CN118019550A - 预防、缓解或治疗黏膜黏连的药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供了一种预防、缓解或治疗黏连的药物及其应用。在体腔受外界刺激后的成纤维细胞存在激活负调控受体Pear1，成纤维细胞Pear1缺失能够明显促进体内黏膜黏连形成，Pear1激动剂可以特异地抑制成纤维细胞激活，合成细胞外基质，改善黏连病变。通过给予Pear1激动剂，可以有效地防止黏连的形成。同时，提供了Pear1激动型抗体，其不影响正常组织修复愈合，不会对组织造成缺氧状态，且抗体药物半衰期长，易扩散，副作用小，给药途径方便。

Description

预防、缓解或治疗黏膜黏连的药物及其应用
本申请要求于2021年7月22日提交的中国申请号为202110833123.3的申请的优先权。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种缓解或治疗黏连的相关靶点及其调控分子，具体涉及Pear1作为靶点在缓解或治疗黏连中的应用，进一步还涉及靶向Pear1的调控分子(如抗体)及其应用。
背景技术
人体和动物体的黏膜属于机体的重要部分，其主要覆盖于机体的消化系统、泌尿系统、呼吸系统、口腔、关节、皮肤内层等，分布较为广泛。黏膜构成机体免疫系统的一道屏障，可抵抗有害物质或致病微生物的侵袭，也会出现相应的损伤，形成黏膜病变。黏膜内有血管和神经，能分泌黏液。
多种因素UI导致黏膜黏连，例如机械损伤、感染等。例如，外科手术虽然可以达到手术治疗的效果，但外科干预对患者的组织例如腹膜等产生不同程度的损伤，形成纤维性黏附，包括粘附性囊膜炎、腹腔黏连、骨盆黏连、心包黏连、硬膜外黏连、牙周黏连、关节腔黏连，这严重威胁到患者的身体功能恢复及预后效果，如腹腔黏连引起的肠黏连、肠梗阻等并发症会引起腹痛，并可导致危及生命的肠坏死和女性不孕；此外，黏连还是二次手术组织分离困难并导致手术出血量增加的主要原因。黏连原为手术后人体自然愈合过程，但过度的愈合则会导致过度黏连形成，影响脏器或组织的正常活动功能，并为二次手术造成大出血的隐患。
手术黏连从一个组织内延伸到另一组织，通常在两个受伤的表面发生细胞外基质蛋白沉积在受损组织上而发生组织黏连。手术黏连形成的机制复杂，是组织损伤后修复的结果，与手术所造成的锐性、机械性或热损伤、感染、热辐射、局部缺血、脱水及异物反应等多种因素有关，在组织创伤基础上继发一系列反应，导致大量组胺、激肽等血管活性物质释放，局部血管通透性增加，局部组织在缺氧基础上发生氧化应激损伤，局部大量游离的氧、氮自由基进一步诱发局部炎症反应，加重组织损伤。随后，细胞外基质蛋白在局部沉积，内含大量渗出的白细胞、巨噬细胞，此后通过基质蛋白沉积和成纤维细胞增殖激活完成组织的愈合过程，细胞外纤维蛋白沉积占据优势，会形成早期黏连。随后，成纤维母细胞与血管侵入，局部血管化，形成永久性黏连。
虽然本领域也有一些防黏连的药品，例如防黏连膜、防黏连胶可以用于在手术结束前植入伤口，防止术后黏连，然而目前的防黏连膜等药物均为生理性隔离，有时会导致局部组织缺氧，影响伤口愈合。因此，本领域迫切需要开发新的防黏连药物，不影响组织愈合并防止组织器官黏连。
发明内容
本发明的目的在于提供缓解或治疗黏膜黏连的药物及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种Pear1(血小板内皮聚集受体1，Platelet Endothelial Aggregation Receptor1)基因、其编码的蛋白或其激动剂在制备预防、缓解或治疗黏连疾病的药物组合物中的应用。
在一个实施方式中，所述黏连疾病包括：黏膜黏连疾病，浆膜黏连疾病；较佳地，所述黏连疾病包括(但不限于)：损伤、出血、感染、异物刺激、肿瘤浸润或炎性细胞浸润后形成的黏连疾病；较佳地，所述损伤形成的黏连包括术后黏连、放疗或化疗后黏连，所述感染形成的黏连包括炎症黏连；较佳地，所述黏连疾病包括(但不限于)：消化系统、泌尿系统、呼吸系统、生殖系统、口腔、关节、皮肤内层的黏连疾病，更佳地包括：腹腔、盆腔、胸腔、子宫、关节腔、心包、硬膜外或牙周部位的黏连疾病。
在另一实施方式中，所述的黏连疾病为腹腔黏连、盆腔黏连、胸腔黏连或关节腔黏连。
在另一实施方式中，所述的Pear1基因、其编码的蛋白的激动剂包括增强Pear1的表达、活性、稳定性和/或有效作用时间的试剂；较佳地，包括(但不限于)：特异性激活Pear1活性的抗体、其抗原结合片段或变体，重组表达Pear1的表达构建物(包括表达载体)，Pear1的化学激动剂，促进Pear1基因启动子驱动能力的表达上调剂；更佳地，所述Pear1的化学激动剂包括：FcεR1α、硫酸葡聚糖、岩藻聚糖或其组合。
在另一实施方式中，所述Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂还用于：抑制黏膜成纤维细胞的激活；降低组织羟脯氨酸含量；降低病灶处黏膜厚度；降低病灶处成纤维细胞(如肌成纤维细胞)增殖或活化；降低病灶处胶原的合成；或降低黏连相关指标，较佳地所述指标包括：纤维蛋白原(FIB)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、t-PA/PAI、MMPs/TIMPs、转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和/或白介素(IL-6、IL-17)。
在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗黏连疾病的方法，包括将Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂给予需要预防、缓解或治疗的对象。
在本发明的另一方面，提供一种用于预防、缓解或治疗黏连疾病的药物组合物或药盒，其中包括有效量的Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂，以及药学上可接受的载体。
在另一实施方式中，所述药物组合物的剂型根据物质形态包括选自：液体剂如汤剂、注射剂、混悬剂，固体剂如冻干剂、散剂、颗粒剂、丸剂，半固体剂如膏剂、糊剂，气体剂如气雾剂、干粉吸入剂、气溶胶吸入剂。
在另一实施方式中，所述药物组合物的剂型根据给药途径，包括选自：注射剂(如腔内(非静脉)、静脉、肌内、皮下、皮内及穴位注射剂)，皮肤给药制剂(如洗剂，涂膜剂，软膏剂、透皮贴膏等)，黏膜给药制剂(如口腔膜剂，舌下片剂、含漱剂)，经胃肠道制剂(如汤剂、合剂、颗粒剂、丸剂、片剂等)，经呼吸道吸入制剂(如气雾剂、干粉吸入剂、气溶胶吸入剂)，经直肠制剂(如栓剂、灌肠剂)，或其组合。
在另一实施方式中，所述药物组合物或药盒中，组分或组合物的施用包括：局部涂布、局部注射、透皮吸收、皮下注射、吸入给药、肺部雾化。
在另一实施方式中，所述药物组合物还包括FcεR1α、硫酸葡聚糖、岩藻聚糖、适配体和小分子化合物中的一种或多种作为Pear1激动剂；更优选包括FcεR1α、硫酸葡聚糖和岩藻聚糖。
在另一实施方式中，所述激动剂是特异性激活Pear1活性的抗体、其抗原结合片段或变体；较佳地，所述抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：26、27和28所示，或如SEQ ID NO：26、27和29所示，或如SEQ ID NO：26、30和28所示，或如SEQ ID NO：31、27和32所示，或如SEQ ID NO：33、34和35所示；和/或所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：45、GAT和SEQ ID NO：46所示，或如SEQ ID NO：47、SAS和SEQ ID NO：28所示，或如SEQ ID NO：49、DTS和SEQ ID NO：50所示，或如SEQ ID NO：51、GAT和SEQ ID NO：52所示。
