CN118011048A - 制备具有改进的冷却特性的低温样品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备低温样品的方法和设备，由此使用冷冻剂对样品进行快速冷却。该方法包括提供样品的步骤，该样品包括在大体上平面的样本载体上提供的样本。该方法包括提供用于将低温流体输送到该样品的至少一个流动装置的步骤，其中该流动装置包括用于将低温流体流引导到该样品上的第一喷嘴。然后，将样品定位在该第一喷嘴旁边，并且提供流出该第一喷嘴的低温流体流，使得样品被低温冷却。如本文所限定，第一喷嘴的喷嘴口具有在第一方向上测量的宽度和在基本上垂直于该第一方向的第二方向上测量的高度，其中该宽度大于该高度。使用诸如实质上椭圆形或矩形的非圆形的喷嘴口提供了更加改进的冷却，使得样本载体的所有部分被均匀地冷却。

Description

制备具有改进的冷却特性的低温样品的方法

说明书

本发明涉及一种制备低温样品的方法，通过该方法使用冷冻剂对该样品进行快速冷却，并且该方法包括以下步骤：提供样品，该样品包括在基本上平面的样本载体上提供的样本；提供用于将低温流体输送到该样品的至少一个流动装置，其中该流动装置包括用于将低温流体流引导到该样品上的第一喷嘴；以及将该样品定位在该第一喷嘴旁边，并且提供从该第一喷嘴流出的低温流体流，使得该样品被低温冷却；

本发明还涉及一种用于执行这种方法的设备。

术语“样本”应被解释为是指例如可以使用一个或多个研究装置来研究的感兴趣对象。在样本载体上提供样本，该样本载体可用于在这些研究装置中的研究期间容易地操纵感兴趣对象。

术语“样品”应被解释为样本载体与在该样本载体上提供的样本的组合。

术语“冷冻剂”应被解释为是指处于低温温度(即处于或低于-150℃)的液体。这类冷冻剂的示例包含液态乙烷、液态丙烷、液态氧及其混合物。

术语“低温样品”应被解释为是指处于低温温度(即处于-150℃或低于-150℃的低温温度)并且可以在被布置成至少部分地在低温温度下操作的研究装置中被研究的样品(即，在样本载体上提供的样本)。作为示例，研究装置可以包括带电粒子显微镜。

术语“喷嘴”应被解释为是指被设计成将流中的低温流体引导到样品上的任何元件。喷嘴可以包括可用于在低温流体流离开流动通道时建立该低温流体流的方向或特性的特征，例如通道、孔、管道、软管、管等。如本文所限定，术语喷嘴包括管嘴以及孔口。

带电粒子显微镜法是众所周知且日益重要的用于对微观物体进行成像的技术，特别是呈电子显微镜法的形式。从历史上看，电子显微镜的基本类已经演变成许多众所周知的设备种类，如透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和扫描透射电子显微镜(STEM)，以及各种子类，如所谓的“双束”工具(例如，FIB-SEM)，所述工具另外采用“机械加工”聚焦离子束(FIB)，例如允许进行支持性活动，如离子束铣削或离子束诱导沉积(IBID)。更具体来说：

-在SEM中，扫描电子束对样品的照射促进“辅助”辐射例如以二次电子、背散射电子、X射线和光致发光(红外、可见光和/或紫外光子)的形式从样品发出；然后检测该发出辐射通量的一个或多个分量，并将其用于图像累积目的。

-在TEM中，用于照射样品的电子束被选择为具有足够高的能量以穿透样本(为此，该样本通常将比SEM样品的情况下更薄)。然后，可使用从样本中发出的透射电子的通量来创建图像。当这种TEM以扫描模式操作(因此成为STEM)时，所讨论的图像将在照射电子束的扫描运动期间累积。

作为使用电子作为照射束的替代方案，也可以使用其他种类的带电粒子执行带电粒子显微镜法。在这方面，短语“带电粒子”应该广义地解释为包括例如电子、正离子(例如Ga或He离子)、负离子、质子和正电子。

应当注意的是，除了成像和执行(局部)表面改性(例如，研磨、蚀刻、沉积等)之外，带电粒子显微镜还可以具有其他功能，诸如执行光谱分析、检查衍射图等。

在所有情况下，带电粒子显微镜(CPM)将至少包括以下部件：

-辐射源，诸如肖特基(Schottky)电子源或离子枪。

-照明器，该照明器用于操纵来自源的“原始”辐射束，并且对该辐射束执行某些操作，诸如聚焦、减轻像差、裁剪(带孔)、滤波等。该照明器通常包括一个或多个(带电粒子)透镜，并且可以包括其他类型的(粒子)光学部件。如果需要，照明器可以设有偏转器系统，所述偏转器系统可以被调用以使其输出束以在正在研究的样品上执行扫描运动。

-样品架，用于固持研究中的样品。具体地说，样品架被布置用于固持样本载体(该样本载体上具有样本)，并且通常被布置用于相对于带电粒子束定位(例如，倾斜、旋转)样本载体。如果需要，可以移动此样品架，以便实现射束相对于样品的扫描运动。一般来说，这种样品架将连接到定位系统，如机械台。样品架可以包括将样品保持在给定(热或冷)温度范围内的装置；在本发明的特定上下文中，该样品架通常包括用于将样品保持在低温下的装置。

-检测器(用于检测从被照射的样本发出的辐射)，该检测器本质上可以是单一的或复合的/分布的，并且该检测器可以采取许多不同的形式，这取决于检测到的辐射。示例包含光电二极管、CMOS检测器、CCD检测器、光伏电池、X射线检测器(如硅漂移检测器和Si(Li)

检测器)等。一般来说，CPM可包括若干不同类型的检测器，其选择可以在不同情况下被调用。

在透射型显微镜(例如，诸如(S)TEM)的情况下，CPM还将包括：

-成像系统，该成像系统实质上获取穿过样本(平面)透射的带电粒子并且将它们引导(聚焦)到分析设备上，诸如检测/成像装置、分光镜设备(诸如EELS模块；EELS＝电子能量损失谱)等。与上文提到的照明器一样，成像系统还可以执行其他功能，诸如像差缓解、裁剪、过滤等，并且该成像系统将通常包括一个或多个带电粒子透镜和/或其他类型的粒子光学部件。

在下文中，本发明通常将通过示例的方式在电子显微镜法的特定上下文中阐述。然而，这类简化仅用于清楚/说明目的，且不应解释为限制。

需要在含水液体(例如水、电解质、细胞液、血浆等)中储存和研究的生物样本(例如细胞、细胞成分、单细胞生物体等)在CPM中进行检查时会面临巨大的挑战，因为:

-引入到CPM的(准)真空环境中的含水液体将开始除气/沸腾，因此往往会使样本劣化；

-为了防止这种情况，可以在样品载体上提供样本，之后，可以在将样本引入到该真空中之前冷冻样本；

-然而，为了防止由(尖锐的)冰晶的形成导致对样本的损害，此类冻结一般必须非常快速地进行，目的是实现样本玻璃化(固化成无定形的玻璃样相)而没有显著的冰结晶。

为了促进此类玻璃化(也为了允许在透射型CPM(诸如TEM)中研究样本)，样品应相对较薄(片状)，但仍然应能够支撑该样品的边缘(以便所采用的支撑装置对光束穿透没有显著影响)。为此，通常使用栅格状支架结构(诸如所谓的TEM )，多孔膜(诸如所谓的“多孔碳膜”)横跨该栅格状支架结构，在该多孔膜的穿孔中可以(例如，通过表面张力效应)固持少量样本。例如，参见图1。

