CN117980503A - 用于核酸测序的光学系统及其方法 - Google Patents

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CN117980503A CN202280064095.6A CN202280064095A CN117980503A CN 117980503 A CN117980503 A CN 117980503A CN 202280064095 A CN202280064095 A CN 202280064095A CN 117980503 A CN117980503 A CN 117980503A
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阿拉什·格尔巴尼
拉塞尔·胡迪玛
约翰·贝利
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Abstract

描述了荧光成像系统设计，其提供更大的视场、增加的空间分辨率、改善的调制传递和图像质量、更高的空间采样频率、当重新定位视场时图像捕获之间的更快过渡、改善的成像系统占空比和更紧凑的系统，从而使得能够以更低的成本进行用于基因组学和其他成像应用的更高通量图像采集和分析。

Description

用于核酸测序的光学系统及其方法
交叉引用
本申请要求于2021年7月21日提交的美国临时申请号63/224,351、于2022年4月25日提交的美国临时申请号63/334,613以及于2022年4月25日提交的美国临时申请号63/334,609的权益，其中的每一个通过引用全文并入本文。
背景技术
在典型的基于荧光的基因组测试测定中，例如，基因分型或核酸测序(使用实时、循环或逐步反应方案)，使用激发光源激发附接到拴系在基底上的核酸分子的染料分子，在基底上的一个或多个空间定位位置中生成荧光光子信号，并且随后通过光学系统将荧光成像到图像传感器上。然后使用分析过程来分析图像，找到标记分子(或克隆扩增的分子簇)在基底上的位置，并且根据波长和空间坐标来定量荧光光子信号，然后可以将其与特定化学反应(例如，杂交事件或碱基加成事件)在基底上的指定位置发生的程度关联起来。基于成像的方法提供了大规模的并行性和多重复用能力，这有助于降低此类技术的成本和可访问性。然而，例如，由于标记分子(或克隆扩增的分子簇)在基底表面的小区域内的过密堆积，或者由于图像中的低对比度噪声比(CNR)而引起的检测误差，可导致将荧光信号归因于正确分子(或克隆扩增的分子簇)的误差。
发明内容
本文公开的方面提供了系统，其包括：包括弯曲表面的基底，其中所述弯曲表面包括被配置为与分析物结合的至少一个结合部分；和包括光源的光学系统，其中所述光源被配置为将光引导至所述弯曲表面，并且其中所述光被配置为探测与所述至少一个结合部分结合的所述分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述分析物包括核酸。在一些实施方案中，所述至少一个结合部分包括被配置为与所述核酸结合的至少一个核酸。在一些实施方案中，所述弯曲表面是流动池的部件。在一些实施方案中，所述系统还包括流动池，其中所述流动池包括所述弯曲表面。在一些实施方案中，所述弯曲表面包括流动池的毛细管。在一些实施方案中，所述弯曲表面包括玻璃、聚合物或其组合。在一些实施方案中，所述光源被配置为以落射荧光配置探测所述弯曲表面。在一些实施方案中，所述光源被配置为以透射配置探测所述弯曲表面。在一些实施方案中，所述光源是激光器、发光二极管、卤素灯或白炽灯。在一些实施方案中，所述光源被配置为生成具有约500纳米(nm)至540nm、620nm至650nm、或460nm至500nm波长的所述光。在一些实施方案中，所述系统还包括第二弯曲表面。在一些实施方案中，所述系统还包括焦移组件，其被配置为在所述弯曲表面与所述第二弯曲表面之间移动焦场。在一些实施方案中，所述焦移组件包括至少一个可移动透镜。在一些实施方案中，所述至少一个可移动透镜布置在透镜镜筒内。在一些实施方案中，所述焦移组件包括至少一个可移动棱镜。在一些实施方案中，所述弯曲表面和所述第二弯曲表面是流动池的基本上圆柱形部件的不同部分。在一些实施方案中，所述第二弯曲表面包括被配置为与第二分析物结合的至少一个第二结合部分。在一些实施方案中，所述光学系统相对于所述弯曲表面是可移动的。在一些实施方案中，所述光学系统绕所述弯曲表面是可旋转的。在一些实施方案中，所述光学系统被配置为对多个结合部分进行成像。在一些实施方案中，所述弯曲表面具有25微米(μm)的平坦度偏差。在一些实施方案中，所述弯曲表面具有大于所述光学系统的焦深的平坦度偏差。在一些实施方案中，所述系统还包括多个子光学系统，其中所述多个子光学系统彼此不平行。在一些实施方案中，所述多个子光学系统中的每个子光学系统被单独布置成与所述弯曲表面的多条切线垂直。在一些实施方案中，所述系统还包括台，其中所述弯曲表面布置在所述台上。在一些实施方案中，所述台包括倾斜台、旋转台、平移台或其任何组合。在一些实施方案中，所述弯曲表面包括与其偶联的亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述至少一个结合部分与所述亲水性聚合物偶联。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。在一些实施方案中，所述系统具有至多约0.6的数值孔径。在一些实施方案中，所述数值孔径是至多约0.25。在一些实施方案中，所述系统还包括成像传感器，其被配置为在所述引导至所述弯曲表面之后收集所述光。在一些实施方案中，所述系统还包括被配置为加热所述表面的加热器。在一些实施方案中，所述加热器是集成加热器。在一些实施方案中，所述加热器是红外加热器。
本文公开的方面提供了系统，其包括：流动池；和光学系统，所述光学系统包括：光源，所述光源被配置为将所述第一光引导至所述流动池；滤光器，所述滤光器被配置为(i)从所述流动池接收第二光并且(ii)传送第三光，其中所述第三光包括所述第二光的至少一部分并且不包括所述第一光；和传感器，所述传感器被配置为从所述滤光器接收所述第三光。在一些实施方案中，系统还包括布置在所述光源与所述滤光器之间的聚焦元件组件，其中所述聚焦元件组件被配置为聚焦来自所述流动池和所述传感器的所述第二光。在一些实施方案中，所述聚焦元件组件包括第一聚焦元件和第二聚焦元件，其中所述第一聚焦元件沿着所述光源与所述传感器之间的光路布置在所述滤光器与所述第二聚焦元件之间。在一些实施方案中，所述聚焦元件组件包括楔形块组件，并且其中所述第一聚焦元件包括第一楔形件，并且所述第二聚焦元件包括第二楔形件。在一些实施方案中，所述第一楔形件和所述第二楔形件由熔融二氧化硅组成。在一些实施方案中，所述第一楔形件和所述第二楔形件具有包括约1.5的折射率。在一些实施方案中，所述系统还包括与所述第一楔形件耦合的压电驱动器。在一些实施方案中，所述系统还包括在所述第一楔形件与所述第二楔形件之间的间隙。在一些实施方案中，所述系统还包括容纳所述流动池的外壳。在一些实施方案中，所述外壳还容纳在楔形块-压电驱动器组件中的所述楔形块和所述压电驱动器。在一些实施方案中，所述楔形块–压电驱动器组件布置在所述传感器与所述流动池之间。在一些实施方案中，所述系统还包括台。在一些实施方案中，所述台是倾斜台、旋转台、平移台或其组合。在一些实施方案中，所述光学系统还包括被配置用于初始聚焦的自动聚焦元件。在一些实施方案中，所述系统还包括透镜镜筒。在一些实施方案中，所述自动聚焦元件容纳在所述透镜镜筒内。在一些实施方案中，所述流动池包括一个或多个内表面，所述内表面具有与其偶联的亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述流动池还包括与所述亲水性聚合物层偶联的多种生物聚合物。在一些实施方案中，所述流动池包括第一内表面和第二内表面，其中所述第一内表面布置在所述传感器与所述第二内表面之间。在一些实施方案中，所述第一内表面和所述第二内表面包括与其偶联的生物聚合物。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物层包含聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。在一些实施方案中，所述滤光器包括多带滤光器。在一些实施方案中，所述多带滤光器包括三带阻带滤光器。在一些实施方案中，所述光学系统还包括布置在所述滤光器与所述流动池之间的成像光学器件。在一些实施方案中，所述成像光学器件具有包括1x的缩减。在一些实施方案中，所述光学系统具有包括大于1毫米(mm)2的视场(FOV)。在一些实施方案中，所述光学系统具有包括小于0.6的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，所述NA包括约0.25。在一些实施方案中，所述传感器包括多个成像传感器，所述成像传感器被配置为捕获所述FOV。在一些实施方案中，所述光源包括多个光源，所述多个光源包括：第一光源，其被配置为发射包括第一波长范围的所述第一光；第二光源，其被配置为发射包括第二波长范围的第二光；和第三光源，其被配置为发射包括第三波长范围的第三光，其中所述第一波长范围、所述第二波长范围和所述第三波长范围是不同的波长范围。在一些实施方案中，由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团。在一些实施方案中，由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团；并且由所述第二光源的所述第二波长范围激发的所述第二荧光团不同于由所述第三光源的所述第三波长范围激发的第三荧光团。在一些实施方案中，由所述第三光源的所述第三波长范围激发的第三荧光团不同于由所述第一光源的所述第一波长范围激发的所述第一荧光团。在一些实施方案中，所述第一光源的所述第一波长范围包括在约500至约540纳米(nm)之间。在一些实施方案中，所述第二光源的所述第二波长范围包括在约620至约640nm之间。在一些实施方案中，所述第三光源的所述第三波长范围包括在约460至约500nm之间。在一些实施方案中，所述流动池包括内表面，所述内表面包括多个离散区域，其中(i)所述多个离散区域中的第一离散区域包括在所述第一离散区域处与所述内表面偶联的第一组的核酸分子，并且(ii)所述多个离散区域中的第二离散区域包括在所述第二离散区处与所述内表面偶联的第二组的所述核酸分子，其中所述第一组的所述核酸分子不同于所述第二组的所述核酸分子。在一些实施方案中，所述第一组的所述核酸分子包含与其偶联的第一荧光团，并且所述第二组的所述核酸分子包含与其偶联的第二荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团。在一些实施方案中，所述多个离散区域中的第三离散区域包括在所述第三离散区域处与所述内表面偶联的第三组的所述核酸分子，并且其中所述第三组的所述核酸分子不同于所述第一组和所述第二组的所述核酸分子。在一些实施方案中，所述第三组的所述核酸分子包含与其偶联的第三荧光团，其中所述第三荧光团不同于第二第一荧光团和所述第二荧光团。在一些实施方案中，所述多个离散区域中的第四离散区域包括在所述第四离散区域处与所述内表面偶联的第四组的核酸分子，并且其中所述第四组的核酸分子包含所述第一荧光团和所述第三荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第三荧光团。在一些实施方案中，所述光源包括发光二极管(LED)光源。在一些实施方案中，所述光学系统还包括光传输部件。在一些实施方案中，所述光传输部件包括波导、光管、光纤或其组合。在一些实施方案中，所述光源包括固态光源。在一些实施方案中，所述系统还包括加热器。在一些实施方案中，所述加热器是集成加热器。在一些实施方案中，所述集成加热器是透明加热器块集成加热器。在一些实施方案中，所述加热器是红外(IR)加热器。在一些实施方案中，所述光学系统不包括二向色元件。在一些实施方案中，所述光学系统不包括镜筒透镜。在一些实施方案中，所述光学系统不包括校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路。在一些实施方案中，所述光学系统不包括激光器。在一些实施方案中，所述光学系统不包括以下的任何组合：二向色元件；镜筒透镜；校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述传感器之间的所述光路；激光器。在一些实施方案中，所述流动池布置在所述光源与所述传感器之间。
本文公开的方面提供了系统，其包括：被配置为照射样品的光源；被配置为获得被照射的所述样品的图像的传感器；和沿着所述光源与所述传感器之间的光路永久布置的聚焦元件，其中聚焦元件组件包括：外壳；第一聚焦元件；和第二聚焦元件，其中所述第一聚焦元件被配置为在所述外壳内相对于所述第二聚焦元件移动，而不相对于所述光路移动所述外壳。在一些实施方案中，所述系统还包括多个所述光源，其中所述多个光源中的每个光源发射具有不同波长的光。在一些实施方案中，所述系统还包括多个所述传感器，其中所述多个所述传感器中的每个传感器被配置为在不同时间获得所述样品的所述图像。在一些实施方案中，所述系统还包括沿着所述光源与所述传感器之间的所述光路布置的滤光器，其中所述滤光器被配置为从所述样品接收光并将另一个光传送至所述传感器。在一些实施方案中，所述滤光器包括多带滤光器。在一些实施方案中，所述多带滤光器包括三带阻带滤光器。在一些实施方案中，所述第一透镜在所述光路中被放置在所述第二透镜之前。在一些实施方案中，所述第一透镜在所述光路中被放置在所述第二透镜之后。在一些实施方案中，所述样品与流动池的一个或多个内表面偶联。在一些实施方案中，所述样品与所述流动池的所述一个或多个内表面共价偶联。在一些实施方案中，所述样品与流动池的两个或更多个内表面偶联。在一些实施方案中，所述样品与所述流动池的所述两个或更多个内表面共价偶联。在一些实施方案中，所述流动池的所述两个或更多个内表面包括第一内表面和第二内表面，并且其中所述第一内表面沿着在所述光源与所述第二内表面之间的所述光路布置。在一些实施方案中，所述一个或多个内表面包括与其偶联的亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述一个或多个内表面包括与其偶联的亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述样品包含与所述亲水性聚合物层偶联的多种生物聚合物。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物层包含聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。在一些实施方案中，所述系统具有包括大于1毫米(mm)2的视场(FOV)。在一些实施方案中，所述系统具有包括小于0.6的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，所述NA包括约0.25。在一些实施方案中，所述传感器包括多个成像传感器，所述成像传感器被配置为捕获所述FOV。在一些实施方案中，所述聚焦元件组件包括楔形块组件，并且其中所述第一聚焦元件包括第一楔形件，并且所述第二聚焦元件包括第二楔形件。在一些实施方案中，所述第一楔形件和所述第二楔形件由熔融二氧化硅组成。在一些实施方案中，所述第一楔形件和所述第二楔形件具有包括约1.5的折射率。在一些实施方案中，所述系统还包括在所述第一聚焦元件与所述第二聚焦元件之间的间隙。
本文公开的方面提供了对样品进行成像的方法，所述方法包括：提供本文所述的所述系统；用来自所述光源的所述光照射所述样品，其中所述样品与所述流动池的一个或多个内表面偶联；通过从与所述流动池的所述一个或多个内表面偶联的所述样品接收所述第二光并将第三光传送至所述传感器，由所述滤光器过滤所述第二光；以及用所述传感器获得所述样品的图像。在一些实施方案中，所述样品包含生物聚合物，其中所述生物聚合物的第一子集与所述流动池的所述一个或多个内表面的第一内表面偶联，并且所述生物聚合物的第二子集与所述流动池的所述一个或多个内表面的第二内表面偶联。在一些实施方案中，所述用所述传感器获得所述样品的所述图像包括对所述流动池的所述第一内表面和所述第二内表面进行成像。
本文公开的方面提供了对样品进行成像的方法，所述方法包括：提供本文公开的所述系统；通过所述光源照射所述样品；用所述聚焦元件组件聚焦从所述样品发射的光；以及接收来自(c)的所述光并通过所述传感器获得所述样品的图像。在一些实施方案中，所述样品包含生物聚合物，其中所述生物聚合物的第一子集与流动池的第一内表面偶联，并且所述生物聚合物的第二子集与流动池的第二内表面偶联。在一些实施方案中，所述用所述传感器获得所述样品的所述图像包括对所述流动池的所述第一内表面和所述第二内表面进行成像。在一些实施方案中，所述第一内表面和所述第二内表面包括与其偶联的亲水性聚合物层。在一些实施方案中，所述通过所述传感器获得所述样品的所述图像包括对大于4mm2的视场(FOV)进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述样品进行测序。在一些实施方案中，所述测序包括进行结合测序(sequencing-by-binding)或合成测序(sequencing-by-synthesis)。在一些实施方案中，所述测序包括：提供可检测核苷酸缀合物，所述可检测核苷酸缀合物包含(i)共同核心、(ii)多个标记和(iii)与所述共同核心偶联的多个核苷酸；在防止所述多个核苷酸的核苷酸与多个引发的核酸序列的互补核苷酸之间形成磷酸二酯键的条件下，使所述样品的所述多个引发的核酸序列与所述可检测核苷酸缀合物接触，其中所述第一多个核苷酸的所述核苷酸与所述多个引发的核酸序列的引发的核酸序列中的所述互补核苷酸稳定偶联；检测来自所述可检测核苷酸缀合物的所述多个标记的信号，从而鉴定所述引发的核酸序列的所述互补核苷酸；以及用不同的可检测核苷酸缀合物进行(a)至(c)以检测第二信号，从而鉴定所述引发的核酸序列中的另一个互补核苷酸。
在一方面，本公开提供了一种系统，其包括：弯曲基底，其中所述弯曲基底包括被配置为与分析物结合的至少一个结合部分；和包括光源的光学系统，其中所述光源被配置为将来自所述光源的光引导至所述弯曲基底，并且其中所述光被配置为探测与所述弯曲基底结合的所述分析物的存在或不存在。
在一些实施方案中，所述分析物包括核酸。在一些实施方案中，所述至少一个结合部分包括被配置为与所述核酸结合的至少一个核酸。在一些实施方案中，所述弯曲基底是流动池的部件。在一些实施方案中，所述系统还包括流动池，其中所述流动池包括所述弯曲基底。在一些实施方案中，所述弯曲基底包括流动池的毛细管。在一些实施方案中，所述弯曲基底包括玻璃、聚合物或其组合。在一些实施方案中，所述光源被配置为以落射荧光配置探测所述弯曲基底。在一些实施方案中，所述光源被配置为以透射配置探测所述弯曲基底。在一些实施方案中，所述光源是激光器、发光二极管、卤素灯或白炽灯。在一些实施方案中，所述光源被配置为生成具有约500纳米(nm)至540nm、620nm至650nm、或460nm至500nm波长的所述光。在一些实施方案中，所述系统还包括第二弯曲基底。在一些实施方案中，所述系统还包括焦移组件，其被配置为在所述弯曲基底与所述第二弯曲基底之间移动焦场。在一些实施方案中，所述焦移组件包括至少一个可移动透镜。在一些实施方案中，所述至少一个可移动透镜布置在透镜镜筒内。在一些实施方案中，所述焦移组件包括至少一个可移动棱镜。在一些实施方案中，所述弯曲基底和所述第二弯曲基底是流动池的基本上圆柱形部件的不同部分。在一些实施方案中，所述第二弯曲基底包括被配置为与第二分析物结合的至少一个第二结合部分。在一些实施方案中，所述光学系统相对于所述弯曲基底是可移动的。在一些实施方案中，所述光学系统绕所述弯曲基底是可旋转的。在一些实施方案中，所述光学系统被配置为对多个结合部分进行成像。在一些实施方案中，所述弯曲基底具有25微米(μm)的平坦度偏差。在一些实施方案中，所述弯曲基底具有大于所述光学系统的焦深的平坦度偏差。在一些实施方案中，所述系统还包括多个子光学系统，其中所述多个子光学系统彼此不平行。在一些实施方案中，所述多个子光学系统中的每个子光学系统被单独布置成与所述弯曲基底的多条切线垂直。在一些实施方案中，所述系统还包括台，其中所述弯曲基底布置在所述台上。在一些实施方案中，所述台包括倾斜台、旋转台、平移台或其任何组合。在一些实施方案中，所述弯曲基底包括与其偶联的亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述至少一个结合部分与所述亲水性聚合物偶联。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。在一些实施方案中，所述系统具有至多约0.6的数值孔径。在一些实施方案中，所述数值孔径是至多约0.25。在一些实施方案中，所述系统还包括成像传感器，其被配置为在所述引导至所述弯曲基底之后收集所述光。在一些实施方案中，所述系统还包括被配置为加热所述基底的加热器。在一些实施方案中，所述加热器是集成加热器。在一些实施方案中，所述加热器是红外加热器。
在另一方面，本公开提供了一种系统，其包括：弯曲基底；和包括光源的光学系统，其中所述光源被配置为将来自所述光源的光引导至所述弯曲基底。
在另一方面，本公开提供了一种系统，其包括：基底；和光学系统，其中所述光学系统被配置为对所述基底的至少约5平方毫米(mm2)的区域进行成像。
在一些实施方案中，所述光学系统被配置为同时对所述区域进行成像。在一些实施方案中，所述光学系统包括多个子光学系统。在一些实施方案中，所述多个子光学系统被配置为平行地对所述基底的所述区域进行成像。在一些实施方案中，所述光学系统包括被配置为提供光束的光源和透镜，其中所述透镜被配置为将来自所述光源的光束聚焦到包括所述区域的所述基底的聚焦区域上。在一些实施方案中，所述光束在所述聚焦区域上的均匀性为至少约90％。在一些实施方案中，所述基底基底的所述区域被布置为中空圆柱体。在一些实施方案中，所述基底是毛细管流动池的至少一部分。在一些实施方案中，所述毛细管流动池包括固体核心。在一些实施方案中，所述系统还包括台，其中所述基底布置在所述台上。在一些实施方案中，所述台包括倾斜台、旋转台、平移台或其任何组合。在一些实施方案中，所述基底包括与其偶联的亲水性聚合物。在一些实施方案中，所述至少一个结合部分与所述亲水性聚合物偶联。在一些实施方案中，所述亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。在一些实施方案中，所述系统具有至多约0.6的数值孔径。在一些实施方案中，所述数值孔径是至多约0.25。在一些实施方案中，所述系统还包括成像传感器，其被配置为在所述引导至所述基底之后收集所述光。在一些实施方案中，所述系统还包括被配置为加热所述基底的加热器。在一些实施方案中，所述加热器是集成加热器。在一些实施方案中，所述加热器是红外加热器。在一些实施方案中，所述基底是弯曲基底。在一些实施方案中，所述弯曲基底具有25微米(μm)的平坦度偏差。在一些实施方案中，所述弯曲基底具有大于所述光学系统的焦深的平坦度偏差。在一些实施方案中，所述光学系统被配置为以约1μm或更小的分辨率对所述基底的所述区域进行成像。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请通过引用全文并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用全文并入。如果本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间存在冲突，则以本文中的术语为准。
附图说明
发明性概念的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所附图中：
图1A-图1B示意性地示出了对双表面载体结构成像的非限制性示例，其用于呈现样品位点以通过本文公开的成像系统进行成像。图1A：对流动池前和后内表面成像的图示。图1B：对基底的前和后外表面成像的图示。
图2A-图2B示出了包括二向色分束镜的多通道荧光成像模块的非限制性示例，所述二向色分束镜用于将激发光束传输至样品，并且接收所产生的荧光发射并将所产生的荧光发射通过反射重定向至四个检测通道，所述四个检测通道被配置为检测四个不同对应波长或波段的荧光发射。图2A：等距俯视图。图2B：等距仰视图。
图3A-图3B示出了图2A和图2B的多通道荧光成像模块内的光路，该多通道荧光成像模块包括二向色分束镜，所述二向色分束镜用于将激发光束传输至样品，并且接收所产生的荧光发射并将所产生的荧光发射通过反射重定向至四个检测通道，所述四个检测通道用于检测四个不同对应波长或波段的荧光发射。图3A：俯视图。图3B：侧视图。
图4是说明二向色滤光器性能与光束入射角之间的关系的图。
图5是说明光束占用面积大小与二向色滤光器上的光束入射角之间的关系的图。
图6A-图6B示意性地说明了多通道荧光成像模块的二向色滤光器和检测通道的示例性配置，其中二向色滤光器具有倾斜的反射表面，使得入射光束与二向色滤光器的反射表面之间的角度(例如，中心角)小于45。图6A：包括四个检测通道的多通道荧光成像模块的示意图。图6B：说明光束在二向色反射器上的入射角(AOI)的详细视图。
图7提供了说明对应于图6A和图6B中所示的成像模块配置的改善二向色滤光器性能的图。
图8提供了说明对应于图6A和图6B中所示的成像模块配置的改善二向色滤光器性能的图。
图9A-图9B提供了说明由图6A和图6B的成像模块配置产生的表面变形减少的图。图9A说明了折叠角度对通过向最后一个反射镜添加1波PV球光焦度引起的图像质量劣化的影响。图9B说明了折叠角度对通过向最后一个反射镜添加0.1波PV球光焦度引起的图像质量劣化的影响。
图10A-图10B提供了说明由使用激发光束的s偏振产生的改善激发滤光器性能(例如，通带与周围阻带之间的更陡峭过渡)的图。图10A：在40度和45度的入射角下的示例性带通二向色滤光器的透射光谱，其中入射光束是线性偏振的并且相对于二向色滤光器的平面是p偏振的。图10B：改变光源相对于二向色滤光器的取向，使得入射光束相对于二向色滤光器的平面是s偏振的，导致通带与阻带之间的边缘明显更陡峭。
图11A-图11B说明了本文公开的具有0.3的数值孔径(NA)的示例性双表面成像系统的调制传递函数(MTF)。图11A：第一表面。图11B：第二表面。
图12A-图12B说明了本文公开的具有0.4的NA的示例性双表面成像系统的MTF。图12A：第一表面。图12B：第二表面。
图13A-图13B说明了本文公开的具有0.5的NA的示例性双表面成像系统的MTF。图13A：第一表面。图13B：第二表面。
图14A-图14B说明了本文公开的具有0.6的NA的示例性双表面成像系统的MTF。图14A：第一表面。图14B：第二表面。
图15A-图15B说明了本文公开的具有0.7的NA的示例性双表面成像系统的MTF。图15A：第一表面。图15B：第二表面。
图16A-图16B说明了本文公开的具有0.8的NA的示例性双表面成像系统的MTF。图16A：第一表面。图16B：第二表面。
图17A-图17B提供了用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的所计算的斯特列尔比的图。图17A：对于不同物镜和/或光学系统数值孔径，作为中间流体层厚度(流体通道高度)的函数的用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的斯特列尔比的图。图17B：针对通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像和厚度为0.1mm的中间水层，作为数值孔径的函数的斯特列尔比的图。
图18提供了本公开的双波长激发/四通道发射荧光成像系统的示意图。
图19提供了用于物镜设计的光射线追迹图，所述物镜设计被设计为用于对0.17mm厚的盖玻片相对侧的表面成像。
图20提供了当用于对0.17mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图21提供了当用于对0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中说明的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图22提供了当用于对与0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图23提供了当用于对1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图24提供了当用于对与1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图19中说明的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图25提供了用于镜筒透镜设计的射线追迹图，如果与图19中说明的物镜结合使用，则所述镜筒透镜设计提供通过1mm厚的盖玻片的改善的双面成像。
图26提供了当用于对1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图25中说明的物镜和镜筒透镜的组合的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图27提供了当用于对与1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图25中说明的物镜和镜筒透镜的组合的随空间频率变化的调制传递函数的图。
图28提供了用于本公开的镜筒透镜设计(左)的射线追迹图，所述设计已被优化以提供高质量的双面成像性能。因为镜筒透镜不再进行无限远校正，因此可以将适当设计的补偿透镜(右)与镜筒透镜结合使用，以补偿非无限远校正的镜筒透镜，用于制造和测试目的。
图29图示了具有2个流体适配器的单个毛细管流动池的一个非限制性示例。
图30图示了流动池盒的一个非限制性示例，该流动池盒包括底座、流体适配器和任选的其他部件，并且被设计成容纳两个毛细管。
图31图示了系统的一个非限制性示例，该系统包括连接到各种流体流量控制部件的单个毛细管流动池，其中该单个毛细管与在显微镜载物台上或在定制成像仪器中的安装兼容，以用于各种成像应用。
图32说明了系统的一个非限制性实例，所述系统包括具有集成隔膜阀的毛细管流动池盒，以减少或最小化死体积并保存某些关键试剂。
图33说明了系统的一个非限制性实例，所述系统包括毛细管流动池、显微镜设置和温度控制机构。
图34说明了通过使用与流动池盒接触放置的金属板来控制毛细管流动池的温度的一个非限制性实例。
图35说明了用于包括非接触式热控制机构的毛细管流动池的温度控制的一种非限制性方法。
图36A-图36C说明了流动池装置制造的非限制性实例。图36A说明了一件式玻璃流动池的制备。图36B说明了两件式玻璃流动池的制备。图36C说明了三件式玻璃流动池的制备。
图37A-图37C说明了玻璃流动池设计的非限制性实例。图37A说明了一件式玻璃流动池设计。图37B说明了两件式玻璃流动池设计。图37C说明了三件式玻璃流动池设计。
图38说明了毛细管管腔中的簇(例如，聚合酶集落(polony))扩增的可视化。
图39提供了如本文公开的测序系统的框图的非限制性实例。
图40提供了如本文公开的测序方法的流程图的非限制性实例。
图41提供了如本文公开的结构化照射系统的示意图的非限制性实例。
图42提供了用于获取和处理如本文公开的流动池表面的结构化照射图像的流程图的非限制性实例。
图43A-图43B提供了如本文公开的多重复用读磁头的非限制性示意图。图43A：多重复用读磁头的侧视图，其中单个显微荧光计被配置为对公共表面(例如，流动池的内表面)进行成像。图43B：多重复用读磁头的顶视图，说明了由多重复用读磁头的单个显微荧光计获取的成像路径。
图44A-图44B提供了如本文公开的多重复用读磁头的非限制性示意图。图44A：多重复用读磁头的侧视图，其中多个单个显微荧光计4401的第一子集被配置为对第一表面(例如，流动池的第一内表面)进行成像，并且多个单个显微荧光计的第二子集被配置为对第二表面(例如，流动池的第二内表面)进行成像。图44B：图44A的多重复用读磁头的顶视图，说明了由多重复用读磁头的单个显微荧光计4401获取的成像路径。
图45说明了根据本文的一些实施方案的光学成像系统的非限制性实例，所述光学成像系统具有多个成像传感器，所述成像传感器被配置用于通过多个光源顺序照射后对流动池进行透射成像，每个光源发射不同的颜色。将液体样品引入疏水垫上的流动池中，并通过拉力流过流动池。
图46提供了根据本文的一些实施方案的利用光学系统对流动池的表面成像以进行核酸测序的方法的非限制性示意图。
图47A-图47B提供了根据本文所述的各种实施方案的光学系统。图47A提供了根据本文的一些实施方案的用于对流动池的表面进行成像的光学系统的非限制性剖面图。图47B提供了图47A的光学系统与IDEX仪器核心的比较。
图48A提供了通过图47B中所示的IDEX仪器核心成像的具有424个单独分片的流动池的非限制性示例。图48B提供了通过本文所述的光学系统成像的具有<40个单独分片的流动池的非限制性示例(参见图45、46、47A-47B)。
图49A-图49B提供了被配置用于双面流动池的双面成像的光学系统的非限制性剖面图。如图所示的光学系统包括用于快速聚焦的压电驱动楔形块。图49A说明了被配置为聚焦在流动池的后内表面上的光学系统。图49B说明了被配置为聚焦在流动池的前内表面上的光学系统。
图50提供了被配置用于对大面积表面进行成像的光学系统的非限制性剖面图。所述光学系统包括多个光学子系统，其中每个子系统的优化FOV与每个相邻光学子系统的FOV重叠，从而提供大面积FOV。
图51A-图51B提供了聚焦透镜组件的非限制性剖面图。聚焦透镜组件被配置为在光路(例如，光轴)内维持固定位置，并且允许容纳在聚焦透镜组件的透镜外壳内的至少第一透镜与第二透镜之间的相对运动。图51A示出了具有第一透镜和第二透镜的聚焦透镜组件。图51B示出了与图51A相比具有第二透镜的相对移动的相同聚焦透镜组件。
图52提供了被配置用于对弯曲大面积表面进行成像的光学系统的非限制性剖面图。所述光学系统包括多个光学子系统，其中每个系统被放置成与表面近似正交，并且其中每个子系统的FOV与每个相邻光学子系统的FOV重叠，从而提供用于对弯曲大面积表面进行成像的系统。
图53A-图53B提供了被配置为对毛细管流动池进行成像的光学系统的非限制性剖面图。在此实例中，被配置为对弯曲大面积表面进行成像的光学系统绕x轴旋转并沿x轴平移，以获得毛细管流动池的整个内表面的图像。图53A说明了与z轴对准的中心光学子系统的光轴。图53B说明了旋转90度以与y轴对准的中心光学子系统的光轴。
图54A-图54B提供了被配置为对毛细管流动池进行成像而无需台来使光学系统绕x轴旋转的光学系统的非限制性剖面图。如图所示的光学系统包括用于快速聚焦的压电驱动楔形块。图54A说明了被配置为聚焦在距离光源最近的毛细管流动池的内表面上的光学系统。图54B说明了被配置为聚焦在距离光源更远的毛细管流动池的内表面上的光学系统。
图55是示出通过使各种荧光标记的多价分子与对应的正确DNA模板反应而进行的捕获测定的结果的条形图。
图56是示出捕获测定的结果的条形图，其中使增加浓度的各种荧光标记的多价分子与对应的正确DNA模板反应。
图57呈现了四个示出捕获测定的结果的图，比较了携带核苷酸臂的荧光标记的多价分子的信号强度，所述核苷酸臂包含N3-接头、接头-6、接头-8或炔丙基接头。用CF680或CF532荧光团标记多价分子。测试两个不同浓度的多价分子(20和80nM)。所述图示出了以秒为单位的捕获时间(x轴)和P90信号强度(y轴)。
图58呈现了四个示出捕获测定的结果的图，比较了携带核苷酸臂的荧光标记的多价分子的信号强度，所述核苷酸臂包含N3-接头、接头-6、接头-8或炔丙基接头。用AF647或CF570荧光团标记多价分子。测试两个不同浓度的多价分子(20和80nM)。所述图示出了以秒为单位的捕获时间(x轴)和P90信号强度(y轴)。
图59呈现了三个示出实时成像捕获动力学测定的结果的图，比较了携带核苷酸臂的荧光标记的多价分子的信号强度，所述核苷酸臂包含接头6或10-16中的一个。测试三个不同浓度的多价分子(15、7.5和2.5nM)。所述图示出了以秒为单位的捕获时间(x轴)和信号强度(y轴)。
图60是示出携带核苷酸臂的荧光标记的多价分子的结合动力学研究的结果的图，所述核苷酸臂包含接头6或10-16中的一个。所述图示出了多价分子浓度(x轴，nM)和速率(y轴)。图14中所示的图例也适用于图13。
图61是示出针对携带核苷酸臂的荧光标记的多价分子确定的结合常数(K)的条形图，所述核苷酸臂包含接头6或10-16中的一个。
图62大体上示出了根据一些实施方案的组合亲合力测序系统的实例。
图63示出了被编程或以其他方式被配置为实现本文提供的方法的计算机系统。
具体实施方式
需要荧光成像方法和系统，其为基因组学应用提供增加的光学分辨率和改善的图像质量，从而导致基因组测试准确性的对应改善。本文公开了用于高性能荧光成像方法和系统的光学系统设计，其可以为基于荧光成像的基因组学应用提供改善的光学分辨率(包括高性能光学分辨率)、改善的图像质量和更高的通量中的任一个或多个。所公开的光学照射和成像系统设计可以提供以下优点中的任一个或多个：改善的二向色滤光器性能、增加的二向色滤光器频率响应的均匀性、改善的激发光束过滤、更大的视场、增加的空间分辨率、改善的调制传递、对比度噪声比和图像质量、更高的空间采样频率、当重新定位样品平面以捕获一系列图像(例如，不同视场的图像)时图像捕获之间的更快转换、改善的成像系统占空比、以及更高通量图像采集和分析。
光学系统：在一些实施方案中，本文描述了如图45的非限制性示意图所示的光学系统4500，其消除了对二向色元件或校正光学器件(诸如用于流动池的双面成像的镜筒透镜)的需要。本文公开的光学系统4500可以用作被设计用于多种化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的系统的部件。如图45所示，在一些实施方案中，光学系统包括多个成像传感器4501-4504，其被配置用于对流动池4521进行成像。在一些实施方案中，成像传感器4501-4504可以是CCD成像传感器。在一些实施方案中，成像传感器4501-4504可以是CMOS成像传感器。在一些实施方案中，像素移位器4505-4508用于相对于对应的成像传感器4505-4508平移被成像的物体。在一些实施方案中，光学系统包括多带带通滤光器4509。在一些实施方案中，所述多带带通滤光器是多带荧光带通滤光器。在一些实施方案中，所述多带带通滤光器是三带荧光带通滤光器。在一些实施方案中，所述三带荧光带通滤光器被称为三带陷波滤光器。在一些实施方案中，成像光学器件4510-4513定位在成像传感器4501-4504与流动池4521之间。在一些实施方案中，一个成像光学器件4505-4508，也称为成像光学组件，将从流动池4521发射的光聚焦到成像传感器，例如4501、4502、4503或4504中的一个上。在一些实施方案中，所述光学系统包括集成平场组件。在一些实施方案中，所述光学系统包括像差校正。在一些实施方案中，所述光学系统缺乏带通滤光器。在一些实施方案中，所述光学系统缺乏截止滤光器。在一些实施方案中，所述光学系统缺乏二向色反射镜。在一些实施方案中，液体处理系统4514将样品4515分配到流动池4521。在一些实施方案中，液体处理系统4514将液体样品分配到附接到流动池4521的疏水垫4516。在一些实施方案中，液体处理系统4514是液滴分配系统。在一些实施方案中，液滴分配系统4514将样品4515作为液滴递送到流动池4521的疏水垫4516。在一些实施方案中，液体样品4515通过拉力被吸入到流动池4521的内部4517中。在一些实施方案中，拉力通过真空泵4518启动。在一些实施方案中，流动池4521包括通过底板4519和顶板4520封闭的内部通道4517。在一些实施方案中，顶板4520和底板4519是透明的。在一些实施方案中，顶板包括前内表面4528。在一些实施方案中，底板包括后内表面4529。在一些实施方案中，存在于流动池4521的内部通道4517中的样品由多个光源4522、4523或4524照射。在一些实施方案中，单个光源4522、4523和4524中的每一个分别发射不同颜色或光谱的光4525、4526和4527。在一些实施方案中，光学系统4500包括加热器。
在一些实施方案中，陷波滤光器是指带阻滤光器。在一些实施方案中，陷波滤光器是指带阻滤光器。在一些实施方案中，滤光器的陷波是指带阻或阻带。在一些实施方案中，滤光器的陷波是指带通或通带。在一些实施方案中，多带陷波滤光器是指多带带通滤光器。在一些实施方案中，多带陷波滤光器是指多带带阻滤光器。
在一些实施方案中，光学系统4500的成像光学器件4510包括1x的缩减。在一些实施方案中，所述光学系统具有大于1mm2、大于2mm2、大于4mm2、大于10mm2、大于20mm2、大于36mm2、大于40mm2、大于60mm2、大于80mm2或大于100mm2的视场(FOV)。在一些实施方案中，所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，NA是在约0.1至约0.50、约0.20至约0.40之间或是约0.30。在一些实施方案中，NA是0.25。在一些实施方案中，NA是0.1、0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55或0.60。在一些实施方案中，多个成像传感器被配置为捕获FOV。在一些实施方案中，多个光源包括：第一光源4522，其被配置为发射第一波长范围4525；第二光源4523，其被配置为发射第二波长范围4526；和第三光源4524，其被配置为发射第三波长范围4527。在一些实施方案中，第一荧光团由第一光源4522的第一波长范围4525激发。在一些实施方案中，第二荧光团由第二光源4523的第二波长范围4526激发。在一些实施方案中，第三荧光团由第三光源4524的第三波长范围4527激发。在一些实施方案中，样品包含多种生物聚合物。在一些实施方案中，光学系统4500不包括二向色元件。在一些实施方案中，光学系统4500不包括镜筒透镜。
本文描述了用于多种化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的各种方法。图46提供了根据本文的一些实施方案的利用图45中所示的光学系统4500对包含在流动池4521内的样品4515进行成像的成像方法4601的示意图。在一些实施方案中，成像方法可以被配置用于核酸测序。在一些实施方案中，样品4515被包含在流动池4521的内部通道4517内或流动通过所述内部通道，如图45所示。在一些实施方案中，样品包含生物聚合物。在一些实施方案中，所述生物聚合物包括单元。在一些实施方案中，荧光团与生物聚合物的单元互补。在一些实施方案中，荧光团附接至与生物聚合物的单元互补的核苷酸。在一些实施方案中，两个或更多个可检测的不同荧光团附接至与生物聚合物的单元互补的核苷酸。在一些实施方案中，生物聚合物是核酸序列。在一些实施方案中，所述单元是与荧光团标记的核苷酸互补的核苷酸。在一些实施方案中，多个光源发射光，传送通过样品。
本文描述了用于对生物聚合物(例如，核酸分子)进行测序的各种方法。在图46中示出了测序方法和仪器4601以及碱基判定方法4602的非限制性示意图。在一些实施方案中，所述方法包括：使用包括多个光源中的第一光源4522的光学系统4500照射样品4515，其中第一光源4522发射第一波长范围4525，从而激发样品4515的第一荧光团并获取样品4515的第一图像，其中光学系统4500包括多个成像传感器4501-4504，进一步地，其中样品4515布置在多个光源4522-4524与多个成像传感器4501-4504之间的光路中；使用多个光源中的第二光源4523照射样品4515，其中第二光源4523发射第二波长范围4526，从而激发样品4515的第二荧光团并获取样品4515的第二图像；使用多个光源中的第三光源4524照射样品4515，其中第三光源4524发射第三波长范围4527，从而激发样品的第三荧光团并获取样品4515的第三图像；将第一图像、第二图像和第三图像组合成合成图像；经由第一荧光团发射的第一信号来鉴定第一核苷酸的存在，其中所述第一信号是从合成图像的第一感兴趣区域(ROI)中提取的；经由第二荧光团发射的第二信号来鉴定第二核苷酸的存在，其中所述第二信号是从合成图像的第二ROI中提取的；经由第三荧光团发射的第三信号来鉴定第三核苷酸的存在，其中所述第三信号是从合成图像的第三ROI中提取的；以及分别经由第一荧光团和第三荧光团发射的第一和第三信号来鉴定第四核苷酸的存在，其中所述第一和第三信号是从合成图像的第四ROI提取的。在一些实施方案中，光学系统4500还包括流动池4521，其中流动池4521布置在多个成像传感器4501-4504与多个光源4522-4524之间的光路中。在一些实施方案中，光学系统4500还包括至少一个像素移位器4505-4508。在一些实施方案中，光学系统4500还包括多带带通滤光器4509，其布置在多个成像传感器4501-4504与流动池4521之间的光路中。在一些实施方案中，所述方法还包括布置在多带带通滤光器4509与流动池4521之间的光路中的成像光学器件4510-4513。在一些实施方案中，光学系统4500具有1x的缩减。在一些实施方案中，所述光学系统具有大于1mm2、大于2mm2、大于4mm2、大于10mm2、大于20mm2、大于36mm2、大于40mm2、大于60mm2、大于80mm2或大于100mm2的视场(FOV)。在一些实施方案中，所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，NA是0.25。在一些实施方案中，FOV由多个图像传感器4501-4504捕获。
在一些实施方案中，所述测序是亲合力测序。亲合力测序的额外讨论包括在2019年9月23日提交的美国专利号10,768,173中，所述专利通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，所述第一荧光团与第一核苷酸缀合物相关联。在一些实施方案中，所述第二荧光团与第二核苷酸缀合物相关联。在一些实施方案中，所述第三荧光团与第三核苷酸缀合物相关联。在一些实施方案中，所述第一荧光团和所述第三荧光团与第四核苷酸缀合物相关联。在一些实施方案中，核苷酸缀合物可以包括聚合物-核苷酸缀合物。在一些实施方案中，核苷酸缀合物可以包括颗粒-核苷酸缀合物
在一些实施方案中，可以用作第一荧光团、第二荧光团和/或第三荧光团的荧光团包括但不限于，荧光素和荧光素衍生物，诸如羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、羧基萘基荧光素、异硫氰酸荧光素、NHS-荧光素、碘代乙酰胺基荧光素、荧光素马来酰亚胺、SAMSA-荧光素、荧光素氨基硫脲、碳酰肼甲基硫代乙酰基-氨基荧光素、罗丹明和罗丹明衍生物诸如TRITC、TMR、丽丝胺罗丹明、德克萨斯红、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明10、NHS-罗丹明、TMR-碘乙酰胺、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、丽丝胺罗丹明B磺酰肼、德克萨斯红磺酰氯、德克萨斯红酰肼、香豆素和香豆素衍生物诸如AMCA、AMCA-NHS、AMCA-磺基-NHS、AMCA-HPDP、DCIA、AMCE-酰肼、BODIPY和衍生物诸如BODIPY FL C3-SE、BODIPY 530/550C3、BODIPY 530/550C3-SE、BODIPY 530/550C3酰肼、BODIPY 493/503C3酰肼、BODIPY FL C3酰肼、BODIPY FL IA、BODIPY 530/551IA、Br-BODIPY 493/503、级联蓝和衍生物诸如级联蓝乙酰基叠氮化物、级联蓝尸胺、级联蓝乙二胺、级联蓝酰肼、荧光黄和衍生物诸如荧光黄碘乙酰胺、荧光黄CH、花青和衍生物诸如吲哚鎓系花青染料、苯并吲哚鎓系花青染料、吡啶鎓系花青染料、噻唑鎓系花青染料、喹啉鎓系花青染料、咪唑鎓系花青染料、Cy 3、Cy5、镧系元素螯合物和衍生物诸如BCPDA、TBP、TMT、BHHCT、BCOT、铕螯合物、铽螯合物、Alexa Fluor染料、DyLight染料、Atto染料、LightCycler红染料、CAL Flour染料、JOE及其衍生物、俄勒冈绿染料、WellRED染料、IRD染料、藻红蛋白和藻胆素染料、孔雀石绿、对称二苯代乙烯、DEG染料、NR染料、近红外染料和本领域已知的其他物质，诸如在Haugland,Molecular Probes Handbook,(Eugene,Oreg.)第6版；Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy,第2版,PlenumPress New York(1999)或Hermanson,Bioconjugate Techniques,第2版中描述的那些，或其衍生物，或其任何组合。花青染料可以磺化或非磺化形式存在，并且包含被两个氮原子之间的聚甲炔桥隔开的两个假吲哚(indolenin)、苯并吲哚鎓、吡啶鎓、噻唑鎓和/或喹啉鎓基团。市售花青荧光团包括，例如，Cy3(其可包含1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓或1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)、Cy5(其可包含1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓或1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-磺基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓-5-磺酸酯)和Cy7(其可包含1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓或1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)，其中“Cy”代表“花青”，且第一个数字表示两个假吲哚基团之间的碳原子数。Cy2是噁唑衍生物而不是假吲哚，且苯并衍生的Cy3.5、Cy5.5和Cy7.5是此规则的例外。在一些实施方案中，报告部分可以是FRET对，使得可以在单个激发和成像步骤下进行多个分类。如本文所用，FRET可包括激发交换(Forster)转移或电子交换(Dexter)转移。
本文描述了用于对流动池中的样品进行成像的光学系统4700，其中不包括聚焦步骤。
本文描述了用于对流动池中的样品进行成像以用于分析生物聚合物(例如，核酸测序)的光学系统4700。在一些实施方案中，如图47A-图47B中所示的此类系统4700比以前的光学系统更紧凑并且通量更高。表1和图48A-图48B提供了将标准流动池和光学系统的测序循环时间与如本文所述的光学系统进行比较的非限制性实例。表1提供了具有424个单独分片(tile)(例如，有效区域、感兴趣区域等)的标准流动池(如图48A所示)与针对在本文所述的光学系统上成像而优化的具有<40个单独分片的流动池(如图48B所示)相比的循环和运行时间以及相应的计算。在一些实施方案中，一个图像在面积上等同于一个分片。在一些实施方案中，当流动池4521(也在图48B中示出)通过光学系统成像时，每个分片暴露于来自三个单独的LED光源的三个连续光脉冲，其中每个LED光源发射不同的波长。在一些实施方案中，每个不同的波长与如本文所述的不同荧光团的激发光谱相匹配。在一些实施方案中，光学系统4500的成像传感器与每个激发脉冲同步以生成图像，其中一个图像表示一个分片的整个区域，并且进一步地，其中图像的像素各自表示荧光团发射的荧光量。在一些实施方案中，通过光学系统4500在一个分片中成像2个单独的表面。在一些实施方案中，通过包括8个成像模块(例如，光学子系统)的光学系统4500、4700获取具有0.3秒的总曝光时间的总计8个图像。在表1中，标题为“当前”并用蓝色突出显示的行表示当用图47B中所示的IDEX光学系统成像时，对于图48A中所示的标准流动池，在322个循环内的总时间为36.17小时。相比之下，标题为“Sleq”的行显示当用如图47A-图47B中所示的光学系统4700成像时，对于Sleq池(参见图48B)，总时间在13.63与14.28小时之间。表1的底行显示当仅进行25个循环时1.11小时的总时间。减少的测序时间证明了如本文所述的光学系统4700所允许的较大FOV的优点。
表1.以前的系统相对于根据一些实施方案的系统的循环和运行时间
图48A提供了本文所述的具有424个单独分片的流动池的成像区域的说明。图48B提供了本文所述的具有小于40个分片的流动池的成像区域的说明。
图47A提供了用于对流动池4521的表面进行成像的光学系统的非限制性剖面图。在一些实施方案中，光学系统包括LED组散热器4701、光管照射器4702、流动池4521、成像光学器件的部分4703、一个或多个像素移位器4704和多个成像传感器4705。如图47B中所示，光学系统4700比相当的仪器(诸如IDEX仪器核心)小。较小的光学仪器的优点包括但不限于布线要求减少、可用故障模式的数量减少、热交换要求减少以及台式机占用面积减少。
在一些实施方案中，本文描述了光学系统4900，如图49A-图49B的非限制性示意图中所示，其被配置用于对流动池4905进行双面成像。本文公开的光学系统4900可以在被设计用于多种化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的系统中使用。如图49A-图49B中所示，光学系统包括成像传感器4912，其可以被配置用于对流动池4905进行成像。在一些实施方案中，样品流与x轴重合，如图49A-图49B中所示。在一些实施方案中，可以存在多个成像传感器4912。成像传感器4912可以是CCD成像传感器。在一些实施方案中，成像传感器4912可以是CMOS成像传感器。在一些实施方案中，光学系统4900包括像素移位器4911。像素移位器4911可以被配置为提高图像分辨率。在一些实施方案中，像素移位器4911相对于成像传感器4912平移被成像的物体。在一些实施方案中，光学系统包括滤光器4910。在一些实施方案中，滤光器4910包括多带滤光器。在一些实施方案中，滤光器4509包括多带阻带滤光器。在一些实施方案中，滤光器4910是三带荧光阻带滤光器。在一些实施方案中，所述三带荧光阻带滤光器被称为三带陷波滤光器。在一些实施方案中，所述系统包括成像光学器件4909。在一些实施方案中，成像光学器件4909包括物镜。
在一些实施方案中，滤光器4910定位在成像传感器4912与流动池4905之间。在一些实施方案中，成像光学器件4909，也称为成像光学组件，将从流动池4909发射的光聚焦到成像传感器4912上。在一些实施方案中，光学系统4900包括集成平场组件。在一些实施方案中，所述光学系统包括像差校正模块。在一些实施方案中，所述光学系统包括楔形块4916，其被配置用于调节光学系统的路径长度。在一些实施方案中，楔形块4916包括第一楔形件4907、第二楔形件4906或其组合。在一些实施方案中，所述系统包括压电驱动器4908，其被配置为使第一楔形件4907和第二楔形件4906的位置相对于彼此移动，从而调节光学系统的光路长度。在一些实施方案中，流动池4905被配置用于双面成像(DSI)。在一些实施方案中，流动池4905包括前内表面4904、后内表面4905或其组合。在一些实施方案中，前内表面4904和/或后内表面4903包括样品位点4902。在一些实施方案中，光学系统包括光轴4913。在一些实施方案中，光学系统包括最佳成像体积4915。在某些方面，最佳成像体积4915包括视场(FOV)、照射面积、采集面积、焦平面、焦深、样品位点4902发射处于或高于可接受水平的亮度的区域和/或体积或其组合。典型地，在显微镜技术中，FOV中心的物体的亮度可以在中心处最大，并且朝向角落和/或边缘降低。
在一些实施方案中，所述光学系统缺乏带通滤光器。在一些实施方案中，所述光学系统缺乏截止滤光器。在一些实施方案中，所述光学系统缺乏二向色反射镜。
多价分子
本公开提供了一种多价分子，其包含附接至至少一个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，所述至少一个核苷酸臂可以包含核心附接部分。在一些实施方案中，所述至少一个核苷酸臂可以包含间隔子。在一些实施方案中，所述至少一个核苷酸臂可以包含接头。在一些实施方案中，所述至少一个核苷酸臂可以包含核苷酸单元。在一些实施方案中，所述至少一个核苷酸臂可以包含核心附接部分、间隔子、接头和核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核心可以包括珠、颗粒或纳米颗粒。在一些实施方案中，所述核心可以包括烷基、烯基或炔基核心，诸如可以存在于支化聚合物或树枝状聚合物中。在一些实施方案中，所述核心可以包含介导核心与核苷酸臂缀合的部分。在一些实施方案中，所述核心可以附接至多个核苷酸臂。在一些情况下，所述核心可以附接至约1至约50个核苷酸臂。在一些情况下，所述核心附接至约2至约20个核苷酸臂。在一些情况下，所述核心附接至约2至约4个核苷酸臂。在一些情况下，所述核心附接至约4至约10个核苷酸臂。在一些情况下，所述核心附接至约10至约15个核苷酸臂。在一些情况下，所述核心附接至约15至约20个核苷酸臂。图1、2和3示出了多价分子的一般架构。
本公开提供了一种多价分子，其包含附接至至少一个生物素化核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，所述至少一个生物素化核苷酸臂可以包含核心附接部分。在一些实施方案中，所述至少一个生物素化核苷酸臂可以包含间隔子。在一些实施方案中，所述至少一个生物素化核苷酸臂可以包含接头。在一些实施方案中，所述至少一个生物素化核苷酸臂可以包含核苷酸单元。在一些实施方案中，所述至少一个生物素化核苷酸臂可以包含核心附接部分、间隔子、接头和核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核心可以包含链霉亲和素型或亲和素型部分，并且生物素化核苷酸臂的生物素单元可以介导所述核心与生物素化核苷酸臂的缀合。链霉亲和素型或亲和素型核心可以是四聚体生物素结合蛋白，其可以结合一个、两个、三个或多达四个生物素化核苷酸臂。
在一些实施方案中，所述核心可以包含链霉亲和素型或亲和素型部分，包括链霉亲和素或亲和素蛋白，以及可以与至少一个生物素部分结合的链霉亲和素或亲和素的任何衍生物、类似物和其他非天然形式。链霉亲和素或亲和素部分可以包括天然或重组形式，以及突变体版本和衍生分子。链霉亲和素或亲和素的突变体版本可以包含氨基酸插入、缺失、取代或截短中的任一种或者两种或更多种的任何组合。突变体版本还可以包括融合多肽。许多不同形式的链霉亲和素和亲和素是可商购获得的。
多价分子可以使用对生物素化核苷酸臂上的生物素部分具有高亲和力的链霉亲和素或亲和素核心来配置，以减少核苷酸臂从核心解离。可以制备多价分子的混合物，其中混合物含有多价分子的两个或更多个亚群体，并且每个亚群体含有具有一种类型的核苷酸单元(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)的多价分子。被配置为在核心与核苷酸臂之间具有高亲和力的多价分子可以减少核苷酸臂从核心的不期望解离以及不同核心之间核苷酸臂的交换。测序反应期间核苷酸臂的交换可以导致碱基判定错误和测序准确性降低。在一些实施方案中，具有增加的稳定性(例如，生物素化核苷酸臂的解离减少)的多价分子可以包含染料标记的链酶亲和素，其中链酶亲和素亚基携带Lys121Arg突变，其可以表现出生物素化核酸臂从链酶亲和素核心的解离减少。
链酶亲和素部分可以包括对于结合生物素具有高亲和力的全长或截短形式。例如，链酶亲和素部分可以表现出约10-14mol/L或约10-15mol/L的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，链酶亲和素可以在可以用染料标记的位点处包含任何氨基酸取代突变。例如，染料标记位点可以在可以与生物素结合位点重叠的位置121处包含赖氨酸。在一些实施方案中，在Lys121处附接至链酶亲和素的染料可以阻断或抑制生物素与染料标记的链酶亲和素结合。包含在位置121处携带赖氨酸的染料标记的链酶亲和素的多价分子可以表现出生物素化核苷酸臂从链酶亲和素核心的解离。具有增加的稳定性的多价分子可以包含携带Lys121Arg突变的染料标记的链酶亲和素，其可以表现出生物素化核酸臂从链酶亲和素核心的解离减少。
在一些实施方案中，链酶亲和素部分可以包含任何氨基酸取代，其增加对于结合生物素的亲和力(例如，将Kd增加至约10-16mol/L)、改善生物素在高达约60℃、或约65℃、或约70℃或约80℃的温度下的保留、或增加对于结合生物素的亲和力和改善生物素保留的组合。
亲和素部分可以包括对于结合生物素具有高亲和力的全长或截短形式。例如，亲和素部分可以表现出约10-14mol/L或约10-15mol/L的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，亲和素可以包含八个精氨酸残基中的任一个或任何组合的取代(例如，在图22或23中加下划线并加粗)。亲和素可以包括部分去糖基化形式和非糖基化形式。亲和素部分可以包括衍生形式，例如N-酰基亲和素，例如N-乙酰基、N-邻苯二甲酰基和N-琥珀酰基亲和素和可商购获得的产品，包括EXTRAVIDIN、CAPTAVIDIN(在四个生物素结合位点处对酪氨酸残基进行选择性硝化以生成可逆结合生物素的亲和素)、NEUTRAVIDIN(具有化学去糖基化残基并包括经修饰的精氨酸残基)和NEUTRALITE AVIDIN(八个精氨酸残基中的五个被中性氨基酸替代，两个赖氨酸残基的两个被谷氨酸替代，并且Asp17被异亮氨酸替代)。具有中性非极性侧链的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬氨酸。具有中性极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。
在一些实施方案中，核心可以用可检测报告部分标记。核心可以是链酶亲和素或亲和素，它们是同源四聚体。同源四聚体中的每个亚基可以包括至少一个赖氨酸残基，其可以与荧光团缀合。标记反应可以采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯缀合的荧光团。可以附接至链酶亲和素或亲和素亚基的荧光团的最大数量可以由亚基中赖氨酸残基的数量决定。
当制备标记的链酶亲和素或亲和素核心时，可以优化标记反应以实现预定的标记程度(有时缩写为DoL)。标记程度可以用标记/蛋白质形式的摩尔比来表示。具有较低标记程度的染料-核心缀合物将表现出较弱的荧光强度。具有非常高标记程度(例如，DoL>6)的染料-核心缀合物可由于来自缀合荧光团的自淬灭而表现出减少的荧光。在一些实施方案中，链酶亲和素或亲和素核心的预定标记程度可以取决于染料。荧光染料包括但不限于：来自Biotium的CF647、CF680、CF570和CF532染料；来自Thermo Fisher Scientific的AF647、AF680、AF568和AF532；来自AATBio的IFluor 647、IFluor 680、IFlour 568和IFlour 532；来自Dyomics的DY648P1、DY679P1、DY585和DY530；以及来自Fluoroprobes的AFDy 647、IRFlour 680LT、AFDye 568和AFDye 532。预定标记程度可以是约1-10、或约3-8、或约3.5-7、或约1.6-4。
红色荧光团比绿色染料更亮(强度更高)，当在同一载体(例如，流动池)上对红色标记和绿色标记的多价分子进行成像时，这会导致渗色。多价分子的亚群体的标记程度可以增加或降低，以实现来自标记的多价分子混合物的改善的信号平衡。例如，与用绿色荧光团标记的多价分子的亚群体的标记程度相比，用红色荧光团标记的多价分子的亚群体的标记程度可以降低。在一些实施方案中，用红色荧光团标记的多价分子的亚群体的标记程度可以是约1-3、或约2-3、或约3-6。在一些实施方案中，用绿色荧光团标记的多价分子的亚群体的标记程度可以是约4-7。
溶液荧光测量可以用于确定标记的链酶亲和素或亲和素核心的相对亮度。可替代地，标记程度可以通过采用其中固定在流动池上的克隆扩增的模板分子与引物、聚合酶和荧光标记的多价分子在适于将多价分子结合到复合聚合酶而不将核苷酸单元掺入到引物中的条件下接触并且可以检测信号强度的功能测定(例如，流动池捕获测定)来确定。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含相同类型的核苷酸单元。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂具有选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的核苷酸单元。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含不同类型的核苷酸单元。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中至少第一附接臂可以具有选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的第一核苷酸单元，并且第二附接臂可以具有选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的第二核苷酸单元，其中第一和第二核苷酸单元是不同的。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含相同类型的间隔子。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂具有相同的间隔子。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含不同类型的间隔子。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中至少第一附接臂可以具有第一类型的间隔子，并且第二附接臂可以具有第二类型的间隔子，其中第一和第二间隔子单元是不同的。在一些实施方案中，第一和第二类型的接头可以选自本文所述的任何间隔子。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含相同类型的接头。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂具有相同的接头。在一些实施方案中，接头可以选自本文所述的任何接头(例如，图5A(底部)和图5B-F)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含不同类型的接头。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中至少第一附接臂可以具有第一类型的接头，并且第二附接臂可以具有第二类型的接头，其中第一和第二接头单元是不同的。在一些实施方案中，第一和第二类型的接头可以选自本文所述的任何接头(例如，图5A(底部)和图5B-F)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个e臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含相同类型的间隔子和接头。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂具有相同的间隔子和接头。在一些实施方案中，间隔子和接头可以选自本文所述的任何间隔子和接头。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含相同类型的反应性基团。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂具有相同的反应性基团。在一些实施方案中，反应性基团可以包括烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮化物基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团、二硫化物基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。
在一些实施方案中，接头中的反应性基团可以与化学试剂反应。例如，反应性基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。反应性基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。反应性基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。反应性基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。反应性基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中，核苷酸臂在接头中可以具有相同类型的反应性基团，其中反应性基团可以包括叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基基团。在一些实施方案中，接头中的叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以在接头中包含不同类型的反应性基团。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中至少第一附接臂可以在第一接头单元中具有第一类型的反应性基团，并且第二附接臂可以在第二接头单元中具有第二类型的反应性基团，其中第一和第二反应性基团是不同的。
在一些实施方案中，第一接头单元中的第一反应性基团和第二接头单元中的第二反应性基团可以选自以下的任何组合：烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮化物基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团、二硫化物基团、碳酸酯基团、脲基团和甲硅烷基基团。
在一些实施方案中，第一和第二反应性基团可以与化学试剂反应。例如，反应性基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。反应性基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。反应性基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。反应性基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。反应性基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中，核苷酸臂在接头中可以具有不同类型的反应性基团，其中反应性基团可以包括叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基基团。在一些实施方案中，接头中的叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含具有相同类型的糖3’OH基团的核苷酸单元。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂具有带有相同类型的糖3’OH基团的核苷酸单元。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含具有相同类型的糖3’封闭基团(blocking group)(例如，链终止部分)的核苷酸单元。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中所有附接的臂可以具有带有相同类型的糖3’封闭基团的核苷酸单元。在一些实施方案中，糖3’封闭基团可以包括烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮化物基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团、二硫化物基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。在一些实施方案中，糖3’封闭基团可以包括3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团或3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，糖3’封闭基团可以包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团。
在一些实施方案中，糖3’封闭基团可以与化学试剂反应。例如，糖3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。糖3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。糖3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。糖3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。糖3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中，糖3’封闭基团(例如，叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基)可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含具有不同的糖3’封闭基团的核苷酸单元。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中至少第一附接臂可以具有带有第一3’封闭基团的第一核苷酸单元，并且第二附接臂可以具有带有第二3’封闭基团的第二核苷酸单元，其中第一和第二3’封闭基团是不同的。
