CN117982728A

CN117982728A - 一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用

Info

Publication number: CN117982728A
Application number: CN202410187462.2A
Authority: CN
Inventors: 杜田明; 牛煜淼; 耿子瑶; 陈嘉文; 乔爱科
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2024-02-20
Filing date: 2024-02-20
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2044-02-20

Abstract

本发明公开了一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用，属于自组装矿化胶原制备技术领域。一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，包括以下步骤：S1、制备水凝胶复合胶原支架；S2、在电动循环装置施加动态循环应力载荷的条件下进行复合胶原支架矿化。本发明采用上述一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用，所制备的矿化胶原材料完成了多尺度多层次的矿化，比传统的矿化胶原材料力学性能更强，且制备出的结构和力学性能都与人体骨组织有极高的匹配度，大大提高仿生矿化胶原的发展前景。

Description

一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用

技术领域

本发明涉及自组装矿化胶原制备技术领域，尤其是涉及一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用。

背景技术

骨组织是一种由无机物和有机物夹杂的复合物，是自然界最复杂的化合物之一，其主要由羟基磷灰石和胶原组成。有机物和无机物的完美结合使得骨具有良好的刚度和韧性。骨组织从纳米尺度到宏观尺度的复杂结构，使得生物矿化材料的力学性能优于人造材料。这也给仿生骨基质材料提出了更高的要求——通过改变仿生矿化胶原结构进而提升力学性能。

动态压应力作为骨生成过程中的必要因素，也可以影响骨的结构进而提升力学性能。但是，至今还未有制备出动态压应力介导下的体外仿生自组装矿化胶原的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用，旨在为胶原矿化提供持续稳定的循环应变的情况下，制备出胶原与磷灰石结合程度更高、与机体矿化胶原相似度更高、具有与真实骨相似的矿物质结构和承受机械载荷的仿生矿化胶原。

为实现上述目的，本发明提供了一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，包括以下步骤：

S1、制备水凝胶复合胶原支架；

S2、在电动循环装置施加动态循环应力载荷的条件下进行复合胶原支架矿化。

优选地，所述步骤S1中制备过程具体包括：

S1-1、向1％～3％的胶原溶液中加入2％醋酸和去离子水，迅速加入脱乙酰度≥95％的壳聚糖，滴入1M/L柠檬酸，搅拌10min；滴入1M/L CaCl₂，搅拌20min；加入10％EDC、2.5％NHS充分搅拌并调节pH为6.0，制得复合胶原溶液；

S1-2、将复合胶原溶液泵入环形聚丙烯模型中，反应12h后放入-20℃的环境下冷冻12h；

S1-3、待胶原柱体成型后取出，放入交联液中充分交联；

S1-4、交联反应结束后取出胶原柱体，用去离子水冲洗，每次2min，共冲洗三次，得到胶原和壳聚糖制得的胶原支架。

优选地，步骤S1-1中，壳聚糖溶质与胶原溶质的质量比为4:1，醋酸体积为胶原液体积的1～3％，去离子水体积为胶原溶液体积的5～15％，柠檬酸溶液体积为胶原溶液体积的5～15％，CaCl₂溶液体积为胶原溶液体积的4～12％，EDC溶液体积为胶原体积的5～15％，NHS溶液体积为胶原体积的5～15％。

优选地，步骤S1-3中交联液包括：0.25～1％NHS、1～4％EDC。

优选地，所述步骤S2中矿化包括：

S2-1、配置仿生矿化液：配置仿生矿化液：仿生矿化液中各物质的浓度：5mMCaCl₂、8.35mM NH₄HPO₄、50μg/L聚丙烯酸，pH为7.4；

S2-2、将胶原支架连接到电动循环加载装置中进行循环加载；

S2-3、循环加载结束后，将所得样品冲洗并进行冷冻干燥，得到自组装多尺度矿化胶原。

优选地，所述步骤S2-2循环加载过程中动态压缩应变的参数为1～4％、0.5Hz，循环加载时间12h，每小时前30min加载，后30min不加载。

因此，本发明采用上述一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用，具有如下技术效果：

(1)相较于传统的自组装胶原矿化的方法，本发明充分考虑了动态力学加载幅值、矿物质运输过程以及力学反馈在矿化中的影响，构建了以力学因素为主，多因素协同调节的仿生矿化体系，更好地模拟了体内复杂的骨基质矿化的过程，制备出更符合真实骨结构的骨基质材料；