从US2017/0169991 A1(也公布为EP3179229A1)并且从US 2019/0180974A1(也公布为EP3495798A1)已知在上文的开始段落中阐述的方法。

玻璃化方法可以包括将样品插入液体乙烷浴槽中。插入可以包括将样品引入液体乙烷浴槽中，其中样品保持在水平取向。

其他玻璃化方法包括使用被引导到样品的液体冷却剂流。样品可以由以大体上竖直的取向延伸的样本载体固持，并且液体冷却剂流可以是从样品的相对侧提供的。其他玻璃化方法包括提供液体冷却剂流和同时在液体乙烷浴槽中冲洗样品的组合。

文献中阐述的技术和上文提到的技术产生令人满意的结果，但是可以被改进。

在现有技术中，已知使用圆形喷嘴，诸如圆形管嘴。然后将单个圆形喷嘴指向圆形样品的第一侧的中心。可提供第二圆形喷嘴以冷却样品的另一侧的中心。这种单个喷嘴(的组件)的缺点是所获得的冷却能力对于圆形样品的边缘来说是不够的。增大射流速度以在样品的边缘处获得更高的冷却速率导致样品中心处的箔破裂，并且因此不提供对这个问题的解决方案。增大射流的直径在整个栅格区域上引入了射流与反射切向流之间的干涉，并且也没有提供对这个问题的解决方案。在EP4067860A1中描述了多射流方法，但是可能导致具有降低的冷却速率的驻点。因此，仍然存在提高整个样品上的冷却速率的期望。

考虑到这一点，本发明的目的是，提供一种通过玻璃化制备低温样品的方法。具体地说，本发明的目的是，在具有中心部分和周边部分的样品上提供改进的冷却速率，其中样品的中心部分和样品的周边部分经历相等的冷却速率，而没有上文提到的现有技术方法的缺点。具体地说，本发明的目的是，与现有技术相比，这种方法应该产生更一致的结果，以及在整个样品上产生更一致的结果。

这些和其他目的在如由权利要求1限定的制备低温样品的方法中实现。在如本文所限定的方法中，使用冷冻剂对样品进行快速冷却。该方法包括提供样品的步骤，该样品包括在大体上平面的样本载体上提供的样本。该方法还包括提供用于将低温流体输送到该样品的至少一个流动装置的步骤，其中该流动装置包括用于将低温流体流引导到该样品上的第一喷嘴。然后，将样品定位在该第一喷嘴旁边，并且提供流出该第一喷嘴的低温流体流，使得样品被低温冷却。

如本文所限定，第一喷嘴包括喷嘴口。第一喷嘴的喷嘴口具有在第一方向上测量的宽度和在基本上垂直于该第一方向的第二方向上测量的高度，其中该宽度大于该高度。换句话说，本文所限定的喷嘴口是非圆形的。与圆形喷嘴相比，如本文所限定的喷嘴口在样本载体上具有改进的切向冷却剂速度，特别是由于与圆形喷嘴的径向流动剖面相比，更大的宽高在样品上建立实质上2D流动剖面。如本文所限定的喷嘴口提供栅格状样本载体的射流冻结而不破坏箔，并且足够快以在栅格的整个直径上形成无定形薄冰层。

在宽度方向上相对宽但在高度方向上相对窄的流具有的主要优点是，当扁平形状的射流撞击样品时，该流分裂成两片液体流。一片移动到第一方向，并且另一片在相反的第二方向上移动。由于射流的广泛性质，在“宽度”方向上几乎不发生流的任何扩散。结果，流体在样品表面上在“高度”方向上的速度在整个样品区域上被保持，并且这个速度与由圆形射流呈现的径向流相比可以更大。

由此，实现了本发明的目标。

下面，将给出与本公开相关联的坐标系的示例性定义，以进一步阐明如本文所公开的方法的一个或多个特性。

笛卡尔坐标系可以与喷嘴相关联，该坐标系具有以下三个方向：喷嘴口的宽度(＝x方向)、喷嘴口的高度(＝y方向)以及来自喷嘴的流动方向(＝z方向)。该流动方向与喷嘴口的宽度(x)和高度(y)基本上正交。

注意，在喷嘴的宽度大于高度的情况下，建立了实质上2D流型。这意味着流主要作为y方向和z方向的函数而变化，但不是x方向的函数。换句话说，在yz平面中观察到的流型对于所有x坐标是基本上相等的。因此，流型和流线是高度和z方向的函数，并且因此是f(y,z)，但比f(x)小得多。

通常，流在喷嘴处开始，射流或流从喷嘴出来、变大并且然后撞击到样品的表面上，在该表面处，射流或流撞击并且分叉成两个单独的向外引导的流。分叉包括在具有正y方向(例如，向下方向)上的分量的方向上行进的一个分流，以及在具有负y方向(例如，向上方向)上的分量的相反方向上行进的另一个分流。

大体上平面的样品可以相对于喷嘴定位，使得平面样品的第一表面与来自喷嘴的液体冷却剂的流动方向正交。那么，分叉包括在正y方向上行进的流和在负y方向上行进的流。

在喷嘴的宽度与水平面(即水平)对准的情况下，喷嘴的高度与重力方向(即竖直)对准，并且样品被定位成与流正交(如上文段落中所述)，则流将分叉成在向上竖直方向上(逆着重力)行进的流和在向下竖直方向上(在重力的方向上)行进的流。

下文将描述其他有利的实施方案。

在一个实施方案中，第一喷嘴包括仅单个喷嘴口。单个喷嘴口确保2D流并且防止局部驻点(并且防止当使用多个喷嘴口时将存在的定时和同步问题)，并且因此提供样品的更均匀冷却。因此，喷嘴可以由一个喷嘴口组成。

在其中多个喷嘴口存在于单个喷嘴中的其他实施方案中，具有大于1的宽高比的喷嘴口提供朝向样品的流的至少80％。例如，可以想到提供一个或多个更小的附加喷嘴口以改进样品的冷却(例如，以冷却样品上的特定热点)。如本文所限定的具有与高度相比更大的宽度的喷嘴口优选地通过提供来自该喷嘴的总流量的至少80％、优选地至少90％来考虑冷却样品的主要源。

也可提供具有相应喷嘴口的附加喷嘴，其中这些喷嘴中的每个喷嘴指向样品的单个侧。在一个实施方案中，喷嘴中的至少一个喷嘴包括如本文所限定的喷嘴口，因此具有超过高度的宽度。这个喷嘴口贡献了瞄准样品的这个相应单个侧的所有喷嘴的所有流量的至少80％。附加喷嘴可以在样品的另一侧处提供，并且可以提供对流量的附加贡献。该至少80％是仅针对单个侧来计数的。

在一个实施方案中，方法包括仅将具有仅单个喷嘴口的单个喷嘴引导到样品的一个相应侧的步骤。实际上，这可能意味着样品的仅单个侧被冷却。然而，在优选实施方案中，可提供冷却样品的另一侧的第二喷嘴。这个第二喷嘴可以与第一喷嘴相同，或者可以不同地实施。第二喷嘴也可以具有仅单个喷嘴口。第二单个喷嘴口可指向样品的相应另一侧。这里，方法包括仅将单个扁平形状的射流引导到样品的一侧(并且可选地，仅将第二单个扁平形状的射流引导到样品的另一侧)的步骤。

