CN117980377A - 功能化多肽、纳米颗粒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及功能化多肽、纳米颗粒及其用途。功能化多肽包括用胍部分功能化的聚赖氨酸,其中多肽是约50%至约98%功能化的。胍功能化赖氨酸单体单元的数目为5至100,赖氨酸单体单元的数量为1至50。功能化多肽和纳米颗粒可用于治疗微生物感染或用于治疗癌症。
Description
技术领域
总体而言,本发明涉及功能化多肽、纳米颗粒及其用途。
背景技术
癌症通常采用化学疗法和/或放射疗法进行治疗。虽然这种疗法通常能有效地摧毁大量的肿瘤细胞,但往往会留下许多对治疗有耐药性的肿瘤细胞。这些耐药细胞可以增殖形成新的肿瘤,然后对治疗产生耐药性。化疗药物的已知组合的使用有时会产生多药耐药性(MDR)肿瘤细胞。
此外,包括癌症在内的许多疾病是由复杂的分子相互作用驱动的,这些相互作用在任何时候都会失调几种途径。因此,治疗靶向其中一种途径中的单个成分可能不足以破坏或纠正这些复杂的机制。由于复杂性的规模,早期的药物发现研究越来越多地发展到靶向多种分子、途径或网络。在治疗此类疾病时,可以将具有不同机制的药物组合(即联合疗法),具有有益的效果,包括对MDR肿瘤细胞的有效治疗和将副作用(如不良细胞毒性)降至最低。然而,这种药物混合物很难预测和配制,而且在后期试验中经常被放弃。
化疗化合物的广泛使用也会引起耐药性,这进一步限制了化学疗法的应用。因此,迫切需要找到在不引起耐药性的情况下对抗癌症的替代方法。
近年来,正电荷聚合物作为大分子化学治疗剂受到关注,因为癌症细胞膜具有净负电荷。然而,阳离子聚合物在体内静脉给药后表现出显著的不稳定性和毒性。阳离子聚合物可能与许多带负电荷的血液成分静电相互作用,导致聚集体的形成和血管闭塞,这大大阻碍了其临床应用。
希望克服或改善上述问题中的至少一个。
发明内容
本发明提供式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的至少一个单体单元
其中
m是从5到100的整数;并且
k是从1到20的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。
在一些实施方案中,式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽(random co-polypeptide)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约95%。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽进一步包含式(C)的至少一个单体单元:
其中g是从1到10的整数。
在一些实施方案中,g是3或4。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于式(C)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约5%至约20%,或优选约10%至约16%。
在一些实施方案中,式(C)的单体单元、式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
在一些实施方案中,m是18,k是2,并且g是2。在一些实施方案中,m是30,k是3,并且g是2。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约10nm至约200nm的胶束直径,或优选约20nm至约50nm的胶束直径。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于临界胶束浓度(CMC)值为约1μg/mL至约100μg/mL,或优选约8μg/mL至约11μg/mL。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约+1mV至约+30mV的泽塔(zeta)电位(ζ),或优选约+8mV至约+15mV的泽塔电位(ζ)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽进一步包含式(D)的单体单元:
其中p是从5到100的整数。
在一些实施方式中,p是12。
在一些实施方案中,式(D)的单体单元、式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
在一些实施方式中,m是27,k是2,并且p是12。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于5至100的聚合度,或优选20至40的聚合度。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于多分散指数(PDI)为约1.1至约1.7,或优选为约1.1至约1.2。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于在水性介质中的稳定性为至少100天。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌和/或真菌的抗微生物活性。
在一些实施方案中,革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌和MRSA,革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克氏菌,真菌为白色念珠菌。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于具有最小抑制浓度(MIC)为约1μg/mL至约200μg/mL的抗微生物活性,或优选约15μg/mL至约130μg/mL的抗微生物活性。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约15μg/mL至约2000μg/mL的最小杀菌浓度(MBC)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约15μg/mL至约2000μg/mL的最小杀真菌浓度(MFC)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约1至约500的(MBC或MFC)/MIC比率(R),或优选4或更小的(MBC或MFC)/MIC比率(R)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于50%裂解(HC50)下约100μg/mL至约8000μg/mL的最小溶血浓度。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约4000μg/mL至约8000μg/mL的溶血浓度(HC50)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于对癌症细胞约1μg/mL至约200μg/mL的IC50值,或优选对癌症细胞约25μg/mL的IC50值。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于人类乳腺癌症细胞系(MCF-7)相对于耐药人类乳腺癌症细胞系(MCF-7/ADR)的IC50比率为约1。
本发明还提供了一种功能化多肽纳米颗粒,其包括:
a)式(I)的功能化多肽或本文公开的其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药;和
b)式(II)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,包括
i)式(E)的单体单元:
其中q是从0到10的整数;
ii)式(F)的单体单元:
其中r是从10到100的整数;和
iii)甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)末端;
其中式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
其中式(I)的功能化多肽与式(II)的功能化多肽的摩尔比为约1:1至约1:10。
在一些实施方式中,q是从1到8的整数。
在一些实施方案中,r是从15到50的整数。
在一些实施方式中,q是6,r是20。
在一些实施方案中,式(E)的单体单元和式(F)的单体单元形成无规共多肽。
在一些实施方案中,mPEG具有约2000g/mol至约10000g/mol的分子量。
在一些实施方案中,mPEG具有约60个乙二醇单体单元至约150个乙二醇单体单元,或优选约110个乙二醇单体单元。
在一些实施方案中,mPEG和包含式(E)单体单元和式(F)单体单位的无规共多肽形成嵌段共多肽。
在一些实施方案中,式(II)的功能化多肽的特征在于式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比为约80%至约90%。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒在约1至小于7的pH下是可离解的。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于对癌症细胞的IC50值为约1μg/mL至约200μg/mL。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于在约6.5的pH下对癌症细胞的IC50值为约10μg/mL至约50μg/mL,或约25μg/mL,或优选在约7.4的pH下,对癌症细胞的IC50值为约25μg/mL至约150μg/mL,或约60μg/mL。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于人类乳腺癌症细胞系(MCF-7)相对于耐药人类乳腺癌症细胞系(MCF-7/ADR)的IC50比率为约1。
本发明还提供了一种合成式(I)的功能化多肽的方法,包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的单体单元
其中m是从5到100的整数;并且
k是从1到20的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
包括:
a)使聚(L-赖氨酸)与2-甲基-2-硫代假脲(2-methyl-2-thiopseudourea)反应以形成式(A)的单体单元。
在一些实施方案中,2-甲基-2-硫代假脲由N-保护基团保护。
在一些实施方案中,2-甲基-2-硫代假脲由至少一个叔丁氧羰基(Boc)保护基团保护。
在一些实施方案中,2-甲基-2-硫代假脲是1,3-双(叔-丁氧羰基)-2-甲基-2-硫代假脲。
在一些实施方案中,当2-甲基-2-硫代假脲被N-保护基团保护时,该方法进一步包括对胍基部分进行脱保护的步骤。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使聚(L-赖氨酸)与式(G)的维生素E功能化环状碳酸酯反应以形成式(C)的单体单元的步骤:
在一些实施方案中,该方法进一步包括a)之前的步骤为在开环聚合(ROP)条件下使Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)单体反应并脱保护苄基以形成聚(L-赖氨酸):
在一些实施方案中,在ROP条件下使Lys(Z)-NCA单体反应的步骤进一步包括L-亮氨酸-N-羧酸酐(Leu-NCA)单体:
在一些实施方案中,用苄胺作为引发剂进行ROP。
在一些实施方案中,当Lys(Z)-NCA单体和Leu-NCA单体反应时,式(I)的功能化多肽中亮氨酸的百分比为约10%至约80%,或优选约30%。
本发明还提供一种药物组合物,其包含有效量的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
在一些实施方案中,药物组合物进一步包含在药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在一些实施方案中,药物组合物进一步包含相对于药物组合物约1重量%至约5重量%的羟丙基甲基纤维素。
本发明还提供了一种治疗微生物感染的方法,该方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒以约0.1mg/kg至约300mg/kg的剂量施用。
在一些实施方案中,微生物感染是细菌感染或真菌感染。
本发明还提供用于治疗微生物感染的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
本发明还提供式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法,该方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒以约0.1mg/kg至约300mg/kg的剂量给药。
在一些实施方案中,癌症是乳腺癌症。在一些实施方案中,癌症是肿瘤性癌症。在一些实施方案中,肿瘤被抑制了至少30%。
本发明还提供了用于治疗癌症的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
本发明还提供式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
附图说明
现在将参照附图以非限制性示例的方式描述本发明的实施方式,其中:
图1显示了(A)PLL-Gua和(B)PLL-Gua-VitE的合成路线。
图2显示了(A)PLL22-Gua(Boc)在CDCl3中的以及(B)PLL22-Gua在DMSO-d6中的1HNMR光谱。
图3显示了(A)PLL22-Gua(Boc)-VitE在CDCl3中的以及(B)PLL22-Gua-VitE在DMSO-d6中的1H NMR光谱。
图4显示了p(lys-r-leu)的合成路线。
图5显示了p(lys(Gua)-r-leu)的合成路线。
图6A显示了PLL、PLL-Gua、PLL-Gua-VitE、p(lys-r-leu)和p(lys(Gua)-r-leu)的溶血活性。
图6B显示了PLL11、PLL11-Gua和PLL11-Gua-VitE的溶血活性。
图7A-C显示了PLL22、PLL22-Gua和PLL22-Gua-VitE在3.0小时内对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的杀灭动力学。
图8显示了(A)PLL22、(B)PLL22-Gua和(C)PLL22-Gua-VitE在1×MIC和2×MIC下在4小时内对产β-内酰胺酶SHV-18的肺炎克氏菌的机制研究。O.D.值是通过从每个时间点在500nm的吸光度值中减去0小时在500nm的吸收值而获得的。每个柱状图中每个时间点从左到右的柱条分别为i)1×MIC的PLL22或PLL22-Gua或PLL22-Gua-VitE;ii)2×MIC的PLL22或PLL22-Gua或PLL22-Gua-VitE;iii)多粘菌素B;和iv)盐水。
图9显示了肺炎克氏菌与PLL22、PLL22-Gua和PLL22-Gua-VitE在2×MIC下孵育1小时的CLSM图像。
图10显示了PLL22-Gua(A)的MBCagar和PLL22-Gua(B)对MRSA的抗性频率。
图11显示了(A)在MRSA诱导的伤口感染小鼠模型中证明的PLL22-Gua的体内抗菌功效。(B)从对照和PLL22-Gua治疗的小鼠(200mg/kg)获得的皮肤样品的H&E染色。
图12显示了对照小鼠(右图)和PLL22-Gua治疗的小鼠(左图)的图像。用200mg/kg聚合物治疗不影响毛皮的正常生长,并且来自两组的小鼠的体重没有显示出显著差异。
图13显示了对照小鼠和PLL22-Gua治疗小鼠的正常组织的H&E染色。用聚合物治疗没有对健康组织造成任何损伤。
图14显示了(A)mPEG-PLL/CDA的合成路线。(B)mPEG-PLL/CDA在D2O中的1H NMR。(C)mPEG-PLL/CDA在D2O和pH为6.5、D2O中的水解。
图15A-G显示了(A)pH为7.4、(B)pH为6.6和(C)pH为5.4缓冲液中Gua-NPs的尺寸变化。(D)Gua-NPs在去离子(DI)水中的照片。(E)不同pH缓冲液中Qua-NPs的泽塔电位。(F)Gua-NPs在不同pH缓冲液中的泽塔电位。(G)AF-488@PLL-Gua溶液和AF-488@Gua-NPs溶液两者均可见荧光。
图16显示了BT474细胞在与(A)mPEG-b-PLL、(B)mPEG-PLL/CDA、(C)PLL22-Gua和(D)Gua-NPs孵育48小时后的体外活力。
图17显示了MCF-7和MCF-7/ADR细胞与(A)DOX、(B)PLL22-Gua和(C)Gua-NPs孵育48小时后的体外活力。
图18显示了Gua-NPs的体内抗肿瘤功效。(A)肿瘤体积作为时间的函数,(B)最终肿瘤重量和(C)治疗结束时解剖肿瘤的照片。
图19显示了PLL22-Gua在D2O中的1H NMR。(A)将PLL22-Gua在H2O中在室温下孵育6个月。(B)原始的PLL22-Gua。
图20显示了原始PLL22-Gua和在37℃的H2O中孵育100天后的PLL22-Gua的GPC痕迹。
图21显示了HepG-2人类肝癌细胞与p(lys-r-leu)或p(lys(Gua)-r-leu)孵育48小时的活力。
图22显示了p(lys-r-leu)(A)和p(lys(Gua)-r-leu)(B)对BT-474人类乳腺癌症细胞系的杀灭动力学曲线。
图23显示了PLL-Gua和p(lys(Gua)-r-leu)对BT-474人类乳腺癌症细胞系的杀灭动力学曲线。
图24显示了PLL-Gua(A)和Gua-NPs(B)对BT-474人类乳腺癌症细胞系的杀灭动力学曲线。
图25是显示无药物多肽纳米颗粒作为抗癌剂的制备和使用的方案。阴离子聚合物载体mPEG-b-PLL/CDA和阳离子抗癌多肽PLL-Gua自组装形成带中性电荷的纳米颗粒。纳米颗粒通过胞吞作用被细胞吸收,并将PLLGua从酸性内体释放到胞质溶胶中,使PLL-Gua发挥抗癌剂的生物功能。
