CN117940579A - 具有增强的传感功能的核酸纳米孔 - Google Patents
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Abstract
提供传感核酸纳米孔。纳米孔具有几何结构，其中纳米孔限定了穿过其中的中心内腔。纳米孔的几何结构被配置为适应中心内腔中或附近的分析物分子的全部或部分，从而优化分析物分子对中心内腔的阻塞。提供了增强分析物分子与跨膜纳米孔结合的方法。还提供了用于分子传感的包括传感核酸纳米孔的膜、传感器设备和方法。
Description
技术领域
本发明涉及新型膜纳米结构及其用途。特别地，本申请涉及在蛋白质传感和分子门创建应用中的宽通道膜核酸纳米孔。
背景技术
2020年严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)大流行导致正常社会的方方面面突然和急剧地关闭，部分原因是许多国家无法推出快速有效地跟踪和追踪装置。这种感染的快速社区传播水平使人们更加关注许多公共卫生系统对缓慢的基于实验室的感染诊断的过度依赖，优选的金标准诊断方法是实时逆转录PCR(RT-PCR)检测。虽然基于实验室的检测仍然是准确性的最终基准，但有限的能力水平和缓慢的扩大速度意味着公共卫生当局在规划未来在紧急需要时的快速反应时，不能继续依赖这种方法。即时检验的选择在很大程度上受限于侧流血清学检测，所述侧流血清学检测通过在家读取或邮寄检测提供了快速结果的潜力。然而，对测试性能特征的关注仍然存在，特别是在症状出现前的早期感染阶段，以及应用于普通人群时的低阳性预测值。因此，需要提供替代检测平台，所述平台可以在即时检验中提供高水平的准确性，但可以快速部署和使用。
纳米孔是一种跨膜聚合物和复合物，所述跨膜聚合物和复合物可限定穿孔，并在膜中形成通道，在两种流体(通常是液体，适当的水溶液)之间形成隔断，离子和某些分子可以从中通过。由核酸双链分子，特别是DNA双链分子组成的跨膜纳米孔，体现了开发传感纳米孔的可能性。
最近已经从六个六边形排列的、相互连接的DNA双链分子的结构核心获得了DNA纳米孔，其包含中空通道(见例如，Douglas S.M.,Marblestone A.H.,Teerapittayanon S.,Vazquez A.,Church G.M.,Shih W.M.Nucleic Acids Res.37,5001-5006(2009)；Zheng J.等人，Nature 461,74-77(2009)；Rothemund P.W.Nature 440,297-302(2006)；Fu J.等人，Nat.Nanotechnol.9,531-536(2014)；Burns J.R.等人，Angew.Chem.Int.Ed.52,12069-12072(2013)；和Seifert A.,K.,Burns J.R.,Fertig N.,Keyser U.F.,Howorka S.ACS Nano 9,1117-1126(2015)。膜插入是通过在孔的外部配备疏水性脂质锚来实现的。DNA纳米孔的模块化构建原理可以实现定制的孔径(/>等人，Nano.Lett.,15(5),3134-3138(2015)；WO 2013/083983)，并安装可控门以调节传输(Burns J.R.,Seifert A.,Fertig N.,Howorka S.A.,Nat.Nanotechnol.11,152-156(2016))。由DNA合成的圆形纳米管在本领域中也已被描述(Zheng等人，J.Am.Chem.Soc.,136,10194-10197(2014))。
为了用作大生物分子分析物(如循环抗体、癌症或病原体标志物)的传感器，由核酸纳米孔形成的合适的膜通道应该满足某些标准，即：
1)通道内腔应当至少约3nm宽，以适应通道内腔开口内部或附近的大生物分子；所述大生物分子在通道附近或通道内的结合导致比分析物在孔入口的一般邻近位置结合时更高的读数灵敏度；
2)所述孔应在结构上限定并抗弯曲或变形，以在电读数中获得恒定的基本水平(即减少背景噪声)；和
3)所述孔尺寸应易于调整，以使其适应不同的生物分子大小。
WO-2018/011603-A1以及WO2020/025974-A1中描述了最小内部孔径为几纳米的跨膜核酸的纳米孔。
然而，潜在生物分子分析物的大小和形式的多样性使精确即时检验传感技术的设计和实施具有挑战性。正如对SARS-CoV-2大流行的反应所表明的那样，全球公共卫生当局需要向焦虑人群保证，所使用的测试技术既可靠又准确。与高水平假阴性或假阳性检测结果相关的风险是采用即时检验诊断的主要障碍。然而，例如，在未来本地化流行病成为全球范围的疫情之前，将本地化流行病阻断在其踪迹中的承诺，在很大程度上取决于感染焦点的踪迹和轨迹检测能力。同样，许多主要的公共卫生方案依赖于当地的检测能力，这在发达国家和发展中国家都可能是一个问题。因此，需要进一步提高快速即时检验诊断技术的准确性和可靠性，以满足这些深层次需求。
根据本文提供的教导，本发明的这些和其他用途、特征和优点对于本领域技术人员来说应该是显而易见的。
发明内容
本发明涉及新型核酸纳米孔几何结构的设计和实施，以匹配一种或多种待测分析物的几何结构。这不同于结合分子与一般圆形或多边形孔的简单栓系，并依赖于结合部分与孔几何形状(协同提高了分析物结合时通过纳米孔的电信号产生的信息质量)的协同相互作用。
本发明的第一方面提供了一种传感核酸的纳米孔，其中所述纳米孔具有几何形状，并且其中所述纳米孔限定了穿过其中的中心内腔，并且其中所述纳米孔的几何形状被配置为适应中心内腔内或附近的分析物分子的全部或部分，从而优化分析物分子对中心内腔的阻塞。
本发明的第二方面提供了传感核酸纳米孔，包括：
核酸纳米孔，其中纳米孔限定穿过其中的中心内腔，并且其中所述中心内腔具有限定第一孔隙的顺式第一孔隙端和限定第二孔隙的反式第二孔隙端；和
分析物结合部分，其中所述分析物结合部分包括亲和结合分子，并且其中所述分析物结合部分位于第一和第二孔隙之间的中心内腔中；
其中所述纳米孔具有三级结构，并且所述纳米孔的三级结构被配置为符合至少一部分分析分子的三维形状。
本发明的第三方面提供了一种至少包括本文所述一个纳米孔的膜。
本发明的第四方面提供了一种包括本文所述的传感核酸纳米孔的传感器设备。
本发明的第五方面提供了一种增强分析物分子与跨膜核酸纳米孔结合的方法，所述方法包括：
选择纳米孔的几何形状，使其符合至少一部分分析物分子的三维形状，从而使所述纳米孔能够适应分析物分子并修改通过或穿过所述纳米孔的可测量的电信号或光信号；和
制造具有所需几何形状的核酸纳米孔。
本发明的第六方面提供了通过本发明第五方面的方法获得的核酸纳米孔。
本发明的第七方面提供了可通过本发明第五方面的方法可获得的核酸纳米孔。
本发明的第八方面提供了一种分子传感方法，所述方法包括：
提供本文所述的传感器设备；
将分析物分子与所述纳米孔接触，并建立通过至少一个纳米孔的离子流或穿过所述纳米孔的电子流；和
测量所述纳米孔上的电信号，
其中所述分子传感包括分析物分子检测或表征，其中电测量的变化指示分析物分子。
在本申请的范围内，其明确旨在，在先前段落、权利要求和/或下文的描述和附图中所阐述的各个方面、实施方案、实施例和替代方案，特别是其各个特征，可以独立地或以任何组合被采用。也就是说，全部实施方案和/或任何实施方案的特征均可以以任何方式和/或组合进行组合，除非这些特征是不兼容的。申请人保留更改任何原始提交的权利要求或相应地提交任何新权利要求的权利，包括修改任何原始提交权利要求以从属于和/或并入任何其他权利要求的任何特征的权利，尽管最初没有以这种方式请求保护。
附图说明
现将参考附图，仅通过示例的方式描述本发明的一个或多个实施方案，其中：
图1是在本发明的实施方案中使用的一种类型的核酸纳米孔的代表。(A)示出了纳米孔的平面图，其中主要支架链的取向显示为圆柱体；(B)示出了一个反向视图，可以看到疏水锚的位置——在这种情况下，胆固醇显示为锥体；(C)纳米孔结构在插入脂质膜的过程中；
图2是本发明实施方案的图像(A)示出了病毒粒子，如SARS-CoV-2，所述颗粒展示表面蛋白，如刺突蛋白(i)，由免疫球蛋白分子(ii)识别；(B)示出了NTA-His6接头，其适合于将刺突蛋白(i)全部或部分连接到核酸纳米孔；(C)描述了核酸纳米孔的平面图，所述核酸纳米孔具有三角形构型，具有通过接头栓系的刺突蛋白，从而成为了紧密定向在纳米孔中心内腔中的结合部分，由于孔的互补几何形状和与结合部分的相互作用，抗体(II)能够与内腔匹配。
图3示出了本发明的实施方案中，嵌入膜或固态隔断中的纳米孔的侧截面的图像，(A)位于纳米孔的中心内腔的结合部分，所述纳米孔的孔隙端-孔隙-被描述为区域X；(B)结合部位位于内腔上方向外延伸的孔隙附近。
图4示出了本发明的实施方案中，位于膜或固态隔断内的三角形纳米孔的平面图的图像，结合部分位于内腔中以星(★)示出；(B)分析物，显示为IgG型免疫球蛋白，适应内腔的几何形状，并与结合部分结合。
图5示出了本发明的实施方案中，位于膜或固态隔断内的规则多边形纳米孔的平面图中的图像，结合部分位于内腔中以星(★)示出；(B)分析物，显示为多结构域多肽复合物，适应在内腔的几何形状中，并与结合部分结合。
图6示出了侧边长20nm的三角形膜嵌入DNA纳米孔(Tri-20)的分析：(a)示出了10mV时的原始电流轨迹的示例图(b)示出了5个独立单通道电流轨迹的平均值和标准误差的电流-电压(IV)曲线，(c)20mV时从5个独立插入获得的电导直方图。在1M KCl、10mMHEPES、pH 7.4中进行记录。
图7示出了根据本发明的一个实施方案，通过金属螯合桥携带SARS CoV2刺突蛋白的20nm三角形膜嵌入DNA纳米孔的分析(Tri-20-Spike孔)：(a)示出了10mV时的原始电流轨迹的示例图，(b)示出了3个独立单通道电流轨迹的平均值和标准误差的电流-电压(IV)曲线，(c)20mV时从3个独立插入获得的电导直方图。在1M KCl、10mM HEPES、pH 7.4中进行记录。
图8示出了添加抗刺突蛋白抗体时，对图7中所述的纳米孔的分析(a)显示添加44.5nM新型冠状病毒抗刺突蛋白抗体前开放通道的示例轨迹，箭头指示添加抗体——在添加时发生阻断，(b)已经分析了阻断的停留时间和平均阻断。
图9示出了插入高通量MinION传感器设备的示意性绘制的膜阵列中的Tri-20-Spike孔。MinION的长度为10厘米。
图10示出了插入MinION设备内的MinION膜后，在添加44.5nM SARS-CoV-2抗刺突蛋白抗体之前和之后(间隙后)，在-50mV时，Tri-20-Spike的单通道电流轨迹。
图11示出了Tri-20-Spike和44.5nM SARS-CoV-2抗刺突蛋白抗体的抗体结合事件的散点图，表示为与Toff和相对振幅相关，A/Io，在-40mV。