在一个实施方案中，第一喷嘴的喷嘴口的该宽度超过样本载体的在第一方向上测量的尺寸。这将确保在整个样品上建立2D流。

在一个实施方案中，样本载体包括栅格状支架结构(诸如TEM)，膜横跨该栅格状支架结构。样本载体可以包括相对较大的栅格环元件，该栅格环元件用于封闭和承载栅格状支架。栅格环元件可用于例如使用镊子或其他夹持器来容易地操纵样品。这种具有自动栅格环(作为栅格环元件的示例)的TEM是本领域技术人员公知的。

在一个实施方案中，可以使第一喷嘴的喷嘴口的宽度比栅格状支架结构内部的开放栅格区域宽。在这个实施方案中，栅格环元件可以使用夹持器装置(例如，镊子)来操纵。在喷嘴口具有超过样本载体的尺寸的宽度的情况下，也可以利用流直接冷却栅格环元件和/或夹持器装置(诸如镊子尖端)。这些较大热容的直接冷却避免了样品(并且具体地说，在靠近栅格环元件和/或夹持器装置的地方)的再加热或缓慢冷却。

在一个实施方案中，宽度可以基本上等于该样本载体的在第一方向上测量的尺寸。

在一个实施方案中，第一喷嘴的喷嘴口的高度小于样本载体的在第二方向上测量的尺寸(即比该尺寸小)。换句话说，喷嘴口的高度小于样品的尺寸。由此建立在样品上的2D流。

在一个实施方案中，该样本载体包括中心部分和周边部分。如本文所公开的喷嘴口的尺寸使得中心部分和周边部分经历基本上相等的冷却速率。优选地，喷嘴口的中心部分瞄准样本载体的中心部分，但不同的位置也可以获得更为改进的冷却。本领域技术人员将能够选择合适的位置。这样，中心部分和周边部分基本上同时被冷却。例如，样本载体可以是大体上椭圆形、圆形或正方形。

在一个实施方案中，第一喷嘴的喷嘴口是大体上非圆形的，并且具体地说，第一喷嘴的该喷嘴口是大体上矩形的。在优选实施方案中，第一喷嘴的喷嘴口是矩形的，长边在宽度方向上延伸并且短边在高度方向上延伸。

在一个实施方案中，该高度小于样本载体的在第二方向上测量的尺寸的50％，具体地说，小于40％，更具体地说小于30％。较低的高度有助于在样品上建立2D流。优选地，高度大于样本载体的尺寸的10％，更具体地说，是样本载体的尺寸的大约15％-25％。

观察第一喷嘴的喷嘴口的宽高比，这个宽高比可以在2∶1与10∶1之间，并且优选地大约是6∶1。在宽度大约等于样本载体的尺寸，并且高度是样本载体的尺寸的大约15％-25％的实施方案中，宽高比在1∶7与1∶4之间。这个比率有利于在样品上建立2D流。

如前所述，第一喷嘴的喷嘴口可被定位，使得宽度尺寸被定位成基本上水平的，即平行于地平线。

在一个实施方案中，第一喷嘴的喷嘴口的宽度为至少2.5mm，并且优选地为至少3.5mm。这与用于低温电子显微镜法的标准样品载体的尺寸一致，该标准样品载体在标准中具有大约3mm的直径。在上文给出的比率的情况下，第一喷嘴的喷嘴口的高度可以在0.3mm与1mm之间，并且优选地为大约0.7mm。

在一个实施方案中，流出第一喷嘴的该喷嘴口的流速在1.0m/s与20m/s之间，优选地在5.0m/s与11m/s之间，诸如8m/s。

在一个实施方案中，低温流体流出第一喷嘴的该喷嘴口的流动速率在2ml/s与80ml/s之间，优选地在25ml/s与55ml/s之间，诸如40ml/s。应注意，一般来说，这里给出的值是针对样品的单侧上的总流量。也可以提供样品的另一侧上的流，其中本段中提到的值也适用于该侧。

喷嘴口的尺寸可以适于期望的流速和期望的流动速率，其中较大的面积允许在相对较低的流速(和因此对样品的较小的损坏机率)下的较高流动速率(和因此的冷却速率)。

在一个实施方案中，该流动装置包括定位在距该第一喷嘴一段距离处的第二喷嘴，并且该方法包括以下另外的步骤：将样品定位在该第一喷嘴与该第二喷嘴之间；以及提供穿过第一喷嘴并且穿过第二喷嘴的低温流体流以从两个相对侧对样品进行低温冷却。这允许从两个相对侧冷却样品，从而允许更高的冷却速率，但还保护相对易碎的样品，因为现在相反的力作用在样品上。

注意，第二喷嘴的喷嘴口可以如关于第一喷嘴的喷嘴口所描述的那样实施。如所指示，喷嘴口可以是不同的。在一个实施方案中，该第二喷嘴的该喷嘴口和该第一喷嘴的该喷嘴口都具有大于高度的宽度。在另一个实施方案中，两个喷嘴口基本上相同。

在一个实施方案中，该流动装置包括柱塞，其中：

-该柱塞包括具有在该柱塞的下侧上提供的入口的至少一个流动通道，其中在该入口的下游，该流动通道提供有该第一喷嘴，并且其中柱塞包括用于将该样品定位在该柱塞的上侧中的间隙；

-在该柱塞下方提供低温流体浴槽；

-使用对该柱塞施加向下的压力的工具将该样品插入到该间隙中，由此使该柱塞至少部分地浸没并且使得低温流体流出该第一喷嘴。

在这个实施方案中，通过柱塞的向下移动来建立流体的泵送。

在其他实施方案中，流动装置可以包括用于向喷嘴提供液体冷却剂的泵送机构。这种泵送机构本身是本领域技术人员已知的。

根据一个方面，提供了一种用于制备低温样品的设备，通过该设备使用冷冻剂对样品进行快速冷却，该设备包括用于将低温流体输送到该样品的至少一个流动装置，其中该流动装置包括用于将低温流体流引导到该样品上的第一喷嘴。

如本文所描述，第一喷嘴的喷嘴口具有在第一方向上测量的宽度和在基本上垂直于该第一方向的第二方向上测量的高度，其中该宽度大于该高度。

此类装置的优点已经关于本文所描述的方法进行了说明。

在一个实施方案中，该设备可以包括用于将样本施加到样本载体的施加装置。施加装置可以被布置用于将包含在液体介质中的样本施加到该样本载体。

在一个实施方案中，该设备可以包括用于从该样本载体去除过量液体的吸墨装置。

该设备可以被布置用于以随后的顺序执行以下步骤：使用施加装置将样本施加到样本载体，使用吸墨装置从该样本载体吸除过量液体，以及此后使用流动装置使样本载体上的样本玻璃化。

下文将描述考虑到使用两个喷嘴的一些一般原理和实施方案。

从第一喷嘴施加的低温流体流和从第二喷嘴施加的低温流体流基本上相等。这里，两个喷嘴可用于将相等的低温流体流递送到样品的第一侧(即样品的正面)和样品的第二侧(即样品的背面)。这里，样品的正面是样本被施加到样本载体的一侧。