图26A-I显示了BT-474细胞与(A)PLL-Qua、(B)Qua-NPs、(C)PLL-Gua和(D)Gua-NPs孵育48小时后的活力。不同浓度下(E)PLL-Gua和(F)Gua-NPs的杀灭动力学曲线。在6个重复(replicates)中进行细胞活力测定,结果表示为平均细胞活力(%)±SD。PLL-Gua和Gua-NPs的IC50值分别低于PLL-Qua和Qua-NPs。PLL-Gua和Gua-NPs杀死癌症细胞,这取决于剂量和孵育时间。浓度的增加导致更快的杀灭动力学。在相同浓度(50或100μg/mL)的PLL-Gua和Gua-NPs下,PLL-Gu对细胞的杀灭速度更快。BT-474细胞与不同浓度的PLL-Gua和Gua-NPs孵育2小时后的凋亡群体(G,I)。膜联蛋白VLowPILow:活细胞;膜联蛋白VHighPILow:早期凋亡细胞;膜联蛋白VHighPIHigh:晚期凋亡细胞;膜联蛋白VLowPIHigh:坏死细胞。实验分3个重复进行,结果表示为平均凋亡率(%)±SD。***p<0.001和****p<0.0001。PLL-Gua和Gua-NPs诱导了显著的细胞凋亡而不是坏死,并且与没有任何治疗的对照相比,观察到更高的早期凋亡细胞。在更高的浓度下,可以看到更高的晚期凋亡细胞。(H)BT-474细胞与PLL-Gua(25μg/mL)和Gua-NPs(25μg/mL,基于PLL-Gua)孵育30分钟后的共聚焦显微镜图像(绿色:用AlexaFluor 488标记的PLL-Gua;红色:LysoTracker,其染色酸性区室,如内溶酶体;蓝色:Hoechst 33342染色的细胞核)。PLL-Gua和Gua-NPs都迅速进入细胞。特别是,细胞通过内吞作用吸收Gua-NPs,黄色区域证明了这一点,这表明纳米颗粒在内溶酶体中的定位。比例尺表示10μm。
图27显示了用PLL-Gua(25μg/mL)、Gua-NPs(25μg/mL,基于PLL-Gua)和DOX(5.8μg/mL)治疗24小时后MCF-7和MCF-7/ADR细胞的共聚焦图像。细胞核用Hoechst 33342染色为蓝色,ER、核仁和细胞质RNA用伴刀豆蛋白A Alexa Fluor 488和SYTO 14染色为绿色。比例尺表示20μm。
图28显示了MCF-7和MCF-7/ADR细胞与(A)DOX、(B)PLL-Gua或(C)Gua-NPs孵育48小时后的活力。实验分6个重复进行,结果用平均细胞活力(%)±SD表示。MCF-7/ADR细胞对DOX表现出显著的耐药性,而PLL-Gua和Gua-NPs对MCF-7和MCF-7/ADR的抗癌效果几乎相等,表明MCF-7/ADR细胞对PLL-Gua和Gua-NPs都敏感。(D)DOX、PLL-Gua和Gua-NPs治疗在其各自的IC50浓度下对MCF-7细胞超过24小时迁移的影响。PLL-Gua和Gua-NPs均能有效阻止MCF-7细胞迁移。比例尺表示100μm。
图29显示了在第0天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天静脉注射PLL-Gua(10mg/kg,n=5)和Gua-NPs(20mg/kg,基于PLL-Gua,n=5)6次后小鼠尾巴的照片。PLL-Gua治疗组的五只小鼠中有一只死亡,其中一只出现尾静脉凝血。Gua-NPs治疗组中的所有小鼠都处于良好的健康状况。
图30显示了健康Balb/C小鼠在第0天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天静脉注射PLL-Gua(10mg/kg)和Gua-NPs(20mg/kg,基于PLL-Gua)后第21天的血液生化分析(A-C)。(UREA:血尿素氮;ALT:丙氨酸氨基转移酶;AST:天冬氨酸氨基转移酶)。(D)静脉注射PLL-Gua和Gua-NPs后的LD50(导致50%小鼠死亡率的单次致死剂量)值。带中性电荷的Gua-NPs的LD50为48.9mg/kg,是阳离子PLL-Gua(17.9mg/kg)的2.7倍。负载负电荷载体mPEG-b-PLL/CDA后,PLL-Gua的毒性降低。(E)静脉注射Alexa Fluor 750标记的PLL-Gua(10mg/kg)和Alexa Fluor 750标记Gua-NPs(10mg/kg,基于Alexa Fluor 750标记的PLL-Gua)后6、24和48小时拍摄的主要器官和肿瘤的离体荧光图像。鉴于其相对较低的体内毒性和较高的肿瘤积聚,Gua-NPs被选择用于体内抗癌功效研究。
具体实施方式
令人惊讶地发现,胍功能多肽具有抗癌特性。在不想被理论束缚的情况下,人们认为这种多肽可以通过细胞膜易位,并通过与细胞内靶标(如蛋白质和核酸)非特异性相互作用来干扰重要的细胞过程。由于这些多肽作用于多种细胞内蛋白质/基因,重复暴露于它们不会诱导耐药性。多肽也被发现是非溶血性的。此外,多肽在水中是稳定的。这种特性使其易于储存和运输多肽,也易于施用多肽。多肽可以通过α-氨基酸-N-羧酸酐(NCA)单体的开环聚合(ROP)制备。多肽也可以被改造成具有独特的二级结构,如星形、螺旋形和β片。
此外,发现功能化多肽具有良好的抗微生物活性,特别是对多药耐药性(MDR)细菌具有良好的抗菌活性。由于膜移位抗菌机制,多肽治疗使细菌膜完好无损,避免了内毒素的释放。
细菌感染是对全球公共卫生的最大威胁之一,每年在世界各地造成数百万人死亡。近年来,抗生素的过度使用导致了多药耐药性(MDR)的出现,进一步加剧了这一问题。为了解决这些问题,研究人员一直在研究修改现有的抗生素类别,或引入交叉耐药性有限的新类别,或使用佐剂使细菌对抗生素敏感。此外,还开发了具有不同功能机制的合成抗菌聚合物。大多数抗微生物聚合物基于膜破坏机制杀死微生物,这避免了微生物的内在防御机制,从而缓解了耐药性的发展。这些聚合物通常具有两亲性,同时含有阳离子和疏水成分。在与微生物相互作用时,这些大分子被静电吸引到带负电的膜上,然后插入其疏水成分。这会破坏和裂解细胞膜,最终导致细胞死亡。由于它们以微生物膜为目标,即使在反复接触这些大分子后,微生物也几乎没有机会产生耐药性。然而,膜破坏可能导致内毒素的释放,这可能导致败血症。
为此,人们认为胍功能多肽可以作为抗微生物剂。
此外,通过将胍功能多肽与带负电荷或阴离子多肽配制以形成纳米颗粒,可以进一步中和正电荷,这降低了阳离子聚合物通常观察到的不稳定性和毒性。
例如,通过将带负电荷的mPEG-PLL/CDA与带正电荷的多肽PLL22-Gua混合,通过自组装形成pH敏感纳米颗粒(Gua-NPs),可以进一步中和正电荷。与PLL22-Gua相比,这些Gua-NPs在低pH下具有优异的稳定性并表现出相似的抗癌功效。此外,PLL22-Gua和Gua-NPs对MCF-7和耐药MCF-7/ADR表现出相似活性。此外,Gua-NPs在BT-474人类乳腺癌症异种移植小鼠模型中显示出优异的抗肿瘤功效。
基于纳米颗粒的药物递送系统通过增强纳米颗粒在肿瘤组织中的渗透性和滞留性(EPR)效应表现出很大的优势。尽管EPR效应改善了纳米颗粒向肿瘤部位的积聚,但装载货物的细胞内释放不良可能会降低其化疗疗效。具体而言,考虑到不同组织(正常组织:pH7.4;肿瘤细胞外环境:pH 6.2-6.9)和细胞区室(早期内体:pH 6.0-7.4;晚期内体:pH5.5-6.0;溶酶体:pH 4.5-5.5)的pH值,pH敏感纳米颗粒如微环境敏感纳米颗粒可用于增强货物递送功效和改善细胞内药物释放。因此,在阴离子二嵌段共聚物的设计中,在阴离子多肽嵌段中引入了pH响应功能,使得纳米颗粒可以在肿瘤组织和/或癌症细胞的低pH区室(例如内体)中释放抗癌多肽,并且释放的阳离子多肽可以与细胞内蛋白质和基因结合,阻止其生物活性,进而导致癌症细胞死亡。
本发明提供式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的至少一个单体单元
其中
m是从5到100的整数;并且
k是从1到20的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的至少一个单体单元
其中
m是从5到70的整数;并且
k是从1到20的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的至少一个单体单元
其中
m是从8到50的整数;并且
k是从1到10的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。
赖氨酸中伯胺基团的存在允许用其它部分进一步功能化。
单体是一种分子,它可以与其他单体分子一起反应,在称为聚合的过程中形成更大的聚合物链或三维网络。在这个意义上,单体用于形成聚合物。因此,聚合物包括通过共价键连接的单体单元。
在一些实施方案中,m是从5到70、5到65、5到70、5到60、5到55、5到50、8到50、8到45、8到40、8到35、8到30、9到30、10到30、11到30、12到30、13到30、14到30、15到30、16到30、17到30或18到30的整数。
在一些实施方案中,k是从1到50、1到45、1到40、1到35、1到30、1到25、1到20、1到19、1到20、1到18、1到17、1到16、1到15、1到14、1到13、1到12、1到11、1到10、1到9、1到8、1到7、1到6、1到5、1到4、1到3或1到2的整数。
在一些实施方案中,当m为10至30的整数时,k为1至10的整数,或1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。
在一些实施方案中,当m为15至30的整数时,k为1至10的整数,或1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。
在一些实施方式中,m是21,k是1。
在一些实施方式中,m是33,k是2。在一些实施方式中,m是33,k是1。
在一些实施方案中,式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。在无规共多肽或统计共多肽中,单体单元的序列遵循统计规则,其中在链中的特定点找到给定单体单元的概率等于该单体单元摩尔分数。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。在其它实施方案中,百分比为约55%至约98%、约60%至约98%、约65%至约98%、约70%至约98%、约75%至约98%、约80%至约98%、约85%至约98%,或约95%至约98%。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比约95%。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽进一步包含式(C)的至少一个单体单元:
其中g是从1到10的整数。
在一些实施方案中,g是1到10、1到9、1到8、1到7、1到6、1到5、或1到4、或1到2的整数。在一些实施方案中,g是3或4。在其它实施方案中,g是2。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于式(C)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约5%至约20%。在其它实施方案中,百分比为约6%至约20%、约7%至约20%、约8%至约20%或约9%至约20%,或约10%至约20%。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于式(C)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约10%至约16%。
在一些实施方案中,式(D)的单体单元在式(I)的功能化多肽中无规缀合。在一些实施方案中,式(C)的单体单元、式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
在一些实施方案中,m是18,k是1,并且g是3。在一些实施方案中,m是18,k是2,并且g是2。
在一些实施方案中,m是30,k是2,并且g是3。在一些实施方案中,m是30,k是3,并且g是2。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约10nm至约200nm的胶束直径。在其它实施方案中,胶束直径为约10nm至约190nm、约10nm至约180nm、约10nm至约170nm、约10nm至约160nm、约10mm至约150nm、约10nm至约140nm、约10nm至约130nm、约10nm至约120nm、约10nm至约110nm、约10nm至约100nm、约10nm至约90nm、约10nm至约80nm,约10nm至约70nm、约10nm至约60nm、约10nm至约50nm、约10nm至约40nm、约10nm至约30nm。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约20nm至约200nm、约20nm至约100nm或约20nm至约50nm的胶束直径。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约1μg/mL至约100μg/mL的临界胶束浓度(CMC)值。在其他实施方案中,CMC值为约1μg/mL至约90μg/mL、约1μg/mL至约80μg/mL、约1μg/mL至约70μg/mL、约1μg/mL至约60μg/mL、约1μg/mL至约55μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL至约18μg/mL、约5μg/mL至约16μg/mL、约5μg/mL至约15μg/mL、约5μg/mL至约14μg/mL、约5μg/mL至约13μg/mL或约5μg/mL至约12μg/mL。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约8μg/mL至约11μg/mL的临界胶束浓度(CMC)值。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约+1mV至约+30mV的泽塔电位(ζ)。在其他实施方案中,泽塔电位(ζ)为约+1mV至约+25mV、约+1mV至约+20mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+18mV、+5mV至至约+16mV、+5mV至约+15mV、+5mV至约+14mV、+5mV至至约+13mV,或+5mV至约+12mV。
在一些实施方案中,当存在式(C)的单体单元时,式(I)的功能化多肽的特征在于约+8mV至约+15mV的泽塔电位(ζ)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽进一步包含式(D)的单体单元:
其中p是从5到100的整数。
令人惊讶的是,在功能化多肽中存在式(D)的单体单元提供了比没有的更低的对抗大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的MBCs,这表明疏水性亮氨酸的存在导致更强的抗微生物活性。疏水性亮氨酸氨基酸在功能化多肽中的结合也可以导致更快速的癌症细胞杀灭。
在一些实施方案中,p是从5到100、5到50、5到40、5到30、5到29、5到28、5到27、5到26、5到25、5到24、5到30、5到23、5到22、5到21、5到20、5到19、5到18、5到17、5到16、5到15、5到14、5到13、5到12、6到12、7到12、8到12、9到12或10到12的整数。在一些实施方式中,p是12。
在一些实施方案中,式(D)的单体单元在式(I)的功能化多肽中无规缀合。在一些实施方案中,式(D)的单体单元、式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
在一些实施方式中,m是27,k是2,并且p是12。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于5至100的聚合度。聚合度(DP)定义为聚合物中单体单元的数量。在其它实施方案中,聚合度为5至60、5至55、5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25、5至20、9至55、9至50、9至45、9至40、9至35、10至35、12至35、14至35、16至35、18至35或20至35。在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于20至40或22至35的聚合度。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约1.1至约1.7的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于多分散指数(PDI)为约1.1至约1.6、约1.1至至约1.5、约1.1至约1.4、约1.1至约1.3或约1.1至1.2。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于在水性介质中的稳定性为至少50天、60天、70天、80天、90天或100天。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和/或真菌/酵母的抗微生物活性。