在一些实施方案中，第一核苷酸单元中的第一3’封闭基团和第二核苷酸单元中的第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮化物基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团、二硫化物基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。在一些实施方案中，第一核苷酸单元中的第一3’封闭基团和第二核苷酸单元中的第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团或3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，第一核苷酸单元中的第一3’封闭基团和第二核苷酸单元中的第二3’封闭基团可以选自叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团的任何组合。
在一些实施方案中，第一和第二3’封闭基团可以与化学试剂反应。例如，3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中，第一和第二3’封闭基团(例如，叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基)可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含具有第一糖3’OH封闭基团的核苷酸单元。在一些实施方案中，多个核苷酸臂可以包含具有第二3’OH封闭基团的核苷酸单元。在一些情况下，第一和第二3’OH封闭基团可以是不同的。例如，多价分子可以包含附接至多个核苷酸臂或生物素化核苷酸臂的核心(例如，链酶亲和素或亲和素核心)，其中(a)至少第一臂可以包含具有包括3’OH基团的糖部分的第一核苷酸单元，(b)至少第二臂可以包含具有第一3’封闭基团的第二核苷酸单元，并且(c)至少第三臂可以包含具有第二封闭基团的第三核苷酸单元，其中第一和第二3’封闭基团彼此是不同的。
在一些实施方案中，第一核苷酸单元中的第一3’封闭基团和第二核苷酸单元中的第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮化物基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫基团、二硫化物基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团。在一些实施方案中，第一核苷酸单元中的第一3’封闭基团和第二核苷酸单元中的第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团或3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，第一核苷酸单元中的第一3’封闭基团和第二核苷酸单元中的第二3’封闭基团可以选自叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团的任何组合。
在一些实施方案中，第一和第二3’封闭基团可以与化学试剂反应。例如，3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中，第一和第二3’封闭基团(例如，叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基)可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述多价分子可以具有核心。在一些实施方案中，核心可以用至少一个可检测报告部分标记以形成标记核心。在一些实施方案中，附接至两个或更多个核苷酸臂的标记核心可以构成标记的多价分子。在一些实施方案中，链酶亲和素或亲和素核心可以用1-6或更多个报告部分标记。在一些实施方案中，报告部分可以包括荧光团。
在其核苷酸臂中具有不同单元的多价分子的混合物，其中可以实现不同多价分子之间的区分。在一些实施方案中，第一多价分子的核心可以用报告部分标记，以将其与第二标记(或未标记)的多价分子区分开来。例如，标记的第一多价分子的核苷酸臂中的单元可以不同于标记的第二多价分子的核苷酸臂中的单元。第一多价分子中的任何单元(例如，间隔子、接头、反应性基团、核苷酸碱基、糖3’OH、3’封闭基团或其组合)可以不同于第二多价分子中的对应单元，其中第一和第二报告部分对应于分化单元。在一些实施方案中，第一和第二报告部分可以在光谱上彼此区分开。
在一些实施方案中，第一多价分子的核心可以用对应于附接的核苷酸臂中的碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)的第一报告部分标记，并且第二多价分子的核心可以用对应于附接的核苷酸臂中的碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)的第二报告部分标记，其中第一多价分子中的碱基和第二多价分子中的碱基是不同的。在一些实施方案中，第一和第二报告部分可在光谱上彼此区分开。在一些实施方案中，第一报告部分的检测指示具有第一碱基的第一多价分子的结合事件、掺入事件、或结合和掺入事件的组合，并且第二报告部分的检测指示具有第二碱基的第二多价分子的结合事件、掺入事件、或结合和掺入事件的组合。结合事件可以是多价分子与复合聚合酶结合。掺入事件可以是核苷酸单元掺入到复合聚合酶中可延伸引物的3’末端，其中核苷酸单元是多价分子的一部分。
多价分子的混合物
本公开提供了标记多价分子的单独批次(亚群体)。在一些实施方案中，标记多价分子的单独批次可以使用每个批次的不同报告部分来制备。在一些实施方案中，不同报告部分可以对应于核苷酸臂中的特定碱基。基于附接至核心的报告部分，特定批次可以与其他批次区分开。可以将两个、三个、四个、五个或更多个单独的批次(亚群体)混合在一起以形成包含两个或更多个光谱上可区分的多价分子亚群体的多个标记多价分子。在一些实施方案中，混合物中多价分子的至少一个批次可以是未标记的(例如，深色多价分子)。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子可以包括用不同的报告部分标记的多价分子的至少两个亚群体的混合物。在一些实施方案中，多价分子的至少第一亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第一核苷酸单元的第一报告部分标记。在一些实施方案中，多价分子的至少第二亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第二核苷酸单元的第二报告部分标记。在一些情况下，第一和第二报告部分可以彼此不同。在一些实施方案中，多个多价分子还可以包含用第三报告部分标记的多价分子的至少第三亚群体，其中第一、第二和第三报告部分可以彼此不同。在一些实施方案中，多个多价分子还可以包含用第四报告部分标记的多价分子的至少第四亚群体，其中第一、第二、第三和第四报告部分可以彼此不同。在一些实施方案中，可以将标记多价分子的额外亚群体(例如，第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多)添加到混合物中。在一些实施方案中，报告部分可以是荧光团。在一些实施方案中，多价分子的第一亚群体可以用第一荧光团标记，并且多价分子的第二荧光团可以用第二荧光团标记。在一些情况下，第一荧光团和第二荧光团可以是不同的。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子可以包括用不同的报告部分标记的多价分子的至少两个亚群体的混合物。在一些实施方案中，多价分子的至少第一亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第一核苷酸单元的第一报告部分标记。在一些实施方案中，多价分子的至少第二亚群体可以是未标记的(例如，深色多价分子)。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括用不同的报告部分标记的多价分子的至少三个亚群体的混合物。在一些实施方案中，多价分子的至少第一亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第一核苷酸单元的第一报告部分标记。在一些实施方案中，多价分子的至少第二亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第二核苷酸单元的第二报告部分标记。在一些实施方案中，多价分子的至少第三亚群体可以是未标记的(例如，深色多价分子)。在一些实施方案中，第一和第二报告部分可以彼此不同。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括用不同的报告部分标记的多价分子的至少四个亚群体的混合物。在一些实施方案中，多价分子的混合物可以具有多价分子的至少第一亚群体，所述第一亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第一核苷酸单元的第一报告部分标记。在一些实施方案中，多价分子的混合物可以具有多价分子的至少第二亚群体，所述第二亚群体可以用对应于核苷酸臂上的第一核苷酸单元的第二报告部分标记。在一些实施方案中，多价分子的混合物可以具有用第三报告部分标记的多价分子的至少第三亚群体。在一些实施方案中，多价分子的混合物可以具有可以是未标记的多价分子的至少第四亚群体(例如，深色多价分子)。在一些情况下，第一、第二和第三报告部分可以彼此不同。
任何实施方案包括：四种不同类型的多价分子的混合物，所述多价分子包括：(1)多价分子的第一亚群体，所述多价分子各自包含dATP核苷酸单元和用第一类型的荧光团标记的核心，(2)多价分子的第二亚群体，所述多价分子各自包含dGTP核苷酸单元和用第二类型的荧光团标记的核心，(3)多价分子的第三亚群体，所述多价分子各自包含dCTP核苷酸单元和用第三类型的荧光团标记的核心，以及(4)多价分子的第四亚群体，所述多价分子各自包含dTTP核苷酸单元和用第四类型的荧光团标记的核心，其中第一、第二、第三和第四荧光团可以在光谱上区分开。在一些实施方案中，多价分子的任一个亚群体可以是未标记的，用作“深色”多价分子。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的链酶亲和素或亲和素核心。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有一种类型的核苷酸单元，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心，其中所述核苷酸臂具有一种类型的核苷酸单元，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化核苷酸臂具有一种类型的核苷酸单元，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括两个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中具有至少第一多价分子。在一些情况下，所述至少第一多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP的第一类型核苷酸。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以具有至少第二多价分子。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中包含至少第一多价分子和至少第二多价分子。在一些情况下，所述至少第二多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有与第一多价分子中的第一核苷酸不同的第二类型的核苷酸。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第一类型的核苷酸，选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第二类型的核苷酸，选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP，其中所述第一和第二类型的核苷酸是不同的。在一些实施方案中，所述混合物可以包含两个、三个、四个、五个或更多个不同类型的多价分子，所述多价分子具有选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP的任何组合的核苷酸。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，与核心结合的至少一个核苷酸臂可以具有相同的间隔子。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，与核心结合的至少一个核苷酸臂可以具有相同的接头。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，与核心结合的所有核苷酸臂可以具有相同的间隔子和接头。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括两个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中包含至少第一多价分子，所述第一多价分子可以包含与具有第一类型的间隔子的至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第二多价分子，所述第二多价分子可以包含与具有第二类型的间隔子的至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包括至少第一多价分子和至少第二多价分子的混合物。在一些情况下，第二多价分子中的第二类型的间隔子可以不同于第一多价分子中的第一间隔子。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第一类型的间隔子。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第二类型的间隔子，其中所述第一和第二类型的间隔子是不同的。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括两个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中包含至少第一多价分子，所述第一多价分子包含与具有第一类型的接头的至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第二多价分子，所述第二多价分子包含与具有第二类型的接头的至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包括至少第一多价分子和至少第二多价分子的混合物。在一些情况下，第二多价分子中的第二类型的接头可以不同于第一多价分子中的第一接头。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第一类型的接头。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第二类型的接头，其中所述第一和第二类型的间隔子是不同的。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，与核心结合的所有核苷酸臂可以在接头中具有相同的反应性基团。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述反应性基团可以包括烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮化物、胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物、碳酸酯、脲或甲硅烷基基团。在一些实施方案中，单个多价分子可以包含可以与化学试剂反应的反应性基团。例如，反应性基团烷基、烯基、炔基和烯丙基与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。反应性基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。反应性基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。反应性基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。反应性基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。在一些实施方案中，反应性基团可以包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团。在一些实施方案中，接头中的叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统和试剂盒，所述多个多价分子包括两个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中具有至少第一多价分子(第一亚群体)。在一些实施方案中，所述至少第一亚群体可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂在接头中具有第一类型的反应性基团。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以具有至少第二多价分子(第二亚群体)，所述第二多价分子包含与在接头中具有第二类型的反应性基团的至少一个核苷酸臂结合的核心。在一些情况下，第一亚群体中第一类型的接头中的第一反应性基团不同于第二亚群体中第二类型的接头中的第二反应性基团。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以在接头中具有第一类型的反应性基团。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以在接头中具有第二类型的反应性基团，其中所述第一反应性基团不同于所述第二反应性基团。
在一些实施方案中，所述第一和第二反应性基团可以选自以下的任何组合：烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮化物、胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物、碳酸酯、脲和甲硅烷基基团。在一些实施方案中，单个多价分子可以包含可以与化学试剂反应的第一或第二反应性基团。例如，反应性基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。反应性基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。反应性基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。反应性基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。反应性基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。在一些实施方案中，所述第一或第二反应性基团可以选自叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团的任何组合。在一些实施方案中，接头中的叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基反应性基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，其中与核心结合的所有核苷酸臂可以具有带有相同的糖3’OH基团的核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心。
本公开提供了包含多个(例如，群体)多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，其中所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，其中与核心结合的所有核苷酸臂可以具有带有被相同的3’封闭基团取代的糖3’OH基团的核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述多个多价分子中的单个多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心。在一些实施方案中，所述糖3’封闭基团可以包括烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮化物、胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物、碳酸酯、脲或甲硅烷基基团。在一些实施方案中，单个多价分子可以包含可以与化学试剂反应的3’封闭基团。例如，3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。在一些实施方案中，3’封闭基团可以包括3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团或3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，3’封闭基团可以包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团。在一些实施方案中，叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基3’封闭基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括两个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中包含至少第一多价分子，所述第一多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有第一类型的糖3’OH封闭基团(链终止部分)的第一核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第二多价分子，所述第二多价分子包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有第二类型的糖3’封闭基团(链终止部分)的第二核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含第一多价分子和第二多价分子。在一些情况下，第一3’封闭基团可以不同于第二3’封闭基团。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第一类型的3’封闭基团。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第二类型的3’封闭基团，其中所述第一3’封闭基团不同于所述第二3’封闭基团。
在一些实施方案中，所述第一和第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮化物、胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物、碳酸酯、脲和甲硅烷基基团。在一些实施方案中，单个多价分子可以包含可以与化学试剂反应的第一或第二3’封闭基团。例如，3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。在一些实施方案中，所述第一和第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团和3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，所述第一或第二3’封闭基团可以选自叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团的任何组合。在一些实施方案中，叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基3’封闭基团与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括两个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以在所述多个多价分子中包含至少第一多价分子，所述第一多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有糖3’OH基团的第一核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第二多价分子，所述第二多价分子包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有第一类型的糖3’封闭基团的第二核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含第一多价分子和第二多价分子。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有糖3’OH基团。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第一类型的3’封闭基团。
在一些实施方案中，所述第一3’封闭基团可以选自以下的任何组合：烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮化物、胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物、碳酸酯、脲和甲硅烷基基团。在一些实施方案中，单个多价分子可以包含可以与化学试剂反应的第一3’封闭基团。例如，3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。在一些实施方案中，所述第一3’封闭基团可以选自以下的任何组合：3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团和3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，所述第一3’封闭基团可以选自叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团的任何组合。在一些实施方案中，叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基3’封闭基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
本公开提供了包含多个多价分子的组合物、系统、方法和试剂盒，所述多个多价分子包括三个或更多个不同类型的多价分子的混合物(亚群体)。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第一多价分子。在一些实施方案中，所述至少第一多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有糖3’OH基团的第一核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第二多价分子。在一些实施方案中，所述至少第二多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有第一类型的糖3’封闭基团的第二核苷酸单元。在一些实施方案中，所述多个多价分子可以包含至少第三多价分子。在一些实施方案中，所述至少第三多价分子可以包含与至少一个核苷酸臂结合的核心，所述核苷酸臂具有带有第二类型的糖3’封闭基团的第三核苷酸单元。在一些情况下，第一和第二3’封闭基团是不同的。在一些实施方案中，所述第一多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有糖3’OH基团。在一些实施方案中，所述第二多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第一类型的3’封闭基团。在一些实施方案中，所述第三多价分子可以包含与2-5个生物素化核苷酸臂结合的核心，其中所述生物素化臂可以具有第二类型的3’封闭基团。
在一些实施方案中，所述第一和第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮化物、胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物、碳酸酯、脲和甲硅烷基基团。在一些实施方案中，单个多价分子可以包含可以与化学试剂反应的第一或第二3’封闭基团。例如，3’封闭基团烷基、烯基、炔基和烯丙基可以与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)和哌啶反应，或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。3’封闭基团芳基和苄基可以与H2 Pd/C反应。3’封闭基团胺、酰胺、酮基、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可以与膦或硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。3’封闭基团碳酸酯可以在MeOH中与碳酸钾(K2CO3)反应，在吡啶中与三乙胺反应，或在乙酸(AcOH)中与Zn反应。3’封闭基团脲和甲硅烷基可以与四丁基氟化铵、吡啶-HF反应，与氟化铵反应，或与三乙胺三氟化氢反应。在一些实施方案中，所述第一和第二3’封闭基团可以选自以下的任何组合：3’-O-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-O-丙二酰基基团和3’-O-苄基基团。在一些实施方案中，所述第一和第二3’封闭基团可以选自叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团的任何组合。在一些实施方案中，叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基3’封闭基团可以与化学试剂反应。在一些实施方案中，化学试剂可以包括膦化合物。在一些实施方案中，膦化合物可以包含衍生化三烷基膦部分或衍生化三芳基膦部分。在一些实施方案中，膦化合物可以包括三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、双磺基三苯基膦(BS-TPP)或三(羟基丙基)膦(THPP)。
楔形块组件
本文描述了光学系统的各种实施方案。在一些实施方案中，光学系统是被配置用于样品的荧光读出的光学系统。在一些实施方案中，光学系统包括楔形块组件4916，如图49A-49B中所示。在某些方面，楔形块组件4916包括第一楔形件4907和第二楔形件4906。在一些实施方案中，楔形块组件4916包括可调节光路长度。在一些实施方案中，第一楔形件4907被配置为相对于第二楔形件4906移动。在一些实施方案中，第一楔形件4907与第二楔形件4906的相对移动导致楔形块组件4916的光路长度由于楔形块组件4916的物理厚度变化而变化，如图49A至49B中所示。在一些实施方案中，楔形块组件4916包括将第一楔形件4907与第二楔形件4906分开的间隙。在一些实施方案中，无论第一楔形件4907和第二楔形件4906的相对位置如何，间隙都维持恒定的距离。在一些实施方案中，第一楔形件4907和第二楔形件4906由熔融二氧化硅组成。在一些实施方案中，第一楔形件4907和第二楔形件4906由具有1.5折射率的熔融二氧化硅组成。在一些实施方案中，第一楔形件4907与压电驱动器4908耦合。在一些实施方案中，所述光学系统包括外壳。在一些实施方案中，楔形块组件4916和压电驱动器4908容纳在外壳内。在一些实施方案中，楔形块组件4916和压电驱动器4908构成楔形块-压电驱动器组件。在一些实施方案中，楔形块组件4916的第二楔形件4906接触外壳。在一些实施方案中，楔形块组件4916的第二楔形件4906接触流动池4905。
在一些实施方案中，第一楔形件4907相对于第二楔形件4906的位置决定焦平面沿着光轴4913(例如，z轴)的位置。在一些实施方案中，顶部楔形件4907与底部楔形件4906对准，如图49A所示。在这种实施方案中，楔形块组件4916的物理距离导致焦平面与后内表面对准。在这种情况下，后内表面的样品位点4902是焦点对准的。在一些实施方案中，压电驱动器4908将顶部楔形件4907相对于底部楔形件4906移动到一个位置，如图49B所示，使得楔形块4916在光路内的物理厚度大于处于图49A所示的对准状态下的物理厚度。在这种实施方案中，焦平面被移动以与前内表面对准。在这种情况下，前内表面的样品位点4902是焦点对准的。
台
在此描述了包括台的光学系统的各种实施方案。所述台可以是倾斜台。所述台可以是水平-竖直倾斜台。所述台可以允许旋转。所述台可以被配置为同时在三个不同的轴上平移，其中所有的轴彼此垂直。所述台可以被配置为同时在三个不同的轴上平移，其中所有的轴彼此垂直。所述台可以被配置为同时在三个不同的轴上平移并绕三个不同的轴旋转，其中所有的轴彼此垂直。所述台可以使多个光学子系统5001相对于流动池4905平移，如图50中所示。所述台可以使流动池4905相对于多个光学子系统5001平移，如图50中所示。所述台可以使单个光学子系统4914平移。所述台可以使多个光学子系统5001绕毛细管流动池5201的x轴旋转，如图53A-53B中所示。所述台可以使多个光学子系统5001沿着与毛细管流动池5201的长轴重合的x轴平移，如图52A-53B中所示。
像素移位器
本文描述了包括像素移位器4911的光学系统的各种实施方案。在一些实施方案中，像素移位器4911使得能够进行亚像素分辨率成像。在某些方面，可以通过使用像素移位器4911来增加光学系统的分辨率，而不增加实际的光学系统分辨率。在一些实施方案中，像素移位器4911有效地使成像传感器4912的分辨率倍增。在一些实施方案中，压电致动器被配置用于与图像平面(例如，在x-y平面中)重合的限定横向像素位移。在一些实施方案中，压电致动器被配置用于在光轴4913(例如，z轴或包含z轴的平面)上进行像素位移。在一些实施方案中，倾斜台被配置用于在X-Z或Y-Z或X-Y-Z中进行像素位移。在一些情况下，倾斜台被配置用于在两个维度上进行像素位移。在一些实施方案中，包括像素移位器的光学系统被配置用于对3D样品物体进行成像。在一些情况下，包括像素移位器的光学系统被配置用于对2D样品物体进行成像。
在一些实施方案中，3D物体可以包括样品位点4902。在一些实施方案中，样品位点4902是扩增的核酸。在一些实施方案中，样品位点可以包括一个或多个聚合酶集落。在一些实施方案中，“聚合酶集落(polony)”可以是指聚合酶集落(polymermase colony)。在一些实施方案中，聚合酶集落可以是指单个核酸的分离克隆扩增。在一些实施方案中，3D物体可以包括非生物材料。在一些实施方案中，3D物体可以包括无机材料。在一些实施方案中，3D物体可以包括半导体。在一些情况下，聚合酶集落可以是核酸文库分子，其可以被克隆扩增(例如，在溶液中、在载体上等)以生成扩增子。在一些情况下，扩增子可以用作测序的模板分子。线性文库分子可以被环化以生成环化文库分子。在一些情况下，环化文库分子可以被克隆扩增(例如，在溶液中、在载体上等)以生成多联体。在一些情况下，多联体可以用作核酸模板分子。在一些情况下，可以对多联体进行测序。在一些情况下，多联体可以是聚合酶集落。在一些情况下，聚合酶集落包含核苷酸链。
像素移位器4911可以利用偏振。
自动聚焦元件
本文描述了包括自动聚焦元件的光学系统的各种实施方案。
图51A-图51B提供了聚焦透镜组件的非限制性剖面图。聚焦透镜组件被配置为在光路(例如，光轴)内维持固定位置，并且允许容纳在聚焦透镜组件的透镜外壳内的至少第一透镜与第二透镜之间的相对运动。
在一些实施方案中，自动聚焦元件被配置用于初始聚焦。在一些实施方案中，所述自动聚焦元件容纳在透镜镜筒内。在一些实施方案中，所述自动聚焦元件被内置到透镜镜筒中和/或与透镜镜筒集成在一起。在一些实施方案中，所述自动聚焦元件容纳在透镜组件的透镜镜筒内。在一些实施方案中，自动聚焦元件被配置为改善可靠性，减少光学系统的机械占用面积。在一些实施方案中，自动聚焦元件包括楔形块组件、压电驱动器、楔形块-压电驱动器组件或其组合。
多重成像系统
在一些实施方案中，如图50中所见的光学系统包括多个光学子系统4914。在一些实施方案中，多个光学子系统5001中的每个光学子系统4914包括成像传感器4912、像素移位器4911、滤光器4910、成像光学器件4909、压电驱动楔形块组件、光源4901或其组合。在一些实施方案中，成像传感器4912可以手机式照相机。在一些实施方案中，多个光学子系统5001包括光学子系统的阵列。在一些实施方案中，光学子系统的阵列可以被配置用于多个焦深、多个波长或其组合。在一些实施方案中，多个光学子系统5001中的每个光学子系统4914被配置用于焦深，其中多个光学子系统中的至少两个光学子系统的焦深是不同的。在一些实施方案中，多个光学子系统中的每个光学子系统被配置为检测波长，其中由多个光学子系统中的至少两个光学子系统检测到的波长是不同的。在一些实施方案中，多个光学子系统5001中的每个光学子系统4914的图像传感器4912包括图像传感器4912的阵列。在一些实施方案中，高分辨率低成本照相机被配置为提供成像，像差由软件补偿。在一些实施方案中，光学系统包括一个光学子系统4914，其中光学子系统4914包括一个最佳成像体积，如图49A-图49B中所示。在图49A-图49B中，最佳成像体积4915沿着x轴的范围是有限的。某些因素可影响xy平面(例如，焦平面)中的最佳成像体积的宽度。xy平面或焦平面包括最佳成像体积的横截面，并且可以包括被称为照射区域、采集区域或其组合的区域。包括延伸超过最佳FOV的样品位点4902的表面没有被光源最佳地照射，没有被成像传感器最佳地捕获，没有被光学器件最佳地分辨或其组合。所述表面的此类非最佳区域表现出不均匀的亮度和不均匀的分辨率，如可以在图38中的图像的边缘和/或角落中观察到的。在图38中，样品位点从图像的中心到边缘和/或角落变得更暗并且分辨率更低。图50说明了一个实施方案，其中样品位点4902覆盖的表面延伸超过一个光学子系统4916的最佳成像体积4915，并且其中重叠的最佳成像容积4915重叠以提供复合的最佳成像体积。
在一些实施方案中，光学系统具有6mm x 6mm的优化FOV。在一些实施方案中，所述系统具有约0.5mm至约9mm的优化FOV。在一些实施方案中，所述系统具有约0.5mm至约1mm、约0.5mm至约3mm、约0.5mm至约6mm、约0.5mm至约9mm、约1mm至约3mm、约1mm至约6mm、约1mm至约9mm、约3mm至约6mm、约3mm至约9mm、或约6mm至约9mm的优化FOV。在一些实施方案中，所述系统具有约0.5mm、约1mm、约3mm、约6mm、或约9mm的优化FOV。在一些实施方案中，所述系统具有至少约0.5mm、约1mm、约3mm、或约6mm的优化FOV。在一些实施方案中，所述系统具有至多约1mm、约3mm、约6mm、或约9mm的优化FOV。
在一些实施方案中，光学系统具有6mm x 6mm的优照射区域。在一些实施方案中，所述系统具有约0.5mm至约9mm的优化照射区域。在一些实施方案中，所述系统具有约0.5mm至约1mm、约0.5mm至约3mm、约0.5mm至约6mm、约0.5mm至约9mm、约1mm至约3mm、约1mm至约6mm、约1mm至约9mm、约3mm至约6mm、约3mm至约9mm、或约6mm至约9mm的优化照射区域。在一些实施方案中，所述系统具有约0.5mm、约1mm、约3mm、约6mm、或约9mm的优化照射区域。在一些实施方案中，所述系统具有至少约0.5mm、约1mm、约3mm、或约6mm的优化照射区域。在一些实施方案中，所述系统具有至多约1mm、约3mm、约6mm、或约9mm的优化照射区域。
在一些实施方案中，所述光学系统被配置用于对表面进行快速成像。在一些实施方案中，所述光学系统被配置用于对流动池的表面进行快速成像。在一些实施方案中，所述光学系统被配置用于对流动池的第一表面和第二表面进行快速成像。在一些实施方案中，在5个成像步骤中对流动池4905的表面4903或4904的整个有效区域(例如，感兴趣区域、ROI)进行成像。在一些实施方案中，在约1个成像步骤至约10个成像步骤中对表面4903或4904的有效区域(例如，感兴趣区域)进行成像。在一些实施方案中，在约1个成像步骤至约2个成像步骤、约1个成像步骤至约3个成像步骤、约1个成像步骤至约4个成像步骤、约1个成像步骤至约5个成像步骤、约1个成像步骤至约6个成像步骤、约1个成像步骤至约10个成像步骤、约2个成像步骤至约3个成像步骤、约2个成像步骤至约4个成像步骤、约2个成像步骤至约5个成像步骤、约2个成像步骤至约6个成像步骤、约2个成像步骤至约10个成像步骤、约3个成像步骤至约4个成像步骤、约3个成像步骤至约5个成像步骤、约3个成像步骤至约6个成像步骤、约3个成像步骤至约10个成像步骤、约4个成像步骤至约5个成像步骤、约4个成像步骤至约6个成像步骤、约4个成像步骤至约10个成像步骤、约5个成像步骤至约6个成像步骤、约5个成像步骤至约10个成像步骤、或约6个成像步骤至约10个成像步骤中对表面的有效区域(例如，感兴趣区域)进行成像。在一些实施方案中，在约1个成像步骤、约2个成像步骤、约3个成像步骤、约4个成像步骤、约5个成像步骤、约6个成像步骤、或约10个成像步骤中对表面的有效区域(例如，感兴趣区域)进行成像。在一些实施方案中，在至少约1个成像步骤、约2个成像步骤、约3个成像步骤、约4个成像步骤、约5个成像步骤、或约6个成像步骤中对表面的有效区域(例如，感兴趣区域)进行成像。在一些实施方案中，在至多约2个成像步骤、约3个成像步骤、约4个成像步骤、约5个成像步骤、约6个成像步骤、或约10个成像步骤中对表面的有效区域(例如，感兴趣区域)进行成像。
光学系统方法
本文描述了用于对生物聚合物进行成像的方法，其包括：提供光学系统，所述光学系统包括：多个光学子系统，所述多个光学子系统中的每个光学子系统包括：被配置为单独发射第一波长和第二波长的光源，其中所述第一波长不同于所述第二波长；被配置为排斥所述第一波长和所述第二波长中的每一个的多带滤光器；被配置为对布置在每个光源与每个成像传感器之间的光路中的一种或多种生物聚合物进行成像的成像传感器；和在足以使所述一种或多种生物聚合物中的第一生物聚合物与多种荧光团中的第一荧光团结合并且使所述一种或多种生物聚合物中的第二生物聚合物与所述多种荧光团中的第二荧光团结合的条件下，使所述一种或多种生物聚合物与所述多种荧光团接触，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团；用每个成像传感器对所述第一生物聚合物进行成像，其中所述成像包括(i)用所述第一波长照射所述第一生物聚合物，从而激发所述第一荧光团，和(ii)获取第一图像；用每个成像传感器对所述第二生物聚合物进行成像，其中所述成像包括(i)用所述第二波长照射所述第二生物聚合物，从而激发所述第二荧光团，和(ii)获取第二图像，并且其中所述一种或多种生物聚合物布置在弯曲表面上，并且其中所述多个光学子系统中的每个光学子系统的光轴与所述弯曲表面正交。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述一种或多种生物聚合物中的第三生物聚合物进行成像，包括(i)用第三波长照射所述第三生物聚合物，从而激发所述多种荧光团中的第三荧光团，和(ii)获取第三图像。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述第一图像和所述第二图像组合成合成图像。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的单元，包括分析所述合成图像的第一感兴趣区域(ROI)以检测由所述第一荧光团发射的第一信号。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第二荧光团发射的第二信号。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的第一单元，包括分析所述合成图像的第一ROI以检测由所述第一荧光团发射的第一信号；和鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的第二单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第一荧光团发射的第二信号。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述第一图像、所述第二图像和所述第三图像组合成合成图像。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定由所述第三荧光团结合的所述第三生物聚合物的第三单元，包括分析所述合成图像的第三ROI以检测由所述第三荧光团发射的第三信号。在一些实施方案中，所述方法还包括：鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的第一单元，包括分析所述合成图像的第一感兴趣区域(ROI)以检测由所述第一荧光团发射的第一信号；鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的第二单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第一荧光团发射的第二信号；鉴定由所述第三荧光团结合的所述第三生物聚合物的第三单元，包括分析所述合成图像的第三ROI以检测由所述第三荧光团发射的第三信号；以及鉴定由所述第三荧光团结合的所述第三生物聚合物的第三单元，包括分析所述合成图像的第三ROI以检测由所述第三荧光团发射的第三信号。
本文描述了使用如本文所述的光学系统进行超分辨率成像的各种方法。在一些实施方案中，所述方法包括提供还包括至少一个样品位点的表面，所述样品位点包括固定至多个附接的寡核苷酸分子的克隆扩增的样品核酸分子，其中所述多个固定的克隆扩增的样品核酸分子以小于λ/(2*NA)的距离存在，其中λ是激发能量源的中心波长，并且NA是成像系统的数值孔径；将随机光切换化学同时应用于所述克隆扩增的样品核酸分子，以通过随机光切换使所述多个克隆扩增的样品核酸分子在开启和关闭事件中发出多达四种不同颜色的荧光；以及当所述多个克隆扩增的样品核酸分子发生所述开启和关闭事件时，实时检测每种颜色的颜色通道中的所述开启或关闭事件，以确定所述克隆扩增的样品核酸分子的核苷酸的身份。随机光切换可以包括使用发射荧光团中的暗态来随机切换荧光团的开启和关闭。这可以使得能够对单个荧光团进行成像，然后可以对其进行定位以提供超分辨率图像。在一些情况下，随机光切换可以包括使用受激发射损耗(STED)、随机光学重建(STORM)等。
在一些情况下，超分辨率成像可以包括以至多约1,000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50或更小纳米的分辨率进行成像。在一些情况下，超分辨率成像的分辨率可以通过进行成像的系统的数值孔径来控制。在一些情况下，光学系统的分辨率可以是亚像素分辨率。亚像素分辨率可以是在给定成像中使用的像素大小的情况下(例如，通过计算机处理图像等)以高于可实现的分辨率的分辨率进行成像。
光源
在一些实施方案中，如图49A-图53B中所示的光源4901是固态光源。在一些实施方案中，固态光源是发光二极管(LED)。在一些实施方案中，光源4901被配置为发射多个波长。在一些实施方案中，所述光源包括多个光源。在一些实施方案中，所述多个光源中的每个光源被配置为发射不同波长的光。在一些实施方案中，光源4901被配置为在第一时间发射第一波长的光；在第二时间发射第二波长的光和在第三时间发射第三波长的光。在一些实施方案中，第一时间的第一波长的光、第二时间的第二波长的光和第三时间的第三波长的光按顺序发射。在一些实施方案中，所述多个光源被配置为被传输用于按顺序颜色的定时脉冲序列。在一些实施方案中，多个光学子系统5001被配置为增加检测速度。在一些实施方案中，所述固态光源不是激光器。对于一些应用，所述光源包括滤光器以缩小光源发射的光的光谱。在一些实施方案中，所述光源被称为激发源。在一些实施方案中，所述光源发射的光被称为激发光。
光传输部件
在一些实施方案中，所述光学系统包括光传输部件。在一些实施方案中，所述光传输部件是波导。在一些实施方案中，所述光传输部件是如图47中所示的光管4702。在一些实施方案中，所述光传输部件是光纤。在一些实施方案中，所述光源通过光传输部件将光传输到流动池。在一些实施方案中，所述光源通过光管将光传输到流动池。在一些实施方案中，所述光传输部件定位在光源4901与流动池4905之间。在一些实施方案中，第二光传输部件定位在流动池与成像传感器之间。
成像通道
如本文所述的光学系统可以被配置用于对一种或多种荧光团进行成像。在一些实施方案中，所述光学系统被配置为清晰地对两种、三种或更多种不同的荧光团进行成像。在某些方面，所述光学系统包括一个或多个成像通道。在一些实施方案中，一个或多个成像通道中的第一成像通道被配置为对一种或多种荧光团中的第一荧光团进行成像。在一些实施方案中，一个或多个成像通道中的第二成像通道被配置为对一种或多种荧光团中的第二荧光团进行成像。在一些实施方案中，一个或多个成像通道中的第三成像通道被配置为对一种或多种荧光团中的第三荧光团进行成像。在一些实施方案中，成像通道包括光源4901、滤光器4910、成像传感器4912中的至少一个或其组合。
加热器
通常，测定需要加热。在一些情况下，流动池4905还包括加热器。在一些实施方案中，加热器与流动池集成在一起。在一些实施方案中，加热器与双面成像流动池4905集成在一起。在一些实施方案中，加热器与毛细管流动池5201集成在一起。在一些实施方案中，所述集成加热器是透明加热器块集成加热器。在一些实施方案中，所述加热器是IR加热器。在一些实施方案中，所述透明加热器与流动池的表面共形。在一些实施方案中，所述透明加热器与具有非矩形横截面的流动池共形并完全包围所述流动池。在一些实施方案中，所述透明加热器与具有圆形横截面的流动池共形并完全包围所述流动池。在一些实施方案中，所述透明加热器与毛细管流动池5201共形并完全包围所述毛细管流动池。在一些实施方案中，所述透明加热器在光学系统的一个或多个图像通道的所有图像通道中是透明的。
流动池形状
通常，流动池形状受到标准显微镜系统的限制，所述标准显微镜系统需要可以位于显微镜成像系统的FOV的焦深内的平坦表面。此类限制限制了流动池在其界面处的设计，产生了压力、温度、粘度或其组合的梯度。此类梯度可导致形成气泡的倾向、整个池中的不同反应动力学或其组合。另外，此类问题的典型解决方案需要可能无法通过标准显微镜系统有效成像的流动池设计。对于非平坦流动池形状的最佳成像性能，红外(IR)加热、适形和透明加热器或其组合可以用于降低结合、反应动力学或其他测定因素的梯度。在一些实施方案中，表面5101可以是非平坦的，或者是弯曲的，如图52中所示。表面5101可以包括凹形(远离光学系统弯曲)或凸形曲线(例如，朝向光学系统弯曲)。
在一些实施方案中，流动池可以包括如图53A-图53B和图54A-图54B中所示的毛细管流动池5201。在图53A-图53B中，样品流动通过毛细管流动池5201，其中流动方向沿着x轴。图53A说明了毛细管流动池5201的横截面的非限制性实例，其中样品位点4902布置在毛细管流动池5201的内表面上。在一些实施方案中，光源4901可以被引导至毛细管流动池，其中光被聚焦，从而产生包含布置在毛细管流动池的内表面的远侧上的样品位点4902的优化成像体积4915。在一些实施方案中，多个光学子系统5001(每个光学子系统包括光源4901)分布在毛细管流动池周围，使得最佳成像体积4915重叠，使得能够对布置在比对应于一个最佳成像体积4915的区域更大的区域上的样品位点进行优化成像。在一些实施方案中，光学子系统可以绕毛细管流动池5201的x轴旋转，如图53A-图53B中所示，从而使得重叠的优化成像体积4915能够在毛细管流动池5201的整个内表面上扫描。可替代地，毛细管流动池5201可以绕x轴旋转，并且光学子系统4914可以在成像时保持在恒定位置。
以均匀的图像质量获取布置在毛细管流动池5201的整个内表面上的样品位点4902的图像的另一种方式是通过将楔形块4916结合到每个光学子系统4914中，如图53A-图53B中所示。在某些方面，多个光学子系统4914绕毛细管流动池的x轴布置。在此类情况下，多个光学子系统4914可以经由如本文所述的重叠最佳成像体积4915对毛细管流池的内表面的一部分成像，所述部分大于一个光学子子系统4914的一个最佳成像体积4915。在某些方面，如本文所述，弯曲表面也可以通过将光学子系统4914放置成使得它们的对应光轴4913与待成像的表面的区域至少近似正交来被适当地成像。在此类情况下，多个光学子系统5001可以提供弯曲的大面积表面的优化图像。在一些实施方案中，每个光学子系统4914的楔形块组件4916被调整为在内表面的最靠近光源的一半上提供聚焦，如图54A中所示。可替代地，楔形块组件4916可以被调整为聚焦于布置在毛细管流动池5201的内表面的相对侧上的样品位点4902，如图54B中所示。在此类情况下，不需要旋转毛细管流动池5201或多个光学子系统5001，因为使用多个最佳成像体积4914重新聚焦和获取图像提供了对毛细管流动池的整个内表面的成像覆盖。在一些实施方案中，毛细管流动池沿着x轴平移，以便提供沿着毛细管流动池5201的整个长度的图像。在一些实施方案中，大面积表面可以包括至少约5平方毫米的面积。
像差校正
在一些实施方案中，可以应用像差校正方法以允许通过可以出现在流动池内的气泡进行成像。在一些实施方案中，非平坦流动池表面能够实现直角或离轴照射。在一些实施方案中，本文所述的光学系统可以包括各种元件的磁性定位。在一些实施方案中，所述光学系统可以被配置为对具有圆形边缘的流动池进行成像。
集成平场器
通常，标准荧光显微镜成像系统的照射面积和/或FOV被限制为存在的单个透镜系统和/或单个成像传感器的大小。通常，系统进行系统性地捕获FOV上的亮度的能力可以被称为系统的场均匀性。在一些情况下，从FOV的中心到边缘观察到整个FOV的亮度和分辨率的不均匀性。在一些情况下，照射不均匀性是由系统的透镜的不均匀场曲率效应引起的，通常这些系统是单透镜系统。被设计用于改善场均匀性的系统、装置和方法有时分别被称为平场器或平场。本文所述的光学系统可以包括平场器。在一些情况下，平场器包括多个光学子系统5001，其被设计来提供流动池表面的‘有效区域’的重叠覆盖。在多个光学子系统5001中的单个光学子系统4914的一个图像开始变得不均匀(例如，模糊增加、角落和边缘处的强度损失)的情况下，第二光学子系统4914的最佳成像体积4915可以重叠。在一些情况下，第一光学子系统的最佳成像体积4915与第二光学子系统和第三光学子系统重叠。
在一些实施方案中，包括样品位点4902的流动池的表面5101不是平坦的，如图52中所示。在某些方面，多个光学子系统5001中的每个光学子系统4914被定位成与流动池的有效区域的轮廓相匹配，如图52中所示
光学系统-超分辨率
为了对以高表面密度存在的非常小的样品位点特征，诸如核酸聚合酶集落(例如，包含扩增的靶核酸的斑点)进行成像，可以使用如本文所述的超分辨率成像技术。在一些实施方案中，如本文所述的随机光切换技术可以用于提高图像分辨率。可替代地，如本文所述的结构化照射技术可以用于提高光学系统中的图像分辨率。在一些情况下，超分辨率成像技术可以包括结构化照射。
在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用(包括使用厚流动池壁(例如壁(或盖玻片)厚度>700μm)和流体通道(例如，流体通道的高度或厚度是50-200μm))，成像性能的改善可以使用新颖的物镜设计来实现，所述物镜设计校正光学像差，所述光学像差是通过对厚盖玻片和/或流体通道的与物镜相对侧上的表面成像而引入的。
在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用(包括使用厚流动池壁(例如壁(或盖玻片)厚度>700μm)和流体通道(例如，流体通道的高度或厚度是50-200μm))，成像性能的改善可以甚至在使用商业上可用的现成物镜时通过以下实现：使用新颖的镜筒透镜设计(不同于只是在中间像平面上形成图像的传统显微镜中的镜筒透镜)，所述新颖的镜筒透镜设计与物镜组合地校正由厚流动池壁和/或中间流体层引起的光学像差。
在一些情况下，例如对于多通道(例如，两色或四色)成像应用，成像性能的改善可以通过以下来实现：使用多个镜筒透镜，一个镜筒透镜用于一个成像通道，其中每个镜筒透镜设计已经针对在此成像通道中使用的指定波长范围进行了优化。
在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用，成像性能的改善可以通过以下来实现：使用电光相位板与物镜组合以补偿由分隔流动池的上(近)内表面和下(远)内表面的流体层引起的光学像差。在一些情况下，此设计方法还可以补偿由例如运动致动的补偿器引入的振动，所述运动致动的补偿器根据对流动池的哪个表面进行成像而移入或移出光路。
公开了各种多通道荧光成像模块设计，其可以包括照射和成像光路，所述照射和成像光路包括将激发光束引导至物镜并且将透射通过物镜的发射光引导至多个检测通道的折叠光路(例如，包括一个或多个分束镜或合束镜，诸如二向色分束镜或合束镜)。本文所述的荧光成像模块的一些特别有利的特征包括二向色滤光器入射角的规范，其导致二向色滤光器的通带和阻带波长区域之间更陡峭和/或更均匀的过渡。此类滤光器可以包括在折叠光学器件内，并且可以包括二向色分束镜或合束镜。所公开的成像光学器件设计的另外有利特征可以包括一个或多个激发光源以及一个或多个检测光路相对于物镜和接收激发光束的二向色滤光器的位置和取向。激发光束也可以是线性偏振的，并且线性偏振的取向可以使得s偏振光入射在二向色滤光器的二向色反射表面上。此类特征可以潜在地改善激发光束过滤和/或减少由于，例如，二向色滤光器的表面变形而引入到发射光束中的波前误差。本文所述的荧光成像模块可以包括或可以不包括这些特征中的任一种，并且可以包括或可以不包括这些优点中的任一种。
本文还描述了被配置为通过对例如在流动池表面上形成的固定核酸分子或扩增核酸簇的阵列进行成像来分析大量不同核酸序列的装置和系统。本文所述的装置和系统还可用于例如进行比较基因组学的测序、跟踪基因表达、进行微RNA序列分析、表观基因组学、适体和噬菌体展示文库表征，以及用于进行其他测序应用。本文公开的装置和系统包括光学、机械、流体、热、电和计算装置/方面的各种组合。所公开的流动池装置、盒和系统所赋予的优点包括但不限于：(i)降低了装置和系统的制造复杂性和成本，(ii)显著降低了可消耗成本(例如，与目前可用的核酸测序系统的可消耗成本相比)，(iii)与典型的流动池表面功能化方法的兼容性，(iv)与微流体部件(例如，注射泵和隔膜阀等)组合时的灵活流量控制，以及(v)灵活的系统通量。
本文公开了毛细管流动池装置和毛细管流动池盒，其由现成的、一次性的、单腔(例如，单流体流动通道)或多腔毛细管构成，还可以包括流体适配器、盒底座、一个或多个集成的流体流量控制部件，或其任何组合。本文还公开了基于毛细管流动池的系统，其包括一个或多个毛细管流动池装置(或微流体芯片)、一个或多个毛细管流动池盒(或微流体盒)、流体流量控制器模块、温度控制模块、成像模块，或其任何组合。
一些公开的毛细管流动池装置、盒和系统的设计特征包括但不限于(i)统一的流动通道构造；(ii)试剂流之间的密封、可靠和重复性的切换，这些可以通过以下方式实现：简单的加载/卸载机制，使得可靠地密封了系统与毛细管之间的流体接口，从而有利于毛细管更换和系统重复使用，并能够精确控制反应条件，诸如试剂浓度、pH和温度；(iii)可更换的单个流体流动通道装置或毛细管流动池盒包括多个可以互换使用的流动通道，以提供灵活的系统通量，以及(iv)与多种检测方法(诸如荧光成像)的兼容性。
尽管所公开的毛细管流动池装置和系统、毛细管流动池盒、基于毛细管流动池的系统、微流体装置和盒以及基于微流体芯片的系统主要在其用于核酸测序应用的背景下进行了描述，但是所公开的装置和系统的各个方面不仅可以应用于核酸测序，也可以应用于任何其他类型的化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用。应当理解，可以单独地、共同地或彼此结合地理解所公开的方法、装置和系统的不同方面。尽管本文主要在荧光成像(包括例如荧光显微镜法成像、荧光共聚焦成像、双光子荧光等)的背景下讨论，但本领域技术人员将理解，许多公开的光学设计方法和特征可应用于其他成像模式，例如，明场成像、暗场成像、相衬成像等。
定义：除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语均具有与由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本说明书以及随附权利要求中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式的“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数提及形式。除非另外说明，否则本文中对“或”的任何提及均旨在涵盖“和/或”。
如本文所用，术语“约”数字是指所述数字加或减所述数字的10％。当在范围的上下文中使用时，术语“约”是指所述范围减其最低值的10％且加其最大值的10％。
如本文所用，短语“成像模块”、“成像单元”、“成像系统”、“光学成像模块”、“光学成像单元”和“光学成像系统”可互换使用，并且可以包括较大系统的部件或子系统，所述较大系统还可以包括，例如，流体学模块、温度控制模块、平移台、机器人流体分配和/或微板处理、处理器或计算机、仪器控制软件、数据分析和显示软件等。
如本文所用，术语“检测通道”是指光学系统内的光路(和/或其中的光学部件)，其被配置为将从样品产生的光信号传输至检测器。在一些情况下，检测通道可以被配置用于进行光谱学测量，例如使用检测器(诸如光电倍增管)来监测荧光信号或其他光信号。在一些情况下，“检测通道”可以是“成像通道”，例如光学系统内的光路(和/或其中的光学部件)，其被配置为捕获图像并将图像传输至图像传感器。
如本文所用，“可检测标记”可以是指本领域技术人员已知的多种可检测标记或标签中的任一种。实例包括但不限于发色团、荧光团、量子点、上转换磷光体、发光或化学发光分子、放射性同位素、磁性纳米颗粒、质量标签等。在一些情况下，优选的标记可以包括荧光团。可以用作荧光标记或荧光团的荧光部分包括但不限于，荧光素和荧光素衍生物，诸如羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、羧基萘基荧光素、异硫氰酸荧光素、NHS-荧光素、碘代乙酰胺基荧光素、荧光素马来酰亚胺、SAMSA-荧光素、荧光素氨基硫脲、碳酰肼甲基硫代乙酰基-氨基荧光素、罗丹明和罗丹明衍生物诸如TRITC、TMR、丽丝胺罗丹明、德克萨斯红、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明10、NHS-罗丹明、TMR-碘乙酰胺、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、丽丝胺罗丹明B磺酰肼、德克萨斯红磺酰氯、德克萨斯红酰肼、香豆素和香豆素衍生物诸如AMCA、AMCA-NHS、AMCA-磺基-NHS、AMCA-HPDP、DCIA、AMCE-酰肼、BODIPY和衍生物诸如BODIPY FLC3-SE、BODIPY530/550C3、BODIPY 530/550C3-SE、BODIPY 530/550C3酰肼、BODIPY 493/503C3酰肼、BODIPY FL C3酰肼、BODIPY FL IA、BODIPY 530/551IA、Br-BODIPY 493/503、级联蓝和衍生物诸如级联蓝乙酰基叠氮化物、级联蓝尸胺、级联蓝乙二胺、级联蓝酰肼、荧光黄和衍生物诸如荧光黄碘乙酰胺、荧光黄CH、花青和衍生物诸如吲哚鎓系花青染料、苯并吲哚鎓系花青染料、吡啶鎓系花青染料、噻唑鎓系花青染料、喹啉鎓系花青染料、咪唑鎓系花青染料、Cy 3、Cy5、镧系元素螯合物和衍生物诸如BCPDA、TBP、TMT、BHHCT、BCOT、铕螯合物、铽螯合物、Alexa Fluor染料、DyLight染料、Atto染料、LightCycler红染料、CAL Flour染料、JOE及其衍生物、俄勒冈绿染料、WellRED染料、IRD染料、藻红蛋白和藻胆素染料、孔雀石绿、对称二苯代乙烯、DEG染料、NR染料、近红外染料和其他物质，诸如在Haugland,Molecular Probes Handbook,(Eugene,Oreg.)第6版；Lakowicz,Principles ofFluorescence Spectroscopy,第2版,Plenum Press New York(1999)或Hermanson,Bioconjugate Techniques,第2版中描述的那些，或其衍生物，或其任何组合。花青染料可以磺化或非磺化形式存在，并且包含被两个氮原子之间的聚甲炔桥隔开的两个假吲哚(indolenin)、苯并吲哚鎓、吡啶鎓、噻唑鎓和/或喹啉鎓基团。市售花青荧光团包括，例如，Cy3(其可包含1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓或1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)、Cy5(其可包含1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓或1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-磺基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓-5-磺酸酯)和Cy7(其可包含1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓或1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)，其中“Cy”代表“花青”，且第一个数字表示两个假吲哚基团之间的碳原子数。Cy2是噁唑衍生物而不是假吲哚，且苯并衍生的Cy3.5、Cy5.5和Cy7.5是此规则的例外。
如本文所用，术语“激发波长”是指用于激发荧光指示剂(例如，荧光团或染料分子)并产生荧光的光的波长。尽管通常将激发波长指定为单个波长，例如620nm，但是本领域技术人员将理解，此说明书是指以指定波长为中心的波长范围或激发滤光器带通。例如，在一些情况下，指定激发波长的光包括指定波长±2nm、±5nm、±10nm、±20nm、±40nm、±80nm或更大的光。在一些情况下，所使用的激发波长可以与或可以不与荧光指示剂的最大吸收峰一致。
如本文所用，术语“发射波长”是指由荧光指示剂(例如，荧光团或染料分子)在由适当波长的光激发后发射的光的波长。尽管通常将发射波长指定为单个波长，例如670nm，但是本领域技术人员将理解，此说明书是指以指定波长为中心的波长范围或发射滤光器带通。在一些情况下，指定发射波长的光包括指定波长±2nm、±5nm、±10nm、±20nm、±40nm、±80nm或更大的光。在一些情况下，所使用的发射波长可以与或可以不与荧光指示剂的最大发射峰一致。
如本文所用，如果荧光源自退火或以其他方式拴系于表面的荧光团，诸如具有与表面上的寡核苷酸衔接子的对应区段反向互补的区域并退火至所述对应区段的经荧光标记的核酸序列，那么所述荧光是‘特异性的’。这种荧光与源自没有通过这种退火拴系到表面上的荧光团的荧光，或者在一些情况下与表面的背景荧光形成对比。
如本文所用，“核酸”(也称为“核酸分子”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))是通过共价核苷间键连接的两个或更多个核苷酸的线性聚合物，或其变体或功能片段。在天然存在的核酸实例中，核苷间键通常是磷酸二酯键。然而，其他实例任选地包括其他核苷间键，诸如硫代磷酸酯键，并且可以或可以不包括磷酸基团。核酸包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA、DNA/RNA杂交体、肽核酸(PNA)、PNA与DNA或RNA之间的杂交体，并且还可以包括其他类型的核酸修饰。
如本文所用，术语“核苷酸”是指包含芳香族碱、糖和磷酸的分子。如在此引用的“核苷酸部分”可以是被修饰的核苷酸或核苷，例如像与聚合物核心或接头缀合的核苷酸部分(例如，在核苷酸缀合物、聚合物-核苷酸缀合物或颗粒-核苷酸缀合物中)。规范或非规范核苷酸与所述术语的用法一致。在一些情况下，磷酸包括单磷酸、二磷酸或三磷酸，或对应的磷酸类似物。在一些实施方案中，“核苷酸”是指核苷酸、核苷或其类似物。在一些情况下，核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷(例如，含有2-脱氧-D-核糖的脱氧核糖核苷或含有D-核糖的核糖核苷)。其他核苷酸类似物的非限制性实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯和2-O-甲基核糖核苷酸等。
当涉及本文所述的表面时，术语“非平坦”是指表面的平坦度偏离至少一个维度的精确平坦度，所述平坦度可以使用平坦度计或光学方法(诸如反射率或干涉测量法)进行测量。在一些情况下，非平坦表面可以包括一个或多个弯曲部分。在一些情况下，弯曲部分的曲率可以通过肉眼感知。在一些情况下，非平坦表面可以是弯曲表面。例如，本文其他地方描述的弯曲表面可以是非平坦表面。非平坦基底可以包括在与表面相当的长度尺度上偏离平坦度的特征。例如，非平坦表面可以包括一个或多个特征，所述特征是非平坦表面的尺寸(例如，长度、宽度、厚度等)的至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％或更大百分比。在一些情况下，非平坦表面可以包括一个或多个特征，所述特征是非平坦表面的尺寸的至多约60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更小百分比。特征的实例包括但不限于曲线(例如，单个曲线、波形等)、三角形特征、正方形特征、其他几何特征等，或其任何组合。非平坦表面可以具有表面长度或宽度的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、300％、400％、500％或更大百分比的表面高度变化(例如，平坦度偏差)。例如，宽度为5毫米的圆柱体的半圆形部分可以具有100％的平坦度偏差。非平坦表面可以具有表面长度或宽度的至多约500％、400％、300％、200％、175％、150％、125％、100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比的表面高度变化(例如，平坦度偏差)。
当涉及本文所述的表面时，术语“平坦”或“平坦度”可以是指平均表面平坦度或平面度偏差，其可以使用机械测量计或光学方法(诸如反射率或干涉测量法)进行测量。在一些情况下，平面度偏差可以包括在表面上的两个不同点处测量的切向之间的锐角，例如，在非平坦表面上间隔至少1埃、1nm、1um、1mm、1cm或更大的点处，所述锐角可以大于0.1度、大于0.5度、大于1度、大于2度、大于5度，大于10度、15度、20度或更大，或在由前述任意两个定义的范围内。
在一些情况下，平坦度可以是指与物体表面的高度随物体的面积变化的程度相关的物体(例如，基底)的特性。例如，平坦物体的物体表面高度随物体的长度比例可以没有变化或基本上没有变化。在另一个实例中，非平坦物体的物体表面高度随物体的长度比例可以具有变化。在一些情况下，非平坦表面可以具有单调变化的高度(例如，物体的高度仅在一个方向上变化)。例如，半圆柱形物体可以具有单调变化的高度。在一些情况下，非平坦表面可以具有非单调变化的高度。例如，具有正弦高度谱的表面可以具有非单调变化的高度。
术语“载体”或“样品载体结构”在本文中可互换使用，以包括试剂诸如核酸可以固定在其上的任何固体或半固体物品。核酸可以通过任何方法固定在固体载体上，包括但不限于物理吸附、通过离子或共价键形成或其组合。固体载体可以包括聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的非限制性实例包括膜、平面、微量滴定板、珠、过滤器、测试条、载玻片、盖玻片和试管，在其上合成、附接、连接或以其他方式固定寡聚物的任何固相材料。载体可以包括“树脂”、“相”、“表面”、“基底”、“涂层”和/或“载体”载体可以包括有机聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚环氧乙烷(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺，及其共聚物和接枝物。载体也可以是无机的，诸如玻璃、二氧化硅、可控孔度玻璃(CPG)或反相二氧化硅。载体的构造可以呈珠、球、颗粒、微粒、凝胶或表面的形式。表面可以是平面的、基本上平面的或非平面的。载体可以是多孔的或非多孔的，并且可以具有溶胀或非溶胀特征。载体可以成形为包括一个或多个孔、凹陷或其他容器、器皿、特征或位置。多个载体可以在不同位置处配置成阵列。载体可以是可寻址的(例如，用于试剂的机器人递送)，或者通过检测机构，包括通过激光照射进行扫描和共焦或偏转光收集。扩增载体(例如，珠)可以放置在另一个载体内或上(例如，第二个载体的孔内)。载体可以是流动池，诸如核酸测序流动池。在一些实施方案中，由于载体的聚合物材料，载体可以具有亲水性表面。