图12示出了使用MinION设备的Tri-20和Tri-20-Spike纳米孔的分析。在1M盐条件下，通过单通道电流记录分析高(红色)和低(蓝色)电导状态下的(a)Tri-20和(b)Tri-20-Spike，(i)在-30mV记录的代表性单电流轨迹，(ii)在-60mV至+60mV范围内以20mV步进的电流-电压(IV)图，以及(iv)在-20mV获得的电导直方图。
图13示出了使用Oxford Nanopore Technologie的Minion设备对SARS-CoV-2抗体与Tri-20-Spike纳米孔结合的分析。示出了在(a)-100mV、(b)-80mV、(c)-70mV、(d)-50mV、(e)-40mV、(f)-30mV、(g)-20mV时，添加抗体(i)前的孔和同一个孔在添加44.5nM抗体(ii)后的示例轨迹。从3个独立的孔记录中汇编所述轨迹。
图14示出了添加(a)0nM、(b)47nM、(c)88nM和(d)218nM SARS-CoV-2抗体后，使用Orbit Mini设备获得的DNA纳米孔Tri-20-link的单通道电流轨迹，Tri-20-link是一种具有接头区域但没有SARS-CoV-2刺突蛋白版本的Tri-20孔。在1M KCl、10mM HEPES pH 7.4和+20mV中记录轨迹。
图15示出了在添加(a)0nM、(b)47nM、(c)88nM和(d)218nM非特异性(抗生物素)抗体后，使用Orbit Mini设备获得的DNA纳米孔Tri-20-Spike的单通道电流轨迹。在1M KCl、10mM HEPES pH 7.4和+20mV中记录轨迹。
具体实施方式
除非另有说明，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和化学方法的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术也在文献中进行了解释，例如M.R.Green,J.Sambrook,2012,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Fourth Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等人，(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Online ISSN:1934-3647)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O'D.McGee,1990,In Situ Hybridisation:Principles and Practice,OxfordUniversity Press；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRL Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods ofEnzymology:DNAStructure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology,Academic Press；Synthetic Biology,Part A,Methods in Enzymology,Edited by Chris Voigt,497卷,2-662页(2011)；Synthetic Biology,Part B,ComputerAided Design and DNA Assembly,Methods in Enzymology,ChristopherVoigt编辑,498卷,2-500页(2011)；RNA Interference,Methods in Enzymology,David R.Engelke,andJohn J.Rossi,Volume 392,Pages 1-454(2005)。这些通用文本中的每一个都通过引用并入本文。
在阐述本发明之前，提供了许多有助于理解本发明的定义。
如本文所用，所述术语“包括”是指必须包括任何所述元素，并且也可以任选地包括其他元素。“基本上由……组成”意味着必须包括任何列举的元素，排除会对所列元素的基本和新颖特性产生实质上影响的元素，并可任选地地包括其他元素。“由……组成”意味着排除所列元素以外的所有元素。由这些术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
本文所用的术语“膜”是指封闭或分离的选择性渗透边界、隔断、屏障或薄膜。膜有两个面或表面，它们可以分别称为顺侧和反侧。膜是薄的(即，其厚度基本上小于其宽度和长度)，从而允许其被纳米孔跨越。在本发明的上下文中，膜厚度通常在纳米(10-9米)范围内。膜的排列不受限制，并且可以采取任何形式，例如脂质体和囊泡，或者作为平面或非平面薄片。可用于本发明的膜的具体实例包括脂质双层、聚合物膜或固态基质。
本文所用的术语“固态膜”或“固态基质”是指由固态物质(即非半流体膜)形成的膜或隔断，膜或隔断中提供了一个或多个洞(hole)/口(bore)。一个或多个纳米孔可以位于一个或多个洞(hole)/口(bore)内，如序列号为8828211的美国专利中所公开的，其在此通过引用并入。固态膜可以包括有机和无机材料中的一种或两者，包括但不限于微电子材料，无论是导电的、半导电的还是电绝缘的，包括材料，例如II-IV和III-V氧化物和氮化物(如氮化硅、Al2O3和SiO2、Si、MoS2)，固态有机和无机聚合物(如聚酰胺)、塑料(如)、或弹性体(如双组件加成固化硅橡胶)和玻璃)。如序号为8698481的美国申请专利和美国专利申请出版物2014/174927所公开，膜可以由单原子层(例如石墨烯)或仅几个原子厚的层形成，两者均通过引用并入本文。可以包括多于一层的材料，例如多于一个石墨烯层，如美国专利申请出版物2013/309776中所公开的，其通过引用并入本文。序列号为6627067的美国专利公开了合适的氮化硅膜，所述膜可以被化学官能化，例如在美国专利申请出版物2011/053284所公开的，两者均通过引用并入本文。这种结构被公开了，例如序列号为8828211的美国专利所公开的，其通过引用并入本文。如公开申请WO 2009/020682所公开的，洞/口的内壁可以包被有官能化涂层。所述一个或多个洞/口可以是疏水性的或者具有疏水涂层以帮助在相应的一个或多个洞/口中提供所述一个或多个纳米孔。在已公开申请WO 03003446和WO 2016/187519中公开了用于在固态基质中提供洞/口的合适方法。
本文所用的术语“模块化”是指使用一个或多个单元或模块来设计或构建更大系统的整体或部分。在本发明的上下文中，它指的是使用单个模块、子单元或构建块来构建纳米孔。每个所述模块可以是相同的，或者所述模块可以是不同的。为了形成纳米孔，单个模块可以连接或相互连接到一个或多个其他模块。模块之间的连接方式可以是通过化学或物理方式，例如共价或非共价化学键，或者通过静电或其他吸引力。可选地或附加地，连接方式可以经由附加模块、支撑构件、零件或连锁。纳米孔的模块化设计可以包括模块的框架(frame)或框架(framework)，以及连接或支撑所述框架的附加的、通常较小的子模块，用作支柱或支撑构件。模块跨膜以形成纳米孔的通道；子模块通常不跨膜，并且仅旨在作为纳米孔的结构支撑。一些模块可以位于膜的表面上，以稳定跨膜模块的膜插入。这种位于表面的模块可以采用筏样构型，并用作一个或多个锚的定位点。可以选择模块和子模块的设计，或者它们如何连接，以支撑和加强纳米孔的形成的通道，使得其在插入膜中时保持其形状和构象完整性。所述模块或子模块可以由核酸(通常是DNA)形成。
本文所用术语“核酸”是单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3'和5'末端通过磷酸二酯键连接。多核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基组成。核酸可以包括DNA和RNA，通常是合成制造的，但也可以从天然来源分离。核酸还可以包括修饰的DNA或RNA，例如甲基化或经过化学修饰的DNA和RNA，例如用7-甲基鸟苷的5’端加帽、3’-加工(如切割和聚腺苷化)、以及剪接、或用荧光团或其他化合物标记。核酸还可以包括合成核酸(XNA)，例如己糖醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。因此，本文中所用术语“DNA”和“RNA”，应被理解为这些术语不限于仅包括天然存在的核苷酸。核酸的大小，在本文中也称为“多核苷酸”，通常表示为双链多核苷酸的碱基对数(bp)，或者在单链多核苷酸的情况下表示为核苷酸数(nt)。一千个bp或nt等于一个千碱基(kb)。长度小于约100个核苷酸的多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”。
如本文所用，术语“3′”(“3撇”)和“5′”(“5撇”)具有其在本领域中的通常含义，即用于区分多核苷酸的末端。多核苷酸具有5′端和3′端，多核苷酸序列通常沿5′至3′方向书写。术语“多核苷酸分子的互补物”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和相反方向的多核苷酸分子。
本文所用术语“双链”是指双链DNA，意思是两个互补DNA序列的核苷酸结合在一起，然后卷曲形成双螺旋。
根据本发明，与本文所述核酸序列的同源性不仅限于100％、99％、98％、97％、95％或甚至90％的序列同一性。许多核酸序列尽管具有明显低的序列通一性，但可以证明彼此的生物化学等效性。在本发明中，同源核酸序列被认为是将在低严格性条件下彼此杂交的那些(Sambrook J.等，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold SpringHarbor，NY)。
如本文所用，术语“纳米结构”是指预先设计的二维或三维分子结构，通常由生物聚合物组成，适当地由天然或非天然存在的核酸组成，该结构至少一个维度或其几何形状的一个方面在纳米级(即10-9米)内。纳米级结构适当地具有小于约100nm、通常小于50nm、最适当地小于20nm的维度或几何形状。纳米级结构适当地具有大于约0.1nm，通常大于约1nm，并且任选地大于约2nm的维度或几何形状。核酸纳米结构的组装可以在溶液中自发发生，例如通过加热和冷却预选序列的DNA链的混合物，或者可能需要存在额外的共因子，包括但不限于核酸支架、核酸适配体、核酸钉、辅酶和分子伴侣。当所需的纳米结构由一个或多个预先设计的自发自折叠核酸分子(如DNA)产生时，这通常被称为核酸“折纸”。DNA的合理设计和折叠以产生二维或三维纳米级结构和形状是本领域已知的(例如Rothemund(2006)Nature440297-302)。在经典的支架和钉的方法中，将一种或多种长的生物源支架链组件折叠成特定DNA纳米结构，所述钉组件由较短的合成钉寡核苷酸组成。适当地，支架结构可以基于M13或phiX174序列，其中多个较小的钉和接头序列被配置为实现所需的三维纳米结构几何形状。