(2)在复合胶原支架的矿化过程中施加动态循环应力载荷，通过促进矿物质渗入胶原和改变胶原表面的矿物质形态来促进胶原矿化，随着矿化胶原矿物体积分数的增加，其弹性模量也随之增加；

(3)利用有限元模拟分析矿物质运输规律，评估胶原与磷灰石的夹杂程度，结果表明矿化胶原内部的应力分布随着矿物质分布和含量的变化而变化，即本发明中的矿化胶原材料完成了多尺度多层次的矿化，比传统的矿化胶原材料力学性能更强，且制备出的结构和力学性能都与人体骨组织有极高的匹配度，大大提高仿生矿化胶原的发展前景。

附图说明

图1为本发明实施例一中矿化胶原制备流程图；

图2为本发明实施例一中电动循环加载装置结构示意图；其中(a)部分为主视图，(b)部分为轴测图；

图3为本发明实施例一中电动循环加载装置的力学加载曲线；

图4为本发明实验例一提供的矿化胶原的SEM图；

其中，A1-对比例一矿化4小时边缘位置的SEM电镜下观察的结构图；B1-对比例一矿化4小时中心位置的SEM电镜下观察的结构图；C1-对比例一矿化12小时边缘位置的SEM电镜下观察的结构图；D1-对比例一的矿化12小时的中心位置的SEM电镜下观察的结构图；

A2-实施例一矿化4小时边缘位置的SEM电镜下观察的结构图；B2-实施例一的矿化4小时中心位置的SEM电镜下观察的结构图；C2-实施例一矿化12小时边缘位置的SEM电镜下观察的结构图；D2-实施例一矿化12小时中心位置的SEM电镜下观察的结构图；

A3-对比例二矿化4小时边缘位置的SEM电镜下观察的结构图；B3-对比例二矿化4小时中心位置的SEM电镜下观察的结构图；C3-对比例二矿化12小时边缘位置的SEM电镜下观察的结构图；D3-对比例二矿化12小时中心位置的SEM电镜下观察的结构图；

图5为本发明实验例一提供的钙盐染色观察的矿化胶原宏观结构图；其中，A1-对比例一矿化4小时的钙盐染色结果图；B1-对比例一矿化12小时的钙盐染色结果图；A2-实施例一矿化4小时的钙盐染色结果图；B2-实施例一矿化12小时的钙盐染色结果图；A3-对比例二矿化4小时的钙盐染色结果图；B3-对比例二矿化12小时的钙盐染色结果图；

图6为发明实验例二提供的单轴压缩实验分析应力加载下制备的矿化胶原力学性能的压缩应力-应变曲线图和弹性模量图；其中，a部分为力学测试图像；b部分为实施例一、对比例一至二矿化4小时下的压缩应力-应变曲线；c部分为实施例一、对比例一至二矿化12小时下的压缩应力-应变曲线；d部分为由压缩应力-应变曲线计算的弹性模量；e部分为实施例一、对比例一至二矿化4小时及12小时下压缩弹性模量；f部分为实施例一、对比例一至二矿化4小时及12小时下矿化胶原弹性模量的增加速率；

图7为本发明实验例三提供的有限元模拟分析的应力加载下，矿化胶原矿化过程中的von Mises应力分布云图；其中，a部分为不同力学加载组，实施例一、对比例一至二矿化12小时下的矿化胶原应力分布随应变增加的云图；b部分为有限元模拟中胶原尺寸示意图，X为圆上任意一点到边缘的最短距离；c部分为实施例一(即实验组)同一应变下，应力分布随加载时间增加的云图。

附图标记

1、反应液器皿；2、夹具；3、升降台旋钮；4、滑块；5、滑轨；6、升降台；7、步进电机；8、竖直连接杆；9、水平连接杆。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例一

一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，流程如图1所示，具体包括如下步骤：

S1、制备交联胶原支架

反应原液为成都科乐生物制品公司购买的猪皮I型胶原，浓度范围在1％～3％。

S1-1、取25mL的1.5％I型胶原溶液，加入0.5mL 2％醋酸，加入去离子水2.5mL，迅速加入1.5g壳聚糖(脱乙酰度≥95％)，滴入2.5mL 1M/L柠檬酸，使用磁力搅拌机搅拌10min；滴入2mL 1M/L CaCl₂，再次搅拌20min；加入2.5mL 10％EDC、2.5mL 2.5％NHS，充分搅拌并调节pH为6.0，制得复合胶原溶液。