从第一喷嘴施加的低温流体流可以在给定时间间隔之后减少，使得来自该第一喷嘴的低温流体流不同于从来自第二喷嘴的流施加的低温流体流。这产生了关于样品正面和背面的冷却的故意的不对称性/差异。这减少了流动干扰并且也可以降低成本。在一个实施方案中，正面可以冷却更长时间。在另一个实施方案中，背面冷却更长时间。样品的背面可能需要更多的冷却，因为网形栅格定位在背面，并且庞大载体体积的大部分也在背面，参见图1B。

为了完整性，应当认识到，从喷嘴流出的低温流体可以是液体或(干)气体/水蒸气，并且对于每个喷嘴来说可以是相同的或不同的。一般来说，液体往往比气相流体更为优选，这尤其是因为液体的较大热容量并且它们可相对容易地被储存和泵送。还应注意，如果需要，喷嘴口中的一个或多个喷嘴口可含有网(筛)或其他形式的流动路径细分，例如以便实现层流和/或特定的流型。如上文所提到的，对于两个喷嘴，这种网不必相同。

在根据本发明的设置中，可例如使用一个或多个(电)泵将低温流体泵送穿过所采用的喷嘴；这些泵可根据需要打开/关闭，并且/或者可使用阀系统来任意打开/关闭导管中的流。例如，这种设置允许导管中的一个中的流动速率和/或流动持续时间不同于另一导管中的流动速率和/或流动持续时间。

在替代实施方案中，可以使用“手动泵送”设置，在该设置中，该喷嘴(或多个喷嘴)在柱塞中提供，如上文所描述。

这种设置有效地利用了类似于活塞中使用的流体移位机构(由此[在具有溢流导管的情况下]柱塞起到了活塞头的作用，并且低温浴槽容纳在活塞管中)。它类似于前述US2017/0169991A1中描述的设置。也可以并入如前述US2019/0180974中所述的修改。这些修改允许从喷嘴中的每个喷嘴产生不同的低温流体流。实现此目的的一种方式是在给定时间间隔之后，使用挡板关闭该导管中的连接到该喷嘴中的一个喷嘴的第一导管。进行这种延迟遮挡的一种方便的方式是使用一种构造，其中当柱塞浸没在该浴槽中时，该孔中的连接到该第一导管的第一孔与设置在该浴槽的表面下方的选定距离d处的盖子(罩；封盖构件)接合，然后该盖与柱塞一起移动，以便保持该第一孔关闭。例如，在图3A-3C中描绘了这种情况。如果柱塞以竖直速度v浸没，则可以选择距离d，以便在柱塞的流动/压下开始之后，在给定时间t＝d/v((例如，在10毫秒(ms)至100毫秒的范围内，举例来说，诸如40毫秒至60毫秒)接合挡板。挡板本身例如可以是：

-实施为固有地在所采用的冷冻剂浴槽中上浮，并且/或者举例来说，例如通过使用弹簧机构使该挡板向上偏置而人为地“上浮”。以这种方式，当柱塞(在其向上/返回“行程”)从其脱离时，挡板将向上复原/松弛(到默认/初始位置)。

-附接到将其该挡板的运动限制在竖直路径上的导轨/轨道。

-使用可调节挡块缩减超过一定水平(在深度d处)的上升。

在前一段中所描述的实施方案中，应当注意的是：

-所讨论的“工具”可以例如是镊子或钳子，该镊子或钳子可以用来抓住样本边缘。这种工具例如可以含有如突起、结节或局部增大的特征，所述特征与柱塞顶部(或其上的某个结构)接合，以便将工具的插入(凹槽中的)运动转变成柱塞的(向下)共同运动。

-柱塞最初可以(浅浅地)浮在冷冻剂浴槽中，或者另选地，可以悬挂在浴槽上方。

-尽管图3A至图3C中的图示描绘了样品平面竖直地定向并且低温流体从喷嘴水平地流出的场景，但并非必须如此。实际上，可以例如构建一种设置，在该设置中，样品平面水平地定向，喷嘴布置在该样品平面上方和下方，并且低温流体从管嘴竖直地流出。在两种情况下，需要两个导管的(累积)长度基本上相等，以便在柱塞适当地浸没时确保从两个管嘴基本上同步地放出低温流体。

-柱塞可以由各种材料制成，只要该各种材料(例如，在脆性方面)

适用于低温温度即可。示例包含，举例来说，不锈钢、钛和(某些)

陶瓷。

对于具有相对定位的主表面的大体上平面的样品，例如如上所述的栅格/膜，或者薄片/圆片，以下考虑因素提供了在应用本发明时的(非约束性)指导：

-可以将终端/极端/周向周边与管嘴中的每个管嘴相关联。

-在理想情况下，这些周边将以公共轴线为中心。

-可以使用具有单个喷嘴口的喷嘴，并且这个喷嘴口可以与这个公共轴线对准。

-这个公共轴线将以(近似)法角/直角与(平面的)样品的平面相交。

在理想情况下，公共轴线也将穿过样品的几何中心/质心/重心。

-在名义上，样品将被定位成使得该样品与管嘴等距(或者，在样本载体包括横跨在栅格上的膜的情况下，使得膜与管嘴等距)。如果样品/膜更靠近特定的喷嘴，则仍然可以通过例如以下操作确保样品的正面和背面同时开始流动：

-稍微延迟将冷冻剂泵送到连接到该特定喷嘴的导管中；或/和

-将连接到该特定管嘴的导管实施为略长于连接到另一个管嘴的导管。

关于样品所插入的冷冻剂浴槽，关于所使用的冷冻剂有各种可能的选择。例如，各种从业者报告使用液态乙烷/丙烷混合物。也可以使用液氮。在本发明的特定实施方案中，浴槽中的冷冻剂包括温度范围为-160℃至-183℃的液态乙烷(不含大量其他成分)。当通过插入冷却使样品玻璃化时，往往可以坚持“越冷越好”的准则。然而，在低于约-183℃的温度下，观察到液态乙烷可能往往变得如此粘稠，以至于可能例如通过粘附到样品载体而阻碍插入过程。因此，高于这个水平的温度(例如，-175℃)通常是优选的。

为了实现令人满意的样品玻璃化，将该样品暴露于来自本发明的管嘴的低温流体应当相对突然地进行。具有细长喷嘴口的第一喷嘴的使用有助于低温流体突然暴露在整个样品的增大区域上。暴露于来自喷嘴的低温流体可更渐进，或甚至更扩展，但发现这增加了样品将(至少部分地)冻结成结晶形式而不是凝固成无定形形式(这是不期望的)的风险。取决于各种因素，诸如样品(的栅格/膜)的厚度、所采用的低温流体的温度、由管嘴的喷嘴口产生的压力/流型等，可以调节/优化喷嘴口以建立期望的流。作为非约束性示例，来自喷嘴口的不间断流可具有在5毫秒-200毫秒范围内的标称持续时间，例如大约100毫秒-120毫秒；在样品包括栅格上的多孔膜的情况下，稍微更长的持续时间通常将有助于确保除了在多孔膜中产生水性膜的玻璃化之外，残余的热以令人满意的程度从栅格(和任何相关联的支撑构件)去除，以便防止通过从栅格的热泄漏对膜的不期望的“再加热”，或防止通过从机械支撑件的热泄漏对样品载体的不期望的“再加热”。在发生玻璃化后，水性膜温度将优选地保持低于约-145℃，以防不期望地形成结晶冰。本领域技术人员将能够选择符合与本发明的给定实施方案有关的设置和参数的流动持续时间。