经典的DNA纳米结构由平行排列的DNA双链分子束形成，这些双链分子排列成多边形，形成通道并刺穿膜双层。然而，核酸纳米结构的挑战仍然是磷酸二酯背景的强净负电荷阻碍向两亲性和疏水性平面膜的插入。因此，这通常有利于它们在固态环境中的应用，因为纳米通道连接或位于基底中所述的纳米级洞或口径内。然而，与这种排列相关的一个问题是，由于DNA双链分子和纳米级孔之间的不匹配，它们在传感器应用中经常表现出高水平的离子泄漏。当纳米孔嵌入孔周围的半流体膜中时，离子泄漏大大减少。
形成纳米结构的核酸序列通常是合成制造的，尽管它们也可以通过常规的重组核酸技术获得。包含所需序列的DNA构建体可以包含在微生物宿主生物体(如大肠杆菌)内生长的载体中。这将允许在生物反应器内制备大量的DNA，然后使用常规技术收获。载体可以被分离、纯化以去除外来物质，所需的DNA序列通过限制性内切核酸酶切下并分离，例如通过使用色谱或电泳分离。
本发明上下文中的术语“氨基酸”在其最广泛的意义上使用，并意味着包括天然存在的α-氨基酸或残留物。天然存在的氨基酸常用的一个和三个字母缩写如下：A＝ALA、C＝Cys、D＝Asp、E＝Glu、F＝Phe、G＝Gly、H＝His、I＝Ile、K＝Lys、L＝Leu、M＝Met、N＝Asn、P＝Pro、Q＝Gln、R＝Arg、S＝Ser、T＝Thr、V＝Val、W＝Trp、Y＝Tyr(Lehninger，A.L.(1975)Biochemistry，第二版，第71-92页，Worth Publishers，纽约)。一般术语“氨基酸”进一步包括D-氨基酸、反式反转氨基酸以及化学修饰的氨基酸，如氨基酸类似物、通常不并入蛋白质中的天然氨基酸，如去甲亮氨酸，以及具有本领域已知的氨基酸(如β-氨基酸)特性的化学合成化合物。例如，氨基酸的定义中包括苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物，其允许肽化合物的构象限制与天然Phe或Pro相同。这些类似物和模拟物在这里被称为各自氨基酸的“功能当量”。Roberts和Vellaccio，The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Grossand Meiehofer,eds.,Vol.5p.341,Academic Press,Inc.,纽约1983，通过引用并入本文。
“多肽”是通过肽键连接的氨基酸部分的聚合物，无论是天然产生的还是通过合成方法在体外产生的。长度小于约12个氨基酸部分的多肽通常称为“肽”，长度在约12至约30个氨基酸部分内的多肽可称为“寡肽”。本文所用的术语“多肽”表示天然存在的多肽、前体形式或蛋白原的产物。多肽也可以经历成熟或翻译后修饰加工，所述加工可能包括但不限于：糖基化、蛋白水解切割、脂质化、信号肽切割、前肽切割、磷酸化等。本文所用术语“蛋白质”是指包含一条或多条多肽链的大分子。
本文所用的术语“折叠蛋白”是指在形成它的多肽链(初级结构)翻译后获得某种三维形状的蛋白质。所述术语可指蛋白质的二级结构，其通常是折叠加工的第一阶段，其中形成局部三维结构，例如α螺旋或β片层。所述术语可以更典型地指蛋白质的三级结构，其中蛋白质的二级结构已经折叠以通过疏水或共价相互作用稳定结构。所述术语还包括具有四级结构的蛋白质，其中一个或多个蛋白质亚基是组装的。在适当的情况下，所述折叠的蛋白质也可以被称为“天然”蛋白质结构，并且可以是表现出其生物功能的蛋白质的形式。
本文所用的术语“内部宽度”是指在垂直于通道纵轴的平面(即横截面)中，从一个壁的内表面上的位置到相对壁的内面，跨越通道内部(例如内腔)的直线距离。通道的内部宽度可以沿着其纵轴是恒定的，或者可以因一个或多个收缩的存在而变化。“最小内部宽度”是在通道入口和出口之间，沿通道纵轴的最小内部宽度。通道的最小内部宽度定义了可以通过通道的物体(例如分析物)的最大尺寸。在内腔的横截面是圆形或由规则多边形组成的情况下，内部宽度可以对应于内腔的内径。然而，应当理解的是，在本发明的实施方案中，纳米孔的配置为纳米孔可以具有在横截面上有不规则多边形或圆形形状的内腔，使得其可以有几个内部宽度。
如本文所用，术语“疏水性”是指具有非极性的分子，包括有机分子和聚合物。例如饱和或不饱和碳氢化合物。所述分子可能具有两亲性。
如本文所用，术语“疏水修饰”涉及用一个或多个疏水部分修饰(连接、结合或以其他方式连接)多核苷酸链。本文定义的“疏水部分”是疏水性有机分子。所述疏水性部分可以是包含非极性或低极性脂族、脂族-芳族或芳族链的任何部分。适当地，本发明所用的疏水部分包括分子，例如长链碳环分子、聚合物、嵌段共聚物和脂质。本文所定义的术语“脂质”是指脂肪酸及其衍生物(包括三甘油酯、二甘油酯、单甘油酯和磷脂)，以及含甾醇的代谢产物，如胆固醇。包含在本发明的实施方案中的疏水部分能够与磷脂双层(例如细胞的基于脂质的膜)形成非共价吸引相互作用，并充当纳米孔的膜锚。根据本发明的某些实施方案，具有膜锚定性质的合适的疏水部分，例如脂质分子，可以包括甾醇(包括胆固醇、胆固醇衍生物、植物甾醇、麦角甾醇和胆汁酸)、烷基化酚(包括甲基化酚、多萜醇和生育酚)、黄酮(包括含黄烷酮的化合物，如6-羟基黄酮)、饱和和不饱和脂肪酸(包括衍生物，如月桂酸、油酸、亚油酸和棕榈酸)和合成脂质分子(包括十二烷基-β-D-葡糖苷)。聚合物膜的锚可以与脂质双层的锚相同，或者它们可以不同。可以基于所选择的膜的结合性能来选择特定的疏水部分锚。
本发明的纳米孔可以包括至少一个，或任选地，两个或多个膜锚，所述膜锚用于将亲水性DNA纳米孔附着、连接或锚定到通常疏水的膜(脂质双层或聚合物)。所述锚可以是疏水性锚，且可以进一步选自脂质锚和卟啉。所述脂质锚附着于孔或包含在模块内，所述模块形成孔的整个纳米结构的一部分。模块可以嵌入膜内(即跨膜)，或者可以位于膜的顺式或反式表面上，并与跨膜纳米孔的孔隙相连接。合适的附着通过DNA寡核苷酸或DNA多核苷酸，其在5'或3'末端携带至少一个脂质锚，合适的为胆固醇。在链合成反应中，可以使用修饰的亚磷酰胺对多核苷酸或寡核苷酸进行官能化，所述亚磷酰胺易于与反应性基团(如胆固醇和脂质)或连接基团(包括硫醇和生物素)的附加物相容。使用末端转移酶的酶修饰也可用于将寡核苷酸结合到单链核酸(例如ssDNA)的3’，寡核苷酸掺入了诸如锚的修饰。这些脂质修饰的锚链可以通过“接头”寡核苷酸与DNA序列的相应部分杂交，形成孔支架部分。可选地，使用脂质修饰的寡核苷酸将脂质锚与孔组装，所述寡核苷酸作为支架或钉链起作用。也可以采用使用至少一个，或任选地两个或多个膜锚的锚定方法的组合，其中锚结合到支架链、钉链和适配体寡核苷酸中的一个或全部中。已经发现胆固醇是特别适合用作本发明中的锚的脂质。可以考虑使用其他脂质作为锚，尽管可以预期对于给定的膜，对特定的脂质和给定数量的膜锚有特别的偏好。
在本发明的替代实施例中，疏水改性包括并入纳米孔结构本身的一种或多种合成核酸(XNAs)。
根据本发明的具体实施方案，所述包含至少一个疏水锚的纳米孔，所述疏水锚包括多核苷酸链和至少一个疏水锚分子，其中所述至少一个疏水锚分子：
a.附着于纳米孔的外围并基本等距间隔，其中至少一个疏水锚分子径向远离纳米孔中心内腔的纵轴；和/或
b.附着在纳米孔或其部分的膜面侧，使得一旦插入，所述至少一个疏水锚分子被定向为与膜相互作用和/或垂直延伸到膜中。
在本发明的任选实施例方案中，所述纳米孔包括至少四个疏水锚分子。
其中可以插入本发明的纳米孔的膜可以是任何合适类型的。根据预期用途，所述膜可以是脂质双层或聚合物片层或薄膜。所述膜适当地为两亲性层。两亲性层可以是单层或双层。两亲性层是由同时具有亲水性和亲脂性的两亲性分子形成的层。两亲性分子可以是合成的或天然存在的。包括膜的分子的亲脂性性质促进通过纳米孔的脂质锚定或纳米孔其他疏水锚定区域的锚定。令人惊讶的是，本发明的核酸纳米结构能够完全成功地插入到膜中，因为膜的疏水性导致主要带负电荷的DNA骨架的排斥。可以预期，本发明的纳米结构将仅在膜的一个表面上形成聚集的聚集体，这通常是不能成功插入两亲性单层或双层的复杂核酸纳米结构的情况。因此，纳米结构嵌入这种膜内的能力是令人惊讶和最意想不到的。
在本发明的具体实施方案中，两亲性层可以是脂质双层。脂质组合物可以包括天然存在的脂质，例如磷脂和双极性四醚脂质，和/或人工脂质。脂质通常包括头部基团、界面部分和两个疏水性尾部基团，它们可以相同或不同。合适的头部基团包括但不限于中性头部基团、两性离子头部基团、带负电的头部基团和带正电的头部。脂质的头部基团或尾部基团可以被化学修饰。
专有和非专有合成聚合物薄膜或片层被广泛用于“基于芯片”的纳米孔测序和分析传感器应用，所述分析传感器如Oxford Nanopore销售的/>系统；/>销售的GS/>和GS/>系统；/>销售的/>GenomeAnalyzer/>和/>系统；Life Technologies销售的Ion/>系统和Ion Proton/>Beckman/>销售的/>系统；和Pacific销售的PacBio/>和/>系统。例如，纳米孔成功插入这种类型的聚合物膜的能力允许这些系统适用于各种折叠蛋白质传感应用。这种类型聚合物膜的能力允许这些系统适用于各种折叠蛋白传感应用。
非天然存在的两亲性分子和形成两亲性膜层的两亲性分子是本领域已知的，包括例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人，Langmuir,2009,25,10447-10450)。嵌段共聚物可以是二嵌段(由两个单体亚基组成)，但也可以由两个以上的单体亚基构建，以形成表现为两亲性分子的更复杂的排列。所述共聚物可以是三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。所述膜可以选择PCT/GB2013/052767中公开的膜中的一种，其全部通过引用并入本文。可以对两亲性分子进行化学修饰或官能化以促进纳米结构的插入偶联。膜可以包括脂质和两亲性聚合物，如PCT/US2016/040665中公开的。