S1-2、将复合胶原溶液泵入内径为8mm，高度为40mm的环形聚丙烯模型中，待其反应12h后，放入-20℃的环境下冷冻12h，如图1中(a)所示。

S1-3、待胶原柱体成型后，将其取出，放入交联液中充分交联，交联液为0.25％NHS、1％EDC配置，PH为6，交联反应时间为24h，如图1中(b)、(c)所示。

S1-4、交联反应结束后取出胶原柱体，用去离子水冲洗，每次2min，共冲洗三次，得到胶原和壳聚糖制得的胶原支架，切割边缘不平整位置，得到胶原支架直径为8mm，高度为30mm。

S2、动态加载下制备矿化胶原

S2-1、配置仿生矿化液：包括5mM CaCl₂、8.35mM NH₄HPO₄、50μg/LPAA，pH为7.4，矿化液总量约为1.5L。

S2-2、将胶原支架连接到预制的电动循环加载装置中进行循环加载，使样品在矿化过程中的压缩应变可控，如图1中(d)所示。

电动循环加载装置如图2所示，包括反应液器皿1和升降台6，升降台6内设置升降台旋钮3。升降台6台面上设置步进电机7，步进电机7连接水平丝杠，水平丝杠上设置连接杆与反应液器皿1内的夹具2相连接，并控制夹具2水平移动。反应液器皿1底部设置滑轨5，夹具2底端设有与滑轨5配合的滑块4，以支撑夹具2随水平丝杠平稳移动。滑块4、滑轨5在使用时需要适当将其调到合适位置，防止由于不契合使得摩擦力过大或者过小影响速度。

如图2中(b)部分所示，连接杆包括水平连接杆9和竖直连接杆8，水平连接杆9与水平丝杠通过连轴连接。反应液器皿1、升降台6、水平连接杆9和竖直连接杆8之间横截面呈“n”型。

为了使滑轨5上的滑块4与步进电机7上的连轴能同步位移，需要将水平连接杆9完全水平于地面，即竖直连接杆8也需要完全垂直于地面，并且与电动机丝杆高度保持一致。

为了便于调节水平连接杆9和竖直连接杆8，设置了升降台6，保证滑块和滑轨摩擦力适中，滑块与电动机上的连轴可以同步运动。

同时，部分结构如滑块4、滑轨5、夹具2工作时浸在溶液中，易生锈，需要及时更换，升降台6的升降方便零件的更换。

为实现步进电机7对滑块往复运动的精确控制，还包括步进电机控制系统。步进电机控制系统由CNC可编程步进电机控制器、步进电机驱动器、步进电机7组成。

控制器能根据设定的程序生成脉冲信号，之后将脉冲信号传入步进电机驱动器。步进电机驱动器是一种将电脉冲转化为角位移的执行机构。当步进驱动器接收到一个脉冲信号，它就驱动步进电机7按设定的方向转动一个固定的角度(称为“步距角”)，它的旋转是以固定的角度一步一步运行的。最后，通过步进电机驱动器的驱动，水平丝杠上的连轴实现了位移和速度的精确控制，并将动力传导到滑块4上，实现对胶原程序化、精细化的加载。本实施例中使用的电机丝杆螺距是4mm，电机步距角是1.8°，该设备控制的精度为0.02mm。

矿化过程中，动态压缩应变的参数为1.5％，0.5Hz，样品加载12h，每小时前30min加载，后30min不加载，加载幅值曲线如图3所示。

S2-3、矿化结束后，将所得样品冲洗并进行冷冻干燥，得到自组装多尺度矿化胶原。

实施例二

一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，具体步骤与实施例一相同，不同之处在于：动态压缩应变的参数为2％。

对比例一

一种矿化胶原的制备方法，具体步骤与实施例一相同，不同之处在于：直接将胶原置于仿生矿化溶液中，矿化12h之后，将所得样品冲洗并进行冷冻干燥。

对比例二

一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，具体步骤与实施例一相同，不同之处在于：动态压缩应变的参数为6％。

实验例一

对实施例一(实验组)、对比例一(对照组1)、对比例二(对照组2)中的矿化胶原在矿化4h和12h情况下中心位置和边缘位置的扫描电镜图，结果如图4所示；实施例一(实验组)、对比例一(对照组1)、对比例二(对照组2)中的矿化胶原钙盐染色对比如图5所示。

由图4可知，矿化胶原的边缘部分的表面是粗糙的(图4中A和C)，在中央部分是非常光滑的(图4中B和E)。同时，由图5可知，矿化胶原的边缘部分颜色更深，中间部分颜色较浅。说明矿物质更多地分布于矿化胶原的表面。

