CN117940771A - 用于评估候选药剂的治疗性质的方法和模型系统以及相关的计算机可读介质和系统 - Google Patents

用于评估候选药剂的治疗性质的方法和模型系统以及相关的计算机可读介质和系统 Download PDF

Info

Publication number
CN117940771A
CN117940771A CN202280061668.XA CN202280061668A CN117940771A CN 117940771 A CN117940771 A CN 117940771A CN 202280061668 A CN202280061668 A CN 202280061668A CN 117940771 A CN117940771 A CN 117940771A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
balanced
cell types
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280061668.XA
Other languages
English (en)
Inventor
H·古达兹
约翰尼·余
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN117940771A publication Critical patent/CN117940771A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/30—Prediction of properties of chemical compounds, compositions or mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Computing Systems (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供了体外模型系统、体内模型系统和离体模型系统、创建此类模型系统的方法以及使用此类模型系统来评估候选药剂的一种或多种治疗性质或鉴定新的治疗靶标的方法。还提供了例如在实践本公开的方法中找到应用的计算机可读介质和系统。

Description

用于评估候选药剂的治疗性质的方法和模型系统以及相关的 计算机可读介质和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月23日提交的美国临时专利申请第63/225,209号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
政府支持的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的第R00 CA194077号政府资助下完成的。政府具有本发明的某些权利。
环境技术
最近药物发现成本上升和治疗性分子发现回报减少的现象可以归因于药物发现科学的基础。具体而言，高通量筛选(HTS)一直是并且仍然是新分子发现的黄金标准。然而，HTS的一个关键限制是它的人为的性质——它仅可能在体外生物化学或基于细胞的测定中进行。临床前体内研究之前的体外生物化学或基于细胞的测定无法提供足够的药理学和毒性数据或可靠的预测能力来预测候选治疗药物的体内性能，从而使药物开发过程成本高昂且效率低下。本公开提供了体内模型系统和离体模型系统以及创建用于执行可扩展HTS筛选的此类系统的方法。
发明内容
提供了平衡细胞计数培养物及其产生方法、用于评估候选药剂的一种或多种治疗性质的方法。所述方法包括以三维生长不同细胞类型的细胞的异质池，用小分子化合物处理三维池，以及将处理的三维池的细胞解离成单细胞悬浮液，所述单细胞悬浮液具有适合于单细胞RNA测序的相等的细胞类型代表。所述方法进一步包括对解离的单细胞和来自未用小分子化合物处理的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞核糖核酸(RNA)测序，将来自所述单细胞RNA测序的数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，以及基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质。还提供了例如用于实践本公开的方法的计算机可读介质和系统。
附图的简要描述
图1A至图1G示出了非GENEVA细胞池和GENEVA细胞池的细胞组成的比较。图1A示出了来自基于单细胞RNA测序收获的非GENEVA细胞池(池1)的细胞代表的分布。条形表示每种细胞类型的scRNAseq数据集中的细胞数量。图1B示出了来自使用UMAP聚类可视化算法在二维转录组空间中绘制的图1A的数据集。图1C示出了在从GENEVA细胞池(池2)收获单细胞RNA测序后细胞代表的分布，允许精确捕获数据集中的每个细胞系。图1D示出了单细胞RNA测序数据，其绘制为GENEVA池2的UMAP图。图1E示出了在从GENEVA细胞池(池3)收获单细胞RNA测序后细胞代表的分布，允许精确捕获数据集中的每个细胞系。图1F示出了单细胞RNA测序数据，其被绘制为GENEVA池3的UMAP图。图1G示出了池1至池3的外推。与池2和池3相比，在池1中单细胞RNA测序所需的细胞的总数量明显更高。
图2A至图2F示出了GENEVA在多个体内模型系统和离体模型系统中的应用。图2A示出了用若干种剂量的ARS1620(0.4μM、1.6μM、25.0μM)或DMSO(媒介物)处理的以四种不同的人PDX肿瘤作为输入的离体作为类器官生长的GENEVA池。图2A是使用UMAP聚类可视化算法在二维转录组空间中绘制的。图2B以表格形式示出了来自图2A的数据集，该表格按药物治疗条件和来源基因型(PDX)分类。表格中的细胞是通过单细胞RNA测序获得的每个类别的细胞计数。图2C示出了用ARS1620(100mg/kg)或DMSO(媒介物)处理的以四种不同的人PDX肿瘤作为输入的在体内作为侧翼异种移植物生长的GENEVA池。图2C是使用UMAP聚类可视化算法在二维转录组空间中绘制的。图2D以表格形式示出了来自图2C的数据集，该表格按药物治疗条件和来源基因型(PDX)分类。表格中的细胞是通过单细胞RNA测序获得的每个类别的细胞计数。图2E示出了用ARS1620(100mg/kg)或DMSO(媒介物)处理的以八种不同人类癌细胞系作为输入的在体内作为侧翼异种移植物生长的GENEVA池。图2E是使用UMAP聚类可视化算法在二维转录组空间中绘制的。图2F以表格形式示出了来自图2E的数据集，该表格按药物治疗条件和来源基因型(PDX)分类。表格中的细胞是通过单细胞RNA测序获得的每个类别的细胞计数。
图3A至图3E示出了GENEVA用于发现药物化合物的相对表型、遗传驱动因子和IC50曲线重建的应用。图3A示出了从来自用维罗非尼或ARS1620处理的GENEVA池的药物处理前/后相对细胞计数计算的单独的细胞类型的相对灵敏度。在维罗非尼处理的池中最敏感的细胞系是BRAF.V600E突变体藏匿(harboring)。ARS1620处理的池中最敏感的细胞系是KRAS.G12C突变体藏匿。图3B示出了使用lasso回归模型在GENEVA池中发现导致相对药物敏感性变化的因果驱动因子突变。BRAF.V600E通过lasso算法被预测导致对维罗非尼的药物敏感性主要突变。KRAS.G12C通过lasso算法被预测是导致对ARS1620的药物敏感性的主要突变。图3C示出了在用和不用ARS1620处理之后从GENEVA细胞池数据重建IC50曲线，其中细胞计数与相对存活率百分比的比例测量相拟合，并且对IC50逻辑回归曲线进行插值。IC50曲线由单独的细胞系构建，并且非KRAS.G12C细胞系显示出对ARS1620的存活率明显高于KRAS.G12C细胞系。图3D示出了来自GENEVA池中的不同细胞系的相对药物敏感性测量结果，从而概括了KRAS.G12C作为ARS1620的致敏突变靶标的发现。图3E示出了来自在作为混合的类器官生长的PDX中进行的GENEVA的细胞周期抑制率的计算。这种重建方法通过使用周期状态推断作为表型的测量的细胞计数的替代方法，概述了KRAS.G12C特异性药物对ARS-1620治疗的敏感性。
图4A至图4D示出了GENEVA用于联合疗法和耐药机制的预测的应用。图4A示出了GENEVA发现若干种耐药靶标的上调，示出在用ARS1620以KRAS.G12C特异性方式处理的GENEVA池中的细胞存活机制。图4B示出了通过将药物靶标与i)三种ARS1620抑制剂和ii)靶向特异性耐药途径的化合物联合给药来验证预测的药物靶标。对Bliss药物协同作用进行绘图，并且若干种化合物显示出与多种KRAS.G12C抑制剂的显著药物协同作用。图4C示出了在使用H1373 KRAS.G12C突变系的多臂联合疗法中来自ARS1620和INK128的体内小鼠研究的相对肿瘤体积(每种条件n＝4至5只小鼠)。图4D示出，与INK128和ARS1620独立性或无药物协同作用的无效模型相比，INK128和ARS1620协同地降低了体内肿瘤生长。
图5A至图C示出了GENEVA用于经由内皮-间充质转化(EMT)途径预测耐药性的体内特异性机制的应用。图5A示出，在细胞池中KRAS.G12C细胞系的ARS1620治疗的配对的体内和体外GENEVA实验中，EMT基因集在体内药物治疗后上调，但在体外药物治疗后没有上调。图5B示出了在使用H1373 KRAS.G12C突变系的多臂联合疗法中来自ARS1620和Galunisertib(一种EMT抑制剂)的体内小鼠研究的相对肿瘤体积(每种条件n＝4至5只小鼠)。图5C示出，与Galunisertib和ARS1620独立性或无药物协同作用的无效模型相比，Galunisertib和ARS1620协同地降低了体内肿瘤生长。
图6A至图6E示出了GENEVA用于发现该化合物对线粒体基因的作用的分子机制的应用。图6A绘制了在ARS1620处理后线粒体编码的和基因组编码的线粒体靶向的转录物的GENEVA池中KRAS.G12C系的聚集的基因表达与非线粒体基因转录物的基因表达的比较图。在ARS1620处理后存活的细胞中，线粒体编码的基因和基因组编码的线粒体驻留基因显著下调。图6B绘制了GENEVA细胞池中每个单独的KRAS.G12C细胞系在ARS1620处理后的有丝分裂编码的转录物的基因表达。图6C示出了来自H2030(KRAS.G12C)的长期ARS1620耐受细胞系(30天处理，10uM)的产生和分布。使用H2030药物持久性细胞系和原始亲代细胞系之间的荧光线粒体染色(Mitotracker深红FM)进行的线粒体含量测定显示，在用ARS1620进行长期药物治疗后，线粒体含量降低。图6D示出，KRAS.G12C抑制剂AMG510增加线粒体呼吸和电子传输链活性，作为KRAS.G12C抑制的新致死机制，使用海马测定测量在AMG510处理后(2小时)H2030(KRAS.G12C)细胞的耗氧量。图6E示出，KRAS.G12C细胞系的亚群结构显示出对用ARS1620处理后具有低线粒体读数的细胞类型的选择。
图7A至图7G示出了GENEVA用于发现该化合物对铁死亡基因(ferroptosis gene)的作用的分子机制的应用。图7A绘制了示出来自用ARS1620给药的GENEVA池的多个G12C系之间聚集的Z评分差异的火山图，并且证明了抗铁死亡基因(anti-ferroptotic gene)的共同上调。图7B绘制了每个细胞系响应于ARS1620剂量增加的抗铁死亡基因的基因表达。图7C利用使用荧光脂质过氧化传感器的铁死亡的实验研究来证明脂质过氧化的细胞对ARS1620剂量(48小时)的剂量响应。图7D、图7E、图7F示出了与图7F中的ARS1620相比，图7D中的已知铁死亡药剂六甲蜜胺(Altretamine)、图7E中的埃拉斯汀(Erastin)的存活和脂质过氧化动力学。在所有化合物中，脂质过氧化和存活动力学在IC50附近交叉，表明ARS1620表现为铁死亡诱导剂。图7G示出了多种KRAS抑制剂在KRAS.G12C细胞系H2030中特异性地诱导脂质过氧化，但在KRAS.G12V细胞系H441没有这么多。
图8A至图8D示出了在体内细胞池中并入多种共同给药的化合物的联合疗法的GENEVA测试。图8A示出了使用KRAS.G12突变系中的CLX池进行的GENEVA联合疗法研究，该突变系通过细胞系来源和药物治疗条件进行分类，使用UMAP聚类可视化算法在二维转录组空间中绘制。治疗条件包括抗霉素、ARS1620、Galunisertib、INK128、DMSO、ARS1620+抗霉素、ARS1620+Galunisertib、ARS1620+INK128。图8B利用来自图8A的GENEVA数据，用于对每种药物条件中的细胞周期状态进行的协同计算，并对不同药物条件下的G12C细胞系进行组合估计。图8C至图8D使用估计基因水平协同作用的多因素线性模型，证明了驱动Galuniserib(图8C)和INK128(图8D)与ARS1620联合使用的协同药物效应的基因的鉴定，揭示了线粒体转录物驱动协同药物效应。
图9A至图9B示出了遗传去多重化改进算法和通过GENEVA方法鉴定对ARS1620有响应的患者的新基因型。图9A示出了通过针对来自Totalseq标记的单细胞RNA测序数据集的百分比表示的标准方法进行遗传去多重化去噪算法比较，在细胞分配置信度方面的改进。在虚线或噪声校正算法结果中标注了较高的置信度度量。图9B绘制了用和不用ARS1620给药的GENEVA池，示出了EML4-ALK作为最药物敏感的肿瘤类型的敏感性，其中每个条形表示该基因型在ARS1620治疗或媒介物下的相对存活率。
具体实施方式
在更详细地描述本公开的方法、计算机可读介质和系统之前，应当理解，方法、计算机可读介质和系统不限于所述的特定实施例，因此当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在进行限制，因为方法、计算机可读介质和系统的范围将仅由所附的权利要求来限制。
在提供数值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限与该范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个中间值(直到下限单位的十分之一)都涵盖在该方法、计算机可读介质和系统内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也涵盖在方法、计算机可读介质和系统内，受到所陈述的范围中任何具体排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，不包括这些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在方法、计算机可读介质和系统中。
本文中给出了某些范围，其中数值前面带有术语“约”。术语“约”在本文中用于为其前面的精确数字以及接近或近似该术语前面的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是这样的数字，该数字在其出现的上下文中提供了具体列举的数字的基本等同物。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与方法、计算机可读介质和系统所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的方法、计算机可读介质和系统类似或等同的任何方法、计算机可读介质和系统也可以用于方法、计算机可读介质和系统的实践或测试中，但现在描述代表性的说明性的方法、计算机可读介质和系统。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的材料和/或方法。任何出版物的引用是由于其在提交日期之前公开，并且不应该被解释为承认本发明的方法、计算机可读介质和系统无权早于此类出版物，因为所提供的公开日期可能与可能需要单独确认的实际公开日期不同。
应当注意，如在本文和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。应当进一步注意，权利要求可以被起草成排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在用作与权利要求要素的叙述或“负面”限制的使用相关的如“单独地”、“仅”等排他性术语的使用的前提基础。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的方法、计算机可读介质和系统的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的方法、计算机可读介质和系统的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施例的所有组合都被本公开具体地包含并且在本文中公开，就如同每个组合都被单独和明确地公开一样，在某种程度上，即此类组合包含可操作的过程和/或组成。此外，在描述此类变量的实施例中列出的所有子组合也被本发明的方法、计算机可读介质和系统具体地包含并且在本文中公开，就如同每个此类子组合在本文中被单独和明确地公开一样。
如本领域技术人员在阅读本公开后将明显的是，在不脱离本发明的方法的范围或精神的情况下，本文所述和示出的每个单独的实施例都具有离散的部件和特征，这些部件和特征可以容易地与任何其他若干个实施例的特征分离或组合。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
方法
在一个方面，本公开提供了平衡细胞计数培养物和产生该平衡细胞计数培养物的方法。在一个方面，本公开提供了用于评估候选药剂例如小分子化合物的一种或多种治疗性质的方法。该方法包括以三维生长不同细胞类型的细胞的异质池，用小分子化合物处理三维池，以及以允许来自不同细胞类型的细胞的同等代表的方式将处理的三维池的细胞解离成单细胞。该方法进一步包括对解离的单细胞和来自未用小分子化合物处理的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞核糖核酸(RNA)测序，将来自单细胞RNA测序的数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，以及基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质。
本发明的方法通过将细胞混合在一起，一起向它们给药，然后使用单细胞RNA测序读出药物治疗后的细胞系来解决这个问题。以这种方式，通过将观察单位减少到单个细胞并且通过将细胞系混合/多重化在一起，本发明的方法能够针对许多小分子测定大量表型/基因型不同的细胞系。使用不同的模型来分析所得的单细胞RNA测序数据，以发现生物靶标、有效的协同组合疗法靶标、疾病亚型分层等。
本公开的方法的实施例在图2中作为单细胞RNA测序结果提供。在该实例中，将来自不同患者、器官系统和/或疾病模型/亚型的一大组细胞类型混合在一起以创建池。然后使该池在体内(例如在动物模型例如小鼠中产生异种移植物)或离体(例如产生类器官)三维生长。然后在适合于化合物作用于三维池的成员(细胞)的条件下，用感兴趣的研究小分子化合物处理三维池。药物递送方法将根据三维池的类型而变化，例如，当三维池是体内异种移植物等时，全身注射等。接下来，收获处理的三维池并解离成单细胞，然后对该单细胞进行单细胞RNA测序。通过对每种细胞类型的单独的活细胞的数量进行计数，并且通过将其与来自未用感兴趣的研究小分子化合物处理的相同三维池的每种细胞类型的活细胞的数量进行比较，来记录表型变化。然后对单细胞测序数据进行建模和/或转录组分析，以评估小分子化合物的一种或多种治疗性质，其非限制性实例包括作用机制(MOA)、联合疗法(作为临床联合疗法有效的药物)和亚型分层(在不同患者群体或亚型中的疗效)。