基于聚合物的膜可以由任何合适的材料形成。通常，合成膜由两亲性合成嵌段共聚物组成。亲水性嵌段共聚物的实例为聚乙二醇(PEG/PEO)或聚(2-甲基恶唑啉)，而疏水性嵌段的实例为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚己内酯(PCL)、聚丙交酯(PLA)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。在实施方案中，所使用的聚合物膜可由两亲性嵌段共聚物聚2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱-b-二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(PMPC-b-PDPA)形成。可以通过孵育将DNA纳米孔插入这种多聚体的壁中。在不希望受理论约束的情况下，人们认为一种插入过程广泛地包括第一步骤膜栓系，随后是第二步骤DNA孔相对于膜定向，以实现完全插入。然而，这需要将脂质膜锚包含在孔内，或者至少连接到孔，没有这些锚就不能进行插入。对于本发明的替代配置，特别是当核酸类似物(例如XNA)包含支架和/或钉链的一些或全部骨架时，可以设想可以观察到更复杂的插入动力学。应当理解，在支架和钉链结合能够介导与膜的疏水相互作用的合成生物聚合物骨架成分的情况下，插入过程可以包括也可以不包括与膜共面排列的初始阶段，随后是插入阶段。
膜通常是平面的，尽管在某些实施方案中它可以是弯曲的或做成某种形状的。还可以是两亲性膜层。适当地，所述膜是脂质双层或单层。形成脂质双层的方法是本领域已知的，例如在国际申请号PCT/GB2008/000563中所公开的。脂质双层通常通过Montal和Mueller(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1972；69:3561-3566)的方法形成。
在本发明的另一个实施方案中，膜可以包括固态层。固态层可以由有机和/或无机材料形成，所述材料包括但不限于微电子材料、诸如Si3N4、Al2O3和SiO的绝缘材料、玻璃、诸如聚酰胺和塑料的有机和无机聚合物。固态层可以由诸如PCT/US2008/010637所公开的石墨烯形成。膜可以设置有从膜的一侧延伸到另一侧的纳米级尺寸的一个或多个通孔。固态洞的内壁可以涂覆有脂质，例如US2017/0023544中所公开的，或者被化学官能化，例如PCT/US2008/063066所公开的，以便于将本发明的纳米结构到固态层的合适锚定。
在本发明的具体实施方案中，所述膜可选自：包括由聚合物形成的半流体膜的膜；以及固态膜。在本发明的任选实施方案中，形成半流体膜的聚合物可由两亲性合成嵌段共聚物组成，适当地选自亲水性共聚物嵌段和疏水性共聚物嵌段。在本发明的进一步的实施方案中，膜是囊泡、胶束、平面膜或液滴的形式。在本发明的替代实施方案中，固态膜可由选自II-IV族和III-V族氧化物和氮化物、固态有机和无机聚合物、塑料、弹性体和玻璃的材料形成。
根据本发明的一个实施方案的纳米孔是嵌入在膜或隔断表面内并且其至少一部分定向为基本上与膜或隔断表面共面的跨膜或固态基板的核酸纳米结构。在本发明的一个实施方案中，纳米孔以类似于安装在平面或弯曲片层材料中的索环或孔眼的方式定位在膜或基板中。因此，在本发明的特定实施方案中，本发明的核酸纳米结构被定义为纳米级索环或孔眼，这与可以是圆形或多边形的通道的形状无关。根据本发明的该实施方案，与延伸到膜外的纳米结构的比例相比，纳米孔的大部分纳米结构嵌入在膜内。在本发明的另一个实施方案中，纳米结构包括一个或多个模块，其可以从孔的一侧或两侧径向延伸，但与膜的表面(例如顺式或反式表面)基本共面并位于膜的表面上。在这种实施方案中，模块可以形成与表面相连的筏结构，所述筏结构从孔中的孔隙向外辐射。
适当地，本发明的纳米孔包含一条或多条提供功能性支架组件的多核苷酸链，其中包含在支架组件内的多核苷酸链包括多核苷酸骨架；和提供多个功能性钉组件的多条多核苷酸链。支架链与多条钉多核苷酸链协作并杂交，例如通过适当的Watson-Crick碱基配对杂交，以形成纳米孔的三维构型。纳米孔被期望组装成环形、椭圆形、规则或不规则的多边形结构，能够嵌入膜或隔断表面内，使得钉组件的5’至3’方向的大部分与膜共面。因此，在嵌入膜内或与膜共面(例如位于膜上)的模块内，模块的钉组件的5’至3’方向的大部分与膜的方向共面。这与纳米结构相反，所述纳米结构包括5′至3′垂直定向的核酸束，例如，在束中，穿过并延伸至膜外部。
本发明的纳米孔可以通过“支架和钉”方法组装。在核酸纳米结构的这一重要途径中，DNA被用作构建材料，以制造纳米级的三维形状。由多个未杂交的线性分子组装这些复杂的纳米结构通常被称为“DNA折纸”。DNA折纸加工通常包括使用多条合理设计的“钉”DNA链将一条或多条细长的“支架”DNA链折叠成特定形状。支架链可以具有任何足够不重复的序列。钉链的序列被设计为使得它们与支架链的特定限定部分杂交，并且在这样做的过程中，这两个组件协作迫使支架链呈现特定的结构配置。可用于制造DNA折纸结构的方法可在例如Rothemund,P.W.,Nature 440:297-302(2006)；Douglas等人,Nature 459:414-418(2009)；Dietz等人,Science 325:725-730(2009)和序列号为2007/0117109、2008/0287668、2010/0069621和2010/0216978美国专利申请公开中发现，其每一个通过引用全部并入本文。可以使用例如CaDNAno软件(在http://www.cadnano.org可用)或DAEDALUS在线平台(在http://daedalus-dna-origami.org可用)来促进钉序列设计。
在本发明的实施方案中，钉和/或支架组件还包括连接到其上的多个疏水性膜锚分子。疏水性锚(或部分序列)有助于将纳米孔插入弯曲的或平面的膜中，使得第一支架多核苷酸链的主要部分的方向基本上平行于膜的表面，并且其中第一支架多核酸链嵌入膜内并且基本上与膜共面。在提及支架多核苷酸链的“主要部分”时，这意味着基本上超过50％，适当地超过60％，甚至超过70％，以及高达90％的该链的总长度被定向为使得其基本上与膜共面。在一个特定的实施方案中，支架链的整个长度，除了在所得纳米孔上赋予三维结构所必需的交叉点和/或霍利迪连接体之外，被定向为使得其基本上与膜共面。应当理解，DNA折纸技术允许具体结构的变体，然而，这些变体落在本发明所述纳米结构的总体设计限制范围内。例如，当在与适当的钉链杂交后组装时，支架链可以由多条较短的支架链组成，它们将以等同于单一长度支架链的方式协同工作。
在本发明的实施方案中，纳米孔由一个或多个模块形成或构建。在实施方案中，纳米孔可以由形成基本框架或框架的模块排列形成。在实施方案中，框架的模块由连接并支撑框架结构的附加的、通常较小的子模块支撑。模块的至少一部分旨在形成纳米孔的通道壁的至少一部分，因此模块被设计和配置为跨越其插入的膜。子模块仅旨在结构益处，因此不旨在或被配置为跨膜。虽然框架的每个模块或子模块可以是不同的，但适当地，框架的模块是适当地基本上或完全相同的单元，形成支撑的子模块也是如此。在这些实施方案中，模块和子模块各自由相同的支架和钉DNA结构形成，并以相同的方式组装。单个模块可以通过DNA链连接，DNA链与模块成一体，或者与每个模块杂交。虽然可以设想模块的任何排列，但适当地，对于圆形和椭圆截面的纳米孔，模块可以排列成彼此叠置以形成大致中空的堆叠或塔，从而形成通道。适当地，对于具有多边形横截面的纳米孔，模块被布置为使得它们并排地位于膜的平面中。也可以设想上述排列的组合。模块可以具有可调节的边长(在本文中，边长被定义为平行于膜平面的模块的最长尺寸)，当选择合适的最终总体形状时，其允许制备不同尺寸和/或形状的纳米孔，和在这些孔的通道内的不同大小和(或)形状的内腔。由此限定的通道和内腔可以是规则的或不规则的形状。例如，通道定义的内腔可以是规则多边形或不规则圆形或多边形，例如三角形、四边形(例如正方形、矩形或梯形)、五边形、六边形、七边形、八边形等。可选地，所述通道可以是细长圆形(椭圆形)或细长多边形，例如矩形、长方形或由4条或4条以上边形成的槽形通道。通常，模块的边长在约10nm和20nm之间(图8)。适当地，所述模块的边长可以是至少2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm或10nm。适当地，所述模块的边长最多可以是30nm、25nm、20nm。子模块的大小由模块之间的间距决定，而模块之间的间隔又由孔的形状以及所用模块的大小和数量决定。适当地，模块的边长可以是至少0.5nm、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm或5nm。适当地，所述模块的边长最多可以是10nm、7.5nm或5nm。
如本文所用，术语“基本上”是指行为、特征、特性、状态、结构、项目或结果的完全或几乎完全的范围或程度。例如，一个物体与另一个物体“基本上”共面意味着所述物体要么完全共面，要么几乎完全共面，可能与完全一致性几乎没有变化程度。如本领域技术人员所理解的，在某些情况下，偏离绝对完整性的确切允许程度可能取决于特定情况。然而，一般而言，与绝对一致性的接近程度将具有相同的总体结果，例如功能等效，如同实现了完全一致性。
本发明的纳米孔的三维构型限定了至少一个通道，适当地是跨膜的单个通道，所述通道具有最小内部宽度为至少约3nm的内腔。适当地，当垂直于孔所在的膜的平面观察时，本发明的纳米孔具有单个通道，所述通道至少基本上位于孔结构的中心。所述通道限定了穿过纳米孔的内腔，所述内腔垂直于由膜限定的平面轴。所述横截面中通道的最小开口或孔径(例如，最小收缩)适合于促进与折叠蛋白质或其他分析物的紧密结合相互作用。通常，最小开口为至少3nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm或15nm或更大。适当地，内腔的宽度在大约10nm和大约20nm之间。适当地，所述通道的最大开口(即最小收缩)至多为200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、40nm、30nm、20nm、18nm、15nm、12nm或10nm。适当地，通道的最小开口(即最小收缩)的横截面积为至少5nm2、12nm2、15nm2、25nm2、35nm2、40nm2、45nm2或50nm2或更大。适当地，通道的最小开口(即最小收缩)的横截面积为至多35000nm2、25000nm2、15000nm2、10000nm2、5000nm2、1500nm2、1000nm2、750nm2、500nm2、250nm2、100nm2、50nm2、30nm2、20nm2或15nm2、10nm2、7nm2或更小。
根据本申请的一个实施方案，所述纳米孔限定了内腔，所述内腔沿着纳米结构的中心轴延伸，因此限定了至少第一和第二开口。所述第一和第二开口可以被称为孔隙(例如第一和第二孔隙)，并允许流体通过孔的内腔连通。适当地，所述第一孔位于纳米孔的顺侧，第二孔位于反侧。当纳米孔嵌入膜或固态基质中时，通过孔的流体连通允许可测量的带电离子流通过孔——即，可测量的电流通过纳米孔穿过膜或基质隔断。
