CN117980011A - 用于制备(表皮)真皮等同物或皮肤等同物的双层基底 - Google Patents

用于制备(表皮)真皮等同物或皮肤等同物的双层基底 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于在双层基底上生产真皮或皮肤或表皮等同物的方法，该双层基底包括通过静电纺丝包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层，以及通过静电书写包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层。本申请还涉及通过所述方法能够获得的皮肤或真皮或表皮等同物，真皮等同物或皮肤等同物或表皮等同物用于筛选化合物的用途，以及最后其在伤口敷料或皮肤移植中的用途。

Description

用于制备(表皮)真皮等同物或皮肤等同物的双层基底
技术领域
本发明涉及用于在双层基底上生产真皮或皮肤或表皮等同物的方法，该双层基底包括通过静电纺丝包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层，以及通过静电书写包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层。本申请还涉及通过所述方法能够获得的皮肤或真皮或表皮等同物，真皮等同物或皮肤等同物或表皮等同物用于筛选化合物的用途，以及最后其在伤口敷料或皮肤移植中的用途。
背景技术
静电纺丝(ES)是用于生产纤维的方法，其使用电力来设计带有聚合物溶液或熔融聚合物的纺线。这使得能够生产直径可低至50nm的纤维。然而，随机的沉积会导致形成非织造纤维网。静电书写(Electrowriting)是一种新兴的技术，其通过电纺纤维的受控沉积来使用聚合物，并使得能够在原位构建或组装复杂结构。
这些技术可用于生产用于组织工程，尤其用于重建皮肤组织的真皮部分和可选的皮下部分的多孔基底。
目前，点阵模型是用于获取新认识和评估研究最常用的体外模型。然而，由于高含水量，点阵模型表现出较差的细胞外基质新合成(neosynthesis)和较差的机械特性。
多孔基底具有的优势在于使细胞外基质新合成产生动态真皮隔室，并且还能够容纳多种细胞类型。然而，对于皮肤组织重建，孔隙率也是一个限制因素，因为真皮隔室必须被基质完全填充，以使得能够在顶部沉积表皮细胞，并进行令人满意的表皮重建，而不会使真皮中的角质细胞内陷。这通常通过添加高浓度的维生素C以刺激真皮成纤维细胞的基质新合成、通过选择分泌高细胞外基质含量的特定成纤维细胞和/或通过长时间生长真皮隔室以实现完全填充来实现。当使用来自老年供体和/或暴露于污染和/或病理的成纤维细胞时，这成为一个真正的问题，因为这些细胞产生较少的细胞外基质，使得难以填充真皮隔室，从而使得难以表皮重建。对于一些原材料评估研究来说，在真皮或皮肤等同物的重建中使用维生素C并不总是可取的，因为维生素C具有相对广谱的作用，并且可能会对所评估的分子产生干扰。
此外，传统的多孔基底因制造限制而具有较差的模仿皮肤纳米结构的能力。
单独的静电纺丝是能够制造多孔基底的方案，其中该多孔基底包括直径接近或类似于细胞外基质纤维的纤维。它们将有助于增强细胞粘附、生长和分化。然而，由于不受控制且较低的孔隙率，基底内部的细胞渗透是复杂且中度(mediocre)的。
发明内容
根据本发明的双层基底相对于已知基底具有许多优点：
-厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层是阻止细胞通过的界面，这使得能够独立于真皮基质的组成和数量来重建表皮(即，可以在空的或几乎空的真皮隔室上重建)。这可以阻止角质细胞内陷，同时允许营养物质和蛋白质通过，以及真皮和表皮之间的沟通。
-厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层是非常多孔的，因此能够进行细胞外基质的新合成和重塑。其设计影响细胞行为、细胞外基质组成和组织化，以及基底的机械特性。
已经产生了各种双层基底，其中根据各种设计通过静电书写来印刷形成了最多孔的层。发明人观察到，在这些基底上能够进行表皮重建，并且能够表达主要的表皮标志物，而不依赖于真皮隔室填充和最多孔的层的设计。此外，发明人观察到基底的设计对细胞外基质含量和组织以及对维生素C的应答有影响。
这些基底还具有生物相容性和高度可定制的优点，为获取新认识、体外测试、敷料制备和移植的皮肤模型开辟了新途径。
因此，本发明涉及一种用于生产真皮等同物的方法，包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少200nm且孔隙率小于5μm的层(i)，
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层(ii)，
c.用真皮和/或皮下细胞接种层(ii)，
其中步骤a和步骤b按此顺序(a后接b)或相反顺序(b后接a)依次进行，且其中第二静电纺丝步骤沿着由第一静电纺丝步骤产生的层纵向进行。
本发明还涉及一种用于生产皮肤等同物的方法，包括上述用于生产真皮等同物的方法，且进一步包括在步骤c)和/或在步骤a)和b)之后，用表皮细胞接种层(i)。
本发明还涉及一种用于生产表皮等同物的方法，包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层(i)，
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层(ii)，
c.用表皮细胞接种层(i)，
其中步骤a和步骤b按此顺序(a后接b)或相反顺序(b后接a)依次进行，并且其中第二静电纺丝步骤沿着由第一静电纺丝步骤产生的层纵向进行。
本发明还涉及通过本发明的制备方法能够获得的真皮等同物和皮肤等同物或表皮等同物。
本发明还涉及基底用于形成皮肤等同物或真皮等同物或表皮等同物的用途，所述基底包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物而获得的厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层，
纵向叠加在
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物而获得的厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层上。
本发明还涉及本发明的真皮等同物或皮肤等同物或表皮等同物用于筛选化合物的用途，优选用于筛选能够对皮肤具有美容、皮肤病学或药物活性的化合物的用途，优选用于筛选局部施用在皮肤上或注射到皮肤后具有美容或皮肤病学活性的化合物的用途。
本发明的另一目的进一步涉及用于筛选具有活性的化合物，优选能够对皮肤具有美容、皮肤病学或药物活性的化合物，优选局部施用在皮肤上或注射到皮肤后具有美容或皮肤病学活性的化合物的方法，所述筛选方法包括将候选化合物施用在根据本发明的真皮等同物或根据本发明的皮肤等同物或根据本发明的表皮等同物上。