在另一实施方式中，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示，或所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：16、17、18、19、20、22、23、24或25所示。
在另一实施方式中，所述抗体包括重链可变区和/或轻链可变区；所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示；所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示，或，所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：47、GTS、SEQ ID NO：48所示，或，所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：49、DTS、SEQ ID NO：50所示，或，所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：51、GAT、SEQ ID NO：52所示，或，所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：53、LVS、SEQ ID NO：54所示。
在另一实施方式中，所述变体为在所述抗体的CDR、FR或全长序列经一至几个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个以内氨基酸残基的增加、缺失或替换后的序列。
在另一实施方式中，所述的变体具有或基本上具有靶向激活Pear1的活性。
在另一实施方式中，所述变体的HCDR1为在如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的第三位上由S突变为A或T，第六位上由G突变为D，和/或，第八位上由P突变为T或Y；和/或，所述变体的HCDR2为在如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的第三位上由P突变为S或G，第四位上由Y突变为N，和/或，第八位上由T突变为A；和/或，所述变体的HCDR3为在如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的第九位上由A突变为D，和/或，第十位上由Y突变为F。
在另一实施方式中，所述抗体或其变体的HCDR1包括任一选自SEQ ID NO：26、31、33、36和SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列；HCDR2包括任一选自SEQ ID NO：27、30、34、37、和SEQ ID NO：40-44所示的氨基酸序列；和，HCDR3包括任一选自SEQ ID NO：28、29、32、35和SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；和/或，所述抗体或其变体的LCDR1包括任一选自SEQ ID NO：45、47、49、51和SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列； LCDR2包括任一选自GAT、SAS、DTS、和LVS所示的氨基酸序列；和，LCDR3包括任一选自SEQ ID NO：46、48、50、52或SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列。
在另一实施方式中，所述抗体或其变体的HFR(重链可变区框架区)1包括任一选自SEQ ID NO：55、56和SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列；HFR2包括任一选自SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65和SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列；和，HFR3包括任一选自SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73、74、75和SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列；和HFR4包括任一选自SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列；和/或，
在另一实施方式中，所述抗体或其变体的LFR(轻链可变区框架区)1包括任一选自SEQ ID NO：79、80、81、82、83和SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列；LFR2包括任一选自SEQ ID NO：85、86、87、88、89和SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列；和，LFR3包括任一选自SEQ ID NO：91、92、93、94、95、96、97和SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列；和LFR4包括任一选自SEQ ID NO：99、100、101、102和SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列。
在另一实施方式中，所述的抗体或其变体包括氨基酸序列分别为：
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：47、GTS、SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、DTS、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、GAT、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、SAS、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、LVS、SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：51、GAT、SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：53、LVS、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、SAS、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， 如SEQ ID NO：47、GAT、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、DTS、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：53、LVS、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：3Q、SEQ ID NO：35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：47、GAT、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、DTS、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：53、LVS、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、SAS、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：47、GAT、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、DTS、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：32所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、SAS、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：47、GAT、SEQ ID NO：50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、DTS、SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：49、GAT、SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3， 如SEQ ID NO：45、GAT、SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在另一实施方式中，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：1所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：2所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：3所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：2所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：4所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：5所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：6所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：7所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：7所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：7所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：7所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：8所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：8所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：8所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：8所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：9所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：9所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：9所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：9所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：10所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：10所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：10所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：10所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：11所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：12所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：13所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：14所示；或，所述轻链可变区、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：15所示。
在另一实施方式中，所述变体为与所述抗体的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在另一实施方式中，所述抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv例如scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、或单域抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一实施方式中，所述抗体或其变体为全长抗体，所述全长抗体的重链恒定区选 自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4的重链恒定区或其衍生序列。
在另一实施方式中，所述抗体的轻链恒定区选自κ链或者λ链或其衍生序列。
在另一实施方式中，所述重链恒定区的衍生序列包括将所述hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4的重链恒定区经一至几个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个以内氨基酸残基的增加、缺失或替换后的序列。
在另一实施方式中，所述重链恒定区的衍生序列与hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4的重链恒定区具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在另一实施方式中，所述全长抗体的重链恒定区为hIgG3或hIgG4的重链恒定区或其衍生序列。
在另一实施方式中，所述衍生序列为hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4的重链恒定区经1-2个氨基酸替换后的氨基酸序列。
在另一实施方式中，所述衍生序列为hIgG4S228P突变。
在另一实施方式中，所述轻链恒定区为人κ链。
在另一实施方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；例如，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。
在本发明的另一方面，提供Pear1基因或其编码的蛋白的应用，用于筛选预防、缓解或治疗黏连疾病的药物或化合物(即作为筛药靶点)。
在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗黏连疾病的药物或化合物(或潜在的药物或化合物)的方法，包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达Pear1或含有Pear1；和(2)检测所述体系中Pear1的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高Pear1的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中Pear1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上，较佳地提高50％以上；更佳地提高80％以上)Pear1的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一实施方式中，所述的体系为细胞或细胞培养物体系。较佳地，该细胞表达或过表达Pear1；或该细胞由Pear1处理，其中所述Pear1的浓度为0.001nM-1M。