在一些实施方案中,革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌和MRSA,革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克氏菌,酵母为白色念珠菌。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于具有约1μg/mL至约200μg/mL的最小抑制浓度(MIC)值的抗微生物活性。在其他实施方案中,MIC为约10μg/mL至约200μg/mL、约10μg/mL至约190μg/mL、约10μg/mL至约180μg/mL、约10μg/mL至约170μg/mL、约10μg/mL至约160μg/mL、约10μg/mL至约150μg/mL、约10μg/mL至约140μg/mL、约10μg/mL至约130μg/mL、约10μg/mL至约120μg/mL、约10μg/mL至约110μg/mL,或约10μg/mL至约100μg/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于具有约15μg/mL至约130μg/mL的最小抑制浓度(MICs)的抗微生物活性。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约15μg/mL至约2000μg/mL的最小杀菌浓度(MBC)。在其他实施方案中,MBC为约15μg/mL至约1800μg/mL、约15μg/mL至约1600μg/mL、约15μg/mL至约1400μg/mL、约15μg/mL至约1200μg/mL、约15μg/mL至约1000μg/mL、约15μg/mL至约800μg/mL、约15μg/mL至约600μg/mL、约15μg/mL至约400μg/mL、约15μg/mL至约200μg/mL或约15μg/mL至约100μg/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约15μg/mL至约2000μg/mL的最小杀真菌浓度(MFC)。在其他实施方案中,MFC为约15μg/mL至约1800μg/mL、约15μg/mL至约1600μg/mL、约15μg/mL至约1400μg/mL、约15μg/mL至约1200μg/mL、约15μg/mL至约1000μg/mL、约15μg/mL至约800μg/mL、约15μg/mL至约600μg/mL、约15μg/mL至约400μg/mL、约15μg/mL至约200μg/mL,或约15μg/mL至约100μg/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约1至约500的(MBC或MFC)/MIC比率(R)。在其它实施方案中,该比率为约1至约400、约1至约300、约1至约200、约1至约150、约1至约100、约1至约80、约1至约70、约1至约65、约1至约60、约1至约55、约1至约50、约1至约45、约1至约40、约1至约35、约1至约30、约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至至约5,或约1至小于4。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于4或更小的(MBC或MFC)/MIC比率(R)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于50%裂解(HC50)下约100μg/mL至约8000μg/mL的最小溶血浓度。在其它实施方案中,HC50为约100μg/mL至约6000μg/mL、约200μg/mL至约6000μg/mL、约400μg/mL至约6000μg/mL、约600μg/mL至约6000μg/mL、约800μg/mL至约6000μg/mL、约1000μg/mL至约6000μg/mL、约1200μg/mL至约6000μg/mL、约1400μg/mL至约6000μg/mL、约1600μg/mL至约6000μg/mL、约1800μg/mL至约6000μg/mL、约2000μg/mL至约6000μg/mL、约2500μg/mL至约6000μg/mL、约3000μg/mL至约6000μg/mL,或约3500μg/mL至约6000μng/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约4000μg/mL至约8000μg/mL,或约4000μg/mL至约6000μg/mL的溶血浓度(HC50)。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于对多药耐药性细菌的最小杀菌浓度(MBC)为约1000μg/mL至约2000μg/mL。在其他实施方案中,针对多药耐药性细菌的MBC为约1000μg/mL至约1900μg/mL、约1000μg/mL至约1800μg/mL、约1000μg/mL至约1700μg/mL或约1000μng/mL至约1600μg/mL,或者约1000μg/mL至约1500μg/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于对多药耐药性细菌的最小杀菌浓度(MBC)为约1500μg/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于对癌症细胞的IC50值为约1μg/mL至约200μg/mL。可以针对癌症细胞系测量IC50值。在其他实施方案中,IC50值为约1μg/mL至约150μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL,或约20μg/mL至约30μg/mL。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于约25μg/mL的IC50值。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽的特征在于MCF-7(人类乳腺癌症细胞系)相对于耐药MCF-7/ADR的IC50比率为约1。
本发明还提供了一种功能化多肽纳米颗粒,其包括:
a)如本文所公开的式(I)的功能化多肽;和
b)式(II)的功能化多肽,其包含
i)式(E)的单体单元:
其中q是从0到10的整数;
ii)式(F)的单体单元:
其中r是从10到100的整数;和
iii)甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)末端;
其中式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
其中式(I)的功能化多肽与式(II)的功能化多肽的摩尔比为约1:1至约1:10。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒包括:
a)如本文所公开的式(I)的功能化多肽;和
b)式(II)的功能化多肽,其包含
i)式(E)的单体单元:
其中q是从1到10的整数;
ii)式(F)的单体单元:
其中r是从10到80的整数;和
iii)甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)末端;
其中式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
其中式(I)的功能化多肽与式(II)的功能化多肽的摩尔比为约1:1至约1:10。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒包括:
a)式(I)的功能化多肽或本文公开的其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药;和
b)式(II)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,包括
i)式(E)的单体单元:
其中q是从1到10的整数;
ii)式(F)的单体单元:
其中r是从10到30的整数;和
iii)甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)末端;
其中式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比为约50%至约90%;
其中式(I)的功能化多肽与式(II)的功能化多肽的摩尔比为约1:1至约1:10。
具体而言,合成了具有不同阳离子电荷的抗癌多肽(即伯胺、季铵和胍)以及PEG和pH敏感阴离子多肽的二嵌段共聚物(图25)。通过自组装将阳离子多肽和阴离子多肽简单混合而形成纳米颗粒,并对其粒径、泽塔电位、对人类癌症细胞系(包括药物敏感性和耐药性细胞系)的抗癌活性、抗癌机制(通过流式细胞术和共聚焦显微镜)和溶血活性进行了表征。还研究了它们抑制癌症细胞体外迁移的能力。此外,评估了纳米颗粒的体内毒性和生物分布,并在BT-474人类乳腺癌症异种移植小鼠模型中研究了体内抗癌功效。
在一些实施方案中,q是1至9、2至9、3至9、4至9或5至9的整数。在一些实施方案中,q是从5到8的整数。
在一些实施方案中,r是从5到80、10到75、5到70、5到65、5到60、5到55、5到50、5到45、5到40、5到35、5到30、10到80、10到75、10到70、10到65、10到60、10到55、10到50、10到45、10到40、10到35、10到30、10到29、10到28、10到27、10到26、11到26、12到26、13到26或14到26的整数。在一些实施方案中,r是从15到25的整数。
在一些实施方案中,当q为1至9的整数时,r为10至50、10至40、10至30、10至29、10至28、10至27、10至26、11至26、12至26、13至26或14至26的整数。在一些实施方案中,当q为4至9的整数时,r为10至50、10至40、10至30、10至29、10至28、10至27、10至26、11至26、12至26、13至26或14至26的整数。在一些实施方式中,q是6,r是20。
在一些实施方案中,式(E)的单体单元和式(F)的单体单元形成无规共多肽。
在一些实施方案中,式(F)的单体单元是带电单体单元。带电单体单元可以是具有电离部分或具有去质子化部分的单体单元。例如,式(F)的单体单元可以是:
在一些实施方案中,离子化或去质子化部分与其未离子化或质子化的对应物的摩尔比为约1:1至约1:10、约1:1至至约1:9、约1:1至约1:8、约1:1至约1:7、约1:1至约1:6、约1:1至约1:5、约1:1至约1:4、约1:1至约1:3、约1:1至约1:2、约10:1至约1:1、约9:1至约1:1,约8:1至约1:1、约7:1至约1:1、约6:1至约1:1、约5:1至约1:1、约4:1至约1:1、约3:1至约1:1或约2:1至约1:1。在一些实施方案中,摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中,式(I)功能化多肽与式(II)功能化多肽的摩尔比为约1:1至约1:10、约1:1至约1:9、约1:1至约1:8、约1:1至约1:7、约1:1至约1:6、约1:1至约1:5、约1:1至约1:4、约1:1至约1:3或约1:1至约1:2。在一些实施方案中,摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中,式(I)功能化多肽与式(II)功能化多肽的质量比为约10:12至约10:30。在其它实施方案中,质量比为约10:12至约10:28、约10:12至约10:26、约10:12至约10:24、约10:12至约10:22、约10:12至约10:20、约10:14至约10:20或约10:16至约10:20。在其它实施方案中,质量比为约10:18。
在一些实施方案中,mPEG具有约2000g/mol至约10000g/mol的分子量。在其它实施方案中,分子量为约3000g/mol至约8000g/mol、约3000g/mmol至约7000g/mol、约3000g/mol至约6000g/mol、约3000g/mol至约5500g/mol、约3000g/mol至约5000g/mol、约3000g/mol至约4500g/mol、约3000g/mol至约4000g/mol或约3500g/mol至约4000g/mol。
在一些实施方案中,mPEG具有约60个乙二醇单体单元至约150个乙二醇单体单元。在其它实施方案中,单体单元的数量为约65至约150、约70至约150、约75至约150、约80至约150、约85至约150、约90至约150、约95至约150、约100至约150、约100至约145、约100至约140、约100至约135,或者约100至约130。在一些实施方案中,mPEG具有约110个乙二醇单体单元。
在一些实施方案中,mPEG和包含式(E)单体单元和式(F)单体单元的无规共多肽形成嵌段共多肽。在其它实施方案中,mPEG和包含式(E)单体单元和式(F)单体单元的无规共多肽形成二嵌段共多肽。嵌段共多肽包含两个或多个不同的化学嵌段。
在一些实施方案中,式(II)的功能化多肽的特征在于式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。在其它实施方案中,百分比为约55%至约98%、约60%至约98%、约65%至约98%、约70%至约98%、约75%至约98%、约80%至约98%、约85%至约98%、约90%至约98%、约55%至约90%、约60%至约90%、约65%至约90%、约70%至约90%、约75%至约90%,或约80%至约90%。
在一些实施方案中,式(II)的功能化多肽的特征在于式(F)的单体单元相对于式(II)的功能化多肽的百分比约80%。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒在约1至小于7的pH下是可离解的。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于对癌症细胞的IC50值为约1μg/mL至约200μg/mL。可以针对癌症细胞系测量IC50值。在其他实施方案中,IC50值为约1μg/mL至约190μg/mL、约1μg/mL至约180μg/mL、约1μg/mL至约170μg/mL、约1μg/mL至约160μg/mL、约1μg/mL至约150μg/mL、约1μg/mL至约140μg/mL、约1μg/mL至约130μg/mL、约1μg/mL至约120μg/mL、约1μg/mL至约110μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约90μg/mL、约1μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约75μg/mL、约20μg/mL至约70μg/mL、约20μg/mL至约65μg/mL、约20μg/mL至约60μg/mL、约20μg/mL至约55μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/m L至约45μg/mL,或约20μg/mL,至约40μg/mL。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于在约6.5的pH下对癌症细胞的IC50值为约10μg/mL至约50μg/mL或约25μg/mL。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于在约7.5的pH下约60μg/mL的IC50值。在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于在约7.4的pH下对癌症细胞的IC50值为约25μg/mL至约150μg/mL,或约60μg/mL。。
在一些实施方案中,功能化多肽纳米颗粒的特征在于MCF-7相对于MCF-7/ADR的IC50比率为约1。
本发明还提供了一种合成式(I)的功能化多肽的方法,包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的单体单元
其中m是从5到100的整数;并且
k是从1到20的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
包括:
a)使聚(L-赖氨酸)与2-甲基-2-硫代假脲反应以形成式(A)的单体单元。
在一些实施方案中,合成式(I)的功能化多肽的方法包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的单体单元
其中m是从5到70的整数;并且
k是从1到20的整数;
其中式(A)的单体单元相对于式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
包括:
a)使聚(L-赖氨酸)与2-甲基-2-硫代假脲反应以形成式(A)的单体单元。
在一些实施方案中,赖氨酸与2-甲基-2-硫代假脲的摩尔比为约1:1至约1:10。在其它实施方案中,摩尔比为约1:1至约1:9、约1:1至约1:8、约1:1至约1:7、约1:1至约1:6、约1:1至约1:5,或约1:2至约1:5。在其它实施方案中,摩尔比为约1:3。
在一些实施方案中,2-甲基-2-硫代假脲由N-保护基团保护。在一些实施方案中,2-甲基-2-硫代假脲由至少一个叔丁氧基羰基(Boc)保护基团保护。在一些实施方案中,2-甲基-2-硫代假脲是1,3-双(叔丁氧羰基)-2-甲基-2-硫代假脲。
在一些实施方案中,当2-甲基-2-硫代假脲被N-保护基团保护时,该方法进一步包括对胍部分进行脱保护的步骤。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使聚(L-赖氨酸)与式(G)的维生素E功能化环状碳酸酯反应以形成式(C)的单体单元的步骤:
在一些实施方案中,聚(L-赖氨酸)与式(G)的维生素E功能化环状碳酸酯的摩尔比为约1:1至约1:10。在其它实施方案中,摩尔比为约1:1至约1:9、约1:1至约1:8、约1:1至约1:7、约1:1至约1:6、约1:1至约1:5或约1:2至约1:5。在其它实施方案中,摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中,该方法进一步包括a)之前的步骤为在开环聚合(ROP)条件下使Nε-苄氧基羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)单体反应并脱保护苄基以形成聚(L-赖氨酸):
在一些实施方案中,在ROP条件下使Lys(Z)-NCA单体反应的步骤进一步包括L-亮氨酸-N-羧酸酐(Leu-NCA)单体:
在一些实施方案中,用苄胺作为引发剂进行ROP。
在一些实施方案中,Lys(Z)-NCA与Leu-NCA的摩尔比为约10:1至约1:1。在其它实施方案中,摩尔比为约9:1至约1:1、约8:1至约1:1、约7:1至约1:1、约6:1至约1:1、约5:1至约1:1、约4:1至约1:1、约3:1至约1:1,或约2:1至约1:1。在其它实施方案中,摩尔比为约2:1。
在一些实施方案中,当Lys(Z)-NCA单体和Leu-NCA单体反应时,式(I)的功能化多肽中亮氨酸的百分比为约10%至约80%。在其它实施方案中,该百分比为约10%至约70%、约10%至60%、约10%至约50%、约10%至约45%、约10%至约40%、约10%至约35%,或约10%至约30%。
在一些实施方案中,当Lys(Z)-NCA单体和Leu-NCA单体反应时,亮氨酸在式(I)的功能化多肽中的百分比为约30%。