本发明还涉及根据本发明的真皮等同物、根据本发明的皮肤等同物或根据本发明的表皮等同物，它们用于伤口敷料或皮肤移植。
本发明的详细描述
用于生产真皮等同物的方法
本发明涉及一种用于生产真皮等同物的方法，包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合来形成厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层(i)，
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层(ii)，
c.用真皮和/或皮下细胞接种层(ii)，
其中步骤a和步骤b按此顺序(a后接b)或相反顺序(b后接a)依次进行，且其中第二静电纺丝步骤沿着由第一静电纺丝步骤产生的层纵向进行。
因此，该方法使得能够获得真皮等同物，该真皮等同物为包括真皮和/或皮下细胞的双层基底。该双层基底的示意图如图1所示，该类型基底的照片如图2所示。
在该方法的步骤a和步骤b之后，获得双层基底。在优选的实施方式中，双层基底是水平设置的基本平坦的基底。在该实施方式中，这些层堆叠在彼此的顶部。
可以首先形成层(i)，然后在其上形成层(ii)，或者相反地，首先形成层(ii)，然后在其上形成层(i)。
术语“静电纺丝(ES)”是指电流体动力喷涂技术，例如溶液或熔体静电纺丝、熔体或溶液静电书写，或熔喷(melt blowing)。该技术使得能够沉积聚合物纤维。
术语“静电书写(EW)”是指电流体动力喷涂技术，例如溶液或熔体静电纺丝、熔体或溶液静电书写，或熔喷(melt blowing)，其中纤维沿着特定轮廓沉积，能够形成预定的设计。作为设计的示例，可提及八边形、有机/波状或十边形(参见图3)。
这些技术能够形成包括孔的层(也称为多孔层)。术语“孔”表示不同宽度和深度的中空空间，可选地该空间是封闭的。
术语“孔隙率”是指元件尤其是通过层中包括的层来穿过层的能力。孔隙率在本文中由孔径限定，即形成孔的纤维之间测量出的最大距离。层的孔隙率可以用本领域技术人员熟知的技术来评估，例如扫描电子显微镜，特别是Crossbeam 340SEM，Zeiss，Oberkochen，Germany。
因此，“孔隙率小于或等于5μm的层”是指包括孔的层，并且其中形成每个孔的纤维之间测量出的最大距离小于或等于5μm。
类似地，“孔隙率大于或等于20μm的层”是指包括孔的层，并且其中每个孔的纤维之间测量出的最小距离大于或等于20μm。
优选地，接种在双层基底上的所有细胞来源于相同的人类或动物物种，尤其是来自哺乳动物家族的动物物种。接种的细胞可获自于健康供体或患有引起真皮和/或皮肤疾病的病症的供体。这些细胞可以用基因工程方法(例如转基因)进行修饰，尤其是为了监测基因的表达。可以生产各种真皮、皮肤或表皮等同物，以研究与各种因素，例如年龄、皮肤类型、种族、压力或污染相关的变化。
可选地，接种的细胞可获自于永生化细胞培养物，或获自于原代培养物，或获自于皮肤组织(无需预先培养)中分离出的原代细胞株，优选地所有接种的细胞类型获自于原代培养物。
术语“永生化细胞”是指获自于肿瘤的细胞、自发永生化细胞和/或通过引入至少一种病毒或细胞癌基因而永生化的细胞。在具体的实施方式中，接种在本发明基底上的一种或多种细胞类型获自于通过引入至少一种病毒或细胞癌基因而永生化的细胞的培养物。
术语“原代培养物”是指从个体的组织和/或细胞直接获得的细胞培养物。在替代性实施方式中，接种在本发明基底上的一种或多种细胞类型从取样于相同物种和相同年龄的个体的组织和/或细胞的原代培养物中获得，优选所有细胞类型均从取样于相同物种和相同年龄的个体的组织和/或细胞的原代培养物中获得。根据本发明的实施方式，一种或多种并且优选所有细胞类型均从成年个体获得。在这种情况下，本发明的真皮或皮肤等同物使得能够研究与年龄相关的变化或疾病发展在个体一生中对真皮或皮肤的影响。与从永生化细胞中获得的细胞不同，从原代培养物中获得的细胞保留接触抑制，因此使用这些细胞使得能够限制细胞在基底上的增殖。此外，使用原代培养物使得能够甚至更接近于体内条件。
术语“个体”是指人类或动物物种的受试者，特别是哺乳动物家族的动物物种的受试者。
在第一具体实施方式中，接种的细胞是疾病模型细胞类型。
在第二具体实施方式中，接种的细胞是来自患有疾病的个体的细胞，优选来自患有已经对皮肤有影响或疑似对皮肤有影响的疾病的个体。
术语“疾病模型细胞类型”是指来自动物或人类模型的细胞类型，这些模型再现自发发生的疾病或通过基因工程方法(例如转基因)或药理学工具诱导的疾病，以再现患有这些特定疾病的个体的细胞特征。举例来说，可提及从shFLG(短发夹型丝聚合蛋白)模型获得的细胞类型，其降低丝聚合蛋白表达，特别是如特应性皮炎的疾病模型。优选地，本发明的疾病是已经对皮肤有影响或疑似对皮肤有影响的疾病，例如湿疹、雀斑样痣、特应性皮炎、银屑病、日光性弹性组织增生症(solar elastosis)。
步骤a，形成层(i)
层(i)通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成，并且具有至少200nm的厚度和小于或等于5μm的孔隙率。
优选地，该层通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种熔融聚合物或一种溶液中的聚合物的组合物，更优选包含熔融聚合物的组合物来形成。
优选地，层(i)的孔隙率在0.4μm至5μm之间。这种低孔隙率防止细胞渗透，但能够使营养物质、生长因子、细胞因子、趋化因子等通过。
优选地，层(i)的厚度在200nm至20μm之间，更优选在5μm至10μm之间。这使得能够分离细胞，同时能够使它们交流，尤其是旁分泌交流(paracrine communication)。
优选地，通过静电纺丝层(i)形成的纤维具有50nm和5μm之间，更优选在100nm和500nm之间的直径。
层(i)可以是基本平坦的或包括凹凸(relief)。术语“凹凸”是指突起和/或凹陷。如果层包括凹凸，则凹凸的高度小于2mm，优选小于1.5mm。所述凹凸可以均匀地分布在层的表面上。
步骤b，形成层(ii)
层(ii)通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成，并且具有至少20μm的厚度和大于或等于20μm的孔隙率。
在实施方式中，该层通过静电书写(EW)包含至少一种熔融聚合物或一种在溶液中的聚合物，更优选包含熔融聚合物的组合物来形成。
术语“熔融聚合物”是指在环境温度下通常为固体并且通过升高温度而变成液体的聚合物。
术语“溶液中聚合物”是指聚合物溶解在溶剂中的组合物。
因此，例如在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合溶剂中制备的15％聚己内酯(PCL)溶液是包括溶液中聚合物的组合物，而预热到60℃以上，即高于PCL熔点的PCL颗粒形成熔融聚合物。
