后用DAPI染色15min，PBST 5min洗涤3次。封片。
1.2.4 RNA抽提、逆转录和Real-time PCR
细胞经培养或处理后，弃培养基，用冰PBS洗涤一次，加1mL Trizol试剂，将细胞全部吹下来。若是组织，则向10-20mg组织中加钢珠及1ml Trizol，用研磨仪研磨成匀浆。向1ml Trizol的细胞或组织匀浆中加200μL氯仿，
剧烈混匀，冰上静置5min，12000rpm，4℃离心10min。小心吸取400μl离心后的上清，加入等量异丙醇，剧烈混匀，冰上静置15min，12000rpm，4℃离心10min。离心结束后能看到底部有白色RNA沉淀，小心弃上清，加1ml 75％ DEPC水稀释的乙醇，轻弹，将白色沉淀弹起，8000rpm，4℃离心5min，重复一次。最后一次将上清全部吸走，室温晾至半透明状，加一定体积的DEPC 水溶解。测浓度。RNA反转分去基因组和反转录两部分，去基因组反应体系如下：
42℃2min。4℃hold。
反转反应体系如下：
37℃，30min。85℃5s。4℃hold。
反转好的cDNA用灭菌蒸馏水稀释25倍，混匀，-20℃保存，即为Real Time反应的模板。
Real Time反应体系如下：
根据需要检测的基因引物，配制不含cDNA模板的上述Mix，混匀，冰上待用。根据情况分配好384孔板，先加不同样本的cDNA模板，然后加入混好的引物及SYRB Green Mix，加样过程注意不要污染。用离心机2000rpm，室温离心2min，使整块384板残留在孔壁上的液体全部甩下来，不要残留在
壁上，随后设置程序和加样情况，用QuantStudioTM 6 Flex System检测。检测程序如下：
检测结束后用2-▲▲T计算基因的相对表达量。
1.2.5流式细胞术
小鼠肿瘤细胞单细胞悬液的制备：取200mg小鼠肿瘤组织，剪碎后加入 2.43ml肿瘤消化液中，于37℃震荡水浴锅中消化30min。流式细胞染色分为表面抗原染色和胞内因子(细胞因子和转录因子)染色。若检测细胞因子，首先用RPMI-1640培养基配制广泛性激活阻断剂(PMA、离子霉素、BFA，1：1000 加)，每样加100ul重悬细胞并转移至96孔板中，于37℃细胞培养箱处理细胞 4-6h。之后加入200ul FACS buffer吹打混匀并转移至1.5ml EP管，350g离心5min，小心吸去上清，用100ul PBS重悬细胞。若进行表面抗原染色则忽略以上步骤。将细胞悬液置于冰上，加入死活染料(1：1000加)，冰上避光染色30min。加 1ml PBS洗涤，350g离心5min，小心吸去上清。细胞沉淀用FACS buffer重悬，按1：200的比例加入封闭抗体CD16/CD32，冰上避光30min。之后按1：200的比例加入表面抗体：Treg细胞表面染色依次加入CD45、CD3、CD4、CD25； Th17细胞染色依次加入CD45、CD3、CD4,冰上避光孵育30min。加入1ml FACS buffer洗涤，350g离心5min，小心吸去上清,胞内因子染色则加入固定破膜液 250ul，冰上避光2h。之后加入1ml固定破膜洗液，500g离心5min，小心吸去上清。用固定破膜洗液重悬细胞，按1：200的比例加入胞内抗体Foxp3、IL17A, 冰上避光孵育30min。加入1ml FACS buffer洗涤，500g离心5min，小心吸去上清。用200ul FACS buffer重悬细胞等待上机分析。
1.2.6小鼠皮下移植瘤模型
所有的动物实验均得到中科院上海生命科学研究院营养科学研究所动物伦理委员会的批准，按照上海生命科学研究院动物保护与使用委员会批准的方案进行。6周大小的C57BL/6J购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于SPF 级动物房中。对于皮下成瘤实验，将细胞消化离心收集后重悬于PBS中，然后向每只小鼠腹腔注射2×105个NSCLC细胞；每两天测量肿瘤的大小并计算肿瘤的体积(mm3)按照以下计算公式计算：1/2×a×b2,a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径。小鼠处死后，取出肿瘤然后称重，计算每组肿瘤的平均重量，取出的肿瘤用多聚甲醛固定，用于后续的免疫组化或者免疫荧光分析。