应注意的是，在一个实施方案中，发生射流和插入的组合。射流可以在样品浸没在液体冷却剂之前开始。一旦样品浸没在液体冷却剂中，射流就可以持续一段时间以确保样品的充分冷却。在一个实施方案中，射流开始并且样品在20毫秒内被液体冷却剂浸没/包围。射流仍然可以持续以上段落中提到的总时间段。因此，总射流时间可以是100毫秒-120毫秒，样品在20毫秒后完全浸没。例如，柱塞有助于冷却庞大栅格和机械工具(诸如镊子)。

现将基于示例性实施方案和所附示意图更详细地阐明本发明，在所附示意图中：

图1A至图1B示出了在玻璃化程序中使用的普通样品结构(的特定实施方案)。

图2示出了应用现有技术玻璃化程序可能导致的样品损坏；

图3A至图3C呈现了根据本公开的设备的实施方案的各方面的纵向剖面图；

图4呈现了适用于如本文所公开的方法的带电粒子显微镜的纵向剖面图。

图5A至图5D示意性地示出了具有如本文所限定的喷嘴口的喷嘴的实施方案；

图6示出了具有与待玻璃化的样品对准的喷嘴口的喷嘴；

图7a和图7b分别示出了流出喷嘴口并流到样品上的流的正视图和侧视图；

图7c示出了流出喷嘴口并流到样品上的流的数值模拟；

图8示出了如本文所公开的方法与一种现有技术方法的比较；

图9示出了如本文所公开的设备的另一实施方案。

在附图中，在相关情况下，可以使用对应的附图标记表示对应的部件。应注意，一般来说，图未按比例绘制。

背景示例

图1A呈现了可以与本发明结合使用的样本载体S的特定实施方案的各方面的详细(放大)视图。这种特定类型的样本载体S包括通常被称作“栅格”G的物件。“栅格”G包括金属丝(举例来说，例如包括Cu或Ni)的圆形环21a，环的直径通常为约3mm，并且金属丝的直径通常为约20μm-100μm。附接在环21a内的是直线金属丝部分21b，其(在这种情况下)被布置成形成正交的栅格图案，从而限定出矩阵状的(大体上正方形的)孔(开口/孔洞/窗)23的阵列。图1A的中间部分示出了沿着直径B-B'截取的附图的上部的横向剖视图。它显示出栅格G具有大体上平面(板状)的形式，相对的第一“面”(S1)和第二(S2)“面”基本上彼此平行。如此处所描绘，膜25横跨在第一面S1上(并且任选地，例如，使用粘合剂或通过熔融粘合固定到金属丝21b)。这个膜25可以例如包括碳质材料，诸如尼龙或石墨烯，并且通常具有(在Y方向上的)范围从约0.3nm到数百nm的厚度。膜25含有分布的穿孔27，其在附图底部的详细视图中清楚可见。这些穿孔27的(平行于XZ平面的)直径通常在约1.2μm-3.5μm范围内(例如，约2μm)。栅格G在本质上充当膜25的支架，并且膜25又充当穿孔27的支撑结构(因此它有时被称为“多孔碳支撑物”)。在穿孔27内，将以水性液体薄膜29(包括悬浮在其中的一个或多个研究样本)的形式，提供并支撑最终“样本”，该水性液体薄膜横跨每个给定穿孔27，(尤其)借助表面张力效应保持在适当位置。应当注意的是，如图1A所描绘的结构(栅格G+穿孔膜25、27)和如上所述的结构是可商购的，例如，从如美国加利福尼亚州雷丁市(Redding,California,USA)的TedPella公司的公司买到。也可以例如从如德国耶拿(Jena,Germany)QuantifoilMicro Tools有限公司的公司，购买(各种)预先制造的多孔碳膜(对应于穿孔膜25、27)。尤其在本发明的上下文中，所示结构可被视为具有“背面”Sb和“正面”Sf。

可以使用技术文献中充分描述的和本领域技术人员已知的方法，在膜25的各种穿孔27中提供水性液体膜29。在一种这类已知方法中，将一张吸墨纸(未描绘)压在膜25的外表面/下表面上，然后用所讨论的水性液体润湿，并且随后去除(例如，剥离)膜25，使(大部分)孔27被赋予水性液体的(微型)膜29，该膜通过表面张力效应横跨在孔内。例如，在J.Dubochet等人在Journal ofMicroscopy第128卷,pt 3,1982年12月，第219页-237页中的文章Electron Microscopy offrozen water and aqueous solutions中描述了这种类型的方法，且这里将不再赘述。还参考了US 9,772,265(具有与本申请相同的发明人/受让人，并且以引用的方式并入本文中)中阐述的替代方法。

现在转向图1B，示出了具有用于改进处理的机械轮廓31的EM栅格样本载体S的示例。这里，如图1A所描述的样本载体S被包封在第一轮廓体31中，该第一轮廓体是大体上圆形的并且具有L形横截面区域。该第一轮廓体31也称为夹环31，并且是本领域技术人员已知的。样本载体S提供在该机械轮廓31的凹部内，邻接该机械轮廓31的凹部表面。呈C形夹33(也称为c夹33)形式的固定元件33将样本载体S牢固地固持在机械轮廓31的凹部中的适当位置。包括要研究的样本的水性液体薄膜29提供在栅格S的背面或正面(这里以放大的方式示出，图未按比例绘制)。

在上面提供有样本的样本载体通常被称为样品。

现在转到图2，这个图示出了在使用前述US2017/0169991A1中所阐述的方法(对样品的背面和正面施加相同的冲洗)进行玻璃化之后，如图1A和图1B所示类型的特定样品。浅灰色方格/单元格在成功的玻璃化程序中未受损，而白色方格/单元格在发生膜破裂/分层的地方(或多或少)受损。深色/斑驳的方格/单元格对应于发生玻璃化但冰太厚(或多或少)的位置。在当前情况下，可以看出，大约25％的方格/单元格是次优的。如上所阐述，对样品进行更仔细的检查(在当前附图中不明显)表明，受损的方格/单元格已经脱离，方向主要从后侧到前侧。

实施方案1

图3A至图3C示出了根据本发明的方法和设备的实施方案的各方面。从图3A开始，这个图示出了用于制备用于在低温带电粒子显微镜中研究的样品的设备。所描绘的设备包括：

·用于将样本施加到样本载体的施加装置A；

·用于在将样本施加到样本载体之后从样本载体去除过量液体的吸墨装置B；以及

·用于使在样品载体上提供的样本玻璃化的低温冷却装置。

工具T被提供用于使样品在Y方向上移动，分别经过这些施加装置、吸墨装置和冷却装置。

冷却装置包括用于输送低温流体的一对导管31a、31b。这些导管31a、31b中的每一个都具有两个极端孔口，这些孔口(分别)为：

·(下)入口孔口37a、37b，低温流体可以穿过该(下)入口孔口进入导管31a、31b；

·(上)管嘴(出口孔口)33a、33b，低温流体可以穿过该(上)管嘴(出口孔口)从导管31a、31b出现。这些管嘴33a、33b隔着中间间隙35彼此面对。管嘴33a、33b提供有喷嘴板39a、39b。喷嘴板39a可提供有如本文所限定的喷嘴口，并且将参照图5A至图5D更详细地解释该喷嘴口。喷嘴板39b还可提供有如本文所限定的喷嘴口。应当注意，在所示的实施方案中，有两个喷嘴，它们定位成彼此面对。也可以想到仅存在单个喷嘴的实施方案。