优选地，该层的厚度在20μm和5mm之间。该类型的厚度使得能够再现真皮和皮下隔室。
优选地，层(ii)的孔隙率在20μm和600μm之间。该孔隙率能够在不对细胞施加过度应力的情况下实现活细胞、细胞外基质新合成和组织化的3D整合。
优选地，通过层(ii)的静电纺丝形成的纤维具有在50nm和100μm之间，更具体地1μm和20μm之间的直径。该直径使得能够模拟在细胞外基质中体内观察到的纤维或原纤维或纤维束的直径。
层(ii)可以是基本平坦的或包括凹凸。术语“凹凸”是指突起和/或凹陷。如果该层包括凹凸，则凹凸的高度小于2mm，优选小于1.5mm。所述凹凸可以均匀地分布在层的表面上。
在第一实施方式中，该层的设计可以由基本上直线或弯曲的纤维或两者的混合物或两者的覆盖物来勾勒。因此，一些纤维可以叠加或悬挂在腔上(参见图3)。
在第二实施方式中，该层的设计可以通过混合或叠加不同的基本上直线的纤维来勾勒。术语“不同”指纤维的方向不同。因此，一些纤维可以叠加或悬挂在腔上。
在第三实施方式中，该层的设计可以通过混合或叠加的不同的曲线来勾勒。术语“不同”指纤维的方向和/或曲率不同。因此，一些纤维可以叠加或悬挂在腔上。
在本发明的优选实施方式中，层(ii)具有波状类型或八边形类型或十边形类型的设计。
用于形成层(i)和层(ii)的包含至少一种聚合物的组合物
用于形成层(i)和层(ii)的组合物的所述至少一种聚合物可以是合成的或天然的。用于形成层(i)和层(ii)的组合物的所述至少一种聚合物优选是可生物侵蚀的、可生物吸收的、生物相容的、可生物再吸收的和/或可生物降解的，优选是生物相容的和可生物再吸收的。
用于形成层(i)的包含至少一种聚合物的组合物与用于形成层(ii)的包含至少一种聚合物的组合物可相同或不同。类似地，用于形成层(i)的所述至少一种聚合物与用于形成层(ii)的组合物的至少一种聚合物可相同或不同。
合适的聚合物的示例包括但不限于聚(α-羟基酸)、聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PG)、聚乙二醇(PEG)、聚(α-羟基酸)的共轭物、聚(原酸酯)(POE)、聚阿司匹林(polyaspirins)、聚磷酸肌酸(polyphosphagens)、三乙基-2-乙酰柠檬酸酯、胶原蛋白、弹性蛋白型的肽、淀粉、预胶化的淀粉、壳聚糖、藻酸盐、白蛋白、纤维蛋白、丝蛋白(silk)、己内酯的均聚物或共聚物(优选聚己内酯、PLCL(聚(乳酸-共-己内酯)))、聚(2-乙基-2-噁嗪)(PEtOzi)、葡聚糖、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、PVA-g-PLGA、PEGT-PBT共聚物(多活性)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚丙烯酸(PEO-PPO-PAA)共聚物、PLGA-PEO-PLGA共聚物、PEG-PLG共聚物、PLA-PLGA共聚物、泊洛沙姆407、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物或它们的组合。
在各种实施方式中，组合物包括聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)，聚乳酸(PLA)，聚乙交酯(PGA)，D-乳酸、D,L-乳酸、L-乳酸、D,L乳酸-共-∈-己内酯、D,L-乳酸-共-乙交酯-共-∈-己内酯、L-乳酸-共-∈-己内酯的均聚物或共聚物，或聚(酯)酰胺或它们的混合物。
优选地，所述用于形成层(i)和(ii)的组合物的至少一种聚合物选自：
-天然聚合物，例如蛋白质和多肽、糖胺聚糖、蛋白聚糖，例如胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸、硫酸皮肤素、明胶或它们的混合物或复合物；
-合成聚合物，例如可生物降解的合成聚合物，例如聚乳酸、聚乙交酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(“PLGA”)、聚己内酯(“PCL”)、聚(二氧环己酮)、聚(碳酸三亚甲酯)共聚物、聚葡萄糖酸酯、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)、聚乙二醇、聚己内酯共聚物、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、衍生自酪氨酸的聚碳酸酯和任意无规或(多)嵌段共聚物，或它们的混合物；
-及它们的混合物。
聚乙二醇甲基醚(mPEG)可以用于聚合物中，以赋予其延展性。
在一些实施方式中，这些聚合物也可以施加在形成的纤维上，以提供预期的释放曲线。
步骤c，接种层(ii)
优选地，将真皮和/或皮下细胞接种在层(ii)的自由表面。然后接种的细胞能够在层(ii)内迁移。
术语“真皮和/或皮下细胞”是指真皮或皮下存在或过渡的细胞类型的细胞。其包括但不限于人类、动物或其他来源的任选的经遗传修饰的成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经元细胞、毛囊细胞、汗腺细胞、皮脂腺细胞、顶泌腺细胞(apocrine gland cell)、免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞等)、神经细胞、血管平滑肌细胞、特化肌细胞、干细胞或衍生干细胞(例如来自iPS和ES细胞的细胞)。在本申请中，干细胞应理解为不包括人胚胎干细胞。
在具体的实施方式中，接种的真皮和/或皮下细胞特别包括成纤维细胞，通常是真皮成纤维细胞，特别是人成纤维细胞，更具体地是原代人成纤维细胞。
在优选的实施方式中，基底中接种的成纤维细胞浓度在0和100000个细胞/mm3之间，更优选为1500至25000个细胞/mm3。
可以使用本领域技术人员熟知的任何合适的技术，并在适合真皮和/或皮下细胞，特别是成纤维细胞生长的培养条件下进行接种。
术语“细胞接种”是指受控或随机的手动或机器辅助(使用分配器或生物印刷)细胞沉积。
一旦接种，真皮和/或皮下细胞通常在合适的培养基中培养，优选为适用于成纤维细胞培养的培养基中培养，例如在FHN2D培养基中培养(对应于补充有2mM谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(含或不含抗坏血酸)的DMEM培养基)。真皮和/或皮下细胞可以浸没培养或气-液界面培养，优选在适合其生长的条件下培养，更具体地优选在37℃和5％CO2条件下培养。一旦接种，真皮和/或皮下细胞可以培养长达6个月，优选5至40天。
用于生产皮肤等同物的方法
层(i)的自由表面可以接种表皮细胞。层(i)和层(ii)的细胞接种可以同时进行，或者一个接一个地进行。
因此，本发明涉及用于生产皮肤等同物的方法，包括本发明的生产真皮等同物的方法，并且进一步包括在步骤c之后和/或在步骤a和步骤b两个步骤之后，用表皮细胞接种层(i)。
