CN117980339A

CN117980339A - 用于治疗特应性皮炎的融合蛋白同二聚体

Info

Publication number: CN117980339A
Application number: CN202280062832.9A
Authority: CN
Inventors: M·莫尔塞耶; 张远征; S·D·斯托弗; 乔志松
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2022-08-19
Publication date: 2024-05-03
Also published as: CN117940458A

Abstract

本发明提供了用于治疗犬特应性皮炎的犬白介素‑4受体α融合蛋白和犬白介素‑13受体α2融合蛋白的同二聚体的组合物。所述组合物还可包含抗犬IL‑31的犬源化抗体或抗犬IL‑31Rα的犬源化抗体。

Description

用于治疗特应性皮炎的融合蛋白同二聚体

序列表

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相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年8月20日提交的临时申请美国序列号63/235,259和2021年8月20日提交的临时申请美国序列号63/235,261的优先权。

技术领域

本发明涉及用于治疗犬特应性皮炎的组合物，其包含与犬白介素-4或犬白介素-13结合的融合蛋白。所述组合物可用于治疗犬特应性皮炎。

背景技术

免疫系统包含常驻和再循环的特化细胞的网络，这些细胞协同发挥作用，保护宿主免受传染病和癌症的侵害。免疫系统执行此功能的能力在很大程度上取决于白细胞分泌的一组蛋白的生物活性，这些蛋白统称为白介素。在经过充分研究的白介素中，有三种重要的分子被确定为：白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)和白介素-31(IL-31)。IL-4和IL-13是相关信号传导通路中的关键细胞因子，涉及针对某些病原体(例如组织或管腔寄生寄生虫)提供保护所需的免疫反应的发展。然而，这两种细胞因子与IL-31也与人类和动物过敏性疾病(包括特应性皮炎)的发病机制有关。

特应性皮炎(AD)是一种复发性瘙痒性慢性炎症性皮肤病，其特征是人类免疫系统失调和表皮屏障异常。特应性皮炎的病理学和免疫学特性已成为广泛研究的主题[综述于Rahman et al.Inflammation&Allergy-drug target 10:486-496(2011)and Harskamp etal.,Seminar in Cutaneous Medicine and Surgery 32:132-139(2013)]。特应性皮炎也是伴侣动物(尤其是狗)的常见病症，据估计其患病率约为犬群体的10-15％。狗和猫特应性皮炎的发病机制[综述于Nuttall et al.,Veterinary Records 172(8):201-207(2013)]与人类特应性皮炎的发病机制显著相似，包括多种免疫细胞的皮肤浸润CD4+Th2极化细胞因子环境，包括占优势的IL-4、IL-13和IL-31。

IL-4和IL-13是密切相关的蛋白质，可由许多细胞类型分泌，包括CD4⁺Th2细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、巨噬细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。IL-4和IL-13显示出许多重叠的功能，并且对于T细胞依赖性体液免疫反应的发展至关重要。IL-4和IL-13都是特应性皮炎信号通路的一部分。IL-4与异二聚体受体结合，该受体分别包含共同γc链(γc)的单体和IL-4受体α(IL-4Rα)的单体，而IL-13与包异二聚体受体结合，该受体分别包含IL-13受体α1(IL13Rα1)的单体和IL-4Rα的单体。

因此，Th2细胞因子IL-4、IL-13和IL-31已成为治疗干预的对象，以便开发更好的疗法。已被证明有助于治疗特应性皮炎和/或已显示出这种作用的药物包括：Janus激酶(JAK)抑制剂[参见例如U.S.8,133,899；U.S.8,987,283；WO 2018/108969；US2020/0339585]、脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂[参见例如U.S.8,759,366]以及TH2细胞上表达的趋化受体同源分子的拮抗剂[参见例如U.S.7,696,222、U.S.8,546,422、U.S.8,637,541和U.S.8,546,422]。此外，US2020/0048325A1公开了连续的IL-13/IL-4受体融合蛋白。这些融合蛋白的设计将IL-13Rα1和IL-4Rα以连续排列组合在一起，其中IL-13Rα1通过称为接头的非自身氨基酸序列与IL-4Rα连接，并且连续受体也可以是通过第二非自身氨基酸接头连接至融合配偶体。值得注意的是，所使用的接头也有可能进行翻译后修饰，例如糖基化。

通过与蛋白配体或其蛋白受体结合来阻断特定途径中的信号转导的单克隆抗体的治疗用途已被证明是广泛成功的。事实上，这样的单克隆抗体在人类生物制药的快速增长中发挥着关键作用，截至2017年，占据了超过25％的人类生物制药市场。2014年销售额最高的20种药物中，有6种是单克隆抗体[Chung,Experimental&Molecular Medicine 49:e304；doi:10.1038/emm.2017.46(2017)]。这种趋势还在继续增长。针对人IL-4受体α(IL-4Ra)的单克隆抗体已被开发出来，并且其中一些抗体已对其治疗人类特应性皮炎的治疗效果进行了广泛测试[参见，例如，US2015/0017176 A1]。一种这样的抗体(dupilumab)是通过对转基因小鼠进行免疫产生的，其中小鼠抗体基因被人抗体基因取代，因此，所得抗体是人抗体，而不是例如人源化鼠抗体。

尽管由于单克隆抗体治疗成本高，最初仅限于人类生物制药，但由于生产成本显著降低，犬单克隆产品最近已变得可用。早期迹象表明，这样的单克隆抗体也有可能成为伴侣动物市场的主要治疗药物。例如，针对人IL-31受体α(IL-31RA)的抗体经过测试，发现对人类特应性皮炎相关的瘙痒有显著效果[Ruzicka,et al.,New England Journal ofMedicine,376(9),826–835(2017)]。此外，针对犬IL-31的抗体已被证明对狗与特应性皮炎相关的瘙痒具有显著效果[US 8,790,651 B2；美国10,093,731 B2]。这种犬源化抗体可阻断cIL-31与犬IL-31受体(cIL-31R)的结合，从而阻断cIL-31/cIL-31R信号通路。因此，阻断IL-31与其受体IL-31RA的结合可缓解与特应性皮炎相关的瘙痒。然而，仅仅阻断cIL-31/cIL-31R信号通路只能改善特应性皮炎的瘙痒效应，但无法阻止由犬IL-4(cIL-4)或犬IL-13(cIL-13)/犬IL-4受体α(cIL-4Rα)信号通路引起的伴随皮肤炎症。

最近，还公开了阻断犬IL-4与犬IL-4Rα结合的针对犬IL-4Rα的犬源化抗体[US2018/0346580A1，其全部内容通过引用并入本文]。这些抗体是通过用犬IL-4Rα胞外结构域(ECD)对常规小鼠(即非转基因小鼠)进行免疫而产生的。由于II型IL-4受体由IL-4Rα链和IL-13Rα1链组成，因此获得了可以阻断犬IL-4和犬IL-13与II型犬IL-4受体的结合的针对犬IL-4Rα的抗体，从而有助于阻止与特应性皮炎相关的炎症。

然而，尽管最近在治疗与特应性皮炎相关的瘙痒方面取得了成功，并且最近关于治疗相关炎症的令人鼓舞的公开，许多患有这种病症的受试者仍然没有经历快速起效的止痒作用同时对皮肤炎症有显著效果。因此，需要设计替代疗法来解决这一未满足的医疗需求。

本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”。

发明内容

本发明提供了可用于治疗特应性皮炎的组合物。该组合物可包含结合犬IL-4的融合蛋白以及结合犬IL-13的融合蛋白。在具体的实施方式中，组合物包含含有犬白介素-4受体α-犬片段可结晶区融合蛋白对(cIL-4Rα-cFc融合蛋白)的同二聚体和含有犬白介素-13受体α2-犬片段可结晶区融合蛋白对的同二聚体(cIL-13Rα2-cFc融合蛋白)；其中所述cIL-4Rα-cFc融合蛋白对中的每一个包含结合犬白介素-4(cIL-4)的犬白介素-4受体α(cIL-4Rα)的胞外结构域(ECD)或其片段和cFc(本文中表示为第一cFc)，并且所述cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对中的每一个包含结合犬白介素-13(cIL-13)的犬白介素-13受体α2(cIL-13Rα2)的胞外结构域(ECD)或其片段和cFc(本文中表示为第二cFc)。在某些实施方式中，所述第一cFc和所述第二cFc是相同的。在其他实施方式中，所述第一cFc和所述第二cFc是不同的。

在组合物的具体实施方式中，第一cFc包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一cFc包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一cFc包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一cFc包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一cFc包含与SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在组合物的某些实施方式中，第二cFc包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第二cFc包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第二cFc包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第二cFc包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第二cFc包含与SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在特定的实施方式中，第一cFc和第二cFc是相同的。在其他实施方式中，第一cFc和第二cFc是不同的。

在组合物的某些实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白还包含犬铰链区(本文中表示为第一犬铰链区)。在相关的实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白还包含犬铰链区(本文中表示为第二犬铰链区)。在特定实施方式中，第一犬铰链区域和第二犬铰链区域是相同的。在其他实施方式中，第一犬铰链区域和第二犬铰链区域是不同的。犬铰链区可以作为cIL-4Rα的ECD与第一cFc之间的接头以及作为cIL-13Rα2的ECD与第二cFc之间的接头。

在组合物的具体实施方式中，第一犬铰链区包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一犬铰链区包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一犬铰链区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一犬铰链区包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。

在组合物的某些实施方式中，第二犬铰链区包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第二犬铰链区包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第二犬铰链区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，第一犬铰链区包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在特定的实施方式中，第一犬铰链区和第二犬铰链区是相同的。在其他实施方式中，第一犬铰链区域和第二犬铰链区域是不同的。

在特定实施方式中，犬铰链区和cFc均来自IgGA。在其他实施方式中，犬铰链区和cFc均来自IgGB。在其他实施方式中，犬铰链区和cFc均来自IgGC。在其他实施方式中，犬铰链区和cFc均来自IgGD。

在组合物的某些实施方式中，cIL-4Rα的ECD包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％同一性。在其他实施方式中，cIL-13Rα2的ECD包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列有至少85％、90％、95％或100％同一性。在其他实施方式中，cIL-4Rα的ECD包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少85％、90％、95％或100％同一性，和cIL-13Rα2的ECD包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％的同一性。

在组合物的具体实施方式中，cIL-4Rα的ECD和第一cFc之间的唯一接头包含与犬中天然发现的蛋白(包括其天然存在的变体)中的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在相关的实施方式中，第一犬铰链区作为cIL-4Rα的ECD与第一cFc之间的唯一接头。在其他具体的实施方式中，cIL-13Rα2的ECD和第二cFc之间的唯一接头包含与犬中天然发现的蛋白(包括其天然存在的变体)中的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在相关的实施方式中，第二犬铰链区作为cIL-13Rα2的ECD与第二cFc之间的唯一接头。

在组合物的更具体的实施方式中，cIL-4Rα的ECD和第一cFc之间的唯一接头包含与犬中天然发现的蛋白(包括其天然存在的变体)中的氨基酸序列相同的氨基酸序列，和cIL-13Rα2的ECD和第二cFc之间的唯一接头包含与犬中天然发现的蛋白质(包括其天然存在的变体)中的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在相关的实施方式中，第一犬铰链区作为cIL-4Rα的ECD与第一cFc之间的唯一接头，并且第二犬铰链区作为cIL-13Rα2的ECD与第二cFc之间的唯一接头。