1.2.7RNA-seq分析
如前所述提取小鼠肿瘤组织RNA。由上海美吉生物医药科技有限公司提供样本质检服务和测序服务。样本经过片段化→反转录→连接adaptor后在Illumina NovaSeq6000平台进行测序。下机后使用fastp软件 (https://github.com/OpenGene/fastp)对原始数据进行过滤获得高质量的测序数据 (clean reads)。通过HISAT2将Clean reads映射到小鼠基因组(GRCm38.p5)。使用DESeq2软件进行组间基因的表达差异分析。使用R包进行GO和KEGG通路分析，使用显著差异表达基因(P＜0.05)作为靶基因。使用Goatools (https://github.com/tanghaibao/GOatools)软件进行GO富集分析。使用KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)进行KEGG通路富集分析。数据挖掘和图形呈现过程，包括KEGG、GSEA、热图、聚类等，均在美吉生物云平台 (https://cloud.majorbio.com)进行。
1.2.8数据统计
所有实验至少重复三次，体内实验至少重复两次。用unpaired two-tailedStudent’s t-test检测各细胞或不同小鼠组别间的显著性。根据检验结果0.01< P-value<0.05，为“*”,0.001<P-value<0.05，为“**”,P-value<0.001，为“***”。对Western Blot的量化统计使用Image J进行；免疫荧光用 Image J或Photoshop CS6统计。作图软件为Graphpad Prism 8.0。
实验结果
对C57BL/6J小鼠进行LLC细胞皮下移植瘤的注射(2*10^5细胞/只)，在成瘤14天后，对小鼠进行两周的SeMet治疗(图1A)，并统计小鼠肿瘤生长曲线，发现SeMet治疗可以有效抑制皮下LLC肿瘤生长(图1B-C)。
根据活体实验取得的新鲜肿瘤样本进行RNA-Seq深度测序，比对 KEGG/Reactome/GO三大数据库分析发现，硒处理后信号转导方面和免疫系统方面发生显著变化(图2A-D)，说明硒处理后免疫积极调控和细胞因子刺激发生显著变化，预示硒处理后肿瘤免疫微环境得到了积极的改变。
我们对肿瘤组织中硒蛋白表达相关的多种基因进行检测，发现相比于对照组，SeMet治疗组移植瘤中硒蛋白SOD1、SOD2、GPX1、GPX2、GPX4、Sephs2、 Sepx1、SelS、SelP、Txnrd1、Txnrd2、Txnrd3在mRNA水平显著增加(图3A-L)， SOD1和GPX1在蛋白水平表达也显著增加(图3M-N)，意味着硒补充的有效性。
经检测发现，SeMet治疗后增加了LLC移植瘤中PD-L1的表达(图4A-D)。
接下来我们探究了SeMet和PD-1抗体对小鼠LLC细胞皮下移植瘤的单独以及联合治疗效果。首先对小鼠进行LLC细胞皮下移植瘤的注射(2*10^5细胞/ 只)，在成瘤14天后，对小鼠进行为期两周的腹腔注射SeMet和PD-1抗体单独或者联合治疗，SeMet用量和次数与前述相同；PD-1抗体用量为200μg/只，一周两次(图5A)。统计小鼠肿瘤生长情况发现，与对照组相比，SeMet和PD-1 抗体治疗的小鼠肿瘤生长显著降低，但是SeMet和PD-1抗体联合治疗却没有显示出更好的效果(图5B)，对小鼠肿瘤和体重的比值的统计也验证了这一结果，取小鼠皮下肿瘤可见SeMet治疗的小鼠肿瘤显著减小(图5C-D)。
提取小鼠肿瘤的RNA在mRNA水平进行基因表达水平的探究，发现与对照组相比，SeMet治疗后的确增加了LLC移植瘤中硒蛋白GPX1、GPX2、SOD1、SOD2、 Sephs2、Sepx1、SelS、Txnrd1、Txnrd2、SelF、Selk、SelW、MT2在mRNA水平的表达(图6A-M)，SeMet治疗显著增加了小鼠皮下移植瘤中硒含量。