术语“表皮细胞”是指表皮中存在或过渡的细胞类型的细胞。这包括角质细胞、神经元细胞、黑素细胞、默克尔细胞、干细胞或衍生干细胞(例如来自iPS和ES细胞的细胞)和免疫活性细胞(例如朗格汉斯细胞)。
术语“细胞接种”是指受控或随机的手动或机器辅助(使用分配器或生物印刷)细胞沉积。
在实施方式中，接种的表皮细胞是角质细胞类型，可选具有黑素细胞。优选地，角质细胞和黑素细胞分别培养，然后接种到基底中或基底上。
在使用角质细胞的具体实施方式中，层(i)通过纤维中和/或纤维上的生物活性剂可进一步包括胶原蛋白4或胶原蛋白7。有利地，层(i)上胶原蛋白的厚度不超过10μm。
表皮细胞优选接种在层(i)的自由表面。
在优选的实施方式中，基底上接种的角质细胞浓度在0和2000000个细胞/cm2之间，更优选在150000和400000个细胞/cm2之间。
一旦接种，表皮细胞通常在合适的培养基中培养，优选在适用于培养角质细胞的培养基中培养，例如在含或不含抗坏血酸的G7F扩增培养基和G3F分化培养基(Black等(2005)Tissue Eng.11.723-733)中培养。表皮细胞可以在37℃和5％CO2条件下浸没培养或在气-液界面培养长达6个月，优选5至40天。
在优选0至7天、甚至更优选3至7天的孵育期之后，优选将皮肤等同物例如通过升高插件保持在金属网格的气/液界面，或保持在本领域技术人员已知的能够实现气/液界面的任意其他细胞培养装置。
然后继续孵育，优选直到获得显示皮肤特征的皮肤等同物，即显示四种标准类型的细胞层(即基底层和基底上层、颗粒层和角质层)的表皮等同物覆盖的真皮等同物。在这种情况下，孵育优选持续7至21天，甚至更优选7至14天。
天然或合成化合物可以添加到层(i)的游离或细胞接种的表皮表面上。这些化合物例如是防水化合物(例如合成聚合物，如硅树脂等)、UV过滤剂(UV filters)、杀菌剂(如Mir et al.，Biomatériaux polymères synthétiques pour la cicatrisation：unerevue，Progress in Biomaterials(2018)、Bibliardi et al.，Pansements Bioactifs，Rev.Med.Suisse，2010或Tenehaus et al.，Agents topiques et pansements pour lessoins locaux des 2021中所描述的)或纤维素，单独或混合使用。
用于生产表皮等同物的方法
本发明还涉及用于生产表皮等同物的方法，包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层(i)，
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层(ii)，
c.用表皮细胞接种层(i)，
其中步骤a和步骤b按此顺序(a后接b)或相反顺序(b后接a)依次进行，且其中第二静电纺丝步骤沿着由第一静电纺丝步骤产生的层纵向进行。
术语“表皮细胞”是指表皮中存在或过渡的细胞类型的细胞。这包括角质细胞、神经元细胞、黑素细胞、默克尔细胞、干细胞或衍生干细胞(例如来自iPS和ES细胞的细胞)和免疫活性细胞(例如朗格汉斯细胞)。
术语“细胞接种”是指受控或随机的手动或机器辅助(使用分配器或生物印刷)细胞沉积。
在实施方式中，接种的表皮细胞是角质细胞类型，可选具有黑素细胞。优选地，角质细胞和黑素细胞分别培养，然后接种到基底中或基底上。
在使用角质细胞的具体实施方式中，层(i)通过纤维中和/或纤维上的生物活性剂可进一步包括胶原蛋白4或胶原蛋白7。有利地，层(i)上胶原蛋白的厚度不超过10μm。
表皮细胞优选接种在层(i)的自由表面。
在优选的实施方式中，基底上接种的角质细胞浓度在0和2000000个细胞/cm2之间，更优选为150000和400000个细胞/cm2之间。
一旦接种，表皮细胞通常在合适的培养基中培养，优选在适用于培养角质细胞的培养基中培养，例如在含或不含抗坏血酸的G7F扩增培养基和G3F分化培养基(Black等(2005)Tissue Eng.11.723-733)中培养。表皮细胞可以在37℃和5％CO2条件下浸没培养或在气-液界面培养长达6个月，优选5至40天。
在优选0至7天、甚至更优选3至7天的孵育期之后，优选将皮肤等同物例如升高插件保持在金属网格的气/液界面，或保持在本领域技术人员已知的能够实现气/液界面的任意其他细胞培养装置中。
然后继续孵育，优选直到获得显示预期特征的表皮等同物，即具有四种标准类型细胞层(即基底层、基底上层、颗粒层和角质层)的表皮等同物。在这种情况下，孵育优选持续7至21天，甚至更优选7至14天。
可选地，该方法可以包括在步骤c之前的额外步骤，该步骤包括用一种或多种生物活性剂可选地以模拟真皮基质的水凝胶形式来填充或涂覆层(ii)。
在优选的实施方式中，在步骤c之前，用乙醇处理层(i)。
此外，天然或合成化合物可以添加到层(i)的游离或细胞接种的表皮表面上。这些化合物例如是防水化合物(例如合成聚合物，如硅树脂等)、UV过滤剂(UV filters)、杀菌剂(如Mir et al.，Biomatériaux polymères synthétiques pour la cicatrisation：unerevue，Progress in Biomaterials(2018)、Bibliardi et al.，Pansements Bioactifs，Rev.Med.Suisse，2010或Tenehaus et al.，Agents topiques et pansements pour lessoins locaux des 2021中所描述的)或纤维素，单独或混合使用。
对层(i)和(ii)的补充
在本发明的方法的一些实施方式中，层(i)和/或层(ii)在纤维中和/或纤维上可进一步包括一种或多种生物活性剂。生物活性剂或生物活性化合物在本文中是指修饰、抑制、激活或影响生物或化学事件的化合物或实体。例如，生物活性剂可包括但不限于：蛋白质或肽(优选为皮肤的蛋白质或肽)；抗生素；抗病毒物质；酶抑制剂；激素；细胞-细胞外基质相互作用调节剂，包括细胞生长抑制剂和抗粘附分子；血管舒张剂；DNA；RNA或蛋白质合成抑制剂；抗炎剂；抗血管生成因子；血管生成因子；抗分泌因子；抗凝血剂和/或抗血栓形成剂；前列腺素。优选地，生物活性剂不同于形成用于形成层(i)和层(ii)的组合物的聚合物。例如，生物活性剂可以是胶原蛋白，明胶，肽，乙醇，生长因子，多聚赖氨酸，可选地经硫醇化的RGD肽，可选地经硫醇化的GRGDS肽(SEQ ID NO:1)，以及Yamada(1991)J.Biol.Chem.266:12809-128012中描述的蛋白质和肽，例如纤连蛋白或衍生自纤连蛋白的肽(如I和II肽)，层粘连蛋白或衍生自层粘连蛋白的肽，如肽YIGSR(SEQ ID NO:2)、PDSGR(SEQ ID NO:3)、F9、LGTIPG(SEQ ID NO:4)、p20或PA22-2、玻连蛋白、纤维蛋白原、血管性假血友病因子、巢蛋白、环子孢子蛋白、凝血酶敏感蛋白或淀粉样蛋白P组分及它们的混合物。在一些实施方式中，生物活性剂可包括营养素，例如一种或多种维生素，如抗坏血酸、锌、钙或它们的组合。