在组合物的具体实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白仅由与犬中天然发现的蛋白(包括其天然存在的变体)的氨基酸序列相同的氨基酸序列构成。在相关的实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白仅由与犬中天然发现的蛋白(包括其天然存在的变体)的氨基酸序列相同的氨基酸序列构成。在具体的实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白和cIL-13Rα2-cFc融合蛋白(包括其天然存在的变体)均仅由犬中天然存在的氨基酸序列构成。

在组合物的某些实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在特定的实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在其他的实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其他实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在其他实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在组合物的具体实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在特定的实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在其他实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在其他实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列

本发明的任何组合物还可包含抗瘙痒抗体。在特定实施方式中，抗瘙痒抗体是犬抗体。在更特定的实施方式中，抗瘙痒抗体是针对犬白介素31(cIL-31)的犬抗体。在其他实施方式中，抗瘙痒抗体是犬源化抗体。在特定的实施方式中，犬源化抗瘙痒抗体是针对cIL-31的抗体。在更特定的实施方式中，针对cIL-31的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。在替代的实施方式中，抗cIL-31的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链。

在组合物的其他实施方式中，抗瘙痒抗体是针对犬白介素31R(cIL-31R)的犬抗体。在某些实施方式中，抗瘙痒抗体是针对cIL-31R的犬源化抗体。在其他实施方式中，抗cIL-31R的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。在其他实施方式中，抗cIL-31R的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链。在其他实施方式中，抗cIL-31R的犬源化抗体包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链。

本发明的任何组合物还可以进一步包含一种或多种另外的治疗组分。在特定的实施方式中，另外的治疗组分是Janus激酶(JAK)抑制剂。在其他实施方式中，另外的治疗组分是脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂。在其他实施方式中，另外的治疗组分是TH2细胞上表达的趋化受体同源分子的拮抗剂。

在具体实施方式中，JAK抑制剂是：

其中R¹是任选地被羟基取代的C_1-4烷基，及其药学上可接受的盐。

在替代实施方式中，JAK抑制剂是：

及其药学上可接受的盐。

在其他实施方式中，JAK抑制剂是：

及其药学上可接受的盐。

本发明还包括治疗特应性皮炎的方法，其包括向患有特应性皮炎的犬施用本发明的任何组合物。

通过参考下面的附图说明和具体实施方式将更好地理解本发明的这些和其他方面。

附图说明

图1描述了通过ELISA评估的嵌合和犬源化抗犬IL-31Rα抗体的结合活性。嵌合大鼠/犬44E2[·]。犬源化44E2:H2k1[■]，H2k2[▲]，H5k1[▼]和H5k2[◆]。

图2描述了通过ELISA评估的嵌合和犬源化抗犬IL-31Rα抗体的结合活性。嵌合大鼠/犬：10A12[·]。犬源化10A12:H1L5[■]和H2L6[▲]。

图3描述了通过ELISA评估的嵌合抗体和相应的犬源化抗犬IL-31Rα抗体的结合活性。嵌合大鼠/犬28F12。犬源化28F12:H1k3[■]，H2k2[▲]和H2k3[▼]。

具体实施方式

单克隆抗体通过与上述蛋白配体或其蛋白受体结合来阻断特定通路中的信号转导的成功治疗用途，推动了产生针对犬IL-4受体α的犬源化抗体。因此，针对cIL-4Rα产生鼠抗体，然后犬源化，并在体外显示，可有效阻断cIL-4Rα与其两种天然配体(即cIL-4或cIL-13)的结合。然而，令人惊讶的是，在给狗施用犬源化鼠cIL-4Rα抗体后，在接受治疗的犬中检测到了异常高的量的所谓抗药物抗体(ADA)。更出乎意料的是，测试的多种不同的犬源化鼠cIL-4Rα抗体都出现了这个问题。

ADA的诱导是单克隆抗体治疗药物开发的一个重大障碍。ADA是动物受试者针对施用给动物受试者的治疗性抗体(即药物)形成的抗体。它们通常中和治疗性抗体的生物活性和/或导致治疗性抗体从施用它们的动物受试者的体循环中快速清除。当抗体最初在一个物种(例如小鼠或大鼠)中产生，但用于为第二个物种(例如犬)制备治疗性抗体时(这是犬源化小鼠或大鼠抗体的构建方式)，ADA的问题变得更加严重。

而且，为了在相应的犬源化大鼠抗体中保留所选择的大鼠抗体对靶犬蛋白的强结合亲和力，通常不仅需要包括小鼠或大鼠CDR的氨基酸序列，还包括来自小鼠或大鼠抗体的氨基酸序列的另外氨基酸残基。这些另外的氨基酸被称为回复突变。回复突变用于维持CDR的三维结构，从而有助于在犬源化小鼠或大鼠抗体中保留小鼠或大鼠抗体对犬靶蛋白的强结合亲和力。然而，增加治疗性犬源化小鼠或大鼠抗体中的小鼠或大鼠氨基酸残基的数量，即通过添加小鼠或大鼠CDR和相关回复突变，也增加了该抗体被接受治疗的狗的免疫系统识别为外来物的可能性，从而导致ADA。

如上所述，虽然ADA的发生对于大多数治疗性抗体来说是一个常见问题，但它通常被认为是一个可控制的问题，因为它通常发生在接受治疗的相对较小的亚群中。然而，令人惊讶的是，用犬源化鼠cIL-4Rα抗体治疗的狗表现出ADA的数量出乎意料地高。不将这一令人惊讶的结果的解释限制于任何特定的分子机制，回顾起来，cIL-4Rα在抗原呈递细胞(APC)上表达的事实可能是一个重要因素。因此，治疗性犬源化cIL-4Rα抗体与APC的cIL-4Rα的结合可导致结合的cIL-4Rα的内化。随后将具有包含犬源化抗体的鼠CDR(或鼠CDR和鼠回复突变)的序列的蛋白片段呈现给犬T细胞，这可能导致在治疗的受试者中观察到更高的ADA诱导。

不管用表现出ADA的犬源化鼠cIL-4Rα抗体治疗的狗数量增加的原因是什么，这一发现导致了对阻断cIL-4或cIL-13/cIL-4Rα信号通路的替代策略的评估。一种潜在的替代策略是直接阻断cIL-4和cIL-13，而不是cIL-4Rα，如上所述，cIL-4Rα是犬IL-4受体和犬IL-13受体两者的一部分。实现这一目标的一种可能的方法是通过使用IL-4和IL-13的两个天然存在的结合配偶体的胞外结构域(ECD)，即分别为IL-4Rα的ECD和IL-13Rα1的ECD。

目前可以采用的流行方法是使用包含IL-4Rα的ECD和IL-13Rα1的ECD的连续双特异性融合蛋白。连续的双特异性融合蛋白具有明确的优点，例如允许合成单个治疗性蛋白分子而不需要合成两个单独的蛋白分子。此外，如果双特异性融合蛋白的两个功能组分在功能上相关，如在连续双特异性cIL-13Rα1和cIL-4Rα融合蛋白的情况下，则预期会产生协同作用，因为第一功能组分(例如，cIL-13Rα1)预计会促进第二功能成分(例如，cIL-4Rα)的结合。已经提出了一种这样的策略，其采用连续的IL-13/IL-4受体融合蛋白[参见US2020/0048325A1]。此类融合蛋白的设计将IL-13Rα1和IL-4Rα以连续排列方式聚集在一起，其中IL-13Rα1与IL-4Rα连接。此外，连续的受体还可以通过第二接头连接至融合配偶体。然而，这种方法的一个显著缺点是使用这样的通常是融合受体的非天然成分的接头，因此可能导致潜在的新表位，从而诱导ADA形成。此外，所使用的接头还有可能进行翻译后修饰(例如糖基化)，这可能会产生结构可能发生改变的变体分子，进而进一步导致ADA的形成。

用于创建双特异性融合蛋白的另一种方法是使用IL-13Rα1的ECD和IL-4Rα的ECD或IL-13Rα2的ECD和IL-4Rα的ECD的融合蛋白的双特异性异二聚体[WO2020/086886]。另一种推定策略是使用引入IL-4Rα-cFc融合蛋白同二聚体与IL-13Rα1-cFc融合蛋白和/或IL-13Rα2-cFc融合蛋白的同二聚体组合的犬Fc融合蛋白。在任何一种情况下，这些ECD都可以与犬IgG(cFc)融合，即IgGA、IgGB、IgGC或IgGD。更优选地，融合蛋白可以包含犬IgG铰链区或其片段。ECD中连接cFc有两个主要优点：(i)它延长了融合蛋白的体内半衰期；(ii)它有助于通过亲和层析纯化融合蛋白。因此，IL-4Rα、IL-13Rα1或IL-13Rα2的ECD可以与犬IgG铰链区和犬IgG(cFc)融合/连接。在某些替代方案中，所得融合蛋白按N端到C端的顺序包含：cIL-13Rα1或cIL-13Rα2或cIL-4Rα的ECD、犬铰链区和cFc。WO 01/77332公开了含有IL-13Rα2和犬IgG Fc序列的Fc融合蛋白。然而，这些蛋白质包含插入非自身甘氨酸残基(G)作为IL-13Rα2的ECD和犬IgG Fc之间的接头，随后是来自犬IgG的CH1结构域的9个氨基酸残基。本发明的cFc融合蛋白中不存在甘氨酰接头或来自CH1结构域的9个氨基酸残基段。当融合蛋白在细胞培养系统中表达时，甘氨酸残基随后是丝氨酸残基的存在(如WO 01/77332中公开的Fc融合蛋白中那样)，为融合蛋白的酶促糖基化创造了机会，从而可以导致丝氨酸残基上具有一定水平的糖基化的变体分子的产生。从工业规模的可制造性的角度来看，这是不希望的。此外，插入不属于天然犬IgG序列的甘氨酸残基有可能产生新表位，该表位可以被狗的免疫系统识别，并刺激针对融合蛋白的抗体的产生。此类抗体可能会抵消融合蛋白的治疗效用。

因此，本发明的特定cFc融合蛋白的一个优点是它们不引入非自身氨基酸接头，从而最小化在治疗的动物中导致ADA的机会。另外，本发明的cFc融合蛋白维持为将cIL-4RαFc融合蛋白与犬IL-13Rα1或犬IL-13Rα2Fc融合蛋白分开的非连续分子。尽管存在一些例外¹，通常认为连接融合结构域的非自身氨基酸接头的缺失会导致融合蛋白结构域的低产量、低效力和/或错误折叠，令人惊讶的是具有犬铰链区的和cFc的包含cIL-4Rα或cIL-13Rα1或cIL-13Rα2的ECD的融合蛋白已成功生产和纯化，即使它们不使用非自身氨基酸接头。因此，如下所示，这些融合蛋白被证明具有高治疗价值并降低了ADA风险。

相反，在下述研究中，发现双特异性异二聚体融合蛋白导致表达水平降低、稳定性降低和纯度降低。此外，如上所述，它们还可能增加动物受试者中ADA形成的潜力。此外，尚不清楚是否需要使用两倍的双特异性融合蛋白才能获得与两种单独的单特异性分子(即同二聚体)组合所达到的治疗效果相同的治疗效果。此外，失去了控制两种单独的功能成分的功效/安全性平衡的能力，例如改变一种单独的单特异性蛋白质的剂量，同时保持另一种的剂量恒定的能力。

综上所述，发现双特异性Fc融合蛋白的表达和纯化存在困难。更重要的是，发现它们作为cIL-4和cIL-13活性抑制剂的效力不如两种同二聚体的组合，特别是cIL-4Rα-cFc同二聚体与cIL-13Rα2-cFc同二聚体的组合(参见如下实施例)。因此，本发明提供了包含cIL4和cIL-13活性的有效阻断剂的组合物，即cIL-4Rα-cFc同二聚体与cIL 13Rα2-cFc的组合。