应当指出的是：

-为了方便起见，各种部件31a、31b、33a、33b、35、37a、37b在这里被描绘为驻留在主体P中，该主体可以用作基质/结构以将该各种部件保持在适当位置；例如，主体P可以是金属、陶瓷或环氧树脂的塞子/块，其中这些各种部件已经通过例如铸造、模制、机加工或3D印刷产生。然而，这并不一定如此，并且各种部件可以实际上是(准)独立结构。

-孔口37a、37b；33a、33b在这里描绘成喇叭形，但并不一定如此。在一个实施方案中，孔口是基本上平行的，以提供朝向相应喷嘴口延伸的平行流动通道。

-间隙35被描绘为具有一致的宽度，但是替代地，例如，可以是渐缩的。在理想情况下，该间隙应该(在Z方向上)相对较窄，以便改进初始流同步和对称性。

图3A中还描绘了工具T(诸如镊子、夹钳、钳子、夹子、机械臂等)，该工具可用于例如通过沿着样本载体S的边缘(诸如图1B所示的机械轮廓31)抓握该样本载体来抓住和操纵该样本载体。这个工具T可用于将样本载体从施加装置A传送经过吸墨装置B，在此之后，工具T可用于将样品S定位在间隙35中和管嘴33a、33b之间。

如上文已阐述，将低温流体供应到入口孔口37a、37b的一种方式是使用合适的管子/管道将该入口孔口简单地连接到(电)冷冻剂泵(以及相关联的冷冻剂贮存器)；然后，可以穿过导管31a、31b泵送冷冻剂并将冷冻剂泵送出管嘴33a、33b，以便用低温流体冲洗/喷淋间隙35(位于该间隙中的样品S)。这个实施方案在图9中示出，其中样品被提供在具有喷嘴口211的喷嘴201的前面，并且其中(示意性地)低温流体的贮存器231借助于导管221连接到喷嘴201。提供泵231以将液体从贮存器231泵送到喷嘴211，并泵送到样品S上。

然而，在图3A至图3C所示的实施方案中，实际上，使用(手动)活塞动作来使低温流体移动穿过导管31a、31b。为此，主体P被实施为柱塞，其具有下侧Pu(入口孔口37a、37b位于其中)和顶侧Pt(通过其可以进入间隙35)。然后，这个柱塞P可以例如(部分地)插入/浸入冷冻剂7的容器(管、器皿)5中；当柱塞的下侧Pu在表面9下方移动时，冷冻剂7将(逐渐地)被迫穿过入口孔口37a、37b、穿过导管31a、31b并流出喷嘴39a、39b(参见说明了这个动作的一部分的图3A至图3B至图3C的进程)。请注意，在图3A中，在插入工具T/开始插入程序之前，例如，作为前一次插入迭代的预虹吸和/或毛细管作用的结果，导管31a、31b已经用冷冻剂7灌注/预先填充。以这种方式，确保了冷冻剂供应紧邻样品S的插入位置等待，准备几乎瞬间喷出，从而降低从样品S两侧进行不同步冲洗/流动的风险。

为了产生所需的插入运动，所描绘的设置使用工具T向柱塞P施加向下的力，但并非必须如此，并且实际上，可以通过其他方式向下推动柱塞P。如图3B和3C所示，工具T具有突起/凸耳T'，其与柱塞P的顶侧Pt的交互区域/部件P'接合，允许工具T上的向下的力将向下的动量传递到柱塞P：参见图3B、3C中的说明性向下箭头T”。此外，可以利用突起T'(如果需要)来确保样品S插入到间隙35中的最佳深度(在理想情况下，在管嘴33a、33b之间基本上对称)，并且还可以用于提供样品S在间隙35中的正确的横向定位(再次，在理想情况下，样品(的玻璃状膜)与管嘴33a、33b等距离)。

在如这里所描绘的设置的非限制性示例中，以下说明性(和近似)值可以适用：

-样品S包括直径为3mm且厚度为0.4mm的平面栅格。

-喷嘴39a、39b的直径：3mm-4mm。

-导管31a、31b的直径：2.5mm。

-管嘴31a、31b的间距/间隙35的宽度：1mm。

-流出喷嘴口31a、31b的速度：约1m/s-20m/s

-流出喷嘴口31a、31b的流动速率：2ml/s-80ml/s

本领域技术人员将能够根据给定情况的要求定制其自己的值，并且根据上述流速和流动速率定制喷嘴口的尺寸。喷嘴口的尺寸还将参照图5A至图5D进行讨论。

在图3A至图3C所示的实施方案中，所描绘的设备已经被配置为使得从(左)管嘴33a施加的低温流体流不同于从(右)管嘴33b施加的低温流体流，更具体地，使来自管嘴33a的流的持续时间短于来自管嘴33b的流的持续时间。为此，在经过给定的时间间隔之后，使用遮挡机构(41、43、45)来关闭(左)导管31a(其连接到所述(左)管嘴33a)。更具体地说，该遮挡机构包括：

-盖子(罩/封盖物)41，该盖子设置在冷冻剂浴槽的表面9下方的选定标称距离d处。

-轨道/导轨43，该轨道/导轨允许并引导盖子41进行基本上平行于Y轴的运动。为此，盖子43可以包括孔43'(或者其他合适的结构，例如扣钩或流道)，该孔与轨道43协作以允许该孔和该轨道进行相对运动。

-可调节挡块(例如，螺钉锁定式滑动套环)，该可调节挡块防止盖子41向上运动超过(在深度d处的)某一点。

如上文所阐述，盖子41可以在冷冻剂7中自然上浮(例如，因为该盖子是中空的)，并且/或者可以使用例如弹簧、活塞或磁性布置向上偏置。以这种方式，盖子41可以在与柱塞P接合时向下共同移动，但是当柱塞P从其脱离时将向上返回/松弛。特别参考个别附图：

-在图3B中，尚未发生这种接合。柱塞P向下移动通过冷冻剂7，将(更多)冷冻剂强制性地引入到导管31a、31b中。如图3A示意性地示出，通过填充管嘴31a、31b之间的空间的阴影区域，相关联的压力头使冷冻剂从两个喷嘴口39a、39b流动。

-在图3C中，柱塞P与盖子41接合，并且柱塞P和盖子41向下共同移动(参见箭头47)。由于盖子41的大小/位置，该盖子仅与左入口孔口37a接合，从而阻挡/盖住该左入口孔口并防止冷冻剂流入该左入口孔口中；另一方面，右入口孔口37b不会以这种方式受到阻碍。因此，来自左管嘴33a的冷冻剂流停止，而来自右管嘴33b的流继续。注意，阴影区域(流)现在仅来自右管嘴33b。

如上文所阐述，本领域技术人员可以选择距离d和/或柱塞P的向下速度，以便在开始流动之后，以预选的时间间隔引起来自左管嘴33a的流的这种终止。该时间间隔可以是，例如，10-200毫秒。