之前对小鼠皮下肿瘤进行RNA-seq分析显示SeMet治疗后免疫相关通路发生显著变化(图2A-D)。CD4+ T细胞对肿瘤中的免疫稳态发挥着非常重要的调节作用。肿瘤微环境中存在大量的调节性T细胞(Treg)，以帮助肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。因此，如何促进CD4+ T细胞的抗肿瘤免疫反应成为我们关注的热点。接下来探究了SeMet和PD-1抗体治疗对小鼠肿瘤中CD4+ T细胞相关亚群的调节。首先我们通过qPCR在mRNA水平上发现，与对照组相比，SeMet 治疗后增降低了LLC移植瘤中CD4和Foxp3的表达水平(图7A)，将小鼠肿瘤消化成单细胞，通过流式细胞术分析发现，SeMet和PD-1抗体治疗后显著增加了CD45+的免疫细胞数量(图7B-C)。进一步分析CD25+Foxp3+的Treg细胞发现，只有SeMet治疗后显著降低了Treg细胞的比例，PD-1抗体治疗对Treg的数量没有显著影响，而SeMet和PD-1抗体联合治疗较小程度地降低了Treg的比例 (图7D-E)。表明SeMet治疗能够降低LLC细胞皮下移植瘤中免疫抑制性Treg 细胞的数量，提升抗肿瘤的效果。CD4+ T细胞的另一分化亚型TH17细胞可以通过分泌相关细胞因子，通过抗肿瘤血管生成及募集激活CD8+ T细胞来抑制肿瘤生长增殖，因此，我们也对TH17细胞的效应功能进行了检验，结果发现SeMet 治疗后显著增加了分泌IL-17a的TH17细胞，PD-1抗体以及SeMet和PD-1抗体联合治疗对TH17的比例没有显著影响(图7F-G)。以上结果表明，SeMet治疗增加了CD4+ T细胞的抗肿瘤功能，对肿瘤免疫发挥着积极的调控作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种硒代氨基酸的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗癌症。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述硒代氨基酸包括L-硒代氨基酸。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述硒代氨基酸包括硒代蛋氨酸。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述硒代蛋氨酸包括L-硒代蛋氨酸。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症包括肺癌。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a1)用于预防和/或治疗癌症的第一活性成分，所述第一活性成分包括：硒代氨基酸；
(a2)任选的，预防和/或治疗癌症的第二活性成分，所述第二活性成分包括：其他的用于预防和/或治疗癌症的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述其他的预防和/或治疗癌症的药物包括PD-1抗体。
8.一种药盒，其特征在于，包括：
(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a1)硒代氨基酸，或含有活性成分(a)的药物；和
(ii)任选的第二容器，以及位于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗癌症的药物,或含有活性成分(a2)的药物。
9.一种权利要求6所述的药物组合物或权利要求8所述药盒的用途，其特征在于，用于制备用于预防和/或治疗癌症的药物。
10.一种筛选预防和/或治疗癌症的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试物质的存在下，培养表达硒蛋白的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的硒蛋白的表达量E1和/或活性A1；
并且在不存在所述测试物质且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中硒蛋白的表达量E2和/或活性A2；
(b1)对E1和E2进行比较，如果E1显著高于E2，则表示所述测试物质是预防和/或治疗癌症的候选药物；和/或
(b2)对A1和A2进行比较，如果A1显著高于A2，则表示所述测试物质是预防和/或治疗癌症的候选药物。
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