力学加载下能够很好地调节矿物质的尺寸，力学幅值与矿物质的尺寸呈负相关(图4中A)。力学加载是促进矿物质进入矿化胶原内部的关键，如图4和图5中实验组和对比例二所示。同时，力学加载也是调整矿物质聚集形态的关键。如果不进行力学加载，矿物质不仅颗粒尺寸较大，且分布不均匀，进入矿化胶原内部较少，如图4和图5中对比例一所示。如果力学加载幅值过大，矿物质颗粒尺寸较小，聚集形态变成了泡沫结构，如图4中对比例二所示。高的边缘矿化和低的中心矿化也符合天然松质骨和致密骨的结构和分布，这可能在人工骨替代材料的制备中具有强大的作用。

实验例二

力学性能评价试验，具体操作如下：

通过单轴压缩实验(如图6中a所示)，分析矿化胶原基质在不同循环压缩应变(分为对照组(对比例一、二)、实验组(实施例一))下的力学性能。

取4、12h矿化胶原样品，测定分析其应力-应变曲线，如图6中b、c所示。同时，根据应力-应变曲线计算矿化胶原的弹性模量，如图6中d所示。结果显示，矿化胶原在12h的弹性模量明显高于矿化胶原在4h的弹性模量，这与天然骨的正常生长情况相似(图6中d)。

同时，矿化胶原在不同幅值循环压缩应变加载下的力学性能也存在明显差异。如图6中f所示，其中，幅值1.5％实验组弹性模量增加速率大于对照组。证实了实施例一中的矿化胶原材料具有良好的力学性能，同时说明，力学加载能通过影响矿物质的扩散和颗粒聚集形态，从而影响其力学性能。动态力学加载调控胶原体外仿生矿化有利于制备力学性能好，矿化形态贴近天然结构的骨修复材料，可用于后续体内承重部位骨修复。

实验例三

应力分布模拟分析实验

为了更准确地分析矿化胶原的矿物质和应力分布，建立了真实骨骼的应力分布模型。

实施例一及对比例一至二中所有矿化胶原动态加载模型均表现出边缘应力值高、中心应力值低的现象，如图7所示。然而，这种现象在各组中的表现各不相同，如图7中a所示。实施例一，即1.5％应变组，承受的应力值较高，说明其矿化度较好；对比例一、对比例二的应力未加载组和应力过大组矿化胶原杨氏模量较小，表现较差。

如图7中c所示，随着矿化时间的增加，由于矿物质以扩散的方式进入胶原支架，元素接受的矿物质越来越多，矿化胶原支架边缘和中部的von Mises应力值也随之增加，该结果与图4、图5中的电镜和钙盐染色结果一致，证明了力学加载是通过控制矿物质颗粒的扩散实现对矿化的调控的。

因此，本发明采用上述一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法及应用，所制备的矿化胶原材料完成了多尺度多层次的矿化，比传统的矿化胶原材料力学性能更强，且制备出的结构和力学性能都与人体骨组织有极高的匹配度，大大提高仿生矿化胶原的发展前景。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备水凝胶复合胶原支架；

2.根据权利要求1所述的一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，其特征在于，步骤S1中制备过程具体包括：

S1-3、待胶原柱体成型后取出，放入交联液中充分交联；

3.根据权利要求2所述的一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，其特征在于，步骤S1-1中，壳聚糖溶质与胶原溶质的质量比为4:1，醋酸体积为胶原液体积的1～3％，去离子水体积为胶原溶液体积的5～15％，柠檬酸溶液体积为胶原溶液体积的5～15％，CaCl₂溶液体积为胶原溶液体积的4～12％，EDC溶液体积为胶原体积的5～15％，NHS溶液体积为胶原体积的5～15％。

4.根据权利要求2所述的一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，其特征在于，步骤S1-3中交联液包括：0.25～1％NHS、1～4％EDC。

5.根据权利要求1所述的一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，其特征在于，步骤S2中矿化包括：

S2-1、配置仿生矿化液：仿生矿化液中各物质的浓度：5mM CaCl₂、8.35mM NH₄HPO₄、50μg/L聚丙烯酸，pH为7.4；

S2-2、将胶原支架连接到电动循环加载装置中进行循环加载；

6.根据权利要求5所述的一种动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法，其特征在于：步骤S2-2循环加载过程中动态压缩应变的参数为1～4％、0.5Hz，循环加载时间12h，每小时前30min加载，后30min不加载。

7.一种如权利要求1～6任一项所述的动态加载下制备自组装多尺度矿化胶原方法在提高自组装多尺度矿化胶原力学性能上的应用。