应注意，如图3A至图3C所描绘的遮挡机构41的使用完全是任选的。样品S的两侧上的相等流也是可以想象的。

应注意，如本文所描述的柱塞装置可有效地用作射流冻结装置。如本文所述的柱塞装置的另一优点在于，在柱塞在低温浴槽中的浸没位置，也可以将如本文所述的装置用作柱塞冻结装置。为此，该工具可以简单地进入柱塞装置中以用于建立柱塞冻结。在替代实施方案中，低温浴槽可以提供有泵送装置以建立通过柱塞的导管的强制流动，使得可以在没有实际将柱塞移动到浴槽中的情况下发生射流冻结。

实施方案2

图4是可用于检查根据本发明制备的样品的CPM的实施方案的高度示意性描述；更具体地，该图示出了透射型显微镜M的实施方案，该透射型显微镜在这种情况下是TEM/STEM(但是，在本发明的上下文中，它可能只有效地是例如基于离子的显微镜)。在图中，在真空外壳V内，电子源2(诸如肖特基发射器)产生横穿电子光学照明器4的电子束C，用于将电子引导/聚焦到样品S的所选部分(该所选部分可例如(局部)薄化/平坦化)上。这个照明器4具有电子光轴C'，并且通常将包括各种静电/磁透镜、(扫描)偏转器D、校正器(诸如象散校正装置)等；通常，该照明器还可以包括冷凝器系统(整个项4有时被称为“冷凝器系统”)。

样品S可以被固持在样品架H上，该样品架可以由定位系统/载台A以多个自由度定位。例如，样品架H可包括可以(尤其)在XY平面中移动的指状物(参见所描绘的笛卡尔坐标系；通常，平行于Z的运动和围绕X/Y(至少)倾斜也将是可能的)。这类移动允许样品S的不同部分被沿轴C'(在Z方向上)行进的电子束照射/成像/检查(并且/或者作为射束扫描的替代方案，允许执行扫描运动)。冷却装置H'与样品架H紧密热接触，并且能够将后者维持在低温温度，例如，使用一桶低温冷却剂来达到并维持所需的低温。

沿着轴C'行进的(聚焦)电子束C将与样品S相互作用，使得各种类型的“受激”辐射从样品S发出，该辐射包括(例如)二次电子、背散射电子、X射线和光辐射(阴极发光)。如果需要，这些辐射类型中的一种或多种类型可借助分析装置6来检测，例如，该分析装置可以是组合的闪烁器/光电倍增管或EDX(能量色散X射线光谱法)模块；在这种情况下，可使用与SEM中的基本相同的原理来构造图像。然而，替代地或补充地，可研究横穿(穿过)样品S、从该样品出现(发出)且继续沿着轴C’传播(基本上，但通常具有一些偏转/散射)的电子。这种透射电子通量进入成像系统(组合物镜/投影透镜)8，所述成像系统一般包括各种静电/磁性透镜、偏转器、校正器(如，象散校正装置)等。在正常(非扫描)TEM模式中，该成像系统8可以将透射的电子通量聚焦到荧光屏10上，如果需要，所述荧光屏可以缩回/收回(如箭头10'示意性地所示)，以便使其远离轴C'。样品S(的部分)的图像(或衍射图)将由成像系统8在屏幕10上形成，并且这可通过位于外壳V的壁的合适部分中的查看端口12来观察。屏幕10的缩回机构可例如在本质上是机械的和/或电的，并且这里未描绘。

作为在屏幕10上查看图像的替代方案，相反地，可以利用从成像系统8出现的电子通量的聚焦深度通常非常大(例如，约1米)的事实。因此，可在屏幕10的下游使用各种其他类型的分析设备，诸如：

-TEM相机14。在相机14处，电子通量可以形成静态图像(或衍射图)，其可以由控制器E处理并且显示在显示装置(未描绘)上，例如，如平板显示器。当不需要时，相机14可缩回/撤回(如箭头14'示意性地所示)，以便使其远离轴C'。

-STEM成像器(相机)16。来自成像器16的输出可以记录为射束C在样品S上的(X,Y)扫描位置的函数，并且可以构建图像，该图像是来自成像器16的作为X,Y的函数的输出的“图”。例如，成像器16可以包括直径为例如20mm的单个像素，与相机14中特征性地存在的像素矩阵相反。此外，成像器16通常将具有比相机14

(例如，每秒102个图像)高得多的采集速率(例如，每秒106个点)。再说一次，当不需要时，成像器16可缩回/撤回(如箭头16'

示意性地指示)，以使该成像器避开轴C’(但在例如面包圈形环形暗场成像器16的情况下此类缩回不是必需的；在此类成像器中，

当成像器不在使用中时，中心孔将允许射束通过)。

-作为使用相机14或成像器16成像的替代方案，还可以调用光谱设备18，该光谱设备可以是例如EELS模块(EELS＝电子能量损失能谱仪)。

应注意，项14、16和18的次序/方位并不严格，并且可设想许多可能的变化。例如，分光设备18也可集成到成像系统8中。

应注意，控制器(计算机处理器)E经由控制线(总线)E'连接到各种图示的部件。该控制器E可以提供各种功能，如同步动作、提供设定点、处理信号、执行计算，以及在显示装置(未描绘)上显示消息/信息。不用说，(示意性地描绘的)控制器E可以(部分地)位于外壳V的内部或外部，并且可以根据需要具有单一或复合结构。技术人员将理解，外壳V的内部不必保持在严格真空下。例如，在所谓的“环境TEM/STEM”中，在外壳V内有意地引入/维持给定气体的背景气氛。本领域技术人员还将理解，在实践中，可能有利的是限制外壳V的体积，使得在可能的情况下，该外壳基本上紧靠轴C’，从而采取小管(例如，直径约为1cm)(所采用的电子束穿过该小管)的形式，但加宽以容纳诸如源2、样品架H、屏幕10、相机14、成像器16、光谱设备18等的结构。

例如，图4所示的样品S可以是已经经历根据本发明的玻璃化程序的样品。由于冷却装置H'，这种样品当在CPMM中时(并且在运输/储存时)可以维持在低温温度下。为此，例如，可以采用如以下实施方案：

-冷却装置H'包括杜瓦瓶/烧瓶，该杜瓦瓶/烧瓶(例如，经由铜杆和/或编织物)与支架H紧密地热连接，并且可以填充有冷冻剂。

-复合结构H+H'可以插入到CPMM中/从CPMM中移除，由此该复合结构可以安置在定位系统A的接收器部分中/由该接收器部分夹持。

例如，参考美国专利申请US2012/0112064A1中讨论的设置，以及本领域技术人员本身已知的类似这类设置。

另外的实施方案

现在转向图5A至图5D，将描述如本文所限定的喷嘴口的实施方案。

图5A示出了管嘴39a的实施方案，其中管嘴包括具有单个中心喷嘴口111的喷嘴板101，其中与喷嘴口的高度相比，喷嘴口的宽度更大。这里，喷嘴口是大体上椭圆形的。喷嘴口111提供在喷嘴板101的中心轴线上，使得该喷嘴口可以瞄准样品S的中心位置。宽高比为大约3∶1。

