CN117946442A - 一种改性蛋壳膜、固定化酶及其应用 - Google Patents
一种改性蛋壳膜、固定化酶及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明属于酶固定技术领域，具体涉及一种改性蛋壳膜、固定化酶及其应用。改性蛋壳膜是按照以下步骤制备得到的：将含巯基的物质与蛋壳膜混合进行硫化反应，得到表面含巯基的蛋壳膜；将表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛混合进行反应，得到表面含醛基的改性蛋壳膜。该改性蛋壳膜能够用于固定酶，蛋壳膜上的醛基与酶的氨基发生席夫氏反应，实现对酶的固定化，且酶的固定率高，结合牢固，酶不宜脱落。
Description
技术领域
本发明属于酶固定技术领域，具体涉及一种改性蛋壳膜、固定化酶及其应用。
背景技术
蛋壳膜(ESM，Eggshell membrane)是一种特殊的天然生物材料，虽然常被作为废物抛弃，但其是主要由蛋白质(约80％～85％，其中胶原蛋白约占10％，糖蛋白和其他蛋白占75％)、可溶性有机化合物(如N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素)及少量无机盐组成的纤维状薄膜。多孔网状结构使ESM具有良好的透气和吸附性能，富含氨基酸等有机成分使其很容易被功能化。此外，ESM无毒无害容易被降解。因此，ESM在生物医学工程、材料科学和环境工程等领域的应用一直被人们广泛关注。固定化酶作为生物催化剂因具备不溶于水、便于分离、可以反复使用等优点，在工业上受到普遍欢迎。
目前常用的固定化酶载体有无机固体化合物如玻璃、金属、氧化铝、膨润土、二氧化硅等，合成有机物如合成树脂，天然有机物如纤维素、淀粉、琼脂糖、壳聚糖和海藻酸等。其中，天然有机化合物优势突出，如材料来源广、亲水能力强、容易被改性、无毒性、性能温和、成本低等，研究最为深入，成为优质固定化酶载体来源的宝库。
目前常用的酶固定化方法大致可分为五类：物理吸附法、离子键结合、共价键结合、交联法以及包埋法。每种方法都存在一定的优缺点。物理吸附法主要借助范德华力、氢键、疏水的相互作用等方式实现酶与载体的结合，结合不紧密，酶容易脱落；离子键是利用正负电荷的的相互作用等方式实现酶与载体的结合，酶与载体结合不紧密，且容易受容易pH的影响；交联法是不用载体，依靠连接体使酶与酶之间连接，网络成大的不溶性的固体催化剂，缺点就是反应位点多，酶的三级结构容易被破坏，酶活损失严重；包埋法一般采用凝胶将酶封闭在一定空间内，区域空间有小孔，底物产物可以自由出入，由于受扩散速率和空间位阻的影响，包埋固定化酶催化效率容易降低；共价键一般借助连接体如戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)等与酶和载体发生化学反应实现酶与载体的结合，优点是酶与载体结合紧密，酶不容易脱落，工业上应用广泛，缺点是反应位点多，酶会发生部分失活。因此，开发一种酶固定率高、结合牢固的固定化酶载体是十分必要的。
发明内容
鉴于以上技术问题，本发明综合分析天然有机化合物作为固定化酶载体的优势和不同酶固定化方法之间的差异，以废弃物天然蛋壳膜为研究对象，充分发挥其表面基团丰富、改性容易、透气性能好、机械强度高、耐酸碱能力强等优势，开发出一种改性蛋壳膜。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种改性蛋壳膜，其是按照以下步骤制备得到的：
将含巯基的物质与蛋壳膜混合进行硫化反应，得到表面含巯基的蛋壳膜；
将表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛混合进行反应，得到表面含醛基的改性蛋壳膜。
优选地，所述改性蛋壳膜的膜表面是由纤维呈层状堆积而成的孔隙结构，所述改性蛋壳膜表面电位为100mV～150mV。
优选地，所述含巯基的物质为硫代乙醇酸铵、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇中的一种。
优选地，所述蛋壳膜与含巯基的物质的用量比为1g：25～50mL；且当所述含巯基的物质为二硫苏糖醇时，将其配制成浓度为20～40mM的溶液使用。
优选地，戊二醛是体积浓度为1～3％的戊二醛溶液，表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛溶液的用量比为1g∶50～100mL。
优选地，所述硫化反应是在室温条件下反应24～48h；
表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛的反应是在室温条件下反应24～48h。
本发明第二方面，提供一种所述改性蛋壳膜在固定酶中的用途。
本发明第三方面，提供一种酶固定化方法，是将所述改性蛋壳膜与酶溶液混合后混悬，得到改性蛋壳膜固定化酶。
本发明第四方面，提供一种根据上述固定化方法获得的固定化酶。
优选地，所述固定化酶为改性蛋壳膜固定化胆汁酸盐水解酶，所述改性蛋壳膜固定化胆汁酸盐水解酶用于甘胺鹅去氧胆酸、甘胺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸等结合型胆汁酸的水解。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提供一种改性蛋壳膜，其是先利用含巯基物质破坏蛋壳膜表面的二硫键并产生巯基，蛋壳膜表面暴露的巯基在碱性条件下与戊二醛反应，其中戊二醛上的一个醛基与蛋壳膜上的巯基反应使蛋壳膜表面形成丰富的醛基，另一个醛基与目的酶上的氨基发生席夫氏反应，实现酶的固定化，且酶的固定率高，结合牢固，酶不宜脱落。