本发明还提供一种药物组合物,其包含有效量的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
在一些实施方案中,药物组合物进一步包含在药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在一些实施方案中,药物组合物进一步包含相对于药物组合物约1重量%至约5重量%的羟丙基甲基纤维素。在其它实施方案中,浓度为约1重量%至约4重量%、约1重量%至约3重量%、或约1重量%至约2重量%。
本发明还提供了一种用于治疗微生物感染的方法,该方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽以约0.1mg/kg至约300mg/kg的剂量施用。在其它实施方案中,所述剂量为1mg/kg至约300mg/kg、5mg/kg至约300mg/kg、约5mg/kg至至约280mg/kg、约5mg/kg至约260mg/kg、约5mg/kg至约240mg/kg、约5mg/kg至约220mg/kg、约5mg/kg至约200mg/kg、约5mg/kg至约180mg/kg、约5mg/kg至约160mg/kg、约5mg/kg至约140mg/kg、约5mg/kg至约120mg/kg,约5mg/kg至约100mg/kg、约5mg/kg至约80mg/kg,或约5mg/kg至约60mg/kg。
在一些实施方案中,微生物感染是细菌感染或真菌感染。
在一些实施方案中,微生物感染是革兰氏阳性菌感染、革兰氏阴性菌感染或其组合。
在一些实施方案中,革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌和MRSA,革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克氏菌,真菌为白色念珠菌。
本发明还提供用于治疗微生物感染的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
本发明还提供式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法,该方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
在一些实施方案中,式(I)的功能化多肽以约0.1mg/kg至约300mg/kg的剂量给药。在其它实施方案中,所述剂量为1mg/kg至约300mg/kg、5mg/kg至约300mg/kg、约5mg/kg至至约280mg/kg、约5mg/kg至约260mg/kg、约5mg/kg至约240mg/kg、约5mg/kg至约220mg/kg、约5mg/kg至约200mg/kg、约5mg/kg至约180mg/kg、约5mg/kg至约160mg/kg、约5mg/kg至约140mg/kg、约5mg/kg至约120mg/kg,约5mg/kg至约100mg/kg、约5mg/kg至约80mg/kg,或约5mg/kg至约60mg/kg。
在一些实施方案中,癌症是耐药的癌症。在一些实施方案中,癌症选自膀胱癌症、乳腺癌症、结肠和直肠癌症、子宫内膜癌症、肾脏癌症、白血病、肝脏癌症、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌症、前列腺癌症和甲状腺癌症。在一些实施方案中,癌症是乳腺癌症。
在一些实施方案中,癌症是肿瘤性癌症。
在一些实施方案中,肿瘤被抑制了至少30%。
本发明还提供了用于治疗癌症的式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
本发明还提供式(I)的功能化多肽或功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在某些实施方案中,药学上可接受的形式是异构体。本文中使用的术语“异构体”包括任何和所有几何异构体和立体异构体(例如,对映体、非对映体等)。例如,“异构体”包括顺式异构体和反式异构体、E-异构体和Z-异构体、R-对映体和S-对映体,非对映异构体、(D)-异构体,(L)-异构物、它们的外消旋混合物和它们的其他混合物,这些都在本发明的范围内。例如,在一些实施方案中,可以提供基本上不含相应对映体的异构体/对映体,也可以称为“光学富集”。本文所用的“光学富集”是指该化合物由一种对映体组成的比例明显更大。在某些实施方案中,本发明的化合物由至少约90重量%的优选对映体组成。在其它实施方案中,该化合物由至少约95重量%、98重量%或99重量%的优选对映体组成。优选的对映体可以通过本领域技术人员已知的任何方法从外消旋混合物中分离,包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶,或者通过不对称合成制备。例如,参见Jacques等人,对映异构体、外消旋体和拆分(Wiley Interscience,纽约,1981);Wilen,S.H.等人,四面体33:2725(1977);Eliel,E.L.碳化合物的立体化学(McGraw-Hill,NY,1962);Wilen,S.H.解析剂和光学分辨率表,第268页(E.L.Eliel,编辑,圣母大学出版社,圣母院,1972年)。
还应认识到,本发明的功能化多肽可能具有不对称中心,因此能够以一种以上立体异构形式存在。因此,本发明还涉及在一个或多个不对称中心(例如,大于约90%ee,例如约95%或97%ee或大于99%ee,以及它们的混合物,包括外消旋混合物)以基本纯的异构体形式存在的功能化多肽。这样的异构体可以通过不对称合成来制备,例如使用手性中间体,或者混合物可以通过常规方法来拆分,例如色谱法或使用拆分剂。
本发明的功能化多肽可以作为其在药学上可接受的盐施用给受试者。合适的药学上可接受的盐包括但不限于药学上可接受的无机酸如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐,或药学上可接受的有机酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、马来酸酐、柠檬酸、乳酸、粘液、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯二磺酸、水杨酸环氨基、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和戊酸。
碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵形成的那些。特别地,本发明在其范围内包括阳离子盐,例如钠盐或钾盐,或磷酸基团的烷基酯(例如甲基、乙基)。
碱性含氮基团可以用低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物等试剂;二烷基硫酸盐,如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯;以及其他四分之一化(quarternised)。
应当理解,作为式(I)的功能化多肽的前药的任何功能化多肽也在本发明的范围和精神内。因此,本发明的功能化多肽可以以药学上可接受的前药的形式施用给受试者。术语“前药”在其最广泛的意义上使用,并且包括在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。本领域技术人员很容易想到这样的衍生物。通常描述前药(及其制备)的其他文本包括:前药设计,1985,H.Bundgaard(Elsevier);药物化学实践,1996,Camille G.Wermuth等,第31章(学术出版社);以及药物设计与开发教科书,1991年,Bundgaard等人,第5章(哈伍德学术出版社)。例如,赖氨酸中的氨基部分可以作为酯来保护。
本发明的功能化多肽可以是游离化合物或溶剂合物(例如水合物)的结晶形式,并且这两种形式都在本发明的范围内。溶剂化作用的方法在本领域内通常是已知的。
将本发明的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物或前药以治疗有效量施加给患者。如本文所用,治疗有效量旨在包括至少部分达到所需效果,或延迟微生物感染和/或癌症的发作,或抑制其进展,或完全停止或逆转其进展。
如本文所用,术语“有效量”是指当根据所需给药方案给药时提供所需治疗活性的功能化多肽的量。给药可以每隔几分钟、几小时、几天、几周、几个月或几年进行,也可以在任何一个时间段内连续给药。合适的剂量可以在每剂量约0.1ng/kg体重至1g/kg体重的范围内,例如在每剂量1mg/kg体重至1g/kg的范围内。在一个实施方案中,剂量可以在每剂量每kg体重1mg至500mg的范围内。在另一个实施方案中,剂量可以在每剂量每kg体重1mg至250mg的范围内。在另一个实施方案中,剂量可以在每剂量每kg体重1mg至100mg的范围内,例如每剂量每体重高达50mg。
合适的剂量和给药方案可以由主治医师确定,并且可以取决于病情的严重程度以及待治疗患者的一般年龄、健康状况和体重。
本发明的功能化多肽可以单剂量或一系列剂量给药。虽然活性成分可以单独给药,但优选将其作为组合物,优选作为药物组合物提供。这种组合物的配方是本领域技术人员熟知的。该组合物可以含有任何合适的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括所有常规溶剂、分散介质、填料、固体载体、涂层、抗真菌和抗菌剂、皮肤渗透剂、表面活性剂、等渗剂和吸收剂等。应当理解,本发明的组合物还可以包括其他补充的生理活性剂。
载体必须是药学上“可接受的”,即与组合物的其他成分相容,并且不对患者有害。组合物可以方便地以单位剂量形式存在,并且可以通过药学领域中公知的任何方法制备。这种方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常,组合物是通过使活性成分与液体载体或细碎固体载体或两者均匀而紧密地结合,然后在必要时使产品成型来制备的。
功能化多肽可以直接注射到眼睛,特别是眼睛的玻璃体。本发明的化合物、组合物或组合可以使用任何玻璃体内或经巩膜给药技术给药于眼睛的玻璃体。例如,该化合物、组合物或组合可以通过玻璃体内注射给药于眼睛的玻璃体。玻璃体内注射通常包括以每剂量0.1ng至10mg之间的总量给予本发明的化合物或药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。
用于这种用途的注射剂可以以常规形式制备,或者以液体溶液或悬浮液的形式,或者以适合在注射前以液体中的溶液或悬浮液的形式制备的固体形式,或者作为乳液的形式。载体可以包括,例如,水、盐水(例如,生理盐水(NS)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、平衡盐水溶液(BSS))、乳酸钠林格溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等;如果需要,可以加入少量的辅助物质,如润湿剂或乳化剂、缓冲剂等。可以保持适当的流动性,例如,通过使用诸如卵磷脂的涂层,通过在分散的情况下保持所需的颗粒尺寸,以及通过使用表面活性剂。举例来说,化合物、组合物或组合可溶解于药学上有效的载体中,并使用时间方法(例如,在人眼角膜缘后方约3至约4mm以避免损伤晶状体)用细规中空孔针(例如,30规、1/2或3/8英寸针)注射到眼睛的玻璃体中。
本领域技术人员将理解,也可以使用将功能化多肽或组合物注射和/或给药至眼睛玻璃体的其他手段。这些其他手段可以包括,例如,玻璃体内医疗输送装置。这些装置和方法可以包括,例如,玻璃体内药物递送装置和可生物降解的聚合物递送构件,其插入眼睛中用于药物的长期递送。这些装置和方法可以进一步包括经巩膜递送装置。
包括局部给药或静脉给药的其他给药方式也是可能的。例如,本发明的功能化多肽或组合物的溶液或悬浮液可配制为滴眼液,或配制为直接施用于眼睛表面的膜性眼贴。局部施用通常包括以0.1ng/kg和1g/kg之间的量施用本发明的化合物。
本发明的功能化多肽或组合物也可适用于静脉内给药。例如,式(I)化合物或其在药学上可接受的盐、溶剂合物或前药可以高达1g/kg的剂量静脉内给药。
本发明的功能化多肽或组合物也可适用于口服给药,并可作为离散单元呈现,如胶囊、小袋或片剂,每一个都含有预定量的活性成分;作为粉末或颗粒;作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液;或者作为水包油液体乳液或油包水液体乳液。活性成分也可以以丸剂、软膏或糊状物的形式存在。在另一个实施方案中,式(I)的功能化多肽或药学上可接受的盐、溶剂合物或前药是可口服给药的。
片剂可以通过压缩或模塑制成,任选地使用一种或多种辅助成分。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分来制备,例如粉末或颗粒,任选地与粘合剂(例如惰性稀释剂、防腐剂崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)表面活性剂或分散剂混合。模塑片剂可以通过在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕,并且可以被配制成使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素来提供其中活性成分的缓慢或受控释放,以提供所需的释放曲线。片剂可任选地提供肠溶包衣,以在除胃以外的肠道部分提供释放。
本发明的功能化多肽或组合物可适用于口腔局部给药,包括含片,含片包含调味基质中的活性成分,通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄冈胶;锭剂,其包含惰性基质中的活性成分,如明胶和甘油,或蔗糖和阿拉伯树胶;以及在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。
本发明的功能化多肽或组合物可适用于皮肤局部给药,可包括溶解或悬浮在任何合适载体或基质中的化合物,并且可以是乳液、凝胶、乳膏、糊状物、软膏等形式。合适的载体包括矿物油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡、山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苄醇和水。经皮贴剂也可用于施用本发明的化合物。
本发明的功能化多肽或组合物可适用于肠外给药,包括含水和非水等渗无菌注射溶液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂和溶质,使化合物、组合物或组合与预期受体的血液等渗;以及水性和非水性无菌悬浮液,其可包括悬浮剂和增稠剂。化合物、组合物或组合可存在于单位剂量或多剂量密封容器中,例如安瓿和小瓶中,并且可在使用前立即储存在冻干(冻干)条件下,仅需要添加无菌液体载体,例如注射用水。外用注射溶液和悬浮液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
优选的单位剂量组合物或组合是含有如上所述的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的活性成分的那些。
应该理解的是,除了上述特别提到的活性成分之外,本发明的组合物还可以包括本领域中就所讨论的组合物类型而言常规的其他试剂,例如,那些适合口服给药的试剂可以包括诸如粘合剂、甜味剂、增稠剂、调味剂、崩解剂、涂料、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、褐藻酸或琼脂。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或树莓调味剂。合适的涂层剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物和/或它们的酯、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或面筋。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯基丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油丙酯。
实施例
材料
所有化学品均购自Sigma Aldrich和Tokyo Chemical Industry(新加坡),除非另有规定,否则按原样使用。多粘菌素B购自默克公司。根据已报道的方案(S.Lv,Z.Tang,D.Zhang,W.Song,M.Li,J.Lin,H.Liu,X.Chen,J.可控释放,2014,194,220),通过以正己胺为引发剂的Lys(Z)-NCA单体的ROP和随后的苄基脱保护来合成具有各种DP的PLL。维生素E功能化的环状碳酸酯单体(MTC-VitE)是根据以前的方案制备的(V.W.L.Ng,X.Ke,A.L.Z.Lee,J.L.Hedrick,Y.Y.Yang,Adv.Mater.2013,25,6730)。磷酸盐缓冲盐水(PBS,10×)购自1st BASE,使用前稀释至1×PBS。阳离子调节的米勒-辛顿肉汤(MHB)粉末购自BDDiagnostics,并根据制造商的说明用于制备微生物肉汤。LB琼脂粉,Miller,购自BioBasic,用于根据制造商的说明制备LB琼脂板。金黄色葡萄球菌(ATCC编号6538)、大肠杆菌(ATCC编号25922)、铜绿假单胞菌(ATCC编号9027)、鲍曼不动杆菌(ATCC编号BAA1709)、产β-内酰胺酶SHV-18的肺炎克氏菌亚种肺炎(ATCC编号700603)、白色念珠菌(ATCC编号10231)购自ATCC(U.S.A.)并根据建议的方案进行重组。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌RI0309N(MRSA)是从传染病研究实验室、国家传染病中心和陈笃生医院(Tan Tock Seng Hospital)分离得到的。
实施例
方法