如图1(A)-(C)所示，在一个实施方案中，感测配置包括嵌入平面膜或固态隔断中的纳米结构10。所述纳米结构包括具有上述的具有内腔11的核酸纳米孔，所述内腔的开口端限定了第一和第二孔隙。纳米结构插入并跨膜或固态隔断，两侧有溶液。在与第一孔隙接触的膜的第一侧，放置包含待测试分析物的样品流体。
在第一实施方案下，通过测量离子电流产生信号读数，所述离子电流通过纳米孔从膜的第一侧流到第二侧或相反，其通过溶液中存在的可溶性离子的梯度进行。这种电流的流动在给定时间段是可以测量的。应当理解，可能存在替代读数，用于识别分析物何时在孔内腔最佳定位。例如，可以使用基于场效应晶体管(FET)、量子隧道和荧光和等离子体传感等光学方法的替代检测模式。例如，固态FET纳米孔与相邻纳米带、纳米管或纳米线的组合允许感测与孔内腔相互作用的分析分子，从而破坏通过孔的局部电离子电流。在替代实施方案中，可以进行穿过膜的电压、电流或阻抗的横向电测量，以便在分析物结合时产生可检测的信号读数。应当理解，尽管采用了读数技术，但分析物和相应几何优化的纳米结构之间结合的高保真性将提高信号灵敏度并降低背景噪声。
纳米结构可以进一步包括一个或多个结合部分，所述结合部分可以包括亲和结合组分或能够与亲和结合分子的结合的分子，例如抗原。如图3所示，适当地，结合部分20位于第一孔隙附近或内腔11中(如图3(A)中的区域x所示)。这有助于在第一孔隙附近结合分析物。在图3(B)中，示出了替代实施方案，其中结合部分20栓系到纳米孔的位置，所述位置允许结合部分完全或部分伸到内腔11外部。在分析物结合时，通过第一孔隙，然后通过纳米结构的内腔的电流被阻塞，导致通过纳米孔的电流的全部或大部分被阻断。可以测量信号读数水平(如电流阻断)，以识别检测到的分析物。一个或多个结合部分可以通过共价或非共价键合连接到孔上，例如通过亲和素-生物素或His-标签型的相互作用。
根据本发明，通过优化纳米孔的几何形状来提供更有效的信号，使得其适应并符合仅分析物、或结合部分-分析物复合物组合的三维构型的某些部分或实质部分的形状。例如，可以生成更有效的电流阻断或其他电输出信号。在图4(A)中，描绘了三角形纳米孔，其具有附着在内腔内壁上的结合部分。在这种情况下，所述分析物是IgG型抗体，所述结合部分可能是抗原，其被抗体识别(见图4(B))。在图5(A)中，示出了五边形纳米孔，其中结合部分位于纳米孔相邻壁之间的内部接合/拐角处。在图5(B)中，结合部分被多结构域蛋白复合物(例如IgM或IgA型多肽)识别和结合。因此，纳米孔被配置为使得它接收分析物到内腔或至少到第一孔隙的区域。这需要在纳米孔内腔的三级结构构象方面具有互补几何的对应性，以便允许与分析物的高保真相互作用。因此，内腔的几何结构促进了分析物与结合部分的结合。然而，纳米孔本身并不与分析物共价结合，也不以任何方式与分析物共价结合。相反，内腔和第一孔隙提供了合适的几何支持，其中可能发生结合部分和分析物之间的亲和结合相互作用。这可以通过温和的静电相互作用、范德华力或弱氢键来实现。
在本发明的实施方案中，优化纳米孔几何结构的方法使得基本上形成本文所述纳米孔。
本文所述传感纳米孔的一个特征是，内腔和/或孔隙的几何形状可以最佳配置为在分析物结合时提供确定的电流读数。如纳米孔接收分析物的方式所示，预先定义的形状互补性是有助于提高读取保真性和降低背景信号“噪声”的优点之一。通过优化分析物结合位点所述的纳米孔内腔和/或孔隙的几何结构提供的另一个优点是，对于给定分析物，它可以限定特定电流阻断，如特定值或阈值读数。这可能有助于诊断或筛选应用，其中多个分析物可能存在于样品溶液中，所述样品溶液可能以非特异性相互作用占据孔的几何形状，但只有一类分析物将以高特异性结合，从而达到阈值读数。例如，在类似来源的多种化合物的高通量文库筛选中，配置纳米孔的几何结构，使其有利于所需靶分析物的特定结合相互作用(如通过满足特定阈值的电流阻断被识别)是有利的。对于具有基本上无法改变的预定义结构的蛋白质纳米孔，目前不可能进行这种水平的分析物特异性优化。
配置纳米孔几何结构的一个优点是，它有利于对所需靶分析物的特定结合相互作用，这进一步增加了可从给定分析物结合事件中有效获得的信息。除了优化的电或其他信号生成(例如电流阻塞)，结合的保真性还可以提供特定类型分析物所独有的特定可检测特征。当可能存在多个密切相关的靶分析物时，例如当存在分析物的密切相关异构体时，或者当存在分析物的不同多聚体形式时，信号特征可能是有用的。在这种情况下，提供反映不同结合事件随时间变化的特征的读数是非常有价值的。在替代情况下，可以通过选择适当的互补孔几何形状来优化其他结合事件，以允许测量信号振幅和/或信号持续时间(例如，开/关时间)。因此，本文所述的传感纳米孔促进了更多的多样性，以及优化的可测量传感器输出范围，这可以与先前认为的可能相比，更好地区分要获得的分析物信息。
确定个体过去是否接触过感染性疾病(如新冠肺炎(COVID)或艾滋病毒(HIV)的一个重大挑战涉及识别该个体血浆中的循环抗体。在本发明的具体实施方案中，图2(A-C)示出了固定在三角形核酸纳米孔内腔的SARS-CoV-2刺突蛋白(i)的结合部分。选择纳米孔的几何形状以有利于IgG抗体分析物(ii)的结合，特别是，孔限定了内腔，所述内腔内侧长度约为20nm的等边三角形。所述纳米孔可以嵌入合适的膜中，并暴露于包含分析物的样品溶液中。分析物的结合发生在纳米孔的内腔内。通过测量电流阻断或其他电或非电信号读数，可通过选择纳米孔的适当形状和尺寸优化结合和检测的特异性。IgG抗体的大小通常约为10nm，选择纳米孔内腔、孔隙大小和形状，以适应抗体，允许最佳的测量信号。相比之下，IgM抗体复合物的大小更大，在约35nm左右，具有不同的形状和构型，因此需要具有不同互补几何形状的纳米孔。因此，三级纳米结构在尺寸、几何形状和结合部分位置(即内腔内或附近)方面的构型也可能影响分析物结合的空间或区域选择性等因素。因此，纳米孔大小/形状的尺寸排阻，改善了长结合靶分析物相互作用和短非靶分析物信号之间的信噪比。
在本发明的特定实施方案中，亲和结合分子包括SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)或其片段或衍生物。
在本发明的具体实施方案中，所述分析物结合部分包括栓系至纳米孔的亲和结合分子。
亲和结合部分可以包括多核苷酸或多肽，能够结合存在于溶液中的分析物，所述溶液围绕嵌入纳米孔的膜。当结合分子包括栓系在纳米孔的多肽或多核苷酸时，无论在内腔、孔隙内还是接近纳米孔的顺侧或反侧，所述多肽可以选自：
I.酶——包括聚合酶、解旋酶、促旋酶和端粒酶，以及核酸结合亚结构域或其衍生物；
II.合成或天然来源的亲和结合蛋白和肽——包括亲和蛋白(Affimer)、抗原结合微蛋白、工程化多重复蛋白、锚蛋白结合结构域、乳铁蛋白、cathelicidins、纤维凝胶蛋白、胶原凝集素、T细胞受体结构域和防御素；
III.抗体——包括多克隆、单克隆、人源化和骆驼抗体，或其抗原结合片段及其衍生物，包括Fab、scFv、Bis-scFv、VH、VL、V-NAR、VhH或任何其他抗原结合单结构域抗体片段；
IV.合成或天然来源的亲和结合核酸和核酸类似物，包括寡核苷酸探针、适配体和核酶；
V.天然存在或合成的小分子，包括药物、荧光团、代谢物和趋化因子；
VI.抗原或抗原片段；和
VII.信号分子和/或其多肽受体，包括受体的结合结构域，以及受体复合物。
可选地，所述亲和结合分子可以包括小分子、脂质基团、多糖基团、聚合物或能够与溶液中的分析物进行特异性亲和结合相互作用的任何其他天然存在或合成的分子。
在替代实施方案中，纳米结构可能缺乏任何形式的结合部分，并可能依赖于孔或内腔的几何优化以有进行效分析物结合。在这种实施方案中，纳米结构可以包括基底，所述基底包括嵌入一个或多个纳米结构的膜或固态隔断。所述纳米结构是纳米孔，所述纳米孔通常被配置为将分析物接收到内腔中或至少接收到第一孔隙区域。这要求在纳米孔内腔的三级结构构象方面具有互补几何对应性，以促进与分析物的高保真相互作用。所述纳米孔内腔可以被规则或不规则赋形，以确保与分析物或分析物的一部分的三级结构(如其结构域或亚基)紧密的几何对应。紧密对应可被限定为内腔外围和分析物表面之间的间隙，当分析物位于纳米孔内腔内时，在内腔周围的任何点不超过5nm、4nm、3nm、2nm、1nm或0.5nm，适用于几何最佳方向。可选地，紧密对应可定义为当分析物定位在纳米孔的内腔时，至少>80％、>85％、>90％、>95％或高至100％的内腔横截面区域被阻塞，适用于几何最佳方向。内腔可以是规则或不规则多边形，如三角形、四边形(如正方形、矩形或梯形)、五边形、六边形、七边形、八边形或这些形状的组合。可选地或另外地，通道可以包括圆形、细长圆形(椭圆形)或细长多边形的组件，例如由4个或更多边形成的矩形、长方形或槽形通道。通过非限制性示例，几何优化以适应IgG分析物所述的纳米孔可以被配置为具有通常三角形或甚至Y形的内腔。几何优化可以包括将纳米结构配置成以匹配接合(例如锁和钥匙型布置)的方式接收全部或部分分析物。应当理解，在不存在结合部分的情况下，几何优化以允许可检测的分析物结合，也可以并入本文所述的包括结合部分的实施方案中。
本发明的纳米孔结构适合用于传感器应用，所述传感器应用允许检测可能存在于待测溶液中的各种潜在分析物。示例性分析物可以包括：
ο肽/多肽/蛋白质-折叠的、部分/完全未折叠；
ο酶；
ο蛋白质/核酸构建体；
ο由大小定义的分子；
ο在特定大小范围内的大分子，例如，在选自1-10kD、1-50kD、1-100kD、10-50kD、10-100kD，20-50kD和20-100kD的范围内；
ο多蛋白复合物；
ο抗原或其抗体；
ο糖蛋白；
ο碳水化合物；
ο生物聚合物；
ο毒素；
ο代谢物及其副产物；
ο细胞因子；
ο核酸类
本发明的纳米孔结构可以结合在多个改进的设备和传感器中。这种设备和传感器在需要感测和表征各种材料和分析物的应用中是有用的。作为非限制性示例，特别有用的应用，包括基因组测序、蛋白质测序、其他生物分子测序，以及离子、分子、化学品、小分子、生物分子、金属原子、污染物、聚合物、纳米颗粒等的检测。反过来，这种检测和表征可用于诊断疾病、药物开发、识别食品或水供应的污染或掺假，以及质量控制和标准化。
根据如上所述的本发明的示例性实施方案，传感器设备通常包括基板，所述基板包括嵌入了一个或多个纳米孔的膜或固态隔断。放置衬底以便于与包括分析物的流体(任选地，电解质溶液)接触。相对于基板定位至少一个且任选地多个设备，其中给定设备响应于对一种或一种或多种分析物与纳米孔的结合和/或通过纳米孔的检测而产生信号(例如，机械的、电的和/或光学的)。多个设备可以是大于2个且多达100个、或多达20个、或多达10个、或介于2个和8个设备之间。每个设备可以选自以下的一个或多个：场效应传感器、等离子体传感器、基于激光的传感器、干涉式传感器、波导传感器、悬臂传感器、声学传感器、石英晶体微量天平(QCM)传感器、超声波传感器、机械传感器；热传感器、基于光学染料的传感器、荧光传感器、量热传感器、发光传感器、石墨烯传感器、量子点传感器、量子阱传感器、光电传感器、2D材料传感器、纳米管或纳米线传感器、酶传感器、电化学传感器、包括FET或BioFET传感器、电位传感器、电导传感器、电容式传感器以及电子自旋传感器。这些设备可以以阵列的形式进行协作，从而允许对多个分析物进行多重测试。传感器设备可以进一步包括专用硬件和系统(例如，电路、处理器、存储器、GUI等)以执行指定功能或动作，或者专用硬件和计算机指令的组合，以便提供能够向用户提供有意义的读数的功能传感器设备。