如上所述，本公开的方法包括以三维生长不同细胞类型的细胞池。在某些实施例中，不同细胞类型的细胞池包含1000种或更少、500种或更少、250种或更少、或100种或更少，但2种或更多、5种或更多、10种或更多(例如10至50种)、20种或更多、30种或更多、40种或更多、或50种或更多种不同细胞类型。
不同细胞类型的细胞可以选自任何感兴趣的细胞类型，这些细胞类型可以根据感兴趣的特定小分子化合物、待评估的小分子的一种或多种治疗性质等而变化。根据一些实施例，不同细胞类型的细胞池包含从患者获得的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞或它们的任意组合。
从患者获得的细胞可以包括但不限于来自从患者获得的活检组织的细胞。活检组织可以从健康的组织或患病的组织获得，该患病的组织包括例如癌症组织。根据癌症的类型和/或进行的活检的类型，细胞可以来自实体组织活检或液体活检。在一些情况下，细胞可以由外科活检制备。用于外科活检的任何方便和合适的技术可以用于收集将在本文所述的方法中使用的细胞，包括但不限于例如切除活检、切口活检、导丝定位活检等。在一些情况下，外科活检可以作为外科手术的一部分获得，该外科手术具有除了获得样品以外的主要目的，例如包括但不限于肿瘤切除术、乳房切除术、淋巴结手术、腋窝淋巴结清扫术、前哨淋巴结手术等。
可以使用各种其他活检技术来获得活检组织，进而获得将在本公开的方法中使用的细胞。作为非限制性实例，样品可以通过针吸活检获得。用于针吸活检的任何方便和合适的技术都可以用于收集样品，包括但不限于例如细针抽吸(FNA)、核心针活检、立体定向核心活检、真空辅助活检等。
来自器官系统的细胞可以包括但不限于来自选自皮肤、脑、心脏、肾、肝、胃、大肠、肺和/或类似物的器官系统的细胞。根据一些实施例，来自器官系统的细胞可以包括来自器官系统的细胞，该器官系统选自肾上腺、肛门、阑尾、膀胱(泌尿系统)、骨、骨髓、脑、支气管、膈肌、耳、食管、眼、输卵管、胆囊、生殖器、心脏、下丘脑、关节、肾、大肠、喉、肝、肺、淋巴结、乳腺、肠系膜、口、鼻腔、鼻、卵巢、胰腺、松果体、甲状旁腺、咽、垂体、前列腺、直肠、唾液腺、骨骼肌、平滑肌、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、牙齿、胸腺、甲状腺、气管、舌、输尿管、尿道、韧带、腱、毛发、前庭系统、胎盘、睾丸、输精管、精囊、尿道球腺、甲状旁腺、胸导管、动脉、静脉、毛细血管、淋巴管、扁桃体、神经元、皮下组织、嗅觉上皮(鼻)、小脑及它们的任意组合。
来自疾病模型的细胞可以包括但不限于对疾病进行建模的细胞，该疾病选自癌症(例如来自一种或多种不同癌细胞系的细胞)、心血管疾病、脑血管疾病(例如中风、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血、血管性痴呆等))、呼吸系统疾病、传染病、神经退行性疾病、痴呆、阿尔茨海默氏病、糖尿病、肾病、肝病(例如肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和/或类似物)及它们的任意组合。
根据一些实施例，不同细胞类型的细胞包含来自一种或多种癌细胞系的细胞。“癌细胞”意指表现出肿瘤细胞表型的细胞，其可以通过以下中的一种或多种来表征，例如异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制的丧失、锚定非依赖性生长潜能、在免疫受损的非人类动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力和/或任何合适的细胞转化指标。“癌细胞”在本文中可以与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌细胞”互换使用，并且涵盖实体瘤、半实体瘤、血液恶性肿瘤(例如白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞等)、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。
当不同细胞类型的细胞包含来自一种或多种癌细胞系的细胞时，一种或多种癌细胞系可以来自独立地选自以下的癌症：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、胆管癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、各种类型的头颈癌等。在某些实施例中，一种或多种癌细胞系可以来自独立地选自以下的癌症：实体瘤、复发性多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非小细胞肺癌、转移性黑色素瘤、黑色素瘤、腹膜癌、上皮性卵巢癌、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、转移性结肠直肠癌、结肠直肠癌、胰腺导管腺癌、鳞状细胞癌，食管癌、胃癌、神经母细胞瘤、输卵管癌、膀胱癌、转移性乳腺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、复发性头颈癌鳞状细胞癌、头颈癌、间变性星形细胞瘤、恶性胸膜间皮瘤、乳腺癌、鳞状非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤、转移性肾细胞癌、基底细胞癌(基底细胞上皮瘤)和胶质肉瘤。在某些实施例中，一种或多种癌细胞系可以来自独立地选自以下的癌症：黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌(RCC)、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。根据一些实施例，不同细胞类型的细胞包括来自在portals.broadinstitute.org/ccle可获得的布罗德研究所癌细胞系百科全书(BroadInstitute Cancer Cell Line Encyclopedia)(CCLE)中描述的一种或多种癌细胞系的细胞。
根据一些实施例，不同细胞类型的细胞包括来自一种或多种不同类型的干细胞的细胞。可以包含在不同细胞类型的细胞中的干细胞的非限制性实例包括胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、神经干细胞(NSC)及它们的任意组合。
如上所述，本公开的方法包括以三维生长不同细胞类型的细胞池。在某些实施例中，不同细胞类型的细胞池至少部分在体内以三维生长。根据一个非限制性实例，以三维生长池包括从池中产生异种移植物。如本文所用，“异种移植物”是来自移植到不同物种的受体的一个物种的组织(包括细胞移植物，例如细胞系移植物)。在某些实施例中，供体物种是人，并且受体动物是小鼠、大鼠、猪等。受体动物可以是免疫缺陷的(例如无胸腺裸小鼠、scid/scid小鼠、非肥胖(NOD)-scid小鼠、重组激活基因2(Rag 2)-敲除小鼠等)。当受体动物是啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)时，产生异种移植物可以包括将不同细胞类型的细胞池肠胃外注射到受体啮齿类动物中，例如通过尾静脉注射。根据一些实施例，异种移植物是细胞系来源的异种移植物(CDX)，例如包含来自一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、10种或更多种或25种或更多种)不同细胞系的细胞的异种移植物，其非限制性实例包括肿瘤细胞系。在某些实施例中，异种移植物是患者来源的异种移植物(PDX)，例如包含来自一个或多个不同患者(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、10个或更多个或25个或更多个不同患者)的原代细胞(例如原代肿瘤细胞)的异种移植物。在一些情况下，原代细胞可以经由如本文别处所述的活检获得。
在某些实施例中，不同细胞类型的细胞池至少部分地离体以三维生长。术语“离体”用于指在从生物体获得的样品(例如组织或细胞等)中或该样品上进行的处理、实验和/或测量，这些处理、实验和/或测量是在生物体外部的环境中进行的。因此，如应用于细胞的术语“离体操作”是指在生物体外对细胞的任何处理，包括但不限于培养细胞、对细胞进行一种或多种遗传修饰和/或将细胞暴露于一种或多种药剂。因此，离体操作在本文中可以用于指在动物体外进行的细胞处理，例如，在从动物或其器官获得此类细胞之后。与“离体”相反，如本文所用的术语“体内”是指动物体内的细胞，例如啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、猪等。
在某些实施例中，不同细胞类型的细胞池至少部分地在体外以三维生长。根据一些实施例，以三维生长的不同细胞类型的细胞池在体外生长为类器官。“类器官”意指可以模拟相应的体内器官的三维(3D)多细胞体外或离体组织构建体。类器官可以通过各种类型的可用3D细胞培养系统产生，该3D细胞培养系统包括但不限于3D生物打印支架、芯片上器官、基于微流体的3D细胞培养模型等。根据一些实施例，以三维生长的不同细胞类型的细胞池在体外生长成球状体。可以为越来越多的器官建立类器官，该器官包括但不限于肠、胃、肾、肝、胰腺、乳腺、前列腺、上下气道、甲状腺、视网膜和脑—来自直接来源于活检样品的组织常驻成体干细胞(ASC)，或者来自多能干细胞(PSC)，例如胚胎干细胞(ESC)或诱导的PSC(iPSC)。在某些实施例中，以三维生长的不同细胞类型的细胞池被生长成组织来源的类器官，例如来自一种或多种(例如两种或更多种)不同活检样品的类器官。用于产生干细胞来源的和组织来源的类器官的方法是已知的，并且在例如Hofer&Lutolf(2021)《自然评论材料(Nature Reviews Materials)》6:402-420中描述。
一旦不同细胞类型的细胞池以三维生长，就用小分子化合物处理三维池。“小分子”化合物意指分子量为1000原子质量单位(amu)或更小的化合物(例如有机化合物)。在一些实施例中，小分子为900amu或更小、750amu或更小、500amu或更小、400amu或更小、300amu或更小或200amu或更小。在某些方面，小分子不是由如聚合物中存在的重复分子单元制成的。根据一些实施例，小分子化合物是已知的治疗剂。“治疗剂”或“药物”意指可以在动物例如哺乳动物或人类的靶向位点产生所需生物效应的生理或药理活性物质。治疗剂可以是任何无机化合物或有机化合物。治疗剂可以降低、抑制、减弱、减少、阻止或稳定动物如哺乳动物或人类中疾病、病症或细胞生长的发展或进展。在一些实施例中，小分子化合物是由美国美国食品药品监督管理局(FDA)和/或欧洲药品管理局(EMA)批准用作治疗一种或多种疾病的治疗剂的化合物，该疾病包括但不限于本文别处所述的疾病中的任何一种，例如癌症、心血管疾病、脑血管疾病、呼吸系统疾病、传染病、神经退行性疾病、痴呆、阿尔茨海默氏病、糖尿病、肾病、肝病等。
在一些实施例中，本公开的方法包括用来自小分子化合物的文库的小分子化合物处理三维池。例如，小分子化合物可以来自这样的文库，该文库包括但不限于MedChemExpress(由FDA和/或EMA批准的1280种结构多样、具有生物活性和细胞渗透性的化合物的集合；或1600种结构多样、具有医学活性和细胞渗透性的化合物的集合，这些化合物正在或已经处于某些临床阶段)，ChemDiv的主PPI文库(20,000种多样的、通过计算选择的分子，该分子包括7个子集，包括基于天然产物的、3D模拟物、大环、螺旋-转角模拟物、三肽模拟物、3D多样性天然产物样和Beyond flatland)、MayBridge集合(一组13,000种化学多样的化合物)、ChemBridge DIVERSet-CL(50,000种具有增强的用于治疗开发的潜力的小分子的集合)、TargetMol(3200种结构多样的、具有医学活性和细胞渗透性的化合物的集合，这些化合物被选择成扩展和补充NU-HTA的现有FDA批准的和临床的集合)和/或任何其他感兴趣的小分子化合物文库。
用小分子化合物处理三维池的方式将根据三维池的情况而变化。在三维池(其是包含不同细胞类型的细胞的异种移植物)的情况下，处理三维池可以包括向受体动物(例如小鼠、大鼠、猪等)施用小分子化合物。小分子化合物可以经由选自口服(例如，以片剂形式、胶囊形式、液体形式等)、肠胃外(例如，通过静脉内、动脉内、皮下、肌内或硬膜外注射)、局部、鼻内或异种移植物内施用的施用途径被施用。在作为离体或体外维持和/或生长的类器官、球状体或其他3D多细胞结构的三维池的情况下，处理三维池可以包括将小分子化合物加入到存在三维池的细胞培养基中。在用小分子化合物处理池之前、期间和/或之后，用于生长和/或维持三维池的合适条件可以变化。此类条件可以包括在合适的温度(例如32℃至42℃，如37℃)和pH(例如pH 7.0至7.7，例如pH 7.4)下，在具有合适百分比的CO2(例如3％至10％，例如5％)的环境中在合适的容器(例如细胞培养板或其孔)中，在合适的培养基(例如细胞培养基，例如DMEM、RPMI、MEM、IMDM、DMEM/F-12等)中生长和/或维持三维池。
在用小分子化合物处理三维池之后，所述方法包括将处理的三维池的细胞解离成单细胞。可以采用用于将处理的三维池的细胞解离成单细胞的多种合适的方法。例如，当三维池是离体或体外维持和/或生长的类器官、球状体或其他3D多细胞结构时，可以通过在DMEM/F12基础培养基中使用LiberaseTM酶混合物(Millipore Sigma)消化三维池将细胞解离成单细胞，并且在37℃下旋转消化1小时。当三维池是异种移植物时，异种移植物(例如，肿瘤异种移植物)可以从处死的动物(例如，从小鼠的侧腹)解剖，使用手术刀精细地切碎，重悬于在DMEM/F12基础培养基10U/uL DNAse I 1mg/mL胶原酶IV中的1X LiberaseTM酶混合物中，并且在37℃下旋转消化1小时。
本公开的方法进一步包括对解离的单细胞和来自未用小分子化合物处理的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞核糖核酸(RNA)测序(有时被称为“单细胞RNA-seq”或“scRNA-seq”)。RNA测序(RNA-seq)是一种用于检测和定量分析生物样品中信使RNA分子的基因组方法并且可用于研究细胞响应。作为用于研究蛋白质组的替代品，一些研究已经转向蛋白质编码mRNA分子(统称为“转录组”)，其表达与细胞特征和细胞状态的变化密切相关。scRNA-seq允许比较单独的细胞的转录组。用于scRNA-seq的多种合适的方法是可用的，其非限制性实例包括C1(SMARTer)(例如，参见Pollen等人(2014)《自然生物技术(NatBiotechnol.)》32:1053-8)、Smart-seq2(例如参见Picelli等人(2013)《自然方法(NatMethods)》10:1096-8)、MATQ-seq(例如参见Sheng等人(2017)《自然方法》14:267-70)、MARS-seq(例如参见Jaitin等人(2014)《科学(Science)》343:776-9)、CEL-seq(例如参见哈希imshony等人(2012)《细胞报告(Cell Rep.)》2:666-73)、Drop-seq(例如参见Macosko等人(2015)《细胞(Cell)》161:1202-14)、InDrop(例如参见Klein等人(2015)《细胞》161:1187-201)、Chromium(例如参见Zheng等人(2017)《自然通讯(Nat Commun.)》8:14049)、SEQ-well(例如参见Gierahn等人(2017)《自然方法》14:395-8)、SPLIT-seq(例如参见Rosenberg等人(2017)BioRxiv doi.org/10.1101/105163)等。关于单细胞RNA测序的另外的细节可以在例如Haque等人(2017)《基因组方法(Genome Med)》9,75中找到。
在某些实施例中，对解离的单细胞进行scRNA-seq包括根据BiolegendTotalSeqTM-A方案(www.biolegend.com/en-us/protocols/totalseq-a-antibodies-and-cell-哈希-with-10x-single-cell-3-reagent-kit-v3-3-1-protocol)标记细胞，进行10x3’Chromium单细胞RNA-测序方案(support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep/doc/user-guide-chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v31-chemistry)，以及以每10X文库约300-400M读取量和每BiolegendTotalSeqTM文库约25M读取量进行测序。来自单细胞RNA测序的数据可以被去卷积成单细胞转录组，这些转录组按处理(用小分子化合物处理相对于未用小分子化合物处理)和细胞类型进行分类，例如使用条形码序列信息。
基于分类的单细胞转录组，方法进一步包括评估小分子化合物的一种或多种治疗性质。本公开的方法在评估小分子化合物的多种治疗性质中找到应用。此类治疗性质的非限制性实例包括小分子化合物用于与药物的联合疗法(联合疗法)的候选资格、小分子化合物的作用机制(MoA)、小分子化合物用于治疗疾病亚型(例如，用于精确肿瘤学，包括癌症/肿瘤亚型的新型治疗)的候选资格、小分子化合物的毒性、抗性/耐受性的机制、针对先前未在临床中测试的新适应症的药物再利用等。
根据一些实施例，一种或多种治疗性质包括小分子化合物用于与药物的联合疗法的候选资格，其中此类方法包括基于按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，以及计算每个细胞系的药物诱导的基因表达变化。此类方法进一步包括基于每个细胞系的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分。此类方法进一步包括基于加权评分高于错误发现率的基因来预测联合疗法靶标，其中与药物敏感性反相关的基因预测耐药性，因此代表用于组合靶向的候选靶标。
联合疗法的发现可以包括确定哪些细胞类型对化合物敏感，并且在这些细胞类型中确定治疗之前和之后基因表达的变化。单细胞RNA测序可以用细胞哈希法进行，然后通过使用其单核苷酸多态性对每个单独的细胞进行去多重化，以在分配到用于确定参考SNP的单独参考RNA测序数据集之后分配细胞系特性。对化合物敏感的细胞类型可以通过对每个细胞系在每种条件(药物、非药物)下剩余的细胞的数量进行计数来确定。然后，对于每个细胞系，可以计算在药物治疗之前和之后基因表达的差异，有时在本文中称为“Single-LineDelta”。可以将敏感细胞系的聚集的Single-Line Delta与不敏感细胞系的聚集的Single-Line Delta进行比较，以确定哪些基因在敏感细胞中最上调。这些聚集的基因表达变化然后可以被映射到线数据库中，并且使用文献搜索来确定这些基因中的哪些基因是可药用的。在所有或大多数敏感系中响应于该化合物而上调的基因被鉴定为候选的联合疗法靶标。
在某些实施例中，一种或多种治疗性质包括小分子化合物的作用机制，其中此类方法包括基于按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，确定每个细胞系的药物诱导的基因表达变化，以及聚集所确定的药物敏感细胞系的药物诱导的基因表达变化。此类方法进一步包括基于聚集的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分，将与聚集的药物敏感性相关的基因识别为加权评分高于错误发现率的基因，以及基于与聚集的药物敏感性相关的基因来预测化合物的作用机制。