被视为信息管道的荧光成像：荧光成像系统在典型的基因组测定技术(包括核酸测序应用)中所起作用的有用提取是作为信息管道，其中光子信号在管道的一端(例如，用于成像的物镜)进入，并且关于荧光信号的位置特异性信息在管道的另一端(例如，在图像传感器的位置处)出现。当更多的信息通过这个管道传输时，一些内容不可避免地会在传输过程中丢失且永远无法恢复。这种情况的一个实例是太多标记的分子(或克隆扩增的分子簇)存在于基底表面的小区域内而不能在图像中清楚地分辨；在图像传感器的位置处，很难区分来自相邻分子簇的光子信号，从而增加了将信号归因于错误簇的概率并导致检测错误。在一些情况下，所述簇是聚合酶集落。
光学成像模块的设计：因此，设计光学成像模块的目标是最大化通过此检测管道的信息内容流，并最小化检测错误。在设计过程中需要解决几个关键的设计元素包括：
1)将待成像的基底表面上的物理特征密度与光学成像系统的整体图像质量和所使用的图像传感器的像素采样频率相匹配。这些参数的失配可导致信息丢失，有时甚至产生错误信息，例如，当像素采样频率低于光学分辨率极限的两倍时，可出现空间混叠。
2)将待成像的区域的大小与光学成像系统的整体图像质量和整个视场上的聚焦质量相匹配。
3)将光学系统设计的光学收集效率、调制传递函数和图像传感器性能特征与输入激发光子通量预期的荧光光子通量、染料效率(与染料消光系数和荧光量子产率有关)相匹配，同时考虑到背景信号和系统噪声特征。
4)最大化光谱内容的分离，以减少荧光成像通道之间的串扰。
5)图像采集步骤与样品或光学器件在不同视场的图像捕获之间的重新定位的有效同步，以最小化成像系统的停机时间(或最大化占空比)，并且从而最大化图像捕获过程的总体通量。
本公开描述了一种系统性方式来解决以上概述的每个设计元素并创建成像系统的部件水平规范。
改善光学分辨率和图像质量，以改善或最大化信息传递和通量：一种非限制性设计实践可以从区分两个相邻特征所需的光学分辨率开始，如根据每mm线对的数量X(lp/mm)所规定的，并将其转换为对应的数值孔径(NA)要求。然后，可以使用数值孔径要求来评估对调制传递函数和图像对比度的影响。
标准调制传递函数(MTF)描述了通过光学系统传递的图像对比度(调制)的空间频率响应；图像对比度作为空间频率的函数而降低，并且随着NA的增加而增加。此函数限制了对于给定NA可以实现的对比度/调制。此外，波前误差可对MTF产生负面影响，因此需要使用真实的系统MTF而不是衍射受限光学器件预测的MTF来改善或优化光学系统设计。应注意，如本文所用，MTF将是指整个系统MTF(包括从盖玻片到图像传感器的完整光路)，尽管设计实践可主要考虑物镜的MTF。
在基因组测试应用中，当待成像的目标是表面上的高密度“斑点”阵列(随机分布或图案化)时，可以确定下游分析所需的最小调制传递值，以分辨两个相邻斑点并区分四种可能的状态(例如，开-关、开-开、关-开和关-关)。例如，假设斑点足够小，可近似为点光源。假设检测任务是确定间隔距离d的两个相邻斑点是开还是关(换言之，亮还是暗)，并且由样品平面(或物体平面)处的斑点产生的荧光信号的对比度噪声比(CNR)是C样品，则在理想条件下，图像传感器平面处的两个相邻斑点的读出信号的CNR，C图像可以近似为C图像＝C样品*MTF(1/d)，其中MTF(1/d)是空间频率＝(1/d)时的MTF值。
在典型的设计中，C的值可以至少为4，使得可以使用简单的阈值方法来避免荧光信号的错误分类。假设荧光信号强度在平均值附近的高斯分布，在C图像>4时，正确分类荧光信号(例如，为开或关)的预期误差<0.035％。在对MTF具有接近100％的值的稀疏场(例如，在簇或斑点的低表面密度下)进行测量时，使用专有高CNR测序和表面化学(诸如在美国专利申请号16/363,842中描述的)允许实现拴系到基底表面的克隆扩增的标记寡核苷酸分子簇的样品平面CNR(C样品)值大于12(或甚至更高)。假设样品平面CNR值C样品>12并且目标分类错误率<0.1％(因此，C图像>4)，在一些实施方式中，M(1/d)的最小值可以确定为M(1/d)＝4/12～33％。因此，至少33％的调制传递函数阈值可以用于保留所传递图像的信息内容。
设计实践可以将两个特征或斑点的最小间隔距离d与光学分辨率要求(如上所述以X(lp/mm)表示)联系起来，如d＝(1mm)/X，例如，d是光学系统可以完全分辨的两个特征或斑点之间的最小间隔距离。在本文公开的一些设计中，当设计分析的目的是增加或最大化相关信息传递时，此设计标准可以放宽至d＝(1mm)/X/A，其中2>A>1。对于X lp/mm的相同光学分辨率，减小了d值，即样品平面上的最小可分辨斑点间隔距离，从而能够使用更高的特征密度。
设计实践使用奈奎斯特准则确定样品平面上的最小空间采样频率，其中空间采样频率S≥2*X(并且其中X是如上所述以X lp/mm表示的成像系统的光学分辨率)。当系统空间采样频率接近奈奎斯特准则时，情况经常如此，大于S的成像系统分辨率导致混叠，因为由光学系统分辨的较高频率信息不能被图像传感器充分采样。
在本文公开的一些设计中，可以使用基于关系S＝B*Y(其中B≥2并且Y是真实光学系统MTF极限)的过采样方案来进一步提高成像系统的信息传递能力。如以上所指示，X(lp/mm)对应于实际的、非零(>33％)的最小调制传递值，而Y(lp/mm)是光学分辨率的极限，因此在Y(lp/mm)处的调制为0。因此，在所公开的设计中，Y(lp/mm)可以有利地显著大于X。对于B≥2的值，所公开的设计对于样品物体频率X是过采样的，例如，S≥B*Y>2*X。
以上关系可以用于确定系统放大率，并且可以提供图像传感器像素大小的上限。图像传感器像素大小的选择与系统光学质量以及减少混叠所需的空间采样频率相匹配。图像传感器像素大小的下限可以基于光子通量来确定，因为相对噪声贡献随着像素的减小而增加。
然而，其他设计方法也是可能的。例如，将NA减小至小于0.6(例如，0.5或更小)可以提供增加的景深。这种增加的景深可以实现双表面成像，其中可以在具有或没有重新聚焦的情况下同时对不同深度的两个表面进行成像。如上所讨论，减小NA可降低光学分辨率。在一些实施方式中，可以使用更高的激发光束功率，例如1W或更高的功率来产生强信号。固有的高对比度样品(例如，包括表现出强前景信号和明显降低的背景信号的样品表面)也可以用于促进高对比度噪声比(CNR)图像的采集，例如，具有>20的CNR值，其为核酸测序应用中的碱基判定提供改善的信号辨别等。在本文公开的一些光学系统设计中，使用样品载体结构(诸如具有亲水性表面的流动池)来减少背景噪声。
在各种实施方式中，所公开的光学系统提供了大视场(FOV)。例如，大于2或3mm的FOV可以通过包括例如物镜和镜筒透镜的一些光学成像系统提供。在一些情况下，光学成像系统提供减小的放大率，例如，小于10x的放大率。在一些实施方式中，这种减小的放大率可以有利于大FOV设计。尽管放大率减小，但是此类系统的光学分辨率可以仍然足够，因为可以使用具有小的像素大小或间距的检测器阵列。在一些实施方式中，像素大小小于由光学成像系统(例如，物镜和镜筒透镜)提供的光学分辨率的两倍的图像传感器可以用于满足奈奎斯特定理。
另外其他的设计也是可能的。在被配置为提供双表面成像的一些光学设计中，其中可以同时对不同深度的两个表面进行成像，光学成像系统(例如，物镜和/或镜筒透镜)被配置为比在其他深度的其他位置(例如，其他平面)更多地减少用于在这两个相应深度处对所述两个表面(例如，两个平面)进行成像的光学像差。另外，光学成像系统可以被配置为减少用于通过所述样品载体结构(诸如玻璃层(例如，盖玻片))上的透射层并通过包含样品或在所述两个表面中的至少一个表面上与样品接触的溶液(例如，水溶液)，在这两个相应深度处对所述两歌表面(例如，两个平面)进行成像的像差。
多通道荧光成像模块和系统：在一些情况下，本文公开的成像模块或系统可以包括荧光成像模块或系统。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可以包括单个荧光激发光源(用于提供单个波长或单个激发波长范围内的激发光)和配置为将激发光传输至样品(例如，布置在基底表面上的经荧光标记的核酸分子或其簇)的光路。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可以包括单个荧光发射成像和检测通道，例如光路，所述光路被配置为收集由样品发射的荧光，并将样品的图像(例如，其上布置有经荧光标记的核酸分子或其簇的基底表面的图像)传输至图像传感器或其他光检测装置。在一些情况下，荧光成像系统可以包括两个、三个、四个或多于四个的荧光激发光源和/或光路，其被配置为以两个、三个、四个或多于四个的激发波长(或在两个、三个、四个或多于四个的激发波长范围内)传输激发光。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可以包括两个、三个、四个或多于四个的荧光发射成像和检测通道，其被配置为收集样品在两个、三个、四个或多于四个发射波长(或在两个、三个、四个或多于四个的发射波长范围内)发射的荧光，并将样品的图像(例如，其上布置有经荧光标记的核酸分子或其簇的基底表面的图像)传输至两个、三个、四个或多于四个的图像传感器或其他光检测装置。
双表面成像：在一些情况下，本文公开的成像系统，包括荧光成像系统，可以被配置为获取单个样品载体结构或基底表面的高分辨率图像。在一些情况下，本文公开的成像系统，包括荧光成像系统，可以被配置为获取两个或更多个样品载体结构或基底表面(例如，流动池的两个或更多个表面)的高分辨率图像。在一些情况下，由所公开的成像系统提供的高分辨率图像可以用于随着各种试剂流过流动池或在流动池基底周围流动而监测在流动池的两个或更多个表面上发生的反应(例如，核酸杂交、扩增和/或测序反应)。图1A和图1B提供了这种双表面载体结构的示意图。图1A示出了双表面载体结构，诸如流动池，其包括内部流动通道，分析物或试剂可以通过所述内部流动通道流动。流动通道可以在第一层和第二层、顶层和底层和/或前层和后层之间形成，例如在所示的第一板和第二板、顶板和底板和/或前板和后板之间形成。一个或多个板可包括玻璃板，例如盖玻片等。在一些实施方式中，所述层包括硼硅酸盐玻璃、石英或塑料。这些顶层和底层的内表面提供了流动通道的壁，这些壁有助于限制分析物或试剂通过流动池的流动通道的流动。在一些设计中，这些内表面是平的。类似地，顶层和底层可以是平的。在一些设计中，在顶层和底层之间布置至少一个另外的层(未示出)。该另外的层可在其中切出一个或多个通道，这些通道有助于限定一个或多个流动通道并控制分析物或试剂在流动通道内的流动。样品载体结构(例如，流动池)的另外讨论可以在下面找到。
图1A示意性地说明了流动池的第一内表面和第二内表面、顶内表面和底内表面，和/或前内表面和后内表面上的多个发荧光的样品位点。在一些实施方式中，可以在这些位点处发生反应以结合样品，使得荧光从这些位点发射(应注意，图1A是示意性的且未按比例绘制；例如，发荧光的样品位点的尺寸和间距可小于所示)。
图1B示出了具有两个表面的另一个双表面载体结构，所述两个表面包含待成像的发荧光的样品位点。样品载体结构包括具有第一外表面和第二外表面、顶外表面和底外表面和/或前外表面和后外表面的基底。在一些设计中，这些外表面是平的。在各种实施方式中，分析物或试剂流过这些第一外表面和第二外表面。图1B示意性地说明了在样品载体结构的第一外表面和第二外表面、顶外表面和底外表面，和/或前外表面和后外表面上的多个发荧光的样品位点。在一些实施方式中，可以在这些位点处发生反应以结合样品，使得荧光从这些位点发射(应注意，图1B是示意性的且未按比例绘制；例如，发荧光的样品位点的尺寸和间距可小于所示)。
在一些情况下，本文所述的荧光成像模块和系统可以被配置为对距物镜不同距离的第一表面和第二表面上的这种发荧光的样品位点进行成像。在一些设计中，一次仅对第一表面或第二表面中的一个聚焦。因此，在这样的设计中，这些表面中的一个在第一时间成像，并且另一个表面在第二时间成像。可以在对这些表面中的一个进行成像之后改变荧光成像模块的焦点，以便以可比较的光学分辨率对另一个表面成像，因为两个表面的图像不同时对焦。在一些设计中，可以将光学补偿元件引入到样品载体结构与图像传感器之间的光路中，以对两个表面中的一个成像。在这种荧光成像配置中，景深可能不够大，不能包括第一表面和第二表面两者。在本文所述的荧光成像模块的一些实施方式中，第一表面和第二表面两者可以在同一时间，例如同时成像。例如，荧光成像模块可以具有足够大的景深以包括两个表面。在一些情况下，可以通过例如减小物镜(或显微镜物镜)的数值孔径来提供这种增加的景深，这将在下面更详细地讨论。
如图1A和图1B所示，成像光学器件(例如，物镜)可以与第一表面和第二表面相距合适的距离(例如，与工作距离相对应的距离)定位，以在检测通道的图像传感器上形成第一表面和第二表面的对焦图像。如图1A和图1B的示例所示，第一表面可以在所述物镜和第二表面之间。例如，如所示，物镜布置在第一表面和第二表面两者之上，并且第一表面布置在第二表面之上。第一表面和第二表面例如处于不同的深度。第一表面和第二表面与荧光成像模块、照射和成像模块、成像光学器件或物镜中的任何一个或多个相距不同的距离。第一表面和第二表面彼此分开，其中第一表面在第二表面上方间隔开。在所示的示例中，第一表面和第二表面是平面，并且沿着垂直于所述第一平面和第二平面的方向彼此分开。同样，在所示的示例中，所述物镜具有光轴，并且所述第一表面和第二表面沿所述光轴的方向彼此分开。类似地，第一表面和第二表面之间的间隔可以对应于纵向距离，诸如沿着激发光束的光路和/或沿着穿过荧光成像模块和/或物镜的光轴。因此，这两个表面可以在纵向(Z)方向上彼此分开一定距离，所述纵向方向可以沿着激发光束的中心轴和/或物镜和/或荧光成像模块的光轴的方向。在一些实施方式中，该间隔可以例如对应于流动池内的流动通道。
在各种设计中，物镜(可与另一个光学部件，例如镜筒透镜组合)具有至少与第一表面和第二表面之间的纵向间隔(沿Z方向)一样大的景深和/或聚焦深度。因此，物镜可以单独地或与另外的光学部件组合地在一个或多个检测通道的图像传感器上同时形成第一表面和第二表面两者的对焦图像，其中这些图像具有可比较的光学分辨率。在一些实施方式中，成像模块可以需要或可以不需要重新聚焦以捕获具有可比较的光学分辨率的第一表面和第二表面两者的图像。在一些实施方式中，补偿光学器件不需要移入或移出成像模块的光路以形成第一表面和第二表面的对焦图像。类似地，在一些实施方式中，与用于形成第二表面的对焦图像时成像模块(例如，物镜和/或镜筒透镜)中的一个或多个光学元件(例如透镜元件)的位置相比，所述一个或多个光学元件不需要例如沿着第一光路和/或第二光路(例如，沿着成像光学器件的光轴)在纵向上移动以形成第一表面的对焦图像。然而，在一些实施方式中，成像模块包括自动聚焦系统，所述自动聚焦系统被配置为同时使第一表面和第二表面对焦。在各种实施方式中，将样品对焦以充分分辨样品位点，所述样品位点在横向方向(例如，X和Y方向)上紧密地间隔在一起。因此，在各种实施方式中，没有光学元件进入样品载体结构(例如，支撑样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器(或光电检测器阵列)之间的光路，以形成样品载体结构的第一表面和所述样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。类似地，在各种实施方式中，没有光学补偿用于在图像传感器或光电检测器阵列上形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像，所述光学补偿与用于在图像传感器或光电检测器阵列上形成样品载体结构第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像的光学补偿不相同。另外，在某些实施方式中，与形成样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像相比，在样品载体结构(例如在支撑样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器之间的光路中没有光学元件被不同地调节以形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。类似地，在一些各种实施方式中，与在图像传感器上形成所述样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像相比，在样品载体结构(例如在支撑样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器之间的光路中没有光学元件被移动不同的量或不同的方向以在图像传感器上形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。特征的任何组合都是可以的。例如，在一些实施方式中，在无需将光学补偿器移入或移出流动池和至少一个图像传感器之间的光路并且无需使成像系统的一个或多个光学元件(例如，物镜和/或镜筒透镜)沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，可以获得流动池的上内表面和下内表面的对焦图像。例如，在无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路或者无需使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，可以获得流动池的上内表面和下内表面的对焦图像。
可以将荧光成像模块、照射光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为减少或最小化在两个位置(例如，与流动池或其他样品载体结构上的两个表面相对应的两个平面，例如发荧光的样品位点所在之处)处的光学像差。可以将荧光成像模块、照射光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为相对于其他位置或平面减小或最小化所选位置或平面，例如在双表面流动池上包含发荧光的样品位点的第一表面和第二表面处的光学像差。例如，可以将荧光成像模块、照射光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为与位于距物镜其他距离的其他深度或平面相关的像差相比，减小或最小化位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的光学像差。例如，用于成像第一表面和第二表面的光学像差可以比距物镜约1mm至约10mm范围的区域中的其他地方更小。另外，在一些情况下，荧光成像模块、照射光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个可被配置为补偿由发射光穿过样品载体结构的一个或多个部分(例如包括样品附着在其上的表面中的一个的层以及可与样品接触的溶液)的透射引起的光学像差。该层(例如，盖玻片或流动池的壁)可包括例如具有折射率并引入光学像差的玻璃、石英、塑料或其他透明材料。
因此，当对第一表面和第二表面进行成像时，成像性能可以是基本上相同的。例如，对于第一表面和第二表面的成像，光学传递函数(OTF)和/或调制传递函数(MTF)可以是基本上相同的。这些传递函数中的一个或两个在一个或多个指定的空间频率下或在一系列空间频率上取平均值时可以例如在彼此的20％之内、15％之内、10％之内、5％之内、2.5％之内或1％之内，或由这些值中的任何形成的任何范围内。因此，在无需将光学补偿器移入或移出流动池和至少一个图像传感器之间的光路并且无需使成像系统(例如，物镜和/或镜筒透镜)的一个或多个光学元件沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，成像性能指标对于流动池的上内表面或下内表面成像可以是基本上相同的。例如，在无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路或者无需使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿其间的光路移动的情况下，成像性能指标对于流动池的上内表面或下内表面成像可以是基本上相同的。在一些实施方案中，光路是光轴。下文和于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723中包含了MTF的其他讨论，所述申请通过引用整体并入本文。
本领域技术人员将理解，在一些情况下，所公开的成像模块或系统可以是设计用于对样品或基底表面成像的独立光学系统。在一些情况下，它们可以包括一个或多个处理器或计算机。在一些情况下，它们可以包括一个或多个提供仪器控制功能和/或图像处理功能的软件包。在一些情况下，除了光学部件，例如光源(例如，固态激光器、染料激光器、二极管激光器、弧光灯、钨卤素灯等)、透镜、棱镜、反射镜、二向色反射器、分束镜、光学滤波器、光学带通滤波器、光导、光纤、光圈和图像传感器(例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器和照相机、电荷耦合装置(CCD)图像传感器和相机等)，它们还可以包括机械和/或光机械部件，例如X-Y平移台、X-Y-Z平移台、压电聚焦机构、电光相位板等。在一些情况下，它们可以充当设计用于例如基因组学应用(例如基因测试和/或核酸测序应用)的较大系统的模块、部件、子组件或子系统。例如，在一些情况下，它们可以充当较大系统的模块、部件、子组件或子系统，这些较大系统还包括不透光和/或其他环境控制外壳、温度控制模块、流动池和盒、流体学控制模块、流体分配机器人、盒和/或微孔板处理(拾放)机器人、一个或多个处理器或计算机、一个或多个基于本地和/或基于云的软件包(例如，仪器/系统控制软件包、图像处理软件包、数据分析软件包)、数据存储模块、数据通信模块(例如，蓝牙、WiFi、内联网或因特网通信硬件和相关软件)、显示模块等，或其任何组合。较大系统(例如设计用于基因组学应用的系统)的这些另外的部件将在下面更详细讨论。
图2A和图2B示出了用于多通道荧光成像的照射和成像模块100的非限制性示例。照射和成像模块100包括物镜110、照射源115、多个检测通道120和第一二向色滤光镜130，其可以包括二向色反射器或分束镜。在一些设计中可以包括自动聚焦系统，所述自动聚焦系统可以包括自动聚焦激光器102，其例如投射光斑，所述光斑的大小被监视以确定成像系统何时对焦。照射和成像模块100的一些或全部组件可以耦合到基板105。
照射或光源115可以包括被配置为产生至少期望的激发波长的光的任何合适的光源(在下文中更详细地讨论)。光源可以是发射一个或多个激发波长范围(或频带)内的光的宽带光源。光源可以是窄带光源，其发射一个或多个更窄波长范围内的光。在一些情况下，光源可以产生与期望的激发波长相对应的单个单独的波长(或线)，或者多个单独的波长(或线)。在一些情况下，线可以具有一些非常窄的带宽。可以适合用于照射源115的示例光源包括但不限于白炽灯丝、氙弧灯、汞蒸气灯、发光二极管、激光源(例如激光二极管)或固态激光器或其他类型的光源。如下所述，在一些设计中，光源可以包括偏振光源，例如线性偏振光源。在一些实施方式中，光源的取向使得s偏振光入射在一个或多个光学部件的一个或多个表面上，例如一个或多个二向色滤光镜的二向色反射表面上。
照射源115还可以包括一个或多个另外的光学部件，例如透镜、滤光器、光纤或任何其他合适的透射或反射光学器件，以向第一二向色滤光镜130输出具有合适特性的激发光束。例如，可以包括光束整形光学器件，以例如接收来自光源中的光发射器的光并产生光束和/或提供期望的光束特性。这样的光学器件可以例如包括准直透镜，所述准直透镜被配置为减小光的发散和/或增加准直和/或使光准直。
在一些实施方式中，照射和成像模块100中包括多个光源。在一些这样的实施方式中，不同的光源可以产生具有不同的光谱特性的光，例如，以激发不同的荧光染料。在一些实施方式中，由不同光源产生的光可以被引导以重合并形成聚集的激发光束。该复合激发光束可以由来自每个光源的激发光束构成。与重叠以形成复合光束的单个光束相比，复合激发光束将具有更大的光功率。例如，在包括产生两个激发光束的两个光源的一些实施方式中，由两个单独的激发光束形成的复合激发光束可以具有作为单独的光束的光功率之和的光功率。类似地，在一些实施方式中，可以包括三个、四个、五个或更多个光源，并且这些光源可以各自输出激发光束，所述激发光束一起形成具有光功率为各个光束的光功率之和的复合光束。
在一些实施方式中，光源115输出足够大量的光以产生足够强的荧光发射。较强的荧光发射可以增加荧光成像模块获取的图像的信噪比(SNR)和对比度噪声比(CNR)。在一些实施方式中，光源和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的输出的功率范围可以为约0.5W至约5.0W，或更大(如将在下面更详细地讨论的)。
再次参考图2A和图2B，第一二向色滤光镜130相对于光源布置以从其接收光。第一二向色滤光镜可以包括二向色镜、二向色反射器、二向色分束镜或二向色合束镜，其被配置为透射第一光谱区域(或波长范围)中的光并反射具有第二光谱区域(或波长范围)的光。第一光谱区域可以包括一个或多个光谱带，例如，在紫外光和蓝光波长范围内的一个或多个光谱带。类似地，第二光谱区域可以包括一个或多个光谱带，例如，从绿光到红光和红外光波长延伸的一个或多个光谱带。其他光谱区域或波长范围也是可能的。
在一些实施方式中，第一二向色滤光镜可以被配置为将来自光源的光透射到样品载体结构，例如显微镜载玻片、毛细管、流动池、微流体芯片或其他基底或载体结构。样品载体结构相对于照射和成像模块100支撑并定位样品，例如包含经荧光标记的核酸分子或其互补序列的组合物。因此，第一光路经由第一二向色滤光镜从光源延伸至样品。在各种实施方式中，样品载体结构包括至少一个表面，在所述至少一个表面上布置样品或将样品结合到所述至少一个表面上。在一些情况下，样品可以被布置在以下中或结合至以下：样品载体结构的至少一个表面上的不同的局部区域或位点。
在一些情况下，载体结构可以包括两个表面，所述两个表面距物镜110的距离不同(例如，沿物镜110的光轴位于不同位置或深度)，样品布置在所述两个表面上。如下所述，例如，流动池可以包括至少部分地由第一和第二(例如，上和下)内表面形成的流体通道，并且样品可以布置在第一内表面、第二内表面或两个内表面上的局部位点处。第一表面和第二表面可以由与溶液流过的流体通道相对应的区域分开，并且因此相对于照射和成像模块100的物镜110处于不同的距离或深度。
物镜110可以被包括在第一二向色滤光镜和样品之间的第一光路中。该物镜可以被配置为例如具有焦距长度、工作距离、和/或被定位成将来自光源的光聚焦到样品上，例如显微镜载玻片、毛细管、流动池、微流体芯片或其他基质或载体结构的表面上。类似地，物镜110可被配置为具有合适的焦距长度、工作距离、和/或被定位为收集从样品反射、散射或发射的光(例如，荧光发射)，并形成样品的图像(例如荧光图像)。
在一些实施方式中，物镜110可以包括显微镜物镜，例如现成的物镜。在一些实施方式中，物镜110可以包括定制物镜。定制物镜和/或定制物镜-镜筒透镜组合的示例在下文以及于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723(其全部内容通过引用合并于本文)中进行了描述。物镜110可以被设计为减小或最小化在两个位置，例如与流动池或其他样品载体结构的两个表面相对应的两个平面处的光学像差。物镜110可以被设计为相对于光路中的其他位置或平面减小在所选位置或平面(例如，双表面流动池的第一表面和第二表面)处的光学像差。例如，物镜110可以被设计为与和距物镜其他距离的其他深度或平面相关的光学像差相比，减小位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的光学像差。例如，在一些情况下，用于成像流动池的第一表面和第二表面的光学像差可以比在距物镜前表面1至10mm跨度的区域中的其他地方显示的像差更小。另外，定制物镜110在一些情况下可以被配置为补偿由荧光发射光通过样品载体结构的一个或多个部分(例如包含一个或多个流动池表面(其上布置有样品)的层，或包含填充流动池的流体通道的溶液的层)的透射所引起的光学像差。这些层可以包括例如玻璃、石英、塑料或具有折射率并且可以引入光学像差的其他透明材料。
在一些实施方式中，物镜110可具有0.6或更大的数值孔径(NA)(如下文更详细地讨论)。这样的数值孔径可以提供减小的聚焦深度和/或景深、改善的背景辨别力以及增加的成像分辨率。
在一些实施方式中，物镜110可具有0.6或更小的数值孔径(NA)(如下文更详细地讨论)。这样的数值孔径可以提供增加的聚焦深度和/或景深。这种增加的聚焦深度和/或景深可以提高对相隔一定距离的平面进行成像的能力，例如，所述一定距离将双表面流动池的第一表面和第二表面分开。
如上所述，流动池可包括例如第一层和第二层，其分别包括第一内表面和第二内表面，所述第一内表面和第二内表面由流体通道隔开，分析物或试剂可流过所述流体通道。在一些实施方式中，物镜110和/或照射和成像模块100可以被配置为提供足够大的景深和/或聚焦深度，从而以相当的光学分辨率顺序地(通过在成像第一表面和第二表面之间重新聚焦成像模块)或同时地(通过确保足够大的景深和/或聚焦深度)对流动池的第一内表面和第二内表面成像。在一些情况下，景深和/或聚焦深度可以至少等于或大于将要被成像的流动池的第一表面和第二表面(例如流动池的第一内表面和第二内表面)分开的距离。在一些情况下，第一表面和第二表面，例如双表面流动池或其他样品载体结构的第一内表面和第二内表面，例如可以以约10μm至约700μm的范围或更大的距离分开(如下面将更详细讨论的)。因此，在一些情况下，景深和/或聚焦深度可以在约10μm至约700μm范围内，或者更大(如下面将更详细讨论的)。
在一些设计中，补偿光学器件(例如，“光学补偿器”或“补偿器”)可以移入或移出成像模块中的光路，例如，由物镜110收集的光被传递到图像传感器所通过的光路，以使成像模块能够成像双表面流动池的第一表面和第二表面。成像模块可以被配置为，当补偿光学器件被包括在物镜和被配置为捕获第一表面的图像的图像传感器或光电检测器阵列之间的光路中时，例如对第一表面进行成像。在这样的设计中，成像模块可以被配置为，当从物镜110和被配置为捕获第二表面的图像传感器或光电检测器阵列之间的光路中去除或不包括补偿光学器件时，对第二表面成像。当使用具有高数值孔径(NA)值(例如，对于至少0.6、至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.95、至少1.0或更高的数值孔径值)的物镜110时，对光学补偿器的需求可以更加明显。在一些实施方式中，光学补偿光学器件(例如，光学补偿器或补偿器)包括折射光学元件(例如透镜)，光学透明材料板(例如玻璃)，光学透明材料板(例如玻璃)，或者在偏振光束情况下的四分之一波长板或半波长板等。可以采用其他配置以使第一表面和第二表面能够在不同时间成像。例如，一个或多个透镜或光学元件可以被配置为在物镜110和图像传感器之间的光路中移入和移出或沿其平移。
然而，在某些设计中，物镜110被配置为提供足够大的聚焦深度和/或景深，以使得第一表面和第二表面能够以相当的光学分辨率成像，无需此类补偿光学器件移入和移出成像模块中的光路，例如物镜与图像传感器或光电检测器阵列之间的光路。类似地，在各种设计中，物镜110被配置为提供足够大的聚焦深度和/或景深，以使得第一表面和第二表面能够以相当的光学分辨率成像，无需移动光学器件，例如无需将一个或多个透镜或其他光学部件沿着成像模块中的光路(例如物镜与图像传感器或光电检测器阵列之间的光路)平移。这种物镜的示例将在下面更详细地描述。
在一些实施方式中，物镜(或显微镜物镜)110可以被配置为具有减小的放大率。物镜110可以被配置为例如使得荧光成像模块具有从小于2倍到小于10倍的放大率(如将在下面更详细地讨论的)。这种减小的放大率可以改变设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，物镜110也可以被配置为使得荧光成像模块具有大的视场(FOV)，其范围例如为约1.0mm至约5.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)，如将在下面更详细地讨论的。
在一些实施方式中，物镜110可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得FOV具有衍射受限性能，例如，在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中小于0.15波的像差，如将在下面更详细地讨论的。
在一些实施方式中，物镜110可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得FOV具有衍射受限性能，例如，在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中斯特列尔比大于0.8，如将在下面更详细地讨论的。
再次参考图2A和图2B，第一二向色分束镜或合束镜布置在光源和样品之间的第一光路中，以用一个或多个激发光束照射样品。该第一二向色分束镜或合束镜也在从样品到用于检测荧光发射的不同光通道的一个或多个第二光路中。因此，第一二向色滤光镜130将由照射源115发射的激发光束的第一光路和由样品样本发射的发射光的第二光路耦合到各个光通道，在所述光通道中，光被导引至用于捕获样品图像的相应图像传感器或光电检测器阵列。
在各种实施方式中，第一二向色滤光镜130(例如，第一二向色反射器或分束镜或合束镜)具有被选择为仅在指定的波长带内或可以在多个波长带(包括所需的一个或多个激发波长)内透射来自照射源115的光的通带。例如，第一二向色分束镜130包括具有二向色反射器的反射面，所述二向色反射器具有光谱透射率响应，即例如被配置为透射由光源输出的具有至少一些波长的光，其形成激发光束的一部分。光谱透射率响应可以被配置为不透射(例如，而是反射)一个或多个其他波长的光，例如一个或多个其他荧光发射波长的光。在一些实施方式中，光谱透射率响应也可以被配置为不透射(例如，而是反射)由光源输出的一个或多个其他波长的光。因此，第一二向色滤光镜130可以用于选择光源输出的光的哪个波长或哪些波长到达样品。相反，第一二向色分束镜130中的二向色反射器具有光谱反射率响应，所述光谱反射率响应反射具有与来自样品的期望的荧光发射相对应的一个或多个波长的光，并且可以反射从光源输出的具有一个或多个波长的不意图到达样品的光。因此，在一些实施方式中，二向色反射器具有光谱透射率，其包括一个或多个通带，用于透射要入射到样品上的光；和一个或多个阻带，其反射通带外的光，例如，一个或多个发射波长的光，以及由光源输出的不意图到达样品的可能的一个或多个波长的光。同样，在一些实施方式中，二向色反射器具有光谱反射率，其包括一个或多个光谱区域(该一个或多个光谱区域被配置为反射一个或多个发射波长以及由光源输出的不意图到达样品的可能的一个或多个波长)，并且包括一个或多个在这些反射区域之外透射光的区域。包括在第一二向色滤光镜130中的二向色反射器可以包括反射滤光器，诸如被配置为提供适当的光谱透射和反射分布的干涉滤光器(例如，四分之一波长堆叠)。图2A和图2B还示出了二向色滤光镜105，其可以包括例如二向色分束镜或合束镜，其可以用于引导自动聚焦激光器102穿过物镜并到达样品载体结构。
尽管图2A和图2B中示出并且如上所述的成像模块100被配置为使得激发光束被第一二向色滤光镜130透射至物镜110，但在一些设计中，照射源115可以相对于第一二向色滤光镜130布置和/或第一二向色滤光镜被配置(例如取向)为使得激发光束被第一二向色滤光镜130反射到物镜110。类似地，在一些这样的设计中，第一二向色滤光镜130被配置为透射来自样品的荧光发射，并且可以透射从光源输出的不意图到达样品的具有一个或多个波长的光。如将在下面讨论的那样，透射而不是反射荧光发射的设计可以潜在地减小检测到的发射中的波前误差和/或可以具有其他优点。在任何一种情况下，在各种实施方式中，第一二向色反射器130布置在第二光路中，以接收来自样品的荧光发射，其中至少一些继续到达检测通道120。
图3A和3B示出了图2A和2B的多通道荧光成像模块内的光路。在图2A和图3A中显示的示例中，检测通道120被布置为接收来自样品样本的荧光发射，其由物镜110透射并由第一二向色滤光镜130反射。如上文所提及且在下文中更详细地描述的，在一些设计中，检测通道120可以被布置为接收由第一二向色滤光镜透射而不是反射的发射光的一部分。在任一情况下，检测通道120可以包括用于接收至少一部分发射光的光学器件。例如，检测通道120可以包括一个或多个透镜，例如镜筒透镜，并且可以包括一个或多个图像传感器或检测器，例如用于成像或以其他方式基于接收到的光产生信号的光电检测器阵列(例如，CCD或CMOS传感器阵列)。镜筒透镜可以例如包括一个或多个透镜元件，其被配置为将样品的图像形成到传感器或光电检测器阵列上以捕获其图像。下文和于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723中包含了检测通道的其他讨论，该申请的全部内容通过引用合并于本文。在一些情况下，结合适当的采样方案(包括过采样或欠采样)，使用具有相对较高的灵敏度、小像素和高像素计数的图像传感器可以实现改善的光学分辨率。
图3A和3B是示出图2A和2B的照射和成像模块100的光路的射线追迹图。图3A对应于照射和成像模块100的顶视图。图3B对应于照射和成像模块100的侧视图。这些图中示出的照射和成像模块100包括四个检测通道120。然而，将理解，所公开的照射和成像模块可以等同地在包括多于或少于四个检测通道120的系统中实现。例如，在不背离本公开的精神或范围的情况下，本文公开的多通道系统可以用少至一个检测通道120、或多达两个检测通道120、三个检测通道120、四个检测通道120、五个检测通道120、六个检测通道120、七个检测通道120、八个检测通道120或多于八个的检测通道120来实现。
图3A和3B中所示的成像模块100的非限制性示例包括四个检测通道120、第一二向色滤光镜130(其反射发射光束150)、第二二向色滤光镜(例如，二向色分束镜)135(其将光束150分成透射部分和反射部分)和两个通道特异性二向色滤光镜(例如，二向色分束镜)140(其进一步将光束150的透射和反射部分在各个检测通道120之间拆分)。示出了用于在检测通道之间拆分光束150的二向色分束镜135和140中的二向色反射表面相对于光束150的中心光束轴或成像模块的光轴成45度布置。但是，如下所述，可以采用小于45度的角度，并且可以提供诸如从通带到阻带的更陡峭过渡的优点。
不同的检测通道120包括成像设备124，成像设备124可以包括图像传感器或光电检测器阵列(例如CCD或CMOS检测器阵列)。不同的检测通道120还包括光学器件126，例如透镜(例如，一个或多个镜筒透镜，各自包括一个或多个透镜元件)，其布置成将进入检测通道120的一部分发射光聚焦在与光电检测器阵列124平面重合的焦平面上。与物镜110组合的光学器件126(例如，镜筒透镜)被配置为将样品的图像形成在光电检测器阵列124上以捕获样品的图像，例如，在样品结合到流动池或其他样品载体结构上的表面后，所述表面的图像。因此，样品的这种图像可以包括在样品载体结构的空间范围内的其中样品正在发射荧光的多个荧光发射点或区域。物镜110与光学器件126(例如，镜筒透镜)一起可以提供包括样品的一部分或整个样品的视场(FOV)。类似地，不同检测通道120的光电检测器阵列124可以被配置为捕获由物镜和镜筒透镜提供的全视场(FOV)或其一部分的图像。在一些实施方式中，一些或所有检测通道120的光电检测器阵列124可以检测由布置在样品载体结构，例如流动池的表面或其一部分上的样品发射的发射光，并记录代表其图像的电子数据。在一些实施方式中，一些或所有检测通道120的光电检测器阵列124可以检测由样本发射的发射光中的特征，而无需捕获和/或存储布置在流动池表面上的样品的图像和/或由物镜和光学器件126和/或122(例如镜筒透镜的元件)提供的全视场(FOV)的图像。在一些实施方式中，所公开的成像模块(例如，由物镜110和光学器件126和/或122的组合所提供的)的FOV可以在例如约1mm与5mm之间的范围内(例如在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)，如下所述。可以例如选择FOV以提供成像模块的放大率和分辨率之间的平衡和/或基于图像传感器和/或物镜的一个或多个特性选择FOV。例如，可以结合更小和更快的成像传感器来提供相对较小的FOV以实现高通量。
再次参考图3A和3B，在一些实施方式中，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为减少使用光学器件126结合物镜110获取的图像中的光学像差。在一些包括用于以不同的发射波长成像的多个检测通道实施方式中，用于不同的检测通道的光学器件126(例如，镜筒透镜)具有不同的设计，以减少针对该特定通道被配置用于成像的各个发射波长的像差。在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为当对包括布置在其上的发荧光的样品的样品载体结构上的特定表面(例如，平面、物平面等)成像时，与其他位置(例如，对象空间中的其他平面)相比减小像差。类似地，在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为在对具有布置在其上的发荧光的样品位点的双表面样品载体结构(例如双表面流动池)上的第一表面和第二表面(例如第一平面和第二平面，第一物平面和第二物平面等)成像时，与其他位置(例如，对象空间中的其他平面)相比减小像差。例如，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被设计为与距物镜其他距离的其他深度或平面相关的像差相比，减小位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的像差。例如，与距物镜约1mm至约10mm的区域中的其他地方相比，用于成像第一表面和第二表面的光学像差可以更小。另外，在一些实施方案中，检测通道中的定制光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为补偿由于发射光穿过样品载体结构的一个或多个部分(诸如包括其上布置样品的表面中的一个的层以及可与其上布置样品的表面邻近并且接触的溶液)的透射而引起的像差。包括其上布置样品的表面中的一个的层可以包括例如玻璃、石英、塑料或其他具有折射率并且引入光学像差的透明材料。例如，在一些实施方式中，检测通道中的定制光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为补偿由样品载体结构(例如盖玻片或流动池壁)或其他样品载体结构部件以及可能的与布置样品的表面邻近并与其接触的溶液引起的光学像差。
在一些实施方式中，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)被配置为具有减小的放大率。检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为例如使得荧光成像模块具有小于例如10倍的放大率，如将在下面进一步讨论的。这种减小的放大率可以改变设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，光学器件126(例如镜筒透镜)也可以被配置为使得荧光成像模块具有例如至少1.0mm或更大(例如，直径、宽度、长度或最长尺寸方面)的大视场(FOV)，如将在下面进一步讨论的。
在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得FOV在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中具有小于0.15波的像差，如将在下面进一步讨论的。
再次参考图3A和图3B，在各种实施方式中，样品位于物镜110的焦点位置112处或附近。如以上参考图2A和图2B所述，诸如激光源的光源向样品提供激发光束以诱导荧光。物镜110将荧光发射的至少一部分收集为发射光。物镜110将发射光朝向第一二向色滤光镜130透射，该第一二向色滤光镜130将一部分或全部发射光反射作为光束150，该光束150入射到第二二向色滤光镜135上并到达不同的检测通道，每个检测通道包括光学器件126，其将样品(例如，样品载体结构的表面上的多个发荧光的样品位点)的图像形成在光电检测器阵列124上。
如上所述，在一些实施方式中，样品载体结构包括流动池，例如双表面流动池，其具有两个表面(例如，两个内表面，第一表面和第二表面等)，所述两个表面包含发射荧光发射的样品位点。这两个表面可以沿着激发光束的中心轴和/或物镜的光轴的方向在纵向(Z)方向上彼此分开一定距离。该分开可以例如对应于流动池内的流动通道。分析物或试剂可以流过该流动通道并与流动池的第一内表面和第二内表面接触，从而可以使其与结合组合物接触，使得使荧光发射从第一内表面和第二内表面上的多个位点发出。成像光学器件(例如，物镜110)可以被定位在距样品合适的距离(例如，对应于工作距离的距离)处，以在一个或多个检测器阵列124上形成样品的对焦图像。如上所述，在各种设计中，物镜110(可与光学器件126组合)可具有至少与第一表面和第二表面之间的纵向间距一样大的景深和/或聚焦深度。因此，物镜110和(每个检测通道的)光学器件126可以同时在光电检测器阵列124上形成第一流动池表面和第二流动池表面两者的图像，并且这些第一表面和第二表面的图像都对焦并且具有相当的光学分辨率(或仅通过对物体进行较小的重新聚焦即可进行聚焦，以获取具有相当的光学分辨率的第一表面和第二表面的图像)。在各种实施方式中，补偿光学器件无需移入或移出成像模块的光路(例如，移入或移出第一光路和/或第二光路)以形成具有相当的光学分辨率的第一表面和第二表面的对焦图像。类似地，在各种实施方式中，与用于形成第二表面的对焦图像时成像模块(例如，物镜110或光学器件126)中的一个或多个光学元件(例如透镜元件)的位置相比，所述一个或多个光学元件不需要例如沿着第一光路和/或第二光路在纵向上移动以形成第一表面的对焦图像。在一些实施方式中，成像模块包括自动聚焦系统，其被配置为快速且顺序地将成像模块重新聚焦在第一表面和/或第二表面上，使得图像具有相当的光学分辨率。在一些实施方式中，物镜110和/或光学器件126被配置为使得第一流动池表面和第二流动池表面两者同时以相当的光学分辨率对焦，而无需将光学补偿器移入或移出第一光路和/或第二光路，且无需沿第一光路和/或第二光路纵向移动一个或多个透镜元件(例如，物镜110和/或光学器件126(例如镜筒透镜))。在一些实施方式中，使用本文公开的新颖的物镜和/或镜筒透镜设计顺序地(例如，通过在表面之间重新聚焦)或同时地(例如，无需在表面之间重新聚焦)获取的第一表面和/或第二表面的图像可以使用合适的图像处理算法来进一步处理，以增强图像的有效光学分辨率，使得第一表面和第二表面的图像具有相当的光学分辨率。在各种实施方式中，样品平面足够对焦以分辨第一流动池表面和/或第二流动池表面上的样品位点，样品位点在横向方向(例如，在X和Y方向上)上紧密间隔。
如上所述，二向色滤光器可以包括干涉滤光器，其使用具有不同折射率和特定厚度的光学涂层来基于薄膜干涉原理选择性地透射和反射不同波长的光。因此，在多通道荧光成像模块内实现的二向色滤光器的光谱响应(例如，透射和/或反射光谱)可以至少部分取决于激发光束和/或发射光束的光入射到二向色滤光器上的入射角或入射角范围。关于检测光路的二向色滤光器(例如，图3A和图3B的二向色滤光器135和140)，这种作用可以是特别显著的。
图4是说明二向色滤光器性能与光束入射角(AOI)之间的关系的图。具体地，图4的图说明了入射角对二向色滤光器的过渡宽度或光谱跨度的影响，其对应于光谱响应(例如，透射光谱和/或反射光谱)在二向色滤光器的通带与阻带区域之间过渡的波长范围。因此，具有相对小的光谱跨度(例如，图4的图中的小Δλ值)的透射边缘(或反射边缘)对应于通带与阻带区域之间或透射与反射区域之间(或相反地，反射与透射区域之间)的更陡峭的过渡，而具有相对大的光谱跨度(例如，图4的图中的大Δ_λ值)的透射边缘(或反射边缘)对应于通带与阻带区域之间不那么陡峭的过渡。在各种实施方式中，通带与阻带区域之间的更陡峭的过渡通常是希望的。此外，还可希望在整个或大部分视场和/或光束区域上具有增加的一致性或相对一致的过渡宽度。
荧光成像模块，其中二向色反射镜相对于发射光的中心光束轴或光路(例如，物镜和/或镜筒透镜)的光轴布置成45度，因此对于示例性二向色滤光器，可以具有大约50nm的过渡宽度，如图4所示。因为发射光束没有被准直并且具有一定的发散度，所以荧光成像模块在光束的相对侧之间可以具有大约5度的入射角范围。因此，如图4中所示，发射光束的不同部分可以以40度与50度之间的各种入射角入射到分通道二向色滤光器上。这个相对大的入射角范围对应于大约40nm与约62nm之间的过渡宽度范围。这种相对大的入射角范围由此导致成像模块中的二向色滤光器的过渡宽度增加。因此，多通道荧光成像模块的性能可以通过在整个光束上提供更小的入射角，从而使透射边缘更陡峭，并允许更好地区分不同的荧光发射带来改善。
图5是说明光束占用面积大小(DBS)与二向色滤光器上的光束入射角(DBS角)之间的关系的图。在一些情况下，可需要更小的光束占用面积。例如，较小的光束占用面积允许使用较小的二向色滤光器来将光束分割成不同的波长范围。更小的二向色滤光器的使用进而降低了制造成本，并提高了制造适当平坦的二向色滤光器的容易性。如图5中所示，任何大于0度(例如，垂直于二向色滤光器的表面)的入射角都会导致椭圆光束占用面积，其面积大于光束的横截面面积。45度的入射角在二向色反射器上产生较大的光束占用面积，所述光束占用面积大于以零度入射时光束横截面积的1.4倍。
图6A和图6B示意性地说明了多通道荧光成像模块中的二向色滤光器和检测通道的非限制性示例性配置，其中二向色反射镜相对于发射光的中心光束轴或光路(例如，物镜和/或镜筒透镜)的光轴以小于45度的角度布置。图6A描绘了包括多个检测通道520a、520b、520c、520d的成像模块500。图6B是如图6A中所示的圆圈5B内的成像模块500的部分的详细视图。如将更详细地描述的，图6A和图6B中所示的配置包括多个方面，其可以导致与传统的多通道荧光成像模块设计相比的显著改善。然而，在一些情况下，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本公开的荧光成像模块和系统可以用关于图6A和图6B描述的特征的一个或子集来实现。
图6A中描绘的成像模块500包括物镜510和四个检测通道520a、520b、520c和520d，所述四个检测通道被布置来接收由物镜510透射的发射光和/或对所述发射光进行成像。提供第一二向色滤光器530以耦合激发光路和检测光路。相比于图2A和图2B以及图3A和图3B中所示的设计，第一二向色滤光器530(例如，二向色分束镜或合束镜)被配置为将来自光源的光反射至物镜510和样品，并将来自样品的荧光发射传送至检测通道520a、520b、520c和520d。第二二向色滤光器535通过透射第一部分550a和反射第二部分550b在至少两个检测通道520a、520b之间分割发射光束。提供额外的二向色滤光器540a、540b以进一步分割发射光。二向色滤光器540a透射发射光的第一部分550a的至少一部分并且将部分550c反射至第三检测通道520c。二向色滤光器540b透射发射光的第二部分550b的至少一部分并且将部分550d反射至第四检测通道520d。虽然成像模块500被描绘为具有四个检测通道，但是在各种实施方案中，成像模块500可以包括更多或更少的检测通道，并且适当地具有对应的更大或更小数量的二向色滤光器，以将发射光的一部分提供给每个检测通道。例如，在一些实施方案中，成像模块500的特征可以在仅包括两个检测通道520a、520b并且省略额外的二向色滤光器540a、540b的成像模块中以类似的有利效果来实现。在一些实施方式中，可以仅包括一个检测通道。可替代地，可以采用三个或更多个检测通道。
图6A中所示的检测通道520a、520b、520c、520d可以包括与图2A–图3B中所示的检测通道120的部件相同或相似的部件中的一些或全部。例如，不同的检测通道520a、520b、520c、520d可以包括一个或多个图像传感器或光电检测器阵列，并且可以包括透射和/或反射光学器件，诸如将由检测通道接收的光聚焦到其相应的图像传感器或光检测器阵列上的一个或更多透镜(例如，镜筒透镜)。
物镜510被布置来接收由样本的荧光发射的发射光。特别地，第一二向色滤光器530被布置来接收由物镜510收集和透射的发射光。如以上所讨论并如图6A中所示，在一些设计中，照射源(例如，图2A和图2B的照射源115，诸如激光源等)被布置来提供入射在第一二向色滤光器530上的激发光束，使得第一二向色滤光器530将激发光束反射到透射发射光的相同物镜510中，例如在落射荧光配置中。在一些其他设计中，照射源可以通过其他光学部件沿着不包括相同物镜510的不同光路引导至样本。在此类配置中，可以省略第一二向色滤光器530。
类似地，如以上所讨论并如图6A中所示，检测光学器件(例如，包括检测通道520b、520、520c和520d以及沿着物镜510与检测通道520a、520b、520c、520d之间的光路的任何光学部件诸如二向色滤光器535、540a、540b)可以布置在第一二向色滤光器530的传输路径上，而不是在第一二向色滤光器530的反射路径上。在一个示例性实施方式中，物镜510和检测光学器件被布置成使得物镜510将发射光束550直接朝向第二二向色滤光器535透射。发射光的波前质量可由于沿着发射光束550的路径存在第一二向色滤光器530而在一定程度上降低(例如，通过将一些波前误差赋予给光束550)。然而，通过透射通过二向色分束镜的二向色反射器的光束引入的波前误差通常显著小于从二向色分束镜的二向色反射表面反射的光束的波前误差(例如，小一个数量级)。因此，通过沿着第一二向色滤光器530的透射光束路径而不是沿着反射光束路径放置检测光学器件，可以明显改善多通道荧光成像模块中发射光的波前质量和随后的成像质量。
仍然参考图6A，在成像模块500的检测光学器件内，提供二向色滤光器535、540a和540b以在检测通道520a、520b、520c、520d之间分割发射光束550。例如，二向色滤光器535、540a和540b基于波长来分割光束550，使得发射光的第一波长或波段可以被第一检测通道520a接收，发射光的第二波长或波段可以被第二检测通道520b接收，发射光的第三波长或波段可以被第三检测通道520c接收并且发射光的第四波长或波段可以被第四检测通道520d接收。在一些实施方式中，多个分离的波长或波段可以被检测通道接收。
相比于图2A和图2B以及图3A和图3B中所示的多通道荧光成像模块设计，成像模块500具有相对于入射光束的中心光束轴以小于45度的入射角布置的二向色滤光器535、540a和540b。如图6B中所示，不同的光束550、550a、550b具有相应的中心光束轴552、552a、552b。在各种实施方式中，中心光束轴552、552a、552b位于与光束的传播方向正交的光束横截面的中心。这些中心光束轴552、552a、552b可以对应于单独通道内的物镜和/或光学器件的光轴，例如，相应镜筒透镜的光轴。在图6B中示出了每个光束550、550a、550b的额外射线554、554a、554b，以指示每个光束550、550a、550b的直径。例如，光束直径可以被定义为例如最大直径一半处的全宽度、D4σ(例如，4乘以σ，其中σ分别是光束的水平或垂直边缘分布的标准偏差)或二阶矩宽度，或光束直径的任何其他合适定义。
发射光束550的中心光束轴552可以用作定义光束550在第二二向色滤光器535上的入射角的参考点。因此，光束550的“入射角”(AOI)可以是入射光束550的中心光束轴552与垂直于光束入射在例如二向色反射表面上的表面的线N之间的角度。当发射光束550以入射角AOI入射到第二二向色滤光器535的二向色反射表面上时，第二二向色滤光器535透射发射光的第一部分550a(例如，具有在第二二向色滤光器535的通带区域内的波长的部分)并且反射发射光的第二部分550b(例如，具有在第二二向色滤光器535的阻带区域内的波长的部分)。第一部分550a和第二部分550b各自可以在中心光束轴552a、552b方面类似地描述。如上所述，可以替代性地或额外地使用光轴。
在图6A和图6B的示例性配置中，第二二向色滤光器535被布置成使得光束550的中心光束轴552以30度的入射角入射。类似地，额外的二向色滤光器540a、540b被布置成使得光束550的第一部分550a和第二部分550b的中心光束轴552a、552b也以30度的入射角入射。然而，在各种实施方式中，这些入射角可以是小于45度的其他角度。在一些情况下，例如，入射角可以在约20度与约45度之间的范围内，如将在下面进一步讨论的。此外，二向色滤光器535、540a、540b中的每一个上的入射角不必是相同的。在一些实施方案中，二向色滤光器535、540a、540b中的一些或全部可以被布置成使得它们的入射光束550、550a、550b具有不同的入射角。如上所述，入射角可以相对于成像模块内的光学器件的光轴，例如，物镜和/或检测通道中的光学器件(例如，镜筒透镜)和相应的二向色分束镜中的二向色反射表面。当光轴用于指定AOI时，入射角的相同范围和值也适用于这种情况。
荧光成像模块系统中的发射光束550、550a、550b通常是发散光束。如上所指出的，发射光束可以具有足够大的光束发散度，使得光束直径内的光束区域以相对于光学器件的中心光束轴和/或光轴的入射角相差高达5度或更大的入射角入射在二向色滤光器上。在一些设计中，物镜510可以被配置为例如具有被选择为对于显微镜的给定视场产生较小的光束直径的f数或数值孔径。在一个实例中，物镜510的f数或数值孔径可以被选择为使得光束550、550a、550b的全直径以例如在中心光束轴552、552a、552b的入射角的1度、1.5度、2度、2.5度、3度、3.5度、4度、4.5度或5度内的入射角入射在二向色滤光器535、540a、540b上。
在一些实施方式中，适于产生这种窄光束直径的物镜的焦距长度可以比荧光显微镜或成像系统中通常采用的那些焦距长度更长。例如，在一些实施方式中，物镜的焦距长度可以在20mm至40mm的范围内，如将在下面进一步讨论的。在一个示例中，具有36mm的焦距长度的物镜510可以产生光束550，其特征在于发散度足够小，使得光束550的整个直径上的光以中心光束轴的入射角的2.5度以内的角度入射到第二二向色滤光器535上。
图7和图8提供了说明由于图6A和图6B的成像模块配置(或本文公开的任何成像模块配置)的方面而改善的二向色滤光器性能的图。图7中的图类似于图4的图，并且说明了入射角对二向色滤光器的过渡宽度(例如，透射边缘的光谱跨度)的影响。图7示出了一个实例，其中二向色滤光器(例如，二向色滤光器535、540a和540b)和其中的二向色反射表面的取向使得其入射光束具有30度而不是45度的入射角。图7示出了这种减小的入射角如何显著改善整个光束直径上的过渡宽度的陡峭度和均匀性。例如，虽然在中心光束轴处45度的入射角产生在约40nm与约62nm之间的过渡宽度范围，但在中心光束轴处30度的入射角度产生在约16nm与约30nm之间的过渡宽度范围。在此实例中，平均过渡宽度从约51nm减小至约23nm，从而指示通带与阻带之间的过渡更陡峭。此外，从22nm范围到14nm范围，光束直径上的过渡宽度的变化减少了接近40％，从而指示光束区域上的过渡具有更均匀的陡峭度。
图8说明了在本文公开的任何成像模块配置中可以通过为物镜选择适当的f数或数值孔径以减少光束发散来实现的额外优点。在一些实施方式中，使用更长的焦距。在图8的实例中，物镜510具有36mm的焦距，其具有适当的数值孔径(例如，小于5)，将光束550内的入射角范围从30度±5度减小至30度±2.5度。通过这种设计，过渡宽度的范围可以减小至约19nm与约26nm之间。当与图7的改善系统相比时，虽然平均过渡宽度基本上相同(例如，大约23nm的光谱跨度)，但是光束直径上的过渡宽度的变化进一步减小至7nm的范围，表示相对于图4中所示的过渡宽度范围减小了接近70％。
再次参考图5，中心光束轴处的入射角从45度减小至30度是进一步有利的，因为它减小了二向色滤光器上的束斑大小。如图5中所示，45度的入射角在二向色滤光器上产生的光束占用面积大于光束横截面积的1.4倍。然而，30度的入射角在二向色滤光器上产生的光束占用面积仅为光束横截面积的1.15倍。因此，将二向色滤光器535、540a、540b处的入射角从45度减小至30度导致二向色滤光器535、540、540b上的光束占用面积减小约18％。光束占用面积的这种减小允许使用更小的二向色滤光器。
现在共同参考图9A-图9B，入射角从45度减小至30度还可以提供关于由本文公开的任何成像模块配置中的二向色滤光器引起的表面变形的改善性能，如通过调制传递函数的改善所指示。通常，表面变形的量随着光学元件面积的增大而增加。如果在二向色滤光器上采用较大的面积，则会遇到较大的表面变形量，从而将更多的波前误差引入光束中。图9A说明了折叠角度对通过向最后一个反射镜添加1波峰谷(PV)球光焦度引起的图像质量劣化的影响。图9B说明了折叠角度对通过向最后一个反射镜添加0.1波PV球光焦度引起的图像质量劣化的影响。如图9A和图9B中所示，入射角减小至30度显著地减小了表面变形的影响，以实现接近检测光学器件的衍射受限性能。
在所公开的成像模块的一些实施方式中，可以利用激发光束的偏振态来进一步改善本文公开的多通道荧光成像模块的性能。返回参考图2A、图2B和图6A，例如，本文公开的多通道荧光成像模块的一些实施方式具有落射荧光配置，其中第一二向色滤光器130或530合并激发光束和发射光束的光路，使得激发光和发射光都透射通过物镜110、510。如上所述，照射源115可以包括光源，诸如激光或提供形成激发光束的光的其他光源。在一些设计中，光源包括线性偏振光源，并且激发光束可以是线性偏振的。在一些设计中，包括偏振光学器件以使光偏振和/或旋转光的偏振。例如，可以在激发光束的光路中包括偏振器(诸如线性偏振器)以使激发光束偏振。在一些设计中，可以包括延迟器(例如半波延迟器或多个四分之一波延迟器或具有其他延迟量的延迟器)，以旋转线性极化。
当线性偏振激发光束入射到任何二向色滤光器或其他平面界面上时，它可以是p偏振的(例如，具有平行于入射平面的电场分量)、s偏振的(例如，具有垂直于入射平面的电场分量)，或者在光束内可以具有p偏振和s偏振态的组合。可以通过选择照射源115和/或其一个或多个部件相对于第一二向色滤光器130、530和/或相对于激发光束将与之相互作用的任何其他表面的取向来选择和/或改变激发光束的p偏振态或s偏振态。在光源输出线性偏振光的一些实施方式中，光源可以被配置为提供s偏振光。例如，光源可以包括诸如固态激光器或激光二极管的发射器，其可以围绕其光轴或光束的中心轴旋转以使从其输出的线性偏振光定向。可替代地或另外地，可以采用延迟器来使线性偏振绕光轴或光束的中心轴旋转。如上所述，在一些实施方式中，例如当光源不输出偏振光时，布置在激发光束的光路中的偏振器可使激发光束偏振。例如，在一些设计中，线性偏振器布置在激发光束的光路中。可以旋转该偏振器以提供线性偏振的适当取向，以提供s偏振光。
在一些设计中，将线性偏振绕光轴或光束的中心轴旋转，使得s偏振入射在二向色分束镜的二向色反射器上。当s偏振光入射到二向色分束镜的二向色反射器上时，通带和阻带之间的过渡更陡峭，这与p偏振光入射到二向色分束镜的二向色反射器上时相反。
如图10A和图10B中所示，激发光束的p偏振态或s偏振态的使用可以显著地影响任何激发滤光器(例如，第一二向色滤光器130、530)的窄带性能。图10A说明了在40度和45度的入射角下的示例性带通二向色滤光器在610nm与670nm之间的透射光谱，其中入射光束是线性偏振的并且相对于二向色滤光器的平面是p偏振的。如图10B中所示，改变光源相对于二向色滤光器的取向，使得入射光束相对于二向色滤光器的平面是s偏振的，导致二向色滤光器的通带与阻带之间的边缘明显更陡峭。因此，本文公开的照射和成像模块100、500可以有利地具有相对于第一二向色滤光器130、530取向的照射源115，使得激发光束相对于第一二向色滤光器130、530的平面是s偏振的。如以上所讨论，在一些实施方式中，可以使用偏振器(诸如线性偏振器)来使激发光束偏振。可以旋转该偏振器以提供与s偏振光相对应的线性偏振光的取向。同样如上所述，在一些实施方式中，可以使用其他旋转线性偏振光的方法。例如，光学延迟器(诸如半波延迟器或多种四分之一波延迟器)可以用于旋转偏振方向。其他设置也是可能的。
如本文其他地方所讨论的，减小荧光成像模块和/或物镜的数值孔径(NA)可以增加景深，以使得能够对两个表面进行相当的成像。图11A-16B示出了对于较小的数值孔径，相比于较大的数值孔径，在用1mm玻璃隔开的第一表面和第二表面上，MTF如何更相似。
图11A和图11B示出了在第一(图11A)表面和第二(图11B)表面处对于NA为0.3的MTF。
图12A和图12B示出了在第一(图12A)表面和第二(图12B)表面处对于NA为0.4的MTF。
图13A和图13B示出了在第一(图13A)表面和第二(图13B)表面处对于NA为0.5的MTF。
图14A和图14B示出了在第一(图14A)表面和第二(图14B)表面处对于NA为0.6的MTF。
图15A和图15B示出了在第一(图15A)表面和第二(图15B)表面处对于NA为0.7的MTF。
图16A和图16B示出了在第一(图16A)表面和第二(图16B)表面处对于NA为0.8的MTF。这些图的每一个中的第一表面和第二表面对应于例如流动池的顶表面和底表面。
图17A-图17B提供了用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的所计算的斯特列尔比(即，由光学系统聚焦或收集的峰值光强度与由理想光学系统和点光源聚焦或收集的峰值光强度之比)的图。图17A示出了对于不同物镜和/或光学系统数值孔径，作为中间流体层厚度(流体通道高度)的函数的用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的斯特列尔比的图。如图所示，斯特列尔比随着第一表面和第二表面之间的间隔增大而减小。因此，随着两个表面之间的间隔增加，所述表面中的一个可具有劣化的图像质量。与具有较大数值孔径的成像系统相比，对于具有较小数值孔径的成像系统，随着两个表面之间间隔距离的增加，第二表面成像性能的降低得以减小。图17B示出了针对通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像和厚度为0.1mm的中间水层，作为数值孔径的函数的斯特列尔比的图。在较高数值孔径下成像性能的损失可归因于由用于第二表面成像的流体引起的光学像差增加。随着NA的增加，由用于第二表面成像的流体引入的增加的光学像差会大大降低图像质量。但是，通常，减小光学系统的数值孔径会降低可实现的分辨率。通过提供增加的样品平面(或物平面)对比度噪声比，例如通过使用用于核酸测序应用的化学试剂(其增强经标记的核酸簇的荧光发射和/或降低背景荧光发射)，图像质量的损失可以至少部分抵消。在一些情况下，例如，可以使用包括亲水性基底材料和/或亲水性涂层的样品载体结构。在一些情况下，此类亲水性基底和/或亲水性涂层可降低背景噪声。可以在下面找到对样品载体结构、亲水性表面和涂层以及用于增强对比度噪声比的方法(例如用于核酸测序应用)的其他讨论。
在一些实施方式中，荧光成像系统、照射和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个被配置为具有减小的放大率，例如小于10倍的放大率，如以下将进一步讨论的。这种减小的放大率可以调整设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，荧光显微镜、照射和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个也可以被配置为使得荧光成像模块具有大的视场(FOV)，例如，至少3.0mm或更大(例如，在直径、宽度、高度或最长尺寸方面)的视场，如以下将进一步讨论的。荧光成像系统、照射和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个可被配置为向荧光显微镜提供这种视场，该视场使得FOV在至少80％的视场上具有小于例如0.1波的像差。类似地，荧光成像系统、照射和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个可以被配置为使得荧光成像模块具有这种FOV并且是衍射受限的，或者在此FOV上是衍射受限的。
如上所述，在各种实施方式中，所公开的光学系统提供了大视场(FOV)。在一些实施方式中，通过使用较大的图像传感器或光电检测器阵列来部分地促进获得增加的FOV。光电检测器阵列例如可以具有其中对角线至少为15mm或更大的有效区域，如将在下面进一步讨论的。如上所述，在一些实施方式中，所公开的光学成像系统提供减小的放大率，例如小于10倍的放大率，这可以促进大的FOV设计。尽管放大率降低，但是成像模块的光学分辨率可仍然足够，因为可以使用具有小的像素尺寸或间距的检测器阵列。像素尺寸和/或间距例如可以是约5μm或更小，如将在下面更详细地讨论的。在一些实施方式中，像素尺寸小于由光学成像系统(例如，物镜和镜筒透镜)提供的光学分辨率的两倍，以满足奈奎斯特定理。因此，图像传感器的像素尺寸和/或间距可以使得成像模块的空间采样频率至少是成像模块的光学分辨率的两倍。例如，光电检测器阵列的空间采样频率可以是荧光成像模块(例如，照射和成像模块、物镜和镜筒透镜、物镜和检测通道中的光学器件126、样品载体结构或平台(被配置用于支撑样品载体平台)和光电检测器阵列之间的成像光学器件)的光学分辨率的至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，或者是这些值中的任何之间的范围内的任何空间采样频率。
尽管本文针对荧光成像模块讨论了广泛的特征，但是本文描述的任何特征和设计可以应用于其他类型的光学成像系统，包括但不限于明场和暗场成像，并且可以应用于发光或磷光成像。
双波长激发/四通道成像系统：图18说明了用于双面成像应用的双激发波长/四通道成像系统，其包括物镜和镜筒透镜组合，所述组合在垂直于光轴的方向上被扫描以提供大面积成像，例如，通过平铺多个图像来创建具有比每个单独图像的总视场大得多的总视场(FOV)的合成图像。所述系统包括在不同波长下操作的两个激发光源(例如，激光器或激光二极管)和自动聚焦激光器。使用一系列反射镜和/或二向色反射器将两个激发光束和自动聚焦激光束组合，并通过物镜传输至流动池的上或下内表面。由拴系到流动池表面之一的标记寡核苷酸(或其他生物分子)发射的荧光被物镜收集，透射通过镜筒透镜，并通过一系列中间二向色反射器根据发射光的波长引导至四个成像传感器中的一个。从流动池表面反射的自动聚焦激光被物镜收集，透射通过镜筒透镜，并通过一系列中间二向色反射器引导至自动聚焦传感器。所述系统允许在物镜/镜筒透镜组合在垂直于物镜光轴的方向上被扫描时维持精确聚焦(例如，通过使用精密线性致动器、平移台或安装显微镜转台的焦点调节机构来调节流动池表面与物镜之间的相对距离，以减小或最小化自动聚焦图像传感器上的反射光斑大小)。双波长激发与四通道(例如，四波长)成像能力结合使用，提供对流动池的上(近)和下(远)内表面进行高通量成像。
多重复用光学读磁头：
在一些情况下，可以组装本文所述的任何成像模块的小型化版本，以创建多重复用读磁头，所述多重复用读磁头可以在一个或多个方向上相对于样品表面(例如，流动池的内表面)水平平移，以同时对表面的多个部分进行成像。多重复用读磁头的非限制性实例最近已经在美国公开专利申请号2020/0139375Al中描述。
在一些情况下，例如，小型化成像模块可以包括“显微荧光计”，所述显微荧光计包括照射或激发光源，诸如LED或激光二极管(或连接到外部光源的光纤尖端)、用于准直或聚焦照射或激发光的一个或多个透镜、一个或多个二向色反射器、一个或多个光学滤光器、一个或多个反射镜、分束镜、棱镜、孔径等、一个或多个物镜、如本文其他地方所述的用于以最小焦点调节实现双表面成像的一个或多个定制镜筒透镜、如本文其他地方所述的一个或多个图像传感器或其任何组合。在一些情况下，小型化成像模块(例如，“显微荧光计”)还可以包括自动聚焦机构、微处理器、电源和数据传输连接器、不透光外壳等。所得的小型化成像模块因此可以包括具有小形状因子的集成成像包装或单元。在一些情况下，小型化成像模块的最短尺寸(例如，宽度或直径)可以小于5cm、小于4.5cm、小于4cm、小于3.5cm、小于3cm、小于2.5cm、小于2cm、小于1.8cm、小于1.6cm、小于1.4cm、小于1.2cm、小于1cm、小于0.8cm、或小于0.6cm。在一些情况下，小型化成像模块的最长尺寸(例如，高度或长度)可以小于16cm、小于14cm、小于12cm、小于10cm、小于9cm、小于8cm、小于7cm、小于5cm、小于5cm、小于4.5cm、小于4cm、小于3.5cm、小于3cm、小于2.5cm、小于2cm、小于1.8cm、小于1.6cm、小于1.4cm、小于1.2cm、或小于1cm。在一些情况下，多重复用读磁头内的一个或多个单个小型化成像模块可以包括自动聚焦机构。
在一些情况下，如本文所述的多重复用读磁头可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或超过12个相对于彼此保持在固定位置的小型化成像模块或显微荧光计的组件。在一些情况下，单个小型化成像模块或显微荧光计的光学设计规范和性能特性(例如，用于数值孔径、视场、景深、图像分辨率等)可以与本文其他地方针对所公开的成像模块的其他版本所述的相同。在一些情况下，多个单个小型化成像模块可以线性布置来布置，包括一行、两行、三行、四行或超过四行和/或列。在一些情况下，多个单个小型化成像模块可以例如以六边形紧密封装布置来布置。在一些情况下，多个单个小型化成像模块可以圆形或螺旋布置、随机分布布置或本领域技术人员已知的任何其他布置来布置。
图43A-图43B提供了如本文公开的多重复用读磁头的非限制性示意图。图43A示出了多重复用读磁头的侧视图，其中具有共同光学设计规范(例如，数值孔径、视场、工作距离等)的两行单个显微荧光计(从末端看)被配置为对共同表面(例如，流动池的第一内表面)进行成像。图43B示出了相同多重复用读磁头的顶视图，说明了当读磁头相对于流动池平移时(或反之亦然)通过多重复用读磁头的单个显微荧光计获取的重叠成像路径。在一些情况下，单个显微荧光计的单个视场可以重叠，如图43B中所示。在一些情况下，它们可以不重叠。在一些情况下，多重复用读磁头可以被设计成使得其与流动池内的预定特征(例如，单个流体通道)对准并成像。