胶原蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白或纤维蛋白的存在通常促进细胞，特别是角质细胞和成纤维细胞的粘附。
在涉及成纤维细胞的具体实施方式中，使用的胶原蛋白是胶原蛋白1。
在涉及角质细胞的具体实施方式中，使用的胶原蛋白是胶原蛋白4或胶原蛋白7。
在实施方式中，生物活性剂可以是细胞生长促进剂，例如糖或其组合。
在一些实施方式中，生物活性剂是医药产品。
生物活性剂进一步包括RNA，例如siRNA或shRNA。在一些实施方式中，生物活性剂是生长因子、细胞因子、细胞外基质分子或其片段或衍生物，例如细胞结合位点，如RGD或GRGDS序列。
纤维中和/或纤维上的生物活性剂可以用本领域技术人员已知的不同技术沉积在纤维上，例如：
-浸渍，任选地然后沥干或干燥，
-喷涂或雾化，
-注射，特别是使用移液器。
因此，在本发明的方法中，在步骤a和步骤b之后，可用可选地为模拟真皮-表皮连接处基质的水凝胶形式的一种或多种生物活性剂填充或涂覆层(i)，和/或可用可选地为模拟真皮基质的水凝胶形式的一种或多种生物活性剂填充或涂覆层(ii)。如果进行这些步骤，则优选在用细胞接种所述层之前进行。
术语“填充”是指层的至少50％的空体积被所述活性剂填充，优选至少70％的空体积被填充，并且更优选至少90％的空体积被填充。填充技术尤其包括浸入在包含所述生物活性剂的浴中，将生物活性剂注射或沉积到所述层上。
术语“涂覆”或“覆盖”本文中是指生物活性剂沉积在形成层的纤维表面上。该层的空的空间没有被所述生物活性剂填充。用于沉积生物活性剂并因此用于涂覆或覆盖层的方法包括例如浸入在包含生物活性剂的溶液中，随后进行干燥或沥干步骤。
术语“水凝胶”是指其中溶胀剂是水的凝胶。水凝胶的基质通常是聚合物网络。
这种水凝胶可包括例如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白型肽、琼脂、藻酸盐、脱细胞的真皮细胞外基质及它们的混合物。
举例来说，胶原蛋白4或7或串珠蛋白聚糖(糖胺聚糖)用于模拟真皮-表皮连接处的基质，胶原蛋白1、透明质酸、透明质酸(丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯)、弹性蛋白样肽(丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯)、明胶(甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯)及它们的混合物用于模拟真皮基质。
在本发明的方法的一些实施方式中，层(i)和/或层(ii)可以用任意化合物或处理进行处理和/或修饰以增加细胞粘附，其中所述任意化合物或处理能够使人、动物或其他来源的皮肤中存在或过渡的可选的经遗传修饰的所有细胞类型(例如成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经元细胞、毛囊细胞、汗腺细胞(sweat gland cell)、皮脂腺细胞、顶泌腺细胞、汗腺细胞(sudoral cell)、免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞等)、神经细胞、血管平滑肌细胞、特化肌肉细胞、干细胞或衍生干细胞(如来自iPS细胞和ES细胞的细胞)的细胞粘附、生长、分化、增殖、迁移(例如成纤维细胞、黑素细胞或角质细胞或其他皮肤细胞的化学引诱物)。这些处理包括例如NaOH处理、乙醇处理、层形成后的等离子体处理或层形成期间的串晶结构(shish kebabstructure)。
在一些实施方式中，层(i)和/或层(ii)的纤维可以被化学修饰，例如用甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯、丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺修饰，从而可以在纤维形成之后或期间通过共价键交联。
通过本发明的方法可获得的等同物
本发明还涉及通过本发明的方法能够获得的真皮等同物。
本发明还涉及通过本发明的方法能够获得的皮肤等同物。
本发明还涉及通过本发明的方法能够获得的表皮等同物。
双层基底
双层基底可以适配到插件(insert)、舱(nacelle)、带有或不带有适配器的悬挂系统，以布置在相关的平台(适于插件的培养板(或使用适配器或支撑元件))上，或者放置在任意类型的装置(脱脂棉、带腿的网格等)上，或者如果悬挂系统具有腿或提升系统来实现气-液界面，则还可放置在培养皿中。商业实例有：来自Sigma的CellCrownTM、来自Corning的SnapWellTM、来自Costar的NetWellTM或TransWellTM，与NuncTM插件一起使用的支撑板，或带有O形环的EPISKIN插件(EPISKIN插件：Episkin舱+O形环(专利FR688226A)，参见图4)。然后，液体优选由合适的培养基组成。
然后继续孵育，优选直到获得真皮等同物、皮肤等同物或表皮等同物，并且优选直到等同物具有所预期的特征。例如，对于皮肤等同物，则继续孵育，优选直到获得显示皮肤特征的等同物，即显示四种标准类型细胞层(即基底层和基底上层、颗粒层和角质层)的表皮等同物覆盖的真皮等同物。
在这种情况下，孵育优选持续7至21天，甚至更优选7至14天。
本发明的用途
本发明涉及基底在形成皮肤等同物或真皮等同物或表皮等同物的用途，所述基底包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层，
纵向叠加在
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层上。
当然，所述用途为体外用途。
厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层可以通过静电书写(EW)包含至少一种熔融聚合物或至少一种溶液中聚合物的组合物来形成，优选组合物包括至少一种熔融聚合物。
本发明还涉及本发明的真皮等同物或本发明的皮肤等同物或本发明的表皮等同物分别用于获取关于真皮或皮肤或表皮的新认识的用途。事实上，这些等同物可以用作模型，来研究这些组织的生物学，例如与皮肤老化、紫外线辐射的影响、环境影响(例如干燥或污染)有关的生物学，或者研究疾病。
本发明还涉及本发明的真皮等同物或本发明的皮肤等同物或本发明的表皮等同物在筛选化合物中的用途，优选在筛选能够对皮肤具有美容、皮肤病学(dermatological)或药学活性的化合物中的用途，优选筛选局部施用在皮肤上或注射到皮肤后具有美容或皮肤病学活性的化合物中的用途。