作用机制的发现可以包括使用小分子化合物浓度的系列稀释物对细胞池进行实验性给药，确定哪些细胞类型对该化合物敏感，以及在这些细胞类型中，确定治疗之前和之后基因表达的变化，以及将敏感细胞系相对于不敏感细胞系中的基因表达变化建模为小分子化合物浓度的函数。首先，细胞池可以在实验中进行小分子化合物浓度范围的系列稀释。然后，在用细胞哈希法进行单细胞RNA测序后，可以使用其单核苷酸多态性(SNP)对每个单独的细胞进行去多重化，以在分配到用于确定参考SNP的单独参考RNA测序数据集后分配细胞系特性。对化合物敏感的细胞类型可以通过对每个细胞系在每种条件(药物、非药物)下剩余的细胞的数量进行计数来确定。然后，对于每个细胞系，可以计算药物治疗之前和之后基因表达的差异，有时在本文中被称为“Single-Line Delta”。可以将敏感细胞系的聚集的Single-Line Delta与不敏感细胞系的聚集的Single-Line Delta进行比较，以确定哪些基因在敏感细胞中最上调。然后可以将基因表达变化建模为用于确定哪些基因作为药物浓度的直接函数而变化的化合物浓度的函数。这些浓度依赖的基因表达变化然后可以被映射到参考基因组数据库上，以确定这些基因所属的途径。在该模型中，作为药物浓度的函数的负相关基因表明了药物的作用机制。
根据一些实施例，一种或多种治疗性质包括用于治疗疾病亚型的小分子化合物的候选资格，其中此类方法包括基于按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，其中每个细胞系通过其基因突变和/或转录组标记分类。此类方法进一步包括聚集细胞系中确定的药物敏感性，使用变量选择回归算法为每个突变和/或转录组特征分配预测与聚集的药物敏感性的相关性的评分，以及基于评分高于假发现率的疾病亚型来预测化合物在疾病亚型中的功效。在某些实施例中，变量选择回归算法是加权的lasso回归算法。
近年来，已经开发出针对特定蛋白质的遗传变体的疗法。这些特定的遗传变体或遗传亚型通常用于确定患者应该接受哪种药物。然而，目前还没有简单和高通量的方法来评估针对特定基因亚型开发的药物是否可以有效地用于对抗另一种亚型。本文所述的方法可以在一个实验中同时确定分子在体内、PDX(患者来源的异种移植物)、体外和离体类器官模型系统中针对一系列遗传亚型的相对敏感性。该方法包括汇集来自多个遗传亚型的细胞。这些混合的遗传亚型池然后使用这种小分子进行给药。单细胞RNA测序可以用细胞哈希法进行，然后通过使用其单核苷酸多态性对每个单独的细胞进行去多重化，以在分配到用于确定参考SNP的单独的参考RNA测序数据集之后分配细胞系特性。对化合物敏感的细胞类型可以通过对每个细胞系在每种条件(药物、非药物)下剩余的细胞的数量进行计数来确定。然后可以将细胞系通过其遗传亚型聚集，并且评估按亚型分类的不同细胞系组是否具有共享的敏感性或抗性。回归模型(例如，lasso回归模型)可以针对每种细胞类型中的突变进行训练，以确定哪些遗传突变预测从单细胞RNA测序去卷积数据计算的灵敏度。有效地预测来源于数据的敏感性系数的突变表明了潜在的靶标，并且基于该突变的回归(例如lasso回归)中模型变量系数的符号，可以确定该突变是抗性(阳性)突变还是致敏性(阴性)突变。本发明人已经成功地采用了这种测定和建模来证明它可以预测已知的遗传亚型分层以及发现对针对不同遗传亚型开发的分子敏感的新遗传亚型。亚型分层(其可以被定义为排序和定量地估计哪些遗传亚型诱导对小分子的敏感性或抗性的能力)能够在使用该方法的一个混合实验中实现。
在一个方面，本公开提供了一种平衡细胞计数培养物，其包含已经培养持续一定的时间段的两种或更多种不同细胞类型，其中至少两种不同细胞类型中的每种细胞类型具有生长速率，并且其中两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在培养前以与两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的生长速率相反的比率组合。
在一个方面，本公开提供了一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中平衡细胞计数培养物的0.2体积％至10体积％的样品包含每种不同细胞类型的至少500个细胞，其中在将两种或更多种细胞类型组合以创建细胞池并且接种于培养基中以获得平衡细胞计数培养物之后，在平衡细胞计数培养物被培养72小时至45天的时间段之后，从平衡细胞计数培养物中获取样品。
在一方面，本公开提供了一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中每种细胞类型在培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中细胞类型中的至少两种细胞类型来源于不同的癌组织。
在一个方面，本公开提供了一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中每种细胞类型在培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中细胞类型中的至少两种细胞类型包含彼此不同的癌症突变。
在一个方面，本公开提供了一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中每种细胞类型在培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中细胞类型中的至少两种细胞类型包含彼此不同的癌症突变。
在一些实施例中，在平衡细胞计数培养物中，两种不同细胞类型中的每种细胞类型都用至少1×103个活细胞表示。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物中的至少两种不同细胞类型中没有一种细胞类型的数量超过其他细胞类型2个数量级或更多。在一些实施例中，在平衡细胞计数培养物中，至少两种或更多种不同细胞类型的每种细胞类型的总数量彼此在2个数量级内。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含2至500种不同细胞类型。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含2至500、5至400、6至300、8至200、10至100、10至50、2至30、2至25或10至30种不同细胞类型。在一些实施例中，确定在包含多种细胞类型的平衡细胞计数培养物中每种细胞类型的代表包括UMAP分析。在一些实施例中，UMAP分析提供平衡细胞计数培养物中的不同细胞类型的表现作为一个或多个聚类。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含2种或更多种、至少2种或更多种、至少3种或更多种、至少4种或更多种、至少5种或更多种、至少6种或更多种、至少7种或更多种、至少8种或更多种、至少9种或更多种、至少10种或更多种、至少11种或更多种、至少12种或更多种、至少13种或更多种、至少14种或更多种、至少15种或更多种、至少16种或更多种、至少17种或更多种、至少18种或更多种、至少19种或更多种、至少20种或更多种不同细胞类型。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100种不同细胞类型。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物被培养持续6小时至45天、12小时至40天、24小时至35天、72小时至30天、96小时至20天、120小时至15天的时间段。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物被培养持续72小时的时间段。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物被培养持续14天的时间段。在一些实施例中，两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在步骤(b)中以与通过生长速率确定测定所确定的每种细胞类型的生长速率成反比的比率进行组合，并且ii)按比例缩放到生长的总天数。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物是生长平衡培养物(例如GENEVA池)。术语平衡细胞计数培养物、生长平衡培养物、GENEVA池和GENEVA培养物在说明书中可互换使用。在一些实施例中，生长速率确定测定是钙黄绿素-AM生长测定或细胞滴度Glo生长测定。在一些实施例中，生长速率通过钙黄绿素-AM生长测定和细胞滴度Glo生长测定的组合来确定。在一些实施例中，生长速率由公式(靶细胞数量/欧拉常数^(生长速率*生长天数))/细胞计数来确定。在一些实施例中，生长速率由细胞数量的倍数增加来确定。在一些实施例中，倍数增加由Nf/N0表示，其中Nf是培养时间段结束时的细胞数量，并且N0是培养时间段开始时的细胞数量。在一些实施例中，生长速率由r＝ln(Nf/N0)/t确定，其中“r”代表生长速率，“t”代表测定的时间，并且ln代表自然对数。在一些实施例中，包含在平衡细胞培养物中的细胞具有在0.01至0.8之间、在0.05至0.8之间、在0.07至0.7之间、在0.9至0.5之间或在0.1至0.4之间的生长速率。在一些实施例中，来自每种细胞类型的细胞以一定比率包含，使得来自每种细胞类型的表现与其细胞生长速率成反比。在一些实施例中，当靶细胞数量等于1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿时测量生长速率。在一些实施例中，当靶细胞数量等于1亿时测量生长速率。
在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于一。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于二。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于三。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于四。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于五。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于六。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于七。在一些实施例中，生长速率取自通过细胞生长测定确定的测量值，并且生长天数等于十。在一些实施例中，不同细胞类型包括具有癌症突变的细胞、来自一个或多个受试者的癌细胞、来自一个或多个受试者的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞、来自多种细胞系的细胞或它们的任意组合。在一些实施例中，不同细胞类型包括来自患有疾病的受试者的细胞。在一些实施例中，不同细胞类型包括来自一个或多个患有疾病的受试者的细胞。在一些实施例中，不同细胞类型包括来自疾病模型的细胞，例如类器官，例如异种移植物，例如患者来源的异种移植物。在一些实施例中，疾病是肿瘤疾病，例如癌症。在一些实施例中，癌症选自头、颈、肺、皮肤、乳腺、血液、淋巴、骨、软组织、脑、眼、生殖系统、循环系统、消化系统、内分泌系统、神经系统和泌尿系统的癌症中的一种或多种。在一些实施例中，细胞系是癌细胞系。在一些实施例中，癌细胞系可以包括但不限于H358、NCI-H23、H2122、H2030、SW1573、SK-LU-1、H441、CALU-1、H1792、H1373、H23、H358、H1299、H1975、SKMEL2、MEWO、SKMEL28、HTT144、A375、MIAPACA2或A54中的一种或多种。
在一些实施例中，将平衡细胞计数培养物植入模型系统中，例如体外模型系统、体内模型系统或离体模型系统。在一些实施例中，模型系统是2D体外系统。在一些实施例中，模型系统是3D体外模型系统。在一些实施例中，模型系统是3D支架系统。在一些实施例中，模型系统是离体模型系统，例如类器官。在一些实施例中，模型系统是体内模型系统，例如动物，例如哺乳动物，例如小鼠。在一些实施例中，将平衡细胞计数培养物植入单个小鼠体内。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物的植入在体内系统中产生镶嵌肿瘤(mosaictumor)。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物的植入在小鼠中产生镶嵌肿瘤。在实施例中，本公开提供了一种包含平衡细胞计数培养物的模型系统，其中平衡细胞计数培养物包含多种细胞类型。在一些实施例中，本公开提供了一种包含镶嵌肿瘤的模型系统，该镶嵌肿瘤包含多种细胞类型。在一些实施例中，多种细胞类型包括不同生理来源的细胞、来自不同受试者的细胞、来自不同生物体的细胞、来自相同生物体的不同组织的细胞、来自相同组织但来自不同生物体的细胞、来自来自不同受试者的不同组织或器官的细胞。在一些实施例中，不同类型的细胞包含至少一种彼此不同的单核苷酸多态性。在一些实施例中，不同类型的细胞包含癌症突变。在一些实施例中，细胞可以包含相同的癌症突变。在一些实施例中，细胞可以包含不同的癌症突变。在一些实施例中，突变包括以下中的一种或多种：KRAS.G12C、EML4-ALK、TH21、TP53、PIK3CA、PTEN、APC、VHL、KRAS、MLL3、MLL2、ARID1A、PBRM1、NAV3、EGFR、NF1、PIK3R1、CDKN2A、GATA3、RB1、NOTCH1、FBXW7、CTNNB1、DNMT3A、MAP3K1、FLT3、MALAT1、TSHZ3、KEAP1、CDH1、ARHGAP35、CTCF、NFE2L2、SETBP1、BAP1、NPM1、RUNX1、NRAS、IDH1、TBX3、MAP2K4、RPL22、STK11、CRIPAK、CEBPA、KDM6A、EPHA3、AKT1、STAG2、BRAF、AR、AJUBA、EPPK1、TSHZ2、PIK3CG、SOX9、ATM、CDKN1B、WT1、HGF、KDM5C、PRX、ERBB4、MTOR、TLR4、U2AF1、ARID5B、TET2、ATRX、MLL4、ELF3、BRCA1、LRRK2、POLQ、FOXA1、IDH2、CHEK2、KIT、HIST1H1C、SETD2、PDGFRA、EP300、FGFR2、CCND1、EPHB6、SMAD4、FOXA2、USP9X、BRCA2、NFE2L3、FGFR3、ASXL1、TGFBR2、SOX17、CDKN1A、B4GALT3、SF3B1、TAF1、PPP2R1A、CBFB、ATR、SIN3A、VEZF1、HIST1H2BD、EIF4A2、CDK12、PHF6、SMC1A、PTPN11、ACVR1B、MAPK8IP1、H3F3C、NSD1、TBL1XR1、EGR3、ACVR2A、MECOM、LIFR、SMC3、NCOR1、RPL5、SMAD2、SPOP、AXIN2、MIR142、RAD21、ERCC2、CDKN2C、EZH2、PCBP1突变。
在一个方面，本公开提供了一种制备具有至少两种或更多种不同细胞类型的平衡细胞计数培养物的方法，所述方法包括：
(a)确定两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的生长速率；
(b)组合两种或更多种不同细胞类型以创建细胞池，其中加入到细胞池中的两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的初始细胞计数基于步骤(a)的生长速率来确定；以及
(c)在一段时间内培养步骤(b)的细胞池以产生平衡细胞计数培养物，其中平衡细胞计数培养物的0.2体积％至10体积％的样品包含两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的至少500个细胞。
在一些实施例中，步骤(c)的样品包含5,000至200,000个细胞。在一些实施例中，步骤(c)的样品包含少于200,000、少于175,000、少于150,000、少于140,000、少于130,000、少于120,000、少于110,000或少于100,000个细胞。在一些实施例中，步骤(c)的样品包含两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的不少于500个活细胞。不同细胞类型包括具有癌症突变的细胞、来自一个或多个受试者的癌细胞、来自一个或多个受试者的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞、来自多种细胞系的细胞或它们的任意组合。在一些实施例中，不同细胞类型包括来自患有疾病的受试者的细胞。在一些实施例中，不同细胞类型包括来自一个或多个患有疾病的受试者的细胞。在一些实施例中，不同细胞类型包括来自疾病模型的细胞，例如类器官，例如异种移植物，例如患者来源的异种移植物。在一些实施例中，疾病是肿瘤疾病，例如癌症。在一些实施例中，癌症选自头、颈、肺、皮肤、乳腺、血液、淋巴、骨、软组织、脑、眼、生殖系统、循环系统、消化系统、内分泌系统、神经系统和泌尿系统的癌症中的一种或多种。在一些实施例中，步骤(c)的样品在该时间段结束时获取。在一些实施例中，步骤(c)的至少两个或更多个样品在该时间段期间的不同时间点获取。在一些实施例中，本公开提供了将来自权利要求33至55中任一项的步骤(c)的样品的细胞与来自步骤(c)的样品的步骤(b)的细胞池的两个或更多个细胞相关联的方法，执行步骤进一步包括：
(i)对来自样品的一种或多种细胞进行单细胞RNA测序，以鉴定来自样品的一种或多种细胞中的单核苷酸多态性，以及
(ii)将步骤(i)的单核苷酸多态性与步骤(b)中细胞池的两种或更多种细胞的单核苷酸多态性进行比较，从而将来自步骤(c)样品的细胞与步骤(b)的细胞池的两种或更多种细胞相关联。
在一些实施例中，在平衡细胞计数培养物中，两种不同细胞类型中的每种细胞类型用至少1×103个活细胞表示。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物中的至少两种不同细胞类型中没有一种细胞类型的数量超过其他细胞类型2个数量级或更多。在一些实施例中，在平衡细胞计数培养中，至少两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的总数量彼此在2个数量级内。
在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含2至500种不同细胞类型。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含2至500、5至400、6至300、8至200、10至100、10至50、2至30、2至25或10至30种不同细胞类型。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含2种或更多种、至少2种或更多种、至少3种或更多种、至少4种或更多种、至少5种或更多种、至少6种或更多种、至少7种或更多种、至少8种或更多种、至少9种或更多种、至少10种或更多种、至少11种或更多种、至少12种或更多种、至少13种或更多种、至少14种或更多种、至少15种或更多种、至少16种或更多种、至少17种或更多种、至少18种或更多种、至少19种或更多种、至少20种或更多种不同细胞类型。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100种不同细胞类型。