图44A-图44B提供了多重复用读磁头的非限制性示意图，其中多个单个小型化成像模块的第一子集被配置为对第一样品表面(例如，流动池的第一内表面)进行成像，并且多个小型化成像模块的第二子集被配置为同时对第二样品表面(例如，流动池的第二内表面)进行成像。图44A示出了多重复用读磁头的侧视图，其中单个显微荧光计的第一子集被配置为对例如流动池的第一或上内表面进行成像，并且第二子集被配置为对第二表面(例如，流动池的第二或下内表面)进行成像。图44B示出了图44A的多重复用读磁头的顶视图，说明了由多重复用读磁头的单个显微荧光计获取的成像路径。再一次，在一些情况下，给定子集中的单个显微荧光计的单个视场可以重叠。在一些情况下，它们可以不重叠。在一些情况下，多重复用读磁头可以被设计成使得第一子集和第二子集的单个小型化成像模块与流动池内的预定特征(例如，单个流体通道)对准并成像。
用于较厚的盖玻片的改善或优化的物镜和/或镜筒透镜：现有的设计实践包括物镜的设计和/或使用常用的现成显微镜物镜来优化通过薄(例如<200μm厚)显微镜盖玻片获取图像时的图像质量。当用于在流体通道或流动池的两侧成像时，两个表面之间的间隙的额外高度(即，流体通道的高度；通常约为50μm至200μm)会在为流体通道的非最佳侧捕获的图像中引入光学像差，从而导致光学分辨率降低。这主要是因为与最佳盖玻片厚度相比，另外的间隙高度是显著的(典型的流体通道或间隙高度为50-200μm，相对于盖玻片厚度<200μm)。另一种常见的设计实践是，当要在流体通道或流动池的非最佳侧进行成像时，在光路中使用另外的“补偿”透镜。该“补偿”透镜和将其移入或移出光路所需的机构(以便可以对流动池的两侧进行成像)进一步增加了系统复杂性和成像系统停机时间，并可由于振动等而降低图像质量。
在本公开中，成像系统被设计用于与包括较厚的盖玻片或流动池壁(厚度≥700μm)的流动池耗材兼容。可以针对等于真实盖玻片厚度加上有效间隙厚度的一半(例如，700μm+1/2*流体通道(间隙)高度)的盖玻片，改善或优化物镜设计。这种设计显著降低了间隙高度对流体通道两个表面的图像质量的影响，并且平衡了两个表面的图像的光学质量，因为间隙高度相对于盖玻片的总厚度较小，因此对光学质量的影响降低。
使用较厚的盖玻片的其他优点包括在制造过程中改善了对厚度公差误差的控制，并降低了盖玻片由于热应力和安装诱导应力产生变形的可能性。盖玻片的厚度误差和变形会对流动池的顶表面和底表面两者的成像质量产生不利影响。
为了进一步改善用于测序应用的双表面成像质量，我们的光学系统设计着重于在最适于成像和分辨小斑点或簇的中等空间频率至高空间频率范围内改善或优化MTF(例如，通过改善或优化物镜和/或镜筒透镜设计)。
改善或优化的镜筒透镜设计，用于与市售的现成物镜组合使用：对于低成本测序器设计，由于其价格相对较低，因此可优选使用市售的现成物镜。但是，如上所述，低成本的现成的物镜主要针对厚度约为170μm的薄盖玻片使用而进行了优化。在一些情况下，所公开的光学系统可以利用镜筒透镜设计，该镜筒透镜设计补偿较厚的流动池盖玻片，同时能够在双表面成像应用中针对流动池的两个内表面实现高图像质量。在一些情况下，本文公开的镜筒透镜设计能够在无需将光学补偿器移入或移出流动池和图像传感器之间的光路的情况下，在无需沿光路移动镜筒透镜的一个或多个光学元件或部件情况下，以及在无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件或部件移入或移出光路情况下，对流动池的两个内表面进行高质量成像。
图19提供了用于低光物镜设计的光学射线追迹图，所述低光物镜设计已进行了改善或优化，以对0.17mm厚的盖玻片的相对侧上的表面进行成像。该物镜的调制传递函数图(如图20所示)表示当与设计用于0.17mm厚的盖玻片一起使用时，近衍射受限的成像性能。
图21提供了当用于对0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的相同物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。在约100条线/mm至约800条线/mm(或个周期/mm)的空间频率范围内，MTF值的相对较小的偏差表明，即使使用0.3mm厚的盖玻片时，所获得的图像质量仍然是合理的。
图22提供了当用于对与0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚的水性流体层的表面成像时(例如，对于流动池的双面成像在对远表面进行成像时遇到的那种条件下)，图19中示出的相同物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。从图22的图中可以看出，在约50lp/mm至约900lp/mm的空间频率范围内，MTF曲线与理想的衍射受限情况的偏差表明成像性能下降。
图23和图24提供了当使用图19所示的物镜通过1.0mm厚的盖玻片成像时以及当上内表面和下内表面被0.1mm厚的水性流体层隔开时，流动池的上(或近)内表面(图23)和下(或远)内表面(图24)的随空间频率变化的调制传递函数的图。可以看出，两个表面的成像性能都大大降低。
图25提供了用于镜筒透镜设计的射线追迹图，如果与图19中示出的物镜结合使用，则所述镜筒透镜设计提供通过1mm厚的盖玻片的改善的双面成像。包括复合物镜(透镜元件702、703、704、705、706、707、708、709和710)和镜筒透镜(透镜元件711、712、713和714)的光学设计700得以改善或优化，用于与流动池(其包括厚盖玻片(或壁)，例如，厚度大于700μm，并且流体通道厚度至少为50μm)一起使用，并将来自流动池701的内表面的图像传输到图像传感器715，其中光学图像质量得到显著改善，并且CNR更高。
在一些情况下，镜筒透镜(或镜筒透镜组件)可包括至少两个光学透镜元件、至少三个光学透镜元件、至少四个光学透镜元件、至少五个光学透镜元件、至少六个光学透镜元件、至少七个光学透镜元件、至少八个光学透镜元件、至少九个光学透镜元件、至少十个光学透镜元件或更多，其中光学透镜元件的数量、每个元件的表面几何形状以及它们在组装件中的放置顺序得以改善或优化，以校正由流动池的厚壁引起的光学像差，并且在一些情况下，允许人们使用市售的现成物镜，同时仍保持高质量的双面成像能力。
在一些情况下，如图25所示，镜筒透镜组装件可依次包括第一不对称凸-凸透镜711、第二凸-平透镜712、第三不对称凹-凹透镜713和第四不对称凸-凹透镜714。
图26和图27提供了当使用物镜(针对0.17mm盖玻片校正)和图25所示的镜筒透镜组合通过1.0mm厚的盖玻片成像时以及当上内表面和下内表面被0.1mm厚的水性流体层隔开时，流动池的上(或近)内表面(图26)和下(或远)内表面(图27)的随空间频率变化的调制传递函数的图。可以看出，获得的成像性能几乎是对于衍射受限的光学设计所预期的。
图28提供了用于本公开的镜筒透镜设计(左)的射线追迹图，所述设计已被改善或优化以提供高质量的双面成像性能。因为镜筒透镜不再进行无限远校正，因此可以将适当设计的补偿透镜(右)与镜筒透镜结合使用，以补偿非无限远校正的镜筒透镜，用于制造和测试目的。
特定于成像通道的镜筒透镜的适配或优化：在成像系统设计中，有可能针对所有成像通道在相同波长区域中改善或优化物镜和镜筒透镜两者。通常，相同的物镜由所有成像通道共享(参见例如图18)，并且每个成像通道或者使用相同的镜筒透镜，或者具有共享相同设计的镜筒透镜。
在一些情况下，本文公开的成像系统还可包括用于每个成像通道的镜筒透镜，其中已经针对特定成像通道独立地改善或优化了镜筒透镜，以改善图像质量，例如，以减少或最小化畸变和场曲率，并改善每个通道的景深(DOF)性能。由于每个特定成像通道的波长范围(或带通)比所有通道的组合波长范围窄得多，因此，所公开系统中使用的镜筒透镜的特定于波长或通道的适配或优化导致成像质量和性能方面的显著改善。这种特定于通道的适配或优化导致双面成像应用中流动池的顶表面和底表面的图像质量的改善。
在流动池中没有流体情况下的双面成像：为了使流动池的顶内表面和底内表面两者都有最佳的成像性能，通常需要运动致动的补偿器来校正由流动池中的流体(通常包括约50-200μm的流体层厚度)引起的光学像差。在所公开的光学系统设计的一些情况中，可以在流动池中存在流体的情况下对流动池的顶内表面进行成像。一旦测序化学循环完成，就可以从流动池中提取流体以对底内表面成像。因此，在一些情况下，即使不使用补偿器，也可以保持底表面的图像质量。
使用电光相位板补偿光学像差和/或振动：在一些情况下，通过将电光相位板(或其他矫正透镜)与物镜组合使用以消除由于流体的存在而引起的光学像差，可以在无需从流动池中去除流体的情况下改善双表面图像质量。在一些情况下，可以使用电光相位板(或透镜)来消除由运动致动的补偿器的机械运动引起的振动影响，并且可以为基因组测序应用提供更快的图像获取时间和测序循环时间。
改善的对比度噪声比(CNR)、视场(FOV)、光谱分离和时序设计，以增加或最大化信息传输和通量：在为基因组学应用设计的成像系统中用于增加或最大化信息传输的另一种方法是增加视场(FOV)的大小并减少对特定FOV进行成像所需的时间。对于典型的大NA光学成像系统，通常是获得面积近似为1mm2的视场的图像，其中在当前公开的成像系统设计中，指定了具有长工作距离的大FOV物镜以实现对2mm2或更大的面积进行成像。
在一些情况下，所公开的成像系统设计用于与专有的低结合性基底表面和DNA扩增方法组合使用，其减少由多种混杂信号(包括但不限于荧光染料对基底表面的非特异性吸附，非特异性核酸扩增产物(例如，在对应于核酸分子克隆扩增簇(例如，特异性扩增的集落)的斑点或特征之间的区域中出现在基底表面的核酸扩增产物)，可出现在扩增的集落、定相和定相前核酸链中的非特异性核酸扩增产物等)引起的荧光背景。与公开的光学成像系统组合使用低结合性基底表面和DNA扩增方法(其降低荧光背景)可以显著减少对每个FOV成像所需的时间。
当前公开的系统设计可以通过成像序列改善或优化进一步减少所需的成像时间，其中同时或以交叠的时序获取多个通道的荧光图像，并且其中荧光信号的光谱分离被设计为减少荧光检测通道之间以及激发光和荧光信号之间的串扰。
当前公开的系统设计可以通过改善或优化扫描运动序列来进一步减少所需的成像时间。在典型方法中，使用X-Y平移台将目标FOV移动到物镜下方的位置，执行自动聚焦步骤(其中确定最佳焦点位置)，然后将物镜沿Z方向移动到确定的焦点位置，并获取图像。通过循环经过一系列目标FOV位置来获取一系列的荧光图像。从信息传输占空比的角度来看，信息仅在该周期的荧光图像获取部分期间进行传输。在当前公开的成像系统设计中，执行其中所有轴(X-Y-Z)同时重新定位的单步运动，并且自动聚焦步骤用于检查焦点位置误差。仅当焦点位置误差(焦平面位置和样品平面位置之间的差异)超过一定限度(例如指定误差阈值)时，才发出另外的Z运动指令。结合高速X-Y运动，此方法会增加系统的占空比，从而提高每单位时间的成像通量。
此外，通过将设计的光学收集效率、调制传递函数和图像传感器性能特征与输入激发光子通量预期的荧光光子通量、染料效率(与染料消光系数和荧光量子产率有关)匹配，同时考虑到背景信号和系统噪声特性，可以减少或最小化获取高质量(高对比度噪声比(CNR)图像)所需的时间。
有效的图像获取与改善或优化的平移台步长和稳定时间的组合导致了快速的成像时间(例如，每个视场所需的总时间)和更高通量的成像系统性能。
伴随着大的FOV和快速的图像获取占空比，所公开的设计还可包括指定图像平面平坦度、荧光检测通道之间的色聚焦性能、传感器平坦度、图像畸变和聚焦质量规格。
通过将不同的荧光检测通道的图像传感器分别对准，使得每个检测通道的最佳焦平面重叠，可以进一步改善色聚焦性能。设计目标是确保相对于每个通道的最佳焦平面，在±100nm(或更小)内获取超过90％视场上的图像，从而增加或最大化单个点强度信号的传输。在一些情况下，所公开的设计还确保相对于每个通道的最佳焦平面，在±150nm(或更小)内获取99％视场上的图像，并确保相对于每个成像通道的最佳焦平面，在±200nm(或更小)内获取整个视场上的更多图像。
照射光路设计：用于改善信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)和/或增加通量的另一个因素是增加对于样品的照射功率密度。在一些情况下，所公开的成像系统可以包括照射路径设计，所述照射路径设计利用与液体光导耦合的高功率激光器或激光二极管。液体光导消除了相干光源(例如激光器和激光二极管)固有的光斑。此外，耦合光学器件被设计为用于底部填充液体光导的进入光圈。液体光导进入光圈的底部填充减小了进入物镜的照射光束的有效数值孔径，从而提高了通过物镜到样品平面上的光传输效率。通过这种设计创新，在大视场(FOV)上，照射功率密度可以达到传统设计的3倍。
在一些情况下，通过利用s偏振和p偏振的角度依赖性判别，可以使照射光束偏振取向为，用于减少到达成像传感器的后向散射和后向反射的照射光的量。
结构化照射系统：在一些情况下，所公开的成像模块和系统可以包括结构化照射光学设计，以增加成像系统的有效空间分辨率，从而能够在流动池表面上使用克隆扩增的靶核酸序列(簇)的更高表面密度，以提高测序通量。结构化照射显微镜(SIM)利用空间结构化(例如，周期性)的光图案来照射样品平面，并依赖于被称为莫尔条纹(Moiréfringes)的干涉图案的生成。在略微不同的照射条件下获取多个图像，例如，通过移动和/或旋转结构化照射的图案来创建莫尔条纹。所得的干涉信号的数学去卷积允许重建超分辨率图像，所述超分辨率图像的空间分辨率比使用衍射受限成像光学器件实现的空间分辨率提高约两倍[Lutz(2011),“Biological Imaging by Superresolution Light Microscopy”,Comprehensive Biotechnology(第二版),第1卷,第579-589页,Elsevier；Feiner-Gracia等人(2018),“15-Advanced Optical Microscopy Techniques for the Investigationof Cell-Nanoparticle Interactions”,Smart Nanoparticles for Biomedicine:Micro and Nano Technologies,第219-236页,Elsevier；Nylk等人(2019),“Light-SheetFluorescence Microscopy With Structured Light”,Neurophotonics and Biomedical Spectroscopy,第477-501页,Elsevier]。结构化照射显微镜成像系统的实例最近在Hong的美国专利申请公开号2020/0218052中描述。
图41提供了成像系统4100的非限制性示意图，其包括如本文公开的分支结构化照射光学设计。系统4100的照射光路的第一分支(或臂)包括例如光源(光发射器)4110A、用于准直由光源4110A发射的光的光学准直器4120A、相对于光轴在第一取向上的衍射光栅4130A、旋转窗口4140A和透镜4150A。系统4100的照射光路的第二分支包括例如光源4110B、用于准直由光源4110B发射的光的光学准直器4120B、相对于光轴在第二取向上的衍射光栅4130B、旋转窗口4140B和透镜4150B。衍射光栅4130A和4130B使得能够在样品平面上投影光条纹的图案。
在一些情况下，光源4110A和4110B可以是非相干光源(例如，包括一个或多个发光二极管(LED))或相干光源(例如，包括一个或多个激光器或激光二极管)。在一些情况下，光源4110A和4110B可以包括与例如输出光束的LED、激光器或激光二极管耦合的光纤，所述光束然后由相应的准直透镜4120A和4120B准直。在一些情况下，光源4110A和4110B可以输出相同波长的光。在一些情况下，光源4110A和4110B可以输出不同波长的光。光源4110A和4110B中的任一个可以被配置为输出本文其他地方所述的任何波长和/或波长范围的光。在成像期间，光源4110A和4110B可以使用例如定位在光路中的高速快门(未示出)或通过以预定频率对光源进行脉冲来打开或关闭。
在图41中所示的实例中，系统4100的第一照射臂包括固定的垂直光栅4130A，用于将光栅图案(例如，垂直光条纹图案)以第一取向投影到样品平面(例如，流动池4187的第一内表面4188)上，并且第二照射臂包括固定的水平光栅4130B，用于将光栅图案(例如，水平光条纹图案)以第二取向投影到样品平面4188上。有利地，在此非限制性实例中，成像系统4100的衍射光栅在成像期间不需要机械旋转或平移，这可以提供改善的成像速度、系统可靠性和系统可重复性。在一些情况下，衍射光栅4130A和/或4130B可以绕其相应的光轴旋转，使得投影在样品平面上的光条纹图案之间的角度是可调节的。
如图41中所示，在一些情况下，衍射光栅4130A和4130B可以是透射衍射光栅，其包括形成在玻璃基底或其他合适表面中的多个衍射元件(例如，平行狭缝或凹槽)。在一些情况下，光栅可以实现为相位光栅，其提供光栅材料的折射率的周期性变化。在一些情况下，凹槽或特征间隔可以被选择为以合适的角度衍射光和/或被调谐到成像样品的最小可分辨特征大小，以用于成像系统4100的操作。在其他情况下，衍射光栅可以是反射型衍射光栅。
在图41中所示的实例中，垂直和水平光条纹图案的取向偏移约90度。在其他情况下，衍射光栅的其他取向可以用于产生约90度的偏移。例如，衍射光栅可以被取向为使得它们投影相对于样品平面(例如，流动池第一内表面)4188的x轴或y轴偏移±45度的光条纹图案。图41中所示的成像系统4100的配置在样品载体表面(例如，流动池4187的内表面4188)包括布置在矩形网格上的规则图案化特征的情况下可以是特别有利的，因为使用结构化照射方法增强图像分辨率可以仅使用两个垂直光栅取向(例如，垂直光栅取向和水平光栅取向)来实现。
在系统4100的实例中，衍射光栅4130A和4130B可以被配置为根据以下关系由于相长干涉而将输入照射光束衍射成一系列强度最大值：
m＝阶数＝d sin(θ)/λ
其中d＝衍射光栅中狭缝或凹槽之间的距离，θ＝照射光相对于衍射光栅表面法线的入射角，λ＝照射光的波长，m＝对应于衍射光的强度最大值的整数值，例如，m＝0、±1、±2等。在一些情况下，特定阶的衍射照射光，例如一阶(m＝±1)光可以投影在样品平面(例如，流动池内表面4188)上。在一些情况下，例如，垂直光栅4130A可以将准直光束衍射成一阶衍射光束(±1阶)，其在第一取向上聚焦到样品平面上，并且水平光栅4130B可以将准直光束衍射成一阶衍射光束，其在第二取向上聚焦到样品平面上。在一些情况下，零阶光束和/或所有其他更高阶光束(例如，m＝±2或更高)可以被阻挡，例如，使用例如光束阻挡元件(未示出)从投影到样品平面4188上的照射图案中过滤出来，所述光束阻挡元件例如是可以插入到衍射光栅之后的光路中的阶滤光器。
4100的实例中的结构化照射系统的每个分支包括光学相位调制器或移相器4140A和4140B，以对由每个衍射光栅4130A和4130B透射或反射的衍射光进行相移。在结构化成像期间，每个衍射光束的光学相位可以偏移结构化图案的每个条纹的节距(X)的一部分(例如，1/2、1/2、1/4等)。在图41的实例中，相位调制器4140A和4140B可以实现为例如由旋转致动器或其他致动器机构致动的旋转光学相位板，以旋转和调制每个衍射光束的光路长度。例如，光学相位板4140A可以绕垂直轴旋转以向左或向右偏移由垂直光栅4130A投影在样品平面4188上的图像，并且光学相位板4140B可以绕水平轴旋转以在垂直方向上偏移由水平光栅4130B投影在样品平面4188上的图像。
在其他实施方式中，可以使用改变衍射光的光路长度的其他类型的相位调制器(例如，安装在线性平移台上的光楔等)。另外，虽然光学相位调制器4140A和4140B被图示为放置在衍射光栅4130A和4130B之后，但是在其他实施方式中，它们可以被放置在照射光路中的其他位置。在一些情况下，可以在两个不同的方向上操作单个光学相位调制器以产生不同的光条纹图案，或者可以使用单个运动来调整单个光学相位调制器的位置以同时调整照射光路的两臂的路径长度。
在图41中所示的实例中，光学部件4160可以用于组合来自两个照射光路的光。光学部件4160可以包括例如部分镀银的反射镜，二向色反射镜(取决于光源4110A和4110B输出的光的波长)，包括孔图案或图案化反射涂层、使得来自照射系统的两臂的光以无损或几乎无损的方式组合(例如，除了反射涂层的少量吸收之外没有显著的光功率损失)的反射镜，偏振分束镜(在光源4110A和4110B被配置为产生偏振光的情况下)等。光学部件4160可以被定位成使得由每个衍射光栅反射或透射的所需衍射阶的光在空间上被分辨，并且不想要的光被阻挡。在一些情况下，光学部件4160可以使第一照射光路输出的一阶光通过，并且反射第二照射光路输出的一阶光。在一些情况下，可以通过打开或关闭每个光源，或通过打开和关闭光源的光路中的光学快门，将样品表面4188上的结构化照射图案从垂直取向(例如，使用衍射光栅4130A)切换到水平取向(例如，使用衍射光栅4130B)。在其他情况下，可以通过使用光学开关来切换结构化照射图案，以改变用于照射样品平面的照射光路。
再次参考图41，透镜4170、半反射镜或二向色反射镜4180和物镜4185可以用于将结构化照射光聚焦到样品表面4188(例如，流动池4187的第一内表面)上。由样品表面4188发射、反射或散射的光然后由物镜4185收集，透射通过反射镜4180，并通过图像传感器或照相机4195成像。如所指出的，反射镜4180可以是二向色反射镜，用于将从照射光路的每个分支接收的结构化照射光反射到物镜4185中以投影到样品平面4188上，并且穿过由样品平面4188发射的光(例如，以与激发光不同的波长发射的荧光)以成像到图像传感器4195上。
在一些情况下，系统4100可以任选地包括如本文其他地方所述的定制镜筒透镜4190，使得成像系统的焦点可以从流动池4187的第一内表面4188偏移到第二内表面4189，以实现具有最小调节的双表面成像。在一些情况下，系统4170可以任选地包括如本文其他地方所述的定制镜筒透镜，使得照射光路的焦点可以从流动池4187的第一内表面4188偏移到第二内表面4189，以实现具有最小调节的双表面成像。在一些情况下，透镜4170可以被实现为沿着光轴连接，以调节样品平面上的结构化照射图案的焦点。在一些情况下，系统4100可以包括自动聚焦机构(未示出)，以在图像传感器4195的平面处调节照射光的焦点和/或图像的焦点。在一些情况下，由于在光路中不存在偏振器，图41中所示的系统4100可以提供高的光学效率。根据物镜4185的数值孔径，非偏振光的使用可能或可能不会对照射图案对比度产生显著影响。
为了简单起见，成像系统4100的一些光学部件可以从图41和前面的讨论中省略。虽然系统4100在此非限制性实例中被图示为单通道检测系统，但在其他情况下，其可以被实现为多通道检测系统(例如，使用两个不同的图像传感器和适当的光学器件以及以两个不同波长发射的光源)。此外，虽然系统4100的照射光路在此非限制性实例中被图示为包括两个分支，但在一些情况下，其可以被实现为包括例如三个分支、四个分支或超过四个分支，每个分支包括相对于彼此固定或相对取向可调的衍射光栅。
在一些情况下，可以使用替代性照射路径光学设计来创建结构化照射。例如，在一些情况下，单个大的旋转光学相位调制器可以定位在光学部件4160之后，并且用于代替光学相位调制器4140A和4140B来调制由垂直和水平衍射光栅4130A和4130B输出的两个衍射光束的相位。在一些情况下，代替平行于衍射光栅之一的光轴，单个旋转光学补偿器的旋转轴可以从垂直和水平衍射光栅中的每一个的光轴偏移45度(或另一角度偏移)，以允许沿着两个照射方向的相移。在一些情况下，单个旋转光学相位调制器可以被例如绕标称光束轴旋转的楔形光学部件代替。
在另一个替代性照射光路设计中，衍射光栅4130A和4130B可以安装在相应的线性运动台上，使得它们可以被平移以改变由衍射光栅4130A和4130B反射或透射的光的光路长度(从而改变相位)。线性运动台的运动轴可以垂直于或以其他方式偏离它们各自的衍射光栅的取向，以提供衍射光栅的条纹图案沿着样品平面4188的平移。合适的平移台可以包括例如交叉滚柱轴承台、线性马达、高精度线性编码器和/或其他线性致动器技术，以提供衍射光栅的精确线性平移。
图42提供了用于使用结构化照射来获取和处理图像以增强成像系统的空间分辨率的工作流程的非限制性实例。在一些情况下，可以进行图42中所示的工作流程来对整个样品平面进行成像(例如，通过图像平铺进行流动池的内表面进行成像)，或对较大样品平面的单个区域进行成像。图41中所示的系统4100的垂直衍射光栅4130A和水平衍射光栅4130B可以用于将具有不同的已知取向和/或不同的已知相移的照射光条纹图案投影到样品平面上。例如，成像系统4100可以使用垂直光栅4130A和水平光栅4130B来分别生成水平和垂直照射图案，而光学相位调制器4140A和4140B可以被设置到三个不同的位置，以产生针对每个取向所示的三个相移。
在操作期间，第一照射条件(例如，衍射光栅的特定取向和相移设置)可以用于将光栅光条纹图案投影在样品平面(例如，流动池表面)上。在使用第一照射条件捕获图像之后，可以获取使用一个或多个相移照射图案获取的一个或多个额外图像(例如，使用1、2、3、4、5、6或超过6个相移照射图案获取的1、2、3、4、5、6或超过6个额外图像)。如果成像系统包括照射光路的第二分支，则可以使用第二照射条件作为起点(例如，衍射光栅的第二特定取向和相移设置)来重复图像获取过程，并且可以重复图像获取过程。在一些情况下，可以使用至少5个不同的相移光条纹图案来获取衍射光栅的至少三个不同取向(例如，相对于彼此间隔开60度)的图像。如果不再使用衍射光栅或相移照射光条纹图案的不同取向来获取图像，则可以使用图像重建算法来处理所获取的图像并产生重建的超分辨率图像。在一些情况下，可以在每个取向上使用至少1、2、3、4、5、6或超过6个不同的相移光条纹图案来获取衍射光栅的至少1、2、3、4、5、6或超过6个不同取向的图像。
获取用于重建单个超分辨率图像的多个图像的潜在缺点是调整投影光条纹图案的取向和/或相对相移所需的时间、获取每个图像所需的曝光时间以及下游图像处理。因此，优选将改变衍射光栅取向和相对相位所需的时间最小化的光学设计以及高效的图像重建算法。在一些情况下，重建例如流动池表面的超分辨率图像可需要比重建常规样品(例如，染色组织样品)的更高分辨率图像通常需要更少的图像，所述流动池表面包括拴系到本文其他地方所述的低非特异性结合表面的扩增靶核酸序列的离散的荧光标记簇。
再次参考图42，可以对给定流动池表面的不同区域重复上述循环，例如，在图像将被平铺以创建整个流动池表面的更高分辨率图像的情况下。在一些情况下，如果例如要对第二流动池表面进行成像，则可以在调节成像系统的焦点之后重复上述循环。
其他超分辨率成像技术：在一些情况下，所公开的成像系统可以包括使用替代性超分辨率成像技术，例如，光激活定位显微镜术(PALM)、荧光光激活定位显微镜术(FPALM)和/或随机光学重建显微镜术(STORM)[参见例如Lutz等人(2011),“Biological Imagingby Superresolution Light Microscopy”,Comprehensive Biotechnology(第二版),第1卷,第579-589页,Elsevier)，其基于在单个分子的点扩散函数(PSF)的图像中观察到的强度分布到高斯分布函数的统计曲线拟合。然后使用高斯分布函数来定义分子在样品平面中的位置，其精度远高于经典分辨率极限所允许的精度。可以使用相同的方法进行成像，例如荧光标记分子的小分散子集，诸如拴系到样品载体上的低非特异性结合表面或流动池的内表面的靶核酸序列的克隆扩增簇。
使用这些方法实现的空间准确性或分辨率取决于在分子被光漂白之前从分子收集的光子数量和背景噪声水平[Lutz等人(2011),同上]。在背景噪声可忽略不计并且每个分子可收集至少10,000个光子的情况下，已经证明了1–2nm的位置准确性。在一些情况下，例如，使用本文其他地方所述的亲合力测序方法，包含多个荧光标记(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个标记/缀合物)以确保高光子计数的核苷酸缀合物，任选地与本文其他地方公开的低非特异性结合表面结合使用以确保非常低的背景信号，可以有利于这些超分辨率成像技术用于基因测试和测序应用。空间准确性或分辨率随着收集的光子数量的减少而降低，然而，即使在仅收集中等数量的光子的情况下，位置定位准确性或分辨率为20nm也是可能的。在一些情况下，可以实现横向空间分辨率提高到10倍或更好。在一些情况下，可以实现优于500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或10nm的图像分辨率。
这类成像的第二个基本原理是，在任何给定时间对样品内少量的空间分离的荧光分子进行成像。
在一些情况下，控制样品平面中荧光分子的小分散子集的荧光发射的能力是促进超分辨率成像的关键。例如，在荧光光激活定位显微镜术(FPALM)和光激活定位显微镜术(PALM)的情况下，使用可光激活的绿色荧光蛋白(PA-GFP)作为标记允许使用405nm光的短脉冲在样品中可控地诱导荧光子集，以将PA-GFP从暗、非荧光状态光转换为488nm可激发荧光状态，从而产生可以成像的荧光分子的空间分离子集[Lutz等人(2011),同上]。在随机光学重建显微镜术(STORM)的情况下，例如，花青染料对Cy5–Cy3的光切换特性可以以类似的方式使用，以实现在任何给定时间从样品中的小分子子集(例如，在空间上被至少几个分辨率单位分隔开的小分子子集)随机诱导Cy5荧光。在一些情况下，例如，当与本文其他地方所述的亲合力测序结合时，核苷酸缀合物可以包含可光激活的绿色荧光蛋白(PA-GFP)或其亚结构域或部分。在一些情况下，核苷酸缀合物可以包括缀合物的混合物，其中第一部分用例如Cy3标记进行标记，并且第二部分用例如Cy5标记进行标记。在一些情况下，核苷酸缀合物可以在同一缀合物内包括例如Cy3和Cy5标记的混合物。
超分辨图像是根据在采集图像的时栈中成像的所有分子或特征(例如，标记的核酸簇)的高斯拟合的总和重建的[Lutz等人(2011),同上]，其中强度对应于每个分子或分子子集的位置的位置不确定性。这种数据集的独特之处在于能够以不同的定位精度或分辨率渲染图像。在一些情况下，成像模块包括全内反射荧光(TIRF)光学成像设计在实现这些超分辨率成像技术的使用中可以是有利的，因为用于激发荧光的倏逝波在轴向尺寸上被限制为距样品载体或流动池表面小于200nm，从而抑制背景荧光信号。在一些情况下，成像系统可以包括比本文公开的其他成像模块设计中使用的更高的数值孔径物镜。更高数值孔径物镜的使用可以促进倏逝波激发的实现和对来自荧光探针的光子的高效捕获。在一些情况下，使用单光子敏感EM-CCD照相机或其他类型的图像传感器的宽场成像可以实现每帧许多分子或分子子集(例如，核酸序列簇)的同时成像，从而提高图像采集的通量。
在一些情况下，通过使用本文公开的亲合力测序试剂和低非特异性结合表面来增加信号，同时减少或消除背景，以及使用改进的图像重建算法，可以通过提高成像系统的灵敏度和速度来缩短获取足够的图像以获得足够的特征清晰度和分辨率所需的数据采集时间。
评估图像质量：对于本文公开的光学成像设计的任何实施方案，可以使用本领域技术人员已知的多种性能指标中的任何一种来评估成像性能或成像质量。示例包括但不限于在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、对比度噪声比(CNR)或其任何组合下的调制传递函数(MTF)的测量。
在一些情况下，所公开的用于双面成像的光学设计(例如，所公开的物镜设计、镜筒透镜设计、将电光相板与物镜组合使用等，单独地或组合地)可以显著改善流动池的上(近)内表面和下(远)内表面的图像质量，使得对于上面列出的任何成像性能指标(无论是单独还是组合)，用于对流动池的上内表面和下内表面进行成像的成像性能指标之差小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
在一些情况下，所公开的用于双面成像的光学设计(例如，包括所公开的镜筒透镜设计、将电光相板与物镜组合使用等)可以显著改善图像质量，使得对于上面列出的任何成像性能指标(无论是单独还是组合)，与常规系统(其包括，例如，物镜、运动致动的补偿器(当对流动池的近内表面或远内表面成像时，其移出或移入光路)以及图像传感器)相比，用于双面成像的图像质量性能指标提供在用于双面成像的成像性能指标方面的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％的改善。在一些情况中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，包括所公开的镜筒透镜设计中的一个或多个的荧光成像系统对于双面成像提供了至少相等或更加改善的成像性能指标。在一些情况中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，包括所公开的镜筒透镜设计中的一个或多个的荧光成像系统对于双面成像提供了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的成像性能指标改善。
成像模块规格：
激发光波长：在任何所公开的光学成像模块设计中，所公开的成像模块的光源可以产生可见光，例如绿光和/或红光。在一些情况下，光源单独或与一个或多个光学部件(例如，激发光学滤波器和/或二向色分束镜)组合可以产生约350nm、375nm、400nm、425nm、450nm、475nm、500nm、525nm、550m，575nm、600nm、625nm、650nm，675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、800nm、825nm、850nm、875nm或900nm的激发光。本领域技术人员将认识到，激发波长可以具有在该范围内的任何值，例如约620nm。
激发光带宽：在任何所公开的光学成像模块设计中，光源单独或与一个或多个光学部件(例如，激发光学滤波器和/或二向色分束镜)组合可以在±2nm、±5nm、±10nm、±20nm、±40nm、±80nm或更大的带宽内以指定的激发波长产生光。本领域技术人员将认识到，激发带宽可以具有在该范围内的任何值，例如约±18nm。
光源功率输出：在任何所公开的光学成像模块设计中，一个或多个光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率范围可以是约0.5瓦至约5.0瓦，或更大(如将在下面更详细地讨论的)。在一些情况下，光源的输出和/或从其获得的激发光束的功率可以是至少0.5瓦、至少0.6瓦、至少0.7瓦、至少0.8瓦、至少1瓦、至少1.1瓦、至少1.2瓦、至少1.3瓦、至少1.4瓦、至少1.5瓦、至少1.6瓦、至少1.8瓦、至少2.0瓦、至少2.2瓦、至少2.4瓦、至少2.6瓦、至少2.8瓦、至少3.0瓦、至少3.5瓦、至少4.0瓦、至少4.5瓦、或至少5.0瓦。在一些实施方式中，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率可以是至多5.0瓦、至多4.5瓦、至多4.0瓦、至多3.5瓦、至多3.0瓦、至多2.8瓦、至多2.6瓦、至多2.4瓦、至多2.2瓦、至多2.0瓦、至多1.8瓦、至多1.6瓦、至多1.5瓦、至多1.4瓦、至多1.3瓦、至多1.2瓦、至多1.1瓦、至多1瓦、至多0.8瓦、至多0.7瓦、至多0.6瓦、或至多0.5瓦。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率的范围可以事约0.8瓦至约2.4瓦。本领域技术人员将认识到，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率可以具有此范围内的任何值，例如，约1.28瓦。
光源输出功率和CNR：在所公开的光学成像模块设计的一些实施方式中，一个或多个光源的输出功率和/或从其获得的一个或多个激发光束(包括复合激发光束)的功率，与适当的样品组合，足以在由照射和成像模块获取的图像中提供至少5、至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40或至少50或更大的对比度噪声比(CNR)，或在由这些值中的任何形成的任何范围内的任何CNR。
荧光发射带：在一些情况下，所公开的荧光光学成像模块可以被配置为检测由本领域技术人员已知的各种荧光团中的任何一种产生的荧光发射。用于例如基因分型和核酸测序应用(例如，通过缀合核苷酸、寡核苷酸或蛋白质)的合适的荧光染料的示例包括但不限于荧光素、若丹明、香豆素、花青、及其衍生物，包括花青衍生物花青染料3(Cy3)、花青染料5(Cy5)、花青染料7(Cy7)等。
荧光发射波长：在任何所公开的光学成像模块设计中，所公开的光学系统的检测通道或成像通道可以包括一个或多个光学部件，例如发射光学滤波器和/或二向色分束镜，其被配置为在约350纳米(nm)、375nm、400nm、425nm、450nm、475nm、500nm、525nm、550m、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、800nm、825nm、850nm、875nm或900nm处收集发射光。本领域技术人员将认识到，发射波长可以具有在该范围内的任何值，例如，约825nm。
荧光发射光带宽：在任何所公开的光学成像模块设计中，检测通道或成像通道可以包括一个或多个光学部件，例如，发射光学滤波器和/或二向色分束镜，其被配置为在±2nm、±5nm、±10nm、±20nm、±40nm、±80nm或更大带宽内收集指定发射波长的光。本领域技术人员将认识到，激发带宽可以具有在该范围内的任何值，例如，约±18nm。
数值孔径：在一些情况下，在任何所公开的光学系统设计中，物镜和/或光学成像模块(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)的数值孔径可以在约0.1至约1.4的范围内。在一些情况下、数值孔径可以为至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3或至少1.4。在一些情况下，数值孔径可以为至多1.4、至多1.3、至多1.2、至多1.1、至多1.0、至多0.9、至多0.8、至多0.7、至多0.6、至多0.5、至多0.4、至多0.3、至多0.2或至多0.1。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，数值孔径的范围可以为约0.1至约0.6。本领域技术人员将认识到，数值孔径可以具有在该范围内的任何值，例如约0.55。
光学分辨率：在一些情况下，根据物镜和/或光学系统(例如包括物镜和/或镜筒透镜)的数值孔径，通过任何所公开的光学系统设计实现的样品平面处的最小可分辨光斑(或特征)间隔距离的范围可以为约0.5μm至约2μm。在一些情况下，在样品平面处的最小可分辨光斑间隔距离可以是至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm、至少1.0μm、至少1.2μm、至少1.4μm、至少1.6μm、至少1.8μm或至少1.0μm。在一些情况下，最小可分辨光斑间隔距离可以是至多2.0μm、至多1.8μm、至多1.6μm、至多1.4μm、至多1.2μm、至多1.0μm、至多0.9μm、至多0.8μm、至多0.7μm、至多0.6μm或至多0.5μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，最小可分辨光斑间隔距离可以在约0.8μm至约1.6μm的范围内。本领域技术人员将认识到，最小可分辨光斑间隔距离可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.95μm。
在不同深度的第一表面和第二表面的光学分辨率：在一些情况下，在本文公开的任何光学模块或系统中，本文公开的新颖物镜和/或镜筒透镜设计的使用可以在获取第一表面和第二表面的图像之间需要或不需要重新聚焦情况下赋予第一表面和第二表面(例如流动池上内表面和下内表面)相当的光学分辨率。在一些情况下，由此获得的第一表面和第二表面的图像的光学分辨率可以具有彼此的20％、18％、16％、14％、12％、10％、8％、6％、4％、2％或1％，或在此范围内的任何值内。
放大率：在一些情况下，在任何所公开的光学配置中的物镜和/或镜筒透镜、和/或光学系统(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)的放大率可以在约2倍至约20倍的范围内。在一些情况下，光学系统放大率可以是至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。在一些情况下，光学系统放大率可以是至多20倍、至多15倍、至多10倍、至多9倍、至多8倍、至多7倍、至多6倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍或至多2倍。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，光学系统放大率可以在约3倍至约10倍的范围内。本领域技术人员将认识到，光学系统放大率可以具有在该范围内的任何值，例如，约7.5倍。
物镜焦距长度：在公开的光学设计的一些实施方式中，物镜的焦距长度可以在20mm至40mm的范围内。在一些情况下，物镜的焦距长度可以是至少20mm、至少25mm、至少30mm、至少35mm或至少40mm。在一些情况下，物镜的焦距可以是至多40mm、至多35mm、至多30mm、至多25mm或至多20mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，物镜的焦距长度可以在25mm至35mm的范围内。本领域技术人员将认识到，物镜的焦距长度可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约37mm。
物镜工作距离：在所公开的光学设计的一些实施方式中，物镜的工作距离可以在约100μm至30mm的范围内。在一些情况下，工作距离可以是至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm，至少1mm、至少2mm、至少4mm、至少6mm、至少8mm、至少10mm、至少15mm、至少20mm、至少25mm或至少30mm。在一些情况下，工作距离可以是至多30mm、至多25mm、至多20mm、至多15mm、至多10mm、至多8mm、至多6mm、至多4mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，物镜的工作距离可以在500μm至2mm的范围内。本领域技术人员将认识到，物镜的工作距离可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约1.25mm。
针对通过厚盖玻片成像而优化的物镜：在所公开的光学设计的一些情况下，可以针对不同流动池厚度的盖玻片来改善或优化物镜的设计。例如，在一些情况下，可以将物镜设计成针对厚度为约200μm至约1,000μm的盖玻片具有最佳的光学性能。在一些情况下，可以将物镜设计成针对厚度是至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm或至少1,000μm的盖玻片具有最佳性能。在一些情况下，可将物镜设计为针对厚度为至多1,000μm、至多为900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm或至多200μm的盖玻片具有最佳性能。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，可以将物镜设计为针对厚度为约300μm至约900μm的盖玻片具有最佳光学性能。本领域技术人员将认识到，可以将物镜设计成针对如下盖玻片具有最佳光学性能：该盖玻片可以具有在该范围内的任何值，例如，约725μm。
景深和焦深：在一些情况下，任何所公开的成像模块(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)设计的景深和/或焦深的范围可以是约10μm至约800μm，或更大。在一些情况下，景深和/或焦深可以为至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm或至少800μm，或更大。在一些情况下，景深和/或焦深是至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多250μm、至多200μm、至多175μm、至多150μm、至多125μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm、至多10μm，或更小。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，景深和/或焦深的范围可以为约100μm至约175μm。本领域技术人员将认识到，景深和/或焦深可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约132μm。
视场(FOV)：在一些实施方式中，任何所公开的成像模块设计(例如，由物镜和检测通道光学器件(例如镜筒透镜)的组合所提供)的FOV可以在例如约1mm至约5mm的范围内(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。在一些情况下，FOV可以是至少1.0mm、至少1.5mm、至少2.0mm、至少2.5mm、至少3.0mm、至少3.5mm、至少4.0mm、至少4.5mm或至少5.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。在一些情况下，FOV可以是至多5.0mm、至多4.5mm、至多4.0mm、至多3.5mm、至多3.0mm、至多2.5mm、至多2.0mm、至多1.5mm或至多1.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，FOV的范围可以为约1.5mm至约3.5mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。本领域技术人员将认识到，FOV可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约3.2mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。
视场(FOV)面积：在所公开的光学系统设计的一些情况下，视场的面积可以在约2mm2至约5mm2的范围内。在一些情况下，视场的面积可以是至少2mm2、至少3mm2、至少4mm2或至少5mm2。在一些情况下，视场面积可以是至多5mm2、至多4mm2、至多3mm2或至多2mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，视场的面积可以在约3mm2至约4mm2范围内。本领域技术人员将认识到，视场的面积可以具有在该范围内的任何值，例如，2.75mm2。
物镜和/或镜筒透镜MTF的优化：在一些情况下，所公开的成像模块和系统中的物镜和/或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在中等空间频率至高空间频率范围内优化调制传递函数。例如，在一些情况下，所公开的成像模块和系统中的物镜和/或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在样品平面中在如下空间频率范围内优化调制传递函数：500个周期/mm至900个周期/mm、700个周期/mm至1100个周期/mm、800个周期/mm至1200个周期/mm、或600个周期/mm至1000个周期/mm。
光学像差和衍射受限成像性能：在本文公开的任何光学成像模块设计的一些实施方式中，物镜和/或镜筒透镜可被配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得FOV在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.15波的像差。在一些实施方式中，可将物镜和/或镜筒透镜配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得FOV在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.1波的像差。在一些实施方式中，可将物镜和/或镜筒透镜配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得FOV在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.075波的像差。在一些实施方式中，物镜和/或镜筒透镜可以被配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得FOV在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上是衍射受限的。
光束在二向色反射器、分束镜和合束镜上的入射角：在所公开的光学设计的一些情况下，光束入射在二向色反射器、分束镜或合束镜上的入射角的范围可以为约20度至约45度。在一些情况下，入射角可以是至少20度、至少25度、至少30度、至少35度、至少40度或至少45度。在一些情况下，入射角可以是至多45度、至多40度、至多35度、至多30度、至多25度或至多20度。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，入射角可以在约25度至约40度的范围内。本领域技术人员将认识到，入射角可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约43度。
图像传感器(光电检测器阵列)尺寸：在一些情况下，所公开的光学系统可以包括具有有效区域的图像传感器，所述有效区域的对角线在约10mm至约30mm或更大的范围内。在一些情况下，图像传感器的有效区域的对角线是至少10mm、至少12mm、至少14mm、至少16mm、至少18mm、至少20mm、至少22mm、至少24mm、至少26mm、至少28mm或至少30mm。在一些情况下，图像传感器的有效区域的对角线是至多30mm、至多28mm、至多26mm、至多24mm、至多22mm、至多20mm、至多18mm、至多16mm、至多14mm、至多12mm或至多10mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，图像传感器可以具有对角线范围为约12mm至约24mm的有效区域。本领域技术人员将认识到，一个或多个图像传感器可以具有对角线具有在以上指定的值的范围内的任何值(例如，约28.5mm)的有效区域。
图像传感器像素尺寸和间距：在一些情况下，针对在所公开的光学系统设计中使用的图像传感器所选择的像素尺寸和/或间距可以在至少一维中在约1μm至约10μm的范围内。在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以是至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少6μm、至少7μm、至少8μm、至少9μm或至少10μm。在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以是至多10μm、至多9μm、至多8μm、至多7μm、至多6μm、至多5μm、至多4μm、至多3μm、至多2μm或至多1μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以在约3μm至约9μm的范围内。本领域技术人员将认识到，像素尺寸和/或间距可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.4μm。
过采样：在所公开的光学设计的一些情况下，利用空间过采样方案，其中空间采样频率是光学分辨率X(lp/mm)的至少2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
最大平移台速度：在所公开的光学成像模块的一些情况下，在任何一个轴上的最大平移台速度可以在约1mm/秒至约5mm/秒的范围内。在一些情况下，最大平移台速度可以是至少1mm/秒、至少2mm/秒、至少3mm/秒、至少4mm/秒或至少5mm/秒。在一些情况下，最大平移台速度可以是至多5mm/秒、至多4mm/秒、至多3mm/秒、至多2mm/秒或至多1mm/秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最大平移台速度可以在约2mm/秒至约4mm/秒的范围内。本领域技术人员将认识到，最大平移台速度可以具有在该范围内的任何值，例如，约2.6mm/秒。
最大平移台加速度：在所公开的光学成像模块的一些情况下，在任何一个运动轴上的最大加速度可以在约2mm/秒2至约10mm/秒2范围内。在一些情况下，最大加速度可以是至少2mm/秒2、至少3mm/秒2、至少4mm/秒2、至少5mm/秒2、至少6mm/秒2、至少7mm/秒2、至少8mm/秒2、至少9mm/秒2或至少10mm/秒2。在一些情况下，最大加速度可以是至多10mm/秒2、至多9mm/秒2、至多8mm/秒2、至多7mm/秒2、至多6mm/秒2、至多5mm/秒2、至多4mm/秒2、至多3mm/秒2或至多2mm/秒2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最大加速度可以在约2mm/秒2至约8mm/秒2的范围内。本领域技术人员将认识到，最大加速度可以具有在该范围内的任何值，例如，约3.7mm/秒2。
平移台定位重复性：在所公开的光学成像模块的一些情况下，对于任何一个轴的定位的可重复性可以在约0.1μm至约2μm的范围内。在一些情况下，定位的可重复性可以是至少0.1μm、至少0.2μm、至少0.3μm、至少0.4μm、至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm、至少1.0μm、至少1.2μm、至少1.4μm、至少1.6μm、至少1.8μm或至少2.0μm。在一些情况下，定位的可重复性可以是至多2.0μm、至多1.8μm、至多1.6μm、至多1.4μm、至多1.2μm、至多1.0μm、至多0.9μm、至多0.8μm、至多0.7μm、至多0.6μm、至多0.5μm、至多0.4μm、至多0.3μm、至多0.2μm或至多0.1μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，定位的可重复性可以在约0.3μm至约1.2μm的范围内。本领域技术人员将认识到，定位的可重复性可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.47μm。
FOV重新定位时间：在所公开的光学成像模块的一些情况下，相对于光学器件重新定位样品平面(视场)或者反之亦然所需的最长时间，可以在约0.1秒至约0.5秒的范围内。在一些情况下，最长重新定位时间(即，扫描台步长和稳定时间)可以是至少0.1秒、至少0.2秒、至少0.3秒、至少0.4秒或至少0.5秒。在一些情况下，最长重新定位时间可以是至多0.5秒、至多0.4秒、至多0.3秒、至多0.2秒或至多0.1秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最长重定位时间可以在约0.2秒至约0.4秒的范围内。本领域技术人员将认识到，最长重新定位时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.45秒。
自动对焦校正的误差阈值：在所公开的光学成像模块的一些示例中，用于触发自动聚焦校正的指定误差阈值可以在约50nm至约200nm的范围内。在一些情况下，误差阈值可以是至少50nm、至少75nm、至少100nm、至少125nm、至少150nm、至少175nm或至少200nm。在一些情况下，误差阈值可以是至多200nm、至多175nm、至多150nm、至多125nm、至多100nm、至多75nm或至多50nm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，误差阈值可以在约75nm至约150nm的范围内。本领域技术人员将认识到，误差阈值可以具有在该范围内的任何值，例如，约105nm。
图像获取时间：在所公开的光学成像模块的一些情况下，图像获取时间可以在约0.001秒至约1秒的范围内。在一些情况下，图像获取时间可以是至少0.001秒、至少0.01秒、至少0.1秒或至少1秒。在一些情况下，图像获取时间可以是至多1秒、至多0.1秒、至多0.01秒或至多0.001秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，图像获取时间可以在约0.01秒至约0.1秒的范围内。本领域技术人员将认识到，图像获取时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.250秒。
每个FOV的成像时间：在一些情况下，每个视场的成像时间可以在约0.5秒至约3秒的范围内。在一些情况下，每个FOV的成像时间可以是至少0.5秒、至少1秒、至少1.5秒、至少2秒、至少2.5秒或至少3秒。在一些情况下，每个FOV的成像时间可以是至多3秒、至多2.5秒、至多2秒、至多1.5秒、至多1秒或至多0.5秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，成像时间可以在约1秒至约2.5秒的范围内。本领域技术人员将认识到，成像时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.85秒。
视场平坦度：在一些情况下，在相对于每个荧光(或其他成像模式)检测通道的最佳焦平面±200nm、±175nm、±150nm、±125nm、±100nm、±75nm或±50nm内获取视场的80％、90％、95％、98％、99％或100％上的图像。
用于基因组学和其他应用的系统和系统部件：如上所指出的，在一些实施方式中，所公开的光学成像模块可以用作被配置用于进行例如基因组学应用(例如，基因测试和/或核酸测序应用)或其他化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的较大系统的模块、部件、子组件或子系统。图39提供了例如如本文公开的测序系统的框图的非限制性实例。除了本文公开的一个、两个、三个、四个或超过四个的成像模块(每个成像模块可以包括一个或多个照射光路和/或一个或多个检测光路(例如，一个或多个检测通道，其被配置用于将特定波长范围内的荧光发射成像到图像传感器上))之外，此类系统可以包括一个或多个X-Y平移台、一个或多个X-Y-Z平移台、流动池或盒、流体学系统和流体流量控制模块、试剂盒、温度控制模块、流体分配机器人、盒和/或微孔板处理(拾放)机器人、不透光外壳和/或环境控制腔室、一个或多个处理器或计算机、数据存储模块、数据通信模块(例如，蓝牙、WiFi、内联网或因特网通信硬件和相关软件)、显示模块、一个或多个基于本地和/或基于云的软件包(例如，仪器/系统控制软件包、图像处理软件包、数据分析软件包)等，或其任何组合。
平移台：在本文公开的成像和分析系统(例如，核酸测序系统)的一些实施方式中，所述系统可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个)高精度X-Y(或在某些情况下为X-Y-Z)平移台，用于相对于一个或多个成像模块重新定位一个或多个样品载体结构(例如，一个或多个流动池)，例如，从而平铺一个或多个图像(每个图像对应于成像模块的视场)，以重建整个流动池表面的一个或多个复合图像。在本文公开的成像系统和基因组分析系统(例如，核酸测序系统)的一些实施方式中，所述系统可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个)高精度X-Y(或在某些情况下为X-Y-Z)平移台，用于相对于一个或多个样品载体结构(例如，流动池)重新定位一个或多个成像模块，例如，从而平铺一个或多个图像(每个图像对应于成像模块的视场)，以重建整个流动池表面的一个或多个复合图像。
合适的平移台可从许多供应商，例如Parker Hannifin商购获得。精度平移台系统通常包括多个部件的组合，包括但不限于线性致动器、光学编码器、伺服和/或步进电动机以及电动机控制器或驱动单元。对于本文公开的系统和方法，需要平台移动的高精度和可重复性，以在散布试剂递送和光学检测的重复步骤时，确保例如荧光信号的准确和可再现的定位和成像。
因此，本文公开的系统可以包括指定平移台被配置为相对于照射和/或成像光学器件定位样品载体结构(或反之亦然)的精度。在本公开的一方面，一个或多个平移台的精度在约0.1μm至约10μm之间。在其他方面，平移台的精度是约10μm或更小、约9μm或更小、约8μm或更小、约7μm或更小、约6μm或更小、约5μm或更小、约4μm或更小、约3μm或更小、约2μm或更小、约1μm或更小、约0.9μm或更小、约0.8μm或更小、约0.7μm或更小、约0.6μm或更小、约0.5μm或更小、约0.4μm或更小、约0.3μm或更小、约0.2μm或更小、约0.1μm或更小。本领域技术人员将理解，在一些情况下，平移台的定位精度可以落入由这些值中的任何两个值限定的任何范围内(例如，约0.5μm至约1.5μm)。在一些情况下，平移台的定位精度可以具有在该段所包括的值的范围内的任何值，例如，约0.12μm。
流动池、微流体装置和盒：本文公开的流动池装置和流动池盒可以用作被设计用于多种化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的系统的部件。通常，此类系统可以包括一个或多个所公开的单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置、毛细管流动池盒和/或本文所述的微流体装置和盒中的一个或多个。所公开的流动池装置和盒的另外的描述可以在PCT专利申请公开WO 2020/118255中找到，其全部内容通过引用合并于本文。
在一些情况下，本文公开的系统可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个的单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置、毛细管流动池盒和/或微流体装置和盒。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的固定部件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的可移除的、可更换的部件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的一次性或可消耗部件。
在一些实施方式中，所公开的单个毛细管流动池装置(或单个毛细管流动池盒)包括单个毛细管，例如，玻璃或熔融石英毛细管，其内腔形成试剂或溶液可以流过的流体流动路径，并且其内表面可以形成样品载体结构，目标样品被结合或拴系该样品载体结构上。在一些实施方式中，本文公开的多毛细管毛细管流动池装置(或多毛细管流动池盒)可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个毛细管，其被配置用于执行分析技术，该分析技术还包括成像作为检测方法。
在一些情况下，可以将一个或多个毛细管包装在底座内以形成便于操作的盒，结合了用于进行外部流体连接的适配器或连接器，并且可以任选地包括另外的集成功能件，例如试剂储存器、废物储存器、阀门(例如，微型阀门)、泵(例如，微型泵)等或其任何组合。
图29图示了单个玻璃毛细管流动池装置的一个非限制性示例，该装置包括两个流体适配器(一个固定在一件式玻璃毛细管的每一端)，该流体适配器被设计为与标准OD流体管配合，以提供与外部流体流动控制系统的方便、可交换的流体连接。可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种将流体适配器附接至毛细管，所述技术包括但不限于压配、粘合剂结合、溶剂结合、激光焊接等，或其任何组合。
通常，在所公开的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒中使用的毛细管将具有至少一个内部轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)，其在毛细管的整个长度上延伸。在一些情况下，毛细管可具有两个、三个、四个、五个或多于五个的内部轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)。
用于合适的毛细管(或其内腔)的多个指定的横截面几何形状与本文中的公开内容一致，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些情况下，毛细管(或其内腔)可以具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸(例如，如果内腔是圆形的则为直径，或者如果内腔是正方形或矩形的则为对角线)可以在约10μm至约10mm的范围内。在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm或至少10mm。在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以在约100μm至约500μm的范围内。本领域技术人员将认识到，毛细血管内腔的最大横截面尺寸可以具有该范围内的任何值，例如，约124μm。
在一些情况下，例如，其中流动池装置或盒中的一个或多个毛细管的内腔具有正方形或矩形横截面，第一内表面(例如，顶表面或上表面)和第二内表面(例如，底表面或下表面)之间的距离(其限定流体流动通道的间隙高度或厚度)的范围可以为约10μm至约500μm。在一些情况下，间隙高度可以是至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少225μm、至少250μm、至少275μm、至少300μm、至少325μm、至少350μm、至少375μm、至少400μm、至少425μm、至少450μm、至少475μm或至少500μm。在一些情况下，间隙高度可以是至多500μm、至多475μm、至多450μm、至多425μm、至多400μm、至多375μm、至多350μm、至多325μm、至多300μm、至多275μm、至多250μm、至多225μm、至多200μm、至多175μm、至多150μm、至多125μm、至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，间隙高度可以在约40μm至约125μm的范围内。本领域技术人员将认识到，间隙高度可以具有在该段的值的范围内的任何值，例如，约122μm。
在一些情况下，用于制造所公开的毛细管流动池装置或流动池盒的一个或多个毛细管的长度可以在约5mm至约5cm或更大的范围内。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm或至少5cm。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以是至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm或至多5mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以在约1.5cm至约2.5cm的范围内。本领域技术人员将认识到，一个或多个毛细管的长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.85cm。在一些情况下，装置或盒可以包括多个两个或更多个相同长度的毛细管。在一些情况下，装置或盒可包括多个两个或更多个不同长度的毛细管。
用于构造所公开的毛细管流动池装置或毛细管流动池盒的毛细管可以由本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、熔融石英(石英)、聚合物(例如聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等)、聚醚酰亚胺(PEI)和全氟弹性体(FFKM)作为化学惰性更高的替代品，或其任何组合。就成本和化学兼容性而言，PEI在聚碳酸酯和PEEK之间。FFKM也称为Kalrez。
用于制造毛细管的一种或多种材料通常是光学透明的，以利于与基于光谱或基于成像的检测技术一起使用。在一些情况下，整个毛细管将是光学透明的。可替代地，在一些情况下，仅毛细管的一部分(例如，光学透明的“窗口”)将是光学透明的。
可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制造用于构造所公开的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒的毛细管，其中制造技术的选择通常取决于材料的选择，反之亦然。合适的毛细管制造技术的示例包括但不限于挤出、拉制、精密计算机数控(CNC)机械加工和镗削、激光烧蚀等。
在一些实施方式中，在所公开的毛细管流动池装置和盒中使用的毛细管可以是现成的商业产品。提供精密毛细管的商业供应商的示例包括Accu-Glass(St.Louis,MO；精密玻璃毛细管)、Polymicro Technologies(Phoenix,AZ；精密玻璃和熔融石英毛细管)、Friedrich&Dimmock，Inc.(Millville,NJ；定制精密玻璃毛细管)和Drummond Scientific(Broomall,PA；OEM玻璃和塑料毛细管)。
附接于本文公开的毛细管流动池装置和盒的毛细管的流体适配器，以及毛细管流动池装置或盒的其他部件，可以使用多种合适的技术中的任一种(例如挤压成型、注射成型、压制成型、精密CNC加工等)和材料(例如玻璃、熔融石英、陶瓷、金属、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等)来制造，其中制造技术的选择还是通常取决于所用材料的选择，反之亦然。
图30提供了毛细管流动池盒的非限制性实例，其包括两个玻璃毛细管、流体适配器(在此实例中，每个毛细管两个)以及与毛细管和/或流体适配器匹配的盒底座，从而将毛细管相对于盒保持在固定的取向。在一些情况下，流体适配器可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，盒可以包括与毛细管和/或毛细管流体适配器匹配的另外适配器。如本文其他地方所述，在一些情况下，盒可以包括另外的功能部件。在一些情况下，毛细管永久安装在盒中。在一些情况下，将盒底座设计为允许流动池盒的一个或多个毛细管可互换地移除和更换。例如，在一些情况下，盒底座可以包括铰接的“翻盖”构造，所述构造允许其被打开，从而可以去除和更换一个或多个毛细管。在一些情况下，盒底座被配置成安装在例如荧光显微镜的载物台上或安装在本公开的荧光成像模块或仪器系统的盒保持器内。
在一些情况下，所公开的流动池装置可以包括微流体装置(或“微流体芯片”)和盒，其中微流体装置通过在一层或多层合适材料中形成流体通道来制造，并且包括一个或多个流体通道(例如，“分析”通道)，其被配置用于执行分析技术，该技术还包括成像作为检测方法。在一些实施方式中，本文公开的微流体装置或盒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个流体通道(例如，“分析”流体通道)，其被配置用于执行分析技术，该技术还包括成像作为检测方法。在一些情况下，所公开的微流体装置还可以包括另外的流体通道(例如，用于试剂的稀释或混合)、试剂储存器、废物储存器、用于进行外部流体连接的适配器等，以提供装置内集成的“芯片实验室”功能。
微流体流动池盒的非限制性实例包括：具有在芯片上形成的两个或更多个平行玻璃通道的芯片、与芯片联接的流体适配器、以及与芯片和/或流体适配器匹配的盒底座，以使芯片相对于盒以固定的取向放置。在一些情况下，流体适配器可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，盒可以包括与芯片和/或流体适配器匹配的附加适配器。在一些情况下，芯片被永久地安装在盒中。在一些情况下，将盒底座设计为允许流动池盒中的一个或多个芯片可互换地移除和更换。例如，在一些情况下，盒底座可以包括铰接的“翻盖”构造，所述构造允许其被打开，从而可以去除和更换一个或多个芯片。在一些情况下，盒底座被配置成安装在例如显微镜系统的载物台上或成像系统的盒保持器内。即使在非限制性实例中仅描述一个芯片，也应当理解，在微流体流动池盒中可以使用超过一个的芯片。本公开的流动池盒可包括单个微流体芯片或多个微流体芯片。在一些情况下，本公开内容的流动池盒可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或超过20个微流体芯片。在盒内包装一个或多个微流体装置可以有利于易于操作并在光学成像系统中正确定位装置。
所公开的微流体装置和盒内的流体通道可具有多种横截面几何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些情况下，流体通道可具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些情况下，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸(例如，如果流体通道具有正方形、圆角正方形、矩形或圆角矩形横截面则为对角线)可以在约10μm至约10mm范围内。在一些方面，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm、至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm或至少10mm。在一些方面，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以在约20μm至约200μm范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以具有在该范围内的任何值，例如，约122μm。