此外，响应于对特应性皮炎更好的治疗的需要，本发明还提供

了可以达到同时调节特应性皮炎中涉及的cIL-4/cIL-13和cIL-31信号传导通路以产生快速起效的止痒作用，同时对皮肤炎症有显著效果，并改善皮肤屏障功能的制剂和方法学。这些制剂结合使用cIL-4Rα-cFc融合蛋白和cIL-13Rα2-cFc融合蛋白的同二聚体，以及结合犬IL-31Rα的犬源化大鼠抗体。

因此，本发明提供了cFc融合蛋白的同二聚体的组合物，其结合cIL-4或cIL-13并阻断这些细胞因子与其各自受体的结合。另外，本发明提供了还包含结合cIL-31或cIL-31R并阻断cIL-31与cIL-31受体结合的犬或犬源化抗体的组合物。这些组合物可用于治疗犬的特应性皮炎。

缩写

在本发明的整个具体实施方式和实施例中，将使用以下缩写：

ADCC 抗体依赖性细胞毒性

CDC 补体依赖性细胞毒性

CDR免疫球蛋白变量中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义

cFc 犬片段可结晶区

CHO 中国仓鼠卵巢

EC50 导致50％功效或结合的浓度

ECD 胞外结构域

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体框架区：免疫球蛋白可变区，不包括CDR区。

HRP 辣根过氧化物酶

IC50 导致50％抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A.Kabat首创的免疫球蛋白比对和编号系统

[Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]

mAb 单克隆该抗体(也称为Mab或MAb)

PCR 聚合酶链式反应

PK 药代动力学

V 区IgG链的片段，其在不同抗体之间的序列可变。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VL 免疫球蛋白轻链可变区

Vl 免疫球蛋白lambda轻链可变区

Vk 免疫球蛋白κappa轻链可变区

定义

为了可以更容易地理解本发明，下面具体定义某些技术和科学术语。除非在本文中别处具体定义，否则本文中使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文所使用的，包括所附权利要求，诸如“一个/一种(a/an)”和“所述”之类的单词的单数形式包括它们相应的复数引用，除非上下文另外明确指出。

分子的“活性”可以描述或指分子与配体或受体的结合、催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性、其他分子活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞与细胞相互作用例如粘附的活性，或维持细胞结构例如细胞膜或细胞骨架的活性。“活性”还可以指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫活性]/[mg蛋白]、生物隔室中的浓度等。“活性”可以指先天性或适应性免疫系统的成分的调节。

当“施用”和“治疗”应用于动物(例如犬受试者)、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物(例如犬受试者、细胞、组织、器官或生物流体)接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。

“施用”和“治疗”还指例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一细胞对细胞的体外和离体治疗。术语“受试者”包括任何生物体，优选地动物，更优选地哺乳动物(例如犬、猫或人)并且最优选地犬。

“治疗/处理(treat/treating)”意指将治疗剂，例如包含本发明的cFc融合蛋白的组合物，内部或外部施用于例如具有一种或多种症状或怀疑患有一种或多种病症的犬受试者或患者，该药剂对其具有治疗活性。

通常，治疗剂以有效缓解和/或改善所治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病/病症症状的量施用，无论是以任何临床上可测量的程度通过诱导此类症状的消退还是抑制其进展。有效缓解任何特定疾病/病症症状的治疗剂的量(也称为“治疗有效量”)可以根据例如患者的疾病状态、年龄和体重(例如，犬)，以及药物组合物在受试者中引发所需反应的能力而变化。疾病/病症症状是否已经缓解或改善可以通过兽医或其他熟练的医疗保健提供者通常使用的任何临床测量来评估，以评估该症状的严重性或进展状态。虽然本发明的实施方式(例如，治疗方法或制品)可能不能有效缓解每个受试者的目标疾病/病症症状，但它应当在通过本领域已知的任何统计检验确定的统计显著数量的受试者中缓解目标疾病/病症症状，例如Student’s t-test,chi2-test，根据Mann和Whitney的U-test，Kruskal-Wallis test(H-test),Jonckheere-Terpstra-test和Wilcoxon-test。

当“治疗”应用于人类、兽医(例如犬)或研究受试者时，是指治疗性治疗以及研究和诊断应用。当其应用于人、兽医(例如犬)或研究受试者或细胞、组织或器官时，“治疗”涵盖本发明的抗体和/或融合蛋白与例如犬或其他动物受试者、细胞、组织、生理隔室或生理液体的接触。

如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，包括家猫、纯种和/或杂种伴侣猫、表演猫、实验室猫、克隆猫以及野生猫或野猫。

如本文所用，术语“犬”包括所有家养狗、犬狼科或犬科，除非另有说明。

犬IgG有四种已知的IgG重链亚型和两种已知的轻链亚型。四种IgG重链分别称为A、B、C和D。这些重链代表狗IgG的四个不同亚类，分别称为IgG-A(或IgGA)、IgG-B(或IgGB)、IgG-C(或IgGC)和IgG-D(或IgGD)。每条重链由一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(称为CH1、CH2和CH3)组成。CH1结构域通过称为“铰链”或“铰链区”的氨基酸序列连接至CH2结构域。Tang et al.[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]首先鉴定了这四种重链IgG的DNA和氨基酸序列。这些重链IgG的氨基酸和DNA序列也可从GenBank数据库中获得。例如，IgG-A重链的氨基酸序列具有登录号AAL35301.1，IgG-B具有登录号AAL35302.1，IgG-C具有登录号AAL35303.1，并且IgG-D具有登录号(AAL35304.1)。犬抗体还含有两种类型的轻链：kappa和lambda。这些轻链的DNA和氨基酸序列可以从GenBank数据库获得。例如，kappa轻链氨基酸序列具有登录号ABY 57289.1并且lamda轻链具有登录号ABY 55569.1。

“片段可结晶区”缩写为“Fc区”或简称为“Fc”，对应于与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的CH2-CH3部分。如本文所用，“犬片段可结晶区”可互换地缩写为“cFc区”或仅“cFc”并且对应于来自犬抗体的犬片段可结晶区。Tang et al.[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)；see also,Bergeron et al.,Vet.Immunol.Immunopathol.157:31-41(2014)]首先描述了四种犬IgG的每一种的犬片段可结晶区(cFc)。

如本文所用，跨膜白介素例如犬白介素4受体α、犬白介素13受体α1或犬白介素13受体α2的“胞外结构域”或“ECD”是指白介素蛋白自然投射到细胞周围的环境中的部分。ECD不包括白介素的跨膜部分。犬白介素-4受体α的ECD与犬IL-4结合。犬白介素-13受体α1和犬白介素-13受体α2的ECD均与IL-13结合。

本文所用的“人工蛋白”和“人工蛋白分子”可互换使用，并且表示自然界中不天然存在的蛋白(或蛋白的多聚体，例如二聚体、异二聚体、四聚体和异四聚体等)，例如人造融合蛋白。

如本文所用，“融合蛋白”是包含来自通过肽键将两种或更多种不同蛋白连接在一起的氨基酸序列的人工蛋白。

如本文所用，“cFc融合蛋白”是连接IgG抗体的cFc的人工蛋白，其可包含铰链区(例如IgGB铰链区-CH2-CH3)与另一个生物活性蛋白结构域以产生具有独特的结构和治疗功效的分子。例如，犬IL-13Rα1-cFc融合蛋白包含与犬IgG Fc(cFc)的N末端连接的犬IL-13Rα1的胞外结构域(ECD)。IL-13Rα1的ECD可以通过犬铰链区连接至cFc的N末端。本发明的cFc融合蛋白，虽然通过使用IgGB铰链区和IgGB cFc来举例说明，但决不限于此，而是它们包括具有IgGA、IgGC和IgGD的cFc和任选地IgGA、IgGC和IgGD的铰链区的相应融合蛋白。因此，犬Fc融合蛋白cIL-4Rα-cIgGB-Fc是cIL-4Rα-cFc属的一种，该属还包括cIL-4Rα-cIgGA-Fc、cIL-4Rα-cIgGC-Fc和cIL-4Rα-cIgGD-Fc。

“包含与犬中天然发现的蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列”的本发明的cFc融合蛋白的特定组分(例如，犬ECD、犬铰链区或cFc)由与犬中发现的相应蛋白(包括其天然存在的变体)的区域的相应氨基酸序列相同的氨基酸序列组成。例如，当cFc融合蛋白的成分是cFc本身，并且cFc“包含与犬中天然存在的蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列”时，cFc融合蛋白的cFc区的氨基酸序列与犬抗体的天然存在的犬cFc区或其变体相同。

如本文所用，“仅由与犬中天然存在的蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列构成”的cFc融合蛋白仅由与犬中发现的蛋白(包括其天然存在的变体)相应区域的氨基酸序列各自相同的氨基酸序列组成的该cFc融合蛋白的组分组成。例如，当cFc融合蛋白是由三个组分组成的cIL-13Rα1-cFc融合蛋白时：cIL-13Rα1的ECD通过犬铰链区连接到cFc的N末端，并且“仅由与犬中天然存在的蛋白的氨基酸序列相同氨的基酸序列构成”，cIL-13Rα1-cFc融合蛋白的所有三个组分的各个氨基酸序列：(i)cIL-13Rα1的ECD的氨基酸序列，(ii)cFc的氨基酸序列，和(iii)犬铰链区的氨基酸序列分别与犬中天然发现的蛋白(包括其天然存在的变体)的相应区域的氨基酸序列相同。

如本文所用，术语本发明的cFc融合蛋白的“唯一接头”表示该接头是该cFc融合蛋白中的唯一接头。例如，如果该犬铰链区是包含通过犬铰链区与cFc的N末端连接的cIL-13Rα1的ECD的cFc融合蛋白包含的唯一接头，则该犬铰链区是唯一接头。

如本文所用，“犬白介素-13受体α1-犬片段可结晶区融合蛋白”、“犬白介素-13受体α1-cFc融合蛋白”、“犬IL-13Rα1-cFc融合蛋白”或“cIL-13Rα1-cFc融合蛋白”均可互换使用，并包含通过肽键连接至犬IgG Fc(cFc)的cIL-13Rα1的胞外结构域(ECD)[或结合犬白介素-13(cIL-13)的ECD的片段]。在具体的实施方式中，cIL-13Rα1-cFc融合蛋白还包含将cIL-13Rα1的ECD(或结合cIL-13的ECD的片段)与cFc连接的犬铰链区。cIL-13Rα1-cFc融合蛋白可以通过基因工程从编码cIL-13Rα1ECD(或结合cIL-13的ECD的片段)与cFc(具有或不具有连接铰链区)的化学合成核酸产生。

本文使用的“犬白介素-13受体α2-犬片段可结晶区融合蛋白”、“犬白介素-13受体α2-cFc融合蛋白”、“犬IL-13Rα2-cFc融合蛋白”或“cIL-13Rα2-cFc融合蛋白”可互换使用，并包含通过肽键连接至犬IgG Fc(cFc)的cIL-13Rα2的胞外结构域(ECD)[或结合犬白介素-13(cIL-13)的ECD的片段]。在特定的实施方式中，cIL-13Rα2-cFc融合蛋白还包含将cIL-13Rα2的ECD(或结合cIL-13的ECD的片段)与cFc连接的犬铰链区。cIL-13Rα2-cFc融合蛋白可以通过基因工程从编码cIL-13Rα2ECD(或结合cIL 13的ECD片段)与cFc(具有或不具有连接铰链区)的化学合成核酸产生。

本文使用的“犬白介素-4受体α-犬片段可结晶区融合蛋白”、“犬白介素-4受体α-cFc融合蛋白”、“犬IL-4Rα-cFc融合蛋白”或“cIL-4Rα-cFc融合蛋白”可互换使用，并包含通过肽键连接至犬IgG Fc(cFc)的cIL-4Rα胞外结构域(ECD)[或结合犬白介素4(cIL-4)的ECD的片段]。在具体的实施方式中，cIL-4Rα-cFc融合蛋白还包含将cIL-4Rα的ECD(或结合cIL-4的ECD的片段)与cFc连接的犬铰链区。cIL-4Rα-cFc融合蛋白可以通过基因工程从编码cIL-4RαECD(或结合cIL-4的ECD的片段)与cFc(具有或不具有连接铰链区)的化学合成核酸产生。

如本文所用，包含“结合cIL-4的cIL-4Rα的ECD的片段”(或可互换地，结合cIL-4的cIL-4Rα的ECD的“其片段”)的cIL-4Rα-cFc融合蛋白对cIL-4的结合亲和力比包含全长ECD的相应cIL-4Rα-cFc融合蛋白的结合亲和力至多低100倍，即，解离常数至多高10²倍(例如，与10^-9M相比，10^-7M)。在某些实施方式中，包含结合cIL-4的cIL-4Rα的ECD的片段的cIL-4Rα-cFc融合蛋白对cIL-4的结合亲和力比包含全长ECD的相应的cIL-4Rα-cFc融合物的结合亲和力低至多10倍，即解离常数最多高10倍。在其他实施方式中，包含结合cIL-4的cIL-4Rα的ECD的片段的cIL-4Rα-cFc融合蛋白对cIL-4的结合亲和力比包含全长ECD的相应的cIL-4Rα-cFc融合蛋白的结合亲和力小至多5倍，即解离常数最多高5倍。

如本文所用，包含“结合cIL-13的cIL-13Rα2的ECD的片段”(或可互换地，结合cIL-13的cIL-13Rα2的ECD的“其片段”)的cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对cIL-13结合亲和力比包含全长ECD的相应cIL-13Rα2-cFc融合蛋白的结合亲和力至多低100倍，即解离常数至多高10²倍。在某些实施方式中，包含结合cIL-13的cIL-13Rα2ECD的片段的cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对cIL-13的结合亲和力比包含全长ECD的相应cIL-13Rα2-cFc融合物的结合亲和力低至多10倍，即解离常数最多高10倍。在其他实施方式中，包含结合cIL-13的cIL-13Rα2的ECD的片段的cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对cIL-13的结合亲和力比包含全长ECD的相应cIL-13Rα2-cFc融合蛋白的结合亲和力小至多5倍，即解离常数最多高5倍。

如本文所用，包含“结合cIL-13的cIL-13Rα1的ECD的片段”(或可互换地，结合cIL-13的cIL-13Rα1的ECD的“其片段”)的cIL-13Rα1-cFc融合蛋白对cIL-13的结合亲和力比包含全长ECD的相应cIL-13Rα1-cFc融合蛋白的结合亲和力至多低100倍，即解离常数至多高10²倍。在某些实施方式中，包含结合cIL-13的cIL-13Rα1的ECD的片段的cIL-13Rα1-cFc融合蛋白对cIL-13的结合亲和力比包含全长ECD的相应cIL-13Rα1-cFc融合蛋白的结合亲和力低至多10倍，即解离常数最多高10倍。在其他实施方式中，包含结合cIL-13的cIL-13Rα1的ECD的片段的cIL-13Rα1-cFc融合蛋白对cIL-13的结合亲和力比包含全长ECD的相应的cIL-13Rα1-cFc融合蛋白的结合亲和力小至多5倍，即解离常数最多高5倍。

如本文所用，本发明的犬白介素受体-cFc融合蛋白的“同二聚体”是至少具有相同ECD(或结合相应配体的该ECD的片段)的两个单体融合蛋白的二聚体。两个单体融合蛋白通常也具有相同的cFc和相同的铰链区。例如，当犬白介素受体-cFc融合蛋白是cIL-4Rα-cFc融合蛋白时，ECD是IL-4RαECD并且配体是cIL-4。同源二聚体的两个单体通过每个单体铰链区的半胱氨酸残基形成的二硫键连接在一起。例如，cIL-4Rα-cFc融合蛋白的同二聚体包含两个cIL-4Rα-cFc融合蛋白单体，并且cIL-13Rα2-cFc融合蛋白的同二聚体包含两个cIL-13Rα2-cFc融合蛋白单体。

如本文所用，本发明的犬白介素受体-cFc融合蛋白的“异二聚体”是具有不同ECD(或结合各个ECD的相应配体的各个ECD的片段)的两个单体融合蛋白的二聚体。两个单体融合蛋白通常具有相同的cFc，尽管在某些情况下，由于为了将两个单体保持在一起而进行的修饰，它们可能略有不同。例如，cIL-4Rα-cFc融合蛋白和cIL-13Rα2-cFc融合蛋白的异二聚体包含一个cIL-4Rα-cFc融合蛋白单体和一个cIL-13Rα2-cFc融合蛋白单体，而cIL-4Rα-cFc融合蛋白和cIL-13Rα1-cFc融合蛋白的异二聚体包含一个cIL-4Rα-cFc融合蛋白单体和一种cIL-13Rα1-cFc融合蛋白单体。一个这样的实施方式是cIL-4Rα-13Rα1_ZW1-cFc，其是cIL-4Rα-cFc-ZW-A和cIL-13Rα1-cFc-ZW-B的异二聚体。另一个这样的实施方式是cIL-4Rα-13Rα2_ZW1-cFc，其是cIL-4Rα-cFc-ZW-A和cIL-13Rα2-cFc-ZWB的异二聚体。

如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体。抗体可以是单体、二聚体或更大的多聚体。因此，它以最广泛的意义使用并且具体涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、犬源化抗体、全犬抗体、嵌合抗体和骆驼化单域抗体。“亲本抗体”是在修饰抗体以用于预期用途之前通过将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体，例如将抗体犬源化以用作犬治疗抗体。

如本文所用，本发明的cFc融合蛋白或本发明中使用的“阻断”或正在“阻断”或“正在阻断例如犬受体与其结合配偶体(配体)的结合”的抗体是阻断(部分或完全)犬受体与其犬配体的结合的抗体和/或融合蛋白，反之亦然，如标准结合测定(例如ELISA或流式细胞术)中所确定的。

通常，当该活性以摩尔为基础表达时，本发明的抗体或抗原结合片段保留其犬抗原结合活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)，优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留与亲本抗体一样的犬抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。还意图本发明的抗体或抗原结合片段可以包含基本上不改变其生物活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。

“分离的抗体”是指纯化状态，并且在这种情况下是指该分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。一般而言，术语“分离的”并不意指完全不存在这样的物质或不存在水、缓冲剂或盐，除非它们以显著干扰本文描述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一和第二抗体来自不同物种。[U.S.4,816,567；and Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。通常，可变结构域获自实验动物(例如啮齿动物)的抗体(“亲本抗体”)，并且恒定结构域序列获自动物受试者抗体(例如人或犬)，使得所得嵌合抗体与亲本(例如啮齿动物)抗体相比不太可能分别在人类或犬科动物受试者中引发不良免疫反应。

如本文所用，术语“犬源化抗体”是指含有来自犬和非犬(例如，大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，犬源化抗体将包含至少一个或多个，通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高变环对应于非犬免疫球蛋白的高变环(例如，包含如下例举的6个CDR)，以及所有或基本上所有框架(FR)区(并且通常所有或基本上所有剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些。如本文所例证的，犬源化抗体包含来自大鼠抗犬抗原抗体的三个重链CDR和三个轻链CDRS以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含如本文示例的一个或多个氨基酸改变，其进一步优化犬源化抗体的有效性，例如，增加其与其犬抗原的结合和/或其阻断该犬抗原与犬抗原的天然结合配偶体结合的能力。结合犬IL-31和IL-31Rα的犬源化鼠或大鼠抗犬抗体包括但不限于包含犬IgGA、IgGB、IgGC或IgGD重链的本发明使用的抗体。

每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般来说，完整的抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，两个结合位点通常是相同的。

通常，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区对齐，从而能够与特定表位结合。一般而言，从N端到C端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配通常根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5^th ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat,et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia,et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia,et al.,Nature342:878-883(1989)]的定义。

如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基[即，轻链可变域中的CDRL1(或LCDR1)、CDRL2(或LCDR2)和CDRL3(或LCDR3)以及重链可变域中的CDRH1(或HCDR1)、CDRH2(或HCDR2)和CDRH3(或HCDR3)]。[参见Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991),defining the CDR regions of an antibody by sequence；see also Chothiaand Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)defining the CDR regions of an antibodyby structure].

如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

如本文所用，术语“犬框架”是指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的犬抗体的重链和轻链的氨基酸序列。对于犬源化抗体，在大多数实施方式中，天然犬CDR的氨基酸序列在两条链中被相应的外源CDR(例如，来自小鼠或大鼠抗体的那些)替换。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以含有一些外来非CDR残基，例如，以便保留犬抗体内的外来CDR的构象，和/或修饰Fc功能，如下例示和/或在U.S.10,106,607 B2中公开。

如本文所用，“止痒剂”是倾向于抑制、缓解和/或预防瘙痒的化合物、大分子和/或制剂。止痒剂通俗地称为止痒药。

如本文所用，“抗瘙痒抗体”是可以在动物中充当抗瘙痒剂的抗体，所述动物包括哺乳动物，例如人、犬和/或猫科动物，特别是对于特应性皮炎。在特定的实施方式中，抗瘙痒抗体结合IL-31信号传导通路中的特定蛋白质，例如IL-31或其受体IL-31Rα。抗瘙痒抗体与其相应抗原(例如IL-31或IL-31Rα)的结合抑制例如IL-31与IL-31Rα的结合，并且干扰和/或阻止该通路的成功信号传导，并且从而抑制、缓解和/或预防由IL-31信号通路引起的瘙痒。

如本文所用，“抗炎剂”是通过阻断体内引起炎症的某些物质的相互作用来减轻炎症的化合物、大分子和/或制剂。抗炎剂可以是cFc融合蛋白，其可以在动物中充当抗炎剂，所述动物包括哺乳动物例如人、犬和/或猫科动物，特别是对于特应性皮炎。在特定的实施方式中，抗炎cFc融合蛋白结合IL-4/IL-13信号传导通路中的特定蛋白质，例如IL-4或IL-13。抗炎cFc融合蛋白与其相应抗原(例如，IL-4)的结合抑制例如IL-4与IL-4Rα的结合，并且干扰和/或阻止该通路的信号传导，从而干扰或预防与特应性皮炎相关的慢性炎症。cIL-4Rα-cFc融合蛋白同二聚体与cIL-13Rα2-cFc融合蛋白同二聚体的组合在特应性皮炎的治疗中充当抗炎剂。

如本文所用，“双特异性融合蛋白”是人工蛋白，其可以是连续蛋白，例如通过肽键连接在一起的两个不同的生物活性蛋白结构域，例如cIL-4Rα的ECD、cIL-13Rα1的ECD与cFc和可选的接头。或者，双特异性融合蛋白可以是异二聚体融合蛋白，其中两个不同的生物活性蛋白结构域分别通过肽键与融合配偶体连接在一起，但在异二聚体融合蛋白中通过非肽键(其可以是共价键或非共价键)连接在一起。例如，通过组合具有不同ECD的两个单体融合蛋白而形成的异二聚体，例如cIL-4Rα-cFc融合蛋白单体和cIL-13Rα2-cFc融合蛋白单体的异二聚体。