在一些实施例中，平衡细胞计数培养物被培养持续6小时至45天、12小时至40天、24小时至35天、72小时至30天、96小时至20天、120小时至15天的时间段。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物被培养持续72小时的时间段。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物被培养持续14天的时间段。在一些实施例中，平衡细胞计数培养物包含两种或更多种不同细胞类型，其中两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中细胞类型中的至少两种细胞类型包含彼此不同的癌症突变。在一些实施例中，本公开提供了一种在体内模型系统中产生包含至少两种或更多种不同细胞类型的镶嵌肿瘤的方法。在一些实施例中，通过植入包含两种或更多种来源于癌细胞系、癌组织和/或患有癌症的受试者的细胞的平衡细胞计数培养物并且将该平衡细胞计数培养物植入体内模型系统中来产生镶嵌肿瘤。在一些实施例中，体内模型系统是动物，例如哺乳动物，例如小鼠。
在一些实施例中，将平衡细胞计数培养物植入模型系统中，例如体外模型系统、体内模型系统或离体模型系统。
在一个方面，本公开提供了一种评估候选药剂对两种或更多种细胞类型的影响的方法，所述方法包括制备平衡细胞计数培养物；将平衡细胞计数培养物植入模型系统中；在一定的持续时间内用候选药剂处理模型系统；以及在该持续时间结束时评估平衡细胞计数培养物，以确定候选药剂对平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录影响。在一些实施例中，本公开提供了一种评估候选药剂针对镶嵌肿瘤的单独的细胞的治疗功效的方法。在一些实施例中，候选药剂的治疗功效通过以下来测量：用候选药剂治疗镶嵌肿瘤持续一定的持续时间，评估单独的细胞以确定镶嵌肿瘤的单独的细胞在该持续时间结束时的表型、遗传和转录组表达，并且通过将镶嵌肿瘤的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达与未用候选药剂治疗的相同镶嵌肿瘤的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达进行比较来确定候选药剂的治疗功效。
在一个方面，本公开提供了一种评估候选药剂对两种或更多种细胞类型的影响的方法，该方法包括制备平衡细胞计数培养物；将平衡细胞计数培养物植入模型系统中；在一定的持续时间内用候选药剂处理模型系统；以及在该持续时间结束时评估平衡细胞计数培养物，以确定候选药剂对平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录影响。在一些实施例中，本公开提供了一种在体内系统中同时评估候选药剂对多种细胞类型的影响的方法。在一些实施例中，本公开提供了一种在体外系统中同时评估候选药剂对多种细胞类型的影响的方法。在一些实施例中，本公开提供了一种在离体系统中同时评估候选药剂对多种细胞类型的影响的方法。在一些实施例中，该方法包括：制备平衡细胞计数培养物；将平衡细胞计数培养物植入模型系统中；在一定的持续时间内用候选药剂处理模型系统，评估单独的细胞以确定在该持续时间结束时多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达，以及通过将模型系统中多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达与未用候选药剂处理的相同模型系统的多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达进行比较来确定候选药剂的影响。
在一些实施例中，本公开提供了一种鉴定生物途径中的候选药剂靶标的方法，该方法包括：制备平衡细胞计数培养物；将平衡细胞计数培养物植入模型系统中；在一定的持续时间内用候选药剂处理模型系统，评估单独的细胞以确定在该持续时间结束时多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达，以及通过将模型系统中多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达与未用候选药剂处理的相同模型系统的多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达进行比较来鉴定候选药剂靶标。在一些实施例中，本公开提供了一种鉴定对候选药剂敏感的受试者亚群的方法。该方法包括：制备平衡细胞计数培养物；将平衡细胞计数培养物植入模型系统中；在一定的持续时间内用候选药剂处理模型系统，评估单独的细胞以确定在该持续时间结束时多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达，以及基于候选药剂对平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录组影响的评估来鉴定对候选药剂敏感的受试亚群。在一些实施例中，本公开提供了一种通过使用本文所述的方法确定来自受试者的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达来鉴定受试者亚群对药物产生抗性的时间点的方法。在一些实施例中，本公开提供了一种通过使用本文所述的方法确定来自受试者的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达来确定受试者亚群接受通过候选药剂的治疗性治疗的时间点的方法。在一些实施例中，本公开提供了一种通过使用本文所述的方法确定一种或多种治疗剂对来自受试者的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达的影响，并基于来自受试者的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达确定治疗方案，来确定来自受试者群体的个性化治疗方案的方法。
在一些实施例中，本公开提供了一种通过以下来鉴定联合疗法的功效的方法；制备平衡细胞计数培养物；将平衡细胞计数培养物植入模型系统中；在一定的持续时间内用两种或更多种候选药剂组合治疗模型系统，评估单独的细胞以确定在该持续时间结束时多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达，并且通过组合治疗对单独的细胞的作用来鉴定组合治疗的功效。在一些实施例中，该方法包括用第一候选药剂治疗和第二候选药剂治疗。在一些实施例中，用第一候选药剂和第二候选药剂的治疗是持续的。在一些实施例中，用第一候选药剂和第二候选药剂的治疗是连续的。在一些实施例中，该方法任选地包括用第三候选药剂治疗。
在一些实施例中，模型系统是体外模型系统、体内模型系统或离体模型系统。在一些实施例中，模型系统是2D体外系统。在一些实施例中，模型系统是3D体外模型系统。在一些实施例中，模型系统是3D支架系统。在一些实施例中，模型系统是离体模型系统，例如类器官。在一些实施例中，模型系统是体内模型系统，例如动物，例如哺乳动物，例如小鼠。
在一些实施例中，持续时间为约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约16小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约120小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约20天、约24天、约25天、约30天、约35天、约40天或约45天。在一些实施例中，治疗是间歇的。在一些实施例中，治疗是持续的。
在一些实施例中，候选药剂是可以引起治疗干扰的药剂。在一些实施例中，候选药剂选自小分子、抗体、肽、基因编辑体或核酸适体。在一些实施例中，小分子是KRAS.G12C抑制剂，例如ARS-1620、AMG510或MRTX849。在一些实施例中，候选药剂是生物途径的抑制剂。在一些实施例中，候选药剂是生物途径的激活剂。在实施例中，候选药剂选自ARS-1620、AMG510、Galunisertib、MRTX849、INK128和抗霉素中的一种或多种。
在一些实施例中，评估表型变化包括在持续时间结束时对两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的存活的单独的细胞的数量进行计数。在一些实施例中，评估转录组影响包括在持续时间结束时确定平衡细胞计数培养物中细胞的单细胞转录组谱。在一些实施例中，评估遗传影响包括在持续时间结束时对平衡细胞计数培养物中的细胞进行单细胞RNA测序。在一些实施例中，通过计算由候选药剂处理的平衡细胞计数培养物的单独的细胞的基因表达，并将该基因表达与未用候选药剂处理的相同平衡细胞计数培养物的单独的细胞的基因表达进行比较，来评估候选药剂对平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响。在一些实施例中，通过确定用候选药剂处理的平衡细胞计数培养物的单独的细胞的转录组表达，并将该转录组表达与未用候选药剂处理的相同平衡细胞计数培养物的单独的细胞的基因表达进行比较，来评估候选药剂对平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响。在一些实施例中，通过对在用候选药剂处理的平衡细胞计数培养物中两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的存活的单独的细胞的数量进行计数，并且与在未用候选药剂处理的相同平衡细胞计数培养物中两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的存活的单独的细胞的数量进行比较，来评估候选药剂对平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响。在一些实施例中，评估包括确定遗传影响、表型影响和转录组影响中的一个或多个。
计算机可读介质和系统
本公开的方面还包括计算机可读介质和系统。该计算机可读介质和系统在各种环境中找到用途，包括但不限于在实践本公开的方法中找到用途。
在某些方面，提供了一种或多种非暂时性计算机可读介质，其包括存储在其上的指令。当由一个或多个处理器执行时，该指令使一个或多个处理器将单细胞RNA测序数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组。单细胞RNA测序数据是通过对来自用小分子化合物处理的不同细胞类型的三维池(例如异种移植物、类器官等)的解离的单细胞以及对来自未用小分子化合物处理的不同细胞类型的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞RNA测序而产生的。当由一个或多个处理器执行时，该指令进一步使一个或多个处理器基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质。
在某些实施例中，该指令使一个或多个处理器基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质，其中一种或多种治疗性质包括小分子化合物与药物联合疗法的候选资格。根据一些实施例，该指令使一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，计算每个细胞系的药物诱导的基因表达变化，基于每个细胞系的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分，并且基于加权评分高于错误发现率的基因来预测组合疗法靶标，其中与药物敏感性反相关的基因预测耐药性，因此代表用于组合靶向的候选靶标。
根据一些实施例，该指令使一个或多个处理器基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质，其中一种或多种治疗性质包括小分子化合物的作用机制。在某些实施例中，该指令使一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，确定每个细胞系的药物诱导的基因表达变化，聚集药物敏感细胞系中确定的药物诱导的基因表达变化，基于聚集的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分，将与聚集的药物敏感性相关的基因识别为加权评分高于错误发现率的基因，并且基于与聚集的药物敏感性相关的基因来预测化合物的作用机制。
在某些实施例中，该指令使一个或多个处理器基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质，其中一种或多种治疗性质包括小分子化合物用于治疗疾病亚型的候选资格。根据一些实施例，该指令使一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，聚集细胞系中的药物敏感性，其中通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，其中每个细胞系通过其基因突变和/或转录组特征来分类。该指令使一个或多个处理器使用变量选择回归算法为每个突变和/或转录组特征分配预测与聚集的药物敏感性相关性的评分，并且基于评分高于假发现率的疾病亚型来预测所述化合物在所述疾病亚型中的功效。在某些实施例中，变量选择回归算法是加权的lasso回归算法。
在某些方面，提供了用于评估小分子化合物的一种或多种治疗性质的系统。此类系统包括一个或多个处理器和一个或多个包括存储在其上的指令的非暂时性计算机可读介质。当由一个或多个处理器执行时，该指令使一个或多个处理器将单细胞RNA测序数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组。单细胞RNA测序数据是通过对来自用小分子化合物处理的不同细胞类型的三维池(例如异种移植物、类器官等)的解离的单细胞以及对来自未用小分子化合物处理的不同细胞类型的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞RNA测序而产生的。当由一个或多个处理器执行时，该指令进一步使一个或多个处理器基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质。
在某些实施例中，本公开的系统的一个或多个计算机可读介质的指令使一个或多个处理器基于分类的单细胞转录组来评估小分子化合物的一种或多种治疗性质，其中一种或多种治疗性质包括小分子化合物用于与药物联合疗法的候选资格、小分子化合物的作用机制、小分子化合物用于治疗疾病亚型的候选资格或它们的任意组合。用于执行这些和其他类型的评估的此类非暂时性计算机可读介质的指令的实例在上文中进行了描述，并且为了简洁的目的在此处不再重复。
可以采用各种基于处理器的系统来实施本公开的实施例。此类系统可以包括系统架构，其中系统的部件使用总线彼此电通信。系统架构可以包括以不同方式耦合到系统总线的处理单元(CPU或处理器)以及高速缓存。总线将包括系统存储器(例如，只读存储器(ROM)和随机存取存储器(RAM))在内的各种系统部件耦合到处理器。
系统架构可以包括高速存储器的高速缓存，该高速存储器直接与处理器相连、紧邻处理器或被集成为处理器的一部分。系统架构可以将数据从存储器和/或存储设备复制到高速缓存以供处理器快速访问。以这种方式，高速缓存可以提供性能提升，其避免在等待数据时出现处理器延迟。这些模块和其他模块可以控制或被配置为控制处理器执行各种动作。也可以使用其他系统存储器。存储器可以包括具有不同性能特征的多种不同类型的存储器。处理器可以包括任何通用处理器和硬件模块或软件模块，例如存储在存储设备中的被配置为控制处理器的第一模块、第二模块和第三模块；以及专用处理器，其中软件指令被并入到实际的处理器设计中。处理器本质上可以是完全独立的计算系统(completelyself-contained computing system)，包含多个内核或处理器、总线、存储器控制器、高速缓存等。多核处理器可以是对称的或非对称的。
为了使用户能够与计算系统架构交互，输入设备可以表示任何数量的输入机制，例如用于语音的麦克风、用于手势或图形输入的触摸屏、键盘、鼠标、运动输入、语音等。输出设备也可以是多个输出机构中的一个或多个。在一些情况下，多模态系统可以使用户能够提供多种类型的输入来与计算系统架构通信。通信接口通常可以控制和管理用户输入和系统输出。对在任何特定硬件布置上的操作没有限制，因此，随着硬件或固件布置的发展，本文中的基本特征可以很容易地被改进的硬件或固件配置替换。
存储设备通常是非易失性存储器，并且可以是硬盘或其他类型的可以存储由计算机可访问的数据的计算机可读介质，例如磁带盒、闪速存储卡、固态存储设备、数字多功能盘、盒式磁带、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)及其混合。
存储设备可以包括用于控制处理器的软件模块。也预期了其他硬件或软件模块。存储设备可以连接到系统总线。在一个方面，执行特定功能的硬件模块可以包括存储在计算机可读介质中的软件部件以及必要的硬件部件，例如处理器、总线、输出设备等，以执行所公开的技术的各种功能。
本公开的范围内的实施例还可以包括有形的和/或非暂时性计算机可读存储介质或设备，用于承载或具有存储在其上的计算机可执行指令或数据结构。此类有形的计算机可读存储设备可以是可以由通用或专用计算机访问的任何可用设备，包括如上所述的任何专用处理器的功能设计。作为实例而非限制，此类有形的计算机可读设备可以包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其他光盘存储设备、磁盘存储设备或其他磁存储设备，或者可以用于承载或存储计算机可执行指令、数据结构或处理器芯片设计形式的所需程序代码的任何其他设备。当信息或指令经由网络或另一通信连接(硬连线、无线或其组合)提供给计算机时，计算机适当地将该连接视为计算机可读介质。因此，任何此类连接都被适当地称为计算机可读介质。上述的组合也应当被包括在计算机可读存储设备的范围内。
计算机可执行指令包括例如使通用计算机、专用计算机或专用处理设备执行特定功能或功能组的指令和数据。计算机可执行指令还包括在单机或网络环境中由计算机执行的程序模块。通常，程序模块包括例程、程序、部件、数据结构、对象和执行任务或实现抽象数据类型的专用处理器的设计中固有的功能等。计算机可执行指令、相关数据结构和程序模块代表了用于执行本文中公开的方法的步骤的程序代码装置的实例。此类可执行指令或相关数据结构的特定序列代表了用于实现此类步骤中描述的功能的相应动作的实例。
本公开的其他实施例可以在具有多种类型的计算机系统配置的网络计算环境中实施，该计算机系统配置包括个人计算机、手持设备、多处理器系统、基于微处理器的或可编程的消费电子设备、网络PC、小型计算机、大型计算机等。实施例也可以在分布式计算环境中实施，其中任务由通过通信网络链接(通过硬连线链接、无线链接或其组合)的本地处理设备和远程处理设备执行。在分布式计算环境中，程序模块可以位于本地处理设备和远程存储器存储设备中。
以下实例是通过说明而非限制的方式提供的。
实验的
实例1–3D异质细胞池的创建