在Bruker AV 400M NMR光谱仪上在D2O、TFA-d、DMSO-d或CDCl3中记录多肽的1HNMR光谱。在配备有超水凝胶线性柱和Waters 2414折射率检测器(洗脱液:H2O:CH3COOH:甲醇:CH3COONa=1080:460:460:82;流速:0.5mL/min;温度:35℃;标准:聚(乙二醇))的Waters2414系统上进行多肽的凝胶渗透色谱(GPC)分析。在Malvern Zen3690ZetasizerNano ZS90(Malvern Panalytical)上测量多肽样品的粒度和泽塔电位。使用芘作为探针,在激发波长为300nm至360nm、发射波长为395nm的FluoroMax-4荧光光谱仪(HORIBAScientific)上通过荧光光谱法测量多肽的临界胶束浓度(CMC)。在UV-3600分光光度计(岛津)上测量多肽的UV-Vis光谱。在Spark 10M多模微孔板读取器(TECAN,瑞士)上测量600nm处的光密度(OD)来估计细菌浓度。
胍功能化PLL聚合物(PLL-Gua)的合成(图1a)
将PLL22(100mg)溶解在二甲基亚砜(DMSO,8.0mL)和三甲胺(Et3N,1.0mL)的溶液中。向该溶液中加入在乙腈(ACN,8.0mL)中的1,3-双(叔丁氧羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(610mg),并在室温(RT,~22℃)下在氮气气氛下搅拌过夜。然后在透析(48小时,MWCO=1000Da,VMeOH/VDCM,1/1;MeOH:甲醇,DCM:二氯甲烷)和真空除去溶剂后获得DP为22的PLL22-Gua(Boc)。
使用酸介导的脱保护策略来去除PLL22-Gua(Boc)中的Boc保护基团。简言之,将PLL22-Gua(Boc)(100mg)溶于DCM(9.0mL)和三氟乙酸(TFA,1.0mL)中,并在室温下搅拌过夜。然后在真空下除去溶剂,将粗PLL22-Gua重新溶于MeOH中,在冷乙醚中沉淀3次。除去残留溶剂后,得到白色固体状的PLL22-Gua。使用类似的方案合成DP为35的PLL35-Gua。
PLL22-Gua(Boc)收率:95%;1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ11.46(Boc-NH-),8.26(-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-),3.83(主链的-CH-),3.36(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2),2.09-1.16(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-和Boc的-CH3)。
PLL22-Gua收率:82%;1H NMR(400MHz,DMSO-d,ppm):δ8.25-6.82(-NH-和-NH2),4.23(主链的-CH-),3.04(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2)、1.79-1.12(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-)。
PLL35-Gua(Boc)收率:92%;1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ11.47(Boc-NH-),8.27(-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-),3.85(主链的-CH-),3.37(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2),2.12-1.10(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-和Boc的-CH3)。
PLL35-Gua产量:83%;1H NMR(400MHz,DMSO-d,ppm):δ8.25-6.84(-NH-和-NH2),4.24(主链的-CH-),3.06(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2)、1.77-1.16(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-)。
胍和维生素E功能化PLL聚合物(PLL-Gu-VitE)的合成(图1b)
使用用于PLL-Gua的合成的类似方案来制备PLL-Gua-VitE。简言之,将PLL22(100mg)溶解在DMSO(8.0mL)和Et3N(1.0mL)的溶液中。随后,加入MTC-VitE(19.6mg)在DMSO中的溶液,并将混合物在RT下搅拌8小时。之后,加入1,3-双(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(610mg)的溶液在ACN(8.0mL)中并将混合物于RT下搅拌过夜。然后对粗PLL-Gua-VitE进行与PLL-Gua相同的纯化和脱保护程序。通过使用以下公式测量DMSO中285nm处的UV-Vis吸光度来计算VitE负载量:
VitE负载含量(%)=负载的VitE的重量/聚合物的重量*100%
PLL22-Gua(Boc)-VitE收率:90%;1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ11.47(Boc-NH-),8.27(-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-),3.86(主链的-CH-),3.37(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2),2.14-0.97(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-、Boc的-CH3和VitE的重叠峰),0.90-0.76(VitE的重叠-CH3)。
PLL22-Gua-VitE收率:85%;1H NMR(400MHz,DMSO-d,ppm):δ8.23-6.84(-NH-和-NH2),4.24(主链的-CH-),3.05(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2)、2.04-0.91(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-和VitE的重叠峰),0.89-0.75(VitE的重叠-CH3)。
PLL35-Gua(Boc)-VitE收率:91%;1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ11.46(Boc-NH-),8.25(-CH2-CH2-CH2-CH2-NH),3.85(主链的-CH-),3.36(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2),2.16-0.95(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-、Boc的-CH3和VitE的重叠峰),0.89-0.75(VitE的重叠-CH3)。
PLL35-Gua-VitE收率:83%;1H NMR(400MHz,DMSO-d,ppm):δ8.23-6.84(-NH-和-NH2),4.24(主链的-CH-),3.05(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2)、2.05-0.95(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-和VitE的重叠峰),0.89-0.75(VitE的重叠-CH3)。
胍功能化共聚物(p(lys(Gua)-r-leu))的合成(图5)
以苄胺为引发剂,通过Lys(Z)-NCA和Leu-NCA单体的ROP合成了无规共聚物p(lys-r-leu),随后对苄基进行脱保护。p(lys(Gua)-r-leu)然后使用用于PLL-Gua的合成的类似方案来制备。
p(lys(Z)-r-leu)收率:87%;1H NMR(400MHz,TFA-d,ppm):δ7.35(C6H5-),5.24(γ-苄基的C6H5-CH2),4.85-4.49(主链的-CH-),3.27(赖氨酸的-CH2-NH-),2.13-1.33(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-,亮氨酸的-CH2-CH-),1.11-0.85(亮氨酸的-CH3)。
p(lys-r-leu)收率:80%;1H NMR(400MHz,D2O,ppm):δ7.48-7.26(引发剂的C6H5-),4.28(主链的-CH-),2.93(赖氨酸的-CH2-NH-),1.9-1.22(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-,亮氨酸的-CH2-CH-),1.00-0.77(亮氨酸的-CH3)。
p(lys(Gua(Boc))-r-leu)收率:90%;1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ11.46(Boc-NH-),8.27(-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-),4.17-3.66(主链的-CH-),3.27和3.06(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2-),2.16-1.16(亮氨酸的-CH3)。
p(lys(Gua)-r-leu)收率:90%;1H NMR(400MHz,D2O,ppm):δ7.45-7.24(引发剂的C6H5-),4.45-3.05(主链的-CH-),3.15和2.99(赖氨酸的-CH2-NH-或-CH2-NH2-),2.0-1.18(赖氨酸的-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-,亮氨酸的-CH2-CH-),1.00-0.77(亮氨酸的-CH3)。
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)/最小杀真菌浓度(MFC)的测量
使用肉汤微稀释法测定多肽对微生物的MIC。将细菌在MHB中孵育过夜,并用MHB稀释细菌悬浮液以达到108菌落形成单位(CFU)/mL的浓度(O.D.600=0.07)。随后在MHB中将其稀释1000倍。然后将细菌悬浮液接种到96孔板(100μL/孔)中,并与100μL含有不同多肽浓度的MHB混合。将96孔板在37℃下培养18小时(细菌)或在RT下培养42小时(白色念珠菌)。MIC被确定为多肽的最低浓度,在该浓度下,使用微孔板读数器没有测量浊度变化。
在MIC实验结束时评估MBCs/MFCs。然后将微生物悬浮液铺展在LB琼脂平板上,并将平板在37℃下培养18小时(细菌)或在RT下培养42小时(酵母),以测定每个琼脂平板上的CFU。实验分三次进行。
溶血试验
用大鼠红细胞(RBCs)研究多肽的溶血作用。简言之,将全血以600×g离心10分钟,并用新鲜PBS洗涤以获得RBCs。用10mL PBS稀释大鼠RBCs(0.3mL)以供使用。将多肽溶解在PBS中,并加入圆底96孔板(100μL/孔)中。然后加入等体积的含RBC的PBS溶液,将平板在37℃下孵育1小时。为了测定溶血性,将平板以600×g离心10分钟,将100μL上清液转移到新平板中。使用微板读取器测量576nm处的吸光度。PBS(100μL)用作阴性对照,4%Triton-X溶液(100μL)用作阳性对照。溶血程度(%)通过以下公式计算,数据以平均值±SD(n=3)表示。
溶血(%)=(Ae-An)/(Ap-An)*100%
其中Ae、An和Ap分别表示实验孔、阴性对照孔和阳性对照孔的吸光度。
多肽的杀灭动力学
将不同浓度(1×MIC、2×MIC和4×MIC)的MHB多肽水溶液加入等体积的细菌或酵母(白色念珠菌)悬浮液(106CFU/mL)中。在每个指定的时间点,取出100μL等分的悬浮液,在MHB中连续稀释,然后铺展到LB琼脂板上。然后将平板在37℃下孵育18小时(细菌)或在RT下孵育42小时(酵母)以进行菌落计数。
硝噻吩(Nitrocefin)测定的机理研究
利用硝噻吩监测细菌的外膜渗透性,探讨了其作用机理。简言之,在盐水中以不同浓度制备多肽,并将50μL多肽溶液加入96孔板中。用MHB将产生β-内酰胺酶SHV-18的肺炎克氏菌悬浮液稀释至O.D.600=0.11,离心(3000×g)5分钟,并用盐水冲洗一次所得颗粒,然后再悬浮在等体积的盐水中。得到的细菌悬浮液(100μL/孔)加入到聚合物溶液中,然后加入生理盐水中的硝噻吩溶液(50μL/孔),使聚合物的最终浓度保持在1×MIC和2×MIC,使硝噻吩的最终浓度为50μL/mL。将96孔板在37℃的黑暗中孵育。在预定的时间点测量波长为500nm的UV吸光度。生理盐水和多粘菌素B(4μL/mL)分别作为阴性对照和阳性对照。
共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)
还通过碘化丙啶(PI)染色和CLSM分析研究了细菌膜的渗透性。详细地说,将产生β-内酰胺酶SHV-18的肺炎克氏菌在37℃的4孔室载玻片中孵育过夜,以使细菌粘附在载玻片上。多肽溶液(2×MIC,700μL)然后添加到每个孔中,并在37℃下孵育1小时。然后移除生长培养基,并用PBS冲洗孔。细菌细胞用PI染色(30μM、1mL)在RT下放置15分钟,然后用PBS(1mL)冲洗并在福尔马林溶液中固定10分钟。最后,将盖玻片放置在玻璃显微镜载玻片上并用指甲油固定。在CLSM(Olympus FluoViewTM FV300共聚焦显微镜)下观察PI染色。
微生物耐药性评价
以革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为模型菌,评价微生物对PLL22-Gua的耐药性发展。将细菌(106CFU/琼脂)划线到含有不同浓度PLL22-Gua的LB琼脂平板上,并将平板在37℃下孵育过夜以生长菌落(如果有的话)。MBCagar定义为达到99.9%杀灭率的浓度。然后将较高浓度的MRSA扩散到含有1×MBCagar的琼脂上,以测定对PLL22-Gua的抗性频率。
动物
雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)和雌性Balb/c裸鼠(6-7周龄)获自INVIVOS PTE.LTD.(新加坡)。小鼠在无特定病原体的动物实验室中饲养。动物研究方案得到了新加坡科学、技术和研究机构生物资源中心动物护理和使用委员会(A*STAR)的批准。
体内MRSA诱导的小鼠伤口感染
在MRSA感染的伤口感染模型上评估PLL22-Gua的体内抗菌功效。简言之,去除麻醉小鼠背部的毛发,并用10%聚维酮碘溶液和75%乙醇清洁暴露的皮肤。然后创建三个1cm长的平行伤口,并用对数生长的MRSA(1×1010CFU/mL,60μL)感染1小时。之后,处死一组小鼠以测定感染部位的细菌计数。然后将剩余的小鼠随机分为4组(n=6或7),第1组:生理盐水;第2组:PLL22-Gua(10mg/kg);第3组:PLL22-Gua(20mg/kg);第4组:PLL22-Gua(40mg/kg)。将生理盐水或PLL22-Gua溶液(60μL)涂抹在感染部位,持续2天(2剂/天)。在观察期结束时,收集受感染的皮肤并在1.0mL无菌PBS中匀浆以进行细菌活力计数。结果以lg(CFU/皮肤)表示。通过细菌计数的减少(CFU减少)来量化抗菌功效,使用以下方程计算:
细菌计数减少(%)=(CFU无处理-CFU实验)/CFU无处理×100%
其中CFU无处理和CFU实验分别表示第1天无处理组和第3天实验组的CFU。数据以平均值±SD表示(n=6或7)。
急性皮肤毒性
将小鼠随机分为2组(3只小鼠/组)。小心地去除麻醉小鼠背部的毛发,以避免损伤皮肤。为了增加PLL22-Gua的生物粘附性,在施用到皮肤上之前,将1%(羟丙基)甲基纤维素2910(HPMC)添加到多肽溶液中,并且每只小鼠的PLL22-Gua的剂量为200mg/kg。另一组未经多肽治疗的小鼠作为对照。将处理过的小鼠观察2小时,以检查是否有任何异常行为。之后,对两组小鼠进行为期14天的观察,特别关注皮毛的变化。在观察期结束时,记录小鼠的体重。还收集小鼠背部的皮肤样本和正常组织样本(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏),并在10%福尔马林中固定,然后进行苏木精和曙红(H&E)染色。
mPEG-b-PLG的合成
以mPEG-NH2为引发剂,通过BLG-NCA单体的开环聚合(ROP),然后对苄基进行脱保护,制备了二嵌段共聚物甲氧基-聚(乙二醇)-b-聚(L-谷氨酸钠盐)(mPEG-b-PLG)。将粗产物沉淀到过量的冷却的乙醚中分离,并在真空下干燥。通过溶解在DMSO和饱和NaHCO3中,使用截留分子量(MWCO)为3500Da的透析膜对蒸馏水进行透析,并冷冻干燥,得到纯白色固体产物mPEG-b-PLG,从而进一步纯化。PLG单元的聚合度(DP)为35。
mPEG-b-PLG收率:79%;1H NMR(400MHz,D2O,ppm):δ4.29(酰胺的-CH-),3.70(PEG链),2.36–1.80(-CH2-CH2-COONa)。
mPEG-b-PLL的合成
以mPEG-NH2为引发剂,通过Lys(Z)-NCA单体的开环聚合(ROP)和苄基的脱保护,合成了甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-赖氨酸)(mPEG-b-PLL)。mPEG-NH2的分子量为5000Da,PLL单元的聚合度(DP)为26。
mPEG-b-PLL/CDA的合成
合成了甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-赖氨酸)(mPEG-b-PLL)来递送PLL22-Gua。mPEG的分子量为5000Da,PLL单元的聚合度(DP)为26。为了制备mPEG-PLL/CDA,将mPEG-b-PLL(100.0mg)溶于5%NaHCO3中,加入环己烯-1,2-二羧酸酐(CDA)(47.3mg)。将反应在4℃下搅拌4小时,并使用截留分子量(MWCO)为3500Da的膜对pH 9的水透析混合物,然后冷冻干燥以获得纯白色固体mPEG-PLL/CDA。