图5B示出了管嘴39a的实施方案，其中管嘴包括具有单个中心喷嘴口111的喷嘴板101，其中与喷嘴口的高度相比，喷嘴口的宽度更大。这里，喷嘴口111是大体上矩形的(具有圆化边缘)。喷嘴口提供在喷嘴板101的中心轴线上，使得该喷嘴口可以瞄准样品S的中心位置。宽高比为大约3∶1，类似于图5A。

图5C示出了管嘴39a的实施方案，其中管嘴包括具有单个中心喷嘴口111的喷嘴板101，其中与喷嘴口的高度相比，喷嘴口的宽度更大。这里，使用具有大约6∶1的宽高比的椭圆形喷嘴口。喷嘴口相对于喷嘴板101的中心稍微向上移动。这可有利于瞄准流在样品S上的冲击点。

图5D示出了管嘴39a的实施方案，其中管嘴包括具有单个中心喷嘴口111的喷嘴板101，其中与喷嘴口的高度相比，喷嘴口的宽度更大。比率为大约2∶1。

现在转向图6，示出了管嘴39a的实施方案，其中样品S和操纵工具T定位在该管嘴的前面。这里，管嘴39a包括具有矩形喷嘴口111的喷嘴板101，该矩形喷嘴口具有大约7:1的宽高比，其中宽度使得喷嘴口的尺寸超过样品载体S的尺寸。因此，喷嘴口也至少部分地指向刀具T上。利用这个实施方案，样品可以与较大的环状结构以及固持样品的工具一起被冷却。

这在图7a和图7b中更详细地示出。图7a示出了离开喷嘴口111的流型的前视图，并且图7b示出了该流型的侧视图。可以看出，流实质上是2D流，因为流线主要是Z和Y方向的函数，而X方向的函数较少。换句话说：图7B所示的流型在每个位置X处基本上类似。图7B示出了流以向上引导的流和向下引导的流分叉。这允许低温流体在样品上的速度在样品的高度(即，Y方向)上实质上恒定，并且与随着径向位置增大而导致流动速度降低的圆形喷嘴相比提供改进的冷却特性。

图7c示出了到样品上的液体冷却剂流的数值模拟，其中使用了两个喷嘴口111a、111b，样品S位于这两个喷嘴口111a、111b之间。穿过流动通道121a、121b向喷嘴口111a、111b提供液体冷却剂。可以使用柱塞装置或泵送机构。可以看出，液体冷却剂流被引导到样品S的正面并且也被引导到样品S的背面。如图7b所示的流型建立在样品S的正面F上。在背面B处，存在栅格环131，从而产生样品S中的凹入部分。与正面F相比，这有点影响该流。然而，在样品S的两侧上仍然存在分叉的流。

图8示出了本文所公开的方法和装置与EP4067860A1中所描述的多喷嘴设计之间的比较。可以看出，如本公开中所描述的细长的“信箱”形喷嘴口提供了朝向玻璃温度的更快的冷却速率，并且因此与先前的方法相比改善了冰质量。

所要保护由所附权利要求书赋予。

Claims (19)

1.一种制备低温样品的方法，通过所述方法使用冷冻剂对所述样品进行快速冷却，其中所述方法包括以下步骤：

-提供样品，所述样品包括在大体上平面的样本载体上提供的样本；

-提供用于将低温流体输送到所述样品的至少一个流动装置，其中所述流动装置包括用于将低温流体流引导到所述样品上的第一喷嘴；

-将所述样品定位在所述第一喷嘴旁边，并且提供流出所述第一喷嘴的低温流体流，使得所述样品被低温冷却；

其特征在于所述第一喷嘴的喷嘴口具有在第一方向上测量的宽度和在基本上垂直于所述第一方向的第二方向上测量的高度，其中所述宽度大于所述高度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宽度超过所述样本载体的在所述第一方向上测量的尺寸。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述高度小于所述样本载体的在所述第二方向上测量的尺寸。

4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述样本载体包括中心部分和周边部分，其中所述喷嘴口指向所述样本载体，使得所述中心部分和所述周边部分经历基本上相等的冷却速率。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述第一喷嘴的所述喷嘴口是大体上非圆形的，并且具体地说，其中所述第一喷嘴的所述喷嘴口是大体上矩形的。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述宽度基本上等于所述样本载体的在所述第一方向上测量的所述尺寸。

7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述高度小于所述样本载体的在所述第二方向上测量的所述尺寸的50％，具体地说小于所述尺寸的35％，更具体地说小于所述尺寸的20％。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其中宽高比在2∶1与10∶1之间，并且优选地是大约6∶1。

9.根据权利要求1至8所述的方法，其中所述第一喷嘴的所述喷嘴口被定位，使得宽度尺寸被定位成基本上水平的。

10.根据权利要求1至9所述的方法，其中所述第一喷嘴的所述喷嘴口的宽度是至少2.5mm，优选地是至少3.5mm。

11.根据权利要求1至10所述的方法，其中所述第一喷嘴的所述喷嘴口的高度在0.3mm与1mm之间，并且优选地是大约0.7mm。

12.根据权利要求1至11所述的方法，其中流出所述第一喷嘴的所述喷嘴口的所述流的速度在1.0m/s与20m/s之间，优选地在5.0m/s与11m/s之间，诸如8m/s。

13.根据权利要求1至12所述的方法，其中流出所述第一喷嘴的所述喷嘴口的所述低温流体的流动速率在2ml/s与80ml/s之间，优选地在25ml/s与55ml/s之间，诸如40ml/s。

14.根据权利要求1至13所述的方法，其中所述流动装置包括定位在距所述第一喷嘴一定距离处的第二喷嘴，并且其中所述方法包括以下另外的步骤：

将所述样品定位在所述第一喷嘴与所述第二喷嘴之间；以及

提供穿过所述第一喷嘴并且穿过所述第二喷嘴的低温流体流以从两个相对侧对所述样品进行低温冷却。

15.根据权利要求1至14所述的方法，其中所述第二喷嘴的喷嘴口是根据权利要求1至13中的一项实施的，并且具体地说，其中所述第二喷嘴的所述喷嘴口与所述第一喷嘴的所述喷嘴口相同。

16.根据权利要求1至15所述的方法，其中所述流动装置包括柱塞，其中：

-所述柱塞包括具有在所述柱塞的下侧上提供的入口的至少一个流动通道，其中在所述入口的下游，所述流动通道提供有所述第一喷嘴，并且其中所述柱塞包括用于将所述样品定位在所述柱塞的上侧中的间隙；

-在所述柱塞下方提供低温流体浴槽；

-使用对所述柱塞施加向下的压力的工具将所述样品插入到所述间隙中，由此使所述柱塞至少部分地浸没并且使得低温流体流出所述第一喷嘴。

17.一种用于制备低温样品的设备，通过所述设备使用冷冻剂对所述样品进行快速冷却，所述设备包括：

-用于将低温流体输送到所述样品的至少一个流动装置，其中所述流动装置包括用于将低温流体流引导到所述样品上的第一喷嘴；其特征在于所述第一喷嘴的喷嘴口具有在第一方向上测量的宽度和在基本上垂直于所述第一方向的第二方向上测量的高度，其中所述宽度大于所述高度。

18.根据权利要求17所述的设备，所述设备包括用于将样本施加到样本载体的施加装置。

19.根据权利要求17或18所述的设备，所述设备包括用于从所述样本载体去除过量液体的吸墨装置。