在一些情况下，所公开的微流体装置和盒中的流体通道的长度可以在约5mm至约10cm或更大的范围内。在一些情况下，流体通道的长度可以是小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm、至少5cm、至少6cm、至少7cm、至少8cm、至少9cm或至少10cm。在一些情况下，流体通道的长度可以是至多10cm、至多9cm、至多8cm、至多7cm、至多6cm、至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm或至多5mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，流体通道的长度可以在约1.5cm至约2.5cm的范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.35cm。在一些情况下，微流体装置或盒可以包括多个相同长度的流体通道。在一些情况下，微流体装置或盒可包括多个长度不同的流体通道。
所公开的微流体装置将包括具有在其中形成一个或多个流体通道的材料的至少一个层。在一些情况下，微流体芯片可包括结合在一起以形成一个或多个流体通道的两个层。在一些情况下，微流体芯片可以包括结合在一起以形成一个或多个流体通道的三个层或更多个层。在一些情况下，微流体通道可以具有敞开的顶部。在一些情况下，微流体通道可以被制造在一个层(例如，底层的顶表面)内，并且可以通过将底层的顶表面结合到材料的顶层的底表面来密封。在一些情况下，微流体通道可以被制造在一个层内，例如作为图案化通道，所述图案化通道的深度延伸穿过该层的整个厚度，然后被夹在两个非图案化层之间并结合到其上以密封流体通道。在一些情况下，通过去除基底表面上的牺牲层来制造微流体通道。所述方法不需要将本体基底(例如，玻璃或硅晶片)蚀刻掉。相反，流体通道位于基底的表面上。在一些情况下，微流体通道可以在基底的表面内或表面上制造，然后通过在基底的表面上沉积保形膜或层来密封以在芯片中形成次表面或埋设的流体通道。
可以使用微制造工艺的组合来制造微流体芯片。因为装置是微制造的，所以通常将基于它们与已知的微制造技术(例如，光刻、湿法化学蚀刻、激光烧蚀、激光辐照、空气磨蚀技术、注射成型、压花和其他技术)的兼容性来选择基底材料。通常还选择基底材料以使其与微流体装置可暴露的整个条件范围兼容，所述整个条件范围包括pH极端值、温度、盐浓度以及电磁场(例如，光)或电场的施加。
所公开的微流体芯片可以由本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种制成，包括但不限于玻璃(例如硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、石英玻璃(石英)、硅、聚合物(例如聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等)、聚醚酰亚胺(PEI)和全氟弹性体(FFKM)(作为化学惰性更高的替代品)，或其任何组合。在一些优选的情况下，基底材料可以包括基于二氧化硅的基底，如硼硅酸盐玻璃和石英，以及其他合适的材料。
可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制造所公开的微流体装置，其中制造技术的选择通常取决于所用材料的选择，反之亦然。芯片上的微流体通道可以使用适于在基底表面上形成微结构或微图案的技术来构造。在一些情况下，流体通道通过激光辐照形成。在一些情况下，微流体通道通过聚焦的飞秒激光辐射形成。在一些情况下，微流体通道通过光刻和蚀刻形成，包括但不限于化学蚀刻、等离子体蚀刻或深反应离子蚀刻。在一些情况下，使用激光蚀刻形成微流体通道。在一些情况下，使用直写光刻技术形成微流体通道。直写光刻的示例包括电子束直写和聚焦离子束研磨。
在另外的优选示例中，基底材料可以包括聚合物材料，例如，塑料(例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚氯乙烯(PVC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚砜等)。使用诸如上述的可用微制造技术，可以容易地对此类聚合物基底进行图案化或微加工。在一些情况下，微流控芯片可以使用众所周知的成型技术(例如，注射成型、压花、压模、或通过在模具中使聚合物前体材料聚合(参见，例如，美国专利号5,512,131))由聚合物材料制成，例如由微加工的母盘(master)制成。在一些情况下，此类聚合物基底材料是优选的，因为它们易于制造、成本低且具有可处置性，以及它们对大多数极端反应条件的一般惰性。如同由其他材料(例如，玻璃)制成的流动池装置一样，例如，由这些聚合材料制成的流动池装置可以包括经过处理的表面(例如，衍生化或涂覆的表面)，以增强其在微流体系统中的效用，在下面将更详细地讨论。
通常使用上述微制造技术将微流体装置的流体通道和/或流体腔室作为微尺度通道(例如，凹槽、凹口等)制造到第一基底的上表面中。第一基底包括具有第一平坦表面的顶侧和底侧。在根据本文描述的方法制备的微流体装置中，多个流体通道(例如，凹槽和/或凹口)形成在第一平坦表面上。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基底之前)具有底壁和侧壁，其中顶部保持敞开。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基底之前)具有底壁和侧壁，并且顶部保持封闭。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基底之前)仅具有侧壁，而没有顶表面或底表面(例如，流体通道跨越第一基底的整个厚度)。
流体通道和腔室可通过将第一基底的第一平坦表面放置成与第二基底的平坦表面接触并与其结合来密封，以形成装置的位于这两个部件的接界处的通道和/或腔室(例如，内部)。在一些情况下，在将第一基底结合到第二基底之后，可以将结构进一步放置成与第三基底接触并结合到第三基底。在一些情况下，第三基底可以被放置成与第一基底的不与第二基底接触的一侧接触。在一些情况下，第一基底被放置在第二基底和第三基底之间。在一些情况下，第二基底和第三基底可以覆盖和/或密封在第一基底上形成的凹槽、凹口或孔口，以在这些部件的接界处形成装置的通道和/或腔室(例如，内部)。
该装置可以具有开口，该开口被取向为使得它们与形成在该装置的内部中的流体通道和/或流体腔室中的至少一个流体连通，从而形成流体入口和/或流体出口。在一些情况下，开口形成在第一基底上。在一些情况下，开口形成在第一基底和第二基底上。在一些情况下，开口形成在第一基底、第二基底和第三基底上。在一些情况下，开口位于装置的顶侧。在一些情况下，开口位于装置的底侧。在一些情况下，开口位于装置的第一端和/或第二端，并且通道沿着从第一端到第二端的方向延伸。
本领域技术人员通常广泛地理解可将基底结合在一起的条件，并且基底的这种结合通常通过多种方法中的任何一种来进行，其选择可根据使用的基底材料的性质而变化。例如，可以将基底的热结合应用于许多基底材料，包括例如，基于玻璃或二氧化硅的基底以及一些基于聚合物的基底。这样的热结合技术通常包括在升高的温度和在某些情况下施加外部压力的条件下使待结合的基底表面配合。所使用的精确温度和压力通常将根据所用基底材料的性质而变化。
例如，对于基于二氧化硅的基底材料，即，玻璃(硼硅酸盐玻璃、PyrexTM、钠钙玻璃等)、熔融石英(石英)等，通常在约500℃至约1400℃，并且优选约500℃至约1200℃范围的温度下对基底进行热结合。例如，钠钙玻璃通常在约550℃的温度下结合，而硼硅酸盐玻璃通常在800℃或接近800℃的温度下热结合。另一方面，石英基底通常在1200℃或接近1200℃的温度下热结合。这些结合温度通常是通过将要结合的基底放入高温退火炉中来实现。
另一方面，热结合的聚合物基底通常将使用比基于二氧化硅的基底更低的温度和/或压力，以防止基底过度熔化和/或变形，例如装置的内部(即流体通道或腔室)变平。通常，用于结合聚合物基底的此类升高的温度将从约80℃至约200℃变化，这取决于所使用的聚合物材料，并且优选在约90℃至约150℃之间。由于结合聚合物基底所需的温度大大降低，因此通常可以进行这种结合而无需用于结合基于二氧化硅的基底的高温烘箱。如下文更详细地描述的，这允许将热源并入单个集成的结合系统中。
结合剂也可以用于根据众所周知的方法将基底结合在一起，所述方法通常包括在要结合的基底之间施加一层结合剂并将它们压在一起直至结合剂固化。根据这些方法，可以使用各种结合剂，包括例如可商购获得的UV可固化结合剂。根据本公开，也可以使用替代性方法将基底结合在一起，包括例如对聚合物部分的声波或超声波焊接和/或溶剂焊接。
通常，将例如使用“晶片级”制造同时制造多个所述微流体芯片或装置。例如，可将聚合物基底压印或模制成大的可分离片，然后将其配对并结合在一起。然后可以通过切割或切块将单个装置或结合的基底从较大的片分离。类似地，对于基于二氧化硅的基底，可以由更大的基底晶片或板来制造单个装置，从而允许更高的制造工艺产量。具体地，可以在第一基底晶片或板上制造多个流体通道结构，然后将其用第二基底晶片或板覆盖并与其结合，并且任选地，进一步用第三基底晶片或板覆盖并与其结合。然后，使用已知的方法例如锯切、划片和断裂等，将各个装置从较大的基底上分割下来。
如上所述，顶部或第二基底覆盖在底部或第一基底上以密封各种通道和腔室。在根据本公开的方法进行结合过程中，第一基底和第二基底结合可以使用真空和/或压力来执行以保持两个基底表面处于最佳接触。特别地，可以通过例如使底部基底的平坦表面与顶部基底的平坦表面匹配并通过经穿过顶部基底设置的孔施加真空来保持底部基底与顶部基底的最佳接触。通常，通过将顶部基底放置在真空卡盘上来进行向顶部基底中的孔施加真空，该真空卡盘通常包括具有集成真空源的安装台或表面。在基于二氧化硅的基底的情况下，使结合的基底经受高温以产生初始结合，从而可以然后将结合的基底转移到退火炉中，其中相对彼此之间没有任何偏移。
用于与本文描述的装置结合的可替选的结合系统包括例如粘合剂分配系统，用于在基底的两个平坦表面之间施加粘合剂层。这可以通过在匹配基底之前施加粘合剂层，或通过在相邻基底的一个边缘放置一定量的粘合剂，并允许两个配对基底的芯吸作用将粘合剂吸引到两个基底之间的空间上来完成。
在某些情况下，整个结合系统可以包括用于将顶部和底部基底放置在安装表面上并对齐它们以进行后续结合的自动化系统。通常，此类系统包括用于使安装表面或顶部和底部基底得一个或多个相对于彼此移动的平移系统。例如，机器人系统可用于将顶部和底部基底中的每一个依次提升、平移并将其放置在安装台上，并放置在对齐结构内。在结合过程之后，此类系统还可以从安装表面上移走成品，并将这些配对的基底转移到后续操作中，例如分离或切块操作、基于二氧化硅的基底的退火炉等，然后再在其上放置其他基底以进行结合。
在一些情况下，微流体芯片的制造包括将两个或更多个层的基底(例如，图案化和非图案化的聚合物片)层叠或层压，以生产芯片。例如，在微流体装置中，该装置的微流体特征通常通过激光辐照、蚀刻或以其他方式将特征部制造到第一层的表面中来产生。然后将第二层层压或结合到第一层的表面以密封这些特征部并提供装置的流体元件，例如，流体通道。
如上所述，在一些情况下，可将一个或多个毛细管流动池装置或微流体芯片安装在盒底座中以形成毛细管流动池盒或微流体盒。在一些情况下，毛细管流动池盒或微流体盒可还包括与盒集成的附加部件，以为特定应用提供增强的性能。可以集成到盒中的附加部件的示例包括但不限于用于与系统其他部件进行流体连接的适配器或连接器、流体流量控制部件(例如，微型阀、微型泵、混合歧管等)、温度控制部件(例如，电阻加热元件、用作热源或散热器的金属板、用于加热或冷却的压电(珀耳帖)装置、温度传感器)或光学部件(例如，光学透镜、窗口、滤光镜、反射镜、棱镜、光纤和/或发光二极管(LED)或其他微型光源，这些微型光源可共同用于促进一个或多个毛细管或流体流动通道的光谱测量和/或成像。
流体适配器、盒底座和其他盒部件可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种连接至毛细管、毛细管流动池装置、微流体芯片(或芯片内的流体通道)，所述技术包括但不限于压配合、粘合剂结合、溶剂结合、激光焊接等或其任何组合。在一些情况下，微流体芯片中的微流体通道的入口和/或出口是芯片顶表面上的孔口，并且流体适配器可以附接到或联接至芯片内微流体通道的入口和/或出口。在一些情况下，盒可以包括与芯片和/或流体适配器配合并帮助将芯片定位在盒内的附加适配器(即，除了流体适配器之外)。可以使用与上文针对流体适配器概述的制造技术和材料相同的制造技术和材料来构造这些适配器。
盒底座(或“外壳”)可以由金属和/或聚合物材料制成，例如铝、经阳极氧化的铝、聚碳酸酯(PC)、丙烯酸类(PMMA)或Ultem(PEI)，而其他材料也与本公开一致。外壳可以使用CNC机加工和/或模制技术来制造，并且被设计为使得一个、两个或多于两个的毛细管或微流体芯片以固定的取向被底座约束以产生一个或多个独立的流动通道。可以使用例如压配设计或通过与由硅酮或含氟弹性体制成的可压实适配器配合而将毛细管或芯片安装在底座中。在一些情况下，使用例如螺钉、夹子、钳子或其他紧固件来组装盒底座的两个或更多个部件(例如，上半部和下半部)，使得这两个半部是可分离的。在一些情况下，使用例如粘合剂、溶剂结合或激光焊接来组装盒底座的两个或更多个部件，使得两个或更多个部件被永久地附接。
流动池表面涂层：在一些情况下，可以使用本领域技术人员已知的各种表面修饰技术或聚合物涂层中的任一种来涂覆所公开的流动池装置中的毛细管内腔或微流体通道的一个或多个内表面。在一些情况下，可以配制涂层以增加或最大化一个或多个内表面上的可用结合位点(例如，拴系的寡核苷酸衔接子/引物序列)的数量，以增大或最大化前景信号，例如，由与拴系的寡核苷酸衔接子/引物序列杂交的经标记的核酸分子产生的荧光信号。在一些情况下，可以配制涂层以减少或最小化荧光团与其他小分子或经标记或未标记的核苷酸、蛋白质、酶、抗体、寡核苷酸或核酸分子(例如，DNA、RNA、等)的非特异性结合，以减少或最小化背景信号，例如由经标记的生物分子的非特异性结合或样品载体结构的自发荧光产生的背景荧光。在一些情况下可以通过使用所公开的涂层来实现的增大的前景信号和减小的背景信号的组合因此可以在光谱测量中提供改善的信噪比(SNR)或在成像方法中提供改善的对比度噪声噪比(CNR)。
如将在下面更详细地讨论的，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置，任选地与改进的杂交和/或扩增方案结合使用，产生固相生物测定反应，其表现出：(i)蛋白质和其他反应组分的可忽略的非特异性结合(从而减少或最小化基底背景)，(ii)可忽略的非特异性核酸扩增产物，以及(iii)提供可调节的核酸扩增反应。虽然本文主要在核酸杂交、扩增和测序测定的背景下进行了描述，但本领域技术人员将理解，所公开的低结合性载体可以用于多种其他生物测定形式中的任一种，包括但不限于夹心免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。
在一个优选的方面，一层或多层涂层材料可以施加到流动池装置内表面，其中层的数量和/或每层的材料组成被选择为调节流动池装置内表面的一种或多种表面特性，如美国专利申请号16/363,842中所述，其公开内容通过引用整体并入。可以调节的表面特性的实例包括但不限于表面亲水性/疏水性、总涂层厚度、化学反应性官能团的表面密度、接枝的接头分子或寡核苷酸衔接子/引物的表面密度等。在一些优选的应用中，调节毛细管或通道内腔的一种或多种表面特性，例如，(i)提供化学或生物分析应用(包括固相核酸扩增和/或测序应用)的蛋白质、寡核苷酸、荧光团和其他分子组分的非常低的非特异性结合，(ii)提供改善的固相核酸杂交特异性和效率，以及(iii)提供改善的固相核酸扩增率、特异性和效率。
本领域技术人员已知的多种分子中的任一种，包括但不限于硅烷、氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物或其组合，都可以用于在流动池装置内表面上产生一个或多个化学改性层，其中所用组分的选择可以有所不同，以改变载体表面的一种或多种特性，例如，官能团和/或栓系的寡核苷酸引物的表面密度、载体表面的亲水性/疏水性或载体表面的三个三维性质(例如，“厚度”)。
用于将第一化学改性层接枝到流动池(毛细管或通道)的内表面的附接化学法通常取决于制造流动池装置的材料和所述层的化学性质。在一些情况下，第一层可以共价附接到流动池装置内表面。在一些情况下，第一层可以例如通过非共价相互作用例如静电相互作用、氢键或表面与第一层的分子组分之间的范德华相互作用而非共价附接例如吸附到表面上。无论哪种情况，都可以在附接或沉积第一层之前对基底表面进行处理。本领域技术人员已知的多种表面制备技术中的任何一种都可以用于清洁或处理载体表面。例如，可以使用Piranha溶液(硫酸(H2SO4)和过氧化氢(H2O2)的混合物)酸洗玻璃或硅表面和/或使用氧等离子体处理方法进行清洁。
硅烷化学法构成一种非限制性方法，用于共价修饰玻璃或硅表面上的硅烷醇基以附接更多的反应性官能团(例如，胺基或羧基)，其然后可以用于将接头分子(例如，各种长度的线性烃分子，诸如C6、C12、C18烃或线性聚乙二醇(PEG)分子)或层分子(例如，支化的PEG分子或其他聚合物)偶联到表面上。可以用于产生任何所公开的低结合性载体表面的合适硅烷的实例包括但不限于(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)以及多种PEG-硅烷(例如，具有1K、2K、5K、10K、20K等的分子量)、氨基-PEG硅烷(例如，具有游离的氨基官能团)、马来酰亚胺-PEG硅烷、生物素-PEG硅烷等中的任一种。
可以用于在任何所公开的载体表面中产生一层或多层低非特异性结合材料的优选聚合物的实例包括但不限于各种分子量和分支结构的聚乙二醇(PEG)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物，或其任何组合。可以用于将一层或多层材料(例如，聚合物层)接枝到载体表面和/或使层彼此交联的缀合化学法的实例包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变型)、His标签-Ni/NTA缀合化学、甲氧基醚缀合化学、羧酸酯缀合化学、胺缀合化学、NHS酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷。
在一些情况下，流动池装置内表面上的聚合物或其他化学层的数量可以在1至约10或大于10的范围内。在一些情况下，层的数量是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个。在一些情况下，层的数量可以是至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，层的数量可以在约2个至约4个的范围内。在一些情况下，一个或多个层可以全部包含相同的材料。在一些情况下，每个层可以包含不同的材料。在一些情况下，多个层可以包含多种材料。
多层表面的一个或多个层可以包含支化聚合物或可以是线性的。合适的支化聚合物的实例包括但不限于，支化PEG、支化聚乙烯醇(支化PVA)、支化聚(乙烯基吡啶)、支化聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化PVP)、支化聚(丙烯酸)(支化PAA)、支化聚丙烯酰胺、支化聚(N-异丙基丙烯酰胺)(支化PNIPAM)、支化聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化PMA)、支化聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化PHEMA)、支化聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支化POEGMA)、支化聚谷氨酸(支化PGA)、支化聚赖氨酸、支化聚葡萄糖苷和葡聚糖。
在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的支化聚合物可以包含至少4个分支、至少5个分支、至少6个分支、至少7个分支、至少8个分支、至少9个分支、至少10个分支、至少12个分支、至少14个分支、至少16个分支、至少18个分支、至少20个分支、至少22个分支、至少24个分支、至少26个分支、至少28个分支、至少30个分支、至少32个分支、至少34个分支、至少36个分支、至少38个分支或至少40个分支。分子通常显示出‘2的幂’数量个分支，例如2、4、8、16、32、64或128个分支。
在一些情况下，在沉积一个或多个层(例如，聚合物层)之后，所得的远离表面的官能端基可以包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、马来酰亚胺和双硅烷。
用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以是至少500道尔顿、至少1,000道尔顿、至少1,500道尔顿、至少2,000道尔顿、至少2,500道尔顿、至少3,000道尔顿、至少3,500道尔顿、至少4,000道尔顿、至少4,500道尔顿、至少5,000道尔顿、至少7,500道尔顿、至少10,000道尔顿、至少12,500道尔顿、至少15,000道尔顿、至少17,500道尔顿、至少20,000道尔顿、至少25,000道尔顿、至少30,000道尔顿、至少35,000道尔顿、至少40,000道尔顿、至少45,000道尔顿或至少50,000道尔顿。在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以是至多50,000道尔顿、至多45,000道尔顿、至多40,000道尔顿、至多35,000道尔顿、至多30,000道尔顿、至多25,000道尔顿、至多20,000道尔顿、至多17,500道尔顿、至多15,000道尔顿、至多12,500道尔顿、至多10,000道尔顿、至多7,500道尔顿、至多5,000道尔顿、至多4,500道尔顿、至多4,000道尔顿、至多3,500道尔顿、至多3,000道尔顿、至多2,500道尔顿、至多2,000道尔顿、至多1,500道尔顿、至多1,000道尔顿或至多500道尔顿。此段落中描述的下限值和上限值中任一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面中的任一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以在约1,500道尔顿至约20,000道尔顿的范围内。本领域技术人员将认识到，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以具有在此范围内的任何值，例如，约1,260道尔顿。
在一些情况下，两个或更多个层可以彼此共价偶联或内部交联以提高所得表面的稳定性。在一些情况下，例如，其中多层表面的至少一层包括支化聚合物，被沉积的层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以在每个分子约1个共价键至每个分子约32个共价键的范围内。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以为每个分子至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30、至少32或多于32个共价键。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以为至多32、至多30、至多28、至多26、至多24、至多22、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1个。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量范围可以为约4至约16。本领域技术人员将认识到，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以具有在此范围内的任何值，例如，在一些情况下为约11，或在其他情况下平均值为约4.6。
在材料层偶联至流动池装置内表面之后残留的任何反应性官能团可以通过使用高产率偶联化学法偶联小的惰性分子来任选地封闭。例如，在使用胺偶联化学将新材料层附接到前一层的情况下，任何残留的胺基随后可以通过与诸如甘氨酸的小氨基酸偶联而被乙酰化或灭活。
为了缩放结合位点表面密度(例如，寡核苷酸衔接子/引物表面密度)，并增加亲水性或两性表面的另外维度，已经开发了包含PEG和其他亲水性聚合物的多层涂层的基底。通过使用亲水性和两性表面分层方法(其包括但不限于以下所述的聚合物/共聚物材料)，可以显著增加表面上的衔接子/引物加载密度。传统的PEG涂层方法使用单层引物沉积，其已针对单分子测序应用进行了测试盒报道，但对于核酸扩增应用却无法获得高拷贝数。如本文所述，“分层”可以采用任何相容的聚合物或单体亚单元使用传统交联方法来完成，使得可以依次构建包括两个或更多个高度交联的层的表面。合适的聚合物的实例包括但不限于链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸以及聚赖氨酸和PEG的共聚物。在一些情况下，不同的层可以通过多种缀合反应中的任一种彼此交联，所述缀合反应包括但不限于生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-NHS酯反应，硫醇-马来酰亚胺反应以及带正电荷的聚合物和带负电荷的聚合物之间的离子相互作用。在一些情况下，可以在溶液中构建高衔接子/引物密度材料，然后通过多个步骤将其层叠在表面上。
在一些情况下，PEG多层包括在PEG-胺-APTES上的PEG(8臂，16臂，8臂)。对于在暴露于8uM引物的PEG-胺-APTES上的3层多臂PEG(8臂、16臂、8臂)和(8臂、64臂、8臂)以及使用星形PEG-胺代替16臂和64臂的3层多臂PEG(8臂、8臂、8臂)观察到相似的浓度。还考虑了具有可比较的第一PEG层、第二PEG层和第三PEG层的PEG多层。
在一些情况下，流动池装置内表面上结合位点的所得表面密度，例如寡核苷酸衔接子/引物表面密度，可以在约100个引物分子/μm2至约1,000,000个引物分子/μm2的范围内。在一些情况下，结合位点的表面密度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少5,500、至少6,000、至少6,500、至少7,000、至少7,500、至少8,000、至少8,500、至少9,000、至少9,500、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，结合位点的表面密度可以是至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,500、至多9,000、至多8,500、至多8,000、至多7,500、至多7,000、至多6,500、至多6,000、至多5,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3,500、至多3,000、至多2,500、至多2,000、至多1,500、至多1,000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200或至多100个分子/μm2。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，结合位点的表面密度可以在约10,000个分子/μm2至约100,000个分子/μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，结合位点的表面密度可以具有在此范围内的任何值，例如，在一些情况下为约3,800个分子/μm2，或在其他情况下为约455,000个分子/μm2。在一些情况下，如将在下面针对核酸测序应用进一步讨论的，最初与拴系到流动池装置内表面上的衔接子或引物序列杂交的模板文库核酸序列(例如，样品DNA分子)的表面密度可以小于或等于结合位点的表面密度所指示的表面密度。在一些情况下，如还将在下面进一步讨论的，与流动池装置内表面上的衔接子或引物序列杂交的经克隆扩增的模板文库核酸序列的表面密度可以跨与拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度所指示的表面密度的相同范围或不同范围。
如上列出的流动池装置内表面上的结合位点的局部表面密度不排除在整个表面上的密度变化，使得表面可以包括具有例如500,000/um2的结合位点密度的区域，同时还包括具有明显不同的局部表面密度的至少第二区域。
在一些情况下，具有不同碱基序列和碱基修饰的捕获探针，例如寡核苷酸引物(或其他生物分子，例如酶或抗体)可以各种表面密度拴系到所得表面的一个或多个层上。在一些情况下，例如，用于偶联的表面官能团密度和捕获探针浓度都可以变化以针对某个捕获探针表面密度范围。此外，捕获探针表面密度可以通过用其他“惰性”分子稀释捕获探针来控制，所述惰性分子携带相同的反应官能团用于偶联到表面。例如，胺标记的寡核苷酸探针可以用与NHS酯涂覆的表面反应的胺标记的聚乙二醇稀释，以降低最终引物密度。在寡核苷酸衔接子/引物的情况下，在杂交区与表面附接官能团之间具有不同长度接头的引物也可以用于使表面密度变化。合适的接头的实例包括在引物的5’端的聚-T链和聚-A链(例如，0至20个碱基)、PEG接头(例如，3至20个单体单元)和碳链(例如，C6、C12、C18等)。为了测量或估计捕获探针表面密度，可以将经荧光标记的捕获探针拴系到表面上，然后将荧光读数与包含已知浓度的荧光团的校准溶液的荧光读数进行比较。
在一些情况下，可以例如通过测量水接触角来评估所公开的载体表面(例如，流动池装置内表面)的亲水性(或水溶液情况下的“润湿性”)程度，其中将小滴的水放置在表面上，并使用例如光学张力计测量其与表面的接触角。在一些情况下，可以确定静态接触角。在一些情况下，可以确定前进或后退接触角。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以在约0度至约50度的范围内。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以不超过50度、45度、40度、35度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在许多情况下，接触角不超过此范围内的任何值，例如不超过40度。本领域技术人员将认识到，本公开的给定的亲水性、低结合性的载体表面可以表现出具有在此范围内的任何值的水接触角，例如约27度。在一些情况下，所公开的低非特异性结合表面具有小于45度的水接触角。在一些情况下，所公开的低非特异性结合表面具有小于35度的水接触角。
如所指出的，本公开的亲水性涂覆的流动池装置内表面表现出减少的蛋白质、核酸、荧光团和生物和生化测定方法的其他组分的非特异性结合。给定的载体表面(例如，流动池装置内表面)表现出的非特异性结合的程度可以被定性或定量地评估。例如，在一些情况下，在标准化的一组条件下，将表面暴露于荧光染料(例如，花青染料3(Cy3)、花青染料5(Cy5)等)、经荧光标记的核苷酸、经荧光标记的寡核苷酸和/或经荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)，随后进行指定的冲洗程序和荧光成像可以用作定性工具，用于比较在包含不同表面制剂的载体上的非特异性结合。在一些情况下，在标准化的一组条件下，将表面暴露于荧光染料、经荧光标记的核苷酸、经荧光标记的寡核苷酸和/经或荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)，随后进行指定的冲洗程序和荧光成像可以用作定量工具，用于比较在包含不同表面制剂的载体上的非特异性结合–前提是要确保在荧光信号与载体表面上荧光团的数量呈线性相关(或者以可预测的方式相关)的条件下(例如，在信号饱和和/或荧光团的自淬灭不成问题的条件下)使用合适的校准标准进行荧光成像。在一些情况下，可以用本领域技术人员已知的其他技术例如放射性同位素标记和计数方法来定量评估本公开的不同载体表面制剂表现出的非特异性结合的程度。
在一些情况下，可以使用用于使表面与标记的蛋白质(例如，牛血清白蛋白(BSA)、链霉亲和素、DNA聚合酶、逆转录酶、解旋酶、单链结合蛋白(SSB)等，或其任何组合)、经标记的核苷酸、经标记的寡核苷酸等在一组标准的温育和冲洗条件下接触的标准化程序，随后检测残留在表面上的标记量，并将由此产生的信号与适当的校准标准进行比较，来评估由所公开的低非特异性结合载体表面表现出的非特异性结合的程度。在一些情况下，标记可以包括荧光标记。在一些情况下，标记可以包含放射性同位素。在一些情况下，标记可以包括本领域技术人员已知的任何其他可检测标记。在一些情况下，由给定的载体表面制剂所表现出的非特异性结合的程度由此可以根据每单位面积上非特异性结合的蛋白质分子(或其他分子)的数量来评估。在一些情况下，本公开的低非特异性结合载体可以表现出低于0.001分子/μm2、低于0.01分子/μm2、低于0.1个分子/μm2、低于0.25个分子/μm2、低于0.5个分子/μm2、低于1个分子/μm2、低于10个分子/μm2、低于100个分子/μm2或低于1,000个分子/μm2的非特异性蛋白质结合(或其他特定分子，例如花青染料3(Cy3)的非特异性结合)。本领域技术人员将认识到，本公开的给定载体表面可以表现出落在此范围内的任何数值的非特异性结合，例如，为低于86个分子/μm2。例如，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中与1uM的经Cy3标记的链霉亲和素(GE Amersham)溶液接触15分钟，然后用去离子水冲洗3次后，本文公开的某些修饰表面表现出的非特异性蛋白质结合低于0.5个分子/μm2。本文公开的某些修饰表面表现出Cy3染料分子的非特异性结合低于0.25个分子/μm2。在独立的非特异性结合测定中，将1μM经标记的Cy3 SA(ThermoFisher)、1uM Cy5 SA染料(ThermoFisher)、10uM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-647N(Jena Biosciences)、10uM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-Rho11(JenaBiosciences)、10uM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-Rho11(Jena Biosciences)、10uM 7-炔丙基氨基-7-去氮-dGTP-Cy5(Jena Biosciences、和10uM 7-炔丙基氨基-7-去氮-dGTP–Cy3(JenaBiosciences)在低非特异性结合基底上以384孔板的形式在37℃下温育15分钟。每个孔用50ul去离子RNase/DNase Free水冲洗2-3次，并用25mMACES缓冲液(pH 7.4)冲洗2-3次。在GE Typhoon(GE Healthcare Lifesciences，Pittsburgh，PA)仪器上使用制造商指定的Cy3、AF555或Cy5滤光器组(根据进行的染料测试)在PMT增益设置为800和分辨率为50-100μm下对384孔板进行成像。对于更高分辨率的成像，在Olympus IX83显微镜(Olympus Corp.，Center Valley，PA)上采集图像，所述Olympus IX83显微镜具有全内反射荧光(TIRF)物镜(20x，0.75NA或100X，1.5NA，Olympus)，sCMOS Andor照相机(Zyla 4.2)。二向色反射镜购自Semrock(IDEX Health&Science,LLC，Rochester，纽约)，例如405、488、532或633nm二向色反射器/分束镜，并且带通滤光器选为532LP或645LP，与适当的激发波长一致。本文公开的某些修饰表面表现出染料分子的非特异性结合低于0.25个分子/μm2。
在一些情况下，本文公开的经涂覆的流动池装置可以表面表现出荧光团诸如Cy3的特异性结合与非特异性结合的比率为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或跨本文范围内的任何中间值。
在一些情况下，可以使用诸如化学气相沉积(CVD)的技术将一个或多个表面改性和/或聚合物层施加到流动池装置内表面。在一些情况下，一个或多个表面改性和/或聚合物层可以通过在用于其预期应用之前使一种或多种适当的化学偶联或涂覆试剂流过毛细管或流体通道而被施加到流动池装置内表面。在一些情况下，可以将一种或多种涂覆试剂添加到所使用的缓冲液(例如，核酸杂交、扩增反应和/或测序反应缓冲液)中，以提供流动池装置内表面的动态涂覆。
在一些情况下，化学改性层可以均匀地施加在基底或载体结构的表面上。可替代地，基底或载体结构的表面可以被不均匀地分布或图案化，使得化学改性层被限制在基底的一个或多个离散区域中。例如，可以使用光刻技术对基底表面进行图案化，以在表面上生成化学修饰区域的有序阵列或随机图案。可替代地或组合地，可以使用例如接触印刷和/或喷墨印刷技术对基底表面进行图案化。在一些情况下，化学修饰的离散区域的有序阵列或随机图案可以包含至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400，500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多个离散区域，或跨本文范围内的任何中间数量的离散区域。
在一些情况下，当例如在核酸杂交或扩增应用中使用，以产生杂交或克隆扩增的核酸分子簇(例如，直接或间接用荧光团标记的“离散区域”)时，所公开的低非特异性结合表面的荧光图像表现出至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250的对比度噪声噪比(CNR)，此时用Cy3标记核酸分子，并且使用Olympus IX83倒置荧光显微镜采集图像，所述显微镜配备有20x 0.75NA物镜、532nm光源、适于或优化用于532nm长通激发和Cy3荧光发射滤光器的带通和二向色反射镜滤光器组、Semrock 532nm二向色反射器和照相机(Andor sCMOS，Zyla4.2)，其中调节激发光强度以避免信号饱和，并且在采集图像时将表面浸入在缓冲液(例如，25mMACES，pH 7.4缓冲液)中。如本文所用，对比度噪声噪比(CNR)计算为：
CNR＝(S–B)/噪声
其中S＝前景信号(例如，如在图像中测量的荧光信号，其产生于样品载体表面上的标记核酸集落或簇)，B＝背景信号(其中B＝B inter+B intra)，B inter＝在样品载体表面上标记的核酸集落或簇之间的位置测量的背景信号，B intra＝在核酸集落或簇的位置测量的背景信号(例如，通过使样品载体表面与标记的非互补寡核苷酸接触并测量所得荧光来确定)，并且噪声＝信号噪声。例如，测序表面图像的对比度噪声比(CNR)提供了评估核酸扩增特异性和载体上非特异性结合的关键指标。虽然信噪比(SNR)通常被认为是整体信号质量的基准，但可以表明，改善的CNR相对于SNR作为要求快速图像捕获的成像应用(例如，可以将循环次数最小化的核酸测序应用)中信号质量的基准，可以提供明显的优势。低非特异性结合表面的进一步描述可以见于美国专利号10,876,148、10,704,094和10,982,280，其通过引用整体并入本文。
在一些情况下，聚合物涂覆的样品载体结构，例如，包含所公开的亲水性聚合物涂层的流动池装置内表面，可以对重复暴露于溶剂、温度变化、pH变化或长期储存表现出改善的稳定性。
流体学系统和流体流量控制模块：在一些实施方式中，所公开的成像和/或分析系统可以提供流体流量控制能力，以将样品或试剂输送到连接到系统一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)。试剂和缓冲液可以储存在瓶子、试剂和缓冲液盒或其他合适的容器中，所述容器通过管道和阀门歧管连接到流动池入口。所公开的系统还可以包括用于收集毛细管流动池装置或毛细管流动池盒下游流体的以瓶子、盒或其他合适的容器形式的处理过的样品和废物储存器。在一些实施方案中，流体流量(或“流体学”)控制模块可以提供不同源之间的流量的可编程切换，所述不同源例如，位于仪器中的样品或试剂储存器或瓶子，以及中心区域(例如，毛细管流动池或微流体装置，或大流体腔室(例如微流体装置内的大流体腔室))的一个或多个入口。在一些情况下，流体流量控制模块可以提供来自中心区域(例如，毛细管流动池或微流体装置)的一个或多个出口与连接到系统的不同的收集点(例如，处理过的样品储存器、废物储存器等)之间的流量的可编程切换。在一些情况下，可以将样品、试剂和/或缓冲液储存在与流动池盒或微流体盒本身集成在一起的储存器中。在一些情况下，可以将处理过的样品、用过的试剂和/或使用过的缓冲液储存在与流动池盒或微流体装置盒本身集成在一起的储存器中。
在一些实施方式中，一个或多个流体流量控制模块可以被配置为控制流体到一个或多个毛细管流动池、毛细管流动池盒、微流体装置、微流体盒或其任何组合的输送。在一些情况下，一个或多个流体学控制器可以被配置为控制一种或多种流体或试剂的体积流速、一种或多种流体或试剂的线性流速、一种或多种流体或试剂的混合比或其任何组合。通过所公开的系统的流体流量的控制通常将使用泵(或其他流体致动机构)和阀(例如，可编程泵和阀)来执行。合适的泵的实例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。合适的阀的实例包括但不限于止回阀、机电两通或三通阀、气动两通和三通阀等。在一些情况下，可以通过对试剂和缓冲液容器的一个或多个入口或并入一个或多个流动池盒(例如，毛细管流动池或微流体盒)的一个或多个入口施加正气压来控制通过系统的流体流量。在一些实施方案中，可以通过在一个或多个废物储存器的一个或多个出口处或并入一个或多个流动池盒(例如，毛细管流动池或微流体盒)中的一个或多个出口处抽真空来控制通过系统的流体流量。
在一些情况下，在测定或分析程序中的不同点使用不同的流体流量控制模式，例如正向流动(相对于给定毛细管流动池装置的入口和出口)、反向流动、振荡或脉动流动或其组合。在一些应用中，例如，在分析洗涤/冲洗步骤期间，可以采用振荡或脉动流动，以促进一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，毛细管流动池装置或盒和微流体装置或盒)内流体的完全或有效交换。
类似地，在一些情况下，可以在流动池装置内的不同位置或测定或分析过程工作流程中的不同点使用不同的流体流速，例如，在一些情况下，体积流速可以从-100ml/s至+100ml/s变化。在一些实施方式中，体积流速的绝对值可以为至少0.001ml/秒、至少0.01ml/秒、至少0.1ml/秒、至少1ml/秒、至少10ml/秒或至少100ml/秒。在一些实施方式中，体积流速的绝对值可以是至多100ml/秒、至多10ml/秒、至多1ml/秒、至多0.1ml/秒、至多0.01ml/秒或至多0.001ml/秒。在流动池装置给定位置或给定时间点的体积流速可以具有此范围内的任何值，例如正向流速为2.5ml/s，反向流速为-0.05ml/s，或值为0ml/s(即，停止流动)。
在一些实施方式中，流体学系统可以被设计成使执行例如，基因组分析应用所需的关键试剂(例如，昂贵的试剂)的消耗最小化。例如，在一些实施方式中，所公开的流体学系统可以包括容纳第一试剂或溶液的第一储存器、容纳第二试剂或溶液的第二储存器以及中心区域(例如，中心毛细管流动池或微流体装置)，其中第一储存器的出口和第二储存器的出口通过至少一个阀流体联接到中心毛细管流动池或微流体装置的入口，使得从第一储存器的出口到中心毛细管流动池或微流体装置的入口每单位时间流动的第一试剂或溶液的体积小于从第二储存器的出口到中心区域的入口每单位时间流动的第二试剂或溶液的体积。在一些实施方式中，第一储存器和第二储存器可以被集成到毛细管流动池盒或微流体盒中。在一些情况下，至少一个阀也可以集成到毛细管流动池盒或微流体盒中。
在一些情况下，第一储存器通过第一阀流体联接至中心毛细管流动池或微流体装置，第二储存器通过第二阀流体联接至中心毛细管流动池或微流体装置。在一些情况下，第一和/或第二阀可以是例如隔膜阀、夹管阀、闸阀或其他合适的阀。在一些情况下，第一储存器被定位成紧邻中心毛细管流动池或微流体装置的入口，以减少用于输送第一试剂溶液的死体积。在一些情况下，第一储存器比第二储存器放置更靠近中心毛细管流动池或微流体装置的入口。在一些情况下，第一储存器被定位为紧邻第二阀，以便相对于用于从多个“第二”储存器(例如，两个，三个，四个、五个或六个或更多个“第二”储存器)输送多种“第二”试剂(例如，两种、三种、四种、五种或六种或更多种“第二”试剂)的死体积，减小用于输送第一试剂的死体积。
上述的第一储存器和第二储存器可以用于容纳相同或不同的试剂或溶液。在一些情况下，容纳在第一储存器中的第一试剂不同于容纳在第二储存器中的第二试剂，并且第二试剂包括至少一种试剂，其被在中心毛细管流动池或微流体装置中发生的多个反应共同使用。在一些情况下，例如，在被配置用于在中心毛细管流动池或微流体装置内执行核酸测序化学的流体学系统中，第一试剂包括选自由以下组成的组中的至少一种试剂：聚合酶、核苷酸和核苷酸类似物。在一些情况下，第二试剂包括低成本试剂，例如溶剂。
在一些情况下，可以基于要执行的特定应用(例如，核酸测序)来调节中心区域(例如，中心毛细管流动池盒或包括一个或多个流体通道或流体腔室的微流体装置)的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对真核基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对原核基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对病毒基因组测序的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适于对转录组测序的内部体积。例如，在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于0.05μl、在0.05μl至0.1μl之间、在0.05μl至0.2μl之间、在0.05μl至0.5μl之间、在0.05μl至0.8μl之间、在0.05μl至1μl之间、在0.05μl至1.2μl之间、在0.05μl至1.5μl之间、在0.1μl至1.5μl之间、在0.2μl至1.5μl之间，在0.5μl至1.5μl之间、在0.8μl至1.5μl之间、在1μl至1.5μl之间、在1.2μl至1.5μl之间或大于1.5μl或上述任何两个定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于0.5μl、在0.5μ1至1μl之间、在0.5μl至2μl之间、在0.5μl至5μl之间、在0.5μl至8μl之间、在0.5μl至10μl之间、在0.5μl至12μl之间、在0.5μl至15μl之间、在1μl至15μl之间、在2μl至15μl之间、在5μl至15μl之间、在8μl至15μl之间、在10μl至15μl之间、在12μl至15μl之间或大于15μl或由前述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于5μl、在5μl至10μl之间、在5μl至20μl之间、在5μl至500μl之间、在5μl至80μl之间、在5μl至100μl之间、在5μl至120μl之间、在5μl至150μl之间、在10μl至150μl之间、在20μl至150μl之间、在50μl至150μl之间、在80μl至150μl之间、在100μl至150μl之间、在120μl至150μl之间或大于150μl或由前述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于50μl、在50μl至100μl之间、在50μl至200μl之间、在50μl至500μl之间、在50μl至800μl之间、在50μl至1000μl之间、在50μl至1200μl之间、在50μl至1500μl之间、在100μl至1500μl之间、在200μl至1500μl之间、在500μl至1500μl之间、在800μl至1500μl之间、在1000μl至1500μl之间、在1200μl至1500μl之间或大于1500μl或由前述任何两个定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于500μl、在500μl至1000μl之间、在500μl至2000μl之间、在500μl至5ml之间、在500μl至8ml之间、在500μl至10ml、在500μl至12ml之间、在500μl至15ml之间、在1ml至15ml之间、在2ml至15ml之间、在5ml至15ml之间、在8ml至15ml之间、在10ml至15ml之间、在12ml至15ml之间或大于15ml或上述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于5ml、在5ml至10ml之间、在5ml至20ml之间、在5ml至50ml之间、在5ml至80ml之间、在5ml至100ml之间、在5ml至120ml之间、在5ml至150ml之间、在10ml至150ml之间、在20ml至150ml之间、在50ml至150ml之间、在80ml至150ml之间、在100ml至150ml之间、在120ml至150ml之间或大于150ml，或由前述任何两个所定义的范围的体积。在一些实施方案中，本文描述的系统包括流动池装置或系统的阵列或集合，其包括多个离散的毛细管、微流体通道、流体通道、腔室或内腔区域，其中组合的内部体积为，包含或包括本文公开范围内的一个或多个值。
在一些情况下，用于将第一试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速与用于将第二试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速的比率可以小于1:20、小于1:16、小于1:12、小于1:10、小于1:8、小于1:6或小于1:2。在一些情况下，用于将第一试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速与用于将第二试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速的比率可以具有在这些值跨越的范围内的任何值，例如小于1:15。
如所指出的，与通过例如其他测序装置和系统，特别是在各种测序化学步骤中对于各种使用的昂贵试剂所实现的相比，本文公开的流动池装置和/或流体学系统可以被配置为实现对试剂的更有效使用。在一些情况下，第一试剂包括比第二试剂更昂贵的试剂。在一些情况下，第一试剂包括反应特异性试剂，第二试剂包括对在中心毛细管流动池或微流体装置区域中进行的所有反应共用的非特异性试剂，并且其中反应特异性试剂比非特异性试剂更昂贵。
在一些情况下，利用本文所公开的流动池装置和/或流体学系统可以在减少昂贵试剂的消耗方面传达优势。在一些情况下，与操作例如当前的市售核酸测序系统时遇到的试剂消耗相比，例如，利用本文公开的流动池装置和/或流体学系统可导致试剂消耗减少至少5％、至少7.5％、至少10％、至少12.5％、至少15％、至少17.5％、至少20％、至少22.5％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
图31说明了简单的流体学系统的非限制性实例，其包括连接到各种流体流量控制部件的单个毛细管流动池，其中所述单个毛细管是光可进入的并且与安装在显微镜载物台或定制成像仪器中兼容，用于各种成像应用中。多个试剂储存器与单个毛细管流动池装置的入口端流体联接，其中在任何给定时间点流经毛细管的试剂均通过可编程的旋转阀进行控制，所述可编程的旋转阀允许使用者控制试剂流动的定时和持续时间。在此非限制性实例中，借助于可编程的注射泵来控制流体流量，所述可编程的注射泵提供对体积流体流量和流体流速的精确控制和定时。
图32说明了流体系统的一个非限制性实例，所述流体系统包括具有集成隔膜阀的毛细管流动池盒，以减少或最小化死体积并保存某些关键试剂。将微型隔膜阀集成到盒中允许将阀定位在毛细管入口附近，从而减少或最小化装置内的死体积，并减少昂贵试剂的消耗。将阀和其他流体控制部件集成在毛细管流动池盒内还允许将更大的流体流量控制功能结合到盒设计中。
图33说明了与显微镜装置结合使用的基于毛细管流动池盒的流体系统的非限制性实例，其中所述盒结合或配合温度控制部件，诸如与盒内的毛细管接触并用作热源/散热器的金属板。显微镜设置可以包括照射系统(例如，包括激光器、LED或卤素灯等，作为光源)、物镜、成像系统(例如CMOS或CCD照相机)和平移台，以相对于光学系统移动盒，这允许在台移动时获取毛细管流动池的不同区域的例如荧光和/或亮场图像。
温度控制模块：在一些实施方式中，所公开的系统将包括温度控制功能，以促进测定或分析结果的准确性和可重复性。可以并入仪器系统(或毛细管流动池盒)设计中的温度控制部件的示例包括但不限于电阻加热元件、红外光源、珀耳帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等等。在一些情况下，温度控制模块(或“温度控制器”)可以在执行特定的测定或分析步骤之前的指定的可调时间提供可编程的温度变化。在一些情况下，温度控制器可以在指定的时间间隔内提供可编程的温度变化。在一些实施方式中，温度控制器可以进一步提供具有指定频率和缓变率的两个或更多个设定温度之间的温度循环，从而可以执行用于扩增反应的热循环。
图34说明了通过使用与流动池盒接触放置的金属板来控制流动池(例如，毛细管流动池或基于微流体装置的流动池)的温度的一个非限制性实例。在一些情况下，金属板可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，可以使用珀耳帖或电阻加热器来控制金属板的温度。
图35说明了用于包括非接触式热控制机构的流动池(例如，毛细管流动池或微流体通道流动池)的温度控制的一种非限制性方法。在这种方法中，使用空气温度控制系统将温度控制的空气流引导通过流动池盒(例如，朝向单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)。空气温度控制系统包括热交换器，例如电阻式加热器线圈、附接到珀耳帖装置的翅片等，其能够加热和/或冷却空气并将其保持在恒定的、用户指定的温度下。空气温度控制系统还包括空气输送装置，诸如风扇，其将加热或冷却的空气流引导至毛细管流动池盒。在一些情况下，空气温度控制系统可以被设置为恒定温度T1，使得空气流以及因此流动池或盒(例如，毛细管流动池或微流体通道流动池)被保持在恒定温度T2，在一些情况下，根据环境温度、空气流速等，所述恒定温度T2可以不同于所述恒定温度T1。在一些情况下，两个或更多个此类空气温度控制系统可以安装在毛细管流动池装置或流动池盒周围，使得毛细管或盒可以通过控制空气温度控制系统中的哪一个在给定时间是活动的而在几个不同的温度之间快速循环。在另一种方法中，可以改变空气温度控制系统的温度设置，从而可以对应地改变毛细管流动池或盒的温度。
流体分配机器人：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括自动化的可编程的流体分配(或液体分配)系统，用于将试剂或其他溶液分配到例如微板、毛细管流动池装置和盒、微流体装置和盒等中。合适的自动化的可编程的流体分配系统可从许多供应商，例如Beckman Coulter、Perkin Elmer、Tecan、Velocity 11和许多其他供应商购得。在所公开的系统的优选方面，流体分配系统还包括多通道分配头，例如4通道、8通道、16通道、96通道或384通道分配头，用于同时将可编程体积的液体(例如，范围为约1微升至几毫升)输送到流动池盒或微流体盒上的多个孔或位置。
盒和/或微板处理(拾放)机器人：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括盒和/或微板处理机器人系统，用于相对于光学成像系统自动更换和定位微板、毛细管流动池盒或微流体装置盒，或者用于任选地在光学成像系统和流体分配系统之间移动微板、毛细管流动池盒或微流体装置盒。合适的自动化的可编程微板处理机器人系统可从许多供应商处购得，包括Beckman Coulter、Perkin Elmer、Tecan、Velocity11和许多其他供应商。在所公开的系统的优选方面，自动化的微板处理机器人系统被配置为将包含样品和/或试剂的微孔板的集合移入和移出例如冷藏储存单元。
光谱或成像模块：如上所述，在一些实施方式中，所公开的分析系统将包括光学成像能力，并且还可以包括其他光谱测量能力。例如，所公开的成像模块可以被配置为以本领域技术人员已知的多种成像模式中的任何一种进行操作，包括但不限于，明场、暗场、荧光、发光或磷光成像。在一些情况下，流体学子系统的一个或多个毛细管流动池或微流体装置包括窗口，其允许每个流动池或微流体装置中的一个或多个毛细管或一个或多个流体通道的至少一部分被照射并成像。
在一些实施方式中，可以执行单波长激发和发射荧光成像。在一些实施方式中，可以执行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)荧光成像。在一些情况下，成像模块被配置为获取视频图像。成像模式的选择可以影响流动池装置或盒的设计，因为所有或部分毛细管或盒在感兴趣的光谱范围内可以是光学透明的。在一些情况下，毛细管流动池盒中的多个毛细管可在单个图像内以其整体成像。在一些情况下，毛细管流动池盒内的仅单个毛细管或毛细管子集或其部分可在单个图像内成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建盒内的一个、两个、几个或全部多个毛细管的单个高分辨率图像。在一些情况下，微流体芯片内的多个流体通道可在单个图像内以其整体成像。在一些情况下，微流体芯片内的仅单个流体通道或流体通道的子集或其部分可以在单个图像内成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建盒内一个、两个、几个或全部多个流体通道的单个高分辨率图像。
光谱学或成像模块可以包括例如配备有CCD照相机的CMOS的显微镜。在一些情况下，光谱学或成像模块可以包括例如被配置为执行所关注的特定光谱学或成像技术的定制仪器，例如一种本文所述的成像模块。通常，与光谱学或成像模块关联的硬件可以包括光源、检测器和其他光学部件，以及处理器或计算机。
光源：可以使用多种光源中的任何一种来提供成像或激发光，包括但不限于钨丝灯、钨卤素灯、弧光灯、激光器、发光二极管(LED)或激光二极管。在一些情况下，一个或多个光源与其他光学部件(例如透镜、滤光器、光阑、光圈、反射镜等)的组合可被配置为照射系统(或子系统)。
检测器：各种图像传感器均可以用于成像目的，包括但不限于光电二极管阵列、电荷耦合装置(CCD)照相机或互补金属-氧化物半导体(CMOS)图像传感器。如本文所使用的，“图像传感器”可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在许多情况下，一个或多个图像传感器与其他光学部件(例如透镜、滤光器、光阑、光圈、反射镜等)的组合可被配置为成像系统(或子系统)。在一些情况下，例如，在由系统执行光谱学测量而不是成像的情况下，合适的检测器可以包括但不限于光电二极管、雪崩光电二极管和光电倍增管。
其他光学部件：光谱学测量或成像模块的硬件部件可还包括用于操控、整形、过滤或聚焦通过系统的光束的各种光学部件。合适的光学部件的示例包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、光阑、衍射光栅、有色玻璃滤波器、长通滤波器、短通滤波器、带通滤波器、窄带干涉滤波器、宽带干涉滤波器、二向色性反射器、光纤、光波导等。在一些情况下，如上文所述，光谱学测量或成像模块还可以包括一个或多个平移台或其他运动控制机构，以相对于照射和/或检测/成像子系统移动毛细管流动池装置和盒，或者反之亦然。
全内反射：在一些情况下，可以将光学模块或子系统设计为将流动池装置和盒中的毛细管或微流体通道的全部或部分的光学透明壁用作波导，以通过全内反射将激发光传输至毛细管或通道内腔。当入射的激发光以相对于表面法线的大于临界角(由毛细管或通道壁材料以及毛细管或通道内的水性缓冲液的相对折射率确定)的角度入射到毛细管或通道内腔的表面时，在表面发生全内反射，并且光沿着毛细管或通道的长度传播通过毛细管或通道壁。全内反射在内腔表面产生隐失波，该隐失波穿透管腔内部非常短的距离，并且可以用于选择性激发表面处的荧光团，例如通过固相引物延伸反应已通过聚合酶掺入到正在生长的寡核苷酸中的经标记的核苷酸。
不透光外壳和/或环境控制腔室：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括不透光的外壳，以防止杂散的环境光产生强光并遮蔽例如相对微弱的荧光信号。在一些实施方式中，所公开的系统可以包括环境控制腔室，其能够使系统在严格控制的温度、湿度水平等下运行。
处理器和计算机：在一些情况下，所公开的系统可以包括一个或多个处理器或计算机。处理器可以是硬件处理器，例如中心处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、通用处理单元或计算平台。处理器可以由各种合适的集成电路、微处理器、逻辑装置、现场可编程门阵列(FPGA)等中的任何一个组成。在一些情况下，处理器可以是单核或多核处理器，或者可以将多个处理器配置用于并行处理。尽管参考处理器描述了本公开，但是也可以应用其他类型的集成电路和逻辑装置。处理器可以具有任何合适的数据操作能力。例如，处理器可以执行512位、256位、128位、64位、32位或16位数据操作。
处理器或CPU可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置中。指令可以针对CPU，其随后可以对CPU进行编程或以其他方式配置CPU以实现例如本公开的系统控制方法。CPU执行的操作的示例可以包括获取、解码、执行和回写。
一些处理器可以包括计算机系统的处理单元。该计算机系统可以实现基于云的数据存储和/或计算。在一些情况下，计算机系统可以借助于通信接口可操作地耦合到计算机网络(“网络”)。该网络可以是互联网、内联网和/或外联网，与互联网通信的内联网和/或外联网或局域网(LAN)。在一些情况下，该网络是电信和/或数据网络。该网络可以包括一个或多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如基于云的计算。
计算机系统还可包括计算机存储器或存储器位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口(例如，网络适配器)以及外围装置(例如缓存、其他存储器单元、数据存储单元和/或电子显示适配器)。在一些情况下，通信接口可以允许计算机与一个或多个附加装置进行通信。该计算机可够从耦合的装置接收输入数据以进行分析。存储器单元、存储单元、通信接口和外围装置可以通过例如可并入主板中的通信总线(实线)与处理器或CPU进行通信。存储器或存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。存储器或存储单元可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储器或存储单元可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。
本文所述的系统控制、图像处理和/或数据分析方法可以通过存储在计算机系统的电子存储位置(例如，存储器或电子存储单元)中的机器可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器执行。在一些情况下，可以从存储单元检索代码并将其存储在存储器中，以供处理器随时访问。在一些情况下，可以去掉电子存储单元，将机器可执行指令存储在存储器中。
在一些情况下，代码可以被预编译并配置为与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用。在一些情况下，可以在运行时期间编译代码。可以以编程语言提供代码，可以选择该编程语言以使代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。
本文提供的系统和方法的一些方面可以用软件来体现。该技术的各个方面可被视为“产品”或“制品”，其通常为在一种类型的机器可读介质上携载或在该一种类型的机器可读介质中体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如可随时提供用于软件编程的非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过互联网或其他各种电信网络进行通信。这样的通信例如可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括诸如跨本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的光波、电波和电磁波。携载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用，除非限制于非暂时性、有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
在一些情况下，本公开的系统控制、图像处理和/或数据分析方法可以通过一种或多种算法来实现。可以在中心处理单元执行时通过软件来实现算法。
系统控制软件：在一些情况下，系统可以包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括代码，所述代码用于提供用户界面以及对所有系统功能的手动、半自动或全自动控制(例如，控制流体流量控制模块、温度控制模块和/或光谱学或成像模块)，以及其他数据分析和显示选项。系统计算机或处理器可以是系统的集成部件(例如，嵌入仪器中的微处理器或主板)，也可以是独立模块，例如大型计算机、个人计算机或便携式计算机。由系统控制软件提供的流体流量控制功能的示例包括但不限于体积流体流量、流体流速、样品和试剂添加的时机和持续时间、缓冲液添加和冲洗步骤。系统控制软件提供的温度控制功能的示例包括但不限于指定温度设定点以及控制温度变化的时机、持续时间和缓变速率。系统控制软件提供的光谱学测量或成像控制功能的示例包括但不限于自动聚焦能力，照射或激发光曝光时间和强度的控制，图像采集速率、曝光时间的控制以及数据存储选项。
图像处理软件：在一些情况下，系统还可以包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于提供图像处理和分析能力的代码。可由软件提供的图像处理和分析能力的示例包括但不限于手动、半自动或全自动图像曝光调整(例如，白平衡、对比度调整、信号平均和其他降噪能力等)、自动边缘检测和对象鉴定(例如，用于鉴定毛细管流动池装置内腔表面上经荧光标记的寡核苷酸的克隆扩增簇)、自动化统计分析(例如，用于确定每单位面积的毛细管内腔表面鉴定的寡核苷酸的克隆扩增簇的数量，或用于核酸测序应用中的自动核苷酸碱基判定)以及手动测量能力(例如，用于测量簇或其他对象之间的距离等)。任选地，仪器控制和图像处理/分析软件可以编写为单独的软件模块。在一些实施方式中，仪器控制和图像处理/分析软件可以被结合到集成包中。
本领域技术人员已知的多种图像处理方法中的任何一种都可以用于图像处理/预处理。示例包括但不限于Canny边缘检测方法、Canny-Deriche边缘检测方法、一阶梯度边缘检测方法(例如，Sobel运算子)、二阶差分边缘检测方法、相位一致性(相位相干性)边缘检测方法、其他图像分割算法(例如，强度阈值化、强度聚类方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如用于检测任何形状的广义霍夫变换、圆形霍夫变换，等)和数学分析算法(例如傅里叶变换、快速傅里叶变换、小波分析、自相关法等)或其任何组合。
核酸测序系统和应用：核酸测序提供了所公开的流动池装置(例如，毛细管流动池装置或盒以及微流体装置和盒)和成像系统的应用的一个非限制性实例。许多“第二代”和“第三代”测序技术利用大规模并行的循环阵列方法来进行核苷酸掺入测序，其中拴系到固体载体的单链模板寡核苷酸序列的准确解码依赖于通过互补核苷酸链的聚合酶对由逐步添加A、G、C和T核苷酸产生的信号进行分类。这些方法通常需要用固定长度的已知衔接子序列修饰寡核苷酸模板，通过与和衔接子序列互补的已知序列的表面拴系捕获探针(本文也称为拴系到流动池内表面的“衔接子”或“引物”)杂交来以随机或图案化阵列固定到固体载体(例如，所公开的毛细管流动池装置或微流体芯片的一个或多个管腔表面)，并且然后通过使用例如荧光标记的核苷酸来鉴定模板寡核苷酸中的碱基序列的单碱基加成引物延伸反应的循环系列进行探测。因此，这些过程需要使用小型化流体系统，所述系统对试剂引入到进行测序反应的流动池的时间提供精确、可重复的控制，并且需要小体积以减少或最小化昂贵试剂的消耗。
现有的可商购获得的NGS流动池由经过蚀刻、研磨和/或通过其他方法处理的玻璃层构成，以满足成像、冷却和/或其他要求所需的严格尺寸公差。当流动池被用作耗材时，其制造所需的昂贵制造工艺导致每次测序运行的成本太高，无法使研究和临床领域的科学家和医学专业人员常规地获得测序。
本公开提供了低成本流动池架构的实例，其包括低成本的玻璃或聚合物毛细管或微流体通道、流体适配器和盒底座。利用以其最终横截面几何形状挤出的玻璃或聚合物毛细管可以消除对多种高精度和昂贵的玻璃制造工艺的需要。稳健地约束毛细管或微流体通道的取向并使用模制塑料和/或弹性体部件提供方便的流体连接进一步降低了成本。激光结合聚合物盒底座的部件提供了毛细管或微流体通道的快速而有效的密封，并在结构上稳定毛细管或通道和流动池盒，而不需要使用紧固件或粘合剂。
所公开的装置和系统可以被配置为使用各种“核苷酸掺入测序”“核苷酸结合测序”、“核苷酸碱基配对测序”和“亲合力测序”测序生物化学中的任一种来进行核酸测序。本文公开的流动池装置设计的改善(例如，包括亲水性涂覆表面，所述亲水性涂覆表面使例如布置在其上的经荧光标记核酸簇的前景信号最大化，同时使背景信号最小化)与通过改善的物镜和/或镜筒透镜设计(提供更大的景深和更大的视场)实现的用于快速双表面流动池成像(包括对流动池内表面的同时或近乎同时成像)的光学成像系统设计的改善相结合，可以引起改善用于碱基判定目的的图像的CNR，并且减少试剂消耗(通过改善的流动池设计实现)可以引起显著提高碱基判定准确性、缩短成像循环时间、缩短总体测序反应循环时间以及在对于每个碱基降低的成本下提高通量核酸测序。
本文公开的系统可以被配置为使用各种不同的测序化学来实现各种不同测序方法中的任一种。例如，图40提供了用于实现亲合力测序方法的流程图的非限制性实例。核苷酸缀合物可以用于与栓系到载体表面(例如，流动池的一个或多个内表面)的多个引发的靶核酸序列形成多价结合复合物，使得多价结合复合物表现出比单个核苷酸与单个引发的靶核酸序列之间的结合相互作用所提供的持续时间显著更长的持续时间。通常，这种亲合力测序方法将包括以下步骤中的一个或多个：将靶核酸序列与栓系到载体表面的衔接子/引物序列杂交；克隆扩增以在载体表面上产生扩增的靶序列簇；使载体表面与核苷酸缀合物接触以产生稳定的多价结合复合物，所述核苷酸缀合物包含与聚合物核心缀合的多个核苷酸部分，其中所述核苷酸缀合物还可以包含一个或多个可检测标记，例如荧光团；洗去任何过量的、未结合的核苷酸缀合物；例如通过对载体表面进行荧光成像来检测多价结合复合物；鉴定靶核酸序列中的核苷酸(碱基判定)；例如通过改变缓冲液的离子强度、离子组成和/或pH来使多价结合复合物去稳定；冲洗流动池；以及进行引物延伸反应以添加包含所鉴定核苷酸的互补碱基的核苷酸。可以重复所述循环以鉴定序列中的额外核苷酸碱基，然后处理和组装序列数据。在一些情况下，数据处理可以包括在进行测序运行时实时地或作为运行数据处理步骤后的一部分来计算测序性能指标，诸如Q得分。
在一些情况下，与本文公开的光学成像系统组合使用的所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置可以为核酸测序系统带来以下一项或多项额外优势：(i)减少了流体洗涤时间(由于减少了非特异性结合，因此测序循环时间更快)，(ii)减少成像时间(因此测定读出和测序循环的周转时间更快)，(iii)减少了总体工作流程时间要求(由于减少了循环时间)，(iv)降低了检测仪器成本(由于CNR的改善)，(v)提高了读出(碱基判定)的准确性(由于CNR的改善)，(vi)提高了试剂的稳定性并降低了试剂的使用要求(从而降低了试剂成本)，以及(vii)由于核酸扩增失败而导致的运行失败更少。
本文公开的用于进行核酸测序的方法、装置和系统适用于各种测序应用以及对来源于各种样品和来源中的任一种的核酸分子进行测序。在一些情况下，核酸可以从各种生物样品中的任一种中提取，例如血液样品、唾液样品、尿液样品、细胞样品、组织样品等。例如，所公开的装置和系统可以用于分析来源于本领域技术人员已知的各种不同细胞、组织或样品类型中的任一种的核酸分子。例如，核酸可以从来源于真核生物(诸如动物、植物、真菌、原生生物)、古细菌或真细菌的细胞或包含一种或多种类型的细胞的组织样品中提取。在一些情况下，核酸可以从原核或真核细胞，诸如贴壁或非贴壁真核细胞中提取。核酸从例如原代或永生啮齿动物、猪、猫、犬、牛、马、灵长类动物或人类细胞系中以各种方式提取。核酸可以从各种不同的细胞、器官或组织类型(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子，或来自心脏、肺、脑、肝、肾、脾、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠或小肠的细胞)中的任一种中提取。核酸可以从正常细胞或健康细胞中提取。可替代地或组合地，酸从患病细胞，诸如癌细胞，或从感染宿主的病原细胞中提取。一些核酸可以从细胞类型的不同子集中提取，例如免疫细胞(诸如T细胞、细胞毒性(杀伤)T细胞、辅助T细胞、αβT细胞、γδT细胞、T细胞祖细胞、B细胞、B细胞祖细胞、淋巴干细胞、髓样祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、浆细胞、记忆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞，或其任何组合)、未分化的人类干细胞、已被诱导分化的人类干细胞、稀有细胞(例如，循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞或滋养层细胞)。考虑其他细胞并且与本文的公开一致。