在另一实施方式中，所述细胞包括：黏膜成纤维细胞。
在另一实施方式中，基于黏膜成纤维细胞的筛选时，通过检测成纤维细胞合成细胞外基质的能力来进行进一步判断/辅助判断，若与对照组相比，测试组细胞合成细胞外基质的能力被弱化，则相应的候选物质为潜在所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，所述的体系为动物体系。
在另一实施方式中，所述的动物体系为Pear1人源化转基因动物。
在另一实施方式中，所述动物包括小鼠、大鼠、猫、犬、猴、骆驼、羊驼或其组合。
在另一实施方式中，基于动物进行筛选时，通过BhatiaDS评分或Zuhlke评分来 进行进一步判断/辅助判断，若与对照组相比，测试组BhatiaDS评分或Zuhlke评分显著降低，则相应的候选物质为潜在所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，基于动物进行筛选时，通过组织羟脯氨酸测定来进行进一步判断/辅助判断，若与对照组相比，测试组组织羟脯氨酸含量显著降低，则相应的候选物质为潜在所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，基于动物进行筛选时，通过与黏连相关的指标(如：纤维蛋白原(FIB)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、t-PA/PAI、MMPs/TIMPs、转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL-6、IL-17))测定来进行进一步判断/辅助判断，若与对照组相比，测试组与黏连相关的指标显著降低，则相应的候选物质为潜在所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，基于动物进行筛选时，通过测定皮下黏膜及皮肤厚度，成纤维细胞的增殖、过度活化和胶原的合成来进行进一步判断/辅助判断，若与对照组相比，测试组皮下黏膜及皮肤厚度，成纤维细胞的增殖、过度活化和胶原的合成显著降低，则相应的候选物质为潜在所需的(感兴趣的)药物或化合物。
在另一实施方式中，所述的活性为激活Pear1的活性。
在另一实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对Pear1、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，过表达/缺失表达/下调表达的分子如构建体，活性促进或抑制分子，化学小分子，相互作用分子等。
在另一实施方式中，所述方法还包括：对获得的药物或化合物(潜在药物或化合物)进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗黏连疾病有用的组合物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、Pear1缺失的小鼠比对照小鼠皮下黏膜黏连是形成更严重。A、伤口处HE染色，可见Pear1缺失的小鼠伤口成纤维细胞大量增殖，体积较大的活化型的肌成纤维细胞增多。Image J软件统计表皮和真皮厚度。B、伤口处Masson染色，统计胶原面积。
图2、抗Pear1单抗抑制黏膜成纤维细胞激活。A、细胞培养上清羟脯氨酸含量检测。B、QPCR检测成纤维细胞细胞外基质蛋白胶原1a2、平滑肌肌动蛋白α2(ACTA2)的表达水平。
图3、抗人Pear1单抗可抑制黏连的形成。A、伤口处HE染色；B、伤口处Masson染色，可见与对照组相比抗Pear1单抗LF2、hLF105治疗的小鼠伤口皮下黏膜胶原沉积少。C、对HE染色进行统计，可见与对照组相比抗Pear1单抗LF2、hLF105治疗的小鼠伤口成纤维细胞少，真皮厚度小。
具体实施方式
本发明人首次意外地发现，在体腔受外界刺激后的成纤维细胞都存在一个激活负调 控受体Pear1，成纤维细胞Pear1缺失能够明显促进体内黏膜黏连形成，Pear1激动剂(如特异性激活Pear1活性的抗体，激动型抗体)可以特异地抑制成纤维细胞激活，合成细胞外基质，改善黏连病变。通过给予Pear1激动剂，可以有效地防止黏连的形成。此外，本发明提供了一种Pear1激动型抗体，其不影响正常组织修复愈合，不会对组织造成缺氧状态，且抗体药物半衰期长，易扩散，副作用小，给药途径方便。
本发明人的在先已申请专利，利用Pear1作为纤维化性疾病的靶点，构建了增强Pear1活性的抗体，抑制了成纤维细胞过度激活通路，从而达到治疗纤维化性疾病的目的。这些申请包括：申请日为2020/1/23的中国专利申请202010076729.2，申请日为2020/11/3的中国专利申请202011212639.8。本发明中引用上述中国专利申请的全文。本发明中进一步提出以Pear1作为调控靶点的、与缓解或治疗黏膜黏连相关的新的治疗方案。
术语
如本文所用，术语“黏膜”与“粘膜”可互换使用，是生物体(口腔、器官、胃、肠、尿道等器官里面)中由上皮组织和结缔组织构成的一种膜状结构。本发明中，还可以指的是空腔脏器或关节腔面向腔体的上皮及结缔组织。
如本文所用，术语“黏连”与“粘连”可互换使用。
如本文所用，所述的“增强”、“促进”与“提高”、“增加”等可互换使用；较佳地它们是有统计学意义的“增加”、“促进”、“提高”或“增强”，例如增加2％或更高，5％或更高，10％或更高，15％或更高，20％或更高，30％或更高，50％或更高，80％或更高，100％或更高，200％或更高，500％或更高。
如本文所用，所述的“降低”、“减少”、“弱化”等可互换使用；较佳地它们是有统计学意义的“抑制”、“降低”与“减少”或“弱化”，例如降低2％或更低，5％或更低，10％或更低，15％或更低，20％或更低，30％或更低，50％或更低，80％或更低，100％或更低，200％或更低，500％或更低。
如本文所用，术语“治疗(treatment和treating)”包括给予一种或多种活性组分以预防或延迟该症状或并发症的发作，以及预防或延迟该疾病、病症或障碍的发展，和/或以消除或控制该疾病、病症或障碍以及减轻与该疾病、病症或障碍相关的症状或并发症。术语“治疗”包含治疗性即治愈性治疗和/或姑息性治疗以及预防的即预防性治疗二者。治疗性治疗是指对已发展一种或多种表现出的急性或慢性形式的所述病症的患者的治疗。治疗性治疗可为对症治疗以减轻具体适应症的症状，或者病因治疗以逆转或部分逆转该适应症的病症或阻止或减慢该疾病的进展。预防治疗(“预防”)是指在该疾病的临床发作之前对具有发展一种或多种所述病症的风险的患者进行治疗以降低所述风险。
如本文所用，术语“靶向激活”指的是测试的分子能够对靶点的基因、蛋白或其活性具有激活作用，从而上调其表达或活性。通常“靶向激活”可以通过对其基因或蛋白的表达量、活性程度、下游影响通路或分泌的物质等方法中的一种或多种进行测定。
如本文所用，术语“受试者”与“对象”是指活体动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”可互换地使用。
如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
如本文所用，“有效量”意指本发明的药学活性组分的如下的量，所述量的本发明药学活性组分(i)治疗或预防该特定疾病或病症，(ii)减弱、改善或消除该特定疾病或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述特定疾病或病症的一种或多种症状的发作。术语“有效量”、“安全有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用。本领域技术人员(如有经验的临床医师)可根据受试者对“安全有效量”进行调整。