“同源性”是指当两个多核苷酸序列或两个多肽序列最佳比对时它们之间的序列相似性。当两个比较的序列两者中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，则这些分子在该位置处是同源的。同源性百分比是两条序列共享的同源位置数除以比较的位置总数×100。例如，如果两条序列中的10个位置中有6个在序列最佳比对时匹配或同源，则这两条序列有60％同源性。一般来说，当两个序列比对以给出最大百分比同源性时进行比较。

“分离的核酸分子”意指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，其不与在自然界中发现的分离的多核苷酸的全部或部分核苷酸相关，或与不与自然相连接的多核苷酸连接。出于本公开的目的，应当理解“核酸分子包含”不涵盖完整染色体的特定核苷酸序列。“包含”特定核酸序列的分离的核酸分子除了特定序列之外还可以包含多达十个或甚至多达二十个或更多个其他蛋白或其部分或片段的编码序列，或者可以包含控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调控序列，和/或可以包含载体序列。

短语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸与另一核酸序列形成功能关系时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则该位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点处连接来完成的。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和源自其的培养物，而不考虑转移的次数。人们还理解，由于有意或无意的突变，并非所有后代都具有完全相同的DNA含量。包括具有与在最初转化的细胞中筛选出的相同功能或生物活性的突变体后代。如果有不同的名称，可以从上下文中清楚地看出。

序列同一性是指当两条序列最佳比对时，两条多肽的氨基酸在同等位置上相同的程度。如本文所用，当两条序列的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与第二氨基酸序列100％“相同”。因此，当两条氨基酸序列的50％氨基酸残基相同时，氨基酸序列与第二氨基酸序列50％“相同”。序列比较是在给定蛋白(例如，被比较的蛋白或多肽的一部分)包含的连续氨基酸残基块上进行的。在特定的实施方式中，考虑可能改变两条氨基酸序列之间的对应性的选定的缺失或插入。

序列相似性包括相同的残基和不相同的、生化相关的氨基酸。生化相关的氨基酸具有相似的特性并且可以互换。

“保守修饰变体”或“保守置换”是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得经常可以在不改变蛋白生物活性的情况下进行改变。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不会改变生物活性[参见例如，Watson et al.,MolecularBiology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.；1987)]。此外，结构或功能相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性保守置换直接列于下表A中。

表A

示例性保守氨基酸置换

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本发明还涵盖了本发明cFc融合蛋白的功能保守变体。如本文所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被改变而不改变所需性质(例如抗原亲和力和/或特异性)的cFc融合蛋白。这样的变体包括但不限于用具有相似特性的氨基酸替换氨基酸，例如上表A的保守氨基酸置换。

核酸

本发明包含本发明的cFc融合蛋白，以及包含本发明的cFc融合蛋白以及本发明中使用的抗体的组合物(参见例如下面的实施例)。

本发明还包括编码所提供的cFc融合蛋白和本发明中使用的免疫球蛋白多肽的核酸，所述多肽包含与本文提供的犬源化抗体的氨基酸序列至少约70％相同、优选地至少约80％相同、更优选地至少约90％相同，和最优选地至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列(当通过BLAST算法进行比较时，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配)。本发明进一步提供编码融合蛋白和/或免疫球蛋白多肽的核酸，所述多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似、优选地至少约80％相似、更优选地至少约90％相似且最优选地至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列(当用BLAST算法进行比较时，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配)，也包括在本发明中。

如本文所用，可以使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519),VectorNTI(Informax,Inc.MD),Oxford Molecular Group PLC(1996)和Clustal W算法用比对默认参数和同一性默认参数来测定核苷酸和氨基酸序列同一性百分比。这些商业上可获得的程序还可用于使用相同或类似的默认参数来确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级Blast搜索，例如，使用GCG(Genetics Computer Group,Program Manual forthe GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序使用默认参数。

以下参考文献涉及常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法：Altschul,S.F.,etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.,et al.,Nature Genet.3:266-272(1993)；Madden,T.L.,et al.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.,et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.,et al.,Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.,et al.,Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.et al.,Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.,etal.,"A model of evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequenceand Structure,vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,et al.,"Matrices fordetecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.,et al.,Methods 3:66-70(1991)；Henikoff,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；Dembo,A.,et al.,Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；and Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance ofmultipledistinct local alignments."in Theoretical and Computational Methodsin Genome Research(S.Suhai,ed.),pp.1-14,Plenum,New York(1997)。

本发明的cFc融合蛋白(和本发明中使用的抗体)可以通过本领域已知的方法重组产生。可用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。这些细胞尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或抗原结合部分或其片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选地，允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间来产生抗体。

可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强本发明的抗体(或其其他部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。结合欧洲专利No.0 216 846、0 256055和0 323 997以及欧洲专利申请No.89303964.4来整体或部分地讨论GS系统。

药物组合物和施用

为了制备包含本发明的cFc融合蛋白的药物或无菌组合物(单独或者与本发明使用的抗体一起)，可以将其与药学上可接受的载体或赋形剂混合。[参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)]。

治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(例如以冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式)来制备，[参见，例如，Hardman,et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方式中，将包含本发明的cFc融合蛋白的药物组合物在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至适当的浓度，并添加NaCl或蔗糖以调节张力。可以添加额外的试剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以增强稳定性。

单独施用或与另一种药剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如用于确定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(对50％的人群具有治疗效果的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比即为治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。在特定方面，表现出高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定用于犬的一系列剂量。这样的化合物的剂量优选地位于包括具有很小或无毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和施用途径在此范围内变化。

施用方式可以有所不同。合适的施用途径包括口服、直肠、跨粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。在特定的实施方式中，包含本发明的cFc融合蛋白的药物组合物可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的进一步的实施方式中，包含本发明的cFc融合蛋白的药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、动脉内或通过吸入、气雾剂递送施用。通过非侵入性途径(例如，口服；例如，在丸剂、胶囊或片剂中)的施用也在本发明的范围内。

组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，本发明的药物组合物可以通过用皮下注射针注射来施用，所述注射针包括例如预装注射器或自动注射器。本文公开的药物组合物还可以用无针皮下注射装置施用；例如美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556。

本文公开的药物组合物还可以通过输注施用。众所周知的用于施用药物组合物的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输液泵；美国专利No.4,447,233，其公开了一种以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物、递送系统和模块对于本领域技术人员来说是众所周知的。

或者，可以以局部而非全身的方式，通常以储库或持续释放制剂的形式施用包含本发明的cFc融合蛋白(和任选地本发明中使用的抗体)的组合物。

施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体和/或cFc融合蛋白的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体和/或cFc融合蛋白的免疫原性以及生物基质中的靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体和/或cFc融合蛋白以实现目标疾病/病症状态的改善，同时最小化不期望的副作用。因此，递送的生物制品的量部分取决于特定的治疗性抗体和/或融合蛋白以及所治疗的病症的严重性。选择适当剂量的治疗抗体的指导是可用的[参见，例如，Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,NY(1991)；Bach(ed.)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert,et al.New Engl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom et al.New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon et al.New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz etal.New Engl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh et al.New Engl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky et al.New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。

适当的剂量由兽医确定，例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素。一般来说，剂量开始时的量略小于最佳剂量，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现所需或最佳效果。重要的诊断措施包括症状的诊断措施。

包含本发明的cFc融合蛋白的组合物，单独地或与本发明中使用的抗体一起，可以通过连续输注或通过施用的剂量来提供，例如每天、每周1-7次、每周、每周两次、每月、每两个月、每季度、每半年、每年等。可以例如静脉内、皮下、局部、口服、鼻内、直肠、肌内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0μg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[参见，例如Yang,et al.New Engl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold,et al.New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu,etal.J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji,et al.CancerImmunol.Immunother.52:133-144(2003)]。还可以提供剂量以实现犬血清中本发明的cFc融合蛋白的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其他实施方式中，本发明的cFc融合蛋白是在每周，每两周一次，“每4周”，每月，每两月，或季度以10、20、50、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者皮下或静脉内施用。

如本文所用，“抑制”或“治疗/处理(treat/treatment)”包括推迟与疾病或病症相关的症状的发展和/或降低这样的疾病或病症的症状的严重性。该术语还包括改善现有的不受控制或不需要的症状、预防另外的症状、以及改善或预防这样的症状的根本原因。因此，这些术语表示有益结果已被赋予患有疾病、病症和/或症状或具有发展这样的病症、疾病或症状的潜力的脊椎动物受试者(例如犬)。

本文所用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂组合施用至细胞、组织或受试者，例如犬时，本发明的cFc融合蛋白的量可有效地在疾病或病症的一种或多种症状或这样的疾病或病症的进展中引起可测量的改善。治疗有效剂量还指抗体和/或融合蛋白的量足以导致症状的至少部分改善，例如相关医学病症的治疗、治愈、预防或改善，或这样的病症的治疗、治愈、预防或改善的比率增加。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合、连续或同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断测量或参数改善至少10％；通常至少20％；优选地至少约30％；更优选地至少40％，并且最优选地至少50％。在使用主观测量来评估病症严重性的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。

其他联合疗法

包含本发明的cFc融合蛋白的组合物(有或没有本发明中使用的抗体)可以包含一种或多种另外的治疗组分。Janus激酶(JAK)抑制剂就是这样的治疗成分家族之一。在这种类型的特定实施方式中，JAK抑制剂包含以下化学式：

其中R¹是任选地被羟基取代的C_1-4烷基，及其药学上可接受的盐[U.S.8,133,899；U.S.8,987,283]。更具体地，JAK抑制剂是oclacitinib，甚至更具体地，oclacitinib的马来酸盐。

相对于JAK3优选地抑制JAK1的替代性JAK抑制剂是：1-[(3R,4S)-4-氰基四氢吡喃-3-基]-3-[(2-氟-6-甲氧基-4-吡啶基)氨基]吡唑-4-甲酰胺，其化学式为：

及其药学上可接受的盐[参见WO 2018/108969]。

另一种替代性JAK抑制剂是3-氮杂环丁烷乙腈，1-(环丙基磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-(来源：CAS)；也称为{1(环丙烷磺酰基)-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]氮杂环丁烷-3-基}乙腈(来源：USAN项目化学顾问)，其化学式为：

及其药学上可接受的盐[参见，US2020/0339585]。

可以添加到本发明的组合物中的另一种治疗组分可以是脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂。一种这样的SYK抑制剂是(1S,4R)-4-羟基-2,2-二甲基-4-{5-[3-甲基-5-(4-甲基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-1,3-噻唑-2-基}-环己烷甲酸或其药学上可接受的盐[参见例如美国8,759,366]。

另外，可以添加到本发明的组合物中的另一种治疗组分可以是TH2细胞上表达的趋化受体同源分子的拮抗剂，其包含化学式：

及其药学上可接受的盐[还参见U.S.7,696,222,U.S.8,546,422,U.S.8,637,541,WO 2010/099039；WO 2010/031183；和U.S.8,546,422]。

这些另外的治疗组分可以在施用包含本发明的抗体和/或融合蛋白的组合物之前、同时或之后施用于犬受试者。

当然，上面列出的JAK抑制剂、SYK抑制剂或趋化受体同源分子的预防或治疗剂量的大小将根据待治疗病症的性质和严重程度以及特定抑制剂及其施用途径而变化。它还会根据多种因素而变化，包括年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合和个体犬的反应。一般而言，日剂量为约0.001mg至约100mg/kg狗体重，优选地0.01mg至约10mg/kg。在另一个实施方式中，每日剂量为约0.2mg/kg狗体重至约1.0mg/kg狗体重。在另一个实施方式中，日剂量为约0.1mg/kg狗体重至约3.0mg/kg狗体重。另一方面，在某些情况下可能需要使用超出这些限制的剂量。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。例如，用于口服施用的制剂可含有0.05mg至5g的活性剂，其与适当且方便的量(可在总组合物的约5％至约99.95％之间变化)的载体材料混合。剂量单位形式通常含有约0.1mg至约0.4g的活性成分，通常为0.5mg、1mg、2mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、200mg或400mg。