mPEG-PLL/CDA收率:88%;1H NMR(400MHz,D2O,ppm):δ4.29(酰胺的CH),3.70(PEG链),3.19(-CH2-CH2-NH-CO-),3.00(-CH2-CH2-NH2),2.32-2.10(CDA基团的-CH2-C=C-CH2-),1.62(CDA基团的CH2-CH2-CH2-CH2),1.92-1.24(CDA基团的CH2-CH2-CH2-CH2-NH和CDA基团的CH2-CH2-CH2-CH2)。
季铵功能化多肽(PLL-Qua)的合成
合成了聚(L-赖氨酸)(PLL),聚合度(DP)为22。通过PLL的甲基化反应制备了具有季铵功能的多肽(PLL-Qua)。简言之,将PLL(50.0mg)溶解在6.0mL去离子(DI)水/DMSO(1:1)混合物中,并将Et3N(0.5mL)缓慢添加到上述溶液中。然后将碘甲烷(CH3I,0.2mL)逐滴加入PLL溶液中。将反应物在室温下在黑暗中搅拌过夜,并使用MWCO 2000的膜对水进行透析,然后冷冻干燥以获得白色固体PLL-Qua。
收率:85%;1H NMR(400MHz,D2O,ppm):δ4.35(酰胺的CH),3.36(-CH2-CH2-CH2-CH2-N-),3.14(季铵基团的-CH3),1.97-1.24(-CH2-CH2-CH2-CH2-N-)。
纳米颗粒(Gua-NPs、PLL NPs和Qua-NPs)的制备
通过简单的混合方法制备了Gua-NPs。简言之,将PLL22-Gua(10.0mg)和mPEG-PLL/CDA(18.0mg)分别溶解在去离子水中。在冰浴中超声处理下,将mPEG-PLL/CDA溶液缓慢滴入PLL22-Gua中,获得纳米颗粒(Gua-NPs)。
将PLL(4.0mg)和mPEG-b-PLL/CDA(14.5mg)混合以获得PLL-NPs。将PLL-Qua(4.0mg)和mPEG-b-PLL/CDA(10.0mg)混合以获得Qua-NPs。此外,带负电荷的mPEG-b-PLG也被用于制备纳米颗粒。具体地,将PLL(3.6mg)和mPEG-b-PLG(5.0mg)混合以获得PLL混合物。将PLL-Qua(3.6mg)和mPEG-b-PLG(5.0mg)混合以获得Qua混合物。将PLL-Gua(4.9mg)和mPEG-b-PLG(5.0mg)混合以获得Gua混合物。
细胞培养
人类乳腺癌症细胞系BT-474、MCF-7和MCF-7/ADR购自ATCC。细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基(RPMI 1640,Gibco)中于37℃、5%CO2气氛中培养。由RPMI 1640通过用HCl降低其pH来制备pH为6.5的RPMI 1644培养基。
体外细胞毒性测定
将BT474细胞(7000个细胞/孔)接种在96孔黑色板中,并孵育过夜以进行细胞粘附。然后,将100μL具有不同浓度mPEG-PLL/CDA、PLL22-Gua和Gua-NPs的正常或pH 6.5培养基替换到板中。培养48小时后,取出培养基,加入alamarBlue细胞活力试剂。在37℃中再孵育4小时后,可以使用微孔板读取器检测颜色变化和荧光增加(激发:530-560nm;发射:590nm)。并且根据以下方程计算细胞活力:
细胞活力(%)=(I样本-I背景)/(I对照-I背景)
I样本和I对照分别表示处理过的细胞和未处理的细胞的荧光强度。I背景表示没有细胞的孔的荧光强度。数据以平均值±标准差(SD)(n=6)表示。
此外,还用类似的方法通过alamarBlue分析验证了mPEG-PLL/CDA和PLL22-Gua的细胞毒性。
此外,Gua-NPs和PLL22-Gua对MCF-7和MCF-7/ADR的细胞毒性也使用相同的测定法测量,细胞密度为每孔5000个细胞。使用盐酸阿霉素(DOX)作为阳性对照。对于MCF-7和MCF-7/ADR,所用DOX的初始浓度分别为10μg/mL和100μg/mL。
BT-474杀灭动力学
使用PLL-Gua和Gua-NPs对BT-474细胞进行时间杀灭动力学测定。简言之,将细胞(7000/孔,100μL/孔)接种在96孔黑色平板中并孵育过夜。然后,将100μL具有不同浓度PLL-Gua(25、50和100μg/mL)和Gua-NPs(50、100和150μg/mL,基于PLL-Gua)的培养基替换到孔中。在孵育预定时间段(10分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时、9小时40分钟、24小时和48小时)后,除去培养基,并加入AlamarBlue细胞活力试剂以测量细胞活力。实验分6个重复进行,结果用误差条显示的平均细胞活力(%)±标准偏差表示。
Alexa Fluor 488标记的Gua纳米颗粒的合成(AF-488@Gua-NPs)
Alexa FluorTM 488NHS酯(1.0mg)溶于2mL DMSO中,PLL-Gua(19mg)溶于5mL 0.1MNaHCO3中。将两种溶液混合并在RT下搅拌4小时。使用MWCO 1000的膜对DI水透析混合物以去除游离染料分子,然后冷冻干燥以获得黄绿色固体Alexa Fluor 488标记PLL-Gua(AF-488@PLL-Gua)。AF-488@PLL-Gua(5.0mg)和mPEG-b-PLL/CDA(9.0mg)分别溶解在DI水中。在冰浴中超声处理下,将mPEG-b-PLL/CDA溶液逐滴加入PLL-Gua溶液中,以获得Alexa Fluor488标记的Gua-NP(AF-488@Gua-NPs)。测量了Gua-NPs在不同pH缓冲液中的形成和稳定性。
Gua-NPs的机制研究
通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)探讨了Gua-NPs的抗癌机制。对于流式细胞术测定,将MCF-7细胞(2×105/孔)接种在12孔板中并孵育过夜。将培养基替换为含有Gua-NPs(50和100μg/mL,以PLL-Gu为基础)或PLL-Gua(25和50μg/mL)的新鲜培养基,并孵育2小时。紫杉醇(PTX,48μg/mL)和Triton-X100(0.01%)分别用作对照以诱导细胞凋亡和坏死。孵育2小时后,分离细胞并进行胰蛋白酶消化、收集并以1500rpm离心5分钟。接下来,根据制造商的说明,用Alexa488膜联蛋白V和PI对细胞进行染色。然后通过BDLSR II流式细胞仪(BD Biosciences,U.S.A.)分析样品。在3个重复中进行实验,结果表示为误差条所示的平均凋亡率(%)±标准偏差。
对于CLSM测定,将BT-474细胞(1.4×105/室,0.7mL/室)接种在小室(II小室盖玻片、硼硅酸盐玻璃,小室尺寸4)中并孵育过夜。接下来,加入含有Alexa Fluor 488标记的Gua-NPs(基于Alexa Fluor488标签的PLL-Gua为25μg/mL)或Alexa Fluor 488标记PLL-Gua(25μg/mL)的新鲜培养基,并在37℃孵育30分钟。然后,在加入Hoechst 33342溶液(2μM)并在37℃下孵育10分钟之前,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞持续10分钟。用PBS洗涤残留的Hoechst 33342后,加入LysoTrackerTM深红溶液(100nM)并在37℃下孵育10分钟。最后,使用CLSM(Carl Zeiss LSM 710共焦显微镜,德国)对样品进行可视化。
抑制细胞迁移
将MCF-7细胞(8×105/孔)接种在6孔板中并孵育过夜以进行细胞粘附。为了产生划痕,使用200μL移液管尖端刮出一条穿过细胞层的直线。去除旧培养基并用PBS洗涤,在显微镜下观察细胞以获得原始划痕的图像。加入含有IC50(导致50%细胞生长抑制的聚合物浓度)的DOX、PLL-Gua或Gua-NPs的新鲜培养基并孵育24小时。之后,使用显微镜(Leica,德国)观察划痕并成像。
细胞形态染色
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞以1000个细胞/孔的密度接种在384孔板(PerkinElmerView Plate-384 Black)中的50μL培养基中。将板在37℃孵育过夜,5%CO2用于细胞回收。PLL-Gua和Gua-NPs的最终浓度为25μg/mL(基于PLL-Gua),DOX为5.8μg/mL,最终体积为40μL/孔。将细胞与PLL-Gua、Gua-NPs或DOX孵育24小时(37℃、5%CO2)。随后,用最终浓度为100nM的培养基中的Mito Tracker深红溶液对线粒体进行染色。细胞用5%CO2在37℃的黑暗中孵育30分钟。为了固定细胞,将20μL在PBS中的16%甲醛加入到每个孔中(最终浓度:4%),并在室温下在黑暗中孵育20分钟。用70μL Hanks'平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞两次。向每个孔中加入20μL染色溶液,其中含有1%牛血清白蛋白(BSA)、0.1%Triton X-100、8.25nM Alexa FluorTM594Phalloidin,5μg/mL伴刀豆蛋白A(Alexa FluorTM488缀合物)、1μg/mL Hoechst 33342、1.5μg/mL小麦胚凝集素-Alexa555缀合物和6μM SYTOTM14溶液。将细胞在黑暗中室温孵育30分钟。然后,用70μL HBSS洗涤细胞三次。在最后的洗涤步骤之后,HBSS没有被抽吸。将板密封并以500rpm离心1分钟。然后使用Opera Phenix高含量筛选显微镜(PerkinElmer),4个通道(Ex405/Em456;Ex488/Em522;Ex561/Em599;Ex640/Em706),每个孔9个位点,放大63倍(像素合并(binning)2)对板进行成像。
体内毒性评估
15只健康Balb/c小鼠随机分为3组:第一组:未治疗对照组(n=5);第2组:PLL-Gua(10mg/kg,n=5);第3组:Gua-NPs(20mg/kg,以PLL-Gua为基础,n=5)。PLLGua和Gua-NP在第0、4、8、11、15和18天通过尾静脉注射。在第21天处死所有小鼠。采集血样用于血液化学和血常规测定。切除主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)并固定在福尔马林溶液中,包埋在石蜡中,然后用苏木精和伊红(H&E)染色。
LD50的评估
LD50是在给定时期内导致50%的受治疗小鼠死亡的剂量。简言之,Balb/c小鼠静脉内(i.v.)注射不同剂量的PLL-Gua或Gua-NPs。LD50值是使用Dixon’s方法(J.Am.Statistical Association 60(1965)967–978)根据经处理小鼠7天的存活率估算的。
体内生物分布
将悬浮在Matrigel/RPMI 1640培养基(1:1)中的BT-474细胞(5×106/小鼠)皮下注射到Balb/c裸鼠的右侧腹中。同时,将17β-雌二醇颗粒(pellets)(1个颗粒/小鼠)皮下接种到小鼠颈部以诱导肿瘤生长。26天后,将携带BT-474肿瘤的小鼠分为2组:第1组:AlexaFluor 750标记的PLL-Gua(10mg/kg);第2组:Alexa Fluor 750标记的Gua-NPs(10mg/kg,以Alexa Fluor 750标记PLL-Gua为基础)。在预先确定的时间点(6、24和48小时),处死小鼠(n=3/组),切除肿瘤和正常组织(脑、心脏、肝、脾、肺和肾),并使用小动物IVIS体内成像系统(PerkinElmer,U.S.A.)成像。
体内抗癌功效
将悬浮在Matrigel/RPMI 1640培养基(1:1)中的BT474细胞(5×106/小鼠)皮下注射到Balb/c裸鼠的右侧腹中。同时,将17β-雌二醇颗粒(1个颗粒/小鼠)皮下接种到小鼠颈部以诱导肿瘤生长。21天后,将携带BT474肿瘤(~130mm3)的小鼠分为2组(第0天):第1组:未治疗的对照组;第2组:Gua-NPs(20mg/kg PLL22 Gua)。在第0、2、7、9、14和17天通过尾静脉注射Gua-NPs。通过游标卡尺测量肿瘤体积以评估抗肿瘤活性。还记录了体重,以评估Gua-NPs的全身毒性。在第21天,处死小鼠,并对切除的肿瘤进行拍照和称重。肿瘤体积(Vt,mm3)和肿瘤抑制率(TSR,%)通过以下公式计算:
肿瘤体积(Vt,mm3)=a×b2/2
肿瘤抑制率(TSR,%)={(Vc-Ve)/Vc}×100%
其中a和b分别是肿瘤的最长和最短直径。Vc和Ve分别是对照组和实验组在第21天的肿瘤体积的平均值。
携带肿瘤小鼠肿瘤组织和正常器官的组织学分析
在第21天,切除肿瘤和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏),并将其固定在福尔马林溶液中,包埋在石蜡中,然后用H&E染色。根据制造商的说明,还用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记(TUNEL)(Merck,美国)对肿瘤进行染色。
统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用双尾Student’s-t检验对数据进行统计显著性分析*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001分别被认为具有统计学意义、高度显著性和极高显著性差异。
PLL-Gua的合成
合成了DP为22和35的PLL并分别表示为PLL22和PLL35。使用1,3-双(叔丁氧羰基)-2-甲基-2-硫代假脲作为胍化剂,然后通过TFA介导的Boc保护基团的脱保护,合成了胍(Guanidinium)功能化PLL(图1A)。以PLL22-Gua为代表性实例,胍功能化的成功通过分别在δ1.46和11.46ppm处出现峰d(Boc基团中的-CH3)和e(Boc-NH-)来证实(图2A)。通过峰a和e下的积分面积确定的功能化程度为95%。峰e和d的消失(图2B)表明Boc保护基团完全脱保护。GPC分析显示PLL22-Gua和PLL35-Gua的数均分子量(Mn)分别为3.3×103g/mol和4.7×103g/mol。此外,它们具有窄分布,PDI分别为1.4和1.3。
PLL-Gua-VitE的合成
聚合物的疏水性影响其抗菌活性。为了增加PLL-Gua聚合物的疏水性,通过维生素E功能化的环状碳酸酯(MTC-VitE)的开环偶联维生素E基团。PLL-Gua-VitE的合成与PLL-Gua的合成相似,并且维生素E基团偶联到侧链上(图1B)。以PLL22-Gua(Boc)-VitE为代表性例子,在δ0.90-0.76ppm处出现峰f(维生素E中的-CH3),表明维生素E的结合成功(图3)。随后峰e和d的消失证实了Boc基团的完全脱保护。用紫外-可见光谱法测定了PLL22-Gua-VitE和PLL35-Gua-VitE的维生素E含量,分别为15.9%和9.2%。
具有额外的疏水组分,PLL22-Gua-VitE和PLL35-Gua-VitE能够自组装,分别形成直径为16nm和13nm的胶束。此外,它们的低临界胶束浓度(CMC)值(分别为8.3μg/mL和11.1μg/mL)表明这些胶束具有优异的稳定性。在PBS中,ζ分别为+8.6±0.98和+11.3±1.18mV,这些胶束能够与带负电的细菌膜表面相互作用。
p(lys(Gua)-r-leu)的合成
以苄胺为引发剂,通过Lys(Z)-NCA和Leu-NCA的ROP合成了同时含有胺官能团和亮氨酸基团的两亲性无规共聚物p(lys-r-leu),然后脱保护TFA和HBr/CH3COOH中的苄基(图4)。通过1H NMR光谱证实了p(lys-r-leu)的成功合成,其包含29个赖氨酸重复单元和12个亮氨酸重复单元。在1H NMR中,分别在δ7.35和5.25ppm处的峰e(-PhH-)和d(Ph-CH2-)的消失表明P(lys(Z)-r-leu)成功脱保护。p(lys-r-leu)的GPC分析显示,该多肽的锰含量为5.1×103g/mol,分布狭窄,PDI为1.1。
p(lys-r-leu)的胍功能化以与PLL类似的方式进行(图5),如分别在δ1.45和11.46ppm处出现的峰d(Boc基团中的-CH3)和e(Boc-NH-)所证实的,功能化程度为93%。通过峰d和e的消失证实了在DCM/TFA中Boc的完全脱保护。得到的多肽p(lys(Gua)-r-leu)的Mn为4.5×103g/mol,分布狭窄,PDI为1.2。有趣的是,p(lys-r-leu)和p(lys(Gua)-r-leu)即使在1000μg/mL的浓度下也没有形成胶束。
体外抗菌活性
评估了合成的胍功能化多肽对一系列微生物的体外抗菌活性,包括革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和MRSA)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克氏菌)和酵母白色念珠菌。结果总结在表1中。所有胍功能化多肽均表现出广谱抗菌活性,MIC为15.6-125μg/mL。与非功能化的对应物相比,胍功能化的PLL聚合物更有效,尤其是对金黄色葡萄球菌、MRSA、鲍曼不动杆菌、肺炎克氏菌和白色念珠菌。这突出了胍功能化的重要性。然而,通过在PLL-Gua的侧链中添加维生素E基团来增加其疏水性,并没有显著提高抗菌活性,但它导致对金黄色葡萄球菌、MRSA、肺炎克氏菌和白色念珠菌的杀菌活性降低,可能是因为PLL-Gua-VitE的胶束形成阻止了其疏水成分与细菌膜的相互作用。疏水性更强的p(lys(Gua-r-leu)的MBC值低于PLL35-Gua对抗大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的MBC(表1)。疏水性维生素E与生长培养基中存在的蛋白质的相互作用可能阻止其插入细菌膜。此外,多肽的长度似乎不会影响它们的抗菌活性。抗微生物剂的(MBC或MFC)/MIC比率(R)可用于评估其杀菌/杀真菌潜力。如果聚合物的R值不超过4,则聚合物具有良好的杀菌/杀真菌潜力。针对大多数测试的细菌类型,胍功能化多肽(PLL-Gua,p(lys(Gua-r-leu))的R值小于4。因此,PLL-Gua和p(lys(Gua-r-leu))是体内治疗细菌感染的良好候选者。
表1合成的抗微生物剂对各种类型微生物的MIC和MBC(μg/mL)。R=(MBC或MFC)/MIC。R≤4表示杀菌/杀真菌活性。