如本文所用，术语“抗体或其变体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质、抗体片段或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。在一具体实施方式中，本发明“抗体或变体”为分离的、并且是重组来源的。
如本文所用，术语“抗体片段”是指保留与抗原特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、嵌合抗体。
范围：在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。
黏连疾病
本发明中，“黏连”、“黏连疾病”、“黏连病变”可以互换使用，指的是机体的黏膜或浆膜病变，诱发因素较多，包括损伤、出血、感染、异物刺激或肿瘤浸润后形成黏连，例如术后黏连、放疗或化疗后黏连、炎症黏连等。本发明所述黏连疾病是指发生在生物体(口腔、器官、胃、肠、尿道等器官里面)中由上皮组织和结缔组织构成的一种膜状结构。本发明中，还可以指的是发生在空腔脏器、脏器之间、体腔、器官或关节腔面向腔体的上皮及结缔组织中的由于成纤维细胞过渡激活、胶原异常累积造成的异常增 生组织。
黏连病变可发生在较为广泛的机体部位，这些部位包括但不限于：消化系统、泌尿系统、呼吸系统、口腔、关节、皮肤内层等。形成黏连的原因有多种，机制复杂，但形成过程大多类似，以手术黏连形成为例，黏连是组织损伤后修复的结果，与手术所造成的锐性、机械性或热损伤、感染、热辐射、局部缺血、脱水及异物反应等多种因素有关，在组织创伤基础上继发一系列反应，导致大量组胺、激肽等血管活性物质释放，局部血管通透性增加，局部组织在缺氧基础上发生氧化应激损伤，局部大量游离的氧、氮自由基进一步诱发局部炎症反应，加重组织损伤。随后，细胞外基质蛋白在局部沉积，内含大量渗出的白细胞、巨噬细胞，此后通过基质蛋白沉积和成纤维细胞增殖激活完成组织的愈合过程，细胞外纤维蛋白沉积占据优势，会形成早期粘连。随后，成纤维母细胞与血管侵入，局部血管化，形成永久性粘连。
黏连患者的症状可因黏连程度和部位而有所不同。例如腹腔黏连或肠黏连患者，由于黏连造成肠蠕动减缓或停滞，轻者可无明显不适症状，或偶尔在进食后出现轻度腹痛腹胀；重者可经常伴有腹痛腹胀、排气不畅、嗳气、打嗝、大便干燥等；正常的肠蠕动可将食物残渣和气体排出体外，而肠粘连病人因肠管粘连变窄，肠内容物通过受阻，肠内的气体和粪便不能顺利排出，越积越多时，肠腔内的压力也趋于增大，导致肠道梗阻。此外，由于黏连的存在，局部组织缺血、缺氧、坏死的可能性更大，局部组织在缺氧基础上发生氧化应激损伤，局部大量游离的氧、氮自由基进一步诱发局部炎症反应，加重组织损伤，从而导致二次手术分离困难，组织脆性增加，周边相连组织出血增加，手术难度更大。
本发明的黏连疾病包括但不限于发生在空腔脏器腔体内、脏器与脏器之间、脏器上皮组织和结缔组织内部等部位，尤其是手术、放疗、化疗后的局部部位。例如腹腔、胸腔、盆腔、关节腔等腔体内的位置。
Pear1基因或其蛋白及其作为药物筛选靶点的应用
本发明中首次披露，成纤维细胞Pear1缺失能够明显促进体内黏膜黏连形成，而Pear1激动剂可以特异地抑制成纤维细胞激活、合成细胞外基质，改善黏连病变。
Pear1，即血小板内皮聚集受体1(Platelet Endothelial Aggregation Receptor 1，GeneID：375033)是一种150kDa的I型跨膜蛋白，是多表皮生长因子样结构域受体家族(Multiple Epidermal Growth Factor-Like Domains Protein，MEGF)蛋白家族的成员。人Pear1含有1037个氨基酸(aa)，其中包含20aa信号序列，735aa胞外域(Extracellular domain，ECD)，21aa跨膜区和261aa胞质区。Pear1在哺乳动物中均有存在并具有较高的相似性，例如人Pear1与小鼠Pear1(Gene ID：73182)具有84％的相似性。
本发明中，针对成纤维细胞特异Pear1敲除动物，使用腹腔黏连模型对小鼠形成假手术，结果显示采用Pear1激动剂处理后的小鼠BhatiaDS评分或Zuhlke评分显著地低于对照组。组织羟脯氨酸测定显示，采用Pear1激动剂处理后的动物的组织羟脯氨酸含量显著低于对照组。
采用Pear1激动剂处理后的动物，与黏连相关的指标显著低于对照组。采用成纤维 细胞特异Pear1敲除动物，观测其皮下黏膜黏连形成的情况，结果显示Pear1抑制了黏膜成纤维细胞过度激活以及皮下黏膜黏连的形成。
本发明人通过QPCR检测黏膜成纤维细胞的细胞外基质蛋白如胶原7a1(Col 7a1)，平滑肌肌动蛋白α2(ACTA2)的表达水平，用于表征成纤维细胞激活和胶原合成的情况，结果表明以Pear1为靶点可抑制黏膜成纤维细胞的激活。
为了检测靶向Pear1在体内抑制黏连形成中的作用，本发明人在人源化Pear1动物中构建了黏连模型，并同时在伤口部位给予Pear1激动剂处理，结果显示Pear1激动剂抑制了成纤维细胞合成细胞外基质的能力。
在得知了所述的Pear1的功能和作用机制后，可以基于该特征，以Pear1为靶点，来筛选促进Pear1的表达或活性的物质。
本发明提供一种筛选可用于预防、缓解或治疗黏连疾病的物质(包括潜在物质)的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达Pear1或存在Pear1的体系接触；和检测候选物质对Pear1的影响；若所述候选物质可提高Pear1的表达或活性，则表明该候选物质是可用于预防、缓解或治疗黏连疾病的物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Pear1及其所参与的信号通路蛋白或其上下游蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Pear1的体系或包含Pear1的体系。
所述的表达体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达Pear1的细胞；或可以是重组表达Pear1的细胞。所述的表达Pear1的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗黏连疾病真正有用的物质。
本发明对于Pear1的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于预防、缓解或治疗黏连疾病真正有用的物质，从而用于临床。
Pear1激动剂及组合物
本发明中，“激动剂”包括表达上调剂，其通过促进Pear1基因的表达来发挥作用，当表达获得更多的Pear1蛋白(多表达)时，通常也意味着Pear1活性的提高，从而有助于抑制黏连疾病。
本发明中，任何可提高Pear1的活性、维持Pear1的稳定性、促进Pear1的表达、促进Pear1的分泌、延长Pear1有效作用时间、或促进Pear1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为具有上调Pear1功能/活性的有效物质，它们均可被称为“激动剂”或“上调剂”。所述的上调剂可以是活性上调剂或表达上调剂。
如本文所用，术语“激动剂”、“Pear1激动剂”或“Pear1基因或其蛋白的激动剂”可互换使用，均指能够增强Pear1基因或其蛋白的活性、和/或结合Pear1蛋白、和/或促进Pear1抑制成纤维细胞激活信号通路、和/或减少成纤维细胞释放ECM的物质。本发明的具体实施方案中，提供了一种以Pear1作为调控靶点的Pear1激动型抗体，其对于黏连疾病具有良好的抑制效果。
作为本发明的一种实施方式，所述的Pear1的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)Pear1的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码Pear1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