核酸可以任选地例如通过与核酸的5’或3’端的共价或非共价键来附接到一个或多个非核苷酸部分，诸如标记和其他小分子、大分子(注入蛋白质、脂质、糖等)以及固体或半固体载体。标记包括使用本领域技术人员已知的各种检测方法中的任一种都可检测，从而使所附接的寡核苷酸或核酸类似地可检测的任何部分。一些标记，例如荧光团，发射光学可检测或可见的电磁辐射。可替代地或组合地，一些标记包括使标记的寡核苷酸或核酸在质谱数据中可见的质量标签，或使标记的寡聚核苷酸或核酸可通过电流法或伏安法检测的氧化还原标签。一些标记包括有助于分离和/或纯化标记的寡核苷酸或核酸的磁性标签。核苷酸或多核苷酸通常不附接到标记上，并且直接检测寡核苷酸或核酸的存在。
被配置用于测序的流动池装置：在一些情况下，根据本公开的一个或多个流动池装置可以被配置用于核酸测序应用，例如，其中两个或更多个流动池装置内表面包括亲水性聚合物涂层，其还包含一种或多种捕获寡核苷酸，例如本文公开的衔接子/引物寡核苷酸或任何其他寡核苷酸。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可以包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对真核生物基因组测序。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可以包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对原核生物基因组或其部分测序。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对病毒基因组或其部分测序。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于对转录组测序。
在一些情况下，本公开的流动池装置可包括以大体上面向流动通道的内部的取向的第一表面、以大体上面向流动通道的内部并且还大体上面向或平行于第一表面的取向的第二表面、大体上面向第二流动通道的内部的第三表面和大体上面向第二流动通道的内部并且与第三表面相对或平行的第四表面；其中所述第二表面和第三表面可以位于大体上平坦的基底(其可以是反射、透明或半透明基底)的相对侧或附接到其上。在一些情况下，流动池内的一个或多个成像表面可以位于流动池的中心内，或者位于流动池的两个子单元或子分区之间的分区内或作为其一部分，其中，所述流动池可以包括顶表面和底表面，其中的一个或两者对于可以使用的此类检测模式可以是透明的；并且其中可以将包含拴系到一个或多个聚合物涂层的寡核苷酸衔接子/引物的表面放置或插入流动池的内腔内。在一些情况下，顶表面和/或底表面不包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。在一些情况下，顶表面和/或底表面确实包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。在一些情况下，所述顶表面或所述底表面可包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。放置或插入流动池内腔内的一个或多个表面可以位于或附接到大体上平坦的基底(其可以是反射、透明或半透明基底)的一侧、相对侧或两侧。
通常，流动池装置表面上的一层或多层低非特异性结合涂层中的至少一层可以包含用于共价或非共价附接寡核苷酸分子，例如衔接子或引物序列的官能团，或至少一层在其沉积在载体表面上时可以已经包含共价或非共价附接的寡核苷酸衔接子或引物序列。在一些情况下，拴系到至少一个第三层的聚合物分子的寡核苷酸可以在整个层中以多个深度分布。
在一些情况下，例如在将聚合物偶联或沉积在表面上之前，将寡核苷酸衔接子或引物分子与聚合物在溶液中共价偶联。在一些情况下，在已经将聚合物偶联或沉积在表面上之后，将寡核苷酸衔接子或引物分子共价偶联至聚合物。在一些情况下，至少一个亲水性聚合物层包含多个共价附接的寡核苷酸衔接子或引物分子。在一些情况下，至少两层、至少三层、至少四层或至少五层亲水性聚合物包含多个共价连附的衔接子或引物分子。
在一些情况下，可以使用本领域技术人员已知的各种合适的缀合化学法中的任一种将寡核苷酸衔接子或引物分子偶联至一层或多层亲水性聚合物。例如，寡核苷酸衔接子或引物序列可包含与胺基、羧基、硫醇基等反应的部分。可以使用的合适的胺反应性缀合化学法的实例包括但不限于涉及异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰基叠氮化物基团、NHS酯基、磺酰氯基、醛基、乙二醛基、环氧化物基团、环氧乙烷基、碳酸酯基、芳基卤化物基团、酰亚胺酯基、碳二亚胺基、酸酐基和氟苯基酯基的反应。合适的羧基反应性缀合化学法的实例包括但不限于涉及碳二亚胺化合物，例如水溶性EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·HCL)的反应。合适的巯基反应性缀合化学法的实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。
可以将一种或多种类型的寡核苷酸分子附接或拴系在载体表面上。在一些情况下，一种或多种类型的寡核苷酸衔接子或引物可包含间隔子序列、用于与衔接子连接的模板文库核酸序列杂交的衔接子序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物和/或分子条形码化序列或其任何组合。在一些情况下，可以将1个引物或衔接子序列栓系至表面的至少一层。在一些情况下，可以将至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个不同的引物或衔接子序列拴系在表面的至少一层上。
在一些情况下，栓系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度范围可以为约10个核苷酸至约100个核苷酸。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个核苷酸长。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列可以是至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20个或至多10个核苷酸长。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，栓系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以在约20个核苷酸至约80个核苷酸的范围内。本领域技术人员将认识到栓系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以具有此范围内的任何值，例如约24个核苷酸。
在一些情况下，选择涂层的数量和/或每层的材料组成，以便调节在经涂覆的流动池内表面上的寡核苷酸衔接子/引物(或其他附接的分子)的所得表面密度。在一些情况下，寡核苷酸衔接子/引物的表面密度可以在约1,000个引物分子/μm2至约1,000,000个引物分子/μm2的范围内。在一些情况下，寡核苷酸衔接子/引物的表面密度可以是至少1,000、至少10,000、至少100,000或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，寡核苷酸衔接子/引物的表面密度可以是至多1,000,000、至多100,000、至多10,000或至多1,000个分子/μm2。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，引物的表面密度可以在约10,000个分子/μm2至约100,000个分子/μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，引物分子的表面密度可以具有在此范围内的任何值，例如，约455,000个分子/μm2。在一些情况下，毛细管或通道内腔涂层的表面特性，包括栓系寡核苷酸引物的表面密度，可以被调节以改善或优化例如固相核酸杂交特异性和效率和/或固相核酸扩增率、特异性和效率。
在一些情况下，栓系的衔接子或引物序列可以包含设计用于促进如在低结合性载体上进行的核酸扩增的特异性和效率的修饰。例如，在一些情况下，引物可包含聚合酶终止点，使得在表面缀合点和修饰位点之间的引物序列的链段始终为单链形式，并充当一些依赖解旋酶的等温扩增方法中的5’至3’解旋酶的加载位点。可以用于产生聚合酶终止点的引物修饰的其他实例包括但不限于将PEG链朝向5’端插入引物主链的两个核苷酸之间、插入无碱基核苷酸(例如，既没有嘌呤也没有嘧啶碱基的核苷酸)或可以被解旋酶绕过的病变部位。
核酸杂交：在一些情况下，当单独使用或与改善的缓冲液制剂组合使用以进行固相核酸杂交和/或固相核酸扩增反应作为基因分型或核酸测序应用的一部分时，本文公开的亲水性、聚合物涂覆的流动池装置表面可以提供优点。在一些情况下，本文公开的聚合物涂覆的流动池装置可以提供通过本公开的以下额外方面中的一个或多个可以实现的改善的核酸杂交速率和特异性以及改善的核酸扩增速率和特异性方面的优点：(i)引物设计(例如，序列和/或修饰)，(ii)固体载体上栓系引物密度的控制，(iii)固体载体的表面组成，(iv)固体载体的表面聚合物密度，(v)扩增之前和扩增期间使用改善的杂交条件，和/或(vi)使用减少非特异性引物扩增或增加模板扩增效率的改善的扩增制剂。
在一些情况下，可希望改变经涂覆的流动池表面上拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度和/或拴系的衔接子或引物远离经涂覆的流动池表面的间距(例如，通过改变用于将衔接子或引物拴系到表面的接头分子的长度)，从而在例如使用给定的扩增方法时“调整”载体以获得最佳性能。在一些情况下，调节拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度可以根据所选的扩增方法而变化的方式影响在表面上观察到的特异性和/或非特异性扩增水平。在一些情况下，可以通过调节用于产生载体表面的分子组分的比例来改变拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度。例如，在使用寡核苷酸引物-PEG缀合物产生低结合性载体的最终层的情况下，可以改变寡核苷酸引物-PEG缀合物与非缀合的PEG分子的比例。然后可以使用本领域技术人员已知的各种技术中的任何一种来估计或测量所栓系的引物分子的表面密度。实例包括但不限于使用放射性同位素标记和计数方法；可裂解分子的共价偶联，所述可裂解分子包括可以从限定区域的载体表面裂解的光学可检测标签(例如，荧光标签)，将其收集在固定体积的适当溶剂中，然后通过将荧光信号与已知光学标签浓度的校准溶液的荧光信号进行比较或使用荧光成像技术来量化(条件是已注意标记反应条件和图像采集设置以确保荧光信号与表面上的荧光团数量线性相关)(例如，表面上的荧光团没有明显的自淬灭)。
在一些情况下，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用可以产生是常规杂交方案约2x至约20x快的相对杂交速率。在一些情况下，相对杂交速率可以是常规杂交方案的至少2x、至少3x、至少4x、至少5x、至少6x、至少7x、至少8x、至少9x、至少10x、至少12x、至少14x、至少16x、至少18x、至少20x、至少25x、至少30x或至少40x。
在一些情况下，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用对于任何这些完成指标可以产生不到60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟的总杂交反应时间(例如，杂交反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。
在一些情况下，与常规杂交方案相比，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用可以产生改善的杂交特异性。在一些情况下，可以实现的杂交特异性优于10个杂交事件中有1个碱基错配、20个杂交事件中有1个碱基错配、30个杂交事件中有1个碱基错配、40个杂交事件中有1个碱基错配、50个杂交事件中有1个碱基错配、75个杂交事件中有1个碱基错配、100个杂交事件中有1个碱基错配、200个杂交事件中有1个碱基错配、300个杂交事件中有1个碱基错配、400个杂交事件中有1个碱基错配、500个杂交事件中有1个碱基错配、600个杂交事件中有1个碱基错配、700个杂交事件中有1个碱基错配、800个杂交事件中有1个碱基错配、900个杂交事件中有1个碱基错配、1,000个杂交事件中有1个碱基错配、2,000个杂交事件中有1个碱基错配、3,000个杂交事件中有1个碱基错配、4,000个杂交事件中有1个碱基错配、5,000个杂交事件中有1个碱基错配、6,000个杂交事件中有1个碱基错配、7,000个杂交事件中有1个碱基错配、8,000个杂交事件中有1个碱基错配、9,000个杂交事件中有1个碱基错配或10,000个杂交事件中有1个碱基错配。
在一些情况下，与常规杂交方案相比，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用可以产生改善的杂交效率(例如，载体表面上与靶寡核苷酸序列成功杂交的可用寡核苷酸引物的分数)。在一些情况下，对于下文指定的任何输入靶寡核苷酸浓度和上文指定的任何杂交反应时间，可实现的杂交效率优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些情况下，例如，其中杂交效率低于100％，与载体表面杂交的靶核酸序列的所得表面密度可以小于表面上寡核苷酸衔接子或引物序列的表面密度。
在一些情况下，将所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置用于使用常规杂交(或扩增)方案或改善或优化的杂交(或扩增)方案进行的核酸杂交(或扩增)应用可以导致对与载体表面接触的靶(或样品)核酸分子的输入浓度的要求降低。例如，在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以范围为约10pM至约1μM的浓度与载体表面接触(例如，在退火或扩增之前)。在一些情况下，可以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至少10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM、至少50pM、至少100pM、至少200pM、至少300pM、至少400pM、至少500pM、至少600pM、至少700pM、至少800pM、至少900pM、至少1nM、至少10nM、至少20nM、至少30nM、至少40nM、至少50nM、至少60nM、至少70nM、至少80nM、至少90nM、至少100nM、至少200nM、至少300nM、至少400nM、至少500nM、至少600nM、至少700nM、至少800nM、至少900nM或至少1μM。在一些情况下，可以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至多1μM、至多900nM、至多800nm、至多700nM、至多600nM、至多500nM、至多400nM、至多300nM、至多200nM、至多100nM、至多90nM、至多80nM、至多70nM、至多60nM、至多50nM、至多40nM、至多30nM、至多20nM、至多10nM、至多1nM、至多900pM、至多800pM、至多700pM、至多600pM、至多500pM、至多400pM、至多300pM、至多200pM、至多100pM、至多90pM、至多80pM、至多70pM、至多60pM、至多50pM、至多40pM、至多30pM、至多20pM或至多10pM。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，可以以约90pM至约200nM的浓度范围施用靶(或样品)核酸分子。本领域技术人员将认识到，可以以具有此范围内的任何值例如约855nM的浓度来施用靶(或样品)核酸分子。
在一些情况下，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用可以导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(例如，在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的范围为约0.0001个靶寡核苷酸分子/μm2至约1,000,000个靶寡核苷酸分子/μm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至少0.0001、至少0.0005、至少0.001、至少0.005、至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.5、至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少5,500、至少6,000、至少6,500、至少7,000、至少7,500、至少8,000、至少8,500、至少9,000、至少9,500、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,500、至多9,000、至多8,500、至多8,000、至多7,500、至多7,000、至多6,500、至多6,000、至多5,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3,500、至多3,000、至多2,500、至多2,000、至多1,500、至多1,000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200、至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10、至多5、至多1、至多0.5、至多0.1、至多0.05、至多0.01、至多0.005、至多0.001、至多0.0005或至多0.0001个分子/μm2。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以在约3,000个分子/μm2至约20,000个分子/μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以具有在此范围内的任何值，例如约2,700个分子/μm2。
换句话说，在一些情况下，所公开的低结合性载体单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用可以导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(例如，在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的范围为约100个杂交靶寡核苷酸分子/mm2至约1x 1012个杂交靶寡核苷酸分子/mm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1x 107、至少5x 107、至少1x 108、至少5x 108、至少1x 109、至少5x 109、至少1x 1010、至少5x 1010、至少1x 1011、至少5x 1011、或至少1x 1012个分子/mm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至多1x1012、至多5x 1011、至多1x 1011、至多5x1010、至多1x 1010、至多5x 109、至多1x 109、至多5x108、至多1x 108、至多5x 107、至多1x 107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以在约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以具有在此范围内的任何值，例如约50,700个分子/mm2。
在一些情况下，与附接至低结合性载体表面的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度范围可以为约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少0.6kb、至少0.7kb、至少0.8kb、至少0.9kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb或至少40kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如长度为至少0.85kb。
在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子(例如，多联体)，所述多聚体核酸分子还包含规则出现的单体单元的重复。在一些情况下，单链或双链多聚体核酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb、至少30kb或至少40kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如，长度为约2.45kb。
在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子(例如，多联体)，所述多聚体核酸分子包含约2至约100个拷贝的规则重复的单体单元。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以为至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、和至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有此范围内的任何值，例如约17。因此，在一些情况下，即使杂交效率小于100％，就每单位面积的载体表面上的靶序列的拷贝数而言，杂交的靶序列的表面密度也可超过寡核苷酸引物的表面密度。
核酸表面扩增(NASA)：如本文所用，短语“核酸表面扩增”(NASA)可与短语“固相核酸扩增”(或简称为“固相扩增”)互换使用。在本公开的一些方面，描述了核酸扩增制剂，其与所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置组合，提供了改善的扩增速率、扩增特异性和扩增效率。如本文所用，特异性扩增是指已经共价或非共价拴系在固体载体上的模板文库寡核苷酸链的扩增。如本文所用，非特异性扩增是指引物二聚体或其他非模板核酸的扩增。如本文所用，扩增效率是在给定的扩增循环或扩增反应期间成功扩增的载体表面上的栓系寡核苷酸的百分比的量度。在本文公开的表面上进行的核酸扩增可以获得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％(例如98％或99％)的扩增效率。
各种热循环或等温核酸扩增方案中的任一种均可以与所公开的低结合性载体一起使用。可以与所公开的低非结合性载体一起使用的核酸扩增方法的实例包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、桥式扩增、等温桥式扩增、滚环扩增、环到环扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增或单链结合(SSB)蛋白依赖性扩增。
在一些情况下，单独使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置或与扩增反应组分的制剂组合使用可以实现扩增速率、扩增特异性和扩增效率的改善。除了包含核苷酸、一种或多种聚合酶、解旋酶、单链结合蛋白等(或其任何组合)之外，还可以通过各种方式调节扩增反应混合物以实现改善的性能，包括但不限于缓冲液类型、缓冲液pH值、有机溶剂混合物、缓冲液粘度、去污剂和两性离子组分、离子强度(包括一价和二价离子浓度的调节)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、BSA、聚乙二醇、硫酸葡聚糖、甜菜碱、其他添加剂等的选择。
与使用常规载体和扩增方案获得的那些扩增速率相比，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以产生增加的扩增速率。在一些情况下，对于上述任何一种扩增方法，可以达到的相对扩增速率可以是使用常规的载体和扩增方案的至少2x、至少3x、至少4x、至少5x、至少6x、至少7x、至少8x、至少9x、至少10x、至少12x、至少14x、至少16x、至少18x或至少20x。
在一些情况下，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用对于任何这些完成指标可以产生不到180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、1分钟、50秒、40秒、30秒、20秒或10秒的扩增反应时间(例如，扩增反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。
在一些情况下，所公开的低非结合性载体单独使用或与改善或优化的扩增缓冲液制剂组合使用可以实现不超过60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟的更快的扩增反应时间(例如，扩增反应完成90％、95％、98％或99％所需的时间)。类似地，所公开的低结合性载体单独使用或与改善或优化的缓冲液制剂组合使用在一些情况下可以使得能够在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或不超过30个循环中完成扩增反应。
在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案获得的相比，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以产生增加的特异性扩增和/或减少的非特异性扩增。在一些情况下，可以实现的特异性扩增与非特异性扩增的所得比率为至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1或1,000:1。
在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案获得的相比，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以产生增加的扩增效率。在一些情况下，在以上指定的任何扩增反应时间中，可以实现的扩增效率优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
在一些情况下，与附接至经亲水性聚合物涂覆的流动池装置表面的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度范围可以为约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，经克隆扩增的靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如，长度为至少0.85kb。
在一些情况下，经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸分子(例如，多联体)，所述多聚体核酸分子还包含规则出现的单体单元的重复。在一些情况下，经克隆扩增的单链或双链多聚体核酸分子的长度可以为至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或跨本文所述范围内的任何中间值，例如长度为约2.45kb。
在一些情况下，经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包括单链或双链多聚体核酸(例如，多联体)分子，所述多聚体核酸分子包含约2至约100个拷贝的规则重复的单体单元。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以为至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、和至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有此范围内的任何值，例如约12。因此，在一些情况下，就每单位面积的载体表面上的靶序列的拷贝数而言，即使杂交和/或扩增效率低于100％，经克隆扩增的靶序列的表面密度也可以超过寡核苷酸引物的表面密度。
在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案获得的相比，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以产生增加的克隆拷贝数。在一些情况下，例如其中经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子包含单体靶序列的串联的多聚体重复序列，克隆拷贝数可以比使用常规载体和扩增方案获得的克隆拷贝数少得多。因此，在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的集落约1个分子至约100,000个分子(例如，靶序列分子)。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的集落至少1、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000或至少100,000个分子。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的集落至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,000、至多8,000、至多7,000、至多6,000、至多5,000、至多4,000、至多3,000、至多2,000、至多1,000、至多500、至多100、至多50、至多10、至多5或至多1个分子。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，克隆拷贝数可以在约2,000个分子至约9,000个分子的范围内。本领域技术人员将认识到，克隆拷贝数可以具有此范围内的任何值，例如在一些情况下为约2,220个分子，或在其他情况下为约2个分子。
如上所指出的，在一些情况下，经扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包含单体靶序列的串联的多聚体重复序列。在一些情况下，经扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包含多个分子，每个分子均包含单个单体靶序列。因此，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以导致靶序列拷贝的表面密度范围为约100个靶序列拷贝/mm2至约1x 1012个靶序列拷贝/mm2。在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1x107、至少5x 107、至少1x 108、至少5x 108、至少1x 109、至少5x 109、至少1x 1010、至少5x1010、至少1x 1011、至少5x 1011、或至少1x 1012个经克隆扩增的靶序列分子/mm2。在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以是至多1x 1012、至多5x 1011、至多1x 1011、至多5x 1010、至多1x 1010、至多5x 109、至多1x 109、至多5x 108、至多1x 108、至多5x 107、至多1x 107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个靶序列拷贝/mm2。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以在约1,000个靶序列拷贝/mm2至约65,000个靶序列拷贝/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，靶序列拷贝的表面密度可以具有此范围内的任何值，例如，为约49,600个靶序列拷贝/mm2。
在一些情况下，所公开的低结合性载体单独使用或与改善或优化的扩增缓冲液制剂组合使用可以导致经克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度范围为约100个分子/mm2至约1x 1012个集落/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1x 107、至少5x 107、至少1x 108、至少5x108、至少1x 109、至少5x 109、至少1x 1010、至少5x 1010、至少1x 1011、至少5x 1011、或至少1x 1012个分子/mm2。在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以是至多1x 1012、至多5x 1011、至多1x1011、至多5x 1010、至多1x 1010、至多5x 109、至多1x 109、至多5x 108、至多1x 108、至多5x107、至多1x 107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，经克隆扩增的分子的表面密度可以在约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，经克隆扩增的集落的表面密度可以具有在此范围内的任何值，例如，为约48,800个分子/mm2。
在一些情况下，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以产生来自经扩增和经标记的核酸群体的信号(例如，荧光信号)，其方差系数不大于50％，诸如50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或小于5％。
类似地，在一些情况下，所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置单独使用或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用可以产生来自经扩增和非标记的核酸群体的信号，其方差系数不大于50％，诸如50％、40％、30％、20％、10％、5％或小于5％。
经亲水性聚合物涂覆的流动池装置表面的荧光成像：所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置(包括例如布置在其上的经标记靶核酸分子的克隆簇)可用于各种核酸分析应用中的任何一种，例如核酸碱基鉴别、核酸碱基分类、核酸碱基判定、核酸检测应用、核酸测序应用以及基于核酸的(遗传和基因组)诊断应用。在许多这些应用中，荧光成像技术可用于监测在低结合性载体上进行的杂交、扩增和/或测序反应。荧光成像可以使用本文公开的任何光学成像模块以及各种荧光团、荧光成像技术和本领域技术人员已知的其他荧光成像仪器进行。
在一些情况下，使用荧光成像技术可以评估使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置和反应缓冲液制剂进行的核酸杂交和/或扩增反应，其中图像的对比度噪声比(CNR)提供了评估载体上的扩增特异性和非特异性结合的关键量度。CNR通常被定义为：CNR＝(信号-背景)/噪声。背景项通常被认为是在指定的感兴趣区域(ROI)中针对围绕特定特征(衍射受限光斑，DLS)的间隙区测量的信号。如上所指出的，虽然信噪比(SNR)通常被认为是整体信号质量的基准，但可以表明，改善的CNR相对于SNR作为要求快速图像捕获的应用(例如，可以将循环次数减少或最小化的测序应用)中信号质量的基准，可以提供明显的优势。在高CNR下，即使CNR有适度的改善，也可以大幅减少达到准确的信号辨别(并且因此在测序应用的情况下达到准确的碱基判定)所需的成像时间。
在大多数基于集合的测序方法中，背景项通常被测量为与‘间隙’区相关的信号。除了“间隙”背景(Binter)之外，“细胞内”背景(Bintra)存在于经扩增的DNA集落所占据的离散区域内。这两个背景信号项的组合决定了图像中可实现的CNR，随后直接影响光学仪器要求、架构成本、试剂成本、运行时间、成本/基因组，并最终影响基于循环阵列的测序应用的准确性和数据质量。Binter背景信号由多种来源引起；一些实例包括来自消耗性流动池的自发荧光、检测分子的非特异性吸附(其产生可掩盖来自ROI的前景信号的虚假荧光信号)、以及非特异性DNA扩增产物的存在(例如，由引物二聚体产生的那些)。在典型的下一代测序(NGS)应用中，当前视场(FOV)中的背景信号会随时间进行平均并减去。来自单个DNA集落的信号(例如，FOV中的(S)-Binter)产生可以被分类的可识别的特征。在一些情况下，细胞内背景(Bintra)可产生混杂的荧光信号，所述信号并非特异于感兴趣的靶标，但存在于相同的ROI中，因此更难以平均和减去。
在本公开的经亲水性聚合物涂覆的基底表面上实施核酸扩增可以通过减少非特异性结合来降低Binter背景信号，可以改善特异性核酸扩增，并且可以导致非特异性扩增减少，非特异性扩增会影响来自间隙区和细胞内区域的背景信号。在一些情况下，与使用常规载体和杂交、扩增和/或测序方案所获得的那些相比，所公开的低非特异性结合载体表面任选地与改善的杂交和/或扩增反应制剂组合使用，可以导致CNR提高到2、5、10、100、200、500或1000倍。尽管这里在使用荧光成像作为读出或检测模式的背景下进行了描述，但相同的原理也适用于将所公开的低非特异性结合载体和核酸杂交和扩增制剂用于其他检测模式，包括光学和非光学检测模式。
替代性测序生物化学：除了以上所述的核苷酸掺入测序方法之外，所公开的流动池装置和光学成像系统也与其他新兴的核酸测序生物化学兼容。实例包括美国专利号10,655,176B2中描述的“核苷酸结合测序”方法，和美国专利号10,768,173B2中描述的“亲合力测序”方法。
在一些实施方案中，当前正在由Omniome公司(San Diego，CA)开发的“核苷酸结合测序”方法是基于在防止同源核苷酸共价掺入到引物中的条件下进行检测在沿着模板的每个位置形成的稳定复合物(例如，对于所述位置包含引发的模板(栓系到样品载体结构)、聚合酶和同源核苷酸的三元复合物)的重复循环，然后延伸引物以允许对沿着模板的下一个位置进行检测。在结合测序方法中，在引物延伸到下一个位置之前，对模板每个位置处的核苷酸进行检测。通常，所述方法用于通过唯一地标记每种类型的三元复合物(例如，其所含核苷酸类型不同的不同类型的三元复合物)或通过单独递送试剂以形成每种类型的三元复合物来区分沿着核酸模板的位置可以存在于的四种不同核苷酸类型。在一些情况下，标记可以包括对例如参与三元复合物的同源核苷酸或聚合酶进行荧光标记。因此，所述方法与所公开的流动池装置和成像系统兼容。
在一些实施方案中，当前由Element Biosciences公司(圣地亚哥，加利福尼亚州)正在开发的“亲合力测序”方法依赖于由形成包含多个单独的非共价结合相互作用的复合物而产生的增加的亲合力(或“功能亲和力”)。在一些实施方案中，亲合力测序包括检测在荧光标记的核苷酸缀合物、聚合酶和栓系到样品载体结构的多个引发的靶核酸分子之间形成的多价结合复合物，这允许检测/碱基判定步骤与核苷酸掺入步骤分开。在一些实施方案中，荧光成像用于检测结合的复合物，并且因此确定靶核酸序列中N+1核苷酸的身份(其中引物延伸链的长度为N个核苷酸)。在一些实施方案中，在成像步骤后，多价结合复合物被破坏并洗去，正确的封闭核苷酸被掺入到引物延伸链中，并且重复所述循环。
在一些情况下，本公开的核苷酸缀合物可以包含例如通过核苷酸的5’端，直接或经由接头缀合到聚合物核心的多个核苷酸部分或核苷酸类似物部分。通过非限制性实例，核苷酸部分可以包括核糖核苷酸部分、核糖核苷酸类似物部分、脱氧核糖核苷酸部分、脱氧核糖核苷酸类似物部分或其任何组合。在一些情况下，核苷酸或核苷酸类似物可以包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、腺苷、鸟苷、5-甲基-尿苷和/或胞苷。在一些情况下，核苷酸或核苷酸类似物部分可以包括在聚合酶反应或测序反应期间被修饰以抑制延伸的核苷酸，诸如其中至少一个核苷酸或核苷酸类似物是缺乏3’羟基基团的核苷酸；已被修饰为在3’位置处包含封闭基团的核苷酸；和/或用3’-0-叠氮基基团、3’-0-叠氮甲基基团、3’-0-烷基羟基氨基基团、3’-硫代磷酸酯基团、3’-0-丙二酰基基团或3’-0-苄基基团修饰的核苷酸。
在一些情况下，聚合物核心可以包括线性或支化聚合物，例如线性或支化聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚甘氨酸、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、蛋白质或其他此类聚合物，或掺入前述任意两种或更多种或掺入本领域已知的其他聚合物的共聚物。在一些情况下，聚合物是PEG。在一些情况下，聚合物是支化PEG。在一些情况下，支化聚合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个分支或臂，或2、4、8、16、32、64或更多个分支或臂。在一些情况下，分支或臂可以从中心部分辐射。
在一些情况下，核苷酸缀合物还可以包含一个或多个可检测标记，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或超过二十个可检测标记。在一些情况下，所述一个或多个可检测标记可以包括一个或多个荧光团(例如，花青染料3(Cy3)、花青染料5(Cy5)等)、一个或多个量子点、荧光共振能量转移(FRET)供体和/或FRET受体。
在一些情况下，核苷酸缀合物还可以包含附接至聚合物核心的每个分支或分支的子集的结合部分。合适的结合部分的实例包括但不限于生物素、亲和素、链霉亲和素等、聚组氨酸结构域、互补配对的核酸结构域、G-四联体形成核酸结构域、钙调蛋白、麦芽糖结合蛋白、纤维素酶、麦芽糖、蔗糖、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽、0-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、苄基鸟嘌呤及其衍生物、苄基半胱氨酸及其衍生物、抗体、表位、蛋白A、或蛋白G。结合部分可以是本领域已知的用于结合或促进蛋白质之间、蛋白质与配体之间、蛋白质与核酸之间、核酸之间或小分子相互作用结构域或部分之间的相互作用的任何相互作用分子或其片段。
如上所指出的，在亲合力测序方法中，当核苷酸缀合物的核苷酸部分与靶序列的核苷酸残基互补时，在例如荧光标记的核苷酸缀合物、聚合酶和栓系至样品载体结构(例如，流动池表面)的多个引发的靶核酸分子之间形成多价结合复合物。由此形成的多价结合复合物的稳定性允许测序反应循环中的检测/碱基判定步骤与核苷酸掺入步骤分开。
多价结合复合物(一种在核苷酸缀合物的两个或更多个核苷酸部分、两个或更多个聚合酶分子和两个或更多个引发的靶核酸序列之间形成的三元复合物)的稳定性通过复合物的延长持续时间来证明。例如，在一些情况下，所述多价结合复合物(三元复合物)可以具有小于0.5秒、小于1秒、大于1秒、大于2秒、大于3秒、大于4秒、大于5秒、大于10秒、大于15秒、大于20秒、大于30秒、大于60秒、大于120秒、大于360秒、大于720秒、大于1,440秒、大于3,600秒或更长时间，或由这些值中的任意两个或更多个定义的范围内的时间的持续时间。
使用核苷酸缀合物来与聚合酶和引发的靶核酸形成多价结合复合物导致核苷酸的有效局部浓度相对于使用单个未缀合或未栓系的核苷酸可以实现的平均核苷酸浓度增加许多倍，这进而增强了复合物的稳定性并增加了洗涤步骤后的信号强度。高信号强度在整个结合、洗涤和成像步骤中持续存在，并有助于缩短图像采集时间。在成像步骤后，多价结合复合物可去稳定，例如通过改变离子组成、离子强度和/或缓冲液的pH，并被洗掉。然后可以进行引物延伸反应以将互补链延伸一个碱基。
核酸测序系统性能：在一些情况下，所公开的核酸测序系统包括一个或多个与一个或多个所公开的光学成像系统结合使用的所公开的流动池装置，并且任选地利用一种新兴的测序生物化学，诸如以上所述的“捕获测序”(或“亲合力测序”)方法，可以在以下方面提供改善的核酸测序性能：例如，减少样品输入要求，减少图像采集循环时间，减少测序反应循环时间，减少测序运行时间，提高碱基判定的准确性，减少试剂消耗和成本，提高测序通量，并降低测序成本。
核酸样品输入(pM)：在一些情况下，由于使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置和成像系统，可以获得改善的杂交和扩增效率，并且可以获取用于碱基判定的高CNR图像，因此可以显著降低所公开系统的样品输入要求。在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约1pM至约10,000pM的范围内。在一些情况下，核酸样品输入要求可以是至少1pM、至少2pM、至少5pM、至少10pM、至少20pM、至少50pM、至少100pM、至少200pM、至少500pM、至少1,000pM、至少2,000pM、至少5,000pM、至少10,000pM。在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以是至多10,000pM、至多5,000pM、至多2,000pM、至多1,000pM、至多500pM、至多200pM、至多100pM、至多50pM、至多20pM、至多10pM、至多5pM、至多2pM或至多1pM。此段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约5pM至约500pM的范围内。本领域技术人员将认识到，核酸样品输入要求可以具有在此范围内的任何值，例如，约132pM。在一个实例，约100pM的核酸样品输入足以产生用于可靠碱基判定的信号。
核酸样品输入(纳克)：在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约0.05纳克至约1,000纳克的范围内。在一些情况下，核酸样品输入要求是至少0.05纳克、至少0.1纳克、至少0.2纳克、至少0.4纳克、至少0.6纳克、至少0.8纳克、至少1.0纳克、至少2纳克、至少4纳克、至少6纳克、至少8纳克、至少10纳克、至少20纳克、至少40纳克、至少60纳克、至少80纳克、至少100纳克、至少200纳克、至少400纳克、至少600纳克、至少800纳克或至少1,000纳克。在一些情况下，核酸样品输入要求可以是至多1,000纳克、至多800纳克、至多600纳克、至多400纳克、至多200纳克、至多100纳克、至多80纳克、至多60纳克、至多40纳克、至多20纳克、至多10纳克、至多8纳克、至多6纳克、至多4纳克、至多2纳克、至多1纳克、至多0.8纳克、至多0.6纳克、至多0.4纳克、至多0.2纳克、至多0.1纳克或至多0.05纳克。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求的范围可以为约0.6纳克至约400纳克。本领域技术人员将认识到，核酸样品输入要求可以具有在该范围内的任何值，例如，约2.65纳克。
平铺流动池所需的FOV图像：在一些情况下，所公开的光学成像模块的视场(FOV)足够大，以至于本公开的多通道(或多泳道)流动池(例如，其流体通道部分)可以通过平铺约10个FOV图像(或“帧”)至约1,000个FOV图像(或“帧”)来成像。在一些情况下，整个多通道流动池的图像可需要平铺至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950或至少1,000个FOV图像(或“帧”)。在一些情况下，整个多通道流动池的图像可需要平铺至多1,000、至多950、至多900、至多850、至多800、至多750、至多700、至多650、至多600、至多550、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多90、至多80、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个FOV图像(或“帧”)。该段落中描述的任何下限值和上限值都可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，整个多通道流动池的图像可需要平铺约30个至约100个FOV图像。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，所需的FOV图像的数量可以具有在该范围内的任何值，例如，约54个FOV图像。
成像周期时间：在一些情况下，大的FOV、图像传感器响应灵敏度和/或快速的FOV平移时间的组合使得能够缩短成像周期时间(例如，获取足够数量的FOV图像以平铺整个多通道流动池(或其流体通道部分)所需的时间)。在一些情况下，成像周期时间可以在约10秒至约10分钟的范围内。在一些情况下，成像周期时间可以是至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟或至少10分钟。在一些情况下，成像周期时间可以是至多为10分钟、至多9分钟、至多8分钟、至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟、至多1分钟、至多50秒、至多40秒、至多30秒、至多20秒或至多10秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，成像周期时间可以在约20秒至约1分钟的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，成像周期时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约57秒。
测序周期时间：在一些情况下，缩短的测序反应步骤(例如，由于减少了所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池的洗涤时间要求)可导致缩短整个测序周期时间。在一些情况下，所公开系统的测序周期时间可以在约1分钟至约60分钟的范围内。在一些情况下，测序周期时间可以是至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟或至少60分钟。在一些情况下，测序反应周期时间可以是至多60分钟、至多55分钟、至多50分钟、至多45分钟、至多40分钟、至多35分钟、至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多9分钟、至多8分钟、至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟或至多1分钟。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序周期时间可以在约2分钟至约15分钟的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序周期时间可具有在该范围内的任何值，例如，约1分钟12秒。
测序读取长度：在一些情况下，增强的CNR图像可以通过使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置与所公开的成像系统组合来实现，并且在一些情况下，使用较温和的测序生物化学法可以使得能够针对公开的系统实现更长的测序读取长度。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以在约50bp至约500bp的范围内。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以是至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少350bp、至少400bp、至少450bp或至少500bp。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以是至多500bp、至多450bp、至多400bp、至多350bp、至多300bp、至多250bp、至多200bp、至多150bp、至多100bp或至多50bp。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以在约100bp至约450bp的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约380bp。
测序运行时间：在一些情况下，所公开的核酸测序系统的测序运行时间可以在约8小时至约20小时的范围内。在一些情况下，测序运行时间是至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时或至少20小时。在一些情况下，测序运行时间是至多20小时、至多18小时、至多16小时、至多14小时、至多12小时、至多10小时、至多9小时或至多8小时。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，测序运行时间可以在约10小时至约16小时的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序运行时间可以具有该范围内的任何值，例如，约7小时35分钟。
平均碱基判定准确度：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以在测序运行过程中提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少有98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％的平均碱基判定准确度。在一些情况下，所公开的核酸测序系统每判定1,000个碱基、10,0000个碱基、25,000个碱基、50,000个碱基、75,000个碱基或100,000个碱基可以提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％正确的平均碱基判定准确度。
平均Q得分：在一些情况下，测序运行的质量或准确性可以通过计算Phred质量得分(也称为质量得分或“Q得分”)来评估，所述得分指示给定碱基被测序系统错误判定的概率。例如，在一些情况下，特定测序化学和/或测序系统的碱基判定准确性可以针对从对已知核酸序列文库进行测序运行得到的大的经验数据集进行评估。然后可以根据以下等式来计算Q得分：
Q＝-10log10P
其中P是碱基判定错误概率。例如，Q得分为30指示每1000个被判定的碱基中发生1个碱基判定错误的概率(或99.9％的碱基判定准确率)。
在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以提供更准确的碱基读出。例如，在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以提供针对测序运行中的碱基判定准确性的Q得分，其范围为约20至约50。在一些情况下，所述运行的平均Q得分可以是至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。本领域技术人员将认识到，平均Q得分可以具有在词范围内的任何值，例如约32。
Q得分相对于鉴定的核苷酸％：在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于20的Q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于25的Q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于30的Q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于35的Q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于40的Q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于45的Q得分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的组合物和方法对于鉴定的末端(或N+1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于50的Q得分。
试剂消耗：在一些情况下，由于例如使用使流体通道体积和死体积最小化的所公开的流动池装置和流体系统，所以所公开的核酸测序系统可以具有较低的试剂消耗率和成本。因此，在一些情况下，与Illumina MiSeq测序仪消耗的试剂相比，所公开的核酸测序系统每Gbase测序可需要的试剂按体积计平均减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
测序通量：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可提供的测序通量在约50Gbase/运行至约200Gbase/运行范围内。在一些情况下，测序通量可以是至少50Gbase/运行、至少75Gbase/运行、至少100Gbase/运行、至少125Gbase/运行、至少150Gbase/运行、至少175Gbase/运行或至少200Gbase/运行。在一些情况下，测序通量可以是至多200Gbase/运行、至多175Gbase/运行、至多150Gbase/运行、至多125Gbase/运行、至多100Gbase/运行、至多75Gbase/运行或至多50Gbase/运行。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序通量的范围可以为约75Gbase/运行至约150Gbase/运行。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序通量可以具有在该范围内的任何值，例如，约119Gbase/运行。
测序成本：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以以每Gbase约5美元至每Gbase约30美元的成本提供核酸测序。在一些情况下，测序成本可以是每Gbase至少5美元、每Gbase至少10美元、每Gbase至少15美元、每Gbase至少20美元、每Gbase至少25美元或每Gbase至少30美元。在一些情况下，测序成本可以是每Gbase至多30美元、每Gbase至多25美元、每Gbase至多20美元、每Gbase至多15美元、每Gbase至多10美元、或者每Gbase至多30美元。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序成本可以在每Gbase约10美元至每Gbase约15美元的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序成本可以具有在该范围内的任何值，例如每Gbase约7.25美元。
另外的实施方案
本文提供了成像系统，其被配置为对流动池的第一内表面和第二内表面进行成像，所述成像系统包括：a)物镜；b)至少一个图像传感器；和c)布置在所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的至少一个镜筒透镜；其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)；并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正成像性能，使得所述流动池的所述第一内表面和所述流动池的所述第二内表面的图像具有基本上相同的光学分辨率。
在一些实施方案中，所述流动池具有至少700μm的壁厚和至少50μm的在第一内表面与第二内表面之间的流体填充间隙。在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下，获取第一内表面和第二内表面的图像。在一些实施方案中，所述成像系统具有小于0.6的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，所述成像系统具有大于0.3的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，所述成像系统具有大于1.5mm2的视场(FOV)。在一些实施方案中，第一内表面和第二内表面的图像的光学分辨率在整个视场(FOV)上是衍射受限的。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜按顺序包括非对称凸凸透镜、凸平面透镜、非对称凹凹透镜和非对称凸凹透镜。在一些实施方案中，成像系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计来在两个或更多个荧光波长下为第一内表面和第二内表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取第一内表面和第二内表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，成像系统被配置为对在第一内表面或第二内表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。在一些实施方案中，流动池的第一内表面和第二内表面涂覆有亲水性涂层，并且其中所述亲水性涂层还包含以>10,000个核酸集落/mm2的表面密度布置在其上的标记核酸集落。在一些实施方案中，当用花青染料3(Cy3)标记核酸集落时，使用成像系统采集的第一内表面或第二内表面的图像显示出至少5的对比度噪声比(CNR)，成像系统包括针对Cy3发射优化的二向色反射镜和带通滤光器组，并且在将表面浸入在25mMACES、pH 7.4缓冲液中时在非信号饱和条件下采集图像。在一些实施方案中，所述成像系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在所述两个不同表面中的至少一个上的核酸集落，所述核酸集落已用1、2、3或4个不同的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，成像系统用于监测在第一内表面和第二内表面中的至少一个上的亲合力测序、核苷酸碱基配对测序、核苷酸结合测序或核苷酸掺入测序反应，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，成像系统用于进行核酸测序。在一些实施方案中，成像系统用于确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备从样品中提取的核酸分子进行测序，然后对所述核酸分子进行测序。在一些实施方案中，所述至少一个图像传感器包括具有像素尺寸的像素，所述像素尺寸被选择为使得成像系统的空间采样频率是成像系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，物镜和至少一个镜筒透镜的组合被配置为优化样品平面中700个周期/mm至1100个周期/mm的空间频率范围中的调制传递函数。在一些实施方案中，对于物镜和至少一个镜筒透镜的组合，至少一个镜筒透镜被设计来校正一个或多个指定空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、散光、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(CNR)或其任何组合下的调制传递函数(MTF)。
本文还公开了对核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：a)使用包括物镜和至少一个图像传感器的光学系统对第一表面和轴向移位的第二表面进行成像，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)，并且其中在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下，获取具有基本上相同的光学分辨率的所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像；以及b)检测布置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含所述核酸分子或其互补序列的荧光标记的组合物，以确定所述核酸分子中核苷酸的身份。
在一些实施方案中，利用聚焦机构在获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，所述方法还包括对第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水性涂层。在一些实施方案中，所述亲水性涂层还包含以>10,000个核酸集落/mm2的表面密度布置在其上的标记核酸集落。在一些实施方案中，当用花青染料3(Cy3)标记核酸集落时，使用所述光学系统采集的所述两个表面的表面图像显示出至少5的对比度噪声比(CNR)，光学系统包括针对Cy3发射优化的二向色反射镜和带通滤光器组，并且在将表面浸入在25mMACES、pH 7.4缓冲液中时在非信号饱和条件下采集图像。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上的核酸集落，所述核酸集落已用1、2、3或4个不同的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，所述至少一个图像传感器包括具有像素尺寸的像素，所述像素尺寸被选择为使得光学系统的空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，光学系统包括定位在物镜与至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，所述流动池具有至少700μm的壁厚和至少50μm的在第一内表面与第二内表面之间的间隙。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜按顺序包括非对称凸凸透镜、凸平面透镜、非对称凹凹透镜和非对称凸凹透镜。在一些实施方案中，光学系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计来在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，物镜和镜筒透镜的组合被配置为优化中至高空间频率范围中的调制传递函数。在一些实施方案中，成像性能指标包括在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(CNR)或其任何组合下的调制传递函数(MTF)的测量。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面的图像的光学分辨率在整个视场(FOV)上是衍射受限的。在一些实施方案中，对核酸分子进行测序还包括在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上进行亲合力测序、核苷酸碱基配对测序、核苷酸结合测序或核苷酸掺入测序反应，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备所述核酸分子进行测序，然后对所述核酸分子进行测序。
本文公开了被配置为对两个不同的轴向移位的表面进行成像的成像系统，所述成像系统包括物镜和至少一个图像传感器，其中所述成像系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)，并且其中所述成像系统能够在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取具有基本上相同的光学分辨率的两个不同的轴向移位的表面的图像。
在一些实施方案中，所述成像系统具有大于0.3的数值孔径。在一些实施方案中，成像系统还包括聚焦机构，其用于在获取两个不同的轴向移位的表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，成像系统被配置为对在所述两个不同的轴向移位的表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。在一些实施方案中，所述两个不同的轴向移位的表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个不同表面涂覆有亲水性涂层，并且其中所述亲水性涂层还包含以>10,000个核酸集落/mm2的表面密度布置在其上的标记核酸集落。在一些实施方案中，所述成像系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在所述两个不同表面中的至少一个上的核酸集落，所述核酸集落已用1、2、3或4个不同的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，所述至少一个图像传感器包括具有像素尺寸的像素，所述像素尺寸被选择为使得成像系统的空间采样频率是成像系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，成像系统包括定位在物镜与至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，所述流动池具有至少700μm的壁厚和至少50μm的在第一内表面与第二内表面之间的间隙。在一些实施方案中，成像系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计来在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，两个不同的轴向移位表面的图像的光学分辨率在整个视场(FOV)上是衍射受限的。
本文公开了对核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：a)使用包括物镜和至少一个图像传感器的无补偿光学系统对第一表面和轴向移位的第二表面进行成像，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)；b)处理所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像以校正光学像差，使得所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像具有基本上相同的光学分辨率；以及c)检测布置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含所述核酸分子或其互补序列的荧光标记的组合物，以确定所述核酸分子中核苷酸的身份。
在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下，获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面的图像仅通过重新聚焦光学系统来获取。在一些实施方案中，所述方法还包括对第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上的两个或更多个视场进行成像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水性涂层。在一些实施方案中，所述亲水性涂层还包含以>10,000个核酸集落/mm2的表面密度布置在其上的标记核酸集落。在一些实施方案中，当用花青染料3(Cy3)标记核酸集落时，使用所述光学系统采集的所述两个表面的表面图像显示出至少5的对比度噪声比(CNR)，光学系统包括针对Cy3发射优化的二向色反射镜和带通滤光器组，并且在将表面浸入在25mMACES、pH 7.4缓冲液中时在非信号饱和条件下采集图像。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上的核酸集落，所述核酸集落已用1、2、3或4个不同的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括具有像素尺寸的像素，所述像素尺寸被选择为使得光学系统的空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，光学系统包括定位在物镜与至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，所述流动池具有至少700μm的壁厚和至少50μm的在第一内表面与第二内表面之间的间隙。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜按顺序包括非对称凸凸透镜、凸平面透镜、非对称凹凹透镜和非对称凸凹透镜。在一些实施方案中，光学系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计来在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，物镜和镜筒透镜的组合被配置为优化中至高空间频率范围中的调制传递函数。在一些实施方案中，成像性能指标包括在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(CNR)或其任何组合下的调制传递函数(MTF)的测量。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面的图像的光学分辨率在整个视场(FOV)上是衍射受限的。在一些实施方案中，对核酸分子进行测序还包括在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上进行亲合力测序、核苷酸结合测序或核苷酸掺入测序反应，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备所述核酸分子进行测序，然后对所述核酸分子进行测序。