2、将改性蛋壳膜应用于胆汁酸盐脱氢酶BSH的固定化，BSH的固定率达92.48％，载酶量不低于16.90±0.75mg/g，固定化BSH催化甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的活性为35.28±5.45U/g，催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)的活性为22.86±3.79U/g。此外，固定化BSH表现出良好的热稳定性、操作稳定性和贮藏稳定性等，具有应用于工业生产的潜力。同时，Cu2+能够抑制固定化BSH活性，抑制率达100％；Fe2+和Mn2+能够增强固定化BSH活性，10mM的Fe2+能使固定化BSH的活性增强至原活性的143％，10mM的Mn2+能使固定化BSH的活性增强至原活性的119％。
3、本发明以天然生物材料蛋壳膜为研究对象，对其改性制备固定化酶载体，材料来源广、成本低、无毒性、容易被改性，变废为宝，减少环境污染。
4、蛋壳膜来源广泛，改性容易，可以将改性蛋壳膜固定化酶载体推广到其他酶的固定化研究中，为工业催化助力。此外，动物的胆汁中的胆汁酸主要以结合型为主，利用改性蛋壳膜为载体的固定化BSH催化结合型胆汁酸的水解，为游离型胆汁酸的生产提供了依据。
附图说明
图1为改性蛋壳膜载体亲疏水性的接触角测定图；a、原始的蛋壳膜；b、二硫键破坏后的蛋壳膜；c、与戊二醛结合后的蛋壳膜；
图2为改性蛋壳膜载体的扫描电镜图(100μm)；
图3为改性蛋壳膜载体的扫描电镜图(30μm)；
图4为改性前蛋壳膜载体的Zeta电位图；
图5为改性蛋壳膜载体的Zeta电位图；
图6为改性蛋壳膜为载体的固定化BSH的热稳定性；
图7为改性蛋壳膜为载体的固定化BSH的操作稳定性；
图8为改性蛋壳膜为载体的固定化BSH的贮藏稳定性；
图9为胆汁酸盐水解前后的变化。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明技术方案进行详细描述，但并不因将本发明限制在所述实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择，本发明所用试剂和原料均为市售可得。
需要说明的是，本发明所述的胆汁酸盐水解酶来自乳酸菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、肠球菌(Enterococcus)和梭状芽胞杆菌(Clostridium)或以上微生物的基因改造菌种中的至少一种。
本发明提供一种改性蛋壳膜，其是按照以下步骤制备得到的：
将含巯基的物质与蛋壳膜混合进行硫化反应，得到表面含巯基的蛋壳膜；
将表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛混合进行反应，得到表面含醛基的改性蛋壳膜。
现有技术普遍使用戊二醛的双醛基分别与酶和载体的氨基发生希夫氏反应进行酶的固定化，反应位点多，酶活性容易丧失。本发明使用戊二醛的一个醛基与蛋壳膜的巯基，另一个醛基与蛋壳膜的氨基反应进行酶的固定化，实现对酶的固定化，且酶的固定率高，结合牢固，酶不宜脱落。
实施例1
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mL pH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例2
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值13.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应36h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例3
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值12.0、体积分数1％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应36h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例4
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mLβ-巯基乙醇溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应48h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应36h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例5
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL浓度为20mM二硫苏糖醇溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例6
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL浓度为40mM二硫苏糖醇溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例7
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到25mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例8
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到25mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应36h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例9