本发明中，Pear1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生Pear1。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体等。
优选地，本发明提供的激动剂能够与Pear1基因或其蛋白结合并使Pear1结构发生变化，从而抑制成纤维细胞激活的激动剂。优选地，所述激动剂为靶向于Pear1蛋白并与其结合的激动剂。
在一个优选的实施例中，除本发明抗体外，本发明激动剂还可包括其它类型的对Pear1具有激活作用的物质，例如FcεR1α(即IgE受体Ia的Fc片段)、硫酸葡聚糖、岩藻聚糖或其组合，也可以包括Pear1天然的适配体和/或小分子化合物，更优选包括予FcεR1α、硫酸葡聚糖和岩藻聚糖。
利用本发明Pear1靶点，本领域技术人员可针对Pear1设计各种不同的激动剂，包括但不限于小分子激动剂、抗体或其活性片段、miRNA等。本发明中，所述小分子化合物还可以指天然存在的或人工开发的Pear1受体的小分子激动剂。
本发明中，所述适配体(Aptamer)是指一种经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，与相应的靶标分子(蛋白质、病毒、细菌、细胞、重金属离子等)有严格的识别能力和高度的亲和力。
作为本发明的优选方式，应用特异性结合于/靶向于Pear1蛋白的抗体或其变体，该抗体或其变体在细胞学及动物学层面被证实具有确切的Pear1激活作用。优选地，本发明抗体或其变体为来源于小鼠的单克隆抗体，也可以是重组的、多克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白。优选地，本发明抗体或其变体是人源化的。更优选地，本发明抗体是嵌合抗体。优选地，本发明抗体或其变体如表1～表4所示。
所述靶向Pear1的抗体包括全长抗体及抗体片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv例如scFv)，也包括含有其的双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体Fab片段(Fragment of antigen binding)也叫做抗原结合片段，是抗体结构中可以与抗原结合的区域。Fab片段由一条完整的轻链与重链的VH和CH1 结构域组成。在木瓜蛋白酶的作用下，抗体可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，抗体可以被降解为一个(Fab)2片段和Fc碎片。
可用于本发明抗体或其变体的Fab的FR片段没有特别限制，优选地，本发明采用了人IgG4的FR，以及多个经突变的FR序列，结果更改FR的序列对抗原抗体的结合力变化不大。可见本发明抗体的CDR片段对Pear1蛋白具有非常特异性且稳定的结合功能。本领域技术人员可根据本发明Pear1靶点及其与纤维化疾病的相关性的教导，利用本发明抗体或其变体的CDR，采用多种目前已知的FR，对构成的抗体进行筛选，从而获得的与本发明抗体或变体具有一致或基本一致活性的抗体，也包含在本发明的保护范围内。
可用于本发明的抗体或其变体的恒定区没有特别限制。本领域技术人员可根据本发明Pear1靶点及其与纤维化疾病的相关性的教导筛选出适用于含有本发明抗体或其变体的恒定区片段，从而获得的与本发明抗体或变体具有一致或基本一致活性的完整抗体。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％)的所述的Pear1或其激动剂(如其激动剂或过表达该Pear1的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。
本发明的组合物可直接用于预防、缓解或治疗黏连疾病，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
本发明的组合物含有安全有效量的Pear1、或其激动剂(如过表达该Pear1的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的Pear1或其激动剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的Pear1或其激动剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明还提供了一种预防、缓解或治疗黏连疾病的方法，包括给予受试者有效量的Pear1、或其激动剂(如其激动型抗体或过表达Pear1的表达载体)。
本发明的Pear1或其激动剂的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的Pear1或其激动剂可以是但限于：注射剂(如腔内(非静脉)、静脉、肌内、皮下、皮内及穴位注射剂)，皮肤给药制剂(如洗剂，涂膜剂，软膏剂、透皮贴膏等)，黏膜给药制剂(如口腔膜剂，舌下片剂、含漱剂)，经胃肠道制剂(如汤剂、合剂、颗粒剂、丸剂、片剂等)，经呼吸道吸入制剂(如气雾剂、干粉吸入剂、气溶胶吸入剂)，经直肠制剂(如栓剂、灌肠剂)，或其组合。
作为本发明的一种实施方式，可将所述的Pear1直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码Pear1的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述Pear1的细胞中，使所述的细胞表达Pear1。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现Pear1的表达。
Pear1或其激动剂的给药方式主要取决于所述激动剂的类型和特性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料及方法
1.抗体制备
抗人Pear1单克隆抗体由本发明人通过利用人Pear1胞外蛋白免疫BALB/c小鼠，通过标准的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合技术制备高亲和力单克隆杂交瘤细胞，并通过标准的抗体测序、293S细胞表达、纯化得到。
抗人Pear1单克隆抗体LF2、LF3、LF7、LF11、LF15、LF16抗体的轻链可变区和重链可变区序列列于表1中，其CDR部分序列如表2所示。
表1
表2
本发明还采用CDR移植的方法，对上述抗体对其进行人源化改造，并对框架区的 位点进行了不同的回复突变。人源化抗体hLF101～116、hLF-N55S、hLF-N55D、hLF-N55Q、hLF-G56A和hLF-G56V的序列同样见表3。
表3、抗体序列
抗体 重链抗原结合片段(VH)序列 轻链抗原结合片段(VL)序列
hLF101 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：22
hLF102 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：23
hLF103 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：24
hLF104 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：25
hLF105 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：22
hLF106 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：23
hLF107 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：24
hLF108 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：25
hLF109 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：22