在本发明的特定实施方案中，所述设备是便携式的。在任选实施方案中，本文所述的纳米孔包含在流动池中。在本发明的进一步任选实施方案中，本文所述的纳米孔嵌入由流动池组成的膜中。在本发明的具体实施方案中，本文所述的纳米孔嵌入流动池内组成的固态隔断中。在更具体的实施方案中，本文所述的装置还包括电测量装置和/或荧光测量装置。
因此，根据本发明的实施方案，适当配置的纳米孔设备可以实现各种不同类型的传感器测量。通常，电测量包括：电流测量、阻抗测量、隧道测量(IvanovAP等人，NanoLett.2011Jan 12；11(1):279-85)，和FET测量(国际申请WO 2005/124888)。光学测量可以与电测量相结合或基于电测量(Soni GV等人，Rev Sci Instrum.2010Jan；81(1):014301)，例如，通过将离子电流转换为来自指示剂染料(例如Fluo-8)的荧光信号，所述荧光信号是由通过纳米孔的Ca2+通量引起的(Huang等人，Nat Nanotechnol.2015Nov；10(11):986-991)。如前所述，测量可以是跨膜电流或电压测量，例如流过纳米孔的离子电流的测量。可选地，可以通过测量横向膜电流、电压和/或阻抗值随时间的变化来获得信号。
在替代实施方案中，分子感测的方法可包括：
I.提供如本文所述的传感器设备；
II.使纳米孔与分析物分子接触，并建立通过至少一个纳米孔的离子流或穿过纳米孔的电子流；和
III.测量穿过所述纳米孔的电信号，
其中所述分子感测包括分析物分子检测或表征，其中电测量的变化指示所述分析物分子。
在本发明的任选实施方案中，所述电测量选自:电流测量、阻抗测量、隧道测量和场效应晶体管(FET)测量。
本发明通过以下非限制性实施例来进一步说明。
实施例
实施例1-分析携带SARS CoV 2刺突蛋白的膜结合三角形孔中电流阻塞阻断以检测溶液中抗刺突蛋白抗体分析物
等边三角形核酸膜结合纳米孔被用作测试纳米孔，所述纳米孔限定了三角形内腔和进而形成的三角形孔隙。
选择具有20nm的侧长的孔，从而提供约17nm的最大内部宽度。通常IgG抗体长度约为10nm，形状大致Y形，因此孔的几何形状被选择为与分析物的几何形状相对应。孔通过DNA折纸使用phiX174支架构建，并基本上对应于WO-2020/025974-A中描述的钉核酸序列和方法。
phiX174支架序列如下表1所示：
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下表2提供了钉序列(SEQ ID NO:2-76):
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分析物结合分子通过氨基三乙酸(NTA)缀合方法与纳米孔连接。可以用NTA修饰Oligo-DNA，NTA通过Ni2+或Co3+的络合对与重组蛋白(例如新冠刺突蛋白)连接的His-标签具有高亲和力(Shimada等人，(2008)Biotechnology Letters,第30卷，第2001-2006页)。用于通过NTA修饰的DNA序列使结合部分与纳米孔连接的序列如下表3所示，所述NTA修饰的DNA序列与钉接头序列的一部分杂交。
用作分析物的人SARS-CoV-2抗体来自Antibodies-online(ABIN6952547)。用作结合蛋白的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD(受体结合域，45pmol)来自同一公司(ABIN6952627)。
为了制备携带SARS-CoV-2刺突蛋白的核酸传感孔(Tri-20-Spike孔)，将NTA修饰的DNA寡核苷酸(30pmol)与含有CoCl2(20μM)、NaCl(400mM)和吐温20(0.02v/v％)的HEPES缓冲液(25mM，pH 7.6)中His标记的SARS-CoV-2Spike 1蛋白混合，并在室温孵育1小时。所述溶液用H2O2处理1小时。然后通过10％的PAGE分析检查DNA蛋白缀合物。然后将新鲜制备的DNA蛋白缀合物与纯化的Tri-20以1.5:1的比例混合，所述Tri-20载有DNA蛋白缀合物的互补结合链，并在室温下孵育1小时。所述Tri-20-Spike孔等分并储存在-20℃备用。
使用基于集成芯片的并行记录装置(Orbit Mini和Orbit 16，NanionTechnologies，慕尼黑，德国)和多电极腔阵列(MECA)芯片(IONERA，弗莱堡，日耳曼尼亚)进行单通道电流记录。由溶解在辛烷中至最终浓度为10mg/mL的1,2-植烷酰磷脂酰胆碱(DPhPC)形成双层。电生理缓冲液由1M KCl、10mM HEPES组成，pH 7.4。对于孔插入，Tri-20-Spike孔以2:1(体积/体积)的比例与0.5％OPOE(聚乙二醇单辛醚(n-octyloligooxyethylene)在1M KCl、10mM HEPES、pH 7.4中混合。将混合物施加到顺式室中，并通过电导步骤的增加来监测插入。电流轨迹未经贝塞尔滤波，并使用Element DataRecorder软件(Element s.r.l.，意大利)在10kHz下采集。
对于蛋白感测试验，将抗刺突蛋白抗体(分析物)在电生理缓冲液中稀释至所需浓度。在成功插入纳米孔后，将稀释的蛋白质加入顺式室。Orbit 16用于蛋白感测实验；Orbitmini用于所有其他电生理实验。Orbit 16和Orbit mini分别在顺式和反式处接地。为了便于比较，对电压进行了归一化，并表示为相对于顺式室为正。使用Clampfit软件(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，美国)进行单通道分析。
如图6(a-c)所示，使用普通的未功能化三角形纳米孔来建立基线电流测量、电流-电压曲线和电导直方图。在图7(a-c)中，示出了用SARS CoV 2刺突蛋白功能化的三角形纳米孔(Tri-20-Spike孔)的电流结果、电流电压曲线和电导直方图，所述SARS CoV 2刺突蛋白通过添加N-末端His6标签作为经由Co3+金属螯合桥连接到纳米孔的结合部分而被修饰(参见图2B)。正如预期的那样，由于刺突蛋白堵塞了部分孔内腔，通过所述功能化孔的电流较低。如图8(a)所示，在纳摩尔浓度下快速检测到作为分析物的抗刺突蛋白抗体的存在，其中电流的快速下降被称为“阻断”，代表单个抗体与DNA纳米孔的结合。结合事件用散点图总结(图8(b))，其中每个结合事件用一个点来表示，所述点由阻断的持续时间和阻断的电流幅度来定义。
通过散点图对电流记录的分析表明，与孔结合的抗体导致电流阻塞事件，与开放孔电流相比，电流平均减少63.2±6.0％。阻塞事件的持续时间为0.61±0.35s，从停留时间直方图的指数衰减拟合中获得。数据表明，抗体与传感孔的结合导致所定义的电流阻断。
实施例2-使用MinION设备分析携带SARS CoV 2刺突蛋白的膜结合三角形孔。
评估了纳米孔插入高通量MinION设备中包含的膜以快速感测人SARS-CoV-2抗体的能力。为了实现与Y形分析物更好的几何匹配，选择了三角形孔Tri-20(图9)。
为了折叠Tri-20孔，首先将phiX174支架以1:10的比例与添加了16mM MgCl2的0.5x TAE(20mM Tris碱、10mM乙酸、0.5mM EDTA、pH 8.3)中的相应钉混合。使用40小时折叠程序折叠DNA折纸结构：首先，在75℃下加热溶液10分钟，以变性所需DNA二级结构；然后，退火，溶液以每小时1℃的速率从65℃冷却至25℃，然后以每5分钟1℃速率冷却至10℃，并在收集前保持在4℃。折叠加工后，通过从添加了11mM MgCl2的0.5x TBE缓冲液(45mM Tris-硼酸，1mM EDTA，pH 8.3)形式的1％琼脂糖凝胶中切除纯化DNA折纸结构。通过将胆固醇标记的DNA寡核苷酸以相对于DNA孔处DNA胆固醇附着位点总数的1.5的化学计量加入到纯化的DNA孔中来制备胆固醇标记的孔。胆固醇标记的孔为新鲜制备并在同一天用于膜结合和电流记录实验。
为了制备携带SARS-CoV-2刺突蛋白的核酸传感孔(Tri-20-Spike孔)，将NTA修饰的DNA寡核苷酸(30pmol)与含有CoCl2(20μM)、NaCl(400mM)和吐温20(0.02v/v％)的HEPES缓冲液(25mM，pH 7.6)中SARS-CoV-2Spike 1蛋白的His标记受体结合域(45pmol)混合，并在室温孵育1小时。溶液用H2O2(20mM)处理1小时。然后通过10％PAGE分析检查DNA蛋白缀合物。然后将新鲜制备的DNA蛋白缀合物与纯化的Tri-20以1.5:1的比例混合，并在室温孵育1小时，所述Tri-20载有DNA蛋白缀合物的互补结合链。
使用基于集成芯片的并行记录装置(Orbit Mini和Orbit 16，NanionTechnologies，慕尼黑，德国)和多电极腔阵列(MECA)芯片(IONERA，弗莱堡，日耳曼尼亚)进行单通道电流记录。由溶解在辛烷中至最终浓度为10mg/mL的1,2-植烷酰磷脂酰胆碱(DPhPC)形成双层。电生理缓冲液由1M KCl、10mM HEPES组成，pH 7.4。对于孔插入，Tri-20-Spike孔以2:1(体积/体积)的比例与0.5％OPOE(聚乙二醇单辛醚(n-octyloligooxyethylene)在1M KCl、10mM HEPES、pH 7.4中混合。将混合物施加到顺式室中，并通过电导步骤的增加来监测插入。电流轨迹未经贝塞尔滤波，并使用Element DataRecorder软件(Element s.r.l.，意大利)在10kHz下采集。
对于蛋白质感测实验，将抗刺突蛋白抗体(所述分析物)在电生理缓冲液中稀释至所需浓度。在成功插入纳米孔后，将稀释的蛋白质加入顺式室。Orbit16用于分析物感测实验；Orbit mini用于所有其他电生理实验。Orbit 16和Orbit mini分别在顺式和反式处接地。为了便于比较，对电压进行了归一化，并表示为相对于顺式室为正。使用Clampfit软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，美国)进行单通道分析。