实施例

实施例1

同二聚体Fc融合蛋白

产生重组融合蛋白：

下表2B和2C中列出的重组融合蛋白是在向商业制造商提供所选融合蛋白的精确氨基酸序列后从他们获得的。氨基酸序列可以从公开的蛋白质数据库获得，例如GenBank，例如，全长氨基酸序列的登录号包括对于犬狼疮白介素-4受体亚基α亚型X1的登录号#XP_022275636.1，对于犬狼疮白介素-13受体亚基α-1亚型X2的登录号#XP_038306633.1，对于犬狼疮白介素-13受体亚基α-2前体的登录号#NP_001003075.1。通常，为了重组地产生这些融合蛋白，编码犬融合蛋白的DNA被化学合成，然后克隆到合适的表达载体(例如，pcDNA3.4表达载体)中以在细胞例如CHO或HEK-293细胞中产生蛋白质。因此，商业制造商选择编码融合蛋白氨基酸序列的最佳核苷酸序列，化学合成核酸，将核酸插入产生相应重组融合蛋白的表达载体中，然后纯化表达的融合蛋白。核酸序列通常在商业供应商处生产，过程需要以下步骤：

1.根据目的基因序列，设计并合成多条长度约100个核苷酸的寡核苷酸(合成的重叠寡核苷酸覆盖ECD、铰链区、cFc)；

2.通过聚合酶链式反应(PCR)将寡核苷酸组装在一起，得到全长基因序列；和

3.使用DNA凝胶提取试剂盒纯化PCR产物，并在后续克隆步骤中用作插入片段。在本例中，重组融合蛋白是在CHO细胞中产生的，并使用Protein A柱层析进行纯化。

编码本发明的cFc融合蛋白的核酸包含选定的犬白介素受体(即cIL-4Rα、cIL-13Rα1或cIL-13Rα2)的胞外结构域(ECD)或其片段的编码序列，和犬IgG铰链区以及犬IgG(cFc)地编码序列。所得融合蛋白按N端到C端的顺序包含：ECD、铰链区(粗体)和cFc。cFc和铰链区可源自犬IgGA、IgGB、IgGC或IgGD。cFc融合蛋白可以任选地包含氨基酸置换，以允许延长体内半衰期或消除一些效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性(CDC)[参见例如US 10,106,607 B2]。

同二聚体的两个单体通过每个单体的铰链区中的半胱氨酸残基形成的二硫键连接在一起。同二聚体蛋白质在单独的宿主细胞(例如CHO细胞)中制备，然后可以在从其各自的生产细胞纯化后组合。同二聚体蛋白可以通过多种途径施用给狗，例如IV、SC、IP或IM。同二聚体蛋白可以以0.1ug/kg至20mg/kg或更高的剂量施用。通常，同二聚体蛋白可以以0.1mg/kg至10mg/kg范围的剂量施用。

本发明的同二聚体Fc融合蛋白的实例是：

cIL-4Rα-cIgGB-Fc[SEQ ID NO:5]

cIL-13Rα1-cIgGB-Fc[SEQ ID NO:6]

cIL-13Rα2-cIgGB-Fc[SEQ ID NO:7]

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实施例2

具有延长半衰期的同二聚cFc融合蛋白

了解新生儿Fc受体(FcRn)和IgG抗体之间相互作用的结构和特征，已为提高IgG抗体和Fc融合蛋白的血清半衰期的抗体或Fc的工程化工作提供了基础。几位研究人员描述了蛋白的血清半衰期延长以及延长这样的蛋白的血清半衰期的方法背后的机制[例如，参见Ko et al.,BioDrugs 35:147 157(2021)]。如上文实施例1中所述，由编码期望的氨基酸序列的核苷酸序列重组地合成并产生具有延长的半衰期的同源蛋白。

下文提供了体内半衰期延长的重组cFc融合蛋白的实施例。在这些实施例中，犬cFc是IgGB，然而，在本发明的cFc融合蛋白中使用替代的cFc，即IgGA、IgGC和IgGD也是本发明的一部分。

犬IgG-B Fc最先由Tang等人定义。[Vet Immunology&Immunopathology,80:259-270(2001)]，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，提供如下。

重组融合蛋白的cFc部分的氨基酸序列包含氨基酸替换(粗体和下划线)，其导致在弱酸性pH(例如，pH 6.0)下与野生型cFc相比具有更高的与FcRn结合的亲和力，同时在中性pH(例如，pH7.0-7.2)下具有与野生型cFc所表现出的相似的对FcRn的结合亲和力。每个序列的铰链区以粗体显示，但没有下划线。

cIL-4Rα-cIgGB-Fc-YTE[SEQ ID NO:8]CH2编号(L18Y/A20T/T22E)

cIL-13Rα1-cIgGB-Fc-YTE[SEQ ID NO:9]CH2编号(L18Y/A20T/T22E)

cIL-13Rα2-cIgGB-Fc-YTE[SEQ ID NO:10]CH2编号(L18Y/A20T/T22E)

cIL-4Rα-cIgGB-Fc-H[SEQ ID NO:11]CH2编号(N202H)

cIL-4Rα-cIgGB-Fc-YD[SEQ ID NO:12]CH2编号(L18Y/T22D)

cIL-13Rα2-cIgGB-Fc-YD[SEQ ID NO:13]CH2编号(L18Y/T22D)

粗体氨基酸残基是铰链区，而粗体和下划线的氨基酸残基是置换以增加融合蛋白的体内半衰期。

实施例3

双特异性Fc融合蛋白

双特异性cFc融合蛋白通常被认为是比同二聚体cFc融合蛋白更好的替代品，因为双特异性cFc融合蛋白的两个单体中的每一个均结合不同的靶蛋白。理论上，这可以大幅降低总体制造成本。因此，在产生的一个这样的双特异性cFc融合蛋白包含异二聚体，该异二聚体由第一单体组成，该第一单体按N端到C端的顺序包含：IL-13Rα1的ECD、IgGB的铰链区和IgGB的cFc，而第二单体按N端到C端的顺序包含cIL-4Rα的ECD、IgGB的铰链区和IgGB的cFc。另一种双特异性cFc融合蛋白包含异二聚体，该异二聚体由第一单体组成，该第一单体按N端到C端的顺序包含：IL-13Rα2的ECD、IgGB的铰链区和IgGB的cFc，而第二单体按N端到C端的顺序包含cIL-4Rα的ECD、IgGB的铰链区和IgGB的cFc。

异二聚体蛋白是由编码与上述实施例1中描述的类似的所需氨基酸序列的核苷酸序列重组地合成和产生的。异二聚体蛋白通过多种途径施用给狗，例如IV、SC、IP或IM。异二聚体蛋白可以以0.1ug/kg至20mg/kg或更高的剂量施用。通常，异二聚体蛋白可以以0.1mg/kg至10mg/kg范围内的剂量施用。

为了形成双特异性融合蛋白，重要的是在每个结合配偶体的融合蛋白的Fc部分上进行氨基酸置换，以便有利于形成两个Fc融合蛋白的异二聚体而不是同二聚体。下表1中提供了可用于有利于异源二聚体形成的犬Fc融合蛋白的Fc部分中的特定氨基酸置换的几种潜在方式或组合。这些置换要么有利于Fc异二聚化的杵入臼方法，要么有利于不同Fc链之间的静电吸引以允许异二聚化[有关这些氨基酸置换的全面讨论，请参阅Moore et al.,Methods,154:38-50(2019)and Brinkmann&Kontermann,MABS,9:182-212(2017)]。

一种双特异性融合蛋白cIL-4Rα-13Rα1_ZW1-cFc是cIL-4Rα-cIgGB-Fc-ZW-A和cIL-13Rα1-cIgGB-Fc-ZW-B的异二聚体。另一种双特异性融合蛋白cIL-4Rα-13Rα2_ZW1-cFc是cIL-4Rα-cIgGB-Fc-ZW-A和cIL-13Rα2-cIgGB-Fc-ZW B的异二聚体。

表1

犬IgG-B Fc的氨基酸置换

(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:51)

下面列出了本发明的双特异性Fc融合蛋白的单体的实例，其中氨基酸置换为粗体和下划线：

cIL-4Rα-cIgGB-Fc-ZW-A[SEQ ID NO:18]

cIL-13Rα1-cIgGB-Fc-ZW-B[SEQ ID NO:19]

cIL-13Rα2-cIgGB-Fc-ZW-B[SEQ ID NO:20]

四种犬IgG的现有技术氨基酸序列：

cIgGA[SEQ ID NO:1]现有技术

LGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK

cIgGB[SEQ ID NO:2]现有技术

LGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK

cIgGC[SEQ ID NO:3]现有技术

LGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK

cIgGD[SEQ ID NO:4]现有技术

LGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK

四种犬IgG的犬IgG铰链区的现有技术氨基酸序列：

cIgGA hinge region[SEQ ID NO:21]现有技术

FNECRCTDTPPCPVPEP

cIgGB hinge region[SEQ ID NO:22]现有技术

PKRENGRVPRPPDCPKCPT²PEM

cIgGC hinge region[SEQ ID NO:23]现有技术

AKECECKCNCNNCPCPGCGL

cIgGD hinge region[SEQ ID NO:24]现有技术

PKESTCKCISPCPVPES

cIL-4Rα,cIL-13Rα1,和cIL-13Rα2的ECD的现有技术氨基酸序列

cIL-4Rα[SEQ ID NO:48]现有技术

VKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDLWAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMGPTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWSPSTTWLNYYEPWEQHLP

cIL-13Rα1[SEQ ID NO:49]现有技术

GGVAAPTETQPPVTNLSVSVENLCTVIWTWDPPEGASPNCTLRYFSHFDNKQDKKIAPETHRSKEVPLNERICLQVGSQCSTNESDNPSILVEKCTPPPEGDPESAVTELQCVWHNLSYMKCTWLPGRNTSPDTNYTLYYWHSSLGKILQCEDIYREGQHIGCSFALTNLKDSSFEQHSVQIVVKDNAGKIRPSFNIVPLTSHVKPDPPHIKRLFFQNGNLYVQWKNPQNFYSRCLSYQVEVNNSQTETNDIFYVEEAKCQNSEFEGNLEGTICFMVPGVLPDTLNTVRIRVRTNKLCYEDDKLWSNWSQAMSIGENTDPT

cIL-13Rα2[SEQ ID NO:50]现有技术

SMLSNAEIKVNPPQDFEIVDPGYLGYLSLQWQPPLFPDNFKECTIEYELKYRNIDSENWKTIITKNLHYKDGFDLNKGIEAKINTLLPAQCTNGSEVRSSWAETTYWTSPQGNRETKIQDMDCVYYNWQYLVCSWKPGMGVHFDTNYQLFYWYEGLDHSAECTDYIKVNGKNMGCRFPYLESSDYKDFYICVNGSSESQPIRPSYFIFQLQNIVKPMPPDYLSLTVKNSEEINLKWNMPKGPIPAKCFIYEIEFTEDGTTWVTTTVENEIQITRTSNESQKLCFLVRSKVNIYCSDDGIWSEWSDEQCWKGDIWKET