hLF110 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：23
hLF111 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：24
hLF112 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：25
hLF113 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：22
hLF114 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：23
hLF115 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：24
hLF116 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：25
hLF-N55S SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：22
hLF-N55D SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：22
hLF-N55Q SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：22
hLF-G56A SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：22
hLF-G56V SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：22
本发明抗体的CDR序列如下表4中SEQ ID NO：26～55所示，该等抗体的CDR序列采用IMGT编号规则。
表4、抗体IMGT编号规则下的CDR序列
2.模型构建
2.1黏膜黏连模型构建：腹膜黏连动物模型
对人源化小鼠距腹腔盲端3cm内的蚓突按文献(章志量等，不同原因所致大鼠腹膜黏连的实验研究，中国医学杂志，2005)中的方法进行造模，并分成3组，每组20只： A，生理盐水对照组；B，预防性腹腔注射抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105抗体)0.5mg/kg组，每周一次；C，预防性腹腔注射抗人Pear1单克隆抗体1mg/kg组，每周一次。于2周，4周，2个时间点分别对小鼠处以安乐死后，选择腹部倒“U”型切口进腹，避开原手术切口，观察整个腹腔内的黏连情况，留取黏连组织、灌洗液标本进行进一步观察、检测。并对腹膜黏连模型黏连程度进行评价。
2.2皮下黏膜黏连模型构建
腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠。脱毛并消毒，切除皮肤。在硅胶板的一侧涂上一层薄薄的粘合剂，并将夹板同心地围绕伤口固定。用八针间隔均匀的间断缝合固定每个夹板，将夹板加固在伤口周围完整的组织上，防止伤口边缘挛缩。使用无菌敷贴，剪成圆形贴在硅胶板上保护伤口，防止被动物刮伤或咀嚼。预防性滴入本发明抗人Pear1单克隆抗体同腹腔黏连模型。
3.模型的维护与拍照
使用异氟烷麻醉小鼠，维持2％的异氟烷流量。揭去硅胶板上的无菌敷贴(也可以不揭)，在固定位置与比例尺旁为伤口拍照。如有需要可以重新贴上无菌敷贴。使用Image J处理照片，根据比例尺圈出伤口的大小，计算伤口面积。
4.苏木精和伊红(HE)与Masson染色
小鼠肺和肝脏在4％多聚甲醛中固定48小时，石蜡包埋后，用半自动旋转切片机(leica；rm2235和cm1950)切片，室温下脱蜡，用梯度乙醇复水，进行HE与Masson染色。
5.检测羟脯氨酸
培养黏膜或皮下来源的成纤维细胞饥饿处理12小时，分别加入1μtg/mL抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2抗体或hLF105抗体)处理细胞，30分钟后加入10ng/mL TGFβ处理细胞48小时，收集细胞上清，采用南京建成生物公司羟脯氨酸检测试剂盒，按照说明书步骤检测羟脯氨酸含量。
6.定量PCR(QPCR)
收集方法5中的黏膜成纤维细胞，用Trizol法(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照标准方案提取总mRNA。利用逆转录酶(Takara)合成互补DNA。采用ABI7000Real-time PCR仪(life technologies)检测基因表达，PCR引物序列如表5。18sRNA基因作为内参。
表5、qPCR引物序列
基因 上游引物 下游引物
Col 7a1 caggcattggtgccagtgaaca(SEQ ID NO：104) tggacctccatcctcacagtca(SEQ ID NO：105)
ACTA2 tgctgacagaggcaccactgaa(SEQ ID NO：106) cagttgtacgtccagaggcatag(SEQ ID NO：107)
18sRNA ttgactcaacacgggaaacc(SEQ ID NO：108) agacaaatcgctccaccaac(SEQ ID NO：109)
7.Pear1人源化转基因小鼠构建
人Pear1基因敲入小鼠通过CRISPR/Cas9技术构建，在小鼠Pear1基因编码区外显子1-ATG附近设计靶点，在同源重组模板存在的情况下，使外源基因人Pear1定点整合到目的位置，替换小鼠Pear1基因序列。
8.统计方法
所有数据均采用Graphpad8.0软件进行统计分析。两组数据间比较采用t检验。kaplan-meier分析用于生存率分析。在所有数据比较中，p值小于0.033被认为具有统计学意义。
实施例1、皮下黏膜成纤维细胞与真皮层黏连的相关性
采用成纤维细胞特异Pear1敲除小鼠，观测其皮下黏膜黏连形成的情况，并与对照组比较。
结果显示，Pear1缺失的小鼠比对照小鼠皮下黏膜黏连形成更严重，表现为伤口处黏膜厚度增加，成纤维细胞大量增殖，活化型的肌成纤维细胞增多，胶原面积增加，如图1A-B。
这一实验结果表明，Pear1抑制了黏膜成纤维细胞过度激活以及皮下黏膜黏连的形成，因此可以Pear1作为抑制黏膜黏连的潜在作用靶点。
实施例2、以Pear1为靶点可抑制黏膜成纤维细胞的激活
为了进一步研究靶向Pear1在抑制黏膜成纤维细胞激活中的作用，分离得到人源化Pear1小鼠皮下黏膜成纤维细胞进行体外培养，并用抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105)处理TGFβ激活的成纤维细胞48小时，分别收上清检测羟脯氨酸的含量，收细胞进行QPCR检测细胞外基质蛋白如胶原7a1(Col 7a1)，平滑肌肌动蛋白α2(ACTA2)的表达水平，用于表征成纤维细胞激活和胶原合成的情况。
实验结果显示，与对照组相比，抗Pear1单抗(包括LF2或hLF105)均抑制了成纤维细胞激活及合成细胞外基质的能力，如图2A，B。
该实验数据表明，采用抗Pear1的抗体可以Pear1为靶点可抑制黏膜成纤维细胞的激活，且在受伤后，向黏膜提前应用该靶点的抗体，可起到良好的黏连预防作用。
实施例3、人源化Pear1小鼠皮下黏膜黏连模型中抗Pear1单抗抑制黏连的形成
接着，为了检测靶向Pear1在体内抑制黏连形成中的作用，本发明人在人源化Pear1小鼠中构建了黏连模型，并同时在伤口部位分别滴入抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105)各5微克，每隔7天给药1次。在第14天取下伤口处皮下黏膜组织，HE和Masson染色，显微镜下拍照，Image J软件统计皮下黏膜及皮肤的厚度以及胶原面积，用于指征黏连形成的情况。
结果表明，抗Pear1单抗显著降低了伤口处真皮黏膜厚度，成纤维细胞的增殖、过度活化和胶原的合成，如图3A、B、C。
这些数据都表明，抗Pear1单抗可预防、抑制黏连的形成。