多肽的溶血活性
溶血活性已被广泛用作膜活性抗菌聚合物毒性的初始指标。如图6A、6B和表2所示,在胍功能化后,PLL22-Gua和PLL35-Gua保持非溶血性(HC50>4000μg/mL)。它们的低溶血活性表明PLL-Gua对微生物的选择性高于哺乳动物细胞。还观察到疏水性维生素E和亮氨酸的引入增加了多肽的溶血活性。p(lys-r-leu)与胍官能团的功能化也导致其溶血活性的增加。
表2体外针对大鼠RBCs的溶血试验。
aHC50或HC10是在溶血测定中观察到至少10%或50%的最大裂解的最小浓度。
多肽的杀灭动力学
在1×MIC、2×MIC和4×MIC条件下,研究了PLL22、PLL22-Gua和PLL22-Gua-VitE对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的体外杀灭动力学。通常,多肽表现出快速杀灭动力学,细菌根除率取决于浓度(图7)。在相同浓度下,这些多肽杀死金黄色葡萄球菌的速度比大肠杆菌和白色念珠菌快得多。例如,虽然PLL22-Gua在2×MIC下能够在0.5小时内完全根除金黄色葡萄球菌,但必须花3小时才能完全根除白色念珠菌,即使在3小时后,它也只导致大肠杆菌减少2-log。比较PLL22-Gua和PLL22,很明显,胍功能化基团的存在增强了杀灭动力学。PLL22-Gua在1×MIC和2×MIC下对金黄色葡萄球菌表现出最快的杀灭动力学。在1×MIC下,PLL22-Gua需要1.5小时,而PLL22和PLL22-Gua-VitE分别需要2.5和2.0小时,以实现细菌计数的6-log减少。总之,PLL22-Gua是一种优秀的候选抗菌药物。
硝噻吩测定的机理研究
硝噻吩因含有β-内酰胺环,易受β-内酰胺酶影响,水解后颜色迅速从黄色变为红色。SHV-18是由肺炎克氏菌产生的β-内酰胺酶,存在于周质间隙。因此,受损的细菌外膜将导致硝噻吩的水解,因为受损的膜允许硝噻吩渗透。能够破坏细菌外膜的多粘菌素B用作阳性对照,而生理盐水用作阴性对照。
如图8A所示,1×MIC和2×MIC的PLL22在孵育后3小时引起与多粘菌素B相同程度的硝噻吩水解。这表明PLL22通过破坏细菌的外膜来杀死细菌,并且破坏的程度与时间有关。另一方面,相对于多粘菌素B,即使在孵育4小时后,PLL22-Gua也只引起约50%的硝噻吩水解(图8B)。这表明PLL22-Gua主要通过膜移位来杀死细菌。这解释了为什么PLL22-Gua的浓度从1×MIC增加到2×MIC并没有导致硝噻吩烃水解的增加。有趣的是,PLL22-Gua-VitE引起的硝噻吩断裂是浓度依赖性的(图8C)。这意味着PLL22-Gua-VitE在更高的浓度(2×MIC)下破坏了细菌外膜,这可能是由于多肽和膜的脂质结构域之间的疏水相互作用增强。
机理研究-CLSM分析
膜渗透性的变化也可以通过CLSM使用PI染色来研究。如果膜完整性受损,PI将能够穿透细胞并与细菌DNA结合,从而增强荧光强度。如图9所示,在生理盐水处理的肺炎克氏菌中没有观察到红色荧光,这意味着它们的细菌膜是完整的。相反,在用PLL22处理1小时的大多数细菌细胞中观察到红色荧光,表明它们的膜完整性受到损害。在其他含有季铵基团的合成抗微生物聚合物中也观察到这种膜破坏行为。
然而,用PLL22-Gua处理的细菌显示出很少的红色荧光,这表明PLL22-Gua通过膜易位机制杀死细菌。另一方面,在与PLL22-Gua-VitE孵育1小时后,在部分细菌细胞中观察到红色荧光,表明聚合物在一定程度上引起膜破坏。这些观察结果与硝噻吩染色测定的结果一致。
细菌耐药性评估
据预测,到2050年,耐抗生素的“超级细菌”每年将导致1000多万人死亡。因此,评估PLL22-Gua对细菌的抗性频率是重要的。MRSA(106CFU/琼脂)在含有不同浓度PLL22-Gua的LB琼脂板上划线,以测定MBCagar,其中实现99.9%的细菌杀灭。如图10A所示,PLL22-Gua的MBCagar为1500μg/mL。之后,将MRSA悬浮液(107CFU/琼脂)划线到含有1500μg/mL的PLL22-Gua的LB琼脂板上(图10B)。平板上没有抗性菌落,因此确定对PLL22-Gua的抗性频率小于1/(3×107)=3.3×10-8。低抗性频率证明了PLL22-Gua作为大分子抗菌剂在体内对抗抗微生物耐药性方面的潜在应用。
MRSA诱导的小鼠伤口感染模型中的体内抗菌效果
为了证明PLL22-Gua在体内治疗MDR感染中的潜在应用,在小鼠模型中应用PLL22-Gua治疗MRSA诱导的伤口感染。将MRSA(6×108CFU/皮肤)应用于伤口部位1小时,然后在2天内用PLL22-Gua溶液进行4剂治疗(2剂/天)。为了评估PLL22-Gua的体内杀菌作用,收集感染的皮肤组织,匀浆,并在LB琼脂板上培养,进行CFU计数(图11A)。在生理盐水处理组中,细菌负荷在第3天减少了0.71gCFU,表明细菌负荷稳定。相反,PLL22-Gua治疗后,剂量分别为10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg时,2.07lg CFU、2.26lg CFU和2.30lg CFU的对数减少显著增加(图11A)。当PLL22-Gua以10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg的剂量施用时,细菌去除率分别为99.1%、99.4%和99.5%,显示出优异的体内抗菌功效。鉴于体内验证,PLL22-Gua是一种很有前途的大分子抗菌剂,可以对抗MRSA引起的皮肤感染。
急性皮肤毒性
急性皮肤毒性是另一个重要指标,尤其是皮肤给药物质。在该测定中,将PLL22-Gua溶液与1%HPMC混合用于生物粘附性改善,应用于小鼠的皮肤上。PLL22-Gua的剂量为200mg/kg,远高于治疗所需的有效剂量。然后,按照经济合作与发展组织(OECD)指南的建议,在14天内观察小鼠是否有任何异常。在观察期间,小鼠的皮肤、皮毛、眼睛和呼吸系统没有出现异常。此外,他们没有表现出任何异常的行为特征。与对照组相比,PLL22-Gua处理的小鼠的体重也没有显示出显著差异。此外,在两组小鼠中观察到几乎完全的毛发再生(图12),表明PLL22-Gua的无毒性。皮肤(图11B)和组织(图13)样本的H&E染色显示结构完整正常,没有任何显著的病理异常。这证明PLL22-Gua用于治疗MRSA诱导的伤口感染是安全和有前景的。
无药物抗癌多肽纳米颗粒的制备、表征及mPEG-b-PLL/CDA的合成和纳米颗粒Gua-NPs的制备
合成了具有三种不同电荷基团的阳离子多肽。如上所述合成了DP为22的聚(L-赖氨酸)(PLL)和胍功能化PLL(PLL-Gua)。通过碘甲烷与PLL的甲基化反应制备了季铵功能化PLL(PLL-Qua)。峰c(δ3.14,季铵基团的-CH3)表明功能化成功,功能化程度确定为95%。
接下来,合成了两种带负电荷的多肽。简单的阴离子嵌段多肽,甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-谷氨酸钠盐)(mPEG-b-PLG),DP为35。
通过甲氧基聚(乙二醇)-b-聚(L-谷氨酸钠盐)(mPEG-b-PLL)的伯胺与环己烯-1,2-二羧酸酐(CDA)的反应合成了pH敏感的阴离子聚合物mPEG-PLL/CDA(图14A)。如图14B所示,CDA的共轭度(conjugation degree)为77%(m=6,n=20),通过比较峰值c和c'来确定。1HNMR结果表明,mPEG-PLL/CDA对pH敏感,较低的pH诱导CDA的水解更高(更大、更快)(图14C)。
mPEG-b-PLG不能将带正电荷的多肽(PLL、PLL-Qua或PLL-Gua)凝聚成纳米颗粒,导致在与阳离子多肽混合后沉淀(混浊的悬浮液,其分别标记为PLL-混合物、Qua-混合物或Gua-混合物)。混合物的尺寸不均匀,并且通过动态光散射测量观察到多个峰。相反,阴离子mPEG-b-PLL/CDA和带正电荷的多肽(PLL、PLL-Qua和PLL-Gua)在水溶液中自组装成均匀的纳米颗粒,分别标记为PLL-NPs、Qua-NPs和Gua-NPs。研究了这些纳米颗粒在pH 7.4的PBS中的稳定性。PLL-NPs是不稳定的,如pH 7.4的PBS中尺寸分布和沉淀的变化所证明的,限制了它们在体内的应用。mPEG-PLL/CDA和PLL22-Gua自组装成纳米颗粒(Gua-NPs)(图15D)。如图15A-C所示,Gua-NPs在pH 7.4的PBS中是稳定的,它们的大小不会随着时间的推移而变化,但它们在低pH环境(pH 6.6和pH 5.4)中膨胀或离解,表明纳米颗粒的pH敏感性。此外,在pH7.4的PBS中孵育24小时,Qua-NPs和Gua-NPs的泽塔电位保持一致,约为0mV(图15E和F),这是体内应用的理想选择。这些带中性电荷的纳米颗粒可以促进体内静脉给药。在酸性更强的缓冲液(pH 6.6和5.4)中,Qua-NPs和Gua-NPs的泽塔电位增加表明纳米颗粒的解离和阳离子多肽的释放(图15E和F)。不同pH缓冲液中Gua-NPs的泽塔电位变化也表明Gua-NPs对pH敏感。所有这些发现表明PLL22-Gua可以从酸性肿瘤部位的纳米颗粒中释放,但当纳米颗粒在血流中循环时保持稳定。
Gua-NPs和PLL22-Gua的体外细胞毒性
评估了无药物Gua-NPs对BT474细胞的细胞毒性。尽管mPEG-PLL显示出细胞毒性(图16A),但即使在1800μg/mL的浓度下,mPEG-PLL/CDA在pH 7.4时也没有表现出显著的细胞毒性,并且细胞活力高于95%。然而,在pH 6.5时,由于CDA的水解,mPEG-PLL/CDA显示出抗癌活性(图16B)。PLL22-Gua的IC50(导致50%细胞生长抑制的聚合物浓度)为25.1(图16C),而Gua-NPs在pH 6.5和pH 7.4下的IC50分别为24.2和60μg/mL(图16D)。这些结果进一步表明,纳米颗粒对低pH有反应,从而释放抗癌聚合物。
孵育48小时后,p(lys-r-leu)和p(lys(Gua)-r leu)对HepG2人肝癌细胞系的IC50值分别为52.1和26.4μg/mL(图21),表明胍基团的功能化导致更强的抗癌活性。
图22显示了p(lys-r-leu)和p(lys(Gua)-r-leu)对BT-474人类乳腺癌症细胞系的杀灭动力学曲线,表明胍基的功能化也导致了对癌症细胞的更快杀灭。此外,相对疏水的亮氨酸氨基酸的存在增强了多肽对癌症细胞的杀灭动力学(图23)。
如图24所示,PLL-Gua在加载到纳米颗粒中后以较慢的速率杀死癌症细胞(BT-474)。然而,Gua-NPs在48小时内仍然有效地杀死了细胞(图16B),这表明Gua-NPs在输送到肿瘤组织后可以发挥强大的抗癌作用。
化疗药物在临床上的多药耐药性是一个亟待解决的问题。MCF-7/ADR细胞对小分子化疗药物DOX具有高度耐药性,DOX对MCF-7和MCF-7/ADR的IC50分别为0.13和100μg/mL(图17A)。IC50值的769倍差异阻碍了DOX在多药耐药肿瘤中的应用。然而,PLL22-Gua和Gua-NPs对MCF-7和MCF-7/ADR的抗癌活性相似,表明MCF-7/ADR细胞对PLL22-Gua或Gua-NPs的处理没有耐药性(图17B和C)。
体外抗癌活性
首先使用BT-474细胞在pH 7.4下评估阴离子载体mPEG-b-PLL/CDA的细胞毒性。即使聚合物浓度高达1800μg/mL,细胞活力仍保持在95%以上,表明载体在模拟生理条件下没有细胞毒性。在酸性肿瘤环境(如pH6.5)中,多肽载体显示出一定的抗癌活性,IC50为368μg/mL。这一发现表明,阴离子和pH敏感的mPEG-b-PLL/CDA不仅可以作为中和带正电荷聚合物的载体,还可以作为化疗剂。具有胍官能团的阳离子抗癌多肽PLL-Gua比具有季铵基团的PLL-Qu具有更强的抗癌活性,IC50值为25.1μg/mL(相比之下为76.3μg/mL)(图26A和C)。Gua-NPs和Qua-NPs在pH 7.4时均显示出抗癌活性(图26B和D),这意味着抗癌多肽能够从纳米颗粒中释放出来。Gua-NPs的抗癌活性远强于Qua-NPs(在pH 7.4时,IC50:60.0vs.112.6μg/mL,图26B和D)。此外,在pH 7.4下,Qua-NPs和Gua-NPs的IC50值分别比在pH 6.5培养基中高2.7倍和2.5倍。在较低pH下抗癌活性增强的可能原因有两个。首先,阴离子载体对较低pH环境有反应,促进抗癌多肽的释放,从而提高阳离子多肽的抗癌效果。其次,阴离子多肽载体在pH 6.5下释放阴离子保护基团后发挥抗癌活性。由于PLL-Gua和Gua-NPs表现出较低的IC50值和较强的抗癌功效,因此选择它们进行以下研究。
研究了PLL-Gu和Gua-NPs在不同浓度下对BT-474的杀灭动力学。如图26E和F所示,多肽处理后的细胞活力是剂量和时间依赖性的。浓度的增加导致更快的杀灭动力学。在相同浓度(50和100μg/mL)下,PLL-Gua比其纳米颗粒制剂更快地杀死癌症细胞,这是因为从Gua-NPs释放PLL-Gua所需的额外时间。
机制研究
为了探索PLL-Gu和Gua-NPs的抗癌机制,首先使用共聚焦显微镜研究了用AlexaFluor 488(绿色)标记的PLL-Gu在含有和不含有纳米颗粒制剂的情况下的细胞摄取。在AF-488@PLL-Gua溶液和AF-488@Gua-NPs溶液中均可见强烈的黄绿色荧光(图15G)。此外,AF-488@Gua-NPs在DI水中的大小分布是均匀的(通过DLS测量的单峰)。如对Gua-NPs所观察到的AF-488@Gua-NPs在pH 7.4的PBS中也稳定(图15A),但在低pH缓冲液中随时间变化(图15B和C)。细胞核和内溶酶体分别用Hoechst33342(蓝色)和LysoTracker深红(红色)染色。如图26H所示,PLL-Gua和Gua-NPs在30分钟内都很容易被BT-474细胞吸收。对于PLL-Gua,处理后仅观察到少量绿色荧光与红色荧光重叠,表明在内溶酶体中几乎没有定位。对于Gua-NPs,在孵育30分钟后,发现绿色荧光与内溶酶体的红色荧光共定位,这表明Gua-NPs通过内吞作用被细胞吸收。细胞摄取机制的这种差异也可能导致观察到的杀灭动力学的差异。
接下来,研究PLL-Gua或Gua-NPs处理前后的细胞形态。具体而言,MCF-7和MCF-7/ADR细胞用PLL-Gua(25μg/mL)和Gua-NPs(25μg/mL,以PLL-Gua为基础)处理,并用6种荧光染料染色,以使细胞成分可视化(图27)。未处理的MCF-7和MCF-7/ADR细胞(对照)表现出正常的上皮形态和多边形。PLL-Gua和Gua-NPs处理24小时后,MCF-7细胞的形态和细胞组织发生了变化,产生了细胞器紧密堆积的圆形细胞。最值得注意的是,PLL-Gu和Gua-NPs引起细胞核大小的缩小和核仁染色强度的降低。这表明PLL-Gu和Gua-NP诱导了核浓缩,这是凋亡细胞死亡的特征。DOX是一种有效的DNA损伤诱导剂,被用作阳性对照。虽然DOX处理(5.8μg/mL)导致MCF-7细胞中DNA和RNA的染色显著减少,但它没有诱导MCF-7/ADR细胞中的这种变化。这表明MCF-7/ADR细胞对DOX的作用具有抗性。与MCF-7细胞相比,PLL-Gua和Gua-NPs在MCF-7/ADR细胞中诱导了相似的形态学变化,表明它们能够绕过MCF-7/ADR细胞中的耐药性机制。
然后进行膜联蛋白V/PI染色凋亡测定,以进一步探讨PLL-Gu和Gua-NPs的抗癌机制。膜联蛋白V通过穿透受损的细胞膜对凋亡细胞进行染色,PI对坏死细胞进行染色。膜联蛋白VHighPILow、膜联蛋白-VHighPIHigh和膜联蛋白VLowPIHigh分别代表早期细胞凋亡、晚期细胞凋亡和坏死。如图26G和I所示,PLL-Gua和Gua-NPs都诱导了显著的细胞凋亡而不是坏死,与未经任何治疗的对照组相比,在较低多肽浓度(PLL-Gu和Gua-NPs分别为25和50μg/mL)的治疗后观察到更高的早期凋亡细胞群(PLL-Gua与对照组:12.6±2.7%vs.5.4±0.2%;Gua-NPs与对照组∶11.2±2.6%vs.5.4±0.2%)。在高浓度时(PLL-Gua和Gua-NPs分别为50和100μg/mL),晚期凋亡细胞数量显著增加。这些发现表明PLL-Gua和Gua-NPs诱导癌症细胞死亡主要基于凋亡机制。这与季铵功能化纳米颗粒的发现形成了对比,其中纳米颗粒诱导癌症细胞坏死。这可能是由于季铵功能化纳米颗粒的膜破坏活性。这些结果表明,Gua-NPs通过内吞作用被癌症细胞吸收,并且由于Gua-NPs的pH敏感性,PLL-Gua随后从酸性内涵体释放到胞质溶胶中,其中PLL-GU发挥其抗癌功能,导致细胞凋亡(图25)。
耐药性和迁移抑制研究
化疗药物在临床上的多药耐药性是一个亟待解决的问题。在此,使用药物敏感的MCF-7细胞和耐药的MCF-7/ADR细胞来评估PLL-Gua和Gua-NPs。MCF-7/ADR细胞对常规化疗药物DOX表现出显著耐药性,DOX对MCF-7和MCF-7/ADR的IC50值分别为0.13和≥100μg/mL(图28A)。IC50值的769倍差异阻碍了DOX治疗耐药肿瘤的应用。与此形成鲜明对比的是,PLL-Gua和Gua-NPs对MCF-7和MCF-7/ADR的抗癌功效几乎相等,这表明耐药MCF-7/ADRs细胞对PLL-Gua和Gua-NPs都敏感(图28B和C)。接下来,进行体外伤口划痕试验以研究抗癌剂对MCF-7细胞迁移的抑制作用。如图28D所示,未处理组在孵育24小时后显示出伤口间隙减小,并且在用DOX处理的MCF-7细胞中观察到类似的现象。然而,在与PLL-Gua或Gua-NPs孵育24小时后,伤口没有愈合,这表明PLL-Gua和Gua-NPs有效地阻止了MCF-7细胞迁移。
溶血
溶血活性已被广泛用作阳离子聚合物毒性的初始指标。即使在高浓度(HC10>4000μg/mL)下,PLL-Gua和Gua-NPs仍保持非溶血性,这对于体内应用是期望的。
体内毒性评估
由于安全性始终是首要任务,因此进一步研究了PLL-Gua和Gua-NPs的体内毒性,以评估其作为抗癌药物的临床潜力。将健康雌性Balb/c小鼠随机分为3组(每组n=5),然后在第0、4、8、11、15和18天静脉注射PLLGua(10mg/kg)或Gua-NPs(20mg/kg,基于PLL-Gu)。其余5只健康小鼠作为未经治疗的对照组。PLL-Gua组中的一只小鼠死亡,重复静脉给药后,PLL-Gua也在尾静脉中引起不希望的凝血(图29)。相对较高的毒性将限制其应用。重要的是,用带中性电荷的Gua-NPs处理的小鼠耐受性良好,没有任何血管堵塞,证明Gua-NPs是阳离子抗癌多肽的良好递送系统。