本文公开了用于对核酸分子进行测序的系统，其包括：a)包括物镜和至少一个图像传感器的光学系统，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)，并且被配置为获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像；以及b)处理器，所述处理器被程序化为：i)处理所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像以校正光学像差，使得所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像具有基本上相同的光学分辨率；和ii)检测布置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含所述核酸分子或其互补序列的荧光标记的组合物，以确定所述核酸分子中核苷酸的身份。
在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下，获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面的图像仅通过重新聚焦光学系统来获取。在一些实施方案中，所述成像系统具有大于0.3的数值孔径。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水性涂层，并且其中所述亲水性涂层还包含以>10,000个核酸集落/mm2的表面密度布置在其上的标记核酸集落。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上的核酸集落，所述核酸集落已用1、2、3或4个不同的可检测标记进行标记。在一些实施方案中，所述至少一个图像传感器包括具有像素尺寸的像素，所述像素尺寸被选择为使得光学系统的空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，所述系统包括定位在物镜与至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，所述流动池具有至少700μm的壁厚和至少50μm的在第一内表面与第二内表面之间的间隙。在一些实施方案中，光学系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计来在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。
本文公开了荧光成像系统，其包括：a)至少一个光源，所述光源被配置为提供在一个或多个指定波长范围内的激发光；b)物镜，所述物镜被配置为在样品平面暴露于所述激发光时收集从所述样品平面的指定视场内产生的荧光，其中所述物镜的数值孔径是至少0.3，其中所述物镜的工作距离是至少700μm，并且其中所述视场具有至少2mm2的面积；以及c)至少一个图像传感器，其中通过所述物镜收集的所述荧光被成像到所述图像传感器上，并且其中选择所述图像传感器的像素尺寸，使得所述荧光成像系统的空间采样频率是所述荧光成像系统的光学分辨率的至少两倍。
在一些实施方案中，所述数值孔径是至少0.75。在一些实施方案中，所述数值孔径是至少1.0。在一些实施方案中，所述工作距离是至少850μm。在一些实施方案中，所述工作距离是至少1,000μm。在一些实施方案中，所述视场具有至少2.5mm2的面积。在一些实施方案中，所述视场具有至少3mm2的面积。在一些实施方案中，所述空间采样频率是所述荧光成像系统的光学分辨率的至少2.5倍。在一些实施方案中，所述空间采样频率是所述荧光成像系统的光学分辨率的至少3倍。在一些实施方案中，所述系统还包括X-Y-Z平移台，使得所述系统被配置为以自动方式获取两个或更多个荧光图像的系列，其中所述系列的每个图像是针对不同的视场获取的。在一些实施方案中，在X方向、Y方向和Z方向上同时调整样品平面的位置，以匹配获取不同视场的图像之间的物镜焦平面的位置。在一些实施方案中，在X方向、Y方向和Z方向上同时调整所需的时间小于0.4秒。在一些实施方案中，所述系统还包括自动聚焦机构，其被配置为在误差信号指示焦平面和样品平面在Z方向上的位置差异大于指定误差阈值时在获取不同视场的图像之前调整焦平面位置。在一些实施方案中，指定误差阈值是100nm。在一些实施方案中，指定误差阈值是50nm。在一些实施方案中，所述系统包括三个或更多个图像传感器，并且其中所述系统被配置为将三个或更多个波长范围中的每一个波长范围内的荧光成像到不同的图像传感器上。在一些实施方案中，三个或更多个图像传感器中的每一个的焦平面和样品平面的位置差异小于100nm。在一些实施方案中，三个或更多个图像传感器中的每一个的焦平面和样品平面的位置差异小于50nm。在一些实施方案中，重新定位样品平面、调节焦点和获取图像所需的总时间小于0.4秒/视场。在一些实施方案中，重新定位样品平面、调节焦点和获取图像所需的总时间小于0.3秒/视场。
本文还公开了用于对流动池进行双面成像的荧光成像系统，其包括：a)物镜，所述物镜被配置为收集从所述流动池内的样品平面的指定视场内产生的荧光；b)至少一个镜筒透镜，所述至少一个镜筒透镜定位在所述物镜与至少一个图像传感器之间，其中所述至少一个镜筒透镜被配置为在对所述流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标，并且其中所述流动池具有至少700μm的壁厚和至少50μm的在上内表面与下内表面之间的间隙；其中所述成像性能指标对于在不将光学补偿器移入或移出所述流动池与所述至少一个图像传感器之间的光路、不沿所述光路移动所述镜筒透镜的一个或多个光学元件并且不将所述镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出所述光路的情况下对所述流动池的所述上内表面或所述下内表面进行成像是基本上相同的。
在一些实施方案中，所述物镜是可商购获得的显微镜物镜。在一些实施方案中，所述可商购获得的显微镜物镜具有至少0.3的数值孔径。在一些实施方案中，所述物镜具有至少700μm的工作距离。在一些实施方案中，所述物镜被校正以补偿0.17mm的盖玻片厚度(或流动池壁厚)。在一些实施方案中，所述荧光成像系统还包括电光相位板，所述电光相位板邻近所述物镜定位并且定位在所述物镜与所述镜筒透镜之间，其中所述电光相板提供对由填充所述流动池的所述上内表面与所述下内表面之间的间隙的流体引起的光学像差的校正。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜是包括三个或更多个光学部件的复合透镜。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜是包括四个光学部件的复合透镜。在一些实施方案中，所述四个光学部件按顺序包括第一非对称凸凸透镜、第二凸平面透镜、第三非对称凹凹透镜和第四非对称凸凹透镜。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜被配置为在对具有至少1mm的壁厚的流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜被配置为在对具有至少100μm的间隙的流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。在一些实施方案中，所述至少一个镜筒透镜被配置为在对具有至少200μm的间隙的流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。在一些实施方案中，所述系统包括单个物镜、两个镜筒透镜和两个图像传感器，并且两个镜筒透镜中的每一个被设计来在不同的荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，所述系统包括单个物镜、三个镜筒透镜和三个图像传感器，并且三个镜筒透镜中的每一个被设计来在不同的荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，所述系统包括单个物镜、四个镜筒透镜和四个图像传感器，并且四个镜筒透镜中的每一个被设计来在不同的荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，物镜或镜筒透镜的设计被配置为优化中至高空间频率范围中的调制传递函数。在一些实施方案中，成像性能指标包括在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、对比度噪声比(CNR)或其任何组合下的调制传递函数(MTF)的测量。在一些实施方案中，用于对流动池的上内表面和下内表面进行成像的成像性能指标的差异小于10％。在一些实施方案中，用于对流动池的上内表面和下内表面进行成像的成像性能指标的差异小于5％。在一些实施方案中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，使用至少一个镜筒透镜对于双面成像提供了至少相等或更加改善的成像性能指标。在一些实施方案中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，使用至少一个镜筒透镜对于双面成像提供了至少10％改善的成像性能指标。
本文公开了用于在基于成像的固相基因分型和测序应用中使用的照射系统，所述照射系统包括：a)光源；和b)液体光导，所述液体光导被配置为收集由所述光源发射的光并将其传输至包含栓系的生物大分子的载体表面上的指定照射场。
在一些实施方案中，所述照射系统还包括聚光透镜。在一些实施方案中，所述指定照射场具有至少2mm2的面积。在一些实施方案中，对于用于获取载体表面的图像的成像系统，传输至指定照射场的光在指定视场上具有均匀强度。在一些实施方案中，所述指定视场具有至少2mm2的面积。在一些实施方案中，当光强度的变异系数(CV)小于10％时，传输至指定照射场的光在指定视场上具有均匀强度。在一些实施方案中，当光强度的变异系数(CV)小于5％时，传输至指定照射场的光在指定视场上具有均匀强度。在一些实施方案中，传输至指定照射场的光具有小于0.1的光斑对比度值。在一些实施方案中，传输至指定照射场的光具有小于0.05的光斑对比度值。
在另一方面，本公开提供了一种系统。所述系统可以包括弯曲基底。所述弯曲基底可以包括被配置为与分析物结合的至少一个结合部分。所述系统可以包括光学系统，所述光学系统包括光源。所述光源可以被配置为将来自光源的光引导至弯曲基底。光可以被配置为探测与弯曲表面结合的分析物的存在或不存在。
分析物可以包括如本文其他地方所述的分析物。例如，所述分析物可以包括核酸。在另一个实例中，所述分析物可以包括多肽。所述分析物可以包括多种分析物。例如，所述分析物可以包括多种核酸。结合部分可以基于分析物来选择。例如，结合部分可以被选择为对预定分析物具有结合亲和力。例如，至少部分互补的核酸可以用作核酸分析物的结合部分。
弯曲基底可以是流动池的至少一部分。弯曲基底可以是流动池的部件。例如，弯曲基底可以是流动池的弯曲壁的一部分。在另一个实例中，弯曲基底可以布置在流动池内。例如，弯曲基底可以布置在置于流动池中的可移除芯片上。所述系统可以包括流动池，并且所述流动池可以包括弯曲基底。弯曲基底可以包括流动池的毛细管。例如，弯曲基底可以是毛细管的内壁。弯曲基底可以布置在毛细管的最接近光学系统的一侧上。例如，对于布置在毛细管上方的光学系统，弯曲基底可以在毛细管的顶侧上。弯曲基底可以布置在毛细管的与光学系统相反的一侧上。例如，对于布置在毛细管上方的光学系统，弯曲基底可以布置在毛细管的底部上。
在一些情况下，弯曲基底可以包括玻璃。玻璃可以是对光的波长具有至少部分透明性的氧化物(例如，氧化硅)。弯曲基底可以包括聚合物。聚合物的实例包括但不限于烷基聚合物(例如，聚乙烯、聚丙烯等)、含氟聚合物(例如，Teflon-AF(Dupont)、(Asahi Glass，Japan))、芳香族聚合物(例如，聚二甲苯(Parylene，Kisco，Calif.)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯)、本文其他地方公开的另一种聚合物等或其任何组合。在一些情况下，弯曲基底包括玻璃和聚合物。例如，玻璃板可以插入到聚合物流动池中。在另一个实例中，弯曲基底可以包括经聚合物涂覆的玻璃。
光源可以是如本文其他地方所述的光源。光源可以包括激光器(例如，二极管激光器、气体激光器等)。光源可以包括发光二极管(LED)。光源可以包括白炽光源(例如，卤素灯、白炽灯等)。光源可以被配置为提供光，诸如本文其他地方所述的激发光。例如，光源可以被配置为提供具有约500纳米(nm)至约540nm、约620nm至约650nm、约460nm至约500nm或其任何组合的波长的光。光源可以是宽带光源(例如，被配置为产生具有多个波长的光的光源)。光源可以是窄带光源(例如，被配置为提供单个或几个窄波长带的光源)。
在一些情况下，所述系统可以包括第二弯曲基底。例如，所述系统可以包括与至少一个光源光学通信的多个弯曲基底。第二弯曲基底可以不附接至所述弯曲基底。例如，第二弯曲基底可以是与第一基底的流动池不同的流动池的弯曲部分。第二弯曲基底可以是系统的相同元件的一部分。例如，第二弯曲基底和弯曲基底可以是流动池的基本上圆柱形部件(例如，毛细管)的不同部分。例如，弯曲基底和第二弯曲基底可以是基本上圆柱形流动池的相反侧。在此实例中，弯曲基底和第二弯曲基底可以在图54A-图54B的虚线椭圆中示出。第二弯曲基底可以包括被配置为与第二分析物结合的至少一个第二结合部分。第二结合部分可以是与结合部分相同类型的。例如，核酸可以用作结合部分和第二结合部分两者。第二结合部分可以是与结合部分不同类型的。例如，结合部分可以是核酸，而第二结合部分可以是抗原。
在一些情况下，所述系统被配置为以落射荧光配置探测所述弯曲基底。落射荧光配置可以包括在基底的与光被引入的相同侧上的探测光。例如，所述系统可以被配置为在与基底相互作用之后使用与将光传输至基底相同的物镜来收集光。在一些情况下，所述系统被配置为以透射配置探测所述弯曲基底。透射配置可以包括在基底的与光被引入的相反侧上的探测光。例如，透射配置可以通过检测透射通过样品的光来探测样品的透射和/或吸收。图54A示出了透射配置的实例，其中成像传感器被布置为与光源相对。光源和成像传感器可以与彼此直接相对布置。光源和成像传感器可以与彼此成一定角度布置。
为了处理弯曲基底5301和第二弯曲基底5302，所述系统可以包括焦移组件，所述焦移组件被配置为在弯曲基底与第二曲线基底之间移动焦场。这种偏移的一个实例可以在图53A-图53B中看到，其中成像体积4915(例如，焦场)可以通过使用焦移组件在弯曲基底之间平移。在一些情况下，焦场可以水平偏移(例如，在垂直于光轴的平面中)。
所述焦移组件可以包括至少一个可移动透镜。例如，透镜可以相对于系统的重置是可移动的，以调节系统的焦场。在此实例中，透镜的移动可以重新定向移动通过透镜的光以平移焦场。透镜可以沿着光轴(例如，z轴)移动。透镜可以移动到光轴之外(例如，在xy平面中)。透镜可以在三维中移动。透镜可以布置在透镜镜筒内。例如，透镜可以被置于诸如图51的透镜镜筒中。
在一些情况下，所述焦移组件可以包括至少一个可移动棱镜。可移动棱镜可以被配置为通过折射偏移行进通过可移动棱镜的光束。例如，可移动棱镜可以折射入射光束，并且通过相对于其他光学元件(例如，棱镜、透镜、光栅)移动棱镜，可以移动光束的整体路径，从而偏移焦场。在一些情况下，所述焦移组件可以包括多个棱镜。多个棱镜中的至少一个棱镜可以是可移动的。多个棱镜中的每个棱镜可以是可移动的。例如，可以使用两个可移动棱镜来实现对光通过棱镜的移动的精细控制，这可以导致对焦场的移动的精细控制。
所述光学系统可以相对于所述弯曲基底移动。例如，所述光学系统可以相对于所述弯曲基底平移。所述光学系统可以相对于所述弯曲基底在三维中移动。例如，所述光学系统可以在整个弯曲基底上扫描。所述光学系统可以绕所述弯曲基底旋转。所述光学系统可以以与所述弯曲基底相同的曲率旋转。例如，所述光学系统可以是可旋转的，使得所述弯曲基底在整个旋转过程中保持相同的距离。可旋转光学系统的实例可以在图52A-图52B中看到。
所述光学系统可以被配置为对多个结合部分进行成像。所述光学系统可以被配置为对包含多个结合部分的弯曲基底的区域进行成像。例如，多个结合部分可以布置在基底上，使得它们存在于光学系统的视场中。所述光学系统可以被配置为在相同或基本上相同时间对至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、500、1,000个或更多个结合部分进行成像。所述光学系统可以被配置为在相同或基本上相同时间对至多约1,000、500、250、200、150、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5个或更少个结合部分进行成像。所述多个结合部分可以包括相同类型的结合部分。例如，多个结合部分中的每个结合部分可以是核酸结合部分。所述多个结合部分可以包括多种不同类型的结合部分。例如，所述多个结合部分可以包括核酸和蛋白质。
弯曲基底可以具有平坦度偏差。平坦度偏差可以是弯曲基底的弯曲程度的度量。例如，具有1毫米平坦度偏差的弯曲基底可以具有与基底的平坦平面的1毫米偏差。弯曲基底可以具有至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,500、2,000、2,500、5,000、10,000微米或更大微米的平坦度偏差。弯曲基底可以具有至多约10,000、5,000、2,500、2,000、1,500、1,000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、1微米或更小微米的平坦度偏差。弯曲基底可以具有如由任意两个前述值定义的平坦度偏差。例如，弯曲基底可以具有约100至约500微米的平坦度偏差。弯曲基底可以具有大于光学系统的焦深的平坦度偏差。例如，对于具有10微米焦深的光学系统，弯曲基底可以具有500微米的平坦度偏差。具有大于光学系统的焦深的曲率可以允许对弯曲基底的部分进行选择性成像。例如，源自焦深之外的光可以被光学系统丢弃。因此，可以在不移动基底或光学系统的情况下从弯曲基底的不同区域对多种分析物进行成像。此外，通过相对于弯曲基底移动光学系统，可以分析更多数量的分析物。
所述系统可以包括多个子光学系统。多个子光学系统可以或可以不彼此平行、彼此相邻或其组合。多个子光学系统可以被配置为对弯曲基底的至少部分不同区域进行成像。例如，多个子光学系统可以径向地布置在弯曲基底周围(例如，如图52所示)。多个子光学系统可以被配置有如本文其他地方所述的焦移组件。使用具有焦移组件的子光学系统可以使得能够在不包围子光学组件中的圆柱形基底的情况下在整个圆柱形弯曲基底上进行检测。例如，可以将子光学组件布置在圆柱形弯曲基底的一半上，并且可以使用子光学组件内的焦移组件来寻址圆柱形弯曲基底的另一侧。所述多个子光学系统中的每个子光学系统可以被单独布置成与所述弯曲基底的多条切线垂直。例如，图52的三个子光学组件可以被布置成垂直于弯曲基底的三条不同切线。
所述系统可以包括台。弯曲基底可以布置在台上。例如，弯曲基底可以附接至所述台。所述台可以被配置为支撑和/或移动系统内的弯曲基底。所述台可以包括倾斜台(例如，被配置为在一维、二维或三维中倾斜弯曲基底的台)、旋转台(例如，被配置为在一维、二维或三维中旋转弯曲基底的台)、平移台(例如，被配置为在一维、二维或三维中平移弯曲基底的台)等中的一个或多个。
所述弯曲基底可以包括与其偶联的亲水性聚合物。所述亲水性聚合物可以如本文其他地方所述。所述亲水性聚合物可以降低与弯曲基底接触的样品的表面张力。例如，与不存在亲水性聚合物的情况相比，将亲水性聚合物与弯曲基底偶联可以允许分析物移动得更接近弯曲基底。所述至少一个结合部分可以与所述亲水性聚合物偶联。例如，所述至少一个结合部分可以与所述亲水性聚合物结合。在此实例中，亲水性聚合物中的反应性部分可以与结合部分中的反应性部分反应。
所述系统可以具有如本文其他地方所述的数值孔径(例如，物镜和/或光学成像模块的数值孔径)。所述系统可以包括如本文其他地方所述的成像传感器。例如，成像传感器可以被配置为在将光引导至弯曲基底之后收集光。在一些情况下，所述系统包括被配置为加热所述基底的加热器。所述加热器可以是如本文其他地方所述的加热器。例如，所述加热器可以是集成加热器。在另一个实例中，所述加热器可以是红外加热器。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种系统。所述系统可以包括弯曲基底。所述系统可以包括光学系统，所述光学系统包括光源。所述光源可以被配置为将来自光源的光引导至弯曲基底。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种系统。所述系统可以包括基底。所述系统可以包括光学系统。所述光学系统可以被配置为对基底的至少约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50平方毫米(mm2)或更大平方毫米(mm2)的区域进行成像。所述光学系统可以被配置为对基底的至多约50、45、40、35、30、25、20、15、10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5mm2或更小mm2的区域进行成像。所述光学系统可以被配置为对基底的由任意两个前述值定义的范围内的区域进行成像。例如，光学系统可以被配置为对基底的约4.5至约5.5mm2的区域进行成像。所述基底可以如本文其他地方所述。所述光学系统可以如本文其他地方所述。
所述光学系统可以被配置为同时对所述区域进行成像。例如，所述光学系统可以被配置为使得基底的整个区域在光学系统的视场内。在此实例中，可以同时对整个视场进行成像。所述光学系统可以被配置为基本上同时对所述区域进行成像。例如，所述光学系统可以被配置为基本上同时对所述区域的第一区域和第二区域进行成像。
所述光学系统可以包括多个子光学系统。所述多个子光学系统可以如本文其他地方所述。例如，所述多个子光学系统可以是平行的并且彼此相邻。所述多个子光学系统可以被配置为平行地对所述基底的所述区域进行成像。例如，所述多个子光学系统可以彼此相邻地取向，并且被配置为各自对基底的至少一部分区域进行成像。在此实例中，所述多个子光学系统可以各自生成子图像，并且所述多个子图像可以被组合以形成整个区域的图像。
所述光学系统可以包括被配置为提供光束的光源和透镜。所述透镜可以被配置为将来自光源的光束聚焦到包括所述区域的基底的聚焦区域上。所述光源可以如本文其他地方所述。所述透镜可以包括如本文其他地方所述的透镜。所述透镜可以具有至少约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、10,000mm2或更大mm2的面积。所述透镜可以具有至多约10,000、5,000、4,500、4,000、3,500、3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、10mm2或更小mm2的面积。所述透镜可以是大幅面透镜(例如，被配置用于在大面积上使用的透镜)。光束在聚焦区域上的均匀性可以是至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更大。光束在聚焦区域上的均匀性可以是至多约99.9％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更小。光束在聚焦区域上的均匀性可以在由任意两个前述值定义的范围内。均匀性可以是光束在聚焦区域上的一种或多种特性(例如，功率、波长、通量等)的一致性的度量。均匀性可以是二维或三维的。均匀性可受到光学系统的元件的影响。例如，当透镜中存在缺陷时，不均匀性可增加。
所述基底可以如本文其他地方所述。例如，所述基底可以是弯曲基底。例如，所述基底可以被布置为圆柱体。所述基底可以是如本文其他地方所述的毛细管流动池的至少一部分。所述基底可以具有如本文其他地方所述的平坦度偏差。
所述系统可以包括如本文其他地方所述的台，并且所述基底可以布置在所述台上。例如，所述台可以包括倾斜台、旋转台、平移台等或其任何组合。所述系统可以具有如本文其他地方所述的数值孔径。例如，所述系统可以具有至多约0.6的数值孔径。所述系统可以包括如本文其他地方所述的加热器。例如，所述加热器可以是集成加热器。所述基底可以包括如本文其他地方所述的与其偶联的亲水性聚合物。
所述光学系统可以被配置为以至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500微米或更大微米的分辨率对所述基底的所述区域进行成像。所述光学系统可以被配置为以至多约500、250、200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1微米或更小微米的分辨率对所述基底的所述区域进行成像。所述光学系统可以被配置为以在由任意两个前述值定义的范围内的分辨率对所述基底的所述区域进行成像。
所述系统可以包括成像传感器，其被配置为在引导至基底之后收集光。所述成像传感器可以如本文其他地方所述。例如，所述成像传感器可以是照相机。所述成像传感器可以被配置为提供光的彩色图像。例如，所述成像传感器可以被配置为在引导至基底之后记录关于光的颜色的信息。所述成像传感器可以被配置为不记录光的彩色图像。例如，成像传感器可以记录光的强度，但不能记录波长。
计算机系统
本公开提供了被编程以实现本公开方法的计算机系统。图63示出了被编程或以其他方式被配置为对表面进行成像的计算机系统6301。计算机系统6301可以调节本公开的各个方面。计算机系统6301可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。
计算机系统6301包括一个中央处理单元(CPU，本文也称“处理器”和“计算机处理器”)6305，其可以是单核或多核处理器，或多个用于并行处理的处理器。计算机系统6301还包括存储器或存储器位置6310(例如，随机访问存储器、只读存储器、闪存存储器)、电子存储单元6315(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口6320(例如，网络适配器)以及外围装置6325，诸如缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器6310、存储单元6315、接口6320和外围装置6325通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU6305进行通信。存储单元6315可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统6301可以借助通信接口6320与计算机网络(“网络”)6330可操作地偶联。网络6330可以是互联网、内联网和/或外联网，或与互联网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络6330是电信和/或数据网络。网络6330可以包含一个或多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如云计算。在一些情况下，网络6330借助计算机系统6301可以实现对等网络，其可以使与计算机系统6301耦合的装置能够作为客户端或服务器。
CPU 6305可以执行机器可读指令序列，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置(诸如存储器6310)中。指令可以被引导至CPU 6305，其可以随后编程或以其他方式配置CPU 6305以实现本公开的方法。由CPU 6305进行的操作的实例可以包括提取、解码、执行和写回。在一些情况下，可以使用图形处理单元(GPU)、现场可编程门阵列(FPGA)或包括一个或多个CPU、GPU、FPGA或其任何组合的阵列来代替CPU 6305。
CPU 6305可以是电路的一部分，例如集成电路。系统6301的一个或多个其他部件可以包含在电路中。在一些情况下，电路是一个特定于应用的集成电路(ASIC)。
存储单元6315可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储单元6315可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统6301可以包括一个或多个位于计算机系统6301外部的额外数据存储单元，例如位于与计算机系统6301通过内联网或互联网通信的远程服务器上。
计算机系统6301可以通过网络6330与一个或多个远程计算机系统进行通信。例如，计算机系统6301可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板电脑PC(例如，iPad、/>GalaxyTab)、电话、智能手机(例如，/>iPhone、安卓支持的装置、/>)或个人数字助理。用户可以通过网络6330访问计算机系统6301。
本文所述的方法可以通过存储在计算机系统6301的电子存储位置上(例如，举例而言，在存储器6310或电子存储单元6315上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器6305执行。在一些情况下，可以从存储单元6315检索该代码并将其存储在存储器6310上，以供处理器6305随时访问。在一些情况下，可以去掉电子存储单元6315，并且将机器可执行指令存储在存储器6310上。
代码可以被预编译并配置为与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，也可以在运行期间进行编译。可以以编程语言提供代码，可以选择该编程语言以使代码能够以预编译或即时编译的方式执行。
本文提供的系统和方法(诸如计算机系统6301)可以用编程来体现。该技术的各个方面可被视为“产品”或“制品”，其通常为在一种类型的机器可读介质上携载或在该一种类型的机器可读介质中体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如可随时提供用于软件编程的非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过互联网或其他各种电信网络进行通信。这样的通信例如可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括诸如跨本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的光波、电波和电磁波。携载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用，除非限制于非暂时性、有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质(诸如计算机可执行代码)可以采用多种形式，包括但不限于有形的存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如计算机平台的诸如主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的电线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号的形式，或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些波。因此，计算机可读介质的常见形式包括：软盘、柔性磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、打孔卡纸带、任何其他带有孔图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输此类载波的电缆或链路、或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多形式可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列携带到处理器以进行执行。
计算机系统6301可以包括电子显示器6335或与电子显示器6335通信，所述电子显示器包括用户界面(UI)6340，用于提供例如光学系统的控制界面。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在由中央处理单元6305执行时通过软件来实现。例如，所述算法可以控制光学系统。
编号的实施方案
1.一种用于对核酸分子进行测序的系统，其包括：
a)具有内表面的流动池，所述内表面包括与其偶联的多个引发的靶核酸序列，其中所述多个引发的靶核酸序列中的引发的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；
b)流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为控制试剂向所述流动池的所述内表面的顺序和迭代递送；
c)成像模块，所述成像模块包括：
i)结构化照射系统；和
ii)被配置为获取所述流动池的所述内表面的图像的图像采集系统；以及
d)处理器，其中所述处理器被程序化为指示所述系统迭代地进行包括以下的方法：
i)使与所述流动池的所述内表面偶联的所述多个引发的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以便当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引发的靶核酸序列的核苷酸互补时在所述多个引发的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；和
ii)对所述流动池的所述内表面进行成像以检测所述瞬时结合复合物，从而确定所述引发的靶核酸序列的所述核苷酸的身份。
2.如实施方案1所述的系统，其中所述结构化照射系统包括被设计来将多个周期性光图案投影在所述流动池的所述内表面上的光学系统，并且其中所述多个周期性光图案的相对取向或相移是可调节的。
3.如实施方案1所述的系统，其中所述结构化照射系统包括第一光学臂，所述第一光学臂包括用于发射光的第一光发射器和用于将由所述第一光发射器发射的光分割成第一多个条纹并将所述第一多个条纹投影在所述流动池的所述内表面上的第一分束镜。
4.如实施方案3所述的系统，其中所述结构化照射系统还包括第二光学臂，所述第二光学臂包括用于发射光的第二光发射器和用于将由所述第二光发射器发射的光分割成第二多个条纹并将所述第二多个条纹投影在所述流动池的所述内表面上的第二分束镜。
5.如实施方案4所述的系统，其中所述结构化照射系统还包括用于合并所述第一臂和所述第二臂的光路的光学元件。
6.如实施方案4或实施方案5所述的系统，其中所述第一分束镜包括第一透射衍射光栅，并且所述第二分束镜包括第二透射衍射光栅。
7.如实施方案4或实施方案5所述的系统，其中所述第一和第二光发射器发射非偏振光，并且其中所述第一和第二透射衍射光栅用于衍射由所述第一和第二光发射器中的相应光发射器发射的非偏振光。
8.如实施方案6或实施方案7所述的系统，其中用于合并所述第一多个条纹和所述第二多个条纹的光路的所述光学元件包括具有孔的反射镜，其中所述反射镜被布置成反射由所述第一透射衍射光栅衍射的光，并且所述孔被布置成穿过由所述第二透射衍射光栅衍射的至少一阶光。
9.如实施方案8所述的系统，其还包括：用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹产生相移的一个或多个光学元件。
10.如实施方案9所述的系统，其中用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹产生相移的所述一个或多个光学元件包括用于使所述第一多个条纹产生相移的第一旋转光学窗口和用于使所述第二多个条纹产生相移的第二旋转光学窗口。
11.如实施方案9或实施方案10所述的系统，其中用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹产生相移的所述一个或多个光学元件包括用于平移所述第一衍射光栅的第一线性运动台和用于平移所述第二衍射光栅的第二线性运动台。
12.如实施方案9至11中任一项所述的系统，其中用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹产生相移的所述一个或多个光学元件包括单个旋转光学窗口，其中所述单个旋转光学窗口在至样品的光路中定位在所述具有孔的反射镜之后。
13.如实施方案12所述的系统，其中所述单个旋转光学窗口的旋转轴相对于所述光栅中的每个的光轴偏移约45度。
14.如实施方案9至13中任一项所述的系统，其中所述第一多个条纹在样品平面上相对于所述第二多个条纹成角度地偏移约90度。
15.如实施方案14所述的系统，其中所述样品包括以矩形阵列或六边形阵列规则地图案化的多个特征。
16.如实施方案9至15中任一项所述的系统，其还包括：将所述第一多个条纹和所述第二多个条纹中的每一个投影在所述样品上的物镜。
17.如实施方案9至16中任一项所述的系统，其还包括：用于阻挡由所述第一和第二衍射光栅中的每一个发射的零阶光的一个或多个光束阻挡器。
18.如实施方案17所述的系统，其中所述一个或多个光束阻挡器包括布拉格光栅。
19.如实施方案6至18中任一项所述的系统，其中用于合并所述第一臂和所述第二臂的光路的所述光学元件包括偏振分束镜，其中所述第一衍射光栅衍射垂直偏振光，并且其中所述第二衍射光栅衍射水平偏振光。
20.如实施方案4至19中任一项所述的系统，其中所述第一和第二分束镜各自包括分束镜立方体或板。
21.如实施方案3至20中任一项所述的系统，其中所述第一分束镜包括第一反射衍射光栅，并且所述第二分束镜包括第二反射衍射光栅。
22.如实施方案1至21中任一项所述的系统，其中所述结构化照射系统包括多分束镜载玻片，所述多分束镜载玻片包括安装在线性平移台上的多个分束镜，使得所述多个分束镜相对于所述系统的光轴具有固定取向。
23.如实施方案22所述的系统，其中所述多个分束镜包括多个衍射光栅。
24.如实施方案23所述的系统，其中所述多个衍射光栅包括两个不同的衍射光栅。
25.如实施方案1至24中任一项所述的系统，其中所述结构化照射系统包括固定二维衍射光栅，所述固定二维衍射光栅与空间滤光轮组合使用以将一维衍射图案投影在所述流动池的所述内表面上。
26.如实施方案1至25中任一项所述的系统，其中所述图像采集系统包括定制镜筒透镜，所述定制镜筒透镜与物镜组合，使得能够以基本上相同的图像分辨率对第一流动池内表面和第二流动池内表面进行成像。
27.如实施方案1至26中任一项所述的系统，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。
28.如实施方案27所述的系统，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含与聚合物核心缀合的多个核苷酸部分。
29.如实施方案28所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。
30.如实施方案28或实施方案29所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。
31.如实施方案1至30中任一项所述的系统，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。
32.一种用于对核酸分子进行测序的方法，其包括：
a)提供栓系至表面的多个引发的靶核酸序列，其中所述多个引发的靶核酸序列中的引发的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；
b)使所述多个引发的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以便当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引发的靶核酸序列的核苷酸互补时在所述多个引发的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；以及
c)检测所述瞬时结合复合物以确定所述引发的靶核酸序列的所述核苷酸的身份，其中所述检测包括：
i)在第一组照射条件下用结构化照射系统提供的光照射所述表面，以将在特定方向上取向的第一多个条纹投影在所述表面上；
ii)捕获所述表面的第一多个相位图像，其中在捕获所述第一多个图像期间，所述第一多个条纹的位置在所述表面上偏移；
iii)在第二组照射条件下用所述结构化照射系统提供的光照射所述表面，以将第二多个条纹投影在所述表面上，其中所述第二多个条纹与所述表面上的所述第一多个条纹成角度地偏移；和
iv)捕获被照射而具有所述第二多个条纹的所述表面的多个第二相位图像，其中在捕获所述第二多个条纹期间，所述第二多个条纹的位置在所述表面上偏移。
33.如实施方案32所述的方法，其中所述结构化照射系统包括第一光学臂，所述第一光学臂包括用于发射光的第一光发射器和用于衍射由所述第一光发射器发射的光以将在特定方向上取向的所述第一多个条纹投影在所述表面上的第一衍射光栅。
34.如实施方案33所述的方法，其中所述结构化照明射系统包括第二光学臂，所述第二光学臂包括用于发射光的第二光发射器和用于衍射由所述第二光发射器发射的光以将相对于所述第一多个条纹成角度地偏移的所述第二多个条纹投影在所述表面上的第二衍射光栅。
35.如实施方案32至34中任一项所述的方法，其中所述结构化照射系统包括多分束镜载玻片，所述多分束镜载玻片包括安装在线性平移台上的多个分束镜，使得所述多个分束镜相对于所述系统的光轴具有固定取向，并且其中所述第一组照射条件对应于所述线性平移台的第一位置，并且所述第二组照射条件相应于所述线性平移台的第二位置。
36.如实施方案35所述的方法，其中所述多个分束镜包括多个衍射光栅。
37.如实施方案36所述的方法，其中所述多个衍射光栅包括两个衍射光栅。
38.如实施方案32至37中任一项所述的方法，其中所述结构化照射系统包括固定二维衍射光栅，所述固定二维衍射光栅与空间滤光轮组合使用以将一维衍射图案投影在所述表面上，并且其中所述第一组照射条件对应于所述空间滤光轮的第一位置，并且所述第二组照射条件相应于所述空间滤光轮的第二位置。
39.如实施方案34至38中任一项所述的方法，其中所述第一衍射光栅和所述第二衍射光栅是透射衍射光栅，其中所述结构化照射系统包括用于反射由所述第一衍射光栅衍射的光并穿过由所述第二衍射光栅衍射的至少一阶光的具有孔的反射镜。
40.如实施方案32至39中任一项所述的方法，其还包括：使用至少所述第一多个捕获的相位图像和所述多个第二捕获的相位图像来以计算的方式重建一个或多个图像，所述一个或多个图像具有比所述第一多个和第二多个捕获的相位图像中的每一个更高的分辨率。
41.如实施方案40所述的方法，其中所述第一多个条纹在所述表面上相对于所述第二多个条纹成角度地偏移约90度。
42.如实施方案32至41中任一项所述的方法，其中所述表面包括以矩形阵列或六边形阵列规则地图案化的多个特征。
43.如实施方案32至42中任一项所述的方法，其中所述第一多个条纹和所述第二多个条纹通过旋转定位所述表面与所述第一和第二衍射光栅中的每一个之间的光路中的单个光学窗口进行相移，其中所述单个旋转光学窗口的旋转轴相对于所述衍射光栅中的每一个的光轴偏移。
44.如实施方案34至43中任一项所述的方法，其中在捕获所述第一多个相位图像之后，关闭所述第一光学臂并且打开所述结构化照射系统的所述第二光学臂。
45.如实施方案34至44中任一项所述的方法，其中所述第一衍射光栅和所述第二衍射光栅在图像捕获期间是机械地固定的。
46.如实施方案32至45中任一项所述的方法，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。
47.如实施方案46所述的方法，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含与聚合物核心缀合的多个核苷酸部分。
48.如实施方案47所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。
49.如实施方案47或实施方案48所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。
50.如实施方案32至49中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定所述引发的靶核酸序列的引物链的N+1或末端核苷酸的身份。
51.如实施方案32至50中任一项所述的方法，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。
52.一种检测设备，其包括：
a)包括多个显微荧光计的读磁头组件，
其中所述多个显微荧光计相对于彼此保持在固定位置以形成多重复用读磁头，
其中所述多个显微荧光计的第一子集中的至少一个被配置为获取第一样品平面的不同区域的宽场图像，并且其中所述多个显微荧光计的第二子集中的至少一个被配置为获取第二样品平面的不同区域的宽场图像。
53.如实施方案52所述的检测设备，其还包括平移台，所述平移台被配置为在平行于所述第一和第二样品平面的至少一个方向上移动所述读磁头组件。
54.如实施方案52或实施方案53所述的检测设备，其还包括样品台，所述样品台被配置为容纳包括第一和第二内表面的流动池，使得所述第一内表面保持在所述第一样品平面处，并且所述第二内表面保持在所述第二样品平面处。
55.如实施方案52至54中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计中的至少一个显微荧光计被配置为获取具有至少1mm视场的宽场图像。
56.如实施方案52至55中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计中的至少一个显微荧光计被配置为获取具有至少1.5mm视场的宽场图像。
57.如实施方案52至56中任一项所述的检测设备，其中所述显微荧光计中的至少一个还包括专用自动聚焦机构。
58.如实施方案57所述的检测设备，其中第一显微荧光计的所述自动聚焦机构被配置为整合来自第二显微荧光计的自动聚焦机构的数据，由此所述第一显微荧光计的所述自动聚焦机构基于所述第一显微荧光计的聚焦位置和所述第二显微荧光计的聚焦位置来改变所述第一显微荧光计的焦点。
59.如实施方案52至58中任一项所述的检测设备，其中单个显微荧光计还包括物镜、分束镜和检测器，其中所述分束镜被定位成将来自激发辐射源的激发辐射引导至所述物镜并将来自所述物镜的激发辐射引导至所述检测器。
60.如实施方案59所述的检测设备，其中至少一个单个显微荧光计还包括单个激发辐射源。
61.如实施方案59或实施方案60所述的检测设备，其中所述激发辐射源将所述激发辐射引导至多个显微荧光计中的两个或更多个单个显微荧光计的所述物镜，使得所述两个或更多个单个显微荧光计共享所述激发辐射源。
62.如实施方案59至61中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计中的两个或更多个单个显微荧光计包括或共享至少两个激发辐射源。
63.如实施方案59至62中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计中的单个显微荧光计的所述物镜具有0.2与0.5之间的数值孔径。
64.如实施方案52至63中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计中的显微荧光计被配置为以足以区分间隔小于50微米的特征的分辨率获取图像。
65.如实施方案52至64中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计中的显微荧光计被配置为具有小于所述流动池的所述第一与第二内表面之间的间隔距离的景深。
66.如实施方案52至65中任一项所述的检测设备，其中所述多个显微荧光计的所述第一子集被配置为在第一荧光发射波长下获取宽场图像，并且所述多个显微荧光计的所述第二子集被配置为在第二荧光发射波长下获取宽场图像。
67.一种用于确定靶核酸序列中的核苷酸的身份的方法，其包括：
a)提供多个引发的靶核酸序列，其中所述多个引发的靶核酸序列中的引发的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；
b)使所述多个引发的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以便当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引发的靶核酸序列的核苷酸互补时在所述多个引发的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；以及
c)检测所述瞬时结合复合物以确定所述引发的靶核酸序列的所述核苷酸的身份，其中所述检测包括：
在平行于所述多个引发的靶核酸序列栓系在其上的平面的至少一个方向上平移多重复用读磁头，
其中所述多重复用读磁头包括相对于彼此保持在固定位置的多个显微荧光计，并且其中所述多个显微荧光计中的至少一个显微荧光计被配置为获取所述表面的与所述多个显微荧光计中的其他显微荧光计不同的区域的宽场图像。
68.如实施方案67所述的方法，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。
69.如实施方案68所述的方法，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含与聚合物核心缀合的多个核苷酸部分。
70.如实施方案69所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。
71.如实施方案69或实施方案70所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。
72.如实施方案67至71中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定所述引发的靶核酸序列的引物链的N+1或末端核苷酸的身份。
73.如实施方案67至72中任一项所述的方法，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。
74.如实施方案67至73中任一项所述的方法，其中所述多个引发的靶核酸序列栓系至流动池的第一内表面和第二内表面，并且其中所述多个显微荧光计的第一子集被配置为获取所述流动池的所述第一内表面的不同区域的宽场图像，并且所述多个显微荧光计的第二子集被配置为获取所述流动池的所述第二内表面的不同区域的宽场图像。
75.一种用于对核酸分子进行测序的系统，其包括：
a)具有至少一个内表面的流动池，所述内表面包括与其偶联的多个引发的靶核酸序列，其中所述多个引发的靶核酸序列中的引发的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；
b)流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为控制试剂向所述流动池的所述至少一个内表面的顺序和迭代递送；
c)成像模块，所述成像模块被配置为对所述流动池的所述至少一个内表面进行成像，其中所述成像模块包括：
包括相对于彼此保持在固定位置的多个显微荧光计的多重复用读磁头组件，
其中所述多个显微荧光计中的至少一个显微荧光计被配置为获取所述至少一个表面的与所述多个显微荧光计中的其他显微荧光计不同的区域的宽场图像；和
d)处理器，其中所述处理器被程序化为指示所述系统迭代地进行包括以下的方法：
i)使与所述流动池的所述至少一个内表面偶联的所述多个引发的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以便当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引发的靶核酸序列的核苷酸互补时在所述多个引发的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；和ii)使用所述多重复用读磁头对所述流动池的所述至少一个内表面进行成像以检测所述瞬时结合复合物，从而确定所述引发的靶核酸序列的所述核苷酸的身份。
76.如实施方案75所述的系统，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。
77.如实施方案76所述的系统，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含与聚合物核心缀合的多个核苷酸部分。
78.如实施方案77所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。
79.如实施方案77或实施方案78所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。
80.如实施方案75至79中任一项所述的系统，其中所述方法用于确定所述引发的靶核酸序列的引物链的N+1或末端核苷酸的身份。
81.如实施方案75至80中任一项所述的系统，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。
82.如实施方案75至81中任一项所述的方法，其中所述多个引发的靶核酸序列栓系至所述流动池的第一内表面和第二内表面，并且其中所述多个显微荧光计的第一子集被配置为获取所述流动池的所述第一内表面的不同区域的宽场图像，并且所述多个显微荧光计的第二子集被配置为获取所述流动池的所述第二内表面的不同区域的宽场图像。
83.如实施方案75至82中任一项所述的系统，其还包括平移台，所述平移台被配置为在平行于所述第一和第二样品平面的至少一个方向上移动所述多重复用读磁头组件。
84.如实施方案75至83中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的至少一个显微荧光计被配置为获取具有至少1mm视场的宽场图像。
85.如实施方案75至84中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的至少一个显微荧光计被配置为获取具有至少1.5mm视场的宽场图像。
86.如实施方案74至85中任一项所述的系统，其中所述显微荧光计中的至少一个还包括专用自动聚焦机构。
87.如实施方案86所述的系统，其中第一显微荧光计的所述自动聚焦机构被配置为整合来自第二显微荧光计的自动聚焦机构的数据，由此所述第一显微荧光计的所述自动聚焦机构基于所述第一显微荧光计的聚焦位置和所述第二显微荧光计的聚焦位置来改变所述第一显微荧光计的焦点。
88.如实施方案75至87中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的单个显微荧光计还包括物镜、分束镜和检测器，其中所述分束镜被定位成将来自激发辐射源的激发辐射引导至所述物镜并将来自所述物镜的激发辐射引导至所述检测器。
89.如实施方案88所述的系统，其中至少一个单个显微荧光计还包括单个激发辐射源。
90.如实施方案89所述的系统，其中所述激发辐射源将所述激发辐射引导至多个显微荧光计中的两个或更多个单个显微荧光计的所述物镜，使得所述两个或更多个单个显微荧光计共享所述激发辐射源。
91.如实施方案88至90中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的两个或更多个单个显微荧光计包括或共享至少两个激发辐射源。
92.如实施方案88至91中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的单个显微荧光计的所述物镜具有0.2与0.5之间的数值孔径。
93.如实施方案75至92中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的显微荧光计被配置为以足以区分间隔小于50微米的特征的分辨率获取图像。
94.如实施方案82至93中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计中的显微荧光计被配置为具有小于所述流动池的所述第一与第二内表面之间的间隔距离的景深。
95.如实施方案82至94中任一项所述的系统，其中所述多个显微荧光计的所述第一子集被配置为在第一荧光发射波长下获取宽场图像，并且所述多个显微荧光计的所述第二子集被配置为在第二荧光发射波长下获取宽场图像。
96.一种对核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供包括表面的流动池，其中所述表面包括：
i)基底；
ii)至少一个亲水性聚合物涂层；
iii)附接至至少一个亲水性聚合物涂层的多个寡核苷酸分子；和
iv)所述表面的包含固定至所述多个附接的寡核苷酸分子的多个克隆扩增的样品核酸分子的至少一个离散区域，其中所述多个固定的克隆扩增的样品核酸分子以小于λ/(2*NA)的距离存在，其中λ是激发能量源的中心波长，并且NA是成像系统的数值孔径；
b)将随机光切换化学同时应用于所述多个克隆扩增的样品核酸分子，以通过随机光切换使所述多个克隆扩增的样品核酸分子在开启和关闭事件中发出多达四种不同颜色的荧光；以及
c)当所述多个克隆扩增的样品核酸分子发生所述开启和关闭事件时，实时检测每种颜色的颜色通道中的所述开启或关闭事件，以确定所述克隆扩增的样品核酸分子的核苷酸的身份。
97.如实施方案96所述的方法，其中用于所述随机光切换的试剂的浓度是足够的，使得所述多个克隆扩增的样品核酸分子中的给定克隆扩增的样品核酸分子的给定核苷酸的开启事件将与相邻所述给定克隆扩增的样品核酸分子中的克隆扩增的样品核酸分子的给定核苷酸的开启事件同时发生的概率小于约0.5％。
98.如实施方案96所述的方法，其还包括控制所述开启和关闭事件发生的速率，以控制给定克隆扩增的样品核酸分子的给定核苷酸的开启事件将与相邻所述给定克隆扩增的样品核酸分子中的克隆扩增的样品核酸分子的核苷酸的开启事件同时发生的概率。
99.如实施方案98所述的方法，其中控制所述开启和关闭事件发生的所述速率包括调节所述随机光切换化学中的核苷酸和酶的浓度。
100.如实施方案96所述的方法，其还包括确定颜色通道中的检测事件的照射强度是否大于预定阈值。
101.如实施方案96所述的方法，其还包括确定颜色通道中的检测事件的光斑大小是否大于预定阈值。
102.如实施方案96所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含PEG。
103.如实施方案96所述的方法，其中检测包括获取所述表面的图像，其中所述图像表现出至少40的对比度噪声比(CNR)。
104.如实施方案96所述的方法，其中检测包括获取所述表面的图像，其中所述图像表现出至少60的对比度噪声比(CNR)。
105.如实施方案96所述的方法，其中所述基底包括玻璃。
106.如实施方案96所述的方法，其中所述基底包括塑料。
107.如实施方案96所述的方法，其中所述表面定位在流动通道的内部上。
108.如实施方案96所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物层包含具有至少8个分支的支化亲水性聚合物。
109.如实施方案96所述的方法，其中在所述表面的从所述至少一个离散区域横向移位的区域处测量的背景荧光强度不大于在所述克隆扩增之前在所述至少一个离散区域处测量强度的2x。
110.如实施方案96所述的方法，其中所述样品核酸分子包括单链多聚体核酸分子，所述单链多聚体核酸分子包含规则出现的单体单元的重复。
111.如实施方案110所述的方法，其中所述单链多聚体核酸分子的长度为至少10kb。
112.如实施方案110所述的方法，其还包括所述规则出现的单体单元的双链单体拷贝。
113.如实施方案96所述的方法，其中所述表面包括第一层，所述第一层包括栓系至所述基底的表面的单层聚合物分子；第二层，所述第二层包含栓系至所述第一层的所述聚合物分子的聚合物分子；和第三层，所述第三层包含栓系至所述第二层的所述聚合物分子的聚合物分子，其中至少一个层包含支化聚合物分子。
114.如实施方案113所述的方法，其中所述第三层还包含栓系至所述第三层的所述聚合物分子的寡核苷酸。
115.如实施方案114所述的方法，其中栓系至所述第三层的所述聚合物分子的所述寡核苷酸在整个所述第三层上以多个深度分布。
116.如实施方案113所述的方法，其还包括第四层，所述第四层包含栓系至所述第三层的所述聚合物分子的支化聚合物分子；和第五层，所述第五层包含栓系至所述第四层的所述支化聚合物分子的聚合物分子。
117.如实施方案116所述的方法，其中所述第五层的所述聚合物分子还包括栓系至所述第五层的所述聚合物分子的寡核苷酸。
118.如实施方案117所述的方法，其中栓系至所述第五层的所述聚合物分子的所述寡核苷酸在整个所述第五层上以多个深度分布。
119.如实施方案96所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含选自以下的分子：聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和葡聚糖。
120.一种光学系统，其包括：
多个成像传感器；
多个光源；
流动池，所述流动池布置在所述多个成像传感器与所述多个光源之间的光路中；和
多带陷波滤光器，所述多带陷波滤光器布置在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路中。
121.如实施方案120所述的光学系统，其中所述流动池包括一个或多个内表面，所述内表面具有与其偶联的亲水性聚合物层。
122.如实施方案121所述的光学系统，其中所述流动池还包括与所述亲水性聚合物层偶联的多种生物聚合物。
123.如实施方案121所述的光学系统，其中所述亲水性聚合物层包含聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。
124.如实施方案120所述的光学系统，其还包括像素移位器。
125.如实施方案120所述的光学系统，其中所述多带陷波滤光器包括三带陷波滤光器。
126.如实施方案120所述的光学系统，其还包括布置在所述多带陷波滤光器与所述流动池之间的所述光路中的成像光学器件。
127.如实施方案120所述的光学系统，其中所述成像光学器件具有包括1x的缩减。
128.如实施方案120所述的光学系统，其中所述光学系统具有1x的缩减。
129.如实施方案120所述的光学系统，其中所述光学系统具有包括大于1mm2的视场(FOV)。
130.如实施方案120所述的光学系统，其中所述光学系统具有包括小于0.6的数值孔径(NA)。
131.如实施方案130所述的光学系统，其中所述NA包括约0.25。
132.如实施方案129所述的光学系统，其中所述多个成像传感器被配置为捕获所述FOV。
133.如实施方案120所述的光学系统，其中所述多个光源包括：被配置为发射在第一波长范围内的光的第一光源；
被配置为发射在第二波长范围内的光的第二光源；和
被配置为发射在第三波长范围内的光的第三光源，其中所述第一波长范围、所述第二波长范围和所述第三波长范围是不同的波长范围。
134.如实施方案133所述的光学系统，其中由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团。
135.如实施方案120所述的光学系统，其中：
由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团；并且
由所述第二光源的所述第二波长范围激发的所述第二荧光团不同于由所述第三光源的所述第三波长范围激发的第三荧光团。
136.如实施方案135所述的光学系统，其中由所述第三光源的所述第三波长范围激发的所述第三荧光团不同于由所述第一光源的所述第一波长范围激发的所述第一荧光团。
137.如实施方案133所述的光学系统，其中所述第一光源的所述第一波长范围包括在约500至约540纳米(nm)之间。
138.如实施方案133所述的光学系统，其中所述第二光源的所述第二波长范围包括在约620至约640nm之间。
139.如实施方案133所述的光学系统，其中所述第三光源的所述第三波长范围包括在约460至约500nm之间。
140.如实施方案120所述的光学系统，其中所述流动池包括内表面，所述内表面包括多个离散区域，其中(i)所述多个离散区域中的第一离散区域包括在所述第一离散区域处与所述内表面偶联的第一组的核酸分子，并且(ii)所述多个离散区域中的第二离散区域包括在所述第二离散区处与所述内表面偶联的第二组的所述核酸分子，其中所述第一组的所述核酸分子不同于所述第二组的所述核酸分子。
141.如实施方案140所述的光学系统，其中所述第一组的所述核酸分子包含与其偶联的第一荧光团，并且所述第二组的所述核酸分子包含与其偶联的第二荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团。
142.如实施方案141所述的光学系统，其中所述多个离散区域中的第三离散区域包括在所述第三离散区域处与所述内表面偶联的第三组的所述核酸分子，并且其中所述第三组的所述核酸分子不同于所述第一组和所述第二组的所述核酸分子。
143.如实施方案142所述的光学系统，其中所述第三组的所述核酸分子包含与其偶联的第三荧光团，其中所述第三荧光团不同于第二第一荧光团和所述第二荧光团。
144.如实施方案24所述的光学系统，其中第四组的所述核酸分子在所述第四离散区域处与所述内表面偶联，其中所述第四组的核酸分子包含所述第一荧光团和所述第三荧光团，其中所述第一荧光团和所述第三荧光团是可检测地不同的。
145.如实施方案120所述的光学系统，其中所述多个光源包括发光二极管(LED)光源。
146.如实施方案120所述的光学系统，其还包括第二多带陷波滤光器。
147.如实施方案120所述的光学系统，其中所述光学系统不包括：
(a)二向色元件；
(b)镜筒透镜；
(c)校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路；
(d)自动聚焦元件；
(e)激光器；或
(f)(a)至(e)的任何组合。
148.如实施方案120所述的光学系统，其中所述流动池包括弯曲基底。
149.如实施方案120所述的光学系统，其中所述光学系统包括像素移位器。
150.如实施方案149所述的光学系统，其中所述像素移位器包括多个棱镜。
151.如实施方案149所述的光学系统，其中所述像素移位器包括可移动透镜。
152.一种对生物聚合物进行成像的方法，所述方法包括：
(a)提供光学系统，所述光学系统包括：
(i)多个光源，所述多个光源包括具有第一波长范围的第一光源和具有第二波长范围的第二光源，其中所述第一波长范围不同于所述第二波长范围；和
(ii)多个成像传感器，所述多个成像传感器包括被配置为在由所述第一光源发射的所述第一波长存在下对布置在所述多个光源与所述多个成像传感器之间的光路中的一种或多种生物聚合物进行成像的第一成像传感器，和被配置为在由所述第二光源发射的所述第二波存在下对所述一种或多种生物聚合物进行成像的第二成像传感器；
(b)在足以使所述一种或多种生物聚合物中的第一生物聚合物与多种荧光团中的第一荧光团结合并且使所述一种或多种生物聚合物中的第二生物聚合物与所述多种荧光团中的第二荧光团结合的条件下，使所述一种或多种生物聚合物与所述多种荧光团接触，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团；
(c)用所述光学系统对所述第一生物聚合物进行成像，其中所述成像包括(i)用所述第一光源照射所述第一生物聚合物，从而激发所述第一荧光团，和(ii)用所述第一成像传感器获取所述第一生物聚合物的第一图像；以及
(d)用所述光学系统对所述第二聚合物进行成像，其中所述成像包括(i)用所述第二光源照射所述第二生物聚合物，从而激发所述第二荧光团，和(ii)用所述第二成像传感器获取所述第二生物聚合物的第二图像。
153.如实施方案152所述的方法，其中所述第一生物聚合物与所述第二生物聚合物相同。
154.如实施方案152所述的方法，其还包括：对所述一种或多种生物聚合物中的第三生物聚合物进行成像，包括(i)用所述多个光源中的第三光源照射所述第三生物聚合物，其中所述第三光源发射激发所述多个荧光团中的第三荧光团的第三波长范围，和(ii)用所述多个成像传感器中的第二成像传感器获取所述第三生物聚合物的第三图像。
155.如实施方案152所述的方法，其还包括将所述第一图像和所述第二图像组合成合成图像。
156.如实施方案155所述的方法，其还包括鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的单元，包括分析所述合成图像的第一感兴趣区域(ROI)以检测由所述第一荧光团发射的第一信号。
157.如实施方案155所述的方法，其还包括鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第二荧光团发射的第二信号。
158.如实施方案155所述的方法，其还包括：
(e)鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的第一单元，包括分析所述合成图像的第一ROI以检测由所述第一荧光团发射的第一信号；和
(f)鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的第二单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第一荧光团发射的第二信号。
159.如实施方案154所述的方法，其还包括将所述第一图像、所述第二图像和所述第三图像组合成合成图像。
160.如实施方案159所述的方法，其还包括鉴定由所述第三荧光团结合的所述第三生物聚合物的第三单元，包括分析所述合成图像的第三ROI以检测由所述第三荧光团发射的第三信号。
161.如实施方案154所述的方法，其还包括：
(e)鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的第一单元，包括分析所述合成图像的第一感兴趣区域(ROI)以检测由所述第一荧光团发射的第一信号；
(f)鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的第二单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第一荧光团发射的第二信号；和
(g)鉴定由所述第三荧光团结合的所述第三生物聚合物的第三单元，包括分析所述合成图像的第三ROI以检测由所述第三荧光团发射的第三信号。
162.如实施方案152-161中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物包括一种或多种核酸分子、多肽、蛋白质或其组合。
163.如实施方案152所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物与亲水性聚合物层的表面偶联。
164.如实施方案152所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物与流动池的内表面偶联。
165.如实施方案163所述的方法，其中所述亲水性聚合物层与流动池的内表面偶联。
166.如实施方案152所述的方法，其还包括在(c)中的对所述第一生物聚合物进行成像之后用所述光学系统的像素移位器将所述第一图像传感器移动至新位置。
167.如实施方案152所述的方法，其还包括用所述光学系统的一个或多个三带陷波滤光器排斥波长范围，其中所述三带陷波滤光器被布置在所述多个成像传感器与所述一种或多种生物聚合物之间的所述光路中。
168.如实施方案152所述的方法，其中所述光学系统具有1x的缩减。
169.如实施方案152所述的方法，其中所述光学系统具有大于4mm2的视场(FOV)。
170.如实施方案152所述的方法，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)。
171.如实施方案166所述的方法，其中所述NA是0.25。
172.如实施方案165所述的方法，其还包括用所述多个成像传感器捕获所述FOV。
173.如实施方案152所述的方法，其中所述方法不包括：
(a)用二向色元件进行成像；
(b)使用镜筒透镜；
(c)使用校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路；
(d)自动聚焦；
(e)使用激光器；或
(f)(a)至(e)的任何组合。
174.如实施方案152所述的方法，其中(c)和(d)中的每一个中的所述成像在0.1秒或更短时间内进行。
175.如实施方案28所述的方法，其中(c)中的所述成像和(d)中的所述成像在0.2秒或更短时间内进行。
176.如实施方案154所述的方法，其中(c)至(e)中的每一个中的所述成像在0.1秒或更短时间内进行。
177.如实施方案30所述的方法，其中(c)中的所述成像、(d)中的所述成像和(e)中的所述成像在0.3秒或更短时间内进行。
178.如实施方案152所述的方法，其中(c)中的所述成像在(d)中的照射之前进行。