术语“能够对皮肤具有美容、皮肤病学或药物活性的化合物”是指已知对皮肤具有美容、皮肤病学或药学活性或疑似具有这种活性的化合物。
本发明进一步涉及用于筛选具有活性的化合物的方法，优选用于筛选能够对皮肤具有美容、皮肤病学或药学活性的化合物的方法，优选用于筛选局部施用在皮肤上或注射到皮肤中后具有美容或皮肤病学活性的化合物的方法，所述筛选方法包括将候选化合物施用到本发明的真皮等同物或本发明的皮肤等同物或本发明的表皮等同物上。当然，所述筛选方法是体外方法。
本发明还涉及用于伤口敷料或皮肤移植的本发明的真皮等同物或本发明的皮肤等同物或本发明的表皮等同物。
术语“伤口”是指皮肤被擦伤、割伤、撕裂、烧伤或损伤造成的伤害。
皮肤移植特别用于烧伤、疾病(例如糖尿病)、整形和美容手术的情况。
例如，在伤口敷料中使用本发明的表皮等同物的情况下，层(ii)形成有利于被处理者的成纤维细胞的区域。因此，被处理者的成纤维细胞将能够在该部分的等同物中迁移和增殖，以在伤口处重建健康的皮肤。此外，表皮等同物的层(ii)可包括生物活性剂或经过处理来促进成纤维细胞迁移和粘附的试剂。
类似地，在伤口敷料中使用本发明的真皮等同物的情况下，层(i)形成有利于被处理者的角质细胞的区域。因此，被处理者的角质细胞将能够在层(i)中迁移、增殖和定殖，以在伤口处重建健康的皮肤。此外，真皮等同物的层(i)可包括生物活性剂或经过处理来促进角质细胞迁移和/或增殖的试剂。
本发明还涉及处理方法，包括施用本发明的真皮等同物或本发明的皮肤等同物或本发明的表皮等同物。优选地，本发明涉及一种用于处理伤口的方法，包括向有需要的个体施用本发明的真皮等同物或本发明的皮肤等同物或本发明的表皮等同物。
在下面的实施例中将更详细地描述本发明。
附图说明
[图1]图1示出了用于生产真皮等同物的双层基底的横截面示意图，其中示意图中的1代表层(i)，2代表层(ii)。
[图2]图2示出了用于生产真皮等同物的双层基底的图像(条形代表20μm)。前景示出了层(ii)的纤维的部分，背景示出了孔较少的层(i)。
[图3]图3示出了通过静电书写创建并由发明人测试的不同类型的设计。比例尺为100μm。该图中从左至右示出了纤维直径为8.7±0.48μm的八边形设计、纤维直径为11.71±0.38μm的波状设计、纤维直径为12.38±1.18μm的十边形设计和纤维直径≈14.5μm的波状设计。
[图4]图4示出了使用O形环安装在Episkin插件上的双层基底。
具体实施方式
实施例：
发明人获得了全厚度体外皮肤模型，其具有：
-不同设计的层(ii)(符合八边形和十边形设计的直纤维，以及波状纤维)；
-不同孔隙率分布：
层(i)：0.01μm2和0.3μm2之间，
直八边形熔体静电书写(MEW)的层(ii)：10μm2和500μm2之间，
波状MEW的层(ii)：20μm2和1000μm2之间；
-不同的接种细胞浓度(成纤维细胞：58000至1000000个细胞/cm2，角质细胞：150000至400000个细胞/cm2)；
-不同的纤维涂层(用乙醇、纤连蛋白、聚-L-赖氨酸(PLL)涂覆)和等离子体处理；
-不同的纤维直径(对于层(ii)，测试9μm至14μm)，
-不同的培养时间(11、18、28和36天)。
在所有测试条件下，成纤维细胞和角质细胞能够结合并重建真皮(如果仅存在成纤维细胞)或完整的皮肤模型(如果存在成纤维细胞和角质细胞)。角质细胞形成具有所有层(基底层、棘层、颗粒层和角质层)的完全分化的表皮，并表达相关标志物(棘层和颗粒层的角蛋白10以及颗粒层和角质层的丝聚合蛋白)。
由于层(i)的存在，无论真皮部分的填充如何，发明人从未观察到真皮中角质细胞的任何内陷、渗透或迁移。角质细胞可以与成纤维细胞同时接种，这在表皮和真皮之间没有隔离膜的任何多孔基底中是不可能的。
根据该设计，发明人观察到了差异。事实上，细胞外基质新合成依赖于以下设计：
-弹性蛋白优先在具有直(且较少孔)纤维的设计中表达，
-胶原蛋白1含量似乎在具有直纤维的设计中有所增加。
一般来说，细胞外膜的组织与设计相关。
实施例1：具有第一波状设计的层(ii)的双层基底的形成
材料
聚己内酯(PURASORB PC，Corbion Inc.，Gorinchem，Netherlands)
Episkin插件：Episkin舱和O形环(在专利FR688226A中描述)
溶液静电纺丝注射器：Henke-Sass，Wolf GmbH；Tuttlingen，Germany
熔体静电书写注射器：Nordson EFD；Pforzheim，Germany
扫描电子显微镜，TM3030Plus，Hitachi；Tokyo，Japan
Crossbeam 340扫描电子显微镜，Zeiss；Oberkochen，Germany
熔体静电书写(MEW)印刷机(Pink)，定制；University of(Würzburg或Wuerzburg)，Germany
EMACE600溅射镀膜系统，Leica；Wetzlar，Germany
注射泵，World Precision Instruments；Sarasota，FL，USA
激光切割机，Rayjet；Plymouth，Michigan，USA
静电纺丝层(i)：
在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合溶剂(DCM：DMF比例为3：2)中制备15％重量的医用级聚己内酯(PCL)(Corbion，PC-12)溶液。密封玻璃瓶，并将溶液过夜搅拌。用所制备的溶液装载5ml注射器，并将该注射器连接至27G喷嘴。采用0.5ml/h的流速来进行聚合物纤维静电纺丝。在喷嘴和收集器之间施加18kV的电压差。喷嘴-收集器间距为14cm。将电纺纤维在安装于旋转收集器的玻璃条上收集30分钟。室温和湿度分别为20.8℃和43％。
然后将经纤维涂覆的玻璃条用作用于熔体静电纺丝层(ii)的基底。
静电书写层(ii)，波状设计：
将填充有PCL颗粒的注射器在75℃下预热至少24小时。为了印刷正弦网格，使用25G喷嘴，且喷嘴-收集器间距设定为3.75mm。使用略低于70℃的喷嘴温度，并施加6kV的电压差(喷嘴处+4.5kV，收集器处-1.5kV)来启动喷射。用于挤出聚合物的压力为1.5巴。总共沉积36层(每个方向12层；三个方向)，其中每一层相对于前一层以120°的角度沉积。正弦波的波长设定为2mm，振幅每三层在500μm和250μm之间交替变化。获得了约9μm至15μm，优选10μm的纤维直径，并且总支架高度为约400μm。
实施例2：具有第二波状设计的层(ii)的双层基底的形成
材料
聚己内酯(PURASORB PC，Corbion Inc.，Gorinchem，Netherlands)
Episkin插件：Episkin舱和O形环(在专利FR688226A中描述)
溶液静电纺丝注射器：Henke-Sass，Wolf GmbH；Tuttlingen，Germany
熔体静电书写注射器：Nordson EFD；Pforzheim，Germany
扫描电子显微镜，TM3030Plus，Hitachi；Tokyo，Japan