电生理电流记录也使用MinION流动池分析设备(Oxford NanoporeTechnologies，牛津，英国)进行。电解质溶液为1M KCl当量。OxfordNanoporeTechnologies的专有膜在流动池上预成型。POPC SUV用于促进DNA纳米孔与Minion膜的融合。通过氩气气流在玻璃小瓶(2ml)中干燥POPC溶液(20mg/ml氯仿，50ul)，在1x孵育缓冲液(0.5x TAE，500mM NaCl至1ml)中重悬浮干膜，并超声处理30分钟来制备囊泡。对于孔插入，DNA纳米孔和囊泡以3nM∶1mM脂质的比例在4℃下过夜孵育。随后，将含有囊泡的DNA纳米孔添加到MinION流动池中，每次20μL。为了促进与平面膜的融合，应用了50mV至300mV的电压斜坡协议。成功插入后，获得了电导和IV曲线的记录。为了用Tri-20-Spike纳米孔进行分子传感，将人SARS-CoV-2抗体(Antibodies-online，ABIN6952547)直接添加到流动池中。
不含抗体受体的Tri-20成功插入MinION膜阵列(图9)，并产生平均电导在7.83±0.71nS(SEM，n＝9)的稳定单通道电流(图12a)。
Tri-20通过特异性连接到孔内腔中的同源受体(SARS-CoV-2刺突蛋白)而转化为SARS-CoV-2抗体的传感器(图9)。产生的Tri-20-Spike孔以高度平行MinION记录中产生稳定的读出轨迹(图12(b))。Tri-20-Spike孔的平均电导为1.8±0.2nS(SEM，n＝23)(图12(b))，低于Tri-20的平均电导(图12(a))，证实了纳米孔内腔中存在刺突蛋白。
将人SARS-CoV-2抗体添加到Tri-20-Spike产生了电流阻断(图10、图13)，代表结合到刺突蛋白受体的独立结合事件。结合事件的相对振幅为61.7±6.9％(±STD，n＝357)，平均停留时间为1.7±8.6s(±STD，n＝357)(图11)，这意味着三角形孔形状与Y形分析物匹配，导致高阻断读数。
抗体结合被发现是特异性的，因为抗SARS-CoV-2抗体在Tri-20-link(孔添加了接头，没有刺突蛋白)中没有引起阻断(图14)，添加非特异性抗体也不引起阻断(图15)。
尽管本文详细公开了本发明的特定实施方案，但这仅是为了举例说明的目的。上述实施方案不旨在限制以下所附权利要求的范围。核酸起始材料、目标克隆、或使用的文库类型的选择被认为是本领域技术人员了解本文所述描述实施方案的常规事项。发明人预期，在不脱离权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种替换、改变和修改。
Claims (83)
1.一种传感核酸纳米孔，其中纳米孔具有几何形状，并且所述纳米孔限定了穿过其中的中心内腔，其中所述纳米孔的所述几何形状被配置为适应中心内腔中或附近的分析物分子的全部或部分，从而优化分析物分子对中心内腔的阻塞。
2.根据权利要求1所述的纳米孔，其中所述纳米孔被配置为定位在膜内。
3.根据权利要求2所述的纳米孔，其中所述纳米孔还包括至少一个疏水锚，所述疏水锚有助于纳米孔插入膜中。
4.根据权利要求3所述的纳米孔，其中所述至少一个疏水锚由多核苷酸链和至少一个疏水锚分子组成。
5.根据权利要求4所述的纳米孔，其中所述至少一个疏水锚分子：
a、附着于纳米孔的外围并基本等距间隔，其中所述至少一个疏水锚分子径向远离纳米孔中心内腔的纵轴；和/或
b、附着在纳米孔或其部分的膜面侧，使得一旦插入，所述至少一个疏水锚分子被定向为与膜相互作用和/或垂直延伸到膜中。
6.根据权利要求4至5中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔包括至少四个疏水锚分子。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的纳米孔，其中所述至少一种疏水锚分子选自：脂质和卟啉。
8.根据权利要求7所述的纳米孔，其中所述脂质选自甾醇、烷基化苯酚、黄酮、饱和和不饱和脂肪酸和合成脂质分子(包括十二烷基-β-D-葡萄糖苷)。
9.根据权利要求8所述的纳米孔，其中：
-所述甾醇选自：胆固醇、胆固醇衍生物、植物甾醇、麦角甾醇和胆汁酸；
-所述烷基化酚选自：甲基化酚、多元醇和生育酚；
-所述黄酮选自：含黄烷酮化合物和6-羟基黄酮；
-所述饱和和不饱和脂肪酸选自：月桂酸、油酸、亚油酸和棕榈酸的衍生物；和/或
-所述合成脂质分子是十二烷基-β-D-葡萄糖苷。
10.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中所述中心内腔具有限定第一孔隙的第一端和限定第二孔隙的第二端。
11.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中分析物结合部分位于中心内腔内。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的纳米孔，其中分析物结合部分位于第一孔隙附近或第一孔内。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的纳米孔，其中所述分析物结合部分包括亲和结合分子。
14.根据权利要求13所述的纳米孔，其中所述亲和结合分子包括选自以下的分子：
I.酶——包括聚合酶、解旋酶、促旋酶和端粒酶，以及核酸结合亚结构域或其衍生物；
II.合成或天然来源的亲和结合蛋白和肽——包括亲和蛋白、抗原结合微蛋白、工程化多重复蛋白、锚蛋白结合结构域、乳铁蛋白、cathelicidins、纤维凝胶蛋白、胶原凝集素、T细胞受体结构域和防御素；
III.抗体——包括多克隆、单克隆、人源化和骆驼抗体，或其抗原结合片段及其衍生物，包括Fab、scFv、Bis-scFv、VH、VL、V-NAR、VhH或任何其他抗原结合单结构域抗体片段；
IV.合成或天然来源的亲和结合核酸和核酸类似物，包括寡核苷酸探针、适配体和核酶；
V.天然存在或合成的小分子，包括药物、荧光团、代谢物和趋化因子；
VI.抗原或抗原片段；和
VII.信号分子和/或其多肽受体，包括受体的结合结构域，以及受体复合物。
15.根据权利要求13所述的纳米孔，其中所述亲和结合分子包括SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)或其片段或衍生物。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的纳米孔，其中分析物结合部分包括栓系在纳米孔的亲和结合分子。
17.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔具有三级结构，并且所述纳米孔的所述三级结构被配置为符合分析物分子的三维形状的至少一部分，以促进分析物分子和纳米孔之间的匹配接合。
18.根据权利要求17所述的纳米孔，其中所述纳米孔的所述三级结构被配置为促进结合部分和分析物分子之间的空间或区域特异性相互作用。
19.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中所述分析物分子选自以下列表：肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、酶、核酸、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质核酸复合物、多蛋白复合物、抗原、抗体、以下大小范围内的大分子：1-10kD、1-50kD、1-100kD、10-50kD、10-100kD、20-50kD和20-100kD、碳水化合物、生物聚合物、毒素、代谢物和/或细胞因子。
20.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔限定了具有规则多边形形状的第一孔隙和/或中心内腔。
21.根据权利要求20所述的纳米孔，其中所述规则多边形形状选自：三角形、正方形、四边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
22.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔限定了具有不规则多边形形状的第一孔隙和/或中心内腔。
23.根据前述权利要求中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔和/或其组件的组装是通过DNA折纸技术进行的。
24.一种传感核酸纳米孔，包括：
核酸纳米孔，其中所述纳米孔定义穿过其中的中心内腔，并且其中中心内腔具有限定了第一孔隙的顺式朝向的第一开口端和限定了第二孔隙的反式朝向的第二开口端；和
分析物结合部分，其中所述分析物结合部分包括亲和结合分子，并且其中所述分析物结合部分位于第一和第二孔隙之间的中心内腔内；
其中所述纳米孔具有三级结构，并且所述纳米孔的所述三级结构被配置为符合至少一部分分析物分子的三维形状。
25.根据权利要求24所述的纳米孔，其中所述纳米孔被配置为定位在膜内。
26.根据权利要求25所述的纳米孔，其中所述纳米孔还包括至少一个疏水锚，所述至少一个疏水锚有助于将纳米孔插入膜中。
27.根据权利要求26所述的纳米孔，其中所述至少一个疏水锚由多核苷酸链和至少一个疏水锚分子组成。
28.根据权利要求27所述的纳米孔，其中所述至少一个疏水锚分子：
a、附着于纳米孔的外围并基本等距间隔，其中所述至少一个疏水锚分子径向远离纳米孔中心内腔的纵轴；和/或
b、附着在纳米孔或其部分的膜面侧，使得一旦插入，所述至少一个疏水锚分子被定向为与膜相互作用和/或垂直延伸到膜中。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔包括至少四个疏水锚分子。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的纳米孔，其中所述至少一种疏水锚分子选自：脂质和卟啉。
31.根据权利要求30所述的纳米孔，其中所述脂质选自甾醇、烷基化苯酚、黄酮、饱和和不饱和脂肪酸和合成脂质分子(包括十二烷基-β-D-葡萄糖苷)。
32.根据权利要求31所述的纳米孔，其中：
-所述甾醇选自：胆固醇、胆固醇衍生物、植物甾醇、麦角甾醇和胆汁酸；
-所述烷基化酚选自：甲基化酚、多元醇和生育酚；
-所述黄酮选自：含黄烷酮化合物和6-羟基黄酮；
-所述饱和和不饱和脂肪酸选自：月桂酸、油酸、亚油酸和棕榈酸的衍生物；和/或
-所述合成脂质分子是十二烷基-β-D-葡萄糖苷。
33.根据权利要求32所述的纳米孔，其中所述分析物结合部分位于第一孔隙附近或第一孔隙内。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的纳米孔，其中所述亲和结合分子包括选自以下的分子：