179.如实施方案154所述的方法，其中(c)至(e)中的所述照射顺序进行。
180.如实施方案152所述的方法，其中(c)中的所述照射包括脉冲开启和关闭所述第一光源，并且(d)中的所述照射包括脉冲开启和关闭所述第二光源。
181.如实施方案180所述的方法，其中所述脉冲开启和关闭所述第一光源在与所述脉冲开启和关闭所述第二光源的不同时间进行。
182.如实施方案155或159所述的方法，其还包括将误差校正算法应用于所述合成图像以减少系统偏差。
183.如实施方案152所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物包含一个或多个核酸序列。
184.如实施方案152所述的方法，其还包括重复(c)至(d)以鉴定所述一个或多个核酸序列。
181.一种系统，其包括：
流动池；和
光学系统，所述光学系统包括：
被配置为将第一光引导至所述流动池的多个光源；
被配置为(i)从所述流动池接收第二光并且(ii)传送第三光的多带陷波滤光器，其中所述第三光不同于所述第二光；和
被配置为从所述多带陷波滤光器接收所述第三光的多个成像传感器。182.如实施方案181所述的系统，其中所述流动池包括一个或多个内表面，所述内表面具有与其偶联的亲水性聚合物层。
183.如实施方案182所述的系统，其中所述流动池还包括与所述亲水性聚合物层偶联的多种生物聚合物。
184.如实施方案182所述的系统，其中所述亲水性聚合物层包含聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。
185.如实施方案181所述的系统，其中所述光学系统还包括像素移位器。
186.如实施方案181所述的系统，其中所述多带陷波滤光器包括三带陷波滤光器。
187.如实施方案181所述的系统，其中所述光学系统还包括布置在所述多带陷波滤光器与所述流动池之间的所述光路中的成像光学器件。
188.如实施方案187所述的系统，其中所述成像光学器件具有包括1x的缩减。
189.如实施方案181所述的系统，其中所述光学系统具有包括大于1mm2的视场(FOV)。
190.如实施方案181所述的系统，其中所述光学系统具有包括小于0.6的数值孔径(NA)。
191.如实施方案190所述的系统，其中所述NA包括约0.25。
192.如实施方案181所述的系统，其中所述多个成像传感器被配置为捕获所述FOV。
193.如实施方案181所述的系统，其中所述多个光源包括：
被配置为发射在第一波长范围内的光的第一光源；
被配置为发射在第二波长范围内的光的第二光源；和
被配置为发射在第三波长范围内的光的第三光源，其中所述第一波长范围、所述第二波长范围和所述第三波长范围是不同的波长范围。
194.如实施方案193所述的系统，其中由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团。
195.如实施方案193所述的系统，其中：
由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团；并且
由所述第二光源的所述第二波长范围激发的所述第二荧光团不同于由所述第三光源的所述第三波长范围激发的第三荧光团。
196.如实施方案195所述的系统，其中由所述第三光源的所述第三波长范围激发的所述第三荧光团不同于由所述第一光源的所述第一波长范围激发的所述第一荧光团。
197.如实施方案193所述的系统，其中所述第一光源的所述第一波长范围包括在约500至约540纳米(nm)之间。
198.如实施方案193所述的系统，其中所述第二光源的所述第二波长范围包括在约620至约640nm之间。
199.如实施方案193所述的系统，其中所述第三光源的所述第三波长范围包括在约460至约500nm之间。
200.如实施方案181所述的系统，其中所述流动池包括内表面，所述内表面包括多个离散区域，其中(i)所述多个离散区域中的第一离散区域包括在所述第一离散区域处与所述内表面偶联的第一组的核酸分子，并且(ii)所述多个离散区域中的第二离散区域包括在所述第二离散区处与所述内表面偶联的第二组的所述核酸分子，其中所述第一组的所述核酸分子不同于所述第二组的所述核酸分子。
201.如实施方案200所述的系统，其中所述第一组的所述核酸分子包含与其偶联的第一荧光团，并且所述第二组的所述核酸分子包含与其偶联的第二荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团。
202.如实施方案201所述的系统，其中所述多个离散区域中的第三离散区域包括在所述第三离散区域处与所述内表面偶联的第三组的所述核酸分子，并且其中所述第三组的所述核酸分子不同于所述第一组和所述第二组的所述核酸分子。
203.如实施方案202所述的系统，其中所述第三组的所述核酸分子包含与其偶联的第三荧光团，其中所述第三荧光团不同于第二第一荧光团和所述第二荧光团。
204.如实施方案203所述的系统，其中所述多个离散区域中的第四离散区域包括在所述第四离散区域处与所述内表面偶联的第四组的核酸分子，并且其中所述第四组的核酸分子包含所述第一荧光团和所述第三荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第三荧光团。
205.如实施方案181所述的系统，其中所述流动池包括弯曲基底。
206.如实施方案181所述的系统，其中所述光学系统包括像素移位器，并且任选地，其中所述像素移位器包括多个棱镜或可移动透镜。
207.如实施方案181所述的系统，其中所述光学系统不包括：
(a)二向色元件；
(b)镜筒透镜；
(c)校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路；
(d)自动聚焦元件；
(e)激光器；或
(f)(a)至(e)的任何组合。
208.如实施方案181所述的系统，其中所述流动池布置在所述多个光源与所述多个成像传感器之间。
209.一种方法，其包括：
(a)提供光学系统，所述光学系统包括(i)多个光源、(ii)多带陷波滤光器和(iii)多个成像传感器；
(b)使用所述多个光源将第一光引导至流动池；
(c)在(b)之后，使用所述多带陷波滤光器来(i)从所述流动池接收第二光并且(ii)传送第三光，其中所述第三光不同于所述第二光；以及
(d)使用所述多个成像传感器来从所述多带陷波滤光器接收所述第三光。
210.如实施方案209所述的方法，其中所述流动池包括一个或多个内表面，所述内表面具有与其偶联的亲水性聚合物层。
211.如实施方案209所述的方法，其中所述流动池还包括与所述亲水性聚合物层偶联的一种或多种生物聚合物。
212.如实施方案211所述的方法，其还包括：
(e)在足以使所述一种或多种生物聚合物中的第一生物聚合物与多种荧光团中的第一荧光团结合的条件下，使所述一种或多种生物聚合物与所述多种荧光团接触；和
(f)用所述光学系统对所述第一生物聚合物进行成像，其中所述成像包括(i)用所述第一光照射所述第一生物聚合物，从而激发所述第一荧光团并发射所述第二光，(ii)用所述多带陷波滤光器过滤所述第二光，和(ii)用所述多个成像传感器中的第一成像传感器获取所述第一生物聚合物的第一图像。
213.如实施方案212所述的方法，其还包括：
(g)在足以使所述一种或多种生物聚合物中的第二生物聚合物与所述多种荧光团中的第二荧光团结合的条件下，使所述一种或多种生物聚合物与所述多种荧光团接触，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团；和
(h)用所述光学系统对所述第二生物聚合物进行成像，其中所述成像包括(i)用所述第四光照射所述第二生物聚合物，从而激发所述第二荧光团并发射第五光，(ii)用所述多带陷波滤光器过滤所述第五光，和(ii)用所述多个成像传感器中的第二成像传感器获取所述第二生物聚合物的第二图像。
214.如实施方案213所述的方法，其还包括将所述第一图像和所述第二图像组合成合成图像。
215.如实施方案214所述的方法，其还包括鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的单元，包括分析所述合成图像的第一感兴趣区域(ROI)以检测由所述第一荧光团发射的第一信号。
216.如实施方案214所述的方法，其还包括鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第二荧光团发射的第二信号。
217.如实施方案214所述的方法，其还包括：
(e)鉴定由所述第一荧光团结合的所述第一生物聚合物的第一单元，包括分析所述合成图像的第一ROI以检测由所述第一荧光团发射的第一信号；和
(f)鉴定由所述第二荧光团结合的所述第二生物聚合物的第二单元，包括分析所述合成图像的第二ROI以检测由所述第一荧光团发射的第二信号。
218.如实施方案211-217中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物包括一种或多种核酸分子、多肽、蛋白质或其组合。
219.如实施方案212所述的方法，其还包括在(f)中的对所述第一生物聚合物进行成像之后用所述光学系统的像素移位器将所述多个成像传感器中的所述第一成像传感器移动至新位置。
220.如实施方案209所述的方法，其还包括用所述光学系统的三带陷波滤光器排斥不需要的波长范围，其中所述三带陷波滤光器被布置在所述多个成像传感器与所述流动池之间的所述光路中。
221.如实施方案209所述的方法，其中所述光学系统具有1x的缩减。222.如实施方案209所述的方法，其中所述光学系统具有大于4mm2的视场(FOV)。
223.如实施方案209所述的方法，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)。
224.如实施方案223所述的方法，其中所述NA是0.25。
225.如实施方案224所述的方法，其还包括用所述多个成像传感器捕获所述FOV。
226.如实施方案209所述的方法，其中所述方法不包括：
(a)用二向色元件进行成像；
(b)使用镜筒透镜；
(c)使用校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路；
(d)自动聚焦；
(e)使用激光器；或
(f)(a)至(e)的任何组合。
227.如实施方案209所述的方法，其中进行(b)至(f)在0.1秒或更短时间内进行。
228.如实施方案227所述的方法，其中进行(b)至(h)在0.2秒或更短时间内进行。
229.如实施方案227所述的方法，其中(f)中的所述成像在(h)中的所述成像之前进行。
230.如实施方案209所述的方法，其中(b)的所述使用所述多个所述光源来将所述第一光引导至所述流动池包括在0.1秒或更短时间内脉冲开启和关闭所述第一光。
231.如实施方案209所述的方法，其还包括将误差校正算法应用于所述合成图像以减少系统偏差。
232.如实施方案209所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物包含一个或多个核酸序列。
233.如实施方案209所述的方法，其中所述一种或多种生物聚合物包含一个或多个核酸序列，并且所述方法还包括重复(a)至(f)以鉴定所述一个或多个核酸序列中的核酸碱基类型。
234.一种系统，其包括：
弯曲基底；和
包括光源的光学系统，其中所述光源被配置为将来自所述光源的光引导至所述弯曲基底。
235.一种系统，其包括：
表面；和
光学系统，其中所述光学系统被配置为对所述表面的至少约5平方毫米(mm2)的区域进行成像。
236.如实施方案235所述的系统，其中所述光学系统被配置为同时对所述区域进行成像。
237.如实施方案235所述的系统，其中所述光学系统包括多个子光学系统。
238.如实施方案238所述的系统，其中所述多个子光学系统被配置为平行地对所述表面的所述区域进行成像。
239.如实施方案235所述的系统，其中所述光学系统包括被配置为提供光束的光源和透镜，其中所述透镜被配置为将来自所述光源的所述光束聚焦到包括所述区域的所述基底的聚焦区域上。
240.如实施方案239所述的系统，其中所述光束在所述聚焦区域上的均匀性为至少约90％。
241.如实施方案239所述的系统，其中所述表面的所述区域被布置为中空圆柱体。
242.如实施方案235所述的系统，其中所述表面是毛细管流动池的至少一部分。
243.如实施方案242所述的系统，其中所述毛细管流动池包括实心。244.如实施方案235所述的系统，其还包括台，其中所述表面布置在所述台上。
245.如实施方案244所述的系统，其中所述台包括倾斜台、旋转台、平移台或其任何组合。
246.如实施方案235所述的系统，其中所述表面包括与其偶联的亲水性聚合物。
247.如实施方案246所述的系统，其中所述至少一个结合部分与所述亲水性聚合物偶联。
248.如实施方案246所述的系统，其中所述亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。
249.如实施方案235所述的系统，其中所述系统具有至多约0.6的数值孔径。
250.如实施方案249所述的系统，其中所述数值孔径为至多约0.25。
251.如实施方案235所述的系统，其还包括成像传感器，所述成像传感器被配置为在所述引导至所述表面之后收集所述光。
252.如实施方案235所述的系统，其还包括被配置为加热所述表面的加热器。
253.如实施方案252所述的系统，其中所述加热器是集成加热器。
254.如实施方案252所述的系统，其中所述加热器是红外加热器。
255.如实施方案235所述的系统，其中所述表面是弯曲表面。
256.如实施方案255所述的系统，其中所述弯曲表面具有25微米(μm)的平坦度偏差。
257.如实施方案256所述的系统，其中所述弯曲表面具有大于所述光学系统的焦深的平坦度偏差。
258.如实施方案235所述的系统，其中所述光学系统被配置为以约1μm或更小的分辨率对所述表面的所述区域进行成像。
259.一种方法，其包括：
(a)提供包括流动池和光源的系统，其中所述流动池在所述流动池的一侧上用第一捕获探针进行功能化，其中所述第一捕获探针与分析物偶联，并且其中所述分析物与核苷酸缀合物偶联，所述核苷酸缀合物包含核心、与其偶联的多个核苷酸部分以及与所述核心偶联的一个或多个可检测标记；
(b)使用所述光源照射所述流动池的所述第一侧，其中所述照射包括将来自所述光源的光引导通过第一聚焦元件和第二聚焦元件，其中所述第一聚焦元件在外壳内相对于所述第二聚焦元件移动，而不相对于光路移动所述外壳；以及
(c)检测来自所述流动池的所述流动池的所述第一侧的光学信号。
260.如实施方案259所述的方法，其还包括在所述流动池的第二侧上的第二捕获探针，其中所述第一侧和所述第二侧彼此相对布置，其中所述第二捕获探针对于所述一种或多种分析物具有结合亲和力，并且其中所述照射包括将所述光导向所述流动池的所述第二侧，并且其中所述光信号另外从所述流动池的所述第二侧生成。
261.如实施方案259所述的方法，其中对所述第一侧和所述第二侧进行成像通过所述第一聚焦元件的移动来进行。
262.如实施方案259所述的方法，其中所述一种或多种分析物包括一种或多种核酸分子。
263.如实施方案262所述的方法，其中所述核苷酸缀合物包括多种核酸分子。
264.如实施方案259所述的方法，其还包括将包含一种或多种分析物的溶液引导通过所述流动池并与所述第一捕获探针接触
265.一种系统，其包括：
流动池，所述流动池包括在所述流动池的第一壁上的第一捕获探针；多种分析物，其中所述多种分析物中的第一分析物与所述第一捕获探针结合；
多种多价分子，其中包含核心、与其偶联的多个核苷酸部分和与所述核心偶联的一个或多个可检测标记的至少第一核苷酸缀合物被配置为与所述第一分析物结合；和
包括光源的光学系统，其中所述光学系统被配置为将来自所述光源的光引导至所述流动池以检测与所述第一核苷酸缀合物相关联的信号，其中所述信号至少部分地通过使用第一聚焦元件和第二聚焦元件来检测，其中所述第一聚焦元件被配置为在外壳内相对于所述第二聚焦元件移动，而不相对于光路移动所述外壳。
266.如实施方案265所述的系统，其中所述分析物包括核酸分子。
267.如实施方案265所述的系统，其中在不相对于所述光学系统移动所述流动池的情况下检测来自所述第一壁和所述第二壁的所述信号。
268.如实施方案265所述的系统，其中所述流动池包括在所述流动池的第二壁上的第二捕获探针，其中所述第一壁和所述第二壁布置在所述流动池的相对侧上。
269.如实施方案268所述的系统，其中所述多种分析物中的第二分析物与所述第二捕获探针结合。
270.如实施方案269所述的系统，其还包括包含核心、与其偶联的多个核苷酸部分和与所述核心偶联的一个或多个可检测标记的第二核苷酸缀合物，所述第二核苷酸缀合物被配置为与所述第二分析物结合。271.如实施方案270所述的系统，其中所述光学系统被配置为检测与所述第二核苷酸缀合物相关联的信号。
272.一种方法，其包括：
(a)提供包括流动池和被配置为照射所述流动池的系统，所述流动池包括非平坦表面，其中所述流动池在所述流动池的一侧上用第一捕获探针进行功能化；
(b)引导包含一种或多种分析物的溶液，其中所述第一捕获探针；
(c)引导包含核苷酸缀合物的溶液，所述核苷酸缀合物包含核心、与其偶联的多个核苷酸部分和与所述核心偶联的一个或多个可检测标记，所述核苷酸缀合物被配置为与所述一种或多种分析物的至少一部分结合；
(d)使用所述光源照射所述流动池的所述第一侧；以及
(e)检测来自所述流动池的所述流动池的所述第一侧的光学信号。
273.如实施方案272所述的方法，其还包括在所述流动池的第二侧上的第二捕获探针，其中所述第一侧和所述第二侧彼此相对布置，其中所述第二捕获探针对于所述一种或多种分析物具有结合亲和力，并且其中所述照射包括将所述光导向所述流动池的所述第二侧，并且其中所述光信号另外从所述流动池的所述第二侧生成。
274.如实施方案272所述的方法，其中所述非平坦表面是圆形表面，并且其中所述圆形表面包括所述第一侧和所述第二侧。
275.如实施方案272所述的方法，其中所述一种或多种分析物包括一种或多种核酸分子。
276.如实施方案275所述的方法，其中所述核苷酸缀合物包括多种核酸分子。
277.一种系统，其包括：
流动池，所述流动池包括非平坦表面和在所述流动池的第一壁上的第一捕获探针；
多种分析物，其中所述多种分析物中的第一分析物与所述第一捕获探针结合；
多种多价分子，其中包含核心、与其偶联的多个核苷酸部分和与所述核心偶联的一个或多个可检测标记的至少第一核苷酸缀合物被配置为与所述第一分析物结合；和
包括光源的光学系统，其中所述光学系统被配置为将来自所述光源的光引导至所述流动池以检测与所述第一核苷酸缀合物相关联的信号。
278.如实施方案277所述的系统，其中所述流动池是圆形的，并且其中所述第一壁和所述第二壁是所述圆形流动池的至少一部分。
279.如实施方案277所述的系统，其中所述分析物包括核酸分子。
280.如实施方案277所述的系统，其中所述流动池包括在所述流动池的第二壁上的第二捕获探针，其中所述第一壁和所述第二壁布置在所述流动池的相对侧上。
281.如实施方案277所述的系统，其中所述多种分析物中的第二分析物与所述第二捕获探针结合。
282.如实施方案281所述的系统，其还包括包含核心、与其偶联的多个核苷酸部分和与所述核心偶联的一个或多个可检测标记的第二核苷酸缀合物，所述第二核苷酸缀合物被配置为与所述第二分析物结合。
283.如实施方案282所述的系统，其中所述光学系统被配置为检测与所述第二核苷酸缀合物相关联的信号
实施例
这些实施例仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1-用于基因组学应用的荧光成像模块的设计规格
在表2中提供了本公开的荧光成像模块的设计规格的非限制性实例。
表2.用于基因组学应用的荧光成像模块的设计规格的实例。
实施例2-玻璃微流体流动池装置的制造
用作流动池的微流体装置的晶片级制造可以由例如一层、两层或三层玻璃，例如硼硅酸盐玻璃、熔融二氧化硅玻璃或石英构成，使用图36A-图36C中所示的处理方法之一和诸如聚焦飞秒激光光烧蚀和/或激光玻璃结合的处理技术。
在图36A中，用激光器(例如，产生飞秒激光辐射的激光器)处理第一晶片，以烧蚀晶片材料并提供图案化表面。图案化的晶片表面可以包括多个微流体装置(例如，12个装置/210mm直径的晶片)，每个微流体装置可以包括多个流体通道。然后，可以对经处理的晶片进行切割，以产生包括开放流体通道的单独微流体芯片，所述通道可以任选地随后被密封，例如，通过用膜密封或通过将装置夹持到另一个载体表面。
在图36B中，对第一晶片进行处理以产生图案化表面，所述图案化表面然后可以被放置成与第二晶片接触并结合到第二晶片以密封流体通道。根据所使用的材料，例如玻璃晶片、硅晶片等，可以使用例如热结合工艺、阳极结合工艺、激光玻璃结合工艺等来进行结合。第二晶片覆盖和/或密封具有图案化表面的晶片上的凹槽、凹陷和/或孔，以在两个晶片部件的界面处形成装置的流体通道和/或流体室(例如，内部)。然后可以将结合的结构切成单独的微流体芯片，例如，12个微流体芯片/210mm直径的晶片。
在图36C中，对第一晶片进行处理以产生流体通道的图案，所述流体通道被切割或蚀刻通过晶片的整个厚度(例如，在晶片的任一表面上开口)。然后将第一晶片夹在一侧上的第二晶片与另一侧上的第三晶片之间并与其结合。根据所使用的材料，例如玻璃晶片、硅晶片等，可以使用例如热结合工艺、阳极结合工艺、激光玻璃结合工艺等来进行结合。第二和第三晶片覆盖和/或密封第一晶片中的凹槽、凹陷和/或孔，以形成装置的流体通道和/或流体室(例如，内部)。然后可以将结合的结构切成单独的微流体芯片，例如，12个微流体芯片/210mm直径的晶片。
实施例3-用亲水性聚合物涂层涂覆流动池表面
通过用KOH洗涤制备的玻璃通道，接着用乙醇漂洗，然后在65℃下硅烷化30分钟来涂覆玻璃流动池装置。将流体通道表面用EDC-NHS激活30min.，接着通过将激活表面用5μm引物温育20min.来接枝寡核苷酸引物，然后用30μm氨基封端的聚乙二醇(PEG-NH2)钝化。
遵循以上所述的方法制备多层表面，其中在PEG-NH2钝化步骤之后，使多臂PEG-NHS流动通过流体通道，接着再次添加PEG-NH2，任选地接着用PEG-NHS进行另一次温育，并且任选地接着用多臂PEG-NH2进行另一次温育。对于这些表面，可以在任何步骤接枝引物，尤其是在最后一次添加多臂PEG-NH2之后。
实施例4-用于核酸测序的流动池装置
图37A说明了一件式玻璃微流体芯片/流动池设计的非限制性实例。在这种设计中，可以使用例如聚焦飞秒激光辐射来制造流体通道和入口/出口孔。在流动池装置中有两个流体通道(“泳道”)，并且每个流体通道各自包括例如2行26帧(例如，其中“帧”是相当于对应成像模块的视场的图像区域)，使得平铺2x 26＝52个图像足以对整个流体通道进行成像。流体通道可以具有例如约100μm的深度。流体通道1具有入口孔A1和出口孔A2，并且流体通道2具有入口孔B1和出口孔B2。流动池装置还可以包括1D线性、人可读和/或机器可读条形码以及任选地2D矩阵条形码。
图37B说明了两件式玻璃微流体芯片/流动池设计的非限制性实例。在这种设计中，可以使用例如聚焦飞秒激光光烧蚀或光刻和化学蚀刻工艺来制造流体通道和入口/出口孔。2个部件可以使用如上所述的各种技术中的任一种来结合在一起。入口孔和出口孔可以定位在结构的顶层上并且以一种方式取向，使得它们与在装置的内部中形成的流体通道和/或流体室中的至少一个流体连通。在流动池装置中有两个流体通道，并且与图37A中所示的装置一样，每个流体通道包括例如2行，每行具有26帧。流体通道可以具有例如约100μm的深度。流体通道1具有入口孔A1和出口孔A2，并且流体通道2具有入口孔B1和出口孔B2。流动池装置还可以包括1D线性、人可读和/或机器可读条形码以及任选地2D矩阵条形码。
图37C说明了三件式玻璃微流体芯片/流动池设计的非限制性实例。在这种设计中，可以使用例如聚焦飞秒激光光烧蚀或光刻和化学蚀刻工艺来制造流体通道和入口/出口孔。3个部件可以使用如上所述的各种技术中的任一种来结合在一起。然后可以将第一晶片(包括贯穿模式的流体通道或流体室)夹在一侧上的第二晶片与另一侧上的第三晶片之间并与其结合。入口孔和出口孔可以定位在结构的顶层上并且以一种方式取向，使得它们与在装置的内部中形成的流体通道和/或流体室中的至少一个流体连通。在流动池装置中有两个流体通道，并且与图37A和图37B中所示的装置一样，每个流体通道具有2行，每行具有26帧。流体通道可以具有例如约100μm的深度。流体通道1具有入口孔A1和出口孔A2，并且流体通道2具有入口孔B1和出口孔B2。流动池装置还可以包括1D线性、人可读和/或机器可读条形码以及任选地2D矩阵条形码。
实施例5-毛细管流动池中核酸簇的成像
在毛细管内建立核酸簇并进行荧光成像。使用具有毛细管的流动装置进行测试。所得的簇图像的实例在图38中呈现。所述图表明，通过在如本文公开的毛细管流动池装置的管腔内扩增形成的核酸簇可以可靠地形成和可视化。
实施例6-塑料样品载体结构
在一些情况下，所公开的样品载体结构可以由聚合物制造。可以由其制造样品载体结构(例如，毛细管流动池装置)的材料的实例包括但不限于聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环状烯烃聚合物(COP)、环状烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或其任何组合。还预期构成玻璃和塑料基底两者的各种组合物。
用于本文公开的表面涂覆目的的聚合物表面的改性涉及制备与包括胺的其他化学基团(-R)反应的表面。当在适当的基底上制备时，这些反应性表面可以在室温下长期储存，例如，在一些情况下储存至少3个月或更长时间。此类表面还可以用R-PEG和R-引物寡聚物接枝，用于核酸的表面上扩增，如本文其他地方所述。塑料表面，诸如环烯烃聚合物(COP)，可以使用本领域已知的各种方法中的任一种进行改性。例如，它们可以用钛蓝宝石激光烧蚀、UV介导的乙二醇甲基丙烯酸酯光接枝、等离子体处理或机械搅拌(例如，喷砂处理或抛光等)进行处理，以产生亲水性表面，所述表面可以对各种化学基团(诸如胺)保持数月的反应性。然后，这些基团可以允许钝化聚合物诸如PEG或生物分子诸如DNA或蛋白质的缀合，而不损失生物化学活性。例如，DNA引物寡聚物的附接允许DNA在钝化的塑料表面上扩增，同时减少或最小化蛋白质、荧光团分子或其他疏水性分子的非特异性吸附。
另外，在一些情况下，表面改性可以与例如激光打印或UV掩模相结合，以产生图案化表面。这允许DNA寡聚物、蛋白质或其他部分的图案化附接，从而提供基于表面的酶促活性、结合、检测或处理。例如，DNA寡聚物可以用于仅在图案化特征内扩增DNA，或以图案化方式捕获扩增的长DNA多联体。在一些实施方案中，可以在能够与基于溶液的基底反应的图案化区域中产生酶岛。因为塑料表面尤其适用于这些处理模式，所以在如本文设想的一些实施方案中，塑料样品载体表面或流动池装置可以被认为是特别有利的。
此外，塑料可以进行注射成型、压花、压模或3D打印以形成任何形状，包括微流体装置，比玻璃基底容易得多，并且因此可以用于产生用于多种配置中的生物样品的结合和分析的表面，例如，用于生物标志物检测或DNA测序的样品到结果微流体芯片。
当用荧光标记探测时，可以在改性的塑料表面上进行特异性和局部DNA扩增，以产生具有超高对比度噪声比和非常低背景的核酸点。
可以制备具有胺-引物和胺-PEG的亲水性和胺反应性环烯烃聚合物表面，并且所述表面已被证明支持滚环扩增。当用荧光团标记的引物探测时，或者当通过聚合酶将标记的dNTP添加到杂交引物中时，观察到DNA扩增子的亮点，其表现出大于100的信噪比，背景极低，指示高度特异性扩增，以及超低水平的非特异性蛋白和疏水性荧光团结合，这是诸如基于荧光的DNA测序仪的系统所需的高准确性检测的标志。
实施例7-使用结构化照射成像系统进行成像的实例
结构化照射成像系统4100，诸如图41中所示的非限制性实例，可以与包括低非特异性结合表面的流动池4187组合使用，以进行核酸测序。靶核酸序列以高表面密度与附接至在流动池4187内部上的低非特异性结合表面4188的衔接子/引物序列杂交，并使用专门为所述表面配制的杂交和扩增缓冲液进行克隆扩增，以增强特异性杂交和扩增率。
将流动池4187安装在结构化照射成像系统4100中，并且启动测序反应循环，所述测序反应循环包括使用例如以上所述的核苷酸缀合物化学和图40中所示的工作流程。如果核苷酸缀合物的核苷酸部分与靶序列的核苷酸互补，则将荧光标记的核苷酸缀合物引入流动池4187中并与表面4188接触以形成多价结合复合物。然后冲洗掉过量的未结合的核苷酸缀合物。
对于每个检测步骤，使用衍射光栅(例如，4130A)的不同取向在照射光路的至少一个分支中并且在光学相位调制器(例如，4140A)的几个不同位置处捕获表面4188的一系列图像，以将照射光条纹图案投影到表面4188上。在图像采集之后，使用图像重建算法处理所述系列图像，以生成比单独使用衍射受限光学器件可实现的图像更高分辨率的图像。可以对表面4188上的几个位置重复所述过程，以产生流动池内表面的平铺图像。任选地，可以调整焦平面，并且可以重复所述过程以生成第二流动池内表面4189的更高分辨率图像。
高对比度噪声比图像(使用所公开的具有多重标记核苷酸缀合物测序化学的低结合表面实现)和对使用结构化照射成像系统获取的相对少量的图像进行有效处理来以超分辨率对流动池表面进行成像(从而能够使用更高表面密度的靶序列簇)的组合可以有助于更高的总测序通量。
实施例8-使用多重复用读磁头进行双表面成像的实例
诸如图44A和图44B中示意性示出的多重复用读磁头被设计成进行双表面成像。读磁头包括多个显微荧光计，所述显微荧光计被组装成使得它们相对于彼此保持在固定位置，并且可以在与一对相对的流动池内表面水平的方向上被扫描以获取每个表面的条带的图像。如图44A中所示，多个显微荧光计的第一子集被配置为获取第一流动池内表面的图像，并且多个显微荧光计的第二子集被配置为获取面向第一内表面并且与第一内表面分隔开中间流体通道的厚度的第二流动池内表面的图像。在一些情况下，水平方向可以平行于流动池。在一些情况下，竖直方向可以与流动池垂直或正交。
使用包括低非特异性结合表面涂层的流动池进行核酸测序。靶核酸序列与附接至在流动池内部上的低非特异性结合表面的衔接子/引物序列杂交，并使用专门为所述表面配制的杂交和扩增缓冲液进行克隆扩增，以增强特异性杂交和扩增率。
将流动池安装在包括多重复用读磁头的成像系统中，并且启动测序反应循环，所述测序反应循环包括使用例如以上所述的核苷酸缀合物化学和图40中所示的工作流程。如果核苷酸缀合物的核苷酸部分与靶序列的核苷酸互补，则将荧光标记的核苷酸缀合物引入流动池中并与内表面接触以形成多价结合复合物。然后冲洗掉过量的未结合的核苷酸缀合物。
对于每个检测步骤，在平行于流动池的内表面的至少一个方向上扫描多重复用读磁头(或者可以相对于多重复用读磁头扫描流动池)，并且同时获取第一和第二流动池内表面的图像，如图44B中所示，同时自动聚焦机构维持多重复用读磁头的物镜与至少一个流动池内表面之间的适当工作距离。
使用流动池的单程扫描同时对两个流动池表面进行成像的能力(取决于读磁头的设计)可以提供测序通量的显著改善。
实施例9-使用光学系统的实例
此实施例的目的是证明使用如本文所述的光学系统对核酸序列进行测序。这种光学系统由于减少的光学部件、更少的移动部分和更高的通量而为核酸测序应用提供了额外的优点和实用性。
在此实施例中，通过液体处理系统4514将样品4515递送至流动池4521的疏水垫4516，如图45中所示。通过真空泵4518将样品4515吸入流动池4521的内部通道4517中。样品中存在的核酸序列与附接至流动池4521的内部通道4517的壁的引物反应。然后对样品的核酸序列进行扩增和洗涤。在扩增和洗涤之后，将溶液引入流动池4521中并使其与引发的核酸序列反应，所述溶液含有：(1)与A核苷酸互补的DAPI修饰的核苷酸缀合物；(2)与G核苷酸互补的FITC修饰的核苷酸缀合物；(3)与C核苷酸互补的TRITC修饰的核苷酸缀合物；以及(4)用与T核苷酸互补的DAPI和TRITC两者修饰的第四核苷酸缀合物。然后将流动池4521中的样品经由第一LED光源4522通过0.1秒的UV-蓝光脉冲照射，从而激发DAPI荧光团。与UV-蓝光脉冲同步，成像传感器获取第一图像，所述第一图像捕获由与样品特异性结合的任何DAPI修饰的核苷酸缀合物发出的光发射。只有DAPI荧光发射的光被成像传感器收集，因为第一光源发射的UV-蓝色激发光在405nm之后是可忽略不计的。此光被具有432nm、517nm和615nm的多带中心波长的三带带通滤光器(Edmund Scientific库存#87-236)阻挡。对于此滤光器，带宽在432nm下是36，在517nm下是23并且在615nm下是61。接下来，经由能够激发FITC荧光团的第二LED光源4523，用0.1秒的绿光对样品进行脉冲。与绿光脉冲同步，获取第二图像，所述第二图像捕获由与样品特异性结合的FITC修饰的核苷酸缀合物发出的光发射。然后可以经由第三LED光源4524，用0.1秒的红光对样品进行脉冲，从而激发TRITC荧光团。与红光脉冲同步，获取第三图像，所述第三图像捕获由与样品特异性结合的任何TRITC修饰的核苷酸缀合物发出的光发射。在此实施例中，激发滤光器用于每个LED光源，以使荧光通道串扰，或激发光渗入三带带通滤光器的发射带通(凹口)中最小化。
在此实施例中，如图46中示意性地示出的碱基判定过程4602如下。针对显示强荧光信号的感兴趣区域(ROI)来分析循环的第一图像。在第一图像中显示强荧光信号的ROI指示在暴露于核苷酸缀合物之前在开放位置处存在具有A或T的核酸扩增子，原因如下。第一图像的捕获与通过UV-蓝光进行的样品照射同步，从而激发DAPI。由于与A互补的核苷酸缀合物用DAPI标记并且与T互补的核苷酸缀合物用DAPI和TRITC两者标记，所以显示强荧光的第一图像的ROI指示A或T。接下来，针对显示强荧光信号的ROI来分析循环的第二图像。由于与G互补的核苷酸缀合物用FITC标记，并且由于第二图像的捕获与能够激发FITC的绿色脉冲同步，所以第二图像中显示强荧光信号的ROI指示G。接下来，针对显示强荧光信号的ROI来分析循环的第三图像。这些ROI指示在暴露于核苷酸缀合物之前在开放位置处存在具有C或T的核酸扩增子。这是因为与第三图像的捕获同步，将样品用红光照射，从而激发TRITC。与C互补的核苷酸缀合物用TRITC标记，并且与T互补的核苷酸缀合物用DAPI和TRITC两者标记。在第一和第三图像中观察到的具有强荧光信号的ROI指示在暴露于核苷酸缀合物之前在开放位置处具有T核苷酸。然后含有T的ROI的鉴定允许鉴定含有A和C的ROI。重复测序和成像循环，直至已经鉴定到整个核酸序列。
实施例10-使用超分辨率增强光学系统的实例
此实施例的目的是证明使用如本文所述的超分辨率增强光学系统对核酸序列进行测序。这种系统由于减少的光学部件、更少的移动部分和更高的通量而为核酸测序应用提供了额外的优点和实用性，同时提供超高分辨率读出。
在此实施例中，将样品递送至毛细管流动池5201，如图53A和图53B中所示。包含样品中存在的核酸序列的样品位点4902与附接至毛细管流动池5201的内部通道的壁的引物反应。然后对样品的核酸序列进行扩增和洗涤。在扩增和洗涤之后，将溶液引入毛细管流动池5201中并使其与引发的核酸序列反应，所述溶液含有：(1)与A核苷酸互补的DAPI修饰的核苷酸缀合物；(2)与G核苷酸互补的FITC修饰的核苷酸缀合物；(3)与C核苷酸互补的TRITC修饰的核苷酸缀合物；以及(4)用与T核苷酸互补的DAPI和TRITC两者修饰的第四核苷酸缀合物。然后将毛细管流动池5201中的样品经由光源4901的第一LED光源通过0.1秒的UV-蓝光脉冲照射，从而激发DAPI荧光团。与UV-蓝光脉冲同步，成像传感器获取第一图像，所述第一图像捕获由与样品特异性结合的任何DAPI修饰的核苷酸缀合物发出的光发射。只有DAPI荧光发射的光被成像传感器收集，因为第一光源发射的UV-蓝色激发光在405nm之后是可忽略不计的。此光被三带带阻滤光器4910阻挡。接下来，经由能够激发FITC荧光团的光源4902的第二LED光源，用0.1秒的绿光对样品进行脉冲。与绿光脉冲同步，获取第二图像，所述第二图像捕获由与样品特异性结合的FITC修饰的核苷酸缀合物发出的光发射。经由光源4901的第三LED光源，用0.1秒的红光对样品进行脉冲，从而激发TRITC荧光团。与红光脉冲同步，获取第三图像，所述第三图像捕获由与样品特异性结合的任何TRITC修饰的核苷酸缀合物发出的光发射。在此实施例中，激发滤光器用于每个LED光源，以使荧光通道串扰，或可以不被三带带阻滤光器4910的凹口或带阻阻止的激发光渗入最小化。
楔形块4916可以包括在每个光学子系统4914中，以便对毛细管流动池5201的整个内表面进行成像。如图54A中所示，当顶部楔形件4907与底部楔形件4906对准时，光学子系统4916获取毛细管流动池的内表面的远侧上的图像。如图54B中所示，当顶部楔形件4907移出对准以增加光路长度4913时，光学子系统4916获取毛细管流动池5201的前内表面上的图像。
此实施例中的光学系统能够进行超分辨率成像，其中至少一个样品位点包含固定至多个附接的寡核苷酸分子的克隆扩增的样品核酸分子，其中所述多个固定的克隆扩增的样品核酸分子以小于λ/(2*NA)的距离存在，其中λ是激发能量源的中心波长，并且NA是成像系统的数值孔径。然后将随机光切换化学同时应用于所述克隆扩增的样品核酸分子，以通过随机光切换使所述多个克隆扩增的样品核酸分子在开启和关闭事件中发出多达四种不同颜色的荧光；并且当所述多个克隆扩增的样品核酸分子的开启和关闭事件发生时，在颜色通道中实时检测每种颜色的开启和关闭事件以确定所述克隆扩增的样品核酸分子的核苷酸的身份。
在此实施例中，如图46中示意性地示出的碱基判定过程4602如下。针对显示强荧光信号的感兴趣区域(ROI)来分析循环的第一图像。在第一图像中显示强荧光信号的ROI指示在暴露于核苷酸缀合物之前在开放位置处存在具有A或T的核酸扩增子，原因如下。第一图像的捕获与通过UV-蓝光进行的样品照射同步，从而激发DAPI。由于与A互补的核苷酸缀合物用DAPI标记并且与T互补的核苷酸缀合物用DAPI和TRITC两者标记，所以显示强荧光的第一图像的ROI指示A或T。接下来，针对显示强荧光信号的ROI来分析循环的第二图像。由于与G互补的核苷酸缀合物用FITC标记，并且由于第二图像的捕获与能够激发FITC的绿色脉冲同步，所以第二图像中显示强荧光信号的ROI指示G。接下来，针对显示强荧光信号的ROI来分析循环的第三图像。这些ROI指示在暴露于核苷酸缀合物之前在开放位置处存在具有C或T的核酸扩增子。这是因为与第三图像的捕获同步，将样品用红光照射，从而激发TRITC。与C互补的核苷酸缀合物用TRITC标记，并且与T互补的核苷酸缀合物用DAPI和TRITC两者标记。在第一和第三图像中观察到的具有强荧光信号的ROI指示在暴露于核苷酸缀合物之前在开放位置处具有T核苷酸。然后含有T的ROI的鉴定允许鉴定含有A和C的ROI。重复测序和成像循环，直至已经鉴定到整个核酸序列。
实施例11-核苷酸臂的制备
在1.5mL艾本德管(Eppendorf tube)中，将320uL的生物素-5kPEG-SVA(来自Laysan Bio)与33％ DMF混合以产生25mM浓度的生物素-5k PEG-SVA。在单独的管中，添加440uL缓冲液(0.2MNaHCO3 Na2CO3 pH 9)和200uL dGTP-PA-NH2(10mM原液，来自MyChem)，对所述管进行离心。将溶解的生物素-5k PEG SVA添加到第二管中，并在室温下温育1小时。经由离子交换色谱法对反应物进行纯化。
如下合成包含叠氮基基团的核苷酸臂。从商业来源获得FMOC N3接头。通过将一当量N3接头、一当量二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、一当量4-二甲基氨基吡啶(DMAP)与无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)在室温下混合1小时来进行NHS酯合成反应。通过在室温下使三当量NHS酯溶液与一当量炔丙基-dATP和反应缓冲液反应1小时来进行与炔丙基-胺dNTP的缀合。
实施例12-链霉亲和素核心的制备
将10mg链霉亲和素(Anaspec，目录号AS-72177)溶解在525uL新制备的1X PBS缓冲液(pH 8)中，并在4℃下以14,000rcf离心5分钟以聚集蛋白质。在吸收280nm下经由Nanodrop分析混合物的浓度，四聚体的ε＝179200M-1cm-1(假设MW＝56,000)。将混合物用水1:10稀释。
将荧光团NHS酯制备为在DMSO中的25mM原液。在5mL艾本德管中，添加DMSO和改进的1X PBS缓冲液(pH 8，具有0.01％Tween)和链霉亲和素。缓慢添加荧光团，并在室温下在黑暗中温育7小时。通过添加100uL的1M甘氨酸(pH 9)来淬灭反应。将混合物在14,000rcf、4℃下离心5分钟，并且丢弃任何沉淀物。使用Amicon Ultra-15滤光器去除未反应的荧光团。
实施例13-多价分子的制备
通过使炔丙基胺dNTP与生物素-PEG-NHS反应来制备一种类型的多价分子。将此水性反应驱动至完成并纯化以产生生物素-PEG-dNTP物质。在单独的反应中，使用几种不同的PEG长度，对应于从1K Da至20K Da变化的平均分子量。将生物素-PEG-dNTP物质与新制备的或商业来源的染料标记的链霉亲和素(SA)混合，使用大约3-5:1的染料:SA比率。生物素-PEG-dNTP与染料标记的链霉亲和素的混合在过量的生物素-PEG-dNTP存在下进行，以确保每个链霉亲和素四聚体上的生物素结合位点饱和。通过尺寸排阻色谱法从过量的生物素-PEG-dNTP中纯化完整的复合物。将具有dATP、dGTP、dCTP或dTTP核苷酸单元的每种类型的多价核苷酸单独缀合和纯化，然后混合在一起以产生用于核苷酸结合、核苷酸掺入和核酸测序反应的四碱基混合物。
通过使多臂PEG NHS与过量的染料-NH2和炔丙基胺dNTP反应来在单罐中来制备另一种类型的多价分子。使用范围为4-16个臂且分子量范围为5K Da至40K Da的各种多臂PEGNHS变体。在反应之后，通过尺寸排阻色谱法去除过量的小分子染料和dNTP。将具有dATP、dGTP、dCTP或dTTP核苷酸单元的每种类型的多价核苷酸单独缀合和纯化，然后混合在一起以产生用于核苷酸结合、核苷酸掺入和核酸测序反应的四碱基混合物。
本文描述了单罐(single pot)方法。在2mL艾本德管中，混合914.1uL水、150uL乙腈、112.5uL TEAB、51.6uL生物素化核苷酸臂和271.7uL标记的链霉亲和素核心。将混合物在室温下在黑暗中温育15分钟。用Amicon Ultra-4去除未反应的生物素化核苷酸臂。
实施例14-板上的捕获测定
进行捕获测定以确定核苷酸单元(作为多价分子的一部分)结合复合聚合酶的能力。捕获测定是在允许核苷酸单元与复合聚合酶结合但不掺入的条件下进行的。复合聚合酶包括与核酸模板分子结合的聚合酶，所述核酸模板分子与引物杂交。
用PEG-硅烷涂覆394孔板的孔。在孔中制备模板分子的单链聚合酶集落(克隆扩增的)。测序引物与聚合酶集落杂交。
使用具有3’叠氮基封闭部分的核苷酸的捕获测定：将孔用20mM TRIS pH 8.8、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、10mM MgSO4预洗涤一次。将叠氮基封闭的核苷酸在55℃下掺入在20mM TRIS pH 8.8、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、10mM MgSO4、5uM dNTP-N3、600nM聚合酶中5分钟。将孔用50mM TRIS pH 8.0、1mM EDTA pH 7.5、750mM NaCl、0.02％ Tween-20洗涤六次。
使用多价分子的捕获测定：将孔用10mM TRIS pH 8.0、0.5mM EDTA、50mM NaCl洗涤一次。通过在45℃下添加10mM TRIS pH 8.0、2M甜菜碱、1％ Triton X-100、0.48uM聚合酶、10mM CaCl2、0.5mM EDTA、100mM NaCl、20-160nM荧光标记的多价分子，持续45秒来进行捕获反应。将孔用10mM TRIS pH 8.0、2M甜菜碱、10mM CaCl2、100mM NaCl、0.5mM EDTA、1％Triton X-100洗涤5次。
使用多价分子的捕获测定适用于在多联体模板分子(例如，聚合酶集落)上形成多个亲合性复合物。例如，捕获测定包括：(a)将第一核酸引物、第一聚合酶和第一多价分子与多联体模板分子的第一部分结合，从而形成第一结合复合物，其中第一多价分子的第一核苷酸单元与第一聚合酶结合；和(b)将第二核酸引物、第二聚合酶和第一多价分子与同一多联体模板分子的第二部分结合，从而形成第二结合复合物，其中第一多价分子的第二核苷酸单元与第二聚合酶结合，其中包含相同的多价分子的第一和第二结合复合物形成第一亲合性复合物。
使用落射荧光对表面进行成像，并使用第90百分位确定信号强度。数据在图55和图56中示出。
图55中的数据显示，dA多价分子(dATP核苷酸单元)使用PA、PA11或PA23接头产生最佳信号。当携带N3接头时，dC多价分子(dCTP核苷酸单元)产生最佳信号。值得注意的是，携带PA接头的多价分子在与dA(dATP)核苷酸单元连接时产生最佳信号，然而携带相同接头和Cy5染料组合的多价化合物在与dC(dCTP)核苷酸单位连接时不能产生最佳信号。
图56中的数据显示，信号强度作为接头和浓度的函数变化。
实施例15-流动池上的捕获测定
进行捕获测定以确定核苷酸单元(作为多价分子的一部分)结合复合聚合酶的能力。捕获测定是在允许核苷酸单元与复合聚合酶结合但不掺入的条件下进行的。复合聚合酶包括与核酸模板分子结合的聚合酶，所述核酸模板分子与引物杂交。
制备携带接头-6的荧光标记的多价分子。还制备了携带N3-接头、接头-8或11原子接头(有时称为‘PA’接头)的标记多价分子。用荧光团CF680、CF532、CF570或AF647标记多价分子。
制备了携带两种不同颜色荧光团的多价分子的混合物。一种混合物含有20nM或80nM的dCTP-CF680和dUTP-CF532多价分子中的每一种。另一种混合物含有20nM或80nM的dATP-AF647和dGTP-CF570多价分子中的每一种。针对具有不同接头的多价分子制备这些混合物中的每一种：N3-接头；接头-6(A-接头)；接头-8(mAMBA-接头)；或11原子接头(也称为PA接头)。例如，第一混合物含有20nM的携带N3-接头的dCTP-CF680和dUTP-CF532多价分子。第二混合物含有20nM的携带接头-6的dCTP-CF680和dUTP-CF532多价分子。制备了十二种不同的混合物。每种混合物还含有0.1uM测序聚合酶、5mM乙酸锶、缓冲化合物、EDTA、盐、洗涤剂和粘度添加剂。将乙酸锶包括在混合物中以促进多价分子的核苷酸单元与复合聚合酶的结合而不掺入。单个复合聚合酶包括与模板分子结合的聚合酶，所述模板分子与引物杂交。
将单链多联体模板分子固定在流动池上。将模板分子与测序引物杂交。将流动池加载到测序设备中，所述测序设备被配置为将激光激发传输至流动池并从流动池获得荧光图像。
进行结合反应的重复循环。每个结合循环包括以下一般方法：使多价混合物流动并温育；洗涤；成像；和洗涤。对流动池进行预洗涤，然后与标记多价分子的混合物一起流动，并温育不同的时间长度(例如，2-180秒)。洗涤流动池。使用红色和绿色通道的落射荧光对流动池进行成像，并使用第90百分位确定信号强度。洗涤流动池。对于含有dATP-AF647和dGTP-CF570多价分子的混合物，重复结合循环62次，并且对于含有dCTP-CF680和dUTP-CF532多价分子的混合物，重复结合循环71次。
使用多价分子的捕获测定适用于在多联体模板分子(例如，聚合酶集落)上形成多个亲合性复合物。例如，捕获测定包括：(a)将第一核酸引物、第一聚合酶和第一多价分子与多联体模板分子的第一部分结合，从而形成第一结合复合物，其中第一多价分子的第一核苷酸单元与第一聚合酶结合；和(b)将第二核酸引物、第二聚合酶和第一多价分子与同一多联体模板分子的第二部分结合，从而形成第二结合复合物，其中第一多价分子的第二核苷酸单元与第二聚合酶结合，其中包含相同的多价分子的第一和第二结合复合物形成第一亲合性复合物。
在图57和图58中，N3-接头的数据为绿色，接头-分子为蓝色，接头-8分子为红色，并且11原子接头分子为紫色。
图57中的数据通常显示，多价分子的浓度为20nM或80nM，并且具有dCTP或dUTP核苷酸单元，并用CF680或CF532标记，N3-接头在所有测试的结合时间下生成最高信号强度，接头-6分子生成次高信号强度，接头-8分子生成较低信号强度，并且11原子接头分子生成最低信号强度。
图58中的数据通常显示，多价分子的浓度为20nM或80nM，并且具有dATP核苷酸单元，并用AF647标记，N3-接头在所有测试的结合时间下生成最高信号强度，接头-6分子生成次高信号强度，接头-8分子生成较低信号强度，并且11原子接头分子生成最低信号强度。
图58中的数据通常显示，多价分子的浓度为20nM或80nM，并且具有dGTP核苷酸单元，并用CF570标记，N3-接头在所有测试的结合时间下生成最高信号强度，并且接头-8分子生成最低信号强度。接头-6和11原子接头分子生成类似的信号强度，其低于N3-接头分子的强度并且高于接头-8分子的强度。
图57和图58中的数据指示，标记多价分子与复合聚合酶结合所生成的信号强度可受到接头结构、核苷酸单元、荧光团染料或其组合的影响。
实施例16-显微镜上捕获的实时成像
进行实时捕获测定以确定核苷酸单元(作为多价分子的一部分)结合复合聚合酶的结合动力学。实时捕获测定是在允许核苷酸单元与复合聚合酶结合但不掺入的条件下进行的。复合聚合酶包括与核酸模板分子结合的聚合酶，所述核酸模板分子与引物杂交。
制备了具有淬灭剂的捕获混合物，其包括：Tris HCl(pH 8.8)、EDTA(pH 7.5)、NaCl、Triton X-100、乙酸锶、蔗糖和可以用作单线态氧淬灭剂的试剂的组合。将测序聚合酶添加到捕获/淬灭剂混合物中以生成捕获/淬灭剂/酶混合物。将捕获/淬灭剂/酶混合物分成12个单独的等分试样，并且将每个等分试样与一种类型的浓度为2.5nM、7.5nM或15nM的多价分子(例如，多价分子包括核苷酸单元dATP、dGTP、dCTP或dUTP)混合，以生成12个单独的酶/多价分子混合物。用红色或绿色荧光团标记12个单独混合物中的每个混合物中的多价分子。制备不同的酶/多价分子混合物以测试和比较携带不同接头(包括接头6、10、11、12、13、14、15或16)的多价分子。
制备了具有固定的多联体模板分子的流动池。将流动池加载到测序设备中，所述测序设备被配置为将激光激发传输至流动池并从流动池获得荧光图像(例如，如本文其他地方所述的流动池、如本文其他地方所述的耦合至显微镜的流动池等)。将酶/多价分子混合物流到流动池上。在0.25秒的曝光时间内获得图像(例如，在100秒内获得400个图像)。对图像的信号强度作图并将其拟合为单相指数曲线，以确定K值以及上限和下限。结果在图59、图60和图61中示出。图60中所示的图例也适用于图59中的数据。
实施例17-亲合力测序系统
图62大体上示出了根据一些实施方案的组合亲合力测序系统的实例。系统可以包括流动池5901。流动池可以如本文其他地方所述(例如，实施例16的流动池)。如本文其他地方所述，流动池可以被配置为在基底5904上具有多个固定的多联体模板分子5902。模板分子可以被配置为形成多价分子5903可以被配置为与之结合的多联体模板分子(例如，聚合酶集落)。多价分子可以如本文其他地方所述。所述系统可以包括光学系统5905。所述光学系统可以如本文其他地方所述。例如，光学系统可以被配置有如本文其他地方所述的光源、滤光器和传感器。系统中也可以存在额外的元件(例如，试剂储存器、流体系统、泵等)。在一些情况下，所述系统可以如本文其他地方所述的那样配置，以实现本文其他地方所述的方法。
实施例18-使用多价分子进行的测序
在其上固定有多个多联体模板分子的流动池上进行两阶段测序反应。
第一阶段测序反应通过将一种或多种可溶性测序引物与固定的多联体杂交以形成固定的引物-多联体双链体来进行。将多个第一测序聚合酶流到流动池上(例如，接触固定的引物-多联体双链体)，并在适合将测序聚合酶与双链体结合以形成复合聚合酶的条件下温育。在包含非催化阳离子(例如，锶、钡、钙或其组合)的缓冲液存在下，将荧光标记的多价分子的混合物(例如，浓度为约20-100nM)流到流动池上并在适合将多价分子的互补核苷酸单元与复合聚合酶结合的条件下温育以形成亲合性复合物，而不需要核苷酸单元的聚合酶催化掺入。洗涤复合聚合物。获得保持与复合聚合酶结合的荧光标记多价分子的图像。通过用包含洗涤剂的缓冲液洗涤，去除第一测序聚合酶和多价分子，同时保留与固定多联体杂交的测序引物(保留的双链体)。
第一阶段测序反应适用于在多联体模板分子(例如，聚合酶集落)上形成多个亲合性复合物。例如，第一阶段测序反应包括：(a)将第一核酸引物、第一聚合酶和第一多价分子与多联体模板分子的第一部分结合，从而形成第一结合复合物，其中第一多价分子的第一核苷酸单元与第一聚合酶结合；和(b)将第二核酸引物、第二聚合酶和第一多价分子与同一多联体模板分子的第二部分结合，从而形成第二结合复合物，其中第一多价分子的第二核苷酸单元与第二聚合酶结合，其中包含相同的多价分子的第一和第二结合复合物形成第一亲合性复合物。
第二阶段测序反应通过使保留的双链体与多个第二测序聚合酶接触以形成复合聚合酶来进行。在包含催化阳离子(例如，镁、锰或镁和锰的组合)的缓冲液存在下，将荧光标记的核苷酸类似物(例如，3’O-甲基叠氮基核苷酸)的混合物(例如，约1-5uM)添加到复合聚合酶中，并在适合将互补核苷酸与复合聚合酶结合并促进核苷酸的聚合酶催化掺入的条件下温育以生成新生的延伸测序引物。洗涤复合聚合物。获得作为复合聚合酶的一部分的掺入的荧光标记核苷酸类似物的图像。将掺入的荧光标记核苷酸类似物与切割试剂反应，所述切割试剂去除3’O-甲基叠氮基基团并生成可延伸的3’OH基团。
在替代性第二阶段测序反应中，在包含催化阳离子(例如，镁、锰或镁和锰的组合)的缓冲液存在下，将未标记的核苷酸类似物(例如，3’O-甲基叠氮基核苷酸)的混合物(例如，约1-5uM)添加到复合聚合酶中，并在适合将互补核苷酸与复合聚合酶结合并促进核苷酸的聚合酶催化掺入的条件下温育以生成新生的延伸测序引物。洗涤复合聚合物。没有获得图像。将掺入的未标记核苷酸类似物与切割试剂反应，所述切割试剂去除3’O-甲基叠氮基基团并生成可延伸的3’OH基团。
通过用包含洗涤剂的缓冲液洗涤，去除第二测序聚合酶，同时保留与多联体杂交的新生延伸测序引物(保留的双链体)。通过进行第一阶段和第二阶段测序反应的多个循环来进行重复测序反应，以生成延伸的正向测序引物链。
尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，此类实施方案仅通过举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将构思到许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本发明时可以以任何组合采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (127)

1.一种系统，其包括：
包括弯曲表面的基底，其中所述弯曲表面包括被配置为与分析物结合的至少一个结合部分；和
包括光源的光学系统，其中所述光源被配置为将光引导至所述弯曲表面，并且其中所述光被配置为探测与所述至少一个结合部分结合的所述分析物的存在或不存在。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述分析物包括核酸。
3.如权利要求2所述的系统，其中所述至少一个结合部分包括被配置为与所述核酸结合的至少一个核酸。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述弯曲表面是流动池的部件。
5.如权利要求1所述的系统，其还包括流动池，其中所述流动池包括所述弯曲表面。
6.如权利要求1所述的系统，其中所述弯曲表面包括流动池的毛细管。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述弯曲表面包括玻璃、聚合物或其组合。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述光源被配置为以落射荧光配置探测所述弯曲表面。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述光源被配置为以透射配置探测所述弯曲表面。
10.如权利要求1所述的系统，其中所述光源是激光器、发光二极管、卤素灯或白炽灯。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述光源被配置为生成具有约500纳米(nm)至540nm、620nm至650nm、或460nm至500nm波长的所述光。
12.如权利要求1所述的系统，其还包括第二弯曲表面。
13.如权利要求12所述的系统，其还包括焦移组件，所述焦移组件被配置为在所述弯曲表面与所述第二弯曲表面之间移动焦场。
14.如权利要求13所述的系统，其中所述焦移组件包括至少一个可移动透镜。
15.如权利要求14所述的系统，其中所述至少一个可移动透镜布置在透镜镜筒内。
16.如权利要求13所述的系统，其中所述焦移组件包括至少一个可移动棱镜。
17.如权利要求12所述的系统，其中所述弯曲表面和所述第二弯曲表面是流动池的基本上圆柱形部件的不同部分。
18.如权利要求12所述的系统，其中所述第二弯曲表面包括被配置为与第二分析物结合的至少一个第二结合部分。
19.如权利要求1所述的系统，其中所述光学系统相对于所述弯曲表面是可移动的。
20.如权利要求19所述的系统，其中所述光学系统绕所述弯曲表面是可旋转的。
21.如权利要求1所述的系统，其中所述光学系统被配置为对多个结合部分进行成像。
22.如权利要求1所述的系统，其中所述弯曲表面具有25微米(μm)的平坦度偏差。
23.如权利要求22所述的系统，其中所述弯曲表面具有大于所述光学系统的焦深的平坦度偏差。
24.如权利要求1所述的系统，其还包括多个子光学系统，其中所述多个子光学系统彼此不平行。
25.如权利要求24所述的系统，其中所述多个子光学系统中的每个子光学系统被单独布置成与所述弯曲表面的多条切线垂直。
26.如权利要求1所述的系统，其还包括台，其中所述弯曲表面布置在所述台上。
27.如权利要求26所述的系统，其中所述台包括倾斜台、旋转台、平移台或其任何组合。
28.如权利要求1所述的系统，其中所述弯曲表面包括与其偶联的亲水性聚合物。
29.如权利要求28所述的系统，其中所述至少一个结合部分与所述亲水性聚合物偶联。
30.如权利要求28所述的系统，其中所述亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。
31.如权利要求1所述的系统，其中所述系统具有至多约0.6的数值孔径。
32.如权利要求31所述的系统，其中所述数值孔径为至多约0.25。
33.如权利要求1所述的系统，其还包括成像传感器，所述成像传感器被配置为在所述引导至所述弯曲表面之后收集所述光。
34.如权利要求1所述的系统，其还包括被配置为加热所述表面的加热器。
35.如权利要求34所述的系统，其中所述加热器是集成加热器。
36.如权利要求34所述的系统，其中所述加热器是红外加热器。
37.一种系统，其包括：
流动池；和
光学系统，所述光学系统包括：
光源，所述光源被配置为将第一光引导至所述流动池；
滤光器，所述滤光器被配置为(i)从所述流动池接收第二光并且(ii)传送第三光，其中所述第三光包括所述第二光的至少一部分并且不包括所述第一光；和
传感器，所述传感器被配置为从所述滤光器接收所述第三光。
38.如权利要求37所述的系统，其还包括布置在所述光源与所述滤光器之间的聚焦元件组件，其中所述聚焦元件组件被配置为聚焦来自所述流动池和所述传感器的所述第二光。
39.如权利要求37所述的系统，其中所述聚焦元件组件包括第一聚焦元件和第二聚焦元件，其中所述第一聚焦元件沿着所述光源与所述传感器之间的光路布置在所述滤光器与所述第二聚焦元件之间。
40.如权利要求39所述的系统，其中所述聚焦元件组件包括楔形块组件，并且其中所述第一聚焦元件包括第一楔形件，并且所述第二聚焦元件包括第二楔形件。
41.如权利要求40所述的系统，其中所述第一楔形件和所述第二楔形件由熔融二氧化硅组成。
42.如权利要求40或权利要求41所述的系统，其中所述第一楔形件和所述第二楔形件具有包括约1.5的折射率。
43.如权利要求40至42中任一项所述的系统，其还包括与所述第一楔形件耦合的压电驱动器。
44.如权利要求40至43中任一项所述的系统，其还包括在所述第一楔形件与所述第二楔形件之间的间隙。
45.如权利要求37至44中任一项所述的系统，其还包括容纳所述流动池的外壳。
46.如权利要求43至45中任一项所述的系统，其中所述外壳还容纳在楔形块-压电驱动器组件中的所述楔形块和所述压电驱动器。
47.如权利要求46所述的系统，其中所述楔形块–压电驱动器组件布置在所述传感器与所述流动池之间。
48.如权利要求37所述的系统，其还包括台。
49.如权利要求48所述的系统，其中所述台是倾斜台、旋转台、平移台或其组合。
50.如权利要求37至49中任一项所述的系统，其中所述光学系统还包括被配置用于初始聚焦的自动聚焦元件。
51.如权利要求37至50中任一项所述的系统，其还包括透镜镜筒。
52.如权利要求51所述的系统，其中所述自动聚焦元件容纳在所述透镜镜筒内。
53.如权利要求37至52中任一项所述的系统，其中所述流动池包括一个或多个内表面，所述内表面具有与其偶联的亲水性聚合物层。
54.如权利要求53所述的系统，其中所述流动池还包括与所述亲水性聚合物层偶联的多种生物聚合物。
55.如权利要求37至54中任一项所述的系统，其中所述流动池包括第一内表面和第二内表面，其中所述第一内表面布置在所述传感器与所述第二内表面之间。
56.如权利要求55所述的系统，其中所述第一内表面和所述第二内表面包括与其偶联的生物聚合物。
57.如权利要求53至54中任一项所述的系统，其中所述亲水性聚合物层包含聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。
58.如权利要求37至57中任一项所述的系统，其中所述滤光器包括多带滤光器。
59.如权利要求58所述的系统，其中所述多带滤光器包括三带阻带滤光器。
60.如权利要求37至59中任一项所述的系统，其中所述光学系统还包括布置在所述滤光器与所述流动池之间的成像光学器件。
61.如权利要求60所述的系统，其中所述成像光学器件具有包括1x的缩减。
62.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统具有包括大于1毫米(mm)2的视场(FOV)。
63.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统具有包括小于0.6的数值孔径(NA)。
64.如权利要求63所述的系统，其中所述NA包括约0.25。
65.如权利要求64所述的系统，其中所述传感器包括被配置为捕获所述FOV的多个成像传感器。
66.如权利要求37所述的系统，其中所述光源包括多个光源，所述多个光源包括：
被配置为发射包括第一波长范围的所述第一光的第一光源；
被配置为发射包括第二波长范围的第二光的第二光源；和
被配置为发射包括第三波长范围的第三光的第三光源，其中所述第一波长范围、所述第二波长范围和所述第三波长范围是不同的波长范围。
67.如权利要求66所述的系统，其中由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团。
68.如权利要求66所述的系统，其中：
由所述第一光源的所述第一波长范围激发的第一荧光团不同于由所述第二光源的所述第二波长范围激发的第二荧光团；并且
由所述第二光源的所述第二波长范围激发的所述第二荧光团不同于由所述第三光源的所述第三波长范围激发的第三荧光团。
69.如权利要求68所述的系统，其中由所述第三光源的所述第三波长范围激发的第三荧光团不同于由所述第一光源的所述第一波长范围激发的所述第一荧光团。
70.如权利要求66至69中任一项所述的系统，其中所述第一光源的所述第一波长范围包括在约500至约540纳米(nm)之间。
71.如权利要求66至70中任一项所述的系统，其中所述第二光源的所述第二波长范围包括在约620至约640nm之间。
72.如权利要求66至71中任一项所述的系统，其中所述第三光源的所述第三波长范围包括在约460至约500nm之间。
73.如权利要求37至72中任一项所述的系统，其中所述流动池包括内表面，所述内表面包括多个离散区域，其中(i)所述多个离散区域中的第一离散区域包括在所述第一离散区域处与所述内表面偶联的第一组的核酸分子，并且(ii)所述多个离散区域中的第二离散区域包括在所述第二离散区处与所述内表面偶联的第二组的所述核酸分子，其中所述第一组的所述核酸分子不同于所述第二组的所述核酸分子。
74.如权利要求73所述的系统，其中所述第一组的所述核酸分子包含与其偶联的第一荧光团，并且所述第二组的所述核酸分子包含与其偶联的第二荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第二荧光团。
75.如权利要求73至74中任一项所述的系统，其中所述多个离散区域中的第三离散区域包括在所述第三离散区域处与所述内表面偶联的第三组的所述核酸分子，并且其中所述第三组的所述核酸分子不同于所述第一组和所述第二组的所述核酸分子。
76.如权利要求75所述的系统，其中所述第三组的所述核酸分子包含与其偶联的第三荧光团，其中所述第三荧光团不同于第二第一荧光团和所述第二荧光团。
77.如权利要求73至76中任一项所述的系统，其中所述多个离散区域中的第四离散区域包括在所述第四离散区域处与所述内表面偶联的第四组的核酸分子，并且其中所述第四组的核酸分子包含所述第一荧光团和所述第三荧光团，其中所述第一荧光团不同于所述第三荧光团。
78.如权利要求37至77中任一项所述的系统，其中所述光源包括发光二极管(LED)光源。
79.如权利要求37至78中任一项所述的系统，其中所述光学系统还包括光传输部件。
80.如权利要求79所述的系统，其中所述光传输部件包括波导、光管、光纤或其组合。
81.如权利要求37至80中任一项所述的系统，其中所述光源包括固态光源。
82.如权利要求37所述的系统，其还包括加热器。
83.如权利要求82所述的系统，其中所述加热器是集成加热器。
84.如权利要求83所述的系统，其中所述集成加热器是透明加热器块集成加热器。
85.如权利要求82所述的系统，其中所述加热器是红外(IR)加热器。
86.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统不包括二向色元件。
87.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统不包括镜筒透镜。
88.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统不包括校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述多个成像传感器之间的所述光路。
89.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统不包括激光器。
90.如权利要求37所述的系统，其中所述光学系统不包括以下的任何组合：
(a)二向色元件；
(b)镜筒透镜；
(c)校正光学元件，所述校正光学元件被配置为移入和移出在所述流动池与所述传感器之间的所述光路；
(d)激光器。
91.如权利要求37所述的系统，其中所述流动池布置在所述光源与所述传感器之间。
92.一种系统，其包括：
光源，所述光源被配置为照射样品；
传感器，所述传感器被配置为获得被照射的所述样品的图像；和
聚焦元件组件，所述聚焦元件组件沿着所述光源与所述传感器之间的光路永久布置，其中所述聚焦元件组件包括：
外壳；
第一聚焦元件；和
第二聚焦元件，其中所述第一聚焦元件被配置为在所述外壳内相对于所述第二聚焦元件移动、而不相对于所述光路移动所述外壳。
93.如权利要求92所述的系统，其还包括多个所述光源，其中多个所述光源中的每个光源发射具有不同波长的光。
94.如权利要求92至93中任一项所述的系统，其还包括多个所述传感器，其中所述多个所述传感器中的每个传感器被配置为在不同时间获得所述样品的所述图像。
95.如权利要求92至94中任一项所述的系统，其还包括沿着所述光源与所述传感器之间的所述光路布置的滤光器，其中所述滤光器被配置为从所述样品接收光并将另一个光传送至所述传感器。
96.如权利要求95所述的系统，其中所述滤光器包括多带滤光器。
97.如权利要求96所述的系统，其中所述多带滤光器包括三带阻带滤光器。
98.如权利要求92至97中任一项所述的系统，其中所述第一透镜在所述光路中被放置在所述第二透镜之前。
99.如权利要求92至97中任一项所述的系统，其中所述第一透镜在所述光路中被放置在所述第二透镜之后。
100.如权利要求92至99中任一项所述的系统，其中所述样品与流动池的一个或多个内表面偶联。
101.如权利要求100所述的系统，其中所述样品与所述流动池的所述一个或多个内表面共价偶联。
102.如权利要求100所述的系统，其中所述样品与流动池的两个或更多个内表面偶联。
103.如权利要求102所述的系统，其中所述样品与所述流动池的所述两个或更多个内表面共价偶联。
104.如权利要求102或权利要求103所述的系统，其中所述流动池的所述两个或更多个内表面包括第一内表面和第二内表面，并且其中所述第一内表面沿着在所述光源与所述第二内表面之间的所述光路布置。
105.如权利要求100至101中任一项所述的系统，其中所述一个或多个内表面包括与其偶联的亲水性聚合物层。
106.如权利要求102至103中任一项所述的系统，其中所述一个或多个内表面包括与其偶联的亲水性聚合物层。
107.如权利要求105至106中任一项所述的系统，其中所述样品包含与所述亲水性聚合物层偶联的多种生物聚合物。
108.如权利要求105至107中任一项所述的系统，其中所述亲水性聚合物层包含聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、或葡聚糖或其任何组合。
109.如权利要求92至108中任一项所述的系统，其中所述系统具有包括大于1毫米(mm)2的视场(FOV)。
110.如权利要求92至109中任一项所述的系统，其中所述系统具有包括小于0.6的数值孔径(NA)。
111.如权利要求110所述的系统，其中所述NA包括约0.25。
112.如权利要求109至110中任一项所述的系统，其中所述传感器包括被配置为捕获所述FOV的多个成像传感器。
113.如权利要求92至112中任一项所述的系统，其中所述聚焦元件组件包括楔形块组件，并且其中所述第一聚焦元件包括第一楔形件，并且所述第二聚焦元件包括第二楔形件。
114.如权利要求113所述的系统，其中所述第一楔形件和所述第二楔形件由熔融二氧化硅组成。
115.如权利要求92至114中任一项所述的系统，其中所述第一楔形件和所述第二楔形件具有包括约1.5的折射率。
116.如权利要求92至115中任一项所述的系统，其还包括在所述第一聚焦元件与所述第二聚焦元件之间的间隙。
117.一种对样品进行成像的方法，所述方法包括：
(a)提供如权利要求1至116中任一项所述的系统；
(b)用来自所述光源的所述光照射所述样品，其中所述样品与所述流动池的一个或多个内表面偶联；
(c)通过从与所述流动池的所述一个或多个内表面偶联的所述样品接收所述第二光而由所述滤光器过滤所述第二光，并将第三光传送至所述传感器；以及
(d)用所述传感器获得所述样品的图像。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述样品包含生物聚合物，其中所述生物聚合物的第一子集与所述流动池的所述一个或多个内表面的第一内表面偶联，并且所述生物聚合物的第二子集与所述流动池的所述一个或多个内表面的第二内表面偶联。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述用所述传感器获得所述样品的所述图像包括对所述流动池的所述第一内表面和所述第二内表面进行成像。
120.一种对样品进行成像的方法，所述方法包括：
(a)提供如权利要求1至119中任一项所述的系统；
(b)通过所述光源照射所述样品；
(c)用所述聚焦元件组件聚焦从所述样品发射的光；以及
(d)由所述传感器接收来自(c)的所述光并获得所述样品的图像。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述样品包含生物聚合物，其中所述生物聚合物的第一子集与流动池的第一内表面偶联，并且所述生物聚合物的第二子集与流动池的第二内表面偶联。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述用所述传感器获得所述样品的所述图像包括对所述流动池的所述第一内表面和所述第二内表面进行成像。
123.如权利要求121或122所述的方法，其中所述第一内表面和所述第二内表面包括与其偶联的亲水性聚合物层。
124.如权利要求120至123中任一项所述的方法，其中所述通过所述传感器获得所述样品的所述图像包括对大于4mm2的视场(FOV)进行成像。
125.如权利要求120至124中任一项所述的方法，其还包括对所述样品进行测序。
126.如权利要求120所述的方法，其中所述测序包括进行结合测序或合成测序。
127.如权利要求120所述的方法，其中所述测序包括：
(a)提供可检测核苷酸缀合物，所述可检测核苷酸缀合物包含(i)共同核心、(ii)多个标记和(iii)与所述共同核心偶联的多个核苷酸；
(b)在防止所述多个核苷酸的核苷酸与多个引发的核酸序列的互补核苷酸之间形成磷酸二酯键的条件下，使所述样品的所述多个引发的核酸序列与所述可检测核苷酸缀合物接触，其中所述第一多个核苷酸的所述核苷酸与所述多个引发的核酸序列的引发的核酸序列中的所述互补核苷酸稳定偶联；
(c)检测来自所述可检测核苷酸缀合物的所述多个标记的信号，从而鉴定所述引发的核酸序列的所述互补核苷酸；以及
(d)用不同的可检测核苷酸缀合物进行(a)至(c)以检测第二信号，从而鉴定所述引发的核酸序列中的另一个互补核苷酸。
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