该实例涉及3D异质细胞池的创建。为了创建在长的生长持续时间之后收获时会产生相等数量的细胞的异质细胞系的池，使用了来自不同人的十一个人类细胞系的池。创建池，其中对于每个细胞系，在汇集时的细胞数量是相等的。然后使细胞在细胞培养物中进行七天的生长过程。在七天后，收获池，并且在10X Chromium平台上进行单细胞RNA测序，以获得单细胞RNA测序Illumina片段文库。在Illumina仪器上对文库进行测序，并且将读数进行比对以获得单细胞基因表达谱。使用去多重化软件，单细胞数据包随后被解析为其来源患者(demuxlet，freemuxlet)。经确定，超过90％的单细胞来自细胞系A375，而其他十个细胞系占剩余细胞计数的<10％。由于较少/有限数量的细胞，无法获得若干种细胞系(特别是H358、H1975、A549、H1299、SKMEL2和SKMEL28)的准确转录组状态(图1A至图1B)。
实例2–生长速率平衡的3D异质细胞池(GENEVA)的创建
该实例涉及生长速率平衡的3D异质细胞池的创建。在将每个细胞系(H23、H358、H1299、H1975、SKMEL2、MEWO、SKMEL28、HTT144、A375、MIAPACA2、A549)的细胞加入到池中之前，使用细胞生长速率测定来单独地测量包括池的细胞系的生长速率。使用这些生长速率，然后在汇集时以i)与如通过生长测定确定的细胞系的生长速率成反比和ii)与纵向生长的天数成比例的比率来平衡细胞数量。在汇集、生长、收获和单细胞RNA测序和分析之后，与实例1中获得的池相比，以这种方式平衡的细胞系的池在不同细胞系之间产生了更均匀的细胞类型分布，并且允许来自池中包括的所有细胞系的准确单细胞转录组谱(图2A至图2B)。为了验证通过反向平衡生长速率创建的池能够创建更均匀平衡的池，在保留基于时间的反向生长速率平衡方法的同时，对组成池的不同细胞系进行了实验(H358、NCI-H23、H2122、H2030、SW1573、SK-LU-1、H441、CALU-1、H1792、H1373)。发现该第三个池也能够在不同细胞系中产生更均匀分布的细胞数量，从而允许在长时间的池生长之后对表达谱进行准确的转录推断(图3A至图3B)。
这些具有反向生长速率和时间平衡的实验表明，测量生长速率并遵循严格的平衡方法以创建能够生长并在规定的收获时间均匀分布的细胞池是至关重要的。从这些池中取样的小样品(<100,000个细胞样品)包含来自所有来源的细胞系的代表，而对于不是通过生长速率反向平衡创建的池，需要百万个细胞样品包含来自所有来源的细胞系的代表(图1G)。
用于确定GENEVA纳入标准的生长速率测量
贴壁细胞系在解冻后在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI中繁殖两代。然后使用胰蛋白酶(0.25％)将细胞系解离成单细胞悬浮液。然后使用电子细胞计数仪获得细胞计数，并且将每个细胞系的5,000个细胞分别接种到两个相同的96孔板的孔中。接种两小时后，在2小时时使用来自Promega的细胞滴定辉光(CTG)试剂测定一个板的细胞活力。简而言之，通过倾析除去96孔测定板中的培养基，并且将50μL的CTG试剂直接加入到含有细胞的板中。在37℃下温育30分钟后，然后在96孔兼容光度计上在100V下读取板以测量细胞活力。在RPMI 10％ FBS中生长72小时后，通过倾析除去培养基，并且将50μL的CTG试剂直接加入到含有细胞的板中。在37℃下温育30分钟后，在96孔兼容光度计上在100V下读取板以测量细胞活力。为了测量生长速率，将在72小时时的原始发光信号除以在2小时时的发光信号。该比率估计为细胞数量的倍数增加，以下称为Nf/N0。然后使用公式r＝ln(Nf/N0)/t来计算每个细胞系的生长速率，其中“r”表示增长率，“t”表示测定的时间，并且ln表示自然对数。以这种方式确定组成池的所有细胞系的生长速率，并且仅生长速率大于0.1且小于0.4的细胞被确定为包含在GENEVA池中的可行候选物。在GENEVA池中，生长速率超出这些参数的细胞系被排除在进一步考虑之外。
根据反向生长速率和时间比率创建GENEVA细胞池
然后通过包括来自每种细胞类型的细胞来创建池，使得来自每种细胞类型的代表与其细胞生长速率成反比。获取细胞计数并进行以下计算以确定接种到GENEVA池中的细胞悬浮液的体积：
(靶细胞数量/欧拉常数^(生长速率*生长天数)/细胞计数
在靶细胞数量等于一亿的情况下，生长速率由通过细胞生长测定确定的测量值获得，并且生长天数等于七。使用该公式，计算加入到GENEVA细胞池中的细胞数量，并且将细胞合并成单一悬浮液。然后细胞在RPMI，10％FBS中的细胞培养物中生长七天。通过用0.25％胰蛋白酶解离成单细胞悬浮液来收获细胞。在估计细胞存活力并将细胞稀释至2000个细胞/μL后，单细胞然后被装载有如在“10X Chromium v3.0”方案中规定的“GEM生成试剂”。单细胞悬浮液的进一步加工如10X Chromium方法中所述进行。进行Illumina测序以获得每个细胞25,000个读数。
生成单核苷酸参考组，用于对来源患者的单细胞进行去卷积
如上所述，将被确定为对GENEVA池有活力的细胞系单独接种到6孔细胞培养板中用于生长，如下所示：使用胰蛋白酶(0.25％)将细胞系解离成单细胞悬浮液。然后使用电子细胞计数仪器获得细胞计数，并且将每个细胞系的200,000个细胞单独接种到6孔细胞培养板的孔中。然后加入2mL的培养基以用作生长培养基。在生长两天后，通过倾析培养基并向细胞中直接加入400uL的Trizol RNA提取试剂，收获6孔板用于RNA提取。使用ThermoFisherTrizol RNA提取方法提取RNA。然后将使用该程序提取的RNA转移到不含RNAse的微量离心管中，并且通过将2uL的RNA溶液等分到纳米微滴仪器上来测定纯度。使用来自Lexogen的“Quantseq”试剂盒制备Illumina兼容的DNA文库，并且在Illumina仪器上进行测序。
来自GENEVA合适的细胞系的汇集的遗传特征数据生成
然后，将被确定为对GENEVA池具有活力的细胞系制备成均匀分布的细胞系的池混合物，用于GENEVA汇集的遗传特征数据生成：使用胰蛋白酶(0.25％)将细胞系解离成单细胞悬浮液。然后使用电子细胞计数仪器获得细胞计数，并且在4摄氏度(4C)下将每个细胞系的500,000个细胞单独接种到一个50mL的锥形管中，该锥形管含有5mL的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在将所有细胞系加入到汇集的GENEVA细胞系的管中之后，在4℃下以400g离心10分钟。倾析上清液，并且用5mL 1X PBS重悬细胞沉淀物。细胞再次在4℃下以400g离心10分钟，并且倾析上清液并用2.5mL 1X PBS重悬沉淀物。细胞再次在4℃下以400g离心10分钟，并且倾析上清液并用0.5mL 1X PBS重悬沉淀物，并且使所得的溶液通过45微米过滤管过滤，以获得不含污染性胰蛋白酶和胎牛血清的汇集的细胞系的单细胞悬浮液。然后使用自动细胞计数器对该溶液进行计数，并且稀释至2000个细胞/μL。还通过用1:1的台盼蓝、1X PBS:GENEVA池、1X PBS获得计数来进行活细胞估计。如果池的存活力大于85％，则允许进行单细胞RNA测序制备。在估计细胞存活力并将细胞稀释至2000细胞/μL后，单细胞然后被装载有如“10X Chromium v3.0”方案中规定的“GEM生成试剂”，并且将所得的Illumina文库测序至每个细胞25,000个读数的深度。
通过整合i)单独的细胞系遗传特征数据集和ii)汇集的GENEVA遗传特征数据集来 创建GENEVA相关单核苷酸多态性列表
首先对来自单核苷酸参考组的测序数据进行计算解构，以从RNA测序数据中获得清晰的单核苷酸多态性调用。测序文件(fastq格式)在每次读取的基础上进行修剪，以去除多腺苷酸化和Truseq Illumina测序衔接子污染，使用“bwa”全基因组比对工具进行比对，使用“samtools”工具进行分类和格式化，并且使用“umi_tools”工具通过独特的分子标识符进行重复数据删除。现在已清除序列伪影并与基因组位置完全比对的单独的读数然后使用工具“samtools mpileup”按位置堆叠，然后转换为bcf，最后使用“bcftools”和“vcf-merge”工具转换为单一合并的vcf数据结构格式。对来自第1.d节(上文)的测序数据进行计算解构，以获得来自单细胞转录组的全基因组比对数据。使用来自10X Genomics的“cellranger”工具将测序文件(fastq格式)处理为比对的“.bam”格式。所得的“.bam”文件然后与单独的细胞系vcf文件一起用于下游数据整合。包含来自单独的细胞系的所有检测的SNP突变(第1.d.i节)的合并的“.vcf”文件以及包含来自由使用单细胞RNA测序方法产生的那些相同系形成的GENEVA池的所有SNP突变的“.bam”文件被用作用于数据整合的输入，用于选择和过滤相关SNP，这些相关SNP用于通过SNP的下游GENEVA去多重化。进行数据整合，目的是去除计算上无信息的SNP，这些SNP会阻止来自GENEVA池的单细胞进行准确的基因分型，使其回到其来源的细胞系。合并的“.vcf”文件与“.bam”文件相交，其中过滤标准为每个基因座>250个读数，以允许使用“bedtools相交”工具在两个数据集之间仅进行高置信度读数映射。然后使用递归算法对这些SNP进行进一步过滤，该递归算法整合了工具“demuxlet”作为衡量vcf算法改进的方式。该算法从合并的vcf文件中单独删除了每个SNP，以生成减去数据的“.vcf”文件作为测试对象。然后，将该减去数据的“.vcf”文件与“.bam”文件结合使用，以运行demuxlet，该demuxlet提供了相对单线态比率，一种通过SNP保真度进行去多重化的度量。通过通过SNP保真度迭代测试单个SNP对整体去多重化的个体贡献，得出了有限的高质量SNP列表，并且将其用作高质量参考SNP，用于下游去多重化和使用该特定GENEVA池的进一步GENEVA实验。
实例3–对非生长平衡的和生长平衡的3D异质细胞池进行长持续时间池生长和药 物治疗的能力的比较
该实例针对生长池超过72小时，同时用药物化合物对其进行处理，以允许了解药物对细胞的长期影响。
使用14天的长期治疗持续时间，如实例2中所述，通过在以下等式中将“生长天数”变量设置为等于十四来平衡池：
(靶细胞密度/欧拉常数^(生长速率*生长天数)/细胞计数
建立了移植到各种模型系统中的异种细胞池。处理的池的小样品(总细胞的约1％)含有足够的来自所有来源细胞的细胞，以准确地评估药物在十四天的处理中对该细胞系的影响(图1C、图1D、图1E、图1F)。相反，非生长平衡的异质3D细胞池中，90％的细胞来自一种细胞类型(图1A、图1B)。
实例4–使用GENEVA细胞池创建体内或离体3D模型系统
该实例旨在评估使用药物治疗剂的长期治疗对复杂模型系统(如体内小鼠模型和体外3D模型系统)的影响。
使用针对长期药物治疗进行调整的生长速率平衡的异质细胞池，从四种人类患者来源的异种移植物(PDX)模型中创建池，并且作为汇集的肿瘤植入侧翼异种移植小鼠模型中。通过用分子ARS-1620通过管饲法口服给药十四天，在小鼠中给药汇合的肿瘤。在治疗间隔后，从小鼠收获肿瘤，并且进行单细胞RNA测序、遗传去多重化(如实例2所示)和使用条形码抗体的样品哈希。从每个PDX遗传背景和药物治疗条件中观察到足够数量的细胞(图2C，图2D)，用于推断转录组的药物表型和药物变化。创建来自四个PDX模型的池，用于在3D类器官模型系统中进行十四天药物治疗的植入。细胞池用三种增加剂量的ARS-1620(0.4μM、1.6μM、25.0μM)和一种媒介物条件处理十四天。在治疗间隔后，收获来自3D类器官的肿瘤，并且进行单细胞RNA测序、遗传去多重化和样品哈希。在类器官模型中，从每个PDX遗传背景和药物治疗条件中观察到足够数量的细胞(图2A，图2B)。使用人类细胞系进一步创建池，用于使用上述方法植入体内侧翼异种移植小鼠模型中。
3D类器官GENEVA模型的植入、给药和收获
将5mL的Matrigel Basement膜试剂加入到通过生长速率平衡制备的GENEVA池中，最终浓度为5M/mL。将五十微升的该溶液转移到6孔板中，并且在37℃下温育30分钟。将类器官培养基(高级DMEM/F12基础培养基、1X N-2、1X B-27、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1XPen-Strep、500ng/mL FGF10、1％ FBS)添加到细胞上用于过夜回收。十六小时后，类器官给药有稀释在类器官培养基中的药物化合物。类器官在药物培养基中生长十四天，其中每72小时加入新鲜的药物化合物培养基。在第十四天，通过手动解离收获类器官，并且重悬浮于在1:1DMEM:F12细胞培养基、DNAse I(10U/uL)中的10mg/mL Liberase TM细胞解离试剂中。将类器官在37℃培养箱中在以600RPM摇动的情况下温育45分钟以用于酶促解离，然后在4℃下以800g旋转5分钟。解离的类器官重悬于100μL 1X PBS中。
体内GENEVA模型的植入、给药和收获
将2mL的Matrigel Basement膜试剂加入到通过生长速率平衡制备的GENEVA池中，最终浓度为20M/mL。将一百微升的该溶液以侧腹异种移植物注射液注射到NSG小鼠中。二十四小时后，具有GENEVA肿瘤的小鼠给药含有5％ DMSO和95％ Labrasol的媒介物溶液中的药物化合物。小鼠通过口服管饲给药四至十四天，其中五天给药，两天停药。在第十四天，处死小鼠，通过用外科剪刀匀浆来收获肿瘤，并且重悬于1:1DMEM:F12细胞培养基、DNAse I(10U/μL)中的5mg/mL Liberase TM细胞解离试剂中。将肿瘤在37℃培养箱中在以600RPM振荡的情况下温育45分钟以用于酶促解离，然后在4℃下以800g旋转5分钟。将解离的肿瘤重悬于100μL 1X PBS中。
实例5-通过单RNA测序和转录组分析鉴定细胞来源
该实例旨在将单个细胞分配给它们的患者或来源的细胞系。使用来自GENEVA实验的数据，获得了与GENEVA汇集的mRNA文库对应的fastq测序文件和具有已知基因型的个体产生的参考VCF文件。使用工具freemuxlet和demuxlet(github.com/statgen/popscle)对GENEVA mRNA文库进行去卷积。采用共识方法来匹配被freemuxlet称为独特个体的聚类和来自demuxlet方法的已知群体。这种单独的遗传学方法然后与转录组信息相结合。使用GENEVA mRNA文库数据对细胞进行聚类，并且称为大于或等于十的leiden稀疏因子(leidensparsity因子)的聚类。然后在每个转录组定义的leiden聚类和每个单独遗传学群体之间分配最大似然匹配，以获得每个转录组聚类的百分比频率表示。实施>70％的截断以获得在转录组和遗传学之间具有高准确性的聚类，并去除低于该阈值的聚类。
通过遗传学的去卷积
基于基于单细胞RNA的单核苷酸多态性调用对单细胞进行去卷积。使用固定在用作实验输入的细胞类型的数量的聚类编号来运行Freemuxlet。获得了VCF文件，该文件代表了如由freemuxlet确定的分配给每组遗传上不同的细胞的SNP。然后使用从单系基因分型产生的参考VCF运行Demuxlet。然后使用最大似然法在用于demuxlet的VCF文件和VCF文件之间交叉SNP，将每个未知的freemuxlet聚类分配给来自demuxlet VCF文件的已知参考细胞系，以获得通过基因型的最终聚类分配。
转录组信息与通过遗传学的去卷积的整合
来自mRNA读数的单细胞RNA测序格式化基因计数矩阵数据被由通过遗传学的去卷积分配的单细胞基因型调用覆盖。在不知道这些单细胞基因型调用的情况下，过度聚类是在leiden稀疏因子大于十时进行的，或者通过分配leiden因子以根据以下公式产生聚类总数来进行：
聚类数量＝10*池中细胞类型的数量l
使用基于转录组和基于遗传学的调用的自定义整合功能，获得了基于两种数据源分配的细胞类型的最终列表。对于每个leiden聚类，计算该聚类内属于特定SNP确定的基因型的细胞的百分比。如果来自该聚类的细胞属于大于70％的一种SNP确定的基因型，则通过遗传方法和转录组方法将该聚类标记为高置信度，并且将用于该聚类的基因型分配改变为代表大于所有细胞的70％的群体。具有<70％置信度的所有其他聚类被标记为低置信度数据点用于删除，这些数据点在遗传和转录组分配之间不协调。
实例五的代表性代码:
/>
实例6–使用样品哈希抗体的噪声校正的算法来识别实验样品来源
该实例针对使用噪声校正的样品哈希算法将单细胞分配给它们的原始样品。根据抗体标记(来自Biolegend的Totalseq)子文库数据，使用自定义基线读取调整算法对单细胞进行去多重化。每个细胞都被映射到其来源的细胞池(或者等同地映射到处理它的药物)。开发了与每个细胞分配相关的置信度度量，并且将样品来源识别的准确度提高到大于90％，并且准确度相对于最大读数分配的标准方法有所提高(图9A)。
自定义基线读取调整算法
本文所述的步骤概述了自定义基线读取调整算法的工作原理。从10X GenomicsCellrangerPipeline获得了作为白名单的单细胞RNA测序条形码标识符。生成的表格列出了抗体哈希序列和与这些哈希相关的相应样品。我们读取原始fastq数据，并且从原始读数中剥离恒定序列，以分离单独的scRNAseq条形码区域和单独的抗体标记条形码区域。条形码从scRNAseq条形码读数更正为1的汉明距离内的单细胞白名单。条形码从抗体标签条形码读数更正为汉明距离为1的抗体哈希序列。读取通过汉明后校正条形码进行过滤，以与两个白名单完全匹配。然后通过中位基线读取调整算法来分配条形码。对于每个抗体哈希，根据以下公式来计算要减去的背景噪声:
中位校正因子*中位读数每抗体
其中，为了获得最佳性能，中位校正因子通常为约1.6。对于每个细胞，减去作为特定抗体哈希的背景计算的读数的数量，以获得原始读数的自定义每抗体去噪数据集。对于每个细胞，计算来自每个抗体哈希的读数的百分比。我们返回了单细胞条形码的最终列表及其相应的最高概率抗体哈希和相应的置信区间值。置信区间通过获取来自最佳标识符的读取的百分比，并且减去来自次佳标识符的读取的百分比来计算。来自每个细胞的最高评分抗体哈希被指定为最佳标识符。移除置信区间<＝0.4的细胞。
用于实例6的代表性代码
/>
/>
实例7–使用GENEVA确定对候选药剂敏感性的遗传驱动因子
该实例旨在通过同时推断来自GENEVA细胞池的表型来发现对药物化合物敏感性的遗传驱动因子。建立长持续时间生长平衡细胞池并且进行药物治疗。在使用如实例5中所述的方法和如实例6中所述的样品哈希去多重化向起源患者和药物治疗条件进行分配之后，如图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F所示，在每种药物治疗条件下获得具有离散数量的细胞的数据集。对每种细胞类型在每种药物治疗条件下剩余的活细胞的相对数量进行计数，并且将该药物敏感性信息用作线性模型的响应变量。获得了所有细胞系的完整外显子组遗传突变数据，并且将这些特征用作线性模型回归的解释性变量。应用Lasso特征选择模型来确定哪些基因突变导致了对不同化合物的药物敏感性。靶向具有特定基因突变的细胞系的已知化合物用于概念验证实验，特别是靶向具有BRAF.V600E突变的细胞的维罗非尼(VEM)或靶向具有KRAS.G12C突变的细胞的ARS-1620(ARS)。使用Lasso模型的回归正确地预测了维罗非尼和ARS-1620的突变，该突变使对该化合物的敏感性倾向于与关于这些化合物的现有知识一致(图3B，图3C)。使用若干个剂量的ARS1620，在一个汇集的实验中产生了足够的信息，以生成多种细胞类型的存活曲线(图3D)，相当于同时的IC50测量结果。将这些相对敏感性在细胞系中进行比较，以对ARS1620或多或少敏感的细胞系进行排序(图3E)。
来自GENEVA测定的转录组数据也用于确定药物表型。在体内系统和离体系统两者中使用ARS-1620进行药物治疗后，通过估计细胞周期抑制率(图3F)，具有已知KRAS.G12C突变的患者来源的异种移植物显示出对该化合物敏感(患者877和233)。在该PDX背景下，数据集还允许我们推断敏感驱动因子突变(KRAS.G12C)。。
计算细胞类型针对药物的适合度