Crossbeam 340扫描电子显微镜，Zeiss；Oberkochen，Germany
熔体静电书写(MEW)印刷机(Pink)，定制；University of(Würzburg或Wuerzburg)，Germany
EMACE600溅射镀膜系统，Leica，Wetzlar，Germany
注射泵，World Precision Instruments；Sarasota，FL，USA
激光切割机，Rayjet；Plymouth，Michigan，USA
静电纺丝层(i)：
在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合溶剂(DCM：DMF比例为3：2)中制备15％重量的医用级聚己内酯(PCL)(Corbion，PC-12)溶液。密封玻璃瓶，并将溶液过夜搅拌。用所制备的溶液装载5ml注射器，并将该注射器连接至27G喷嘴。采用0.5ml/h的流速来进行聚合物纤维静电纺丝。在喷嘴和收集器之间施加18kV的电压差。喷嘴-收集器间距为14cm。将电纺纤维在安装于旋转收集器的玻璃条上收集30分钟。室温和湿度分别为20.8℃和43％。
然后将经纤维涂覆的玻璃条用作用于熔体静电纺丝层(ii)的基底。
静电书写层(ii)，波状设计：
将填充有PCL颗粒的注射器在80℃下预热至少24小时。为了印刷正弦网格，使用25G喷嘴，且喷嘴-收集器间的距离设定为3.6mm，收集器速度为180mm/min。使用略低于80℃的喷嘴温度，并施加6kV的电压差(喷嘴处+4.5kV，收集器处-1.5kV)来启动喷射。用于挤出聚合物的压力为2巴。总共沉积30层(每个方向15层；两个方向)，其中每一层相对于前一层以90°的角度沉积。获得了约13μm至15μm，优选14μm的纤维直径，并且总支架高度为约400μm。
实施例3：具有直线设计的层(ii)的双层基底的形成
静电纺丝层(i)：
在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合溶剂(DCM：DMF比例为3：2)中制备15％重量的医用级聚己内酯(PCL)(Corbion，PC-12)溶液。密封玻璃瓶，并将溶液过夜搅拌。用所制备的溶液装载5ml注射器，并将该注射器连接至27G喷嘴。采用0.5ml/h的流速来进行聚合物纤维静电纺丝。在喷嘴和收集器之间施加18kV的电压差。喷嘴-收集器间距为14cm。将电纺纤维在安装于旋转收集器的玻璃条上收集30分钟。室温和湿度分别为20.8℃和43％。
静电书写层(ii)十边形设计：
注射器用PCL颗粒填充，并在77℃下预热至少24小时。经装载的注射器装配22G喷嘴。向注射器施加1.5巴的气压，并施加6kV的电压差(喷嘴处+4.5kV，收集器处-1.5kV)以启动液体喷射。进行稳定化印刷，然后印刷十边形结构。十边形设计由印刷成网格的30层纤维组成，其中每一层都以相对于前一层72°(360/5)的旋转角度印刷/静电书写。每层使用150μm的纤维间距。所有印刷均使用3.6mm的喷嘴-收集器间距。获得了约8μm至13μm，优选10μm的纤维直径，并且生产的层的总高度为约400μm。
实施例4：获得具有直线设计的层(ii)的双层基底的真皮等同物
为了灭菌和增加细胞粘附，用乙醇处理双层基底。
为了能够在气-液界面处进行培养，根据以下定位将双层基底安装在带有O形环的培养插件上：层(i)在插件内部，层(ii)在底部。层(ii)具有八边形设计。
用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤双层基底。然后，将双层基底在成纤维细胞培养基(“FHN2D”：含2mM谷氨酰胺、抗生素和10％小牛血清的DMEM)中孵育。
成纤维细胞(NHF)是在患者知情同意后从整形手术获得的皮肤组织中分离出来的。它们在FHN2D培养基中扩增。
对NHF进行胰蛋白酶化(胰蛋白酶EDTA 0.05％)(37℃下4-6分钟)，计数并以190g离心5分钟来沉淀。
将沉淀重悬于成纤维细胞培养基(“FHN3D”：含2mM谷氨酰胺、抗生素和10％小牛血清以及1mM抗坏血酸的DMEM)中：最终NHF浓度为6000000NHF/ml FHN3D培养基。
将培养插件置于培养皿中，其中双层基底位于顶部(层(ii)位于顶部)。
对于NHF接种：将细胞溶液以100μL/插件(即600000NHF/cm2)的速率接种在层(ii)上的插件上，然后，为了使细胞粘附，将具有细胞的插件在37℃下孵育1小时。
对于真皮等同物的培养步骤，将插件悬浮在其中FHN3D培养基在顶部且双层基底在底部的6孔板中。
然后将插件在FHN3D培养基中于37℃、5％CO2下孵育11天。用光学显微镜和多光子显微镜观察获得的真皮等同物。发明人观察到成纤维细胞在组织学上(伊红、苏木精、藏红花)与呈特定梭形的这些细胞的粘附，以及细胞外基质(ECM)对基底的填充。多光子显微镜显示胶原蛋白1的组织化类似于人皮肤。
实施例5：获得具有波状设计的层(ii)的真皮等同物
在本实施例中，除了使用具有波状设计的层(ii)的双层基底之外，采用与实施例3相同的方案。
用光学显微镜和多光子显微镜观察获得的真皮等同物。
发明人观察到，在实施例4和实施例5的真皮等同物之间，成纤维细胞与特定梭形形状的这些梭形细胞在组织学上(伊红、苏木精和藏红花)显示的粘附以及细胞外基质(ECM)对基底的填充在实施例4中更均匀，这可能是由于实施例5中的不均匀孔隙率。此外，多光子显微镜显示了实施例4和5之间不同的胶原蛋白1纤维组织化。这些结果证明了设计的改变引起基底中组织化和ECM填充的改变。
实施例6：获得具有直线设计的层(ii)的完整皮肤等同物
在本实施例中，层(ii)具有十边形设计。基底的制备类似于实施例4。
在本实施例中，将NHF沉淀重悬于FHN3D培养基中，即最终NHF浓度为4000000NHF/ml FHN3D培养基。
将培养插件置于培养皿中，其中双层基底位于顶部(层(ii)位于顶部)。对于NHF接种：将细胞溶液以100μL/插件(即400000NHF/cm2)的速率接种在插件上，然后，为了促进细胞粘附，将带有细胞的插件在37℃下孵育1小时。
对于真皮等同物的培养步骤，将插件悬浮在其中FHN3D培养基在顶部且双层基底在底部的6孔板中。然后将真皮等同物在FHN3D培养基中于37℃、5％CO2下孵育4天(共计培养18天)或14天(共计培养36天)。
在患者知情同意后，从整形手术获得的皮肤组织中分离角质细胞(NHK)，然后在G7F扩增培养基中使用饲养细胞扩增NHK(Black等(2005)Tissue Eng.11:723-733)。
对获得的NHK进行胰蛋白酶化(胰蛋白酶EDTA 0.05％，37℃下8至10分钟)，计数并通过以190g离心5分钟来沉淀，然后将沉淀重悬于G7F扩增培养基(含0至1mM抗坏血酸)中。
离心后，将角质细胞悬浮在G7F培养基中，使得最终NHK浓度为300000NHK/ml G7F培养基中，然后将其人工接种在插件中：最终浓度为约150000NHK/cm2。