实施例4、人源化Pear1小鼠腹腔黏膜黏连模型中抗Pear1单抗抑制黏连的形成
针对成纤维细胞特异Pear1敲除小鼠，使用腹腔黏连模型对小鼠形成假手术，模型制备及动物分组如前所述。
1.BhatiaDS评分
按照BhatiaDS的评分标准，0级：无黏连；I级：蚓突盲端处理面黏连面积/处理面总面积＜50％，易钝性分离；II级：上述面积比≥50％，易钝性分离；III级：不论黏连面积大小，只要黏连分离困难，虽仍能钝性分离，但分离后肠壁有明显损伤；IV级：不论黏连面积大小，只要黏连牢固、钝性已不能分离、需用锐性分离。每只小鼠由3人分别 进行评分，取其平均值为该样本的黏连分值。
结果表明，采用抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105)处理后的小鼠BhatiaDS评分显著地低于对照组(表6)，尤其在高剂量组(1.0mg/kg)，可见采用Pear1的抗体可有效预防腹腔黏连。
表6
2.Zuhlke评分
通过不同染色法对组织切片进行染色，在光镜下观察黏连组织的厚度、炎症细胞浸润程度、新生毛细血管的增殖、成纤维细胞与间质细胞的增生、胶原纤维的排列情况等以Zuhlke评分标准为量化评分：1级，疏松结缔组织，富含细胞，可见成熟和不成熟的纤维蛋白、网状纤维；2级，含有细胞和毛细血管的结缔组织，可见少量胶原纤维；3级，坚实的结缔组织，少量细胞，可见较多血管，少量弹性纤维和平滑肌纤维；4级，成熟的肉芽组织，细胞少，浆膜层难以辨别。
结果表明，采用抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105，1.0mg/kg)处理后的小鼠腹腔黏连组织较为疏松，富含细胞，评分均为1级-2级，而对照组均为4级，均为致密的结缔组织和肉芽组织，可见采用Pear1的抗体可有效预防腹腔黏连。
3.组织羟脯氨酸测定
组织黏连的形成依赖胶原的合成，羟脯氨酸是合成胶原蛋白的前体，基于这一理论，组织羟脯氨酸含量的测定可间接反映黏连的严重程度，两者呈线性正相关关系，因此留取黏连组织进行羟脯氨酸水平测定作为黏连评估的另一重要方法。
结果表明，采用抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105)处理后的小鼠组织羟脯氨酸含量显著低于对照组。
4.小鼠与黏连相关的指标测定
应用免疫组织化学或RT-PCR方法测定与黏连形成相关的一些指标，来反映黏连的严重程度，如：纤维蛋白原(FIB)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、MMPs/TIMPs、转化生长因子(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)。
结果表明，采用抗人Pear1单克隆抗体(包括LF2或hLF105)处理后的小鼠，与黏连相关的指标显著低于对照组。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

  1. 一种Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂在制备预防、缓解或治疗黏连疾病的药物组合物中的应用。
  2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黏连疾病包括：黏膜黏连疾病，浆膜黏连疾病；较佳地，所述黏连疾病包括：损伤、出血、感染、异物刺激、肿瘤浸润或炎性细胞浸润后形成的黏连疾病；较佳地，所述损伤形成的黏连包括术后黏连、放疗或化疗后黏连，所述感染形成的黏连包括炎症黏连；较佳地，所述黏连疾病包括：消化系统、泌尿系统、呼吸系统、生殖系统、口腔、关节、皮肤内层的黏连疾病，更佳地包括：腹腔、盆腔、胸腔、子宫、关节腔、心包、硬膜外或牙周部位的黏连疾病；更佳地，所述的黏连疾病为腹腔黏连、盆腔黏连、胸腔黏连或关节腔黏连。
  3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Pear1基因、其编码的蛋白的激动剂包括增强Pear1的表达、活性、稳定性和/或有效作用时间的试剂；较佳地，包括：特异性激活Pear1活性的抗体、其抗原结合片段或变体，重组表达Pear1的表达构建物，Pear1的化学激动剂，促进Pear1基因启动子驱动能力的表达上调剂；更佳地，所述Pear1的化学激动剂包括：FcεR1α、硫酸葡聚糖、岩藻聚糖或其组合。
  4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂还用于：
    抑制黏膜成纤维细胞的激活；
    降低组织羟脯氨酸含量；
    降低病灶处黏膜厚度；
    降低病灶处成纤维细胞增殖或活化；
    降低病灶处胶原的合成；或
    降低黏连相关指标，较佳地所述指标包括：纤维蛋白原、α-平滑肌动蛋白、t-PA/PAI、MMPs/TIMPs、转化生长因子、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子和/或白介素。
  5. 一种预防、缓解或治疗黏连疾病的方法，包括将Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂给予需要预防、缓解或治疗的对象。
  6. 一种用于预防、缓解或治疗黏连疾病的药物组合物或药盒，其特征在于，其中包括有效量的Pear1基因、其编码的蛋白或其激动剂，以及药学上可接受的载体。
  7. 如权利要求1所述的应用、权利要求5所述的方法或权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述激动剂是特异性激活Pear1活性的抗体、其抗原结合片段或变体；较佳地，所述抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：26、27和28所示，或如SEQ ID NO：26、27和29所示，或如SEQ ID NO：26、30和28所示，或如SEQ ID NO：31、27和32所示，或如SEQ ID NO：33、34和35所示；和/或所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：45、GAT和SEQ ID NO：46所示，或如SEQ ID NO：47、SAS和SEQ ID NO：28所示，或如SEQ ID NO：49、DTS和SEQ ID NO：50所示，或如SEQ ID NO：51、GAT和SEQ ID NO：52所示；
    更佳地，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14或15所示，或所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：16、17、18、19、20、22、23、24或25所示。
  8. Pear1基因或其编码的蛋白的应用，用于筛选预防、缓解或治疗黏连疾病的药物或化合物。
  9. 一种筛选预防、缓解或治疗黏连疾病的药物或化合物的方法，包括：
    (1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达Pear1或含有Pear1；和
    (2)检测所述体系中Pear1的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高Pear1的表达或活性，则表明该候选物质是所需的药物或化合物。
  10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，
    步骤(2)包括：检测所述体系中Pear1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高Pear1的表达或活性，则表明该候选物质是所需的药物或化合物。
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