表2A

犬cFc的和铰链区

IgG cFc或铰链区	SEQ ID NO:
		IgGA cFc(现有技术)	1
IgGB cFc(现有技术)	2
		IgGC cFc(现有技术)	3
IgGD cFc(现有技术)	4
		IgGA铰链区(现有技术)	21
IgGB铰链区(现有技术)	22
		IgGC铰链区(现有技术)	23
IgGD铰链区(现有技术)	24

表2B

同二聚体融合蛋白

表2C

异二聚体融合蛋白序列

cFc融合蛋白	SEQ ID NO:
		cIL-4Rα-cIgGB-Fc-ZW-A	18
cIL-13Rα1-cIgGB-Fc-ZW-B	19
		cIL-13Rα2-cIgGB-Fc-ZW-B	20

实施例4

Fc融合蛋白与犬IL-4和IL-13的结合

方法：

使用HTX测定下表3和表4中提供的cFc融合蛋白的结合常数。所有动力学测量均由/>HTX使用/>生物传感器和DATA/>12.0软件进行。将10μg/mL生物素标记抗原(犬IL-4(cIL-4)或犬IL-13(cIL-13))加载到/>生物传感器上120秒。接下来，将生物传感器放入1x pH 7.0 TBS/酪蛋白缓冲液中60秒以进行封闭阶段。对于结合阶段，将负载抗原的生物传感器放入识别cIL-4或cIL-13抗原的在1x pH 7.0TBS/酪蛋白缓冲液中的野生型、双特异性或FcRn突变受体Fc融合体的2倍系列稀释液(从1μM降至15.6nM的)中持续30秒。最后一个孔仅是缓冲液，并且该传感器用于参考传感器扣除。最后，将生物传感器放入1x pH 7.0 TBS/酪蛋白缓冲液中120秒进行解离阶段。然后使用Data Analysis 12.0软件分析结果，并使用1:1结合模型拟合曲线。

结果：

cIL-4Rα-cFc、cIL-13Rα1-cFc和cIL-13Rα2-cFc同二聚体和异二聚体融合蛋白的结合速率常数(ka)、解离速率常数(kdis)和解离常数(KD)提供于如下表3和表4。从下表3中可以看出，未修饰的cIL-4Rα-cFc同二聚体与cIL-4的结合常数(KD)约为1X10^-12M。相比之下，异二聚体双特异性cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc与cIL-4的KD为大约高10,000倍(大约1X10^-8M)。换句话说，同二聚体cIL-4Rα-cFc与cIL-4的结合比异二聚体双特异性cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc紧密约四个数量级。值得注意的是，修饰的同二聚体cIL-4Rα-cFc-H与犬IL-4结合的KD(1X10^-10)比未修饰的cIL-4Rα-Fc同二聚体的结合的KD高大约两个数量级，并且修饰的同二聚体cIL-4Rα-cFc-YTE与cIL-4的结合(1X10^-11)比修饰的同二聚体高大约一个数量级。此外，通过该测定无法检测到异二聚体双特异性cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc与cIL4的结合。因此，对同二聚体cIL-4Rα-cFc进行修饰以延长其半衰期，导致同二聚体cIL-4Rα-cFc-NH和cIL-4Rα-cFc-YTE对cIL-4的亲和力分别损失约10至100倍，而cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc异二聚体对cIL-4的亲和力相对于未修饰的cIL-4Rα-cFc同二聚体损失约四个数量级，并且二聚体cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc对cIL-4的亲和力非常低，根据该实验程序无法检测到。

表3

IL-4结合动力学

cFc融合蛋白	KD(M)	ka(M^-1s^-1)	kdis(s^-1)
				cIL-4Rα-cFc	1.18E-12	7.03E+05	8.30E-07
cIL-4Rα-cFc-YTE	1.11E-11	8.30E+05	9.23E-06
				cIL-4Rα-cFc-H	1.26E-10	7.85E+05	9.88E-05

				cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc	9.85E-09	2.37E+05	2.34E-03
cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc	ND	ND	ND

ND＝未检测到结合

未修饰的cIL-13Rα1-cFc与cIL-13的结合常数(KD)为约5X10^-9M(参见下表4)。修饰cIL-13Rα1-cFc以进一步延长其半衰期，即制备cIL-13Rα1-cFc-YTE，导致对cIL-13的亲和力降低约4倍，即KD增加至2X10^-8M。然而，值得注意的是，异二聚体双特异性cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc与cIL-13的结合相比于未修饰的IL-13Rα1-cFc表现出紧密8倍(约4X10^-10M；参见下表4)。这与完全相同的异二聚体结合cIL-4的情况形成鲜明对比，其中如上所述，结合相对于相应的cIL-4Rα-cFc同二聚体减少了几乎四个数量级(参见上表3)。这些结果表明，形成异二聚体可导致异二聚体的两个单独单体对其各自的结合配偶体的结合亲和力的显著差异。

从下表4中可以清楚地看出，未修饰的cIL-13Rα2-cFc与cIL-13极其紧密地结合，具有约7.5X10^-13M的KD。事实上，cIL-13Rα2-cFc同二聚体与cIL-13的结合比cIL-13Rα1-cFc同二聚体与cIL-13的结合紧密介于三到四个数量级。将cIL-13Rα2-cFc修饰为cIL-13Rα2-cFc-YTE或cIL-13Rα2-cFc-YD以延长其半衰期，导致cIL-13的结合亲和力略有增加，即KD降低约一个因子或两个(约4.0X10^-13M)。引人注目的是，cIL-13Rα2-cFc-YTE或cIL-13Rα2-cFc-YD的同二聚体与cIL 13的结合比异二聚体双特异性cIL-4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc紧密约四个数量级，后者的KD约为4X10^-9M(参见下表4)。

表4

IL-13结合动力学

cFc融合蛋白	KD(M)	ka(M^-1s^-1)	kdis(s^-1)
				cIL-13Rα1-cFc	5.37E-09	5.80E+04	3.12E-04
cIL-13Rα1-cFc-YTE	1.65E-08	6.65E+04	1.10E-03
				cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc	4.15E-10	9.44E+04	3.91E-05

				cIL-13Rα2-cFc	7.44E-13	1.00E+06	7.45E-07
cIL-13Rα2-cFc-YTE	4.32E-13	1.17E+06	5.04E-07
				cIL-13Rα2-cFc-YD	4.40E-13	1.15E+06	5.07E-07
cIL-4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc	4.15E-09	3.26E+04	1.35E-04

总之，当cIL-4Rα-cFc的同二聚体被cIL-4Rα-cFc-ZW-A与cIL-13Rα1-cFc-ZW-B或cIL-13Rα2-cFc-ZW-B的异二聚体取代，分别形成cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc和cIL-4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc时，对IL-4的结合亲和力显著降低，cIL-4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc异二聚体的亲和力下降明显更大。另一方面，当cIL-13Rα1-cFc的同二聚体被cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc异二聚体取代时，IL-13的相应结合亲和力增加，而当cIL-13Rα2-cFc的同二聚体被cIL-4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc异二聚体取代时，IL-13的结合亲和力显著降低。

实施例5

cFc融合蛋白对STAT-6磷酸化的抑制

通过抑制DH82细胞中STAT-6磷酸化来测量cFc融合蛋白阻断IL-4和IL-13介导的信号传导的能力，测定如下：

材料：

1.生长活跃的DH82细胞：Merck Animal Health Lot：628-011，2014年10月24日

2.HBSS，1X：Corning，目录21-022-CM

3.AlphaLISA p-STAT6(Tyr641)测定试剂盒：Perkin Elmer，目录ALSU-PST6-A10K

4.重组犬IL-4：R&D Systems，目录：752-CL/CF

5a.用于IL-4研究的cFc融合蛋白样品

(i)cIL4Rα-cFc

(ii)cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc

(iii)cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc

5b.用于IL-13研究的cFc融合蛋白样品：

(i)cIL13Rα1-cFc

(ii)cIL13Rα2-cFc

(iii)cIL4R-IL13Rα1_ZW1-cFc

(iv)cIL4R-IL13Rα2_ZW1-cFc

6.PerkinEnvision

方法：

1.组织培养板每孔接种1x10⁵个DH82细胞(40μL，密度为2.5x10⁵个细胞/mL)，37℃培养2小时。

2.将cFc融合蛋白预稀释至2000nM(孔中终浓度为500nM)，然后在Hank平衡盐溶液(HBSS)中连续稀释3倍。通过将20μL/孔转移到含有DH82细胞的组织培养板上的相应位置来添加蛋白。

3.(a)将犬IL-4在HBSS中稀释至10ng/mL(孔中为2.5ng/mL)，并向板的每个孔中添加20μL。将板在37℃下孵育15分钟；或者替代地

(b)将犬IL-13在HBSS中稀释至20ng/mL(孔中为5ng/mL)，并向板的每个孔中添加20μL。将板在37℃下孵育15分钟。

4.将板从培养箱中取出，并将来自p-STAT-6测定试剂盒的20μL4X裂解缓冲液添加到板的每个孔中。将板在板摇床上以350rpm在室温下搅拌10分钟。

5.受体混合物由p-STAT6测定试剂盒制备，并将每孔15μL添加到96孔1/2面积板中的30μL细胞裂解液中。将板密封，以350rpm搅拌2分钟，然后在室温下孵育1小时。

6.供体混合物是在实验室弱光下用p-STAT6测定试剂盒制备的，并向每个板中每孔添加15μL。将板密封，用箔覆盖，以350rpm搅拌2分钟，然后在室温下孵育1小时。

7.使用PerkinEnVison上的AlphaScreen设置读取板。

结果：

(a)下表5A中提供了DH82中cIL4Rα-cFc、cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc和cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc抑制cIL-4介导的STAT6磷酸化的IC50。可以看出，同二聚体cIL-4Rα-cFc和异二聚体双特异性cIL-4Rα-IL-13Rα1_ZW1-cFc分别在约80pM和约50pM的浓度下抑制50％的IL-4介导的STAT6磷酸化，而cIL-4Rα-IL-13Rα2_ZW1-cFc在比cIL4Rα-cFc或cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc高3个数量级以上的浓度(即约0.2μM)抑制50％的cIL-4介导的STAT6磷酸化。有趣的是，与异二聚体cIL-4Rα-IL13R2α构建体直接相反，异二聚体cIL-4Rα-IL13R1α构建体与cIL-4的结合即使不是比同二聚体cIL-4Rα-cFc更紧密，至少也是一样好(参见表4)，并且该关系与表5A中的IC₅₀数据一致。

(b)下表5B提供了DH82细胞中cIL13Rα1-cFc、cIL13Rα2-cFc、cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc和cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc抑制cIL-13介导的STAT6磷酸化的IC50。可以看出，cIL-13Rα2-cFc在约165pM的浓度下抑制50％的cIL-13介导的STAT6磷酸化，而cIL13Rα1-cFc、cIL4Rα-IL13Rα1_ZW1-cFc和cIL4Rα-IL13Rα2_ZW1-cFc均于远高于纳摩尔浓度抑制50％cIL-13介导的STAT6磷酸化。因此，虽然抑制50％cIL-13介导的STAT6磷酸化的cIL-4Rα-IL-13Rα1_ZW1-cFc浓度比cIL-13Rα1-cFc低6倍，但仍比cIL-13Rα2-cIL高约20倍，而抑制50％cIL-13介导的STAT6磷酸化的cIL-4Rα-IL-13Rα2_ZW1-cFc浓度比cIL-13Rα2-cFc的浓度高约200倍。因此，令人惊讶的是，未修饰的cIL-13Rα2-cFc同二聚体不仅比cIL-4Rα-IL-13Rα2_ZW1-cFc更紧密地结合cIL-13(参见上表4)，而且它也始终如一地以低于cIL-4Rα-IL-13Rα2_ZW1-cFc的浓度抑制cIL-13介导的STAT6磷酸化(参见下表5B)。