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到50mLpH值10.0、体积分数2％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
实施例10
一种改性蛋壳膜，是按照以下步骤制备得到：
(1)1g蛋壳膜加入到50mL硫代乙醇酸铵溶液中，pH值12.0。室温25℃，100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得产物。
(2)取1g步骤(1)中获得的产物，加入到100mLpH值10.0、体积分数3％的戊二醛溶液中，室温25℃、100rpm磁力搅拌，反应24h。反应完成后，用去离子水多次清洗蛋壳膜，-80摄氏度冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h，获得改性蛋壳膜。
由于实施例1～10制备得到的改性蛋壳膜的性能及效果基本相同，故以下仅以实施例1制备得到的改性蛋壳膜为例进行效果说明。
实验例1
改性蛋壳膜的表征——亲疏水性测定分析
将天然蛋壳膜、硫代乙醇酸铵处理后的蛋壳膜以及实施例1获得的改性蛋壳膜分别在-80℃冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h至彻底干燥，剪成1cm2的正方形。将三种样品分别置于接触角测定仪上检测接触角的大小，分析亲疏水性。
结果如图1所示。图1显示，原始的蛋壳膜、二硫键破坏后的蛋壳膜和与戊二醛结合后的蛋壳膜的接触角分别为67.59°、55.49°和46.85°，均小于90°，为亲水性材料。改性处理后接触角逐渐变小，说明亲水性能越来越好。
实验例2
改性蛋壳膜的表征——扫描电镜(SEM)分析
将实施例1获得的改性蛋壳膜在-80℃冷冻12h，冷冻干燥机干燥24h至彻底干燥，剪成1cm2的正方形，用导电胶固定于导电载物台上，15Mpa喷金40s，10Kv条件下，在扫描电子显微镜下观察改性蛋壳膜固定化酶载体表面形态与结构。
结果如图2～3所示。
图2显示，膜表面平整由纤维交织而成，纤维粗细有差距，膜上有孔隙。由纤维组成的孔隙结构既增强的膜的韧性，又使膜透气性能良好。
图3显示，膜表面的纤维呈层状堆积，孔洞明显；纤维上面出现修饰后的点装痕迹。
实验例3
改性蛋壳膜的表征——Zeta电位测定
分别准确称取0.5g改性前后的蛋壳膜，研钵研磨，然后将处理后的固体粉末置于1M的NaOH溶液中100rpm室温磁力搅拌12h，至固体粉末完全溶解。8000rpm离心3min，取上层清液，采用Zeta电位仪，测定改性前后的蛋壳膜Zeta电位的变化，并绘制Zeta电位曲线图。
结果如图4～5所示。改性前平均Zeta电位32.9mV，改性后平均Zeta电位50.9mV。膜的表面电位更大可能为正值，数值在100mV到150mV之间。说明改性后的蛋壳膜载体更容易吸引带负电的蛋白。
实验例4
改性蛋壳膜固定BSH
准确称取1.0g改性蛋壳膜，加入pH 5.5、100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液50mL，磁力搅拌5min进行微环境处理，处理完毕抽滤。加入1.5mg/mL的胆汁酸盐脱氢酶(BSH)溶液12.5mL，在16℃下，垂直混悬3h固定酶，反应结束后，过滤并收集滤液。分别使用10mL浓度为50mM的NaCl溶液和10mL浓度为50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在16℃下垂直混悬30min洗涤固定化酶，收集洗液，得到固定化BSH。
以牛血清白蛋白作为对照，用BCA试剂盒测定滤液和洗液中蛋白浓度，测得BSH的固定率。结果显示，BSH的固定率在90％以上。
(1)胆汁酸盐水解酶BSH的活性可以通过检测从结合型胆汁酸盐中释放出的甘氨酸或牛磺酸的量来确定。具体方法如下：
100μL蒸馏水和150μL茚三酮试剂(茚三酮试剂是按照以下步骤进行配制：0.5mL质量分数1％茚三酮溶于0.5mol/L pH 5.5的柠檬酸盐缓冲液中，再加入1.2mL 30％甘油及0.2mL 0.5mol/L柠檬酸缓冲液pH 5.5)混合，加入每种反应产物50μL。涡旋振荡后沸水煮14min。冷却后，以不含甘氨酸或牛磺酸的溶液为空白对照，测定570nm处的吸光度。一个酶活性的单位定义为在测定条件下每分钟释放1μmol氨基酸的量。其中，反应产物是指固定化BSH催化甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的产物及固定化BSH催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)的产物。
结果显示，固定化BSH催化甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的活性为35.28±5.45U/g；固定化BSH催化牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)的活性为22.86±3.79U/g。
(2)热稳定性研究
分别取适量的游离酶和固定化酶置于pH 5.5、100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在不同温度下热处理2h(5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃)，取出后，迅速放入冰水浴中冷却，在25℃下，测定游离酶和实施例4得到的固定化酶的酶活。以未做处理的游离酶或固定化酶测得的酶活为100％，计算热处理2h后的残余酶活，研究酶活性随热处理温度的变化。