I.酶——包括聚合酶、解旋酶、促旋酶和端粒酶，以及核酸结合亚结构域或其衍生物；
II.合成或天然来源的亲和结合蛋白和肽——包括亲和蛋白、抗原结合微蛋白、工程化多重复蛋白、锚蛋白结合结构域、乳铁蛋白、cathelicidins、纤维凝胶蛋白、胶原凝集素、T细胞受体结构域和防御素；
III.抗体——包括多克隆、单克隆、人源化和骆驼抗体，或其抗原结合片段及其衍生物，包括Fab、scFv、Bis-scFv、VH、VL、V-NAR、VhH或任何其他抗原结合单结构域抗体片段；
IV.合成或天然来源的亲和结合核酸和核酸类似物，包括寡核苷酸探针、适配体和核酶；
V.天然存在或合成的小分子，包括药物、荧光团、代谢物和趋化因子；
VI.抗原或抗原片段；和
VII.信号分子和/或其多肽受体，包括受体的结合结构域，以及受体复合物。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的纳米孔，其中所述亲和结合分子包括SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)或其片段或衍生物。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的纳米孔，其中所述分析物结合部分包括栓系在纳米孔的亲和结合分子。
37.根据权利要求24至36中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔的所述三级结构被配置为符合分析物分子的三维形状的至少一部分，以促进分析物分子和纳米孔之间的匹配接合。
38.根据权利要求37所述的纳米孔，其中所述纳米孔的所述三级结构被配置为促进结合部分和分析物分子之间的空间或区域特异性相互作用。
39.根据权利要求24至38中任一项所述的纳米孔，其中所述分析物分子选自以下列表：肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、酶、核酸、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质核酸复合物、多蛋白复合物、抗原、抗体、以下大小范围内的大分子：1-10kD、1-50kD、1-100kD、10-50kD、10-100kD、20-50kD和20-100kD、碳水化合物、生物聚合物、毒素、代谢物和细胞因子。
40.根据权利要求24至39中任一项所述的纳米孔，其中所述第一孔隙和/或中心内腔具有规则多边形形状。
41.根据权利要求40所述的纳米孔，其中所述规则多边形形状选自：三角形、正方形、四边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
42.根据权利要求24至41中任一项所述的纳米孔，其中所述第一孔隙和/或中心内腔具有不规则多边形形状。
43.根据权利要求24至42中任一项所述的纳米孔，其中所述纳米孔和/或其组件的组装是通过DNA折纸技术进行的。
44.一种插入至少一个根据权利要求1至43中任一项所述纳米孔的膜。
45.根据权利要求44所述的膜，其中所述膜选自：包括由聚合物形成的半流体膜的膜、以及固态膜。
46.根据权利要求45所述的膜，其中形成半流体膜的所述聚合物由两亲性合成嵌段共聚物组成，适当地选自亲水性共聚物嵌段和疏水性共聚物嵌段。
47.根据权利要求45或46所述的膜，其中所述膜为囊泡、胶束、平面膜或液滴的形式。
48.根据权利要求45所述的膜，其中所述固态膜由选自II-IV族和III-V族氧化物和氮化物、固态有机和无机聚合物、塑料、弹性体和玻璃的材料形成。
49.一种包括根据权利要求1至43中任一项所述传感核酸纳米孔的传感器设备。
50.根据权利要求49所述的设备，其中所述设备是便携式的。
51.根据权利要求49或50中任一项所述的设备，其中所述传感核酸纳米孔包含在流动池内。
52.根据权利要求51所述的设备，其中所述传感核酸纳米孔嵌入流动池内的膜中。
53.根据权利要求52所述的设备，其中所述膜选自权利要求44至48中的任何一项。
54.根据权利要求52至53所述的设备，其中所述传感核酸纳米孔嵌入流动池内的固态隔断中。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的设备，还包括电测量设备和/或荧光测量设备。
56.一种增强分析物分子与跨膜核酸纳米孔结合的方法，所述方法包括：
选择纳米孔的几何形状，使其符合至少一部分分析物分子的三维形状，从而使所述纳米孔能够适应分析物分子并修改通过或穿过所述纳米孔的可测量的电信号或光信号；和
制造具有所需几何形状的核酸纳米孔。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述纳米孔被配置为限定穿过其中的中心内腔。
58.根据权利要求56或57中任一项所述的方法，其中所述纳米孔插入选自以下的膜：包括由聚合物形成的半流体膜的膜、以及固态膜。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述纳米孔被配置为包含至少一个疏水锚，以促进纳米孔插入膜中。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述至少一个疏水锚由多核苷酸链和至少一个疏水锚分子组成。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述至少一个疏水锚分子：
a、附着于纳米孔的外围并基本等距间隔，其中所述至少一个疏水锚分子径向远离纳米孔中心内腔的纵轴；和/或
b、附着在纳米孔或其部分的膜面侧，使得一旦插入，所述至少一个疏水锚分子被定向为与膜相互作用和/或垂直延伸到膜中。
62.根据权利要求60至61中任一项所述的方法，其中所述纳米孔被配置为包含至少四个疏水锚分子。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述至少一个疏水锚分子选自：脂质和卟啉。
64.根据权利要求63所述的方法，其中脂质选自：其中所述脂质选自甾醇、烷基化苯酚、黄酮、饱和和不饱和脂肪酸和合成脂质分子(包括十二烷基-β-D-葡萄糖苷)。
65.根据权利要求64所述的方法，其中：
-所述甾醇选自：胆固醇、胆固醇衍生物、植物甾醇、麦角甾醇和胆汁酸；
-所述烷基化酚选自：甲基化酚、多元醇和生育酚；
-所述黄酮选自：含黄烷酮化合物和6-羟基黄酮；
-所述饱和和不饱和脂肪酸选自：月桂酸、油酸、亚油酸和棕榈酸的衍生物；和/或
-所述合成脂质分子是十二烷基-β-D-葡萄糖苷。
66.根据权利要求57至65中任一项所述的方法，其中所述中心内腔具有限定第一孔隙的第一端和限定第二孔隙的第二端。
67.根据权利要求57至66中任一项所述的方法，其中分析物结合部分位于中心内腔内。
68.根据权利要求66或67中任一项所述的方法，其中分析物结合部分位于第一孔隙附近或第一孔隙内。
69.根据权利要求67或68中任一项所述的方法，其中所述分析物结合部分包括亲力结合分子。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述亲和结合分子包括选自以下的分子：
I.酶——包括聚合酶、解旋酶、促旋酶和端粒酶，以及核酸结合亚结构域或其衍生物；
II.合成或天然来源的亲和结合蛋白和肽——包括亲和蛋白、抗原结合微蛋白、工程化多重复蛋白、锚蛋白结合结构域、乳铁蛋白、cathelicidins、纤维凝胶蛋白、胶原凝集素、T细胞受体结构域和防御素；
III.抗体——包括多克隆、单克隆、人源化和骆驼抗体，或其抗原结合片段及其衍生物，包括Fab、scFv、Bis-scFv、VH、VL、V-NAR、VhH或任何其他抗原结合单结构域抗体片段；
IV.合成或天然来源的亲和结合核酸和核酸类似物，包括寡核苷酸探针、适配体和核酶；
V.天然存在或合成的小分子，包括药物、荧光团、代谢物和趋化因子；
VI.抗原或抗原片段；和
VII.信号分子和/或其多肽受体，包括受体的结合结构域，以及受体复合物。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述亲和结合分子包括SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)或其片段或衍生物。
72.根据权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述分析物结合部分包括栓系在纳米孔的亲和结合分子。
73.根据权利要求56至72中任一项所述的方法，其中纳米孔的几何形状被配置为促进分析物分子和纳米孔之间的匹配接合。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述纳米孔的几何结构被配置为促进结合分子和分析物分子之间的空间或区域特异性相互作用。
75.根据权利要求56至74中任一项所述的方法，其中分析物分子选自包以下列表：肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、酶、核酸、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质核酸复合物、多蛋白复合物、抗原、抗体、以下大小范围内的大分子：1-10kD、1-50kD、1-100kD、10-50kD、10-100kD、20-50kD和20-100kD、碳水化合物、生物聚合物、毒素、代谢物和细胞因子。
76.根据权利要求56至75中任一项所述的方法，其中所述纳米孔的几何形状被配置为限定具有规则多边形形状的第一孔隙和/或中心内腔。
77.根据权利要求方法76，其中所述规则多边形形状选自：三角形、正方形、四边形、五边形、六边形、七边形和八边形。
78.任何根据权利要求56至77的方法，其中纳米孔的几何形状被配置为定义具有不规则多边形形状的第一孔隙和/或中心内腔。
79.根据权利要求56至78中任一项所述的方法，其中所述纳米孔和/或其组件的组装是通过DNA折纸技术进行的。
80.一种通过权利要求56至79中任一项所述的方法获得的核酸纳米孔。
81.一种通过权利要求56至79中任一项所述的方法获得的核酸纳米孔。
82.一种用于分子传感的方法，包括：
I.提供权利要求55所述的传感器设备；
II.将纳米孔与分析物分子接触，并建立通过至少一个纳米孔的离子流或穿过纳米孔的电子流；和
III.测量穿过所述纳米孔的电信号，
其中所述分子传感包括分析物分子检测或表征，其中电测量的变化指示分析物分子。
83.根据权利要求82所述的方法，其中电测量选自：电流测量、阻抗测量、隧道测量以及场效应晶体管(FET)测量。
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