表5A

IL-4 IC₅₀

表5B

IL-13 IC₅₀

cFc融合蛋白	IL-13 IC₅₀(nM)
		cIL-13Rα1-cFc	18.44
cIL-13Rα2-cFc	0.165
		cIL-4Rα-IL-13Rα1_ZW1-cFc	3.025
cIL-4Rα-IL-13Rα2_ZW1-cFc	29.45

下面的表6总结了将各种结合配偶体的解离常数与其各自的IC50相关联所获得的结果。可以看出，最佳细胞因子陷阱是cIL-4Rα-cFc同二聚体和cIL-13Rα2-cFc同二聚体。

表6

总结表

cFc融合蛋白	形式	IL-4(KD)	IL-4(IC₅₀)	IL-13(KD)	IL-13(IC₅₀)
						cIL-4Rα-cFc	同二聚体	1x10^-12M	8x10^-11M
cIL-4Rα-IL-13Rα1	异二聚体	1x10^-8M	5x10^-11M	4x10^-10M	3x10^-9M
						cIL-4Rα-IL-13Rα2	异二聚体	ND	2x10^-7M	4x10^-9M	3x10^-8M
cIL-13Rα1-cFc	同二聚体			5x10^-9M	2x10^-8M
						cIL-13Rα2-cFc	同二聚体			7x10^-13M	2x10^-10M

ND＝未检测到结合

实施例6

现有技术犬源化IL-31的抗体

可用于本发明的抗体是U.S.9,206,253B2和U.S.10,150,810B2中描述的抗体。优选地，这些抗体具有以下轻链和重链序列：

来自小鼠抗体克隆M14和犬IgG-B的犬源化重链序列：

[SEQ ID NO:14]现有技术

EVQLVESGPSLVKPGGSLRLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGITDYNPSLKSRITISRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGNYGYAMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK

来自小鼠抗体克隆M14的犬源化轻链序列和犬轻链恒定区：[SEQ ID NO:15]现有技术DIVMTQSPASLSVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFGGSGSGTDFTLTIDPVQADDVATYYCQQSYEDPWTFGGGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD

Z-HC:犬源化重链序列:[SEQ ID NO:16]现有技术

EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLQWVATISYGGSYTYYPDNIKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRGYGYDTMDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG

Z-LC:犬源化轻链序列:[SEQ ID NO:17]现有技术

EIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCKASQSVSFAGTGLMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLEAGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLEPEDVAVYYCQQSREYPWTFGQGTKLEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSEC

表7

现有技术IL-31抗体序列

实施例7

IL-31Rα的犬源化抗体

抗犬IL-31Rα的大鼠单克隆抗体：

通过用犬IL-31Rα的胞外结构域(ECD)(每次使用25μg抗原/动物)在3至4周内多次免疫大鼠来产生针对犬IL-31Rα的单克隆抗体。免疫后，从每只动物收集血清并通过ELISA测试犬IL-31RαECD。将具有最高IL-31RαECD反应性的动物的淋巴结细胞与骨髓瘤SP2/0细胞系融合以产生杂交瘤。融合后大约10天，使用下述方案通过ELISA在IL-31RαECD蛋白包被的板上筛选来自生长的杂交瘤的上清液。选择三种大鼠单克隆抗体进行犬源化：44E3、10A12和28F12。这些犬源化抗体与犬IL-31Rα紧密结合。

ELISA的程序：

1.用IL-31Rα(PBS缓冲液中1μg/mL)包被96孔半区板，25μL/孔。将板在4℃下孵育过夜。

2.用PBST(PBS+0.05％ Tween 20)洗板3次

3.用封闭缓冲液(含5％ FBS的PBS)，25ul/孔，室温封闭板30分钟。

4.将25ul/孔杂交瘤上清液转移至96孔板中，室温孵育60分钟。

5.用PBST洗板3次。

6.将25ul/孔抗大鼠IgG-HRP缀合物(在封闭缓冲液中1:4000稀释)添加到板中，并在室温下孵育60分钟。

7.用PBST清洗板5次。

8.将基于TMB的试剂添加到板中进行比色反应20-30分钟。

9.用0.16M硫酸终止反应。

10.用酶标仪读取酶标板。

使用这个程序，鉴定了几种分泌与犬IL-31Rα反应的抗体的杂交瘤。

犬源化抗体的产生以及犬源化抗体与犬IL-31Rα的结合：

测定了与犬IL-31Rα反应的选定大鼠抗体的HC和LC的核苷酸和推导的氨基酸序列。还确定了代表每种抗体的3个HC CDR和3个LC CDR的氨基酸序列。这些CDR用于开发结合犬IL-31RαECD的犬源化抗体。通过ELISA测定犬源化抗体与IL-31Rα的结合如下：

材料：

1.抗狗IgG(cFc特异性)-过氧化物酶(Sigma-Aldrich SAB3700109-1.5MG)

2.TMB-ELISA底物(Thermo-Fisher Cat#34028)

3.PBS pH7.4(Thermo-Fisher目录号10010001)

4.含Tween 20的Tris缓冲盐水(TBST)(Sigma-Aldrich T9039-10PAK)

方法：

1.用PBS缓冲液中的cIL-31Rα以1μg/mL、100μL/孔包被免疫板。将板在37℃下孵育1-2小时或在4℃下孵育过夜。

2.用TBST缓冲液洗板3次。

3.用封闭缓冲液(TBST中的0.5％ BSA)在室温下封闭板45-60分钟。

4.在稀释板中用封闭缓冲液将抗cIL31-Rα抗体稀释3倍，并将稀释后的抗体转移至cIL-31Rα包被板中，室温孵育45-60分钟。

5.TBST洗板3次。

6.将1:2000稀释的HRP缀合的抗狗IgG Fc添加到板中，室温孵育45-60分钟。

7.用TBST洗板3次。

8.将TMB-ELISA底物加入板中进行比色反应10至15分钟。

9.用1M H3PO4终止反应。

10.用酶标仪在450nM处读取酶标板。

结果：

图1显示了通过ELISA评估的相关嵌合和犬源化抗犬IL-31Rα抗体的结合活性。在ELISA中评估了大鼠抗体44E2的不同设计。ELISA结果表明，虽然所有犬源化抗体以与嵌合44E2抗体的EC50相似的EC50结合犬IL-31Rα，但c44E2 H5k1以与相应嵌合44E2抗体的EC50最相似的EC50结合犬IL-31Rα。

图2显示了通过ELISA评估的相关嵌合和犬源化抗犬IL-31Rα抗体的结合活性。在ELISA中评估了大鼠抗体10A12的不同设计。ELISA结果表明，一种犬源化抗体(c10A12H2L6)与犬IL-31Rα结合的EC50甚至低于相应的嵌合10A12抗体的EC50。

图3描述了通过ELISA评估的相关嵌合和犬源化抗犬IL-31Rα抗体的结合活性。在ELISA中评估了大鼠抗体28F12的不同设计。ELISA结果表明，犬源化抗体以比嵌合28F12抗体的EC50更低的EC50结合犬IL-31Rα。

以下是本发明使用的嵌合(大鼠-犬)抗体和犬源化抗体的氨基酸序列的实例。代表CDR的氨基酸有下划线。

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表8

IL-31R抗体序列

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表9

IL-13和IL-4受体α蛋白的ECD的现有技术序列

ECD	SEQ ID NO:
		cIL-4Rα	48
cIL-13Rα1	49
		cIL-13Rα2	50

本发明的范围不限于本文描述的具体实施方式。事实上，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说根据前面的描述将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种组合物，其包含含有犬白介素-4受体α-犬片段可结晶区融合蛋白对(cIL-4Rα-cFc融合蛋白)的同二聚体和含有犬白介素-13受体α2-犬片段可结晶区融合蛋白对(cIL-13Rα2-cFc融合蛋白)的同二聚体；

其中所述cIL-4Rα-cFc融合蛋白对中的每一个包含结合犬白介素-4(cIL-4)的犬白介素-4受体α(cIL-4Rα)的胞外结构域(ECD)或其片段，和第一犬片段可结晶区(cFc)；和

其中所述cIL-13Rα1-cFc融合蛋白对中的每一个包含结合犬白介素-13(cIL-13)的犬白介素-13受体α2(cIL-13Rα2)的胞外结构域(ECD)或其片段，和第二cFc；

其中所述第一cFc和所述第二cFc是相同的或不同的。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一cFc和所述第二cFc各自包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:51。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述cIL-4Rα-cFc融合蛋白对中的每一个还包含第一犬铰链区；其中所述第一犬铰链区作为所述cIL-4Rα的ECD与所述第一cFc之间的接头；和

其中所述cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对中的每一个还包含第二犬铰链区；其中所述第二犬铰链区作为cIL-13Rα2的ECD与所述第二cFc之间的接头；其中所述第一犬铰链区和所述第二犬铰链区是相同的或不同的。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述第一犬铰链区和所述第二犬铰链区各自包含与选自以下的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列：SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述cIL-4Rα的ECD包含与SEQ IDNO:48的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述cIL-13Rα2的ECD与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％或100％同一性。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的组合物，其中所述第一犬铰链区作为所述cIL-4Rα的ECD与所述第一cFc之间的唯一接头；并且其中所述cIL-4Rα的ECD与所述第一cFc之间的唯一接头包含与犬中天然发现的蛋白中的氨基酸序列相同的氨基酸序列，所述天然发现的蛋白包括其天然存在的变体。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的组合物，其中所述第二犬铰链区作为所述cIL-13Rα2的ECD与所述第二cFc之间的唯一接头；并且其中所述cIL-13Rα2的ECD与所述第二cFc之间的唯一接头包含犬中天然发现的蛋白中的氨基酸序列，所述天然发现的蛋白包括其天然存在的变体。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述cIL-4Rα-cFc融合蛋白对中的每一个仅由与犬中天然发现的蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列组成，所述天然发现的蛋白包括其天然存在的变体。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对中的每一个仅由与犬中天然发现的蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列组成，所述天然发现的蛋白包括其天然存在的变体。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述cIL-4Rα-cFc融合蛋白对中的每一个包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述cIL-4Rα-cFc融合蛋白对中的每一个包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对中的每一个包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述cIL-13Rα2-cFc融合蛋白对中的每一个包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其还包含犬抗瘙痒抗体或犬源化抗瘙痒抗体。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述犬抗瘙痒抗体或犬源化抗瘙痒抗体选自如下：抗犬白介素-31(cIL-31)的犬源化抗体、抗cIL-31的犬抗体、抗犬白介素-31R(cIL-31R)的犬源化抗体、和抗cIL-31R的犬抗体。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述抗cIL-31的犬源化抗体包含：

(i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链，或

(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链。

18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述抗cIL-31R的犬源化抗体选自以下：

(i)包含选自SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链，和包含选自SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30，和SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链；

(ii)包含选自SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，和包含选自SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链；和

(iii)包含选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链，和包含选自SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种选自以下的另外的组分：Janus激酶(JAK)抑制剂、脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂、或TH2细胞上表达的趋化受体同源分子的拮抗剂。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述JAK抑制剂选自以下：

其中R¹是任选地被羟基取代的C_1-4烷基，及其药学上可接受的盐，

及其药学上可接受的盐，和

及其药学上可接受的盐。

21.一种治疗特应性皮炎的方法，其包括向患有特应性皮炎的犬施用权利要求1-20中任一项所述的组合物。