然后将完整的皮肤等同物浸没在含有0至1mM抗坏血酸的G7F培养基中，于37℃、5％CO2下培养3天(共培养18天)和培养7天(共培养36天)。然后，在G3F分化培养基(Black等(2005)Tissue Eng.11:723-733+0至1mM抗坏血酸)中，在气-液界面表面形成完整的皮肤等同物，在37℃、5％CO2下，培养11天(共培养18天)和培养15天(共培养36天)。
发明人观察到令人满意的表皮分化，其具有所有预期的层(即基底层、基底上层、颗粒层和角质层)。此外，真皮保持令人满意的成纤维细胞粘附，并且没有观察到真皮中的表皮内陷。在通过免疫荧光和组织学上(伊红、苏木精和藏红花)检测真皮细胞外基质(ECM)(如胶原蛋白1、原纤维蛋白或弹性蛋白)，真皮-表皮连接处的ECM(如胶原蛋白4和串珠蛋白聚糖(Perlecan))的合成，发现这些蛋白的量在总培养的18天和36天之间增加。此外，用多光子显微镜观察到胶原蛋白组织化，其中纤维缠绕在基底的纤维周围。观察到响应于维生素C，填充基底的EMC，尤其是胶原蛋白1(用藏红花标记或用多光子显微镜观察)的增加。
实施例7：获得具有波状直线设计的层(ii)的完全表皮等同物
在本实施例中，除了使用具有波状设计的层(ii)的层的双层基底之外，采用与实施例6相同的方案。
离心后，将角质细胞悬浮在G7F培养基中，使得最终NHK浓度为300000NHK/ml G7F培养基，然后将其人工接种在插件中：最终浓度为约150000NHK/cm2。
然后将完整的皮肤等同物浸没在含有0至1mM抗坏血酸的G7F培养基中，于37℃、5％CO2下培养7天。然后，在G3F分化培养基(Black等(2005)Tissue Eng.11:723-733+0至1mM抗坏血酸)中，在37℃、5％CO2下，培养14天在气-液界面表面形成完整的皮肤等同物。
发明人观察到，在实施例6的皮肤等同物和实施例7的皮肤等同物之间，通过免疫荧光和组织学上(伊红、苏木精和藏红花)检测真皮细胞外基质(ECM)(如胶原蛋白1、原纤维蛋白或弹性蛋白)，真皮-表皮连接处的ECM(如胶原蛋白4和串珠蛋白聚糖)的合成，发现这些蛋白的量在总培养的18天和36天之间增加。此外，用多光子显微镜观察胶原蛋白组织化，其中纤维缠绕在基底的纤维周围。观察到，响应于维生素C，填充基底的EMC，尤其是胶原蛋白1(用藏红花标记或用多光子显微镜观察)的增加。实施例6和实施例7之间的差异在于实施例7中的基质蛋白组织更不均匀，其存在空白区，实施例7中弹性蛋白的表达较低，以及实施例7中产生具有更大胶原蛋白1纤维成束的胶原蛋白1的不同纤维组织化(通过多光子显微镜观察)。这些结果证明，设计和孔隙率的变化会引起基低中ECM的组织化、填充和含量的变化。

Claims (17)

1.一种用于真皮等同物的生产方法，包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层(i)，
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层(ii)，
c.用真皮和/或皮下细胞接种所述层(ii)，
其中步骤a和步骤b按此顺序或相反顺序依次进行，且其中所述第二静电纺丝步骤沿着由所述第一静电纺丝步骤产生的层纵向进行。
2.一种用于皮肤等同物的生产方法，包括根据权利要求1所述的用于真皮等同物的生产方法，并且进一步包括在步骤c)和/或在两个步骤a)和b)之后，用表皮细胞接种所述层(i)。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的生产方法，其中所述层(i)填充或涂覆有可选地为模拟真皮-表皮连接处基质的水凝胶形式的一种或多种生物活性剂，和/或其中所述层(ii)填充或涂覆有可选地为模拟真皮基质的水凝胶形式的一种或多种生物活性剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产方法，其中所述真皮和/或皮下细胞在合适的培养基中浸没培养或在气-液界面处培养。
5.一种用于表皮等同物的生产方法，包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层(i)，
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物来形成厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层(ii)，
c.用表皮细胞接种所述层(i)，
其中步骤a和步骤b按此顺序或相反顺序依次进行，且其中所述第二静电纺丝步骤沿着由所述第一静电纺丝步骤产生的层纵向进行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的生产方法，其中所述层(ii)通过静电书写包含至少一种熔融聚合物(熔体静电书写MEW)或包含至少一种溶液中聚合物的组合物来形成。
7.根据权利要求2至6所述的生产方法，其中所述表皮细胞在合适的培养基中浸没培养或在气-液界面处培养。
8.通过权利要求1、3至4和6中任一项所述的方法能够获得的真皮等同物。
9.通过权利要求2至4和6至7中任一项所述的方法能够获得的皮肤等同物。
10.通过权利要求5至7中任一项所述的方法能够获得的表皮等同物。
11.基底用于形成皮肤等同物或真皮等同物或表皮等同物的用途，所述基底包括：
a.通过静电纺丝(ES)或静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少200nm且孔隙率小于或等于5μm的层，
纵向叠加在
b.通过静电书写(EW)包含至少一种聚合物的组合物而形成的厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层上。
12.根据权利要求11所述的基底的用途，其中所述厚度为至少20μm且孔隙率大于或等于20μm的层通过静电书写(EW)包含至少一种熔融聚合物(熔体静电书写MEW)或在溶液中的聚合物的组合物来形成。
13.根据权利要求8所述的真皮等同物或根据权利要求9所述的皮肤等同物或根据权利要求10所述的表皮等同物用于筛选化合物的用途，所述化合物优选为能够对皮肤具有美容、皮肤病学或药物活性的化合物，优选局部施用在皮肤上或注射到皮肤后具有美容或皮肤病学活性的化合物。
14.一种用于具有活性的化合物的筛选方法，所述化合物优选为能够对皮肤具有美容、皮肤病学或药物活性的化合物，优选在局部施用在皮肤上或注射到皮肤后具有美容或皮肤病学活性的化合物，所述筛选方法包括将候选化合物施用在根据权利要求8所述的真皮等同物或根据权利要求9所述的皮肤等同物上或根据权利要求10所述的表皮等同物上。
15.根据权利要求8所述的真皮等同物，所述真皮等同物用于伤口敷料或皮肤移植。
16.根据权利要求9所述的皮肤等同物，所述皮肤等同物用于伤口敷料或皮肤移植。
17.根据权利要求10所述的表皮等同物，所述表皮等同物用于伤口敷料或皮肤移植。
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