根据原始细胞类型对每种药物条件下的细胞的数量进行计数。然后将这些原始数量用作基于归一化的函数的输入，该函数针对药物治疗条件之间的总细胞数量的差异进行调整，并且根据以下公式返回每种细胞类型的经调整的适合度计算：
对于每种细胞类型Ci，对于每种药物和媒介物分别为Dx和D0，并且给出具有以下数据结构的细胞计数的矩阵：
/>
基于比例表示的细胞类型Ci对药物Dx的适合度被计算如下：
F(Ci,Dx)＝((#细胞Dx,Ci)/SUM(#细胞Dx))/(#细胞D0,Ci)/SUM(#细胞D0))
还根据相对样品归一化，基于数据集大小，通过计算调整因子来调整样品，以考虑可能逃脱比例计算的总细胞数差异：
对于每种药物或媒介物Dx，在每种条件下对细胞的总数进行计数，计算总细胞计数的几何平均值，并且将每种条件下的细胞总数除以细胞计数的几何平均值，以获得归一化比率。以下矩阵除以每种条件Dx的相应归一化，以获得根据基于几何平均比率的校正针对数据集大小调整的细胞计数的最终校正矩阵。
对于这些适合度计算中的每一个，相对适合度被计算如下：
细胞系的适合度Y＝
(细胞系的适合度Y)/(池内所有细胞系之间的最大适合度)
用于发现药物敏感性的基因型驱动因子的Lasso回归
下载来源于每种细胞类型的全外显子组数据测序数据的突变，并且对最少两种不同细胞类型的交叉进行分类。然后将这些数据格式化为因变量表，其适合输入到lasso回归算法中用于特征选择。以成对的方式，还计算了每个细胞系的适合度，并且将其格式化为lasso算法的响应变量。然后用0.05和0.30之间的α值以50个间隔步长进行lasso回归，以找到预测GENEVA细胞响应的最相关突变。评分最高的解释性变量基因突变按其协变量排序，并且被指定为药物敏感性的驱动因子。
基于ARS-1620多剂量曲线上的GENEVA表型重建的IC50曲线
细胞计数是在不同的药物治疗条件下获得的，特别是在不同的药物浓度下获得。在收获时，这些数字被注释并且用于计算每种细胞类型的绝对细胞数。公式如下:
药物条件下细胞类型Cy细胞的绝对数量，Dx＝
(Dx中Cy的计数的细胞的数量)/
(Dx中计数的细胞总数)*
在收获时从注释中计数的细胞的数量
然后将这些数字用作逻辑回归拟合的输入，并且从多次给药细胞计数中内插IC50曲线。
确定细胞周期抑制率作为以表型读数的细胞计数的替代指标
通过回归整个转录组读数并根据与不同细胞周期状态相关的特定感兴趣基因进行加权来计算细胞周期。细胞被分为G1、S和G2/M。然后计算细胞周期比率作为每个群体细胞的分数：
(G2M的细胞数)/(细胞总数)
然后，将这些比率绘制成它们所经历的实验剂量方案的线性函数，在这种情况下是ARS-1620(uM)的剂量曲线。该函数与以下各项的线性拟合：
x＝ARS-1620(uM)
y＝(G2M的细胞数)/(细胞总数)
创建了一个函数，其中斜率被确定为细胞周期抑制率，反映了测量仅来自在长期过程中的转录组药物扰动数据的表型的替代方法。
用于实例7的代表性代码
/>
/>
实例8–使用GENEVA鉴定长期药物治疗中候选药剂的线粒体作用机制
本实例旨在通过使用GENEVA下调线粒体基因来鉴定化合物ARS1620的分子作用机制。
创建了长期过程GENEVA池，以了解ARS1620如何在人类细胞中实现持久的肿瘤消退。进行七天的药物治疗方案并且分析存活细胞中的转录组变化。线粒体编码的基因下调表明ARS1620对线粒体的影响(图6A至图6B)。作为验证的在ARS1620下长期处理的实验系的产生表明在长期ARS1620处理后线粒体被显著消融(图6C)。使用细胞呼吸测定，由于ARS1620处理，还检测到在线粒体部位处的功能性氧消耗量的显著差异(图6D)。对构成GENEVA池的每个细胞系内的细胞亚群组成的分析显示，在用ARS1620药物处理后，存活的细胞显示出相对于总读数的线粒体读数百分比显著降低，表明线粒体基因表达下调的细胞的群体水平的选择压力(图6E)。
用于因果基因集发现的药物和非药物条件之间每个细胞系的差异表达
对于每个细胞系，单细胞数据集被分成两个子数据集：媒介物处理的和药物处理的。使用双样品t检验来计算两个单细胞数据集之间的差异表达。从双样品t检验输出中获得每个基因的差异表达评分。重复所有细胞系直到完成，并且将基因的所有差异表达评分按细胞系保存到聚集的差异表达表中。根据细胞对测试化合物的表型敏感性对细胞进行分组。对于测试的化合物，如本文前面所述发现了化合物敏感性的遗传驱动因子。使用遗传驱动因子，根据驱动因子的存在或不存在将细胞系分为两个类别，敏感的与非敏感的。差异表达矩阵被分组为敏感细胞系和不敏感细胞系。计算每个细胞系中基因的z评分，根据来自从科学文献筛选的生物基因集数据库的基因集对基因进行分组，并且使用分组的z评分进行两次样品T检验。首先，通过每个细胞系内的z评分将所有差异表达评分归一化为相同的尺度。为差异表达矩阵中的所有基因，创建了取自每个mSIGDB数据库的分组字典(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)。对于来自mSIGDB的基因的每个分组，对每个基因集分别进行两次样品T检验，将所有“敏感”和“不敏感”细胞系作为复制品处理。保存来自每次基因测试的汇总统计数据，并且计算z评分差异。感兴趣分子的生物学作用机制通过对来自每个基因组的中值z评分结果进行排序来确定，以确定基因集响应于化合物的相对上调或下调。
用于实例8的代表性代码
/>
实例9–使用GENEVA鉴定候选药剂在诱导铁死亡中的作用机制
本实例旨在使用GENEVA细胞池通过铁蛋白基因上调来鉴定化合物ARS1620的分子作用机制。
在长期ARS1620治疗后存活的细胞池中KRAS.G12C细胞系分析上调的基因。发现细胞系中持续上调的基因参与了抗铁死亡响应机制(图7A、图7B)。这组基因中有FTH1和FTL，它们是铁蛋白复合物的两种组分，负责螯合不稳定的游离铁。使用脂质过氧化活细胞探针，测量脂质过氧化—铁死亡的标志性表型之一—对ARS-1620治疗的响应。剂量曲线表明ARS-1620以剂量依赖性方式诱导脂质过氧化(图7C)。此外，将细胞存活和脂质过氧化动力学与已知的铁死亡诱导剂(埃拉斯汀和六甲密胺)进行比较表明，ARS-1620在其铁死亡/存活动力学方面与这些铁死亡诱导剂表现相似(图7D)。在所有三种化合物中，存活和归一化的脂质过氧化曲线在IC50存活值附近交叉，证明了相似的药效学。在KRAS.G12C系(H2030)中，所有三种KRAS.G12C抑制剂MRTX849、AMG510和ARS1620都增加脂质过氧化，而在非KRAS.G12C系(H441)中，这种影响明显减弱(图7E)。
实例10–使用GENEVA来鉴定耐药机制
本实例旨在从GENEVA细胞池中的长期药物治疗中识别多种可靶向耐药机制。
使用产生耐药性的十四天药物治疗时间表中的ARS-1620的GENEVA数据集，获得了耐药机制的基因表达指标(图4A)。获得这些靶标的抑制剂，并与三种KRAS.G12C抑制剂ARS1620、AMG510和MRTX849联合测试药物协同作用；其中药物协同作用被定义为药物组合的总和大于单独化合物的累加模型。若干个GENEVA预测的药物靶标显示出高Bliss协同作用评分(大于零的评分表示显著的药物协同作用，图4B)。在一项多臂体内小鼠研究中测试了最强的GENEVA预测，即mTOR耐药性，并且发现随着时间的推移，体内Bliss药物协同作用和肿瘤显著减少(图4C，图4D)。
用于鉴定耐药性途径的药物和非药物条件之间每个细胞系的差异表达
对于每个细胞系，单细胞数据集被分成两个子数据集：媒介物处理的和药物处理的。使用双样品t检验来计算两个单细胞数据集之间的差异表达。从双样品t检验输出中获得每个基因的差异表达评分。对所有细胞系重复这一过程，直到完成，并且将基因的所有差异表达评分按细胞系保存到聚集的差异表达表中。计算每个细胞系中基因的z评分，并且进行具有分组的z评分的两次样品T检验。所有差异表达评分首先通过每个细胞系内的z评分被归一化为相同的尺度。然后对每个基因分别进行两次样品T检验，将所有“敏感”和“不敏感”细胞系作为复制品处理。保存每次基因测试的汇总统计数据，并且计算z评分差异。基因通过汇总统计数据和基因产物的可药用性进行分组。通过选择p值小于或等于0.01的基因，使用按每个基因的p值子集化的t检验结果。通过选择z评分值大于基因评分的前80个百分点的基因，使用由z评分子集化的每个基因的敏感和不敏感系之间的变化δ的中值结果。使用DGIDB.org，将从汇总统计数据中获得的基因与来自DGIDB.org的可药用靶标进行交叉引用，作为可药用靶标的资源，并且获得由感兴趣的化合物诱导的耐药性靶标的最终靶标列表。
用于实例10的代表性代码
/>
实例11–使用GENEVA来鉴定体内特异性耐药机制
本实例旨在使用GENEVA鉴定内皮-间充质转化的诱导作为肿瘤对ARS1620抗性的体内特异性机制。
比较了GENEVA的数据集，其中GENEVA池给药KRAS.G12C抑制剂ARS1620，在体外和体内进行。具体而言，将体外数据与体内数据进行比较，以寻找可归因于所用的模型系统的环境的差异和相似性。响应于药物的最大的上调基因集合之一对体内环境具有特异性，并且在体外没有表现出差异(图5A)。内皮细胞-间充质细胞转化标志性基因表达特征在体内增加，并且代表对ARS1620 KRAS.G12C抑制的可能的药物适应性机制。作为验证研究，联合疗法多臂体内小鼠研究被设计成测试EMT抑制剂Galunisertib与ARS1620联合的疗效。发现该联合疗法在抑制肿瘤生长方面极其有效(图5B)，并且与ARS1620协同地作用以减少生长(图5C)。
对体内模型系统具有特异性的因果基因集的发现
对于体内和体外数据集，我们将在实例8中确定的中值z评分结果和t-检验结果分别在成对的基因集的基础上进行组合。然后将来自体内和体外的组合的z评分结果表计算“体内特异性评分”，如下所示：
对于每个基因组，“体内特异性评分”＝
[(体内中值z评分)–体外中值评分)]/
平均值([log10(体内p值)，log10(体外p值)]
然后通过其体内特异性评分对有序的基因组进行排序，以获得在体内响应于ARS1620显著上调或下调的基因集。
实例12–使用GENEVA来测试联合疗法的疗效
本实例旨在测试联合疗法，以确定GENEVA细胞池中的最佳联合疗法。
利用体内汇集的一组G12C和非G12C系作为异种移植物进行联合疗法研究，在总共八种不同治疗条件在使用和不使用Galuniserib、INK128和Antimycin的情况下比较ARS1620；这些化合物取自我们的联合疗法发现和对ARS1620的线粒体作用的机制理解(图8A)。使用每种药物条件下的细胞周期活性/非活性比例，计算每种药物中若干个细胞系的药物协同作用。Ink128和Galunisertib显示出与先前证明体内协同作用的验证实验一致的相对体内协同作用，而抗霉素显示出拮抗作用，证明ARS1620的相对挽救与线粒体致死表型的拮抗作用一致(图8B)。围绕基因表达和药物治疗+起源细胞系建立的线性模型发现了驱动协同药物表型的基因，其揭示了Galunisertib和INK128一起能够进一步增加线粒体读数的协同减少，这与单独观察到的ARS1620对线粒体的一般影响一致(图8C)。
实例13–使用GENEVA来鉴定对候选药剂敏感的患者亚群
本实例旨在检测PDX模型中对候选药剂(ARS1620)敏感的新型患者亚群。
PDX模型的GENEVA池是为长期药物治疗测定而创建的。将肿瘤植入体内和类器官中，并且来自KRAS.G12C、EML4-ALK和TH21肺癌患者的肿瘤在GENEVA池中给药。在EML4-ALK患者中发现显著药物敏感性大于KRAS.G12C突变肿瘤的敏感性，表明EML4-ALK患者肿瘤对KRAS.G12C抑制剂有响应。(图9B)。
因此，上文仅说明了本公开的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，这些布置虽然没有在本文中明确描述或示出，但是体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文中引用的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为推进本领域所贡献的概念，并且应被理解为不限于此类具体引用的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施例及其具体实例的所有陈述都旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，此类等同物旨在包括当前已知的等同物和未来开发的等同物，即，执行相同功能的任何开发的元件，而不管结构如何。因此，本发明的范围不旨在局限于本文中示出和描述的示例性实施例。

Claims (98)

1.一种用于评估小分子化合物的一种或多种治疗性质的方法，其包括：
以三维生长不同细胞类型的细胞池；
用所述小分子化合物处理三维池；
将处理的三维池的细胞解离成单细胞；
对解离的单细胞和来自未用所述小分子化合物处理的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞核糖核酸(RNA)测序；
将来自所述单细胞RNA测序的数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组；以及
基于分类的单细胞转录组来评估所述小分子化合物的一种或多种治疗性质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞池是生长平衡的细胞池；其中
a)每种不同细胞类型在所述细胞池中用至少1×103个活细胞表示；
b)在所述细胞池中不同细胞类型中没有一种细胞类型的数量超过其他细胞类型2个数量级或更多；或者
c)在所述细胞池中每种不同细胞类型的细胞总数彼此在2个数量级以内。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中不同细胞类型的所述细胞池包含2至100种不同细胞类型。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中不同细胞类型的所述细胞池包含10至50种不同细胞类型。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述不同细胞类型包括从患者获得的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞或它们的任意组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中以三维生长所述池包括从所述池产生异种移植物。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中以三维生长所述池包括从所述池中产生类器官。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物用于与药物联合疗法的候选资格，其中所述方法包括基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组：
通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性；
计算每个细胞系的药物诱导的基因表达变化；
基于每个细胞系的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；以及
基于加权评分高于错误发现率的基因来预测联合疗法靶标，其中与药物敏感性反相关的基因预测耐药性，因此代表用于组合靶向的候选靶标。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物的作用机制，其中所述方法包括基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组：
通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性；
确定每个细胞系的药物诱导的基因表达变化；
聚集药物敏感细胞系中确定的药物诱导的基因表达变化；
基于聚集的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；
将与聚集的药物敏感性相关的基因识别为加权评分高于错误发现率的基因；以及
基于与聚集的药物敏感性相关的基因来预测所述化合物的作用机制。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物用于治疗疾病亚型的候选资格，其中所述方法包括基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组：
通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，其中每个细胞系通过其基因突变和/或转录组特征来分类；
聚集细胞系中所确定的药物敏感性；
使用变量选择回归算法为每个突变和/或转录组特征分配预测与聚集的药物敏感性的相关性的评分；以及
基于评分高于错误发现率的疾病亚型来预测所述化合物在所述疾病亚型中的功效。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述变量选择回归算法是加权的lasso回归算法。
12.一种或多种非暂时性计算机可读介质，其包括存储在其上的指令，所述指令当由一个或多个处理器执行时使得所述一个或多个处理器以：
将单细胞RNA测序数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，其中所述单细胞RNA测序数据通过对来自用小分子化合物处理的不同细胞类型的三维池的解离的单细胞和来自未用所述小分子化合物处理的不同细胞类型的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞RNA测序而产生；以及
基于分类的单细胞转录组来评估所述小分子化合物的一种或多种治疗性质。
13.根据权利要求12所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物用于与药物的联合疗法的候选资格，并且当由所述一个或多个处理器执行时，所述指令进一步使得所述一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组：
计算每个细胞系的药物诱导的基因表达变化；
基于每个细胞系的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；以及
基于加权评分高于错误发现率的基因来预测联合疗法靶标，其中与药物敏感性反相关的基因预测耐药性，因此代表用于组合靶向的候选靶标。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物的作用机制，并且当由所述一个或多个处理器执行时，所述指令进一步使得所述一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组以：
确定每个细胞系的药物诱导的基因表达变化；
聚集药物敏感细胞系中所确定的药物诱导的基因表达变化；
基于聚集的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；
将与聚集的药物敏感性相关的基因识别为加权评分高于错误发现率的基因；以及
基于与聚集的药物敏感性相关的基因来预测所述化合物的作用机制。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物用于治疗疾病亚型的候选资格，并且当由所述一个或多个处理器执行时，所述指令进一步使得所述一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组以：