在第21天处死所有小鼠。采集血液进行完整的血液计数和血液化学分析。如血常规分析的结果所示(表3),与健康小鼠相比,PLL-Gua和Gua-NPs治疗的小鼠没有显著差异,表明急性炎症可以忽略不计,并且没有PLL-Gu或Gua-NPs引起副作用的迹象。此外,血尿素氮(UREA)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平也在健康范围内,表明PLL-Gua和Gua-NPs未造成肝肾损伤(图30A-C)。同样值得注意的是,Gua-NPs治疗没有引起明显的身体异常、正常组织损伤或体重变化,这表明Gua-NPs具有良好的耐受性。
表3在第0天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天静脉注射PLL-Gua(10mg/kg)和Gua-NPs(20mg/kg,基于PLL-Gua)后,健康Balb/c小鼠在第21天的常规全血计数。
WBC:白细胞;NE:中性粒细胞;LY:淋巴细胞;MO:单核细胞;EO:嗜酸性粒细胞;BA:嗜碱性粒细胞;RBC:红细胞;HCT:红细胞压积;MCV:平均肌肉量;MCH:平均肌红蛋白;MCHC:平均身体血红蛋白浓度;RDW:红细胞分布宽度;PLT:血小板;MPV:平均血小板体积。
毒性研究的所有结果表明,Gua-NPs是体内癌症治疗的潜在候选药物。
PLL-Gua和Gua-NPs的LD50测定
PLL-Gua和Gua-NPs的急性毒性通过测定它们的LD50值来评估,LD50值是在给定时期内导致50%的治疗小鼠死亡的剂量。PLL-Gua和Gua-NPs通过尾静脉静脉注射,LD50值分别为17.9和48.9mg/kg(基于PLL-Gua)(图30D)。纳米颗粒制剂降低了PLL-Gua’s的毒性,通过中和PLL-Gua中的阳离子电荷,其LD50增加了2.7倍。这些发现表明,纳米颗粒是一种很有前途的抗癌剂PLL-Gua的体内递送制剂。
体内生物分布
荧光成像已被广泛用于研究载药纳米颗粒的生物分布/EPR效应。为了研究PLL-Gua和Gua-NPs的体内分布,对携带皮下BT-474肿瘤的Balb/c裸鼠进行离体荧光成像研究。具体而言,通过尾静脉静脉内注射近红外染料Alexa Fluor 750标记的PLL-Gua和AlexaFluor 750-标记的Gua-NPs。在给药后的不同时间间隔,对小鼠实施安乐死,切除肿瘤和主要器官(脑、心、肝、脾、肺和肾)并进行成像。如图30E所示,用PLL-Gua和Gua-NPs处理的肿瘤的荧光强度相似,在注射后6小时没有显著差异。然而,在注射后24小时,与用游离PLL-Gua处理的小鼠相比,用Gua-NPs处理的小鼠在肿瘤部位显示出显著更高的荧光,因为在用PLLGua处理的肿瘤中没有看到荧光。这些结果表明,由于Gua-NPs的EPR效应,Gua-NPs在肿瘤部位的积累比PLL-Gua更有效。此外,Alexa Fluor 750标记的PLL-Gua和Gua-NPs的荧光信号由于从器官中清除而随着时间的推移而减弱。PLL-Gua和Gua-NPs治疗组在注射后48小时均未显示肿瘤积聚。剩余的Gua-NPs大多被隔离在脾脏中,而在大脑、心脏和肺中的积累可以忽略不计。游离多肽PLL-Gua主要通过肝脏和肾脏排出。在用游离多肽PLL-Gua处理的小鼠的脑组织中在处理后6小时观察到一些荧光信号,而在用Gua-NPs处理的小鼠脑组织中没有观察到,这表明纳米颗粒递送系统在脑组织中的最小化积聚方面是有利的。此外,大多数Gua-NPs在给药后48小时后从体内清除,这可能是观察到无毒性的原因,即使在21天的治疗期内Gua-NPs的累积剂量(6×20mg/kg小鼠体重=120mg/kg小鼠重量)高于LD50(48.9mg/kg小鼠体重)(图30A-C)。
Gua-NPs的体内抗肿瘤作用
如图18A所示,与未治疗的对照组相比,Gua-NPs显著抑制了肿瘤生长,在第21天,Gua-NPs治疗组的肿瘤抑制率为45.1%。治疗结束时的肿瘤重量测量(图18B)和解剖肿瘤的照片(图18C)也显示了Gua-NPs治疗的治疗益处。这些发现表明,Gua-NPs是癌症治疗的潜在候选药物。
Gua-NPs较低的体内毒性和更有效的肿瘤积聚支持了对纳米颗粒在体内治疗效果的进一步研究。在第0天将携带肿瘤Balb/c裸鼠(肿瘤体积:~130mm3)随机分为2组:对照组和Gua-NPs(20mg/kg,基于PLL-Gu)。在第0、2、7、9、14和17天静脉注射Gua-NPs。与对照组相比,无药物的Gua-NPs在21天内显著抑制了肿瘤生长(图18A)。在第21天,切除肿瘤并称重。治疗小鼠的肿瘤重量减轻显示了Gua-NPs的治疗益处(图18B和C)。
为了进一步验证治疗效果,对切除的肿瘤进行H&E和TUNEL染色,用于细胞形态观察和凋亡分析。与未处理的对照相比,Gua-NPs处理的小鼠诱导了显著更大的坏死和细胞凋亡。所有这些结果表明,Gua-NPs是癌症治疗的潜在候选药物。
衰变
PLL22-Gua在室温下在水中保存6个月后,其1H NMR光谱没有变化(图19)。此外,PLL22-Gua在37℃下孵育100天后的GPC痕迹也与原始痕迹相似(图20)。这些发现表明,胍功能化的多肽是稳定的,并且可以长期储存。
结论
合成了胍功能化多肽。特别是,与本研究中报道的其他多肽相比,PLL-Gua对金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克氏菌和白色念珠菌表现出优异的广谱抗菌功效,增强了杀灭效率和快速杀灭动力学。此外,PLL-Gua即使在4000μg/mL的浓度下也没有表现出溶血活性。更重要的是,在小鼠模型中,PLL22-Gua被证明是治疗MRSA诱导的伤口感染的有效抗菌剂,而不会诱导急性皮肤毒性。多肽PLL22-Gua是一种很有前途的大分子抗菌剂,用于预防和治疗MRSA引起的皮肤感染。PLL22-Gua和Gua-NPs在体外和体内的优异抗癌功效表明PLL22-Gu也是癌症治疗的潜在候选物。合成的抗癌多肽PLL-Gua成功地与带负电荷的多肽载体mPEG-b-PLL/CDA自组装,形成带中性电荷的纳米颗粒Gua-NPs。Gua-NPs在PBS(pH 7.4)中表现出优异的稳定性,在酸性环境(pH 6.5)中显示出良好的pH敏感性。在pH 6.5下,Gua-NPs表现出与PLL-Gua相似的体外抗癌功效。PLL-Gu和Gua-NPs均以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡。PLL-Gua可能通过膜易位进入细胞,而Gua-NPs通过内吞作用被细胞吸收。尽管MCF-7/ADR细胞对DOX具有抗性,但它们对PLL-Gua和Gua-NPs敏感。PLL-Gua和Gua-NPs触发了MCF-7和MCF-7/ADR细胞的形态和细胞组织的类似变化,证明了它们绕过MCF-7/ADR细胞耐药性机制的能力。此外,与不含纳米颗粒制剂的游离PLL-Gua相比,Gua-NPs表现出较低的体内毒性和较高的LD50值,并增加了在肿瘤部位的积聚。此外,Gua-NPs在体外阻止了癌症细胞的迁移。更重要的是,在BT-474人类乳腺癌症异种移植小鼠模型中,无药物中性荷Gua-NPs表现出优异的抗肿瘤功效,在测试剂量下毒性可忽略不计。使用pH敏感的阴离子多肽递送合成阳离子抗癌多肽是治疗癌症克服耐药性的一种有前途的方法。
将理解,所描述的实施例的各个方面的许多进一步的修改和排列是可能的。因此,所描述的方面旨在包括落入所附权利要求的精神和范围内的所有这样的改变、修改和变化。
在本说明书和随后的权利要求中,除非上下文另有要求,否则“包含”一词以及诸如“包含”和“包含”的变体将被理解为包括所述整数或步骤或整数或步骤的组,但不排除任何其他整数或整数或步骤或整数或步骤的组。
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本说明书中对任何先前出版物(或从中获得的信息)或任何已知事项的引用,不被也不应被视为确认或承认,或以任何形式暗示该先前出版物(或者从中获取的信息)或者已知事项构成本说明书所涉领域的公知常识的一部分。
Claims (44)
1.式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,包括:
a)式(A)的单体单元
和
b)式(B)的至少一个单体单元
其中
m是从5到100的整数;和
k是从1到20的整数;
其中,所述式(A)的单体单元相对于所述式(I)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%。
2.根据权利要求1所述的功能化多肽,其中,所述式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
3.根据权利要求1或2所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于所述式(A)的单体单元相对于所述式(I)的功能化多肽的百分比为约95%。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽进一步包含式(C)的至少一个单体单元:
其中,g是从1到10的整数。
5.根据权利要求4所述的功能化多肽,其中,g为3或4。
6.根据权利要求4或5所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于式(C)的单体单元相对于所述式(I)的功能化多肽的百分比为约5%至约20%。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(C)的单体单元、所述式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的功能化多肽,其中,m为18,k为2,并且g为2,或者m为30,k为3,并且g为2。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的功能化多肽,其中,当存在式(C)的单体单元时,所述式(I)的功能化多肽的特征在于约10nm至约200nm的胶束直径。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的功能化多肽,其中,当存在式(C)的单体单元时,所述式(I)的功能化多肽的特征在于具有约1μg/mL至约100μg/mL的临界胶束浓度(CMC)值,和/或约+1mV至约+30mV的泽塔电位(ζ)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽进一步包含式(D)的单体单元:
其中,p是从5到100的整数。
12.根据权利要求11所述的功能化多肽,其中,p是12。
13.根据权利要求11或12所述的功能化多肽,其中,所述式(D)的单体单元、所述式(A)的单体单元和式(B)的至少一个单体单元形成无规共多肽。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的功能化多肽,其中,m是27,k是2,并且p是12。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)功能化多肽的特征在于具有5至100的聚合度。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)功能化多肽的特征在于具有约1.1至约1.7的多分散指数(PDI)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于具有对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗微生物活性。
18.根据权利要求17所述的功能化多肽,其中,所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌和MRSA,所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克氏菌,并且所述真菌为白色念珠菌。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于具有约1μg/mL至约200μg/mL的最小抑制浓度(MIC)的抗微生物活性。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于具有约1至约500的最小杀细菌浓度或最小杀真菌浓度(MBC或MFC)/MIC比率(R)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于50%裂解时的最小溶血浓度(HC50)为约100μg/mL至约8000μg/mL,和/或溶血浓度(HC50)为约4000μg/mL至约8000μg/mL。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于对癌症细胞的IC50值为约1μg/mL至约200μg/mL。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的功能化多肽,其中,所述式(I)的功能化多肽的特征在于人类乳腺癌症细胞系(MCF-7)相对于耐药人类乳腺癌症细胞系(MCF-7/ADR)的IC50比率为约1。
24.一种功能化多肽纳米颗粒,其包含:
a)根据权利要求1-23中任一项的式(I)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药;和
b)式(II)的功能化多肽或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,包括
i)式(E)的单体单元:
其中,q是从0到10的整数;
ii)式(F)的单体单元:
其中,r是从10到100的整数;和
iii)甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)末端;
其中,所述式(F)的单体单元相对于所述式(II)的功能化多肽的百分比为约50%至约98%;
其中,所述式(I)的功能化多肽与所述式(II)的功能化多肽的摩尔比为约1:1至约1:10。
25.根据权利要求24所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,q是1至8的整数,r是15至50的整数,并且q是6并且r是20。
26.根据权利要求24或25所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述式(E)的单体单元和所述式(F)的单体单元形成无规共多肽。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述mPEG末端具有约2000g/mol至约10000g/mol的分子量。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述式(II)的功能化多肽的特征在于所述式(F)的单体单元相对于所述式(Ⅱ)的功能化多肽的百分比为约80%至约90%。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述功能化多肽纳米颗粒在约1至小于7的pH下是可离解的。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述功能化多肽纳米颗粒的特征在于对癌症细胞的IC50值为约1μg/mL至约200μg/mL。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述功能化多肽纳米颗粒的特征在于在约6.5的pH下对癌症细胞的IC50值为约10μg/mL至约50μg/mL,以及在约7.4的pH下对于癌症细胞的IC50值为约25μg/mL至约150μg/mL。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒,其中,所述功能化多肽纳米颗粒的特征在于,人类乳腺癌症细胞系(MCF-7)相对于耐药人类乳腺癌症细胞系(MCF-7/ADR)的IC50比率为约1。
33.一种药物组合物,其包含有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药,其中,所述药物组合物任选地进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
34.根据权利要求33所述的药物组合物,其中,所述药物组合物进一步包含相对于所述药物组合物为约1重量%至约5重量%的羟丙基甲基纤维素。
35.一种用于治疗微生物感染的方法,所述方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
36.根据权利要求35所述的方法,其中,所述微生物感染是细菌感染或真菌感染。
37.用于治疗微生物感染的根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
38.根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途。
39.一种用于治疗癌症的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
40.根据权利要求39所述的方法,其中,所述癌症是耐药的癌症。
41.根据权利要求39或40所述的方法,其中,所述癌症是乳腺癌症。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法,其中,所述癌症是肿瘤性癌症。
43.用于治疗癌症的根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。
44.根据权利要求1至23中任一项所述的式(I)的功能化多肽或根据权利要求24至32中任一项所述的功能化多肽纳米颗粒或其在药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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PB01 | Publication | ||
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