结果如图6所示。将改性蛋壳膜为载体的固定化BSH在35℃热处理2h，酶活性约保留初始活性的90％；在45℃热处理2h，酶活性约保留初始活性的80％；55℃热处理2h，酶活性约保留初始活性的45％。说明改性蛋壳膜为载体的固定化BSH的热稳定性良好。
(3)操作稳定性研究
取0.5g实施例4得到的固定化BSH于锥形瓶中，以100mM、pH 5.5柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲液，反应底物为终浓度2mM的甘胺鹅去氧胆酸(GCDCA)，在25℃下反应4h。待一次反应结束后，过滤分离固定化酶，用去离子水洗涤，测定其酶活性。连续重复催化转化反应6次，以初始酶活为100％，测定多次反应后，固定化酶的残留活性，考察固定化BSH的操作稳定性。
结果如图7所示。使用改性蛋壳膜为载体的固定化BSH连续进行7次催化反应，酶活性约保留初始活性的70％。说明改性蛋壳膜为载体的固定化BSH的操作稳定性良好，适合进行多批次的催化应用。
(4)贮藏稳定性研究
将实施例4得到的固定化BSH置于pH 5.5、100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，于4℃中储存，每隔一周测定其酶活，以初始酶活为100％，测定经过1周、2周、3周、4周、5周及6周不同时间段储存后固定化酶的残留酶活，考察固定化酶的贮藏稳定性。
结果如图8所示。改性蛋壳膜为载体的固定化BSH在4℃环境中的贮藏2周，酶活性保留在初始酶活的90％以上；贮藏3周，酶活性保留约为初始酶活的80％；贮藏6周，酶活性保留约为初始酶活的58％。
(5)金属离子对固定化BSH的影响
以0.1M的甘胺鹅去氧胆酸(GCDCA)为底物，分别研究了Mg2+、Co2+、Ag+、Cr2+、Hg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ph2+对实施例4得到的固定化BSH的影响，金属离子的浓度为10mM。催化条件为45℃、pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，不加以上金属离子时固定化BSH的的活性看作100％。
结果如表1所示。Cu2+能够抑制固定化BSH活性，抑制率达100％。Fe2+和Mn2+能够增强固定化BSH活性，10mM的Fe2+能使固定化BSH的活性增强至原活性的143％，10mM的Mn2+能使固定化BSH的活性增强至原活性的119％。表明固定化BSH可被应用于调节催化速率，调控反应终止过程。
表1金属离子对固定化BSH的影响
(6)固定化BSH对胆汁酸盐的水解
固定化BSH对胆汁酸盐甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)的水解在100mM、pH 5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行，反应温度45℃，催化时间2h，记录催化前后反应液的变化。
结果如图9所示。观察固定化BSH对GCDCA和TCDCA水解2h前后的变化可以发现，水解前溶液清澈透明，水解后出现非常明显的白色沉淀。白色沉淀是由于水解生成的游离胆汁酸CDCA不溶于水造成的。
上述实施例为本发明较佳实施方式，但是本发明不受上述实施例的限制，未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化皆为等效置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种改性蛋壳膜，其特征在于，其是按照以下步骤制备得到的：
将含巯基的物质与蛋壳膜混合进行硫化反应，得到表面含巯基的蛋壳膜；
将表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛混合进行反应，得到表面含醛基的改性蛋壳膜。
2.根据权利要求1所述的改性蛋壳膜，其特征在于，所述改性蛋壳膜的膜表面是由纤维呈层状堆积而成的孔隙结构，所述改性蛋壳膜表面电位为100mV～150mV。
3.根据权利要求1所述的改性蛋壳膜，其特征在于，所述含巯基的物质为硫代乙醇酸铵、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇中的一种。
4.根据权利要求3所述的改性蛋壳膜，其特征在于，所述蛋壳膜与含巯基的物质的用量比为1g：25～50mL；且当所述含巯基的物质为二硫苏糖醇时，将其配制成浓度为20～40mM的溶液使用。
5.根据权利要求1所述的改性蛋壳膜，其特征在于，戊二醛是体积浓度为1～3％的戊二醛溶液，表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛溶液的用量比为1g∶50～100mL。
6.根据权利要求1所述的改性蛋壳膜，其特征在于，
所述硫化反应是在室温条件下反应24～48h；
表面含巯基的蛋壳膜与戊二醛的反应是在室温条件下反应24～36h。
7.一种权利要求1～6任一项所述改性蛋壳膜在固定酶中的用途。
8.一种酶固定化方法，其特征在于，是将权利要求1～6任一项所述的改性蛋壳膜与酶溶液混合后混悬，得到改性蛋壳膜固定化酶。
9.一种根据权利要求8所述的酶固定化方法得到的固定化酶。
10.根据权利要求9所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶为改性蛋壳膜固定化胆汁酸盐水解酶，所述改性蛋壳膜固定化胆汁酸盐水解酶用于结合型胆汁酸的水解。
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