聚集细胞系中的药物敏感性，其中通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，其中每个细胞系通过其基因突变和/或转录组特征来分类；
使用变量选择回归算法为每个突变和/或转录组特征分配预测与聚集的药物敏感性相关性的评分；以及
基于评分高于假发现率的疾病亚型来预测所述化合物在所述疾病亚型中的功效。
16.根据权利要求15所述的一种或多种非暂时性计算机可读介质，其中所述变量选择回归算法是加权的lasso回归算法。
17.一种用于评估小分子化合物的一种或多种治疗性质的系统，所述系统包括：
一个或多个处理器；和
一种或多种非暂时性计算机可读介质，所述一种或多种非暂时性计算机可读介质包括存储在其上的指令，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时使得所述一个或多个处理器以：
将单细胞RNA测序数据去卷积成按处理和细胞类型分类的单细胞转录组，其中所述单细胞RNA测序数据通过对来自用小分子化合物处理的不同细胞类型的三维池的解离的单细胞和来自未用所述小分子化合物处理的不同细胞类型的对照三维池的解离的单细胞进行单细胞RNA测序而产生；以及
基于分类的单细胞转录组来评估所述小分子化合物的一种或多种治疗性质。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物用于与药物的联合疗法的候选资格，并且当由所述一个或多个处理器执行时，所述指令进一步使得所述一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组以：
计算每个细胞系的药物诱导的基因表达变化；
基于每个细胞系的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；以及
基于加权评分高于错误发现率的基因来预测联合疗法靶标，其中与药物敏感性反相关的基因预测耐药性，因此代表用于组合靶向的候选靶标。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的系统，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物的作用机制，并且当由所述一个或多个处理器执行时，所述指令进一步使得所述一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组以：
确定每个细胞系的药物诱导的基因表达变化；
聚集药物敏感细胞系中确定的药物诱导的基因表达变化；
基于聚集的计算的药物诱导的基因表达变化，基于其与药物敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；
将与聚集的药物敏感性相关的基因识别为加权评分高于错误发现率的基因；以及
基于与聚集的药物敏感性相关的基因来预测所述化合物的作用机制。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的系统，其中所述一种或多种治疗性质包括所述小分子化合物用于治疗疾病亚型的候选资格，并且当由所述一个或多个处理器执行时，所述指令进一步使得所述一个或多个处理器基于按处理和细胞类型分类的所述单细胞转录组以：
聚集细胞系中的药物敏感性，其中通过对每种条件下剩余的细胞的数量进行计数来确定每个细胞系的药物敏感性，其中每个细胞系通过其基因突变和/或转录组特征来分类；
使用变量选择回归算法为每个突变和/或转录组特征分配预测与聚集的药物敏感性相关性的评分；以及
基于评分高于假发现率的疾病亚型来预测所述化合物在所述疾病亚型中的功效。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述变量选择回归算法是加权的lasso回归算法。
22.一种平衡细胞计数培养物，其包含两种或更多种不同细胞类型，所述细胞类型已经被培养持续一定的时间段，其中所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型都具有生长速率，并且其中所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在培养前以与所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的生长速率相反的比率组合。
23.根据权利要求22所述的平衡细胞计数培养物，其中所述时间段为6小时至45天、12小时至30天、24小时至20天或72小时至14天。
24.22或23所述的平衡细胞计数培养物，其中，
(i)在所述平衡细胞计数培养物中，两种不同细胞类型中的每种细胞类型都用1×103个活细胞表示；
(ii)在所述平衡细胞计数培养物中，所述至少两种不同细胞类型中没有一种细胞类型的数量超过其他细胞类型2个数量级或更多；或者
(iii)在所述平衡细胞计数培养中，所述至少两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的总数彼此在2个数量级内。
25.一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中所述平衡细胞计数培养物的0.2体积％至10体积％的样品包含每种不同细胞类型的至少500个细胞，其中在将两种或更多种细胞类型组合以创建细胞池并且接种于培养基中以获得所述平衡细胞计数培养物之后，在所述平衡细胞计数培养物被培养持续72小时至45天的时间段之后从所述平衡细胞计数培养物中取出所述样品。
26.一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中每种细胞类型在所述培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中至少两种细胞类型来源于不同的癌组织。
27.一种平衡细胞计数培养物，其包含至少两种或更多种不同细胞类型，其中每种细胞类型在所述培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中至少两种细胞类型包括彼此不同的癌症突变。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物包含2至100种不同细胞类型。
29.根据权利要求28所述的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物包含10至50种不同细胞类型。
30.根据权利要求22至29中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述不同细胞类型包括具有癌症突变的细胞、来自一个或多个受试者的癌细胞、来自一个或多个受试者的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞、来自多种细胞系的细胞或其它们的任意组合。
31.根据权利要求22至30中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物被植入模型系统中。
32.根据权利要求31所述的平衡细胞计数培养物，其中所述模型系统是体外模型系统、体内模型系统或离体模型系统。
33.一种制备具有至少两种或更多种不同细胞类型的平衡细胞计数培养物的方法，所述方法包括：
(a)确定两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的生长速率；
(b)组合所述两种或更多种不同细胞类型以创建细胞池，其中加入到所述细胞池中的所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的初始细胞计数基于步骤(a)的所述生长速率来确定；以及
(c)在一定的时间段内培养步骤(b)的所述细胞池以产生所述平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物的0.2体积％至10体积％的样品包含所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的至少500个细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(c)的所述样品包含5,000至200,000个细胞。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中在步骤(c)的所述样品中存在所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的不少于500个活细胞。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中添加到所述细胞池中之后，来自所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的代表与如在步骤(a)中确定的该细胞类型的细胞生长速率成反比。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述平衡细胞计数培养物包含2至100种不同细胞类型。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述平衡细胞计数培养物包含2至50种不同细胞类型。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述确定步骤(a)的所述生长速率包括测量所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的生长速率。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述不同细胞类型选自具有癌症突变的细胞、来自一个或多个受试者的癌细胞、来自一个或多个受试者的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞、来自多种细胞系的细胞或它们的任意组合。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述不同细胞类型选自一种或多种异种移植物模型。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述异种移植物来源于患有疾病的受试者之一。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病为肿瘤疾病。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤疾病是选自头、颈、肺、皮肤、乳腺、血液、淋巴、骨、软组织、脑、眼、生殖系统、循环系统、消化系统、内分泌系统、神经系统和泌尿系统的癌症中的一种或多种的癌症。
45.根据权利要求33至44中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(b)中当细胞类型具有每天0.2倍的生长速率时排除所述细胞类型。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述时间段为六小时至45天。
47.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(c)中的所述时间段为12小时至20天。
48.根据权利要求47所述的方法，其中步骤(c)中的所述时间段为24小时至14天。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述时间段为72小时。
50.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述时间段为七天。
51.根据权利要求33至50中任一项所述的方法，其中步骤(c)的所述样品在所述时间段结束时获取。
52.根据权利要求33至51中任一项所述的方法，其中步骤(c)的至少两个或更多个样品在所述时间段期间的不同时间点获取。
53.根据权利要求33至52中任一项所述的方法，其中步骤(a)中每种细胞类型的所述生长速率分别通过钙黄绿素-AM生长测定或细胞滴度Glo生长测定来确定。
54.根据权利要求33至53中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在步骤(b)中以与如通过所述钙黄绿素-AM生长测定确定的每种细胞类型的所述生长速率成反比的比率进行组合，并且ii)按比例缩放至生长的总天数。
55.根据权利要求33至54中任一项所述的方法，其中步骤(c)的所述样品为所述平衡细胞计数培养物的0.5体积％至体积3％。
56.一种将来自根据权利要求33至55中任一项的步骤(c)的所述样品的细胞与来自步骤(c)的所述样品的步骤(b)的所述细胞池的所述两个或更多个细胞相关联的方法，执行步骤进一步包括：
(i)对来自所述样品的一种或多种细胞进行单细胞RNA测序，以鉴定来自所述样品的所述一种或多种细胞中的单核苷酸多态性；以及
(ii)将步骤(i)的所述单核苷酸多态性与步骤(b)中的所述细胞池的所述两种或更多种细胞的单核苷酸多态性进行比较，从而将来自步骤(c)的所述样品的细胞与步骤(b)的所述细胞池的所述两种或更多种细胞相关联。
57.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括对所述样品的一种或多种细胞进行单细胞转录组分析。
58.根据权利要求33至57中任一项所述的方法，其中步骤(c)的一部分在体外进行。
59.根据权利要求33至58中任一项所述的方法，其中步骤(c)的一部分在体内进行。
60.根据权利要求33至58中任一项所述的方法，其进一步包括将所述平衡细胞计数培养物植入到模型系统中。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述模型系统是体外模型系统、离体模型系统或体内模型系统。
62.一种平衡细胞计数培养物，其根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备。
63.根据权利要求62所述的平衡细胞计数培养物，其中在步骤(c)结束时，在所述样品中存在所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的不少于500个活细胞，其中步骤(c)的所述时间段在24小时至45天之间。
64.根据权利要求62或63所述的培养物的平衡细胞计数培养物，其中步骤(c)的所述时间段在3天至20天之间。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述不同细胞类型包括具有癌症突变的细胞、来自一个或多个受试者的癌细胞、来自一个或多个受试者的原代细胞、来自器官系统的细胞、来自疾病模型的细胞、来自多种细胞系的细胞或它们的任意组合。
66.根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物包含两种或更多种不同细胞类型，其中所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在所述培养物中用至少1×103个活细胞表示，并且其中所述细胞类型中的至少两种细胞类型来源于不同受试者。
67.根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物包含两种或更多种不同细胞类型，其中所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在所述培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中所述细胞类型中的至少三种细胞类型来源于不同的癌组织。
68.根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物包含两种或更多种不同细胞类型，其中所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型在所述培养物中用至少1×103个细胞表示，并且其中所述细胞类型中的至少两种细胞类型包含彼此不同的癌症突变。
69.根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物被植入体外模型系统、离体模型系统或体内模型系统中。
70.根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物，其中所述平衡细胞计数培养物中没有一种细胞类型的数量超过其他细胞类型2个数量级或更多。
71.根据权利要求33至61中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物，其中所述两种或更多种不同细胞类型的每种细胞类型的总数彼此在2个数量级以内。
72.一种评估候选药剂对两种或更多种细胞类型的影响的方法，所述方法包括：
i)制备根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的平衡细胞计数培养物；
ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到模型系统中；
iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述模型系统；以及
iv)在所述持续时间结束时评估所述平衡细胞计数培养物，以确定所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录影响。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述模型系统是体外模型系统、体内模型系统或离体模型系统。
74.一种在体内模型系统中产生包含至少两种或更多种不同细胞类型的镶嵌肿瘤的方法，所述方法包括：
(i)制备根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述细胞类型中的至少两种细胞类型来源于不同的癌组织；以及
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到体内系统中，其中所述体内系统是哺乳动物。
75.一种评估候选药剂对根据权利要求74所述的包含至少两种或更多种不同细胞类型的镶嵌肿瘤的单独的细胞的治疗功效的方法，所述方法包括：
(i)在一定的持续时间内用所述候选药剂治疗所述镶嵌肿瘤；
(ii)将处理的镶嵌肿瘤的细胞解离成单独的细胞；
(iii)评估所述单独的细胞，以确定在所述持续时间结束时所述镶嵌肿瘤的所述单独的细胞的表型、遗传和转录组表达；以及
(iv)通过将所述镶嵌肿瘤的所述单独的细胞的所述表型、基因组和转录组表达与未用所述候选药剂治疗的相同镶嵌肿瘤的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达进行比较来确定所述候选药剂的治疗功效。
76.一种在体内系统中同时评估候选药剂对多种细胞类型的影响的方法；所述方法包括：
(i)制备根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述细胞类型中的至少两种细胞类型彼此不同；
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到体内系统中，其中所述体内系统是哺乳动物；
(iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述体内系统；
(iv)评估单独的细胞，以确定在所述持续时间结束时所述多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达；以及
(v)通过比较所述体内系统中所述多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的所述表型、基因组和转录组表达与未用所述候选药剂处理的相同体内系统中多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达来确定所述候选药剂的影响。
77.一种在离体系统中同时评估候选药剂对多种细胞类型的影响的方法；所述方法包括：
(i)制备根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述细胞类型中的至少两种细胞类型彼此不同；
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到离体系统中，其中所述离体系统是类器官；
(iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述离体系统；
(iv)评估单独的细胞，以确定在所述持续时间结束时所述离体系统中所述多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达；以及
(v)通过将所述离体系统中的所述多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的所述表型、基因组和转录组表达与未用所述候选药剂处理的相同离体系统中的多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达进行比较来确定所述候选药剂的影响。
78.一种在体外系统中同时评估候选药剂对多种细胞类型的影响的方法；所述方法包括：
(i)制备根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述细胞类型中的至少两种细胞类型彼此不同；
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到体外系统中，其中所述体外系统是2D或3D体外模型系统；
(iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述体外系统；
(iv)评估单独的细胞，以确定在所述持续时间结束时所述体外系统中的所述多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、遗传和转录组表达；以及
(v)通过将所述体外系统中的所述多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的所述表型、基因组和转录组表达与未用所述候选药剂处理的相同体外系统中的多种细胞类型中的每种细胞类型的单独的细胞的表型、基因组和转录组表达进行比较来确定所述候选药剂的影响。
79.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述方法包括评估联合疗法中多于一种候选药剂的影响。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述方法包括评估第一候选药剂和第二候选药剂的组合的影响。
81.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述方法评估所述第一候选药剂和所述第二候选药剂的药物协同作用。
82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述方法评估所述第一候选药剂和所述第二候选药剂的组合在抑制肿瘤生长中的功效。
83.一种鉴定对候选药剂敏感的受试者亚群的方法，所述方法包括：
(i)产生根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的包含多种细胞类型的平衡细胞计数培养物，其中所述多种细胞类型包括来自至少两种不同受试者的细胞；
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到模型系统中；
(iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述模型系统；
(iv)在所述持续时间结束时评估所述平衡细胞计数培养物，以确定所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录影响；以及
(v)基于步骤iv)的评估鉴定对所述候选药剂敏感的所述受试者亚群。
84.一种鉴定生物途径中的候选药剂靶标的方法，所述方法包括：
(i)制备根据权利要求22至32或62至71中任一项所述的平衡细胞计数培养物；
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到模型系统中；
(iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述模型系统；
(iv)在所述持续时间结束时评估所述平衡细胞计数培养物，以确定所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录影响；以及
(v)基于步骤iv)的评估来鉴定所述生物途径中的所述候选药剂靶标。
85.一种鉴定候选药剂用于治疗疾病的疗效的方法，所述方法包括：
(i)制备根据权利要求32至56中任一项所述的平衡细胞计数培养物，其中所述不同细胞类型包括来自患有疾病的两个或更多个受试者的细胞；
(ii)将所述平衡细胞计数培养物植入到模型系统中；
(iii)在一定的持续时间内用候选药剂处理所述模型系统；
(iv)在所述持续时间结束时评估所述平衡细胞计数培养物，以确定所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录影响；以及
(v)基于步骤iv)的评估来确定所述候选药剂用于治疗疾病的治疗功效。
86.根据权利要求72至73或75至85中任一项所述的方法，其中评估所得的平衡细胞计数培养物以确定所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的遗传和转录影响包括：
(i)将所得的平衡细胞计数培养物的细胞解离成单细胞；
(ii)对所得的平衡细胞计数培养物中剩余的两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的细胞的数量进行计数；
(iii)确定每种细胞类型的候选药剂诱导的一种或多种基因表达变化；
(iv)基于每种单独的细胞的计算的候选药剂诱导的基因表达变化，基于其与候选药剂敏感性的预测相关性，为每个基因分配加权评分；以及
(v)基于步骤iv)的加权评分来确定所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的表型、遗传和转录组影响。
87.根据权利要求72至73或75至86中任一项所述的方法，其中所述候选药剂是引起治疗干扰的药剂。
88.根据权利要求72至73或75至87中任一项所述的方法，其中所述候选药剂是选自小分子、抗体、肽、基因编辑器或核酸适体的药剂。
89.根据权利要求72至73或79至88中任一项所述的方法，其中确定所述表型、遗传和转录组影响包括评估所述候选药剂对根据权利要求22至31或61至69中任一项所述的平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响，或对根据权利要求32至60中任一项所述的方法制备的平衡细胞计数培养物的影响。
90.根据权利要求89所述的方法，其中通过计算由所述候选药剂处理的所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的基因表达并且将所述基因表达与未由所述候选药剂处理的相同平衡细胞计数培养物的单独的细胞的基因表达进行比较来评估所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中通过确定由所述候选药剂处理的所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的转录组表达并且将所述转录组表达与未由所述候选药剂处理的相同平衡细胞计数培养物的单独的细胞的基因表达进行比较来评估所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响。
92.根据权利要求89至91中任一项所述的方法，其中通过对由所述候选药剂处理的所述平衡细胞计数培养物中的所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的存活的单独的细胞的数量进行计数并且与未由所述候选药剂处理的相同平衡细胞计数培养物中的两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的存活的单独的细胞的数量进行比较来评估所述候选药剂对所述平衡细胞计数培养物的单独的细胞的影响。
93.根据权利要求72至73或79至92中任一项所述的方法，其中所述评估遗传影响包括在所述持续时间结束时对所述平衡细胞计数培养物中的细胞进行单细胞RNA测序。
94.根据权利要求72至73或79至93中任一项所述的方法，其中评估表型变化包括在所述持续时间结束时对所述两种或更多种不同细胞类型中的每种细胞类型的存活的单独的细胞的数量进行计数。
95.根据权利要求72至73或79至94中任一项所述的方法，其中评估转录组影响包括在所述持续时间结束时确定所述平衡细胞计数培养物中细胞的单细胞转录组谱。
96.根据权利要求72至73或74至95中任一项所述的方法，其中所述持续时间为6小时至45天、12小时至30天、24小时至20天或72小时至14天。
97.根据权利要求72至73或74至96中任一项所述的方法，其中所述持续时间为至少24小时。
98.根据权利要求72至73或74至97中任一项所述的方法，其中所述持续时间为14天。
CN202280061668.XA 2021-07-23 2022-07-22 用于评估候选药剂的治疗性质的方法和模型系统以及相关的计算机可读介质和系统 Pending CN117940771A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163225209P 2021-07-23 2021-07-23
US63/225,209 2021-07-23
PCT/US2022/038069 WO2023004149A1 (en) 2021-07-23 2022-07-22 Methods and model systems for assessing therapeutic properties of candidate agents and related computer readable media and systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117940771A true CN117940771A (zh) 2024-04-26

Family

ID=84979606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280061668.XA Pending CN117940771A (zh) 2021-07-23 2022-07-22 用于评估候选药剂的治疗性质的方法和模型系统以及相关的计算机可读介质和系统

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4374169A1 (zh)
CN (1) CN117940771A (zh)
WO (1) WO2023004149A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6518035B1 (en) * 1998-06-02 2003-02-11 Rosetta Inpharmatics, Inc. Targeted methods of drug screening using co-culture methods
PL3150704T3 (pl) * 2014-05-30 2023-01-23 Corning Incorporated Sposób hodowli i masa komórkowa
WO2021081374A1 (en) * 2019-10-25 2021-04-29 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for high-throughput compressed screening for therapeutics

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023004149A1 (en) 2023-01-26
EP4374169A1 (en) 2024-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Loss of CHD1 promotes heterogeneous mechanisms of resistance to AR-targeted therapy via chromatin dysregulation
Baron et al. The stress-like cancer cell state is a consistent component of tumorigenesis
Jain et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects
Capdevila et al. Early evolutionary divergence between papillary and anaplastic thyroid cancers
Cheng et al. Solute carrier family 39 member 6 gene promotes aggressiveness of esophageal carcinoma cells by increasing intracellular levels of zinc, activating phosphatidylinositol 3-kinase signaling, and up-regulating genes that regulate metastasis
CN108064380A (zh) 使用多种细胞信号传导途径活性的医学预后和治疗反应的预测
US20150219624A1 (en) Methods for identifying anti-cancer compounds
Jiang et al. Long noncoding RNA RBMS3-AS3 acts as a microRNA-4534 sponge to inhibit the progression of prostate cancer by upregulating VASH1.
IL296316A (en) Systems and methods for deconvolution of expression data
Zhang et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq reveals distinct cancer-associated fibroblasts in head and neck squamous cell carcinoma
Mens et al. Multi-omics analysis reveals microRNAs associated with cardiometabolic traits
Chen et al. A potential circRNA-miRNA-mRNA regulatory network in asthmatic airway epithelial cells identified by integrated analysis of microarray datasets
Penas et al. RKIP regulates differentiation-related features in melanocytic cells
Wang et al. Single-cell transcriptome analysis revealing the intratumoral heterogeneity of ccRCC and validation of MT2A in pathogenesis
Zhao et al. CD168+ macrophages promote hepatocellular carcinoma tumor stemness and progression through TOP2A/β-catenin/YAP1 axis
EP3397051B1 (en) Fly avatars for cancer and uses thereof
Liu et al. Multi-omics of extracellular vesicles: an integrative representation of functional mediators and perspectives on lung disease study
Pang et al. Competing endogenous RNA and coexpression network analysis for identification of potential biomarkers and therapeutics in association with metastasis risk and progression of prostate cancer
KR20180000991A (ko) 환자특이적 환자 유래 세포의 제조방법 및 이의 이용
CN117940771A (zh) 用于评估候选药剂的治疗性质的方法和模型系统以及相关的计算机可读介质和系统
Andreatta et al. Projecting single-cell transcriptomics data onto a reference T cell atlas to interpret immune responses
Audesse et al. FOXO3 regulates a common genomic program in aging and glioblastoma stem cells
Sheng et al. A random walk-based method to identify candidate genes associated with lymphoma
Sunderland et al. Biglycan and reduced glycolysis are associated with breast cancer cell dormancy in the brain
Maia de Oliveira da Silva et al. Global gene expression reveals an increase of HMGB1 and APEX1 proteins and their involvement in oxidative stress, apoptosis and inflammation pathways among beta‐thalassaemia intermedia and major phenotypes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication