CN117940573A

CN117940573A - 衣壳变体及其使用方法

Info

Publication number: CN117940573A
Application number: CN202280056042.XA
Authority: CN
Inventors: S·拉潘; H·莱维汀
Original assignee: Dino Treatment Co
Current assignee: Dino Treatment Co
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2024-04-26
Also published as: WO2022266483A1; CA3222839A1; AU2022292742A1; EP4355889A1; US20240287141A1; JP2024527496A

Abstract

本公开部分地涉及可用于递送有效载荷的变体衣壳多肽。

Description

衣壳变体及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年6月18日提交的美国临时申请第63/202,639号的优先权，该申请在此通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用整体并入本文。创建于2022年6月15日的所述ASCII副本命名为257394_001102_ST25.txt并且大小为81,512字节。

背景技术

依赖性细小病毒，例如腺相关依赖性细小病毒，例如腺相关病毒(AAV)，作为用于将各种有效载荷递送至细胞(包括在人类受试者中)的载体而受到关注。

发明内容

本公开部分地提供了改进的变体依赖性细小病毒衣壳蛋白(例如AAV2的变体)、如VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，产生依赖性细小病毒的方法，用于其的组合物，以及由其产生的病毒颗粒。在一些实施例中，与衣壳蛋白中没有突变的病毒颗粒相比，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒具有增加的眼部生物分布和/或转导。本公开进一步提供了变体衣壳多肽和包含此类变体衣壳多肽的病毒颗粒，其在静脉内施用后令人惊奇地转导眼部组织(例如，视网膜组织)，并且特别地，在静脉内施用后转导眼部组织的程度远高于不具有本文所述的突变的其他方面相似的病毒颗粒。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含编码如本文所提供的变体衣壳蛋白的序列的核酸。在一些实施例中，依赖性细小病毒是腺相关依赖性细小病毒(AAV)。在一些实施例中，AAV是AAV2，例如AAV2的变体。

在一些实施例中，本公开部分地涉及本文所述的衣壳多肽。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的载体，例如质粒。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如，包含编码衣壳多肽，如VP1的序列的核酸)的依赖性细小病毒颗粒，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒，该变体衣壳多肽包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽。

在一些实施例中，本公开部分地涉及核酸分子，该核酸分子包含SEQ ID NO:5、SEQID NO:6或SEQ ID NO:7，其片段，或其与其具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如包含编码衣壳多肽(例如VP1多肽)的序列的核酸)的载体，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。

在一些实施例中，本公开部分地涉及细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸或载体，该核酸或载体例如包含编码衣壳多肽(如VP1)的序列，其中衣壳多肽编码序列在编码序列中包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码衣壳多肽(如VP1多肽)的序列，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。

在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的多肽的细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其中多肽编码序列包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码VP1多肽的序列，其中VP1编码序列包含如本文所提供的相应的改变或突变。

在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒接触。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒接触。

在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸(例如，包含编码如本文所提供的AAV2衣壳变体的序列的核酸)；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。

在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的多肽；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。

在一些实施例中，本公开部分地涉及在细胞、无细胞体系或其他翻译体系中制备的依赖性细小病毒颗粒，其中该细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含编码依赖性细小病毒的核酸，该依赖性细小病毒包含如本文所提供的衣壳变体。

在一些实施例中，本公开部分地涉及一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向受试者施用本文所述的依赖性细小病毒颗粒。

进一步参考以下编号的实施例描述本发明。

附图说明

图1。在眼睛的每个区域中收集的组织的图。在视网膜(左图和中图)中，分别收集来自视网膜的上侧、鼻侧、下侧和颞侧区域中的每一者的周边和中央视网膜样本，还分别收集黄斑。在每个区域，分别收集神经视网膜和脉络膜/RPE层(中图)。在TM/SC区域(右图)，分别收集上侧、颞侧、鼻侧和下侧样本。

图2A至2C。代表性参考衣壳VP1多肽的多序列比对。此类比对可用于确定对应于不同参考衣壳多肽内的位置的氨基酸位置。

列举的实施例

1.一种变体衣壳多肽，其包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽。

2.根据实施例1所述的变体衣壳多肽，其中变体是与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽(AAV2)相同的血清型。

3.根据实施例1所述的变体衣壳多肽，其中变体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽(AAV2)相比是不同的血清型。

4.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中多肽包含SEQ ID NO:1的变体，其中变体衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的585、586、587、588、589、590、591、593、597、600、608中的一个或多个位置处的突变的突变，任选地其中突变包括插入、缺失或取代。

5.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585处的突变的突变。

6.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置586处的突变的突变。

7.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置587处的突变的突变。

8.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置588处的突变的突变。

9.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置589处的突变的突变。

10.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置590处的突变的突变。

11.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置591处的突变的突变。

12.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置593处的突变的突变。

13.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置597处的突变的突变。

14.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置600处的突变的突变。

15.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置608处的突变的突变。

16.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、588、589、590、593、597和608处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或所有突变)。

17.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、586、587、588、589、590、591、593和600处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有突变)。

18.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、588、590、591和597处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个或所有突变)。

19.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含与SEQ IDNO:1相比的R585V、R588T、Q589G、A590P、A593G、T597I和D608N中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或所有突变)。

20.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含与SEQ IDNO:1相比的R585S、G586S、N587I、R588T、Q589A、A590P、A591G、A593G和V600C中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有突变)。

21.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中衣壳多肽包含与SEQ IDNO:1相比的R585N、R588T、A590P、A591T和T597H中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个或所有突变)。

22.一种变体衣壳多肽，其包含：(a)以下中任一者的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4；(b)以下中任一者的VP2或VP3序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4；(c)包含与其(例如，与(a)或(b)的多肽)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:1，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)；或(d)相对于(a)或(b)的多肽，具有至少1个、但不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过3个或不超过2个氨基酸突变的多肽，其中相对于SEQ ID NO:1，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)。

23.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少或约95、96、97、98或99％相同，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

24.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约20个突变，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

25.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约10个突变，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

26.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与SEQIDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约5个突变，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

27.一种变体衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列。

28.一种变体衣壳多肽，其由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列组成。

29.根据前述实施例中任一项所述的变体衣壳多肽，其中变体衣壳多肽为VP1多肽、VP2多肽或VP3多肽。

30.一种核酸分子，其编码根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽。

31.根据实施例30所述的核酸分子，其中核酸分子包含SEQ ID NO:5、6、7的序列，其片段，或其与其具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。

32.根据实施例31所述的核酸分子，其中其片段编码VP2衣壳多肽或VP3衣壳多肽。

33.一种病毒颗粒(例如，腺相关病毒(“AAV”)颗粒)，其包含根据实施例1至29中任一项所述的或由根据实施例30至32中任一项所述的核酸分子编码的变体AAV2衣壳多肽。

34.根据实施例33所述的病毒颗粒，其包含含有转基因(例如，有效载荷)和一个或多个调控元件的核酸。

35.根据实施例33至34中任一项所述的病毒颗粒，其中病毒颗粒相对于野生型AAV2(例如，包含SEQ ID NO:1的或由SEQ ID NO:8编码的衣壳多肽的病毒颗粒)表现出增加的眼部转导，例如，如在小鼠或在NHP中测量的，例如，如本文所述。

36.根据实施例35所述的病毒颗粒，其中增加的眼部转导是增加的视网膜转导。

37.根据实施例35至36中任一项所述的病毒颗粒，其中在全身性、例如静脉内施用后表现出增加的眼部转导。

38.根据实施例30至32中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子是双链或单链的，并且其中核酸分子是线性或环状的，例如其中核酸分子为质粒。

39.一种产生包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的方法，所述方法包括将根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸分子引入细胞(例如HEK293细胞)中，以及从中收获病毒颗粒。

40.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与(a)包含根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽和有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或(b)根据实施例34至37中任一项所述的病毒颗粒接触。

41.根据实施例40所述的方法，其中细胞为眼部细胞。

42.根据实施例41所述的方法，其中眼部细胞位于视网膜中。

43.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽以及有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或向受试者施用根据实施例34至37中任一项所述的病毒颗粒。

44.根据实施例43所述的方法，其中病毒颗粒将有效载荷递送至眼睛。

45.根据实施例44所述的方法，其中病毒颗粒将有效载荷递送至视网膜。

46.根据实施例40至45中任一项所述的方法，其中病毒颗粒通过全身性、例如静脉内施用进行施用。

47.根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽、根据实施例33至37中任一项所述的病毒颗粒或根据实施例40至46中任一项所述的方法，其中病毒颗粒(例如，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒)与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将有效载荷递送至眼睛。

48.根据实施例47所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中眼睛的一个或多个区域是视网膜。

49.根据实施例48所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中视网膜包括非黄斑视网膜。

50.根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽、根据实施例33至37中任一项所述的病毒颗粒或根据实施例40至46中任一项所述的方法，其中病毒颗粒(例如，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒)与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将有效载荷递送至眼睛，并且其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、150倍、200倍或250倍。

51.根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽、根据实施例33至37中任一项所述的病毒颗粒或根据实施例40至46中任一项所述的方法，其中病毒颗粒(例如，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒)与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将有效载荷递送至眼睛，其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中转导的增加对于非黄斑视网膜是特异性的。

52.根据实施例39至51中任一项所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中向受试者的施用是经由全身性、例如静脉内注射进行的。

53.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中依赖性细小病毒颗粒是包含根据实施例1至29中任一项所述的或由根据实施例30至31或38中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的病毒颗粒，或是根据实施例33至37中任一项所述的病毒颗粒。

54.一种治疗受试者的CNS和/或眼部疾病或病症的方法，该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中依赖性细小病毒颗粒是包含根据实施例1至29中任一项所述的或由根据实施例30至31或38中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的病毒颗粒，或是根据实施例33至37中任一项所述的病毒颗粒，任选地其中该疾病或病症是神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)。

55.一种细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据实施例1至37或47至52中任一项所述的衣壳多肽、核酸分子或病毒颗粒。

56.一种制备依赖性细小病毒(例如，腺相关依赖性细小病毒(AAV)颗粒的方法，所述方法包括：

提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸；以及

在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，

从而制备依赖性细小病毒颗粒。

57.根据实施例56所述的方法，其中细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第二核酸分子并且所述第二核酸分子包装在依赖性细小病毒颗粒中。

58.根据实施例57所述的方法，其中第二核酸包含有效载荷，例如编码治疗产品的异源核酸序列。

59.根据实施例56至58中任一项所述的方法，其中根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸介导依赖性细小病毒颗粒的产生，该依赖性细小病毒颗粒不包含根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸。

60.根据实施例56至59中任一项所述的方法，其中根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸以由编码SEQ ID NO:1的核酸介导的生产水平的至少10％、至少20％、至少50％、至少100％的水平，或者相比由编码SEQ ID NO:1的核酸分子介导的生产水平高至少10％、高至少20％、高至少50％或高至少100％的水平，来介导依赖性细小病毒颗粒的产生。

61.一种组合物，例如药物组合物，其包含根据实施例33至37或47至52中任一项所述的病毒颗粒或通过根据实施例39或56至60中任一项所述的方法产生的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。

62.根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽、根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸分子、或根据实施例33至37或47至52中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗受试者的疾病或病症。

63.根据实施例1至29中任一项所述的变体衣壳多肽、根据实施例30至32或38中任一项所述的核酸分子、或根据实施例33至37或47至52中任一项所述的病毒颗粒，其用于制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物。

具体实施方式

本公开部分地涉及可用于产生依赖性细小病毒颗粒的变体衣壳变体。在一些实施例中，与没有变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒相比，颗粒具有增加的眼部转导，该眼部转导可用于以眼中更高的转导效率将所关注的转基因或分子递送至眼睛。因此，本文提供变体衣壳多肽、编码其的核酸分子、包含变体衣壳多肽的病毒颗粒、以及使用其的方法。

定义

一个/种(a/an)、该/所述(the)：如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包含复数指示物。

约、大约：如本文所使用的，术语“约”和“大约”通常意指在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度在给定值或值范围的百分之15(％)内，通常在10％内，并且更通常在5％内。

依赖性细小病毒衣壳：如本文所使用的，术语“依赖性细小病毒衣壳”是指包含依赖性细小病毒多肽的组装的病毒衣壳。在一些实施例中，依赖性细小病毒衣壳是功能性依赖性细小病毒衣壳，例如，完全折叠和/或组装、有能力感染靶细胞、或保持稳定(例如，折叠/组装和/或有能力感染靶细胞)至少持续阈值时间。

依赖性细小病毒颗粒：如本文所使用的，术语“依赖性细小病毒颗粒”是指包含依赖性细小病毒多肽和包装的核酸(例如包含有效载荷、依赖性细小病毒基因组的一种或多种组分(例如，完整的依赖性细小病毒基因组)，或两者)的组装的病毒衣壳。在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒是功能性依赖性细小病毒颗粒，例如，包含所需的有效载荷、完全折叠和/或组装、有能力感染靶细胞、或保持稳定(例如，折叠/组装和/或有能力感染靶细胞)至少持续阈值时间。

依赖性细小病毒X颗粒/衣壳：如本文所使用的，术语“依赖性细小病毒X颗粒/衣壳”是指包含至少一种衍生自天然存在的依赖性细小病毒X物种的多肽或多肽编码核酸序列的依赖性细小病毒颗粒/衣壳。例如，依赖性细小病毒B颗粒是指包含至少一种衍生自天然存在的依赖性细小病毒B序列的多肽或多肽编码核酸序列的依赖性细小病毒颗粒。如此上下文中所使用的，衍生自意指与所讨论的序列具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。相应地，如本文所使用的，AAVX颗粒/衣壳是指包含至少一种衍生自天然存在的AAV X血清型的多肽或多肽编码核酸序列的AAV颗粒/衣壳。例如，AAV2颗粒是指包含至少一种衍生自天然存在的AAV2序列的多肽或多肽编码核酸序列的AAV颗粒。

外源：如本文所使用的，术语“外源”是指存在于环境中(例如，存在于核酸、多肽或细胞中)的特征、序列或组分，其在所述环境中并非天然存在。例如，包含突变体衣壳多肽的核酸序列或编码其的核酸分子可包含衣壳多肽。以这种方式使用术语外源意指在该位置包含所讨论的突变的多肽或编码多肽的核酸分子不是天然存在的，例如，不存在于AAV2中，例如，不存在于SEQ ID NO:1中。

功能性：如本文所使用的，关于依赖性细小病毒衣壳的多肽组分(例如，Cap(例如，VP1、VP2和/或VP3)或Rep)，术语“功能性”是指提供该多肽组分的天然存在形式(例如，当存在于宿主细胞中时)的活性的至少50、60、70、80、90或100％的多肽。例如，功能性VP1多肽可以稳定地折叠并组装成依赖性细小病毒衣壳(例如，其有能力用于包装和/或分泌)。如本文所使用的，关于依赖性细小病毒衣壳或颗粒，“功能性”是指包含一种或多种以下生产特征的衣壳或颗粒：包含所需的有效载荷、完全折叠和/或组装、有能力感染靶细胞，或保持稳定(例如，折叠/组装和/或有能力感染靶细胞)至少持续阈值时间。

核酸：如本文所使用的，在其最广泛意义上，术语“核酸”是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如将从上下文显而易见，在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸单体(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸单体的寡核苷酸链或包含许多个别核酸单体的较长的多核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”为RNA或包括RNA；在一些实施例中，“核酸”为DNA或包括DNA。在一些实施例中，核酸是一个或多个天然核酸残基、包括一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中，核酸是一个或多个核酸类似物、包括一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸是一个或多个经修饰、合成或非天然存在的核苷酸，包括一个或多个经修饰、合成或非天然存在的核苷酸，或由一个或多个经修饰、合成或非天然存在的核苷酸组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，核酸是一个或多个“肽核酸”、包括一个或多个“肽核酸”或由一个或多个“肽核酸”组成，其在本领域中是已知的并且在主链中具有代替磷酸二酯键的肽键，被视为处于本发明的范围内。或者或另外，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-氨基亚磷酸酯键而非磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸具有对如RNA或蛋白质等功能性基因产物进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸为部分或完全单链的；在一些实施例中，核酸为部分或完全双链的。

变体：如本文所使用的，“变体衣壳多肽”是指与参考序列(例如SEQ ID NO:1)不同的多肽。变体可以例如包含突变(例如取代、缺失或插入)。在一些实施例中，变体与参考序列是约或至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，参考序列是包含SEQ ID NO:1的多肽。

衣壳多肽和编码其的核酸

本公开部分地涉及包含编码变体衣壳多肽的序列的核酸，该变体衣壳多肽与参考序列相比包含突变(插入、缺失或取代)。在一些实施例中，参考序列是SEQ ID NO:1。本公开部分地涉及变体衣壳多肽，与SEQ ID NO:1相比，该变体衣壳多肽包含具有一个或多个突变的SEQ ID NO:1。本公开进一步部分地涉及变体衣壳多肽，其包含用对应于本文所述的突变的一个或多个突变修饰的除了SEQ ID NO:1之外的参考序列。与参考序列相比，突变可以是例如插入、缺失或取代。在一些实施例中，参考序列是SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，衣壳多肽包含选自表2的突变。在一些实施例中，选自表2的突变是取代，例如至少2个或更多个残基，例如至少6至10个残基，例如至少7至10个残基，例如至少8至10个残基，例如至少9至10个残基，例如至少10个残基的取代，该取代对应于在与SEQID NO:1相比的585与608之间的位置处的取代。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在根据SEQ ID NO:1的位置585、586、587、588、589、590、591、593、597、600、608或其任意组合处的突变的突变，任选地其中突变包含插入、缺失或取代。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置586处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置587处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置588处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置589处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置590处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置591处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置593处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置597处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置600处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置608处的突变的突变。在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置588和590处的突变的突变。

在一些实施例中，对应于位置585的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是缬氨酸、丝氨酸或天冬酰胺。在一些实施例中，位置585处的取代是缬氨酸，例如R585V。在一些实施例中，位置585处的取代是丝氨酸，例如R585S。在一些实施例中，位置585处的取代是天冬酰胺，例如R585N。

在一些实施例中，对应于位置586的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是丝氨酸。在一些实施例中，位置586处的取代是丝氨酸，例如G586S。

在一些实施例中，对应于位置587的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是异亮氨酸。在一些实施例中，位置587处的取代是异亮氨酸，例如N587I。

在一些实施例中，对应于位置588的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是苏氨酸。在一些实施例中，位置588处的取代是苏氨酸，例如R588T。

在一些实施例中，对应于位置589的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是丙氨酸或甘氨酸。在一些实施例中，位置589处的取代是丙氨酸，例如Q589A。在一些实施例中，位置589处的取代是甘氨酸，例如Q589G。

在一些实施例中，对应于位置590的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是脯氨酸。在一些实施例中，位置590处的取代是脯氨酸，例如A590P。

在一些实施例中，对应于位置591的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是苏氨酸或甘氨酸。在一些实施例中，位置591处的取代是苏氨酸，例如A591T。在一些实施例中，位置591处的取代是甘氨酸，例如A591G。

在一些实施例中，对应于位置593的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是甘氨酸。在一些实施例中，位置593处的取代是甘氨酸，例如A593G。

在一些实施例中，对应于位置597的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是异亮氨酸或组氨酸。在一些实施例中，位置597处的取代是异亮氨酸，例如T591I。在一些实施例中，位置597处的取代是组氨酸，例如T591H。

在一些实施例中，对应于位置600的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是半胱氨酸。在一些实施例中，位置600处的取代是半胱氨酸，例如V600C。

在一些实施例中，对应于位置608的突变是取代。在一些实施例中，取代是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，取代是天冬酰胺。在一些实施例中，位置608处的取代是天冬酰胺，例如D608N。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、588、589、590、593、597和608处的突变的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、586、587、588、589、590、591、593和600处的突变的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、588、590、591和597处的突变的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R585V、R588T、Q589G、A590P、A593G、T597I和D608N突变的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R585S、G586S、N587I、R588T、Q589A、A590P、A591G、A593G和V600C突变的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R585N、R588T、A590P、A591T和T597H突变的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R588T和A590P突变的突变。

在一些实施例中，提供了核酸分子。在一些实施例中，核酸分子具有选自表2的序列。在一些实施例中，核酸分子具有SEQ ID NO:5至7的序列。在一些实施例中，核酸分子具有SEQ ID NO:5的序列。在一些实施例中，核酸分子具有SEQ ID NO:6的序列。在一些实施例中，核酸分子具有SEQ ID NO:7的序列。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含选自表2的突变。在一些实施例中，选自表2的突变是取代，例如至少2个或更多个残基，例如至少6至10个残基，例如至少7至10个残基，例如至少8至10个残基，例如至少9至10个残基，例如至少10个残基的取代，该取代对应于在与SEQ ID NO:1相比的585与608之间的位置处的取代。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在根据SEQ IDNO:1的位置585、586、587、588、589、590、591、593、597、600、608或其任意组合处的突变的突变，任选地其中突变包含插入、缺失或取代。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ IDNO:1相比的位置585处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置586处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置587处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置588处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置589处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置590处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置591处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置593处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置597处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置600处的突变的突变。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ IDNO:1相比的位置608处的突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ IDNO:1相比的位置588和590处的突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ IDNO:1相比的位置585、588、589、590、593、597和608处的突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ IDNO:1相比的位置585、586、587、588、589、590、591、593和600处的突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于在与SEQ IDNO:1相比的位置585、588、590、591和597处的突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R585V、R588T、Q589G、A590P、A593G、T597I和D608N突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R585S、G586S、N587I、R588T、Q589A、A590P、A591G、A593G和V600C突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R585N、R588T、A590P、A591T和T597H突变的突变。

在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽包含对应于与SEQ ID NO:1相比的R588T和A590P突变的突变。

在一些实施例中，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的突变差异中的至少1个，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的突变差异的至少1个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少2个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的2个突变差异的至少2个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少3个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的3个突变差异的至少3个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少4个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的4个突变差异的至少4个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少5个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的5个突变差异的至少5个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少6个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的6个突变差异的至少6个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少7个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的7个突变差异的至少7个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少8个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的8个突变差异的至少8个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的至少9个突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的9个突变差异的至少9个突变。在某些方面，本公开提供了衣壳多肽(和编码所述衣壳多肽的核酸)，该衣壳多肽包含与表1的任何变体衣壳多肽相关的全部突变差异，或者包含对应于与表1的任何变体衣壳多肽相关的全部突变差异的突变。

在任何上述方面，应当理解，在上述的变体衣壳多肽中，在指定了与表1的任何变体衣壳多肽的突变差异相关或对应的多个突变差异的情况下，该突变可以选自与该变体衣壳多肽相关的突变差异中的任一者。因此，例如，对于VAR-3的突变差异(具有突变差异R585N、R588T、A590P、A591T、T597H)，当变体衣壳包含突变差异中的1个时，其可以是R585N、R588T、A590P、A591T或T597H；同样地，当变体衣壳包含突变差异中的2个时，这两个可以是R585N和R588T、R585N和A590P、R585N和A591T、R585N和T597H、R588T和A590P、R588T和A591T、R588T和T597H、A590P和A591T、A590P和T597H，或A591T和T579H；同样地，当变体包含突变差异中的3个时，这3个可以是R585N和R588T和A590P、R585N和R588T和A591T、R585N和R588T和T597H、R585N和A590P和A591P、R585N和A590P和T597H、R585N和A591T和T597H、R588T和A590P和A591T、R588T和A590P和T597H、R588T和A591T和T597H，或A590P和A591T和T597H；同样地，当变体包含突变差异中的4个时，这4个可以是R585N和R588T和A590P和A591T、R585N和R588T和A590P和T597H、R588T和A590P和A591T和T597H、R585N和R588T和A591T和T597H、或R585N和A590P和A591T和T597H。

在一些实施例中，本文公开了包含R588T突变和A590P突变(根据SEQ ID NO:1编号)的衣壳多肽。在实施例中，衣壳多肽进一步包含A593G突变(根据SEQ ID NO:1编号)。在实施例中，包含这些突变的衣壳多肽包含如下序列：该序列相对于SEQ ID NO:1包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个另外的突变，并且相对于SEQ ID NO:1包含少于35个、少于34个、少于33个、少于32个、少于31个、少于30个、少于29个、少于28个、少于27个、少于26个、少于25个、少于24个、少于23个、少于22个、少于21个或少于20个另外的突变。在实施例中，衣壳多肽包含相对于SEQ ID NO:1包含零与14个之间的另外的突变的序列。在实施例中，包含这些突变的衣壳多肽包含与SEQ ID NO:1至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。在实施例中，所述衣壳多肽是VP1衣壳多肽。在实施例中，所述衣壳多肽是VP2衣壳多肽。在实施例中，所述衣壳多肽是VP3衣壳多肽。

本领域技术人员应当理解，可以使用常规技能来生成表1的每种变体衣壳多肽的2至9个突变差异的可能组合的表格(最多至表1的变体衣壳多肽的突变差异的总数)并且VAR-1至VAR-3中的每一者的此类表格整体并入本文。此类表可以例如使用来自Python中的“itertools”包的“combinations”方法来生成，此类方法在此通过引用整体并入本文。

在实施例中，变体衣壳多肽包含如表1中所述的一个或多个突变差异，或者该一个或多个突变差异对应于如表1中所述的一个或多个突变差异。在实施例中，除了表1中所述的突变差异或对应于如表1中所述的突变差异之外，变体衣壳多肽与本文所述的参考AAV血清型至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同。在实施例中，除了表1的突变差异或对应于此类变体衣壳多肽内所包含的表1的突变差异之外，本文所述的变体衣壳多肽与SEQ ID NO:1的衣壳多肽(例如SEQ ID NO:1的VP1、VP2或VP3序列)至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在实施例中，除了表1的突变差异或对应于此类变体衣壳多肽内所包含的表1的突变差异之外，本文所述的变体衣壳多肽与SEQ ID NO:9的衣壳多肽(例如SEQ ID NO:9的VP1、VP2或VP3序列)至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在实施例中，除了表1的突变差异或对应于此类变体衣壳多肽内所包含的表1的突变差异之外，本文所述的变体衣壳多肽与SEQ ID NO:11的衣壳多肽(例如SEQ IDNO:11的VP1、VP2或VP3序列)至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在实施例中，除了表1的突变差异或对应于此类变体衣壳多肽内所包含的表1的突变差异之外，本文所述的变体衣壳多肽与SEQ ID NO:13的衣壳多肽(例如SEQ ID NO:13的VP1、VP2或VP3序列)至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在实施例中，除了表1的突变差异或对应于此类变体衣壳多肽内所包含的表1的突变差异之外，本文所述的变体衣壳多肽与SEQ ID NO:15的衣壳多肽(例如SEQ ID NO:15的VP1、VP2或VP3序列)至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在实施例中，除了表1的突变差异或对应于此类变体衣壳多肽内所包含的表1的突变差异之外，本文所述的变体衣壳多肽与SEQ ID NO:16的衣壳多肽(例如SEQ ID NO:16的VP1、VP2或VP3序列)至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在一些实施例中，变体衣壳多肽包含：(a)以下中任一者的多肽：SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4；(b)以下中任一者的VP2或VP3序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4；(c)包含与其(例如，与(a)或(b)的多肽)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:1，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)；或(d)相对于(a)或(b)的多肽，具有至少1个、但不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过3个或不超过2个氨基酸突变的多肽，其中相对于SEQ ID NO:1，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)。

在一些实施例中，变体衣壳多肽包含VP1、VP2、VP3或其任意组合，其各自与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少或约95、96、97、98或99％相同。

在一些实施例中，变体衣壳多肽包含VP1、VP2、VP3或其任意组合，其各自具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约20个突变。

在一些实施例中，变体衣壳多肽包含VP1、VP2、VP3或其任意组合，其各自具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约10个突变。

在一些实施例中，变体衣壳多肽包含VP1、VP2、VP3或其任意组合，其各自具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约5个突变。

在一些实施例中，变体衣壳多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列。

在一些实施例中，变体衣壳多肽由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列组成。

在一些实施例中，核酸分子编码如本文提供的衣壳多肽。在一些实施例中，核酸分子编码衣壳多肽，该衣壳多肽与如本文提供的衣壳多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在一些实施例中，提供的衣壳多肽包含与如本文提供的衣壳多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的衣壳多肽。

在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:2、3或4的序列。在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:4的序列。

在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:5、6或7的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。

在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:5、6或7的核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:2、3或4的序列。在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:2的序列。在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:3的序列。在一些实施例中，核酸分子或用于％同一性目的的参考核酸分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:4的序列。

在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:2、3或4的序列，该序列由SEQ ID NO:5、6或7的核苷酸序列编码。在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:2的序列，该序列由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:3的序列，该序列由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码。在一些实施例中，衣壳多肽或用于％同一性目的的参考多肽包含SEQ ID NO:4的序列，该序列由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码。

在一些实施例中，核酸分子包含与本文所述的核酸分子(例如与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:7中的任一者)至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在一些实施例中，衣壳多肽包含如下序列：该序列包括与VAR-1至VAR-3中的任一者(例如，如表1所示)相关的突变中的一个、两个、三个、四个、五个、六个(如果存在)、七个(如果存在)、八个(如果存在)或九个(如果存在)。在一些实施例中，衣壳多肽包含如下序列：该序列包括对应于与VAR-1至VAR-3中的任一者(例如，如表1所示)相关的突变的一个、两个、三个、四个、五个、六个(如果存在)、七个(如果存在)、八个(如果存在)或九个(如果存在)突变。在一些实施例中，衣壳多肽在其他方面与参考衣壳多肽序列(例如，如本文所述，例如与SEQ ID NO:1)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同。在一些实施例中，衣壳多肽在其他方面与参考衣壳多肽序列(例如，如本文所述，例如与SEQID NO:1)100％相同。

在一些实施例中，衣壳多肽包含如下序列：该序列包括与VAR-1至VAR-3中任一者相关的所有突变差异(例如，如表1所示)，并且该序列进一步包括相对于SEQ ID NO:1的不超过30个、不超过20个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个另外的突变。

在一些实施例中，衣壳多肽是VP1衣壳多肽。在实施例中，衣壳多肽是VP2衣壳多肽。在实施例中，衣壳多肽是VP3衣壳多肽。就参考序列SEQ ID NO:1而言，VP1衣壳多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-724。就参考序列SEQ ID NO:1而言，VP2衣壳多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸138-724。就参考序列SEQ ID NO:1而言，VP3衣壳多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸203-724。

表1列出了关于包含含有变体衣壳的核酸的示例性变体依赖性细小病毒颗粒的信息，其关于所述非限制性示例性变体的眼部转导特性和生产特征。表2中提供了衣壳多肽和编码其的核酸分子的示例性序列。

表1.包含来自实例1中所述的文库实验的变体衣壳多肽的示例性变体依赖性细小病毒(例如，AVV)颗粒的转导(在静脉内(“IV”)施用后)和病毒产生。取代被标记为n###N，其中“N”是最终氨基酸，“n”是参考氨基酸并且“###”是SEQ ID NO:1的参考氨基酸位置；缺失被标记为n###-，其中“-”表示在参考序列SEQ ID NO:1的位置“###”处“n”的缺失；插入被标记为###_Naa_###_(n)y，其中“###”是参考序列SEQ ID NO:1中插入发生在其之间的氨基酸位置，“Naa”是指插入的长度(具有“N”个氨基酸)并且“(n)y”提供插入的序列)。每个个别突变差异(例如，在一行内，在第7列中的引号(‘’)中的每个突变)和此类个别突变差异的组合有时在本文中被称为“与VAR-X相关的突变”，其中VAR-X是“名称列”中列出的变体标识符。

表4至6。在根据实例2向非人灵长类动物进行玻璃体内(IVT)施用(表4)或静脉内(IV)施用(表5；眼部区域/表6；肝脏)之后，相对于包含野生型AAV2的衣壳多肽(例如，SEQID NO:1的衣壳多肽)的比较病毒颗粒，或者在肝脏特性的情况下，相对于包含野生型AAV2的衣壳多肽(例如，SEQ ID NO:1的衣壳多肽)或野生型AAV5的衣壳多肽(例如，SEQ ID NO:9的衣壳多肽)的比较病毒颗粒，所测量的包含所示变体的衣壳多肽的病毒颗粒的眼部区域和肝脏的生物分布和转导。所有值都是相对于通过相同施用途径递送的指示比较物的log2。“脉络膜”是指来自取自所有视网膜和黄斑组织样本的聚集样本的脉络膜层。“视网膜”是指来自取自所有视网膜和黄斑组织样本的聚集样本的神经视网膜层。“非黄斑视网膜”是指来自取自所有视网膜，而非黄斑的组织样本的聚集样本的神经视网膜层。

表4.

表5.

表6.

表7.如实例2中所述对非人灵长类动物静脉内施用后的总体脑组织样本中的相对转导率。所有值都是相对于针对包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒观察到的转导率的log2。标准差是与每个变体相关的八个独特条形码的测量值的标准差。

表2

在一些实施例中，衣壳多肽与如表2中提供的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性。在一些实施例中，衣壳多肽与SEQ ID NO:2的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性。在一些实施例中，衣壳多肽与SEQ ID NO:3的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性。在一些实施例中，衣壳多肽与SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性。

在一些实施例中，衣壳多肽具有SEQ ID NO:2至4的序列。在一些实施例中，衣壳多肽具有SEQ ID NO:2的序列。在一些实施例中，衣壳多肽具有SEQ ID NO:3的序列。在一些实施例中，衣壳多肽具有SEQ ID NO:4的序列。

在一些实施例中，核酸分子编码与如表2所提供的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的衣壳多肽，并且任选地包括与表2的变体衣壳多肽中的一者相关的突变中的至少一者，例如全部。在一些实施例中，核酸分子编码与SEQ ID NO:2的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的衣壳多肽，并且任选地包括与表2的VAR-1相关的突变中的至少一者，例如全部。在一些实施例中，核酸分子编码与SEQ ID NO:3的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的衣壳多肽，并且任选地包括与表2的VAR-2相关的突变中的至少一者，例如全部。在一些实施例中，核酸分子编码与SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的衣壳多肽，并且任选地包括与表2的VAR-2相关的突变中的至少一者，例如全部。

在一些实施例中，衣壳多肽包含参考衣壳序列，如SEQ ID NO:1，以及至少或约80％、85％、90％、或95％、或100％的突变(插入、缺失或取代)，如VAR-1、VAR-2或VAR-3的表1的突变差异列中所示。在一些实施例中，参考衣壳序列包含至少、约或精确地80％的突变(插入、缺失或取代)。在一些实施例中，参考衣壳序列包含至少、约或精确地85％的突变(插入、缺失或取代)。在一些实施例中，参考衣壳序列包含至少、约或精确地90％的突变(插入、缺失或取代)。在一些实施例中，参考衣壳序列包含至少、约或精确地95％的突变(插入、缺失或取代)。在一些实施例中，参考衣壳序列包含100％的突变(插入、缺失或取代)。

在一些实施例中，衣壳多肽包含参考衣壳序列，如SEQ ID NO:1，以及至少、或约、或精确地80％、85％、90％、或95％、或100％的突变的以下组中的一者(这些突变组的术语在上表1的图例中提供)：

[‘R585V’、‘R588T’、‘Q589G’、‘A590P’、‘A593G’、‘T597I’、‘D608N’]；

[‘R585S’、‘G586S’、‘N587I’、‘R588T’、‘Q589A’、‘A590P’、‘A591G’、‘A593G’、‘V600C’]；或

[‘R585N’、‘R588T’、‘A590P’、‘A591T’、‘T597H’]。

在一些实施例中，衣壳多肽包含参考衣壳序列，如SEQ ID NO:1，以及至少、或约、或精确地80％、85％、90％、或95％、或100％的[‘R585V’、‘R588T’、‘Q589G’、‘A590P’、‘A593G’、‘T597I’、‘D608N’]。在一些实施例中，衣壳多肽包含[‘R585V’、‘R588T’、‘Q589G’、‘A590P’、‘A593G’、‘T597I’、‘D608N’]的突变中的至少6个或全部。

在一些实施例中，衣壳多肽包含参考衣壳序列，如SEQ ID NO:1，以及至少、或约、或精确地80％、85％、90％、或95％、或100％的[‘R585S’、‘G586S’、‘N587I’、‘R588T’、‘Q589A’、‘A590P’、‘A591G’、‘A593G’、‘V600C’]。在一些实施例中，衣壳多肽包含[‘R585S’、‘G586S’、‘N587I’、‘R588T’、‘Q589A’、‘A590P’、‘A591G’、‘A593G’、‘V600C’]的突变中的至少8个或全部。

在一些实施例中，衣壳多肽包含参考衣壳序列，如SEQ ID NO:1，以及至少、或约、或精确地80％、85％、90％、或95％、或100％的[‘R585N’、‘R588T’、‘A590P’、‘A591T’、‘T597H’]。在一些实施例中，衣壳多肽包含[‘R585N’、‘R588T’、‘A590P’、‘A591T’、‘T597H’]的突变中的至少4个或全部。

在实施例中，核酸分子包括编码本文所述的变体衣壳多肽的序列。

变体衣壳(对应位置)

本文所述的衣壳多肽序列的突变是相对于参考序列(例如SEQ ID NO:1)内的位置和/或位置处的氨基酸来描述的。因此，在一些实施例中，本文所述的衣壳多肽是参考序列(例如，SEQ ID NO:1)的变体衣壳多肽，例如包括包含与参考衣壳多肽序列(例如，参考衣壳多肽VP1、VP2和/或VP3序列)，例如SEQ ID NO:1(或其中包含的VP2或VP3序列)至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的衣壳多肽并且进一步包括本文所述的一个或多个，例如全部突变，例如与根据表1的VAR-1至VAR-3中的任一者相关的突变。

本领域技术人员应当理解，且不受理论的束缚，参考序列内的每个氨基酸位置对应于其他衣壳多肽(如衍生自具有不同血清型的依赖性细小病毒的衣壳多肽)的序列内的位置。使用本领域已知的序列比对工具来鉴定此类对应位置。特别优选的序列比对工具是Clustal Omega(Sievers F.等人，Mol.Syst.Biol.7:359,2011,DOI:10.1038/msb.2011.75，其通过引用整体并入本文)。示例性参考衣壳多肽的比对显示于图2A至2C中。因此，在一些实施例中，本发明的变体衣壳多肽包括参考衣壳多肽的变体，该参考衣壳多肽的变体在对应于相对于不同的参考衣壳多肽的本文所述的突变的位置的位置处，在此类参考衣壳多肽中，包含本文所述的一个或多个突变。因此，例如，相对于SEQ ID NO:1描述为XnnnY的突变(其中X是SEQ ID NO:1中位置nnn处存在的氨基酸并且Y是该位置处的氨基酸突变，例如本文所述的)，本公开提供了变体衣壳多肽，其包含与除了SEQ ID NO:1(或其中包含的VP2或VP3序列)的参考衣壳多肽序列(例如，参考衣壳多肽VP1、VP2和/或VP3序列)至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，并且进一步包含在对应于SEQ ID NO:1的位置nnn的位置处的所公开的突变(例如，在新的变体衣壳多肽序列中对应于SEQ ID NO:1的位置nnn的位置处包含Y)。如上所述，使用序列比对工具，如例如上述clustal omega工具来确定此类对应位置。图2A至2C中提供了示例性已知AAV血清型的对应氨基酸位置的实例。

因此，在实施例中，本公开提供了衣壳多肽序列，其是除SEQ ID NO:1之外的参考序列(例如，除如本文所述的SEQ ID NO:1之外的参考序列)的变体，其包括对应于本文所述的突变的一个或多个突变。在实施例中，此类变体包括对应于与根据表1的VAR-1至VAR-3中任一者相关的所有突变的突变。

如本文所使用的，如用于涉及序列(如氨基酸或核酸序列)中的位置的术语“对应于”，可以用于涉及整个衣壳多肽或多核苷酸序列，如包含VP1、VP2和VP3多肽的衣壳多肽的全长序列，或编码其的核酸分子。在一些实施例中，术语“对应于”可用于涉及衣壳多肽的区域或结构域。例如，对应于参考衣壳多肽的VP1部分中的位置的位置可以对应于变体衣壳多肽的多肽的VP1部分。因此，当比对两个序列以确定位置是否对应于另一个位置时，可以使用全长多肽或者可以使用结构域(区域)来确定位置是否对应于特定位置。在一些实施例中，区域是VP1多肽。在一些实施例中，区域是VP2多肽。在一些实施例中，区域是VP3多肽。在一些实施例中，当参考多肽是AAV的某种血清型的野生型序列(例如，全长或区域)时，变体多肽可以是具有与参考序列(例如，全长或区域)相比在此类对应位置处进行的突变的相同血清型。在一些实施例中，变体衣壳多肽与参考序列相比是不同的血清型。

本文所述的变体衣壳多肽任选地是本领域已知的参考衣壳血清型的变体(例如，包含参考衣壳多肽)。此类参考AAV血清型(和相关参考衣壳多肽)的非限制性实例包括：AAV1、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV5、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9.11、AAV9.13、AAV9、AAV9 K449R(或K449R AAV9)、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74(也称为AAVrh74)、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8RR533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAVShuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAVSM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAVCBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAVCHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAVCKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAVCKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAVCKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAVCLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAVCLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAVCLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAVCLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAVCLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAVCLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAVCLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAVCLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAVCSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、和/或AAVF9/HSC9、7m8、Spark100、AAVMYO及其变体。

在一些实施例中，参考AAV衣壳序列包含AAV2序列。在一些实施例中，参考AAV衣壳序列包含AAV5序列。在一些实施例中，参考AAV衣壳序列包含AAV8序列。在一些实施例中，参考AAV衣壳序列包含AAV9序列。在一些实施例中，参考AAV衣壳序列包含AAVrh74序列。尽管不希望受理论束缚，但应当理解，参考AAV衣壳序列包含VP1区域。在某些实施例中，参考AAV衣壳序列包含VP1、VP2和/或VP3区域，或其任意组合。参考VP1序列可以被认为与参考AAV衣壳序列同义。

SEQ ID NO:1(野生型AAV2)的示例性参考序列如下：

除非另有说明，否则SEQ ID NO:1是参考序列。在上述序列中，VP1、VP2和VP3中发现的序列加下划线(例如，VP3衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸203-735的氨基酸，例如由其组成)，VP1和VP2两者中发现的序列以粗体显示(例如，VP2衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸138-735的序列，例如由其组成)，并且没有加下划线或粗体的序列仅在VP1中发现(例如，VP1衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-735的氨基酸，例如由其组成)。

编码SEQ ID NO:1的示例性核酸序列是SEQ ID NO:8：

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA(SEQ ID NO:8)。

野生型AAV5的示例性参考序列，SEQ ID NO:9(野生型AAV5)如下：

在上述序列中，VP1、VP2和VP3中发现的序列加下划线(例如，VP3衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:9的氨基酸193-725的氨基酸，例如由其组成)，VP1和VP2两者中发现的序列以粗体显示(例如，VP2衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:9的氨基酸137-725的序列，例如由其组成)，并且没有加下划线或粗体的序列仅在VP1中发现(例如，VP1衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:9的氨基酸1-725的氨基酸，例如由其组成)。

编码SEQ ID NO:9的示例性核酸序列是SEQ ID NO:10：

ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTCGCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGCATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGGAAACGGGCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGAGCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAAGTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTTCGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACCTTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGACGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTGTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA(SEQ ID NO:10)。

野生型AAV8的示例性参考序列，SEQ ID NO:11(野生型AAV8)如下：

在上述序列中，VP1、VP2和VP3中发现的序列加下划线(例如，VP3衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:11的氨基酸204-739的氨基酸，例如由其组成)，VP1和VP2两者中发现的序列以粗体显示(例如，VP2衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:11的氨基酸138-735的序列，例如由其组成)，并且没有加下划线或粗体的序列仅在VP1中发现(例如，VP1衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:11的氨基酸1-739的氨基酸，例如由其组成)。

编码SEQ ID NO:11的示例性核酸序列是SEQ ID NO:12：

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTGCAGGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGTTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAACAGCCCGCCAGAAAAAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACATCGGGAGGAGCCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTCACCAGCACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTGCCGTACGTTCTCGGCTCTGCCCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCCCAGTACGGCTACCTAACACTCAACAACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCAACACACAAAGACGACGAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAA(SEQ ID NO:12)。

野生型AAV9的示例性参考序列，SEQ ID NO:13(野生型AAV9)如下：

在上述序列中，VP1、VP2和VP3中发现的序列加下划线(例如，VP3衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:13的氨基酸203-737的氨基酸，例如由其组成)，VP1和VP2两者中发现的序列以粗体显示(例如，VP2衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:13的氨基酸138-737的序列，例如由其组成)，并且没有加下划线或粗体的序列仅在VP1中发现(例如，VP1衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:13的氨基酸1-737的氨基酸，例如由其组成)。

编码SEQ ID NO:13的示例性核酸序列是SEQ ID NO:14：

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGTATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA(SEQ ID NO:14)。

野生型AAVrh74的示例性参考序列，SEQ ID NO:15(野生型AAVrh74)如下：

SEQ ID NO:16(替代野生型AAVrh74)的替代示例性参考序列如下：

在上述序列(SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16)中，VP1、VP2和VP3中发现的序列加下划线(例如，VP3衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:15的氨基酸204-739的氨基酸，例如由其组成)，VP1和VP2两者中发现的序列以粗体显示(例如，VP2衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:15的氨基酸137-739的序列，例如由其组成)，并且没有加下划线或粗体的序列仅在VP1中发现(例如，VP1衣壳多肽包括对应于SEQ ID NO:15的氨基酸1-739的氨基酸，例如由其组成)。

编码SEQ ID NO:15的示例性核酸序列是SEQ ID NO:17。

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACAACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCCAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGCGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGCGGGTTCTCGAACCTCTGGGCCTGGTTGAATCGCCGGTTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGCTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCAAAAAAGAGACTCAATTTTGGGCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCTCAACCAATCGGAGAACCACCAGCAGGCCCCTCTGGTCTGGGATCTGGTACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGCACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGGCTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGATTCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTGCTCGGCTCGGCGCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGCAGTCAGGCTGTGGGCCGGTCGTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAATTCAGCTACAACTTCGAGGACGTGCCCTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCTCTCATCGACCAGTACTTGTACTACCTGTCCCGGACTCAAAGCACGGGCGGTACTGCAGGAACTCAGCAGTTGCTATTTTCTCAGGCCGGGCCTAACAACATGTCGGCTCAGGCCAAGAACTGGCTACCCGGTCCCTGCTACCGGCAGCAACGTGTCTCCACGACACTGTCGCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCTGGCGTTGCCATGGCTACCCACAAGGACGACGAAGAGCGATTTTTTCCATCCAGCGGAGTCTTAATGTTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAAAGACAACGTGGACTATAGCAGCGTGATGCTAACCAGCGAGGAAGAAATAAAGACCACCAACCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCGTGGTGGCCGATAACCTGCAACAGCAAAACGCCGCTCCTATTGTAGGGGCCGTCAATAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTGTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCATACGGACGGCAACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAGCATCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAAAACACACCTGTTCCCGCGGATCCTCCGACCACCTTCAATCAGGCCAAGCTGGCTTCTTTCATCACGCAGTACAGTACCGGCCAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAGAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAATACTGAGGGTACTTATTCCGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAA(SEQ ID NO:17)。

本公开涉及由衣壳(Cap)基因编码的结构衣壳蛋白(包括VP1、VP2和VP3)。这些衣壳蛋白形成病毒载体(如AAV)的外部蛋白质结构壳(即衣壳)。由Cap多核苷酸合成的VP衣壳蛋白通常包含甲硫氨酸作为肽序列中的第一个氨基酸(Met1)，其与对应Cap核苷酸序列中的起始密码子(AUG或ATG)相关。然而，在多肽合成之后或在多肽合成期间，第一个甲硫氨酸(Met1)残基或通常任何第一个氨基酸(AA1)通常会被蛋白质加工酶(如Met-氨基肽酶)切割。这种“Met/AA剪切”过程通常与多肽序列中第二个氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的对应乙酰化相关。Met剪切通常发生在VP1和VP3衣壳蛋白上，但也可能发生在VP2衣壳蛋白上。在Met/AA剪切不完全的情况下，可以产生包含病毒衣壳的一种或多种(一种、两种或三种)VP衣壳蛋白的混合物，其中一些包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)并且其中一些由于Met/AA剪切(Met-/AA-)而缺乏Met1/AA1氨基酸。有关衣壳蛋白中Met/AA剪切的进一步讨论，请参见Jin等人Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysisfor Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus CapsidProteins.Hum Gene Ther Methods.2017年10月28日(5):255-267；Hwang等人N-TerminalAcetylation of Cellular Proteins Creates Specific DegradationSignals.Science.2010年2月19日.327(5968):973-977；其内容各自均通过引用整体并入本文。根据本公开，提及衣壳多肽不限于剪切的(Met-/AA-)或未剪切的(Met+/AA+)，并且在上下文中还指独立的衣壳多肽、由衣壳蛋白的混合物组成的病毒衣壳、和/或编码、描述、产生或导致本公开的衣壳多肽的多核苷酸序列(或其片段)。直接提及“衣壳多肽”(如VP1、VP2或VP3)还包括VP衣壳蛋白，该衣壳蛋白包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)以及对应的VP衣壳多肽，该衣壳蛋白由于Met/AA剪切(Met-/AA-)而缺乏Met1/AA1氨基酸。进一步根据本公开，对分别包含或编码包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)的一种或多种衣壳多肽的特定SEQ IDNO:(无论是蛋白质还是核酸)的提及应当理解为教导缺乏Met1/AA1氨基酸的VP衣壳多肽，因为当审查序列时，很容易看出仅仅缺乏第一个列出的氨基酸(无论是否是Met1/AA1)的任何序列。作为非限制性实例，提及长度为736个氨基酸并且包括由AUG/ATG起始密码子编码的“Met1”氨基酸(Met+)的VP1多肽序列也被理解为教导如下VP1多肽序列：长度为735个氨基酸，并且不包括736个氨基酸Met+序列中的“Met1”氨基酸(Met-)。作为第二个非限制性实例，提及长度为736个氨基酸并且包括由任何NNN起动密码子编码的“AA1”氨基酸(AA1+)的VP1多肽序列也可以被理解为教导如下VP1多肽序列：长度为735个氨基酸，并且不包括736个氨基酸AA1+序列中的“AA1”氨基酸(AA1-)。提及由VP衣壳蛋白形成的病毒衣壳(如提及特定的AAV衣壳血清型)，可以并入包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA1+)的VP衣壳蛋白、由于Met/AA1剪切缺乏Met1/AA1氨基酸(Met-/AA1-)的对应VP衣壳蛋白及其组合(Met+/AA1+和Met-/AA1-)。作为非限制性实例，AAV衣壳血清型可包括VP1(Met+/AA1+)、VP1(Met-/AA1-)、或VP1(Met+/AA1+)和VP1(Met-/AA1-)的组合。AAV衣壳血清型还可以包括VP3(Met+/AA1+)、VP3(Met-/AA1-)、或VP3(Met+/AA1+)和VP3(Met-/AA1-)的组合；并且还可以包括VP2(Met+/AA1)和VP2(Met-/AA1-)的类似任选组合。

在一些实施例中，参考AAV衣壳序列包括与上述序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，参考AAV衣壳序列由与上述序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在某些实施例中，参考序列不是AAV衣壳序列，而是不同的载体(例如，慢病毒、质粒等)。

在一些实施例中，本公开的核酸(例如，编码本文所述的变体衣壳多肽)包含常规的控制元件或序列，其以允许在用核酸(例如，包含所述核酸的质粒载体)转染或用包含所述核酸的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至核酸分子。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与所关注的基因邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制所关注的基因的表达控制序列。

表达控制序列包括有效的RNA加工信号，如剪接和多聚腺苷酸化(多聚A)信号；适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；稳定细胞质mRNA的序列；增强蛋白质稳定性的序列；提高翻译效率的序列(例如Kozak共识序列)；以及在一些实施例中，增强所编码的转基因产物的分泌的序列。表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以与本文公开的组合物和方法一起使用。

在一些实施例中，可以使用转基因的天然启动子。不希望受理论束缚，天然启动子可以模拟转基因的天然表达，或提供时间、发育或组织特异性表达，或响应于特定转录刺激的表达。在一些实施例中，转基因可以可操作地连接至其他天然表达控制元件，如增强子元件、多聚腺苷酸化位点或Kozak共识序列，例如以模拟天然表达。

在一些实施例中，转基因可操作地连接至组织特异性启动子。

在一些实施例中，携带转基因的载体，例如质粒，还可以包括选择性标志物或报告基因。此类选择性报告基因或标志物基因可用于发出细菌细胞中载体(例如质粒)存在的信号。载体的其他组分，例如质粒，可以包括复制起点。这些和其他启动子和载体元件的选择是常规的并且许多此类序列是可用的(参见，例如，Sambrook等人，以及其中引用的参考文献)。

在一些实施例中，与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加眼睛中的转导。在一些实施例中，与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加视网膜中的转导。在一些实施例中，与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽相对于黄斑和小梁网增加非黄斑视网膜中的转导。在一些实施例中，所述病毒颗粒是静脉内施用的。

在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ IDNO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以至少1倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以至少2倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以4倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以6倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ IDNO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以8倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以10倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以15倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以16倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以32倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以64倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以100倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以150倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以200倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以500倍增加眼部转导。在一些实施例中，例如与具有参考衣壳多肽，例如具有野生型衣壳多肽(SEQ ID NO:1)的病毒颗粒相比，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽以1000倍增加眼部转导。在实施例中，增加的眼部转导通过比较由包装在变体病毒颗粒中的核酸产生的靶组织中(例如，靶组织的细胞或细胞群中)的mRNA水平与由包装在参考病毒颗粒中(例如，包装在包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的衣壳中)的核酸产生的靶组织(例如，靶组织的细胞或细胞群中)中的mRNA水平进行测量。

在一些实施例中，衣壳多肽是分离的或纯化的多肽(例如，从细胞、其他生物组分或污染物中分离或纯化)。在一些实施例中，变体多肽存在于依赖性细小病毒颗粒中，例如本文所述的。在一些实施例中，变体衣壳多肽存在于细胞、无细胞体系或翻译体系中，例如本文所述的。

在一些实施例中，衣壳多肽存在于依赖性细小病毒B(例如，AAV2)颗粒中。在一些实施例中，衣壳颗粒具有增加的眼部转导。

在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒包含与本文所提供的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2-4)具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体衣壳多肽包含与本文所提供的变体衣壳多肽的氨基酸序列相差不超过30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施例中，另外的改变改善了依赖性细小病毒颗粒的生产特征或其制备方法。在一些实施例中，另外的改变改善或改变依赖性细小病毒颗粒的另一特征，例如趋向性。

VP1核酸和多肽

本公开进一步部分地涉及包含编码本文所提供的依赖性细小病毒(例如，依赖性细小病毒B，例如AAV2)多肽的序列的核酸，以及由其编码的VP1多肽。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:2、3或4的序列。

依赖性细小病毒颗粒

本公开还部分地涉及包含本文所述的或通过本文所述的方法产生的核酸或变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒(例如，功能性依赖性细小病毒颗粒)。

依赖性细小病毒是单链DNA细小病毒，其仅在细胞中生长，在该细胞中某些功能例如由共感染的辅助病毒提供。已知依赖性细小病毒的几个物种，包括依赖性细小病毒A和依赖性细小病毒B，其包括本领域已知的作为腺相关病毒(AAV)的血清型。至少十三种AAV的血清型已被表征。AAV的一般信息和评论可以在例如Carter,Handbook of Parvoviruses，第1卷，第169-228页(1989)以及Berns,Virology，第1743-1764页,Raven Press,(New York,1990)中发现。AAV血清型，以及在某种程度上，依赖性细小病毒物种在结构和功能上显著相关。(参见例如，Blacklowe,Parvoviruses and Human Disease的第165-174页,J.R.Pattison编辑,(1988)；以及Rose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型都明显表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制特性；并且都带有三种相关的衣壳蛋白。此外，异源双链体分析揭示了沿基因组长度的血清型之间的广泛的交叉杂交，进一步表明了相互关联性。依赖性细小病毒基因组在末端还包含对应于“反向末端重复序列”(ITR)的自退火片段。

天然存在的依赖性细小病毒(例如AAV血清型)的基因组结构非常相似。例如，AAV的基因组是线性、单链DNA分子，其长度大约5,000个核苷酸(nt)或更少。反向末端重复序列(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白和结构衣壳(Cap)蛋白的独特编码核苷酸序列两侧。三种不同的病毒颗粒(VP)蛋白形成衣壳。末端145nt是自身互补的并且被组织成使得可以形成T形发夹的能量稳定的分子内双链体。这些发夹结构用作病毒DNA复制的起点，从而用作用于细胞DNA聚合酶复合物的引物。Rep基因编码Rep蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68由p5启动子转录，并且Rep52和Rep40由p19启动子转录。cap基因编码VP蛋白VP1、VP2和VP3。cap基因由p40启动子转录。

在一些实施例中，本公开的依赖性细小病毒颗粒包含核酸，该核酸包含本文所提供的衣壳多肽。在一些实施例中，颗粒包含如本文所提供的变体衣壳多肽。

在一些实施例中，本公开的依赖性细小病毒颗粒可以是AAV2颗粒或其变体。在一些实施例中，AAV2颗粒包含如本文所提供的衣壳多肽和/或编码其的核酸分子。

在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒包含衣壳，该衣壳包含本文所述的变体衣壳多肽。在实施例中，依赖性细小病毒颗粒包含本文所述的变体衣壳多肽和核酸分子。在实施例中，依赖性细小病毒颗粒包含本文所述的变体衣壳多肽和核酸分子，该核酸分子包含一个或多个反向末端重复序列(ITR)(例如衍生自AAV2依赖性细小病毒的ITR)、一个或多个调控元件(例如，启动子)和有效载荷(例如，如本文所述)。在实施例中，ITR中的至少一者是经修饰的。在实施例中，核酸分子是单链的。在实施例中，核酸分子是自身互补的。

增加的眼部转导特征(眼部靶向)

本公开部分地涉及核酸、多肽、细胞、无细胞体系、翻译体系、病毒颗粒、组合物以及与制备其相关的方法以产生与具有参考序列(例如具有SEQ ID NO:1的野生型序列)的衣壳多肽的病毒颗粒相比具有增加的眼部转导(例如视网膜转导)的病毒颗粒。在实施例中，在病毒颗粒或其组合物的静脉内施用后表现出此类增加的眼部转导。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致眼睛中转基因的眼部转导增加，并且因此导致眼睛中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致视网膜中转基因的眼部转导增加，并且因此导致视网膜中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致非黄斑视网膜中转基因的眼部转导增加，并且因此导致非黄斑视网膜中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致黄斑中转基因的眼部转导增加，并且因此导致黄斑中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致小梁网中转基因的眼部转导增加，并且因此导致小梁网中转基因的表达增加。在实施例中，在静脉内施用时实现增加的眼部转导。

在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致眼睛前三分之一处转基因的眼部转导增加，其包括玻璃体前面的结构。玻璃体前面的结构的实例包括角膜、虹膜、睫状体、晶状体、小梁网和施累姆氏管。因此，在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致角膜、虹膜、睫状体、晶状体、小梁网或施累姆氏管或其任意组合中转基因的眼部转导增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致晶状体后(如在前玻璃体膜和其后面的所有光学结构中，如玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经，或其任意组合中)转基因的眼部转导增加。因此，在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致在前玻璃体膜和其后面的所有光学结构中(如玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经，或其任意组合中)转基因的眼部转导增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致眼睛前三分之一处和晶状体后转基因的眼部转导增加。

在一些实施例中，眼部转导的增加在log2标度上，是具有参考序列衣壳多肽(例如具有野生型衣壳多肽SEQ ID NO:1)的病毒颗粒的约1-10倍好(例如，约2-5倍好，例如，约3-5倍好，例如约7-9倍好，例如约8倍好)。例如，在log2标度上转导以8倍优于另一病毒颗粒的病毒颗粒因此相对于具有参考序列的病毒颗粒在转导方面表现出256倍的改进。在实施例中，在静脉内施用时实现增加的转导。

在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:1，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加转导而不增加变体衣壳多肽在眼睛中的生物分布。在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:1，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加转导而不增加变体衣壳多肽在视网膜中的生物分布。在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:1，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加转导而不增加变体衣壳多肽在小梁网中的生物分布。在实施例中，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽，在每种情况下相对于包含野生型AAV2和/或野生型AAV5衣壳多肽的病毒颗粒，增加眼睛的一个或多个区域(例如，脉络膜、视网膜、黄斑、非黄斑视网膜或小梁网)中的转导，但减少肝脏中的转导。在实施例中，肝脏转导的减少是相对于AAV2或AAV5至少约4倍，并且在实施例中，比包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒低至少约16倍。表1和表4至6中提供了包含本发明的示例性变体衣壳多肽的病毒颗粒的相对转导值(相对于包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒的log2)。在实施例中，包括在任何上述实施例中，转导是如通过对从所关注组织的细胞分离的病毒RNA进行定量NGS测序来测量的，例如，如实例1中所述。在实施例中，包括在任何上述实施例中，转导是如通过对从所关注组织分离的病毒DNA进行定量NGS测序来测量的，例如，如实例1中所述。在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:1，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加转导而不增加变体衣壳多肽在眼睛中的生物分布。在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:1，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加转导而不增加变体衣壳多肽在视网膜中的生物分布。在一些实施例中，相对于SEQ ID NO:1，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽增加转导而不增加变体衣壳多肽在小梁网中的生物分布。

增加的CNS转导特征(CNS靶向和CNS/眼部双重靶向)

本公开部分地涉及核酸、多肽、细胞、无细胞体系、翻译体系、病毒颗粒、组合物以及与制备其相关的方法以产生与具有参考序列(例如具有SEQ ID NO:1的野生型序列)的衣壳多肽的病毒颗粒相比具有增加的中枢神经系统(“CNS”)转导(例如，全脑、小脑和/或中脑)转导的病毒颗粒。在实施例中，在病毒颗粒或其组合物的静脉内施用后表现出此类增加的CNS转导。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致脑的一个或多个区域中转基因的转导增加，并且因此导致脑的此类一个或多个区域中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致中脑中转基因的转导增加，并且因此导致中脑中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致小脑中转基因的转导增加，并且因此导致小脑中转基因的表达增加。在一些实施例中，包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的使用导致CNS的一个或多个区域(例如，小脑和/或中脑)中转基因的转导增加，并导致眼睛的一个或多个区域(例如，视网膜、黄斑、脉络膜和/或小梁网)中转基因的转导增加，并且因此导致此类组织组合中转基因的表达增加。在实施例中，在静脉内施用时实现增加的CNS或CNS和眼部转导。

在一些实施例中，CNS转导的增加在log2标度上，是具有参考序列衣壳多肽(例如具有野生型衣壳多肽SEQ ID NO:1)的病毒颗粒约1-10倍好(例如，约2-8倍好，例如，约3-8倍好，例如约5-8倍好，例如约或至少8倍好)。例如，在log2标度上转导以8倍优于另一病毒颗粒的病毒颗粒因此相对于具有参考序列的病毒颗粒在转导方面表现出256倍的改进。在实施例中，在静脉内施用时实现增加的转导。

降低的肝脏转导特征(肝脏脱靶)

在实施例中，存在于病毒颗粒中的衣壳多肽，在每种情况下相对于包含野生型AAV2和/或野生型AAV5衣壳多肽的病毒颗粒，增加眼睛的一个或多个区域(例如，脉络膜、视网膜、黄斑、非黄斑视网膜或小梁网)和/或CNS的一个或多个区域中的转导，但减少肝脏中的转导。在实施例中，肝脏转导的减少是相对于野生型AAV2或野生型AAV5至少约4倍，并且在实施例中，比包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒低至少约16倍。

在实施例中，本文提供了衣壳多肽和包含所述衣壳多肽的病毒颗粒，如本文所述，其中相对于包含野生型AAV2的衣壳多肽(例如，SEQ ID NO:1的衣壳多肽)的病毒颗粒，包含所述衣壳多肽(如本文所述)的病毒颗粒表现出：(1)一种或多种眼部组织(例如，神经视网膜、黄斑和/或视网膜的神经视网膜层、脉络膜和/或小梁网)中的转导增加；(2)一种或多种CNS组织(例如中脑和/或小脑)中的转导增加，以及(3)一种或多种肝脏组织中的转导降低。在实施例中，对一种或多种眼部组织的增加的转导是通过具有野生型AAV2衣壳多肽(例如SEQ ID NO:1的衣壳多肽)的其他方面相同的病毒颗粒所表现出的转导水平的至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍；对一种或多种CNS组织的增加的转导是通过具有野生型AAV2衣壳多肽(例如，SEQ ID NO:1的衣壳多肽)的其他方面相同的病毒颗粒所表现出的转导水平的至少20倍、至少40倍、至少100倍、至少150倍或至少300倍；以及对一种或多种肝脏组织的降低的转导是通过具有野生型AAV2衣壳多肽(例如，SEQ ID NO:1的衣壳多肽)的其他方面相同的病毒颗粒所表现出的转导水平的不大于25％或不大于5％。在实施例中，例如向哺乳动物、例如向非人灵长类动物的全身性(例如，静脉内)施用后测量转导。在实施例中，转导是如通过对从所关注组织分离的病毒RNA进行定量NGS测序来测量的，例如，如实例1中所述。

表1和表4至7中提供了包含本发明的示例性变体衣壳多肽的病毒颗粒的相对转导值(相对于包含野生型AAV2(并且在肝脏的情况下，野生型AAV5)衣壳多肽的病毒颗粒的log2)。在实施例中，包括在任何上述实施例中，转导是如通过对从所关注组织的细胞分离的病毒RNA进行定量NGS测序来测量的，例如，如实例1中所述。在实施例中，包括在任何上述实施例中，生物分布是如通过对从所关注组织分离的病毒DNA进行定量NGS测序来测量的，例如，如实例1中所述。

制备本文所述的组合物的方法

本公开部分地涉及一种制备本文所述的衣壳多肽或依赖性细小病毒颗粒(例如本文所述的依赖性细小病毒颗粒)的方法。在一些实施例中，一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含编码本文所提供的变体衣壳多肽，或本文所提供的多肽(例如，变体衣壳多肽)的本文所述的核酸；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而产生依赖性细小病毒颗粒。

在一些实施例中，提供包含本文所述的核酸的细胞包括将核酸引入细胞，例如用核酸转染或转化细胞。本公开的核酸可以位于可以递送至宿主细胞的任何遗传元件(载体)的一部分，例如裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、非病毒递送媒介物中的蛋白质(例如，基于脂质的载体)、病毒等，其转移其上所携带的序列。此类载体可以通过任何合适的方法，包括转染、脂质体递送、电穿孔、膜融合技术、病毒感染、高速DNA包被的团粒和原生质体融合来递送。本领域技术人员拥有构建本发明的任何实施例的核酸操作中的知识和技能，并且所述技能包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY。

在一些实施例中，本公开的载体包含编码如本文所提供的依赖性细小病毒变体衣壳多肽或其片段的序列。在一些实施例中，本公开的载体包含编码依赖性细小病毒rep蛋白或其片段的序列。在一些实施例中，此类载体可含有编码依赖性细小病毒cap(例如，本文所述的变体衣壳多肽)和rep蛋白两者的序列。在其中提供AAV rep和cap两者的载体中，依赖性细小病毒rep和依赖性细小病毒cap序列可以均具有相同的依赖性细小病毒物种或血清型来源，如AAV2。可替代地，本公开还提供了载体，在该载体中rep序列来自与cap序列所衍生自的依赖性细小病毒物种或血清型不同的物种或血清型。在一些实施例中，rep和cap序列由单独来源(例如单独的载体，或宿主细胞基因组和载体)表达。在一些实施例中，rep序列与不同依赖性细小病毒物种或血清型的cap序列框内融合以形成嵌合的依赖性细小病毒载体。在一些实施例中，本发明的载体进一步含有有效载荷，例如包含选定转基因的小基因(例如如本文所述的有效载荷)，例如侧接依赖性细小病毒5’ITR和依赖性细小病毒3’ITR。

本文所述的载体，例如质粒，可用于多种目的，但特别适合用于产生包含依赖性细小病毒序列或其片段以及在一些实施例中的有效载荷的重组依赖性细小病毒颗粒。

在一些实施例中，本公开提供了一种制备依赖性细小病毒颗粒(例如，依赖性细小病毒B颗粒，例如，AAV2颗粒或包含如本文所述的变体衣壳多肽的颗粒)或其部分的方法。在一些实施例中，该方法包括：培养含有编码如本文所提供的依赖性细小病毒变体衣壳多肽或其片段的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；有效载荷(例如，如本文所述)，例如，包含依赖性细小病毒反向末端重复序列(ITR)和转基因的小基因，任选地在调控元件如启动子的控制下；以及足够的辅助功能以促进有效载荷(例如小基因)包装到依赖性细小病毒衣壳中。在宿主细胞中培养以将有效载荷，例如小基因包装至依赖性细小病毒衣壳中所需的组分可以以反式形式提供至宿主细胞。在一些实施例中，可通过宿主细胞提供所需组分(例如，有效载荷(例如小基因)、rep序列、cap序列和/或辅助功能)中的任一种或多种，该宿主细胞使用本领域的技术人员已知的方法已被工程化以稳定地包含所需组分中的一种或多种。在一些实施例中，已被工程化以稳定地包含所需组分的宿主细胞包含在诱导型启动子控制下的所需组分。在一些实施例中，所需组分可以在组成型启动子的控制下。本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例，并且另外的实例是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，已被工程化以稳定地包含一种或多种组分的选定的宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的组分和在一种或多种诱导型启动子控制下的另一组分。例如，可以从293细胞(例如，其包含在组成型启动子控制下的辅助功能)生成已被工程化以稳定地包含所需组分的宿主细胞，该293细胞包含在一种或多种诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。

产生本公开的依赖性细小病毒颗粒所需的有效载荷(例如小基因)、rep序列、cap序列和辅助功能可以以转移其上携带的序列的任何遗传元件的形式(例如，以载体或载体组合的形式)递送至包装宿主细胞。可以通过任何合适的方法(包括本文所述的方法)递送遗传元件。用于构建本公开的遗传元件、载体和其他核酸的方法是本领域技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是众所周知的并且对合适的方法的选择不是对本发明的限制。参见，例如，K.Fisher等人，J.Virol,70:520-532(1993)和美国专利5,478,745。除非另有说明，否则本文所述的依赖性细小病毒ITR和其他选定的依赖性细小病毒组分可以容易地选自任何依赖性细小病毒物种和血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9。ITR或其他依赖性细小病毒组分可以使用本领域技术人员可用的技术从依赖性细小病毒物种或血清型中容易地分离。依赖性细小病毒物种和血清型可以从学术、商业或公共来源分离或获得(例如，美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)，Manassas，VA)。在一些实施例中，依赖性细小病毒序列可以通过合成或其他合适的方式通过参考公开的序列(如在文献中或在如例如GenBank或PubMed的数据库中可获得的公开的序列)而获得。

本公开的依赖性细小病毒颗粒(例如，包括变体衣壳多肽和例如有效载荷)可以使用允许产生依赖性细小病毒或生物产品并且可以维持在培养物中的任何无脊椎动物细胞类型来产生。在一些实施例中，昆虫细胞可用于产生本文所述的组合物或用于制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法中。例如，所使用的昆虫细胞系可以来自草地贪夜蛾(如Sf9、SF21、SF900+)、果蝇细胞系、蚊子细胞系(例如，白纹伊蚊衍生的细胞系)、家养蚕细胞系(例如，家蚕细胞系)、粉纹夜蛾细胞系(如High Five细胞)或鳞翅目细胞系(如暗巫夜蛾细胞系)。在一些实施例中，昆虫细胞对杆状病毒感染敏感，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、SP900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAml、BM-N、Ha2302、Hz2E5和Ao38。

在一些实施例中，本公开的方法可以用允许依赖性细小病毒的复制或生物产品的产生并且可以维持在培养物中的任何哺乳动物细胞类型进行。在一些实施例中，所使用的哺乳动物细胞可以是HEK293、HEK293T、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT1080、A549、Cos-7、ARPE-19或MRC-5细胞。在一些实施例中，培养物是贴壁细胞培养物。在一些实施例中，培养物是悬浮细胞培养物。

在昆虫细胞中表达蛋白质(例如，重组或异源蛋白质，例如依赖性细小病毒多肽)的方法已有充分记载，将核酸(如载体，例如昆虫细胞相容性载体)引入此类细胞的方法以及将此类细胞维持在培养物中的方法也是如此。参见，例如，METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,Richard编辑,Humana Press,N J(1995)；O'Reilly等人,BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORS,A LABORATORY MANUAL,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kirnbauer等人,Vir.219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)；以及Samulski等人，美国专利第6,204,059号。在一些实施例中，昆虫细胞中编码依赖性细小病毒多肽(例如，依赖性细小病毒基因组)的核酸构建体是昆虫细胞相容性载体。如本文所使用的，“昆虫细胞相容性载体”是指能够有效转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。可以使用任何载体，只要它是昆虫细胞相容的即可。载体可以整合到昆虫细胞的基因组中或保留在染色体外。载体可以永久或暂时存在，例如作为附加型载体。可以通过本领域已知的任何方式引入载体。此类方式包括但不限于细胞的化学处理、电穿孔或感染。在一些实施例中，载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。

在一些实施例中，编码依赖性细小病毒多肽的核酸序列可操作地连接至调控表达控制序列以在特定细胞类型如Sf9或HEK细胞中表达。本领域技术人员已知的用于在昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中表达外源基因的技术可以与本公开的组合物和方法一起使用。用于昆虫细胞中多肽的分子工程和表达的方法描述于例如Summers和Smith.A Manualof Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures,TexasAgricultural Experimental Station Bull.第7555号,College Station,Tex.(1986)；Luckow.1991.于Prokop等人,Cloning and Expression of Heterologous Genes inInsect Cells with Baculovirus Vectors'Recombinant DNA Technology andApplications,97-152(1986)；King,L.A.和R.D.Possee,The baculovirus expressionsystem,Chapman and Hall,United Kingdom(1992)；O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow,Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual,New York(1992)；W.H.Freeman和Richardson,C.D.,Baculovirus Expression Protocols,Methods inMolecular Biology,第39卷(1995)；美国专利第4,745,051号；US2003148506；和WO 03/074714。适合于编码依赖性细小病毒多肽的核苷酸序列的转录的启动子包括多面体、p10、p35或IE-1启动子，并且还考虑了上述参考文献中描述的其他启动子。

在一些实施例中，提供包含本文所述的核酸的细胞包括获取包含该核酸的细胞。

培养细胞、无细胞体系和其他翻译体系的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，培养细胞包括向细胞提供合适的培养基并将细胞和培养基孵育持续适合实现病毒颗粒产生的时间。

在一些实施例中，制备依赖性细小病毒颗粒的方法进一步包括纯化步骤，该纯化步骤包括将依赖性细小病毒颗粒从一种或多种其他组分(例如，从细胞或培养基组分)分离。

在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒的产生包括以下项中的一者或多者(例如，全部)：依赖性细小病毒多肽的表达、依赖性细小病毒衣壳(例如，包含本文所提供的变体衣壳多肽的衣壳)的组装、依赖性细小病毒基因组的表达(例如，复制)，以及将依赖性细小病毒基因组包装到依赖性细小病毒衣壳中以产生依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒的产生进一步包括依赖性细小病毒颗粒的分泌。

在一些实施例中，并且如本文别处所述，编码变体衣壳多肽的核酸分子位于依赖性细小病毒基因组中。在一些实施例中，并且如本文别处所述，将编码变体衣壳多肽的核酸分子与依赖性细小病毒基因组一起包装到依赖性细小病毒颗粒中，作为制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法的一部分。在其他实施例中，编码变体衣壳多肽的核酸分子不被包装到通过本文所述的方法制备的依赖性细小病毒颗粒中。

在一些实施例中，制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法产生包含有效载荷(例如，本文所述的有效载荷)和变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，有效载荷包含第二核酸(例如，除了依赖性细小病毒基因组之外)，并且依赖性细小病毒颗粒的产生包括将第二核酸包装到依赖性细小病毒颗粒中。在一些实施例中，用于制备依赖性细小病毒颗粒的方法中的细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第二核酸。在一些实施例中，第二核酸包含外源序列(例如，对依赖性细小病毒、细胞或将施用依赖性细小病毒颗粒的靶细胞或受试者是外源的)。在一些实施例中，外源序列编码外源多肽。在一些实施例中，外源序列编码治疗产品。

在一些实施例中，本文所述的核酸或多肽通过本领域技术人员已知的方法产生。本公开的核酸、多肽及其片段可以通过任何合适的方式，包括重组生产、化学合成或其他合成方式来产生。此类产生方法在本领域技术人员的知识范围内并且不限制本发明。

应用

本公开部分地涉及包含本文所述的核酸、多肽或颗粒的组合物。本公开进一步部分地涉及利用本文所述的组合物、核酸、多肽或颗粒的方法。基于本公开将显而易见，本文公开的核酸、多肽、颗粒和方法具有多种用途。

本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如编码变体衣壳多肽的核酸)的载体。许多类型的载体是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，载体包含质粒。在一些实施例中，载体是分离的载体，例如从细胞或其他生物组分中去除的载体。

本公开部分地涉及细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸或载体，例如包含编码变体衣壳多肽的核酸分子的核酸或载体。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系能够产生包含变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含核酸，该核酸包含依赖性细小病毒基因组或足以促进包含变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒产生的依赖性细小病毒基因组的组分。

在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系进一步包含促进依赖性细小病毒颗粒产生和/或分泌的一种或多种非依赖性细小病毒核酸序列。所述序列在本文中被称为辅助序列。在一些实施例中，辅助序列包含来自另一种病毒，例如腺病毒或疱疹病毒的一个或多个基因。在一些实施例中，辅助序列的存在对于依赖性细小病毒颗粒的产生和/或分泌是必需的。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含含有一个或多个辅助序列的载体，例如质粒。

在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码一个或多个依赖性细小病毒基因(例如，Cap基因、Rep基因或完整的依赖性细小病毒基因组)的序列和辅助序列，并且其中第二核酸包含有效载荷。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码一个或多个依赖性细小病毒基因(例如，Cap基因、Rep基因或完整的依赖性细小病毒基因组)的序列和有效载荷，并且其中第二核酸包含辅助序列。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含辅助序列和有效载荷，并且其中第二核酸包含编码一个或多个依赖性细小病毒基因(例如，Cap基因、Rep基因或完整的依赖性细小病毒基因组)的序列。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第一核酸、第二核酸和第三核酸，其中第一核酸包含编码一个或多个依赖性细小病毒基因(例如，Cap基因、Rep基因或完整的依赖性细小病毒基因组)的序列，第二核酸包含辅助序列，并且第三核酸包含有效载荷。

在一些实施例中，第一核酸、第二核酸和任选的第三核酸位于单独的分子中，例如单独的一个或多个载体和基因组DNA。在一些实施例中，第一核酸、第二核酸和任选的第三核酸中的一个、两个或全部被整合(例如，稳定整合)到细胞的基因组中。

本公开的细胞可以通过用本文所述的核酸转染合适的细胞来产生。在一些实施例中，制备包含如本文所提供的变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒的方法或改进制备依赖性细小病毒颗粒的方法包括提供本文所述的细胞。在一些实施例中，提供细胞包括用本文所述的一种或多种核酸转染合适的细胞。

在一些实施例中，包含变体衣壳的病毒颗粒以来自相同生产细胞类型(例如来自HEK293细胞，例如来自HEK293细胞的贴壁培养物)的wt AAV2的生产水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％的水平产生。在一些实施例中，包含变体衣壳的病毒颗粒相比来自相同生产细胞类型(例如来自HEK293细胞，例如来自HEK293细胞的贴壁培养物)的wtAAV2的生产水平以至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％或更高的水平产生。

适合于与本文所述的核酸和载体一起使用的许多类型和种类的细胞是本领域已知的。在一些实施例中，细胞是人类细胞。在一些实施例中，细胞是永生化细胞或来自本领域已知的细胞系的细胞。在一些实施例中，细胞是HEK293细胞。

病毒颗粒和递送有效载荷的方法

本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞(例如受试者中或样本中的细胞)的方法。在一些实施例中，将有效载荷递送至细胞的方法包括使细胞与包含变体衣壳多肽(例如本文所述)且包含有效载荷(例如本文所述)的依赖性细小病毒颗粒接触。在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒是本文所述的依赖性细小病毒颗粒并且包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，细胞是眼部细胞。在一些实施例中，细胞是CNS细胞。在一些实施例中，眼部细胞位于视网膜、黄斑或小梁网中。在一些实施例中，眼部细胞位于视网膜中。在一些实施例中，眼部细胞位于黄斑中。在一些实施例中，眼部细胞位于小梁网中。在一些实施例中，细胞是小脑细胞。在一些实施例中，细胞是中脑细胞。在一些实施例中，本公开部分地涉及将有效载荷递送至CNS细胞和眼部细胞(例如受试者中或样本中的细胞)的方法，该方法包括使细胞与依赖性细小病毒颗粒接触，该依赖性细小病毒颗粒包含变体衣壳多肽(例如，本文所述)且包含有效载荷(例如，本文所述)，其中有效载荷被递送至CNS细胞和眼部细胞两者。在实施例中，相比其他细胞类型(例如肝脏细胞)，有效载荷以更高的效率递送至CNS和/或眼部细胞。

在一些实施例中，眼部细胞位于眼睛的前三分之一处，其包括玻璃体前面的结构。玻璃体前面的结构的实例包括角膜、虹膜、睫状体、晶状体、小梁网和施累姆氏管。因此，在一些实施例中，细胞位于角膜、虹膜、睫状体、晶状体、小梁网、或施累姆氏管、或其任意组合中。

在一些实施例中，眼部细胞位于晶状体的后面，如在前玻璃体膜和其后面的所有光学结构中，如玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经或其任意组合。因此，在一些实施例中，细胞位于前玻璃体膜和其后面的所有光学结构中，如玻璃体、视网膜、脉络膜或视神经或其任意组合。

本公开进一步部分地涉及包含本文所述的衣壳多肽的病毒颗粒。在实施例中，病毒颗粒包含本文所述的衣壳多肽和核酸表达构建体。在实施例中，病毒颗粒的核酸表达构建体包含有效载荷。

在一些实施例中，有效载荷包含转基因。在一些实施例中，转基因是与转基因侧翼的载体序列异源的核酸序列，其编码所关注的多肽、RNA(例如，miRNA或siRNA)或其他产物。转基因的核酸可以以足以促进转基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达的方式与调控组分可操作地连接。

转基因可以是任何多肽或RNA编码序列，并且选定的转基因将取决于预期的用途。在一些实施例中，转基因包含报告序列，其在表达时产生可检测信号。此类报告序列包括但不限于编码比色报告基因(例如，β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶)的DNA序列、细胞分裂报告基因(例如，胸苷激酶)、荧光或发光报告基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶)、抗性传递序列(例如氯霉素乙酰转移酶(CAT))、或膜结合蛋白，包括针对其的高亲和力抗体存在或可以通过常规方式产生，例如包含抗原标签，例如血凝素或Myc。

在一些实施例中，可操作地与驱动其表达的调控元件连接的报告序列提供可通过常规方式检测的信号，该常规方式包括酶、放射照相、比色、荧光或其他光谱测定、荧光活化细胞分选测定和免疫学测定，其包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。

在一些实施例中，转基因编码可用于生物学和医学的产物，如RNA、蛋白质、肽、酶、显性失活突变体。在一些实施例中，RNA包括tRNA、核糖体RNA、dsRNA、催化RNA、小发夹RNA、siRNA、反式剪接RNA和反义RNA。在一些实施例中，RNA抑制或消除所治疗的受试者(例如，人或动物受试者)中靶核酸序列的表达。

在一些实施例中，转基因可用于纠正或改善基因缺陷。在一些实施例中，基因缺陷包括正常基因以低于正常水平表达的缺陷或功能性基因产物不表达的缺陷。在一些实施例中，转基因编码在宿主细胞中表达的治疗性蛋白或多肽。在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒可以包含或递送多个转基因，例如以纠正或改善由多亚基蛋白引起的基因缺陷。在一些实施例中，不同的转基因(例如，各自位于/递送于不同的依赖性细小病毒颗粒中，或位于/递送于单个依赖性细小病毒颗粒中)可用于编码蛋白质的每个亚基，或用于编码不同的肽或蛋白质，例如，当编码蛋白质亚基的DNA的大小较大时，例如对于免疫球蛋白、血小板衍生生长因子或肌营养不良蛋白。在一些实施例中，蛋白质的不同亚基可以由相同转基因编码，例如，编码每个亚基的单个转基因，其中每个亚基的DNA被内部核酶进入位点(IRES)或酶促切割序列(例如，弗林蛋白酶切割位点)分离。在一些实施例中，DNA可以由编码2A肽的序列分离，该2A肽在翻译后事件中自切割。参见，例如，Donnelly等人,J.Gen.Virol.,78(Pt1):13-21(1997年1月)；Furler等人,Gene Ther.,8(11):864-873(2001年6月)；Klump等人,Gene Ther 8(10):811-817(2001年5月)。

在一些实施例中，提供了包含基因组的病毒颗粒，其中基因组包含核酸表达构建体。核酸表达构建体可以包括有效载荷(例如包含异源转基因的有效载荷)和一个或多个调控元件。

在一些实施例中，该颗粒与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将有效载荷递送至眼睛，并且其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、150倍、200倍、250倍或500倍。

在一些实施例中，该颗粒与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将有效载荷递送至眼睛，其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中相对于黄斑组织，转导的增加对于非黄斑视网膜组织是特异性的。在一些实施例中，该颗粒与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将有效载荷递送至眼睛，其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中相对于小梁网组织，转导的增加对于非黄斑视网膜组织是特异性的。

在一些实施例中，本文所述的病毒颗粒(例如，包含本文所述的变体衣壳多肽)表现出增加的视网膜转导，例如，相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，视网膜转导增加至少200倍或至少250倍，例如在静脉内施用后，并且产生的水平是相对于包含SEQID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒的产生水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。在一些实施例中，本文所述的病毒颗粒(例如，包含本文所述的变体衣壳多肽)表现出增加的视网膜转导，该增加的视网膜转导相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，视网膜转导增加至少200倍，例如在静脉内施用后，并且产生的水平是相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒的产生水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。在一些实施例中，本文所述的病毒颗粒(例如，包含本文所述的变体衣壳多肽)表现出增加的视网膜转导，该增加的视网膜转导相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，视网膜转导增加至少250倍，例如在静脉内施用后，并且产生的水平是相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒的产生水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。在一些实施例中，本文所述的病毒颗粒(例如，包含本文所述的变体衣壳多肽)表现出增加的视网膜转导，例如，相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，视网膜转导增加至少200倍、至少250倍或更多，例如在静脉内施用后，并且产生的水平是相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒的产生水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。在一些实施例中，本文所述的病毒颗粒(例如，包含本文所述的变体衣壳多肽)表现出：(1)增加的视网膜转导，例如相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，视网膜转导增加至少200倍、至少250倍或更多，例如在静脉内施用后；(2)增加的CNS(例如中脑和/或小脑)转导，例如相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，CNS(例如，中脑和/或小脑)增加至少20倍、至少50倍、至少100倍或更多，例如在静脉内施用后；(3)并且产生的水平是相对于包含SEQ IDNO:1的衣壳多肽的病毒颗粒的产生水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。

在一些实施例中，本文所述的病毒颗粒(例如，包含本文所述的变体衣壳多肽)表现出：(1)增加的视网膜转导，例如相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，视网膜转导增加至少200倍、至少250倍或更多，例如在静脉内施用后；(2)增加的CNS(例如中脑和/或小脑)转导，例如相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，CNS(例如，中脑和/或小脑)增加至少20倍、至少50倍、至少100倍或更多，例如在静脉内施用后；(3)降低的肝脏转导，例如相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒，肝脏转导降低至少3倍、至少10倍或至少30倍，例如在静脉内施用后；并且(4)产生的水平是相对于包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒的产生水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。

在前述实施例中的任一者中，增加的转导或生物分布如本文实例1中所述测量(例如，关于转导，如通过从总体组织(例如NHP组织)中分离的病毒cDNA的定量来测量，所关注的病毒cDNA归一化为测试品中该病毒颗粒的流行程度，以及关于生物分布，如通过从总体组织(例如NHP组织)中分离的病毒DNA的定量来测量，所关注的病毒DNA归一化为测试品中该病毒颗粒的流行程度)。

在一些实施例中，病毒颗粒的核酸包含调控元件，该调控元件包括启动子。在一些实施例中，启动子是在哺乳动物细胞，例如人类细胞、例如在所关注的人类细胞类型中具有活性的普遍存在的或组成型启动子。

在一些实施例中，细胞类型是眼部细胞，如例如神经视网膜细胞、感光视网膜神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、感光细胞(例如视杆细胞或视锥细胞)、内皮细胞(例如视网膜色素上皮细胞)和内皮样细胞等。普遍存在的启动子的实例包括但不限于：CAG启动子(来自巨细胞病毒早期增强子元件的杂交体、鸡β肌动蛋白启动子，例如鸡β肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子，以及任选的兔β珠蛋白基因的剪接受体)、鸡β肌动蛋白启动子、CBA启动子、CMV启动子、人PGK启动子、泛素启动子、人EF1-α启动子及其片段。在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如在眼部组织或眼睛的细胞中特异性的启动子。眼部组织特异性启动子的实例包括但不限于TBG启动子、hAAT启动子、CK8启动子和SPc5-12启动子、在视杆细胞中有活性的rho启动子、或在视锥细胞中有活性的视蛋白启动子。在一些实施例中，调控元件包括感光细胞特异性调控元件(例如启动子)，如例如视紫红质启动子；视紫红质激酶启动子；β磷酸二酯酶基因启动子；视网膜色素变性基因启动子；光感受器间视黄醇结合蛋白(IRBP)基因增强子；IRBP基因启动子、视蛋白基因启动子、视黄裂素基因启动子、CRX同源域蛋白基因启动子、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α转导活性多肽1(GNAT1)基因启动子、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)基因启动子、人锥体抑制蛋白(hCAR)启动子以及PR2.1、PR1.7、PR1.5和PR1.1启动子。在一些实施例中，调控元件包括视网膜色素上皮(RPE)细胞特异性调控元件(例如，RPE特异性启动子)，例如在RPE细胞中赋予可操作地连接的基因选择性表达的调控元件，如例如，RPE65基因启动子、细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)基因启动子、色素上皮衍生因子(PEDF又名丝氨酸蛋白酶抑制剂F1)基因启动子和卵黄状黄斑营养不良(VMD2)启动子。在一些实施例中，调控元件包括对神经胶质细胞特异性的启动子，例如在视网膜神经胶质细胞中赋予可操作地连接的有效载荷选择性表达的调控元件，如例如神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子。在一些情况下，调控元件包括对双极细胞特异性的启动子(例如双极特异性启动子)，例如在双极细胞中赋予可操作地连接的有效载荷选择性表达的调控元件，如例如GRM6启动子。在实施例中，启动子序列的长度在100与1000个核苷酸之间。在实施例中，启动子序列的长度为约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸。如前一句中所使用的，“约”是指所列举的长度的50个核苷酸以内的值。本领域技术人员可以容易地选择合适的调控元件，例如启动子，如但不限于本文所述的那些。

在一些实施例中，核酸表达构建体包含内含子。内含子可以位于启动子与异源转基因之间。在一些方面，内含子位于表达构建体上异源转基因的5’处，例如紧邻异源转基因的5’处或异源转基因的5’处的100个或更少的核苷酸处。在一些方面，内含子是衍生自人b-珠蛋白和Ig重链的嵌合内含子(也称为b-珠蛋白剪接供体/免疫球蛋白重链剪接受体内含子，或b-珠蛋白/IgG嵌合内含子；Reed,R.,等人Genes and Development,1989，通过引用整体并入本文)。在其他方面，内含子是VH4内含子或SV40内含子。

如本文所提供的，在一些实施例中，提供了包含有效载荷的病毒颗粒，其中该有效载荷包含含有异源转基因的核酸。在一些实施例中，异源转基因编码RNA干扰剂，例如siRNA、shRNA或其他干扰核酸。

在一些实施例中，有效载荷包括编码治疗性多肽的异源转基因。在一些方面，异源转基因是人类基因或其片段。在一些方面，治疗性多肽是人类蛋白。在一些实施例中，病毒颗粒的异源转基因编码可用于治疗疾病的分子，并且将病毒颗粒施用至有此需要的患者以治疗所述疾病。根据本公开的疾病(和异源转基因或由所述异源转基因编码的分子)的实例包括：MPSI(α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA))；MPS II-亨特综合征(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS))；蜡样脂褐质沉积症(即，神经元蜡样脂褐质沉积症)-贝敦氏症(CLN1、CLN2、CLN10、CLN13、CLN5、CLN11、CLN4、CNL14、CLN3、CLN6、CLN7、CLN8、CLN12)；MPS Illa-Sanfilippo A型综合征(硫酸肝素硫酸酯酶(也称为N-磺基葡萄糖胺磺基氢化酶(SGSH))；MPS IIIB-Sanfilippo b型综合征(N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU))；MPS VI-Maroteaux-Lamy综合征(芳基硫酸酯酶B)；MPS IV A-Morquio综合征A型(GALNS)；MPS IV B-Morquio综合征B型(GLB1)；成骨不全症I型、II型、III型或IV型(COL1Al和/或COL1A2)；遗传性血管性水肿(SERPING1、C1NH)；成骨不全症V型(IFITM5)；成骨不全症VI型(SERPINF1)；成骨不全症VII型(CRTAP)；成骨不全症VIII型(LEPRE1和/或P3H1)；成骨不全症IX型(PPIB)；戈谢病I型、II型和III型(葡糖脑苷脂酶；GBAl)；帕金森病(葡糖脑苷脂酶；GBAl和/或多巴胺脱羧酶)；Pompe(酸性麦芽糖酶；GAA；hGAA)；异染性脑白质营养不良(芳基硫酸酯酶A)；MPS VII-Sly综合征(β-葡萄糖醛酸酶)；MPS VIII(葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶)；MPS IX(透明质酸酶)；枫糖尿病(BCKDHA、BCKDHB、和/或DBT)；Niemann-Pick病(鞘磷脂酶)；帕金森病(抗-α突触核蛋白RNAi)；阿尔茨海默病(抗突变体APP RNAi)；没有鞘磷脂酶缺乏的Niemann-Pick病(编码胆固醇代谢酶的NPC1或NPC基因)；泰伊-萨克斯二氏病(β-己糖胺酶的α亚基)；Sandhoff病(β-己糖胺酶的α和β亚基)；Fabry病(α-半乳糖苷酶缺乏)；岩藻糖苷贮积症(岩藻糖苷酶(FUCAl))；α-甘露糖苷贮积症(α-甘露糖苷酶)；β-甘露糖苷贮积症(β-甘露糖苷酶)；Wolman病(胆固醇酯氢化酶)；Dravet综合征(SCN1A、SCN1B、SCN2A、GABRG2)；帕金森病(神经秩蛋白)；帕金森病(神经胶质衍生生长因子(GDGF))；帕金森病(酪氨酸羟化酶)；帕金森病(谷氨酸脱羧酶；FGF-2；BDGF)；脊髓性肌肉萎缩症(SMN、包括SMN1或SMN2)；弗里德希氏共济失调(共济蛋白)；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)(SOD1抑制剂，例如，抗-SOD1 RNAi)；糖原贮积病la(葡萄糖-6-磷酸酶)；XLMTM(MTMl)；Crigler Najjar(UGTlAl)；CPVT(CASQ2)；脊髓小脑性共济失调(ATXN2；ATXN3或其他ATXN基因；抗-突变体Machado-Joseph病/SCA3等位基因RNAi)；Rett综合征(MECP2或其片段)；全色盲(CNGB3、CNGA3、GNAT2、PDE6C)；Choroidermia(CDM)；Danon病(LAMP2)；囊性纤维化(CFTR或其片段)；杜氏肌营养不良(迷你-/微小-杜氏肌营养不良蛋白基因)；SARS-Cov-2感染(抗-SARS-Cov-2 RNAi、SARS-Cov-2基因组片段或S蛋白(包括变体))；肢带型肌营养不良症2C型-γ-肌聚糖病(人-α-肌糖)；晚期心力衰竭(SERCA2a)；类风湿性关节炎(TNFR:Fc融合；抗-TNF抗体或其片段)；莱伯氏先天性黑蒙症(GAA)；X-连锁肾上腺脑白质营养不良(ABCD1)；肢带型肌营养不良症2C型-γ-肌聚糖病(γ-肌糖)；安吉尔曼综合征(UBE3A)；视网膜色素变性症(hMERTK)；年龄相关黄斑退化(sFLT01)；Phelan-McDermid综合征(SHANK3；22q13.3替换)；贝克肌萎缩症和散发性包涵体肌炎(羟基脲卵泡抑素344)；帕金森病(GDNF)；异染性脑白质营养不良-MLD(cuARSA)；丙型肝炎(抗-HCV RNAi)；肢带型肌营养不良症2D型(hSGCA)；人类免疫缺陷病毒感染；(PG9DP)；急性间歇性卟啉症(PBGD)；莱伯氏遗传性视神经病变(PIND4v2)；α-1抗胰蛋白酶缺乏症(αIAT)；X-连锁视网膜劈裂症(RS1)；无脉络膜症(hCHM)；巨轴突神经病变(GAN)；乙型血友病(因子IX)；纯合子FH(hLDLR)；Dysferlin肌病(DYSF)；全色盲(CNGA3或CNGB3)；进行性核上性麻痹(MAPT；抗-Tau；抗-MAPT RNAi)；鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OTC)；甲型血友病(因子VIII)；年龄相关黄斑退化(AMD)、包括湿性AMD(抗VEGF抗体或RNAi)；X-连锁视网膜色素变性症(RPGR)；肌强直性营养不良1型(DMPK；抗-DMPK RNAi、包括抗-CTG三核苷酸重复RNAi)；肌强直性营养不良2型(CNBP)；面肩胛肱型肌营养不良症(D4Z4 DNA)；眼咽肌营养不良症(PABPN1；突变PABPN1抑制剂(例如，RNAi))；黏多糖贮积症VI型(hARSB)；莱伯遗传性视神经病变(ND4)；X-连锁肌管型肌病(MTMl)；Crigler-Najjar综合征(UGTlAl)；视网膜色素变性症(hPDE6B)；黏多糖贮积症3B型(hNAGLU)；杜氏肌营养不良(GALGT2)；阿尔茨海默病(NGF；ApoE4；ApoE2；ApoE3；抗-ApoE RNAi)；家族性脂蛋白脂酶缺乏症(LPL)；α-1抗胰蛋白酶缺乏症(hAAT)；莱伯氏先天性黑蒙症2(hRPE65v2)；贝敦氏症；婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症(CLN2)；亨廷顿氏病(HTT；抗-HTT RNAi)；脆性X染色体综合征(FMR1)；莱伯氏遗传性视神经病变(PlND4v2)；芳香氨基酸脱羧酶缺乏症(hAADC)；视网膜色素变性症(hMERKTK)；和视网膜色素变性症(RLBP1)。

在一些方面，异源转基因编码抗体或其片段(例如抗体轻链、抗体重链、Fab或scFv)。由异源转基因编码的抗体或其片段的实例包括但不限于：抗Ab抗体(例如索拉珠单抗、GSK933776和仑卡奈单抗)、抗sortilin(例如AL-001)、抗Tau(例如ABBV-8E12、UCB-0107和NI-105)、抗SEMA4D(例如VX15/2503)、抗α突触核蛋白(例如普尼珠单抗、NI-202和MED-1341)、抗SOD1(例如NI-204)、抗CGRP受体(例如艾普奈珠单抗、瑞玛奈珠单抗或伽奈珠单抗(galcanezumab))、抗VEGF(例如塞瓦珠单抗、雷珠单抗、贝伐珠单抗和布洛赛珠单抗(brolucizumab))、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALKl(例如，阿伐苏单抗)、抗C5(例如，特度鲁单抗、瑞武丽珠单抗和依库丽单抗)、抗CD105(例如，卡妥昔单抗)、抗CClQ(例如，ANX-007)、抗TNFa(例如，阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如，依来努单抗)、抗TTR(例如，NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如，帕姆雷芦单抗(pamrevlumab))、抗IL6R(例如，萨特利珠单抗、托珠单抗和萨利霉素)、抗IL6(例如西妥昔单抗、克拉扎珠单抗、西鲁单抗、奥洛珠单抗和吉瑞利单抗(gerilimzumab))、抗IL4R(例如，度普利尤单抗)、抗IL17A(例如，依奇珠单抗和苏金单抗)、抗IL5R(例如瑞利珠单抗)、抗IL-5(例如，贝那利珠单抗和美泊利珠单抗)、抗IL13(例如，曲罗芦单抗)、抗IL12/IL23(例如，优特克单抗)、抗CD 19(例如，伊奈利珠单抗)、抗IL31RA(例如奈莫利珠单抗)、抗ITGF7 mAb(例如依曲利组单抗)、抗SOSTmAb(例如罗莫单抗)、抗IgE(例如奥马珠单抗)、抗TSLP(例如奈莫利珠单抗)、抗pKal mAb(例如拉那鲁单抗)、抗ITGA4(例如，那他珠单抗)、抗ITGA4B7(例如，维多珠单抗)、抗BLyS(例如，贝利木单抗)、抗PD-1(例如，纳武单抗和帕博利珠单抗)、抗RANKL(例如，地诺单抗)、抗PCSK9(例如，阿利库单抗和依洛尤单抗)、抗ANGPTL3(例如，依维苏单抗*)、抗OxPL(例如，E06)、抗fD(例如，兰帕利珠单抗)或抗MMP9(例如，安地卡昔单抗)，任选地其中重链(Fab和Fc区)和轻链通过自切割弗林蛋白酶(F)/F2A或弗林蛋白酶(F)/T2A、IRES位点或柔性接头分离，例如，确保重链和轻链多肽的等量表达。

在实施例中，有效载荷包含编码与眼睛疾患相关的基因产物的核酸或其片段。与眼睛的疾患有关的示例性基因产物包括：例如，ADP-核糖基化因子样6(ARL6)；BBSome相互作用蛋白1(BBIP1)；BBSome蛋白1(BBS1)；BBSome蛋白2(BBS2)；BBSome蛋白4(BBS4)；BBSome蛋白5(BBS5)；BBSome蛋白7(BBS7)；BBSome蛋白9(BBS9)；BBSome蛋白10(BBS10)；BBSome蛋白12(BBS12)；中心体蛋白290kDa(CEP290)；细胞纤毛内转运蛋白172(IFT172)；细胞纤毛内转运蛋白27(IFT27)；肌醇多磷酸-5-磷酸酶E(INPP5E)；内向整流钾通道亚家族J成员13(KCNJ13)；亮氨酸拉链转录因子样1(LZTFL1)；McKusick-Kaufman综合征蛋白(MKKS)；Meckel综合征1型蛋白(MKS1)；肾结核3蛋白(NPHP1)；行气血定义的结肠癌抗原8(SDCCAG8)；含三方基序的蛋白32(TRIM32)；三角形四肽重复结构域8(TTC8)；贝敦氏症蛋白(CLN3)；细胞色素P450 4V2(CYP4V2)；Rab护卫蛋白1(CHM)；含PR(正调节因子)结构域13的蛋白(PRDM13)；RPE-视网膜G蛋白偶联受体(RGR)；TEA结构域家族成员1(TEAD1)；芳烃相互作用受体蛋白样1(AIPL1)；视锥-视杆otx样感光器同源框转录因子(CRX)；鸟苷酸环化酶活化蛋白1A(GUCA1A)；视网膜特异性鸟苷酸环化酶(GUCY2D)；磷脂酰肌醇转移膜相关家族成员3(PITPNM3)；prominin 1(PROM1)；外周蛋白(PRPH)；外周蛋白2(PRPH2)；调节突触膜胞吐蛋白1(RIMS1)；脑信号蛋白4A(SEMA4A)；线虫(C.elegans)unc119蛋白的人类同源物(UNC119)；ATP结合盒转运体—视网膜(ABCA4)；ADAM金属肽酶结构域9(ADAM9)；活化转录因子6(ATF6)；染色体21开放阅读框2(C21orf2)；染色体8开放阅读框37(C8orf37)；钙通道；电压依赖性；α2/δ亚基4(CACNA2D4)；钙粘蛋白相关家族成员1(原钙粘附蛋白21)(CDHR1)；神经酰胺激酶样蛋白(CERKL)；视锥感光器cGMP门控阳离子通道α亚基(CNGA3)；视锥环核苷酸门控阳离子通道β3亚基(CNGB3)；细胞周期蛋白M4(CNNM4)；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)；α转导活性多肽2(GNAT2)；钾通道亚家族V成员2(KCNV2)；磷酸二酯酶6C(PDE6C)；磷酸二酯酶6H(PDE6H)；中心体1中心粒蛋白B的蛋白质组(POC1B)；RAS致癌基因家族的RAB28成员(RAB28)；视网膜和前神经褶同源框2转录因子(RAX2)；11-顺式视黄醇脱氢酶5(RDH5)；RPGTP酶调节因子相互作用蛋白1(RPGRIP1)；微管蛋白酪氨酸连接酶样家族成员5(TTLL5)；L型电压门控钙通道α-1亚基(CACNA1F)；视网膜色素变性症GTP酶调节因子(RPGR)；视杆转导蛋白α亚基(GNAT1)；视杆cGMP磷酸二酯酶β亚基(PDE6B)；视紫红质(RHO)；钙结合蛋白4(CABP4)；G蛋白偶联受体179(GPR179)；视紫红质激酶(GRK1)；代谢型谷氨酸受体6(GRM6)；富含亮氨酸的重复免疫球蛋白样跨膜结构域蛋白3(LRIT3)；抑制蛋白(s-抗原)(SAG)；溶质载体家族24(SLC24A1)；瞬时受体电位阳离子通道、亚家族M、成员1(TRPM1)；夜盲蛋白(NYX)；绿锥视蛋白(OPN1LW)；红锥视蛋白(OPN1MW)；蓝锥视蛋白(OPN1SW)；共济蛋白(FXN)；肌苷单磷酸脱氢酶1(IMPDH1)；orthodenticle同源框2蛋白(OTX2)；crumbs同源物1(CRB1)；含死亡结构域的蛋白1(DTHD1)；生长分化因子6(GDF6)；细胞纤毛内转运蛋白140衣藻同源物蛋白(IFT140)；含有IQ基序的B蛋白(IQCB1)；lebercilin(LCA5)；卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)；烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)；RD3蛋白(RD3)；视黄醇脱氢酶12(RDH12)；视网膜色素上皮特异性65kD蛋白(RPE65)；精子发生相关蛋白7(SPATA7)；tubby样蛋白1(TULP1)；线粒体基因(KSS、LHON、MT-ATP6、MT-TH、MT-TL1、MT-TP、MT-TS2、线粒体编码的NADH脱氢酶[MT-ND])；bestrophin 1(BEST1)；C1q和肿瘤坏死相关蛋白5胶原(C1QTNF5)；含EGF的原纤蛋白样细胞外基质蛋白1(EFEMP1)；很长的脂肪酸蛋白的延长(ELOVL4)；视网膜成束蛋白同源物2、肌动蛋白捆绑蛋白(FSCN2)；鸟苷酸环化酶活化蛋白1B(GUCAB)；hemicentin 1(HMCN1)；感光基质蛋白多糖1(IMPG1)；视网膜色素变性症1样蛋白1(RP1L1)；金属蛋白酶-3的组织抑制剂(TIMP3)；补体因子H(CFH)；补体因子D(CFD)；补体成分2(C2)；补体成分3(C3)；补体因子B(CFB)；DNA-损伤调节自噬调节剂2(DRAM2)；硫酸软骨素蛋白多糖2(VCAN)；线粒体融合蛋白2(MFN2)；核受体亚家族2组F成员1(NR2F1)；视神经萎缩1(OPA1)；跨膜蛋白126A(TMEM126A)；线粒体内膜转位酶8同源物A(TIMM8A)；碳酸酐酶IV(CA4)；己糖激酶1(HK1)；kelch样7蛋白(KLHL7)；核受体亚家族2组E3(NR2E3)；神经视网膜亮氨酸拉链(NRL)；嗅觉受体家族2亚家族W成员3(OR2W3)；pre-mRNA加工因子3(PRPF3)；pre-mRNA加工因子4(PRPF4)；pre-mRNA加工因子6(PRPF6)；pre-mRNA加工因子8(PRPF8)；pre-mRNA加工因子31(PRPF31)；视网膜外节膜蛋白1(ROM1)；视网膜色素变性症蛋白1(RP1)；PIM-激酶相关蛋白1(RP9)；核内小核糖核蛋白200kDa(SNRNP200)；分泌磷酸蛋白2(SPP2)；拓扑异构酶I结合富含精氨酸/丝氨酸蛋白(TOPORS)；ADP-核糖基化因子样2结合蛋白(ARL2BP)；染色体2开放阅读框71(C2orf71)；肝素钾-1(CLRN1)；视杆cGMP门控通道α亚基(CNGA1)；视杆cGMP门控通道β亚基(CNGB1)；细胞色素P450 4V2(CYP4V2)；脱氢多酚二磷酸合成酶(DHDDS)；DEAH box多肽38(DHX38)；ER膜蛋白复合物亚基1(EMC1)；eyes shut/spacemaker同源物(EYS)；具有序列相似性161成员A的家族(FAM161A)；G蛋白偶联受体125(GPR125)；类肝素-α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT)；NAD(+)-特异性异柠檬酸脱氢酶3β(IDH3B)；感光基质蛋白多糖2(IMPG2)；KIAA1549蛋白(KIAA1549)；kizuna中心体蛋白(KIZ)；雄性生殖细胞相关激酶(MAK)；c-mer原癌基因受体酪氨酸激酶(MERTK)；甲羟戊酸激酶(MVK)；NIMA(在有丝分裂基因A中没有)相关激酶2(NEK2)；神经元分化蛋白1(NEUROD1)；cGMP磷酸二酯酶α亚基(PDE6A)；磷酸二酯酶6G cGMP-特异性视杆γ(PDE6G)；进行性视杆-视锥变性蛋白(PRCD)；视黄醇结合蛋白3(RBP3)；视黄醛结合蛋白1(RLBP1)；溶质载体家族7成员14(SLC7A14)；usherin(USH2A)；锌指蛋白408(ZNF408)；锌指蛋白513(ZNF513)；口面指综合征蛋白1(OFD1)；视网膜色素变性症2(RP2)；retinoschisin(RS1)；含自水解酶结构域的蛋白12(ABHD12)；钙粘蛋白样基因23(CDH23)；中心体蛋白250kDa(CEP250)；钙和整合蛋白结合家族成员2(CIB2)；whirlin(DFNB31)；单基因听原性癫痫易感性1同源物(GPR98)；组氨酰基-tRNA合成酶(HARS)；肌球蛋白VIIA(MYO7A)；原钙粘附蛋白15(PCDH15)；harmonin(USH1C)；含有小鼠支架蛋白的锚蛋白重复序列的人类同源物和SAM结构域(USH1G)；杜氏肌营养不良蛋白(DMD)；norrin(NDP)；磷酸甘油酸激酶(PGK1)；钙蛋白酶5(CAPN5)；卷曲-4Wnt受体同源物(FZD4)；整合膜蛋白2B(ITM2B)；低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)；微小RNA204(MIR204)；视网膜母细胞瘤蛋白1(RB1)；跨膜四蛋白12(TSPAN12)；染色体12开放阅读框65(C12orf65)；钙粘蛋白3(CDH3)；膜型卷曲相关蛋白(MFRP)；鸟氨酸转氨酶(OAT)；磷脂酶A2组V(PLA2G5)；视黄醇结合蛋白4(RBP4)；G蛋白信号9的调节因子(RGS9)；G蛋白信号9结合蛋白的调节因子(RGS9BP)；ARMS2；切除修复交叉互补鼠类修复缺陷互补组6蛋白(ERCC6)；腓骨蛋白5(FBLN5)；HtrA丝氨酸肽酶1(HTRA1)；toll样受体3(TLR3)；和toll样受体4(TLR4)、视蛋白；视紫红质；通道视紫红质；卤代视紫红质等。

在一些实施例中，病毒颗粒包含编码基因组编辑系统的异源转基因。实例包括CRISPR基因组编辑系统(例如，CRISPR基因组编辑系统的一种或多种组分，如例如引导RNA分子和/或RNA引导的核酸酶，如Cas酶，如Cas9、Cpf1等)、锌指核酸酶基因组编辑系统、TALEN基因组编辑系统或大范围核酸酶基因组编辑系统。在实施例中，基因组编辑系统靶向哺乳动物(例如人类)，基因组靶序列。在实施例中，病毒颗粒包含编码可靶向转录调控因子的异源转基因。实例包括基于CRISPR的转录调控因子(例如，基于CRISPR的转录调控因子中的一种或多种组分，例如引导RNA分子和/或酶失活的RNA引导的核酸酶/转录因子(“TF”)融合蛋白，如dCas9-TF融合、dCpf1-TF融合等)、锌指转录因子融合蛋白、TALEN转录调控因子或大范围核酸酶转录调控因子。

在一些实施例中，治疗性分子或体系的组分由多于一种独特的病毒颗粒(例如，包括多于一种独特的病毒颗粒的群体)递送。在其他实施例中，治疗分子或治疗分子或体系的组分由单个独特的病毒颗粒(例如，包括单个独特的病毒颗粒的群体)递送。

转基因也可以编码任何生物活性产物或其他产物，例如研究所需的产物。本领域技术人员可以容易地选择合适的转基因，如但不限于本文所述的那些。

由转基因编码的蛋白质的其他实例包括但不限于：集落刺激因子(CSF)；血液因子，如β-珠蛋白、血红蛋白、组织纤溶酶原活化剂和凝血因子；白细胞介素；可溶性受体，如可溶性TNF-α受体、可溶性VEGF受体、可溶性白细胞介素受体(例如，可溶性IL-1受体和可溶性II型IL-1受体)、或可溶性受体的配体结合片段；生长因子，如角质细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)或成纤维细胞生长因子(FGF，如碱性FGF和酸性FGF)；酶；趋化因子；酶活化剂，如组织纤溶酶原活化剂；血管生成剂，如血管内皮生长因子、神经胶质瘤衍生的生长因子、血管生成素或血管生成素-2；抗血管生成剂，如可溶性VEGF受体；蛋白质疫苗；神经活性肽，如神经生长因子(NGF)或催产素；溶栓剂；组织因子；巨噬细胞活化因子；金属蛋白酶的组织抑制剂；或IL-1受体拮抗剂。

因此，本文提供了包含衣壳多肽的病毒颗粒，该衣壳多肽包含：(a)SEQ ID NO:2的VP1、VP2或VP3序列，(b)包含VAR-1的突变集并且与SEQ ID NO:1具有大于80％(例如，大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)同一性的VP1、VP2或VP3序列，或(c)包含VAR-1的突变集并相对于SEQ ID NO:1具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的突变，但少于40、39、38、37、36、35、34、33、32或31个另外的突变的VP1、VP2或VP3序列。在实施例中，衣壳多肽包含SEQ ID NO:2的VP1、VP2和VP3序列。在实施例中，病毒颗粒包含核酸分子，该核酸分子包含异源转基因，例如编码针对眼部疾患的产物的异源转基因。在实施例中，异源转基因编码抗VEGF抗体或抗体片段、抗VEGF RNA抑制分子、RPE65(例如，人RPE65)蛋白、ABCA4(例如，人ABCA4)蛋白或其片段、RLBP1(例如，人RLBP1)蛋白或其片段、PDE6B(例如，人PDE6B)蛋白或其片段、RPGR(例如，人RPGR)蛋白或其片段、或ACHM3A或ACHM3B(例如，人ACHM3A或人ACHM3B)蛋白或其片段。在实施例中，病毒颗粒的核酸分子进一步包含一个或多个调控元件，例如包含启动子，例如可操作地连接至异源转基因并在所关注的组织中调节来自异源转基因的表达的启动子。在实施例中，病毒颗粒的核酸分子进一步包含以下中的一者或多者：(a)依赖性细小病毒ITR、(b)内含子、(c)增强子或阻遏子序列、(d)填充序列和(e)多聚A序列。

因此，本文提供了包含衣壳多肽的病毒颗粒，该衣壳多肽包含：(a)SEQ ID NO:3的VP1、VP2或VP3序列，(b)包含VAR-2的突变集并且与SEQ ID NO:1具有大于80％(例如，大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)同一性的VP1、VP2或VP3序列，或(c)包含VAR-2的突变集并相对于SEQ ID NO:1具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的突变，但少于40、39、38、37、36、35、34、33、32或31个另外的突变的VP1、VP2或VP3序列。在实施例中，衣壳多肽包含SEQ ID NO:3的VP1、VP2和VP3序列。在实施例中，病毒颗粒包含核酸分子，该核酸分子包含异源转基因，例如编码针对眼部疾患的产物的异源转基因。在实施例中，异源转基因编码抗VEGF抗体或抗体片段、抗VEGF RNA抑制分子、RPE65(例如，人RPE65)蛋白、ABCA4(例如，人ABCA4)蛋白或其片段、RLBP1(例如，人RLBP1)蛋白或其片段、PDE6B(例如，人PDE6B)蛋白或其片段、RPGR(例如，人RPGR)蛋白或其片段、或ACHM3A或ACHM3B(例如，人ACHM3A或人ACHM3B)蛋白或其片段。在实施例中，病毒颗粒的核酸分子进一步包含一个或多个调控元件，例如包含启动子，例如可操作地连接至异源转基因并在所关注的组织中调节来自异源转基因的表达的启动子。在实施例中，病毒颗粒的核酸分子进一步包含以下中的一者或多者：(a)依赖性细小病毒ITR、(b)内含子、(c)增强子或阻遏子序列、(d)填充序列和(e)多聚A序列。

因此，本文提供了包含衣壳多肽的病毒颗粒，该衣壳多肽包含：(a)SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列，(b)包含VAR-3的突变集并且与SEQ ID NO:1具有大于80％(例如，大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)同一性的VP1、VP2或VP3序列，或(c)包含VAR-3的突变集并相对于SEQ ID NO:1具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的突变，但少于40、39、38、37、36、35、34、33、32或31个另外的突变的VP1、VP2或VP3序列。在实施例中，衣壳多肽包含SEQ ID NO:4的VP1、VP2和VP3序列。在实施例中，病毒颗粒包含核酸分子，该核酸分子包含异源转基因，例如编码针对眼部疾患的产物的异源转基因。在实施例中，异源转基因编码抗VEGF抗体或抗体片段、抗VEGF RNA抑制分子、RPE65(例如，人RPE65)蛋白、ABCA4(例如，人ABCA4)蛋白或其片段、RLBP1(例如，人RLBP1)蛋白或其片段、PDE6B(例如，人PDE6B)蛋白或其片段、RPGR(例如，人RPGR)蛋白或其片段、或ACHM3A或ACHM3B(例如，人ACHM3A或人ACHM3B)蛋白或其片段。在实施例中，病毒颗粒的核酸分子进一步包含一个或多个调控元件，例如包含启动子，例如可操作地连接至异源转基因并在所关注的组织中调节来自异源转基因的表达的启动子。在实施例中，病毒颗粒的核酸分子进一步包含以下中的一者或多者：(a)依赖性细小病毒ITR、(b)内含子、(c)增强子或阻遏子序列、(d)填充序列和(e)多聚A序列。

本公开进一步部分地涉及一种将有效载荷递送至受试者(例如动物或人类受试者)的方法。在一些实施例中，向受试者递送有效载荷的方法包括向受试者施用包含含有有效载荷的变体多肽(例如本文所述)的依赖性细小病毒颗粒，例如以足以递送有效载荷的量和时间。在一些实施例中，依赖性细小病毒颗粒是本文所述的依赖性细小病毒颗粒并且包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，颗粒将有效载荷递送至眼睛。在一些实施例中，与没有变体衣壳多肽的颗粒相比或与野生型衣壳多肽相比，向眼睛的递送增加。

治疗方法

本公开部分地涉及一种治疗受试者(例如动物或人类受试者)的疾病或病症的方法。如本文所使用的，术语“治疗疾病或病症”是指治疗明显的疾病或病症，例如，当受试者已经患有该疾病或病症的一种或多种症状时，或者是指治疗预先显现的疾病或病症，例如，当受试者被鉴定为患有疾病或病症但尚未表现出该疾病或病症的一种或多种症状时。可以通过例如基因测试来鉴定预先显现的病症。在一些实施例中，治疗受试者的疾病或病症的方法包括向受试者施用包含本文所述的变体多肽例如包含本文所述的有效载荷的依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，以有效治疗疾病或病症的量和/或时间施用包含变体多肽且包含本文所述的有效载荷的依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，治疗受试者的CNS和/或眼部疾病或病症的方法包括向受试者施用包含本文所述的变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒例如包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，以有效治疗CNS和/或眼部疾病或病症的量和/或时间施用包含变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，CNS和/或眼部疾病或病症是神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)。在一些实施例中，以有效治疗CNS和/或眼部疾病或病症的量和/或时间施用包含变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒包含本文所述的有效载荷，任选地其中该疾病或病症是神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)。在一些实施例中，治疗受试者的神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)的方法包括向受试者施用包含本文所述的变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒例如包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，治疗受试者的CNS疾病或病症的方法包括向受试者施用包含本文所述的变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒例如包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，以有效治疗CNS疾病或病症的量和/或时间施用包含变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，治疗受试者的眼部疾病或病症的方法包括向受试者施用包含本文所述的变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒例如包含本文所述的有效载荷。在一些实施例中，以有效治疗眼部疾病或病症的量和/或时间施用包含变体多肽的依赖性细小病毒颗粒，该依赖性细小病毒颗粒包含本文所述的有效载荷。

在一些实施例中，有效载荷是治疗产品。在一些实施例中，有效载荷是核酸，例如编码外源多肽的核酸。

包含本文所述的变体多肽或通过本文所述的方法产生的依赖性细小病毒颗粒可用于表达一种或多种治疗性蛋白以治疗各种疾病或疾患。在一些实施例中，疾病或疾患是癌症，例如，如上皮癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤等癌症；或自身免疫性疾病，例如多发性硬化症。癌的非限制性实例包括：食道癌；支气管癌；结肠癌；结直肠癌；胃癌；肝细胞癌；基底细胞癌、鳞状细胞癌(各种组织)；膀胱癌，包括移行细胞癌；肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌；肾上腺皮质癌；汗腺癌；皮脂腺癌；甲状腺癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；乳头状癌；乳头状腺癌；囊腺癌；髓样癌；肾细胞癌；子宫癌；睾丸癌；成骨癌；导管原位癌或胆管癌；绒毛膜癌；精原细胞瘤；胚胎癌；威尔姆斯肿瘤；宫颈癌；上皮癌；和鼻咽癌。肉瘤的非限制性实例包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。实体瘤的非限制性实例包括：室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、脑血管瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。白血病的非限制性实例包括：慢性骨髓增殖综合征；T细胞CLL幼淋巴细胞白血病、急性髓性白血病；慢性淋巴细胞白血病，包括B细胞CLL、毛细胞白血病；和急性淋巴细胞白血病。淋巴瘤的实例包括但不限于：B细胞淋巴瘤，如伯基特氏淋巴瘤；和霍奇金淋巴瘤。

在一些实施例中，疾病或疾患是遗传性疾患。在一些实施例中，遗传性疾患是镰刀型细胞贫血症、糖原贮积病(GSD，例如I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV型GSD)、囊性纤维化、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症1、泰伊-萨克斯二氏病、苯丙酮尿症、粘多糖症、半乳糖血症、肌营养不良症(例如杜氏肌营养不良症)、血友病(如血友病A(经典血友病)或血友病B(圣诞节病))、威尔逊氏病、法布里病、戈谢病遗传性血管性水肿(HAE)和α1抗胰蛋白酶缺乏症。其他疾病或疾患的实例在上文“递送有效载荷的方法”部分中提供。

包含本文所述的变体多肽或通过本文所述的方法产生的依赖性细小病毒颗粒可用于表达一种或多种治疗性蛋白以治疗各种疾病或疾患。在一些实施例中，疾病或疾患是眼睛的疾病或疾患，例如色素性视网膜炎；黄斑变性(例如湿性年龄相关性黄斑变性)、视神经炎；莱伯先天性黑蒙；莱伯遗传性视神经病变；全色盲；X连锁视网膜劈裂症；视神经炎；无脉络膜症；视神经萎缩；视锥营养不良；视网膜病变；视网膜母细胞瘤；青光眼；巴尔代-比德尔综合征；亚瑟综合征；无虹膜；弗里德赖希共济失调；卵黄样黄斑营养不良；视网膜母细胞瘤；斯塔加特病；腓骨肌萎缩症；富氏营养不良症；丙酸血症；或色盲；角膜营养不良症；圆锥角膜病；夜盲症；干眼症；巴尔代-比德尔综合征；巴顿氏病；Bietti晶体营养不良症；脉络膜视网膜萎缩；脉络膜视网膜变性；视锥细胞或视锥杆细胞营养不良(常染色体显性、常染色体隐性和X连锁)、先天性静止性夜盲症(常染色体显性、常染色体隐性和X连锁)；色觉障碍，包括全色盲(包括ACHM2、ACHM3、ACHM4和ACHM5)、红色盲、绿色盲和蓝色盲；弗里德赖希共济失调；莱伯氏先天性黑蒙(常染色体显性和常染色体隐性)，包括但不限于LCA1、LCA2、LCA3、LCA4、LCA6、LCA7、LCA8、LCA12和LCA15；莱伯氏遗传性视神经病变；黄斑营养不良(常染色体显性和常染色体隐性)，包括但不限于急性黄斑变性、最佳卵黄样黄斑营养不良、模式营养不良、北卡罗来纳州黄斑营养不良、遗传性玻璃膜疣、索斯比眼底营养不良、家族性显性玻璃膜疣(malattia levantanese)和早产儿的遗传性视网膜病变；眼视网膜发育疾病；眼白化病；视神经萎缩(常染色体显性、常染色体隐性和X连锁)；视网膜色素变性症(常染色体显性、常染色体隐性、X连锁和线粒体遗传性状)，其实例包括RP1、RP2、RP3、RP10、RP20、RP38、RP40和RP43；X连锁视网膜劈裂症；斯塔加特病；和亚瑟综合征，包括但不限于USH1B、USH1C、USH1D、USH1F、USH1G、USH2A、USH2C、USH2D和USH3。复杂遗传性疾病的实例包括但不限于：青光眼(开角型、闭角型、低眼压、正常眼压、先天性、新生血管性、色素性、假性剥脱性)；年龄相关性和其他形式的黄斑变性，渗出性和非渗出性形式两者(常染色体显性和常染色体隐性)，如急性黄斑变性、卵黄样黄斑变性；早产儿视网膜病变；和沃格特小柳原田(VKH)综合征。获得性疾病的实例包括但不限于：急性黄斑神经视网膜病变；前部缺血性视神经病变和后部缺血性视神经病变；白塞氏病；视网膜分支静脉阻塞；脉络膜新生血管形成；糖尿病视网膜病变，包括增殖性糖尿病视网膜病变和相关并发症；糖尿病葡萄膜炎；水肿，如黄斑水肿、黄斑囊样水肿和糖尿病性黄斑水肿；视网膜前膜疾病；黄斑毛细血管扩张；多灶性脉络膜炎；非视网膜病变糖尿病性视网膜功能障碍；眼部肿瘤；视神经萎缩；视网膜脱离；视网膜疾病，如视网膜中央静脉阻塞、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜动静脉阻塞疾病、血管阻塞、葡萄膜炎性视网膜疾病；葡萄膜积液；视网膜感染性和浸润性疾病；视神经疾病，如获得性视神经萎缩。外伤的实例包括但不限于：组织胞浆菌病；视神经外伤；影响眼后部位或位置的眼外伤；视网膜外伤；眼睛的病毒感染；视神经的病毒感染；由眼部激光治疗引起或影响的眼后部病症；由光动力疗法引起或影响的眼后部病症；光凝、放射性视网膜病变；和交感性眼炎。

在一些实施例中，向受试者施用包含变体多肽且包含有效载荷(例如转基因)的依赖性细小病毒颗粒诱导受试者中有效载荷(例如转基因)的表达。在一些实施例中，在眼睛中诱导表达。在一些实施例中，与具有野生型衣壳蛋白的类似颗粒相比，眼睛中的产生增加。在受试者(例如受试者的血清)中表达的有效载荷(例如转基因，例如异源蛋白质，例如治疗性多肽)的量可以变化。例如，在一些实施例中，有效载荷(例如转基因的蛋白质或RNA产物)，可以以小于约5μg/ml的量在受试者的血清中表达。例如，在一些实施例中，有效载荷(例如转基因的蛋白质或RNA产物)，可以以至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约300μg/ml、至少约400μg/ml、至少约500μg/ml、至少约600μg/ml、至少约700μg/ml、至少约800μg/ml、至少约900μg/ml或至少约1000μg/ml的量在受试者的血清中表达。在一些实施例中，有效载荷(例如转基因的蛋白质或RNA产物)，以约9μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约700μg/ml、约800μg/ml、约900μg/ml、约1000μg/ml、约1500μg/ml、约2000μg/ml、约2500μg/ml、或这些值中任意两个之间的范围的量在受试者的血清中表达。

在一些实施例中，经由注射向受试者施用包含变体多肽且包含有效载荷(例如转基因)的依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，注射是全身性注射，例如静脉内、动脉内、肌内或皮下注射。在实施例中，注射是通过静脉内注射。在一些实施例中，注射是注射至眼睛。在一些实施例中，注射是玻璃体内注射、眼眶内注射、眼眶后注射、脉络膜上注射、视网膜下注射、结膜下注射或前房内注射。在一些实施例中，注射是玻璃体内注射。在一些实施例中，注射是眼眶内注射。在一些实施例中，注射是眼眶后注射。在一些实施例中，注射是脉络膜上注射。在一些实施例中，注射是视网膜下注射。在一些实施例中，注射是结膜下注射。在一些实施例中，注射是前房内注射。在一些实施例中，注射是静脉内注射。本发明的方法中考虑的静脉内注射的一个实例是通过介入放射线照相术引导的静脉内施用进行的。在实施例中，此类施用是经由插入至向眼睛提供血流的动脉中(例如经由颈动脉，或至由此产生的任何小动脉(例如经由眼动脉))的引导导管。不受理论的束缚，此类“局部”静脉内施用通过靶向递送至所关注部位来减少引入体内的病毒颗粒的量。

本文公开的序列可以按照同一性百分比来描述。技术人员将理解，此类特征涉及两个或更多个序列的比对。比对可以使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种来进行，如可经由互联网访问的“Clustal W”。作为另一个实例，可以使用GCG版本6.1的程序FASTA来比较核酸序列。FASTA提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的同一性百分比可以使用FASTA及其默认参数来确定，如GCG版本6.1中提供的，该版本通过引用并入本文。类似的程序可用于氨基酸序列，例如“Clustal X”程序。可以使用的另外的序列比对工具由(蛋白质序列比对；(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/))和(核酸比对；http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html))提供。通常，以默认设置可以使用这些程序中的任何程序，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或计算机程序提供至少与参考算法和程序所提供的同一性或比对水平相同的同一性或比对。本文公开的序列可以进一步根据编辑距离来描述。将一个序列改变为另一序列的序列编辑(即单个碱基或核苷酸的添加、取代或缺失)的最小数量是两个序列之间的编辑距离。在一些实施例中，两个序列之间的距离被计算为莱文斯坦距离。

本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他出版物和参考文献(例如，序列数据库参考号)均通过引用整体并入本文。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列，例如在本文任何表中的序列，均通过引用并入本文。除非另有说明，否则本文指定的序列登录号，包括在本文任何表中的序列登录号，是指截至2020年8月21日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质引用多个序列登录号时，涵盖所有序列变体。

本发明通过以下实例进一步说明。提供实例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

实例

实例1

文库创建

设计野生型AAV2的2.5E5衣壳变体的文库并将其克隆到质粒中以创建编码衣壳变体的质粒的文库。如前所述，编码每个变体的衣壳和独特衣壳变体条形码标识符的AAV变体基因组的文库被克隆到三个ITR质粒主链中(Ogden等人2019)。每个质粒主链都包含独特的基因组标识符，可以经由不同的施用途径分析生物分布和转导效率。经由贴壁HEK293T的瞬时三重转染，然后进行碘克沙醇梯度纯化来产生文库。

文库的体外评价

如下所述准备数据。为了测量每个变体的包装效率(或“生产”)，使用两轮PCR制备来自质粒中的载体基因组和产生的AAV文库的条形码，用于Illumina测序。通过将产生的载体池中每个变体的条形码测序水平与用于创建载体池的输入质粒文库中每个变体的条形码序列水平进行比较来表达每个变体的产生效率(针对输入质粒文库中的存在进行归一化)。载体文库中变体频率的测量值还可以通过输入载体文库中的变体频率对生物分布和转导测量值进行下游归一化。产生效率报告于表1中，并且每个报告值均被报告为相对于野生型AAV2产生的log2产生。

非人类灵长类动物中的文库的体内评价

所有NHP实验均按照机构政策和NIH指南进行。选择体重为2.4-2.9kg、对抗AAV2中和抗体血清反应阴性(基于体外NAb测定，血清NAb滴度<1:20)的一只年轻成年雄性食蟹猴(Macaca fasciculis)和一只年轻成年雌性食蟹猴进行研究。在施用测试品之前，收集血液、房水(50μL)和玻璃体液(最多50μL)的样本。用氯胺酮和右美托咪定麻醉动物，并接受载体文库的玻璃体内注射(IVT；在50μL中的4.8E11 vg/眼)、前房内注射(IC；在50μL中的8.5E11 vg/眼)和静脉内注射(IV；1.8-2.5E13 vg/kg)。在生命期间，经由间接检眼镜检查和裂隙灯活组织显微镜检查来监测动物的眼部炎症迹象，并根据动物设施的标准操作程序(SOP)和兽医的建议根据需要经每周IM注射类固醇(甲泼尼龙，40-80mg)和局部类固醇(Durezol)以及阿托品进行治疗。注射后1h、4h和24h以及每周收集血清样本。注射后4周处死动物并收集组织用于生物分布和转导分析。视网膜和小梁网如图1所示被解剖。表3显示了收集的其他组织样本的列表。将所有样本收集到(Sigma-Aldrich)中并在室温孵育过夜，之后将排干并将样本冷冻在-80℃。此外，尸检时收集房水、玻璃体液、血清和脑脊液的样本，并保存在-80℃。

表3.收集的组织的列表。

组织
	肾上腺
大脑(皮质切片)冠状轴
	背根神经节(颈部)
背根神经节(胸部)
	背根神经节(腰部)
性腺(精巢和卵巢)
	心脏，基部(左心房)
心脏，尖部
	心脏，右心室
肾
	肝脏
肺(上叶)
	淋巴结，颈部
骨骼肌，肱二头肌
	骨骼肌，膈肌
骨骼肌，股四头肌
	脊髓(颈部)
脊髓(胸部)
	脊髓(腰部)
脾脏

为了进行生物分布和转导分析，使用Trizol/氯仿和异丙醇沉淀从组织样本中提取总DNA和RNA。RNA样本用TURBO DNA酶(Invitrogen)处理。使用Protoscript II逆转录酶(NEB)进行逆转录，其中引物对载体转基因具有特异性，并包含独特的分子标识符(UMI)。还制备了缺乏逆转录酶的对照反应(-RT对照)。用Luna Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)使用对转基因构建体具有特异性的引物和探针进行生物分布和转导的定量。最后，通过使用与Illumina NGS平台兼容的引物扩增转基因条形码区域来制备用于下一代测序的样本，并使用NextSeq 550(Illumina)对样本进行测序。

测序后，从具有预期扩增子结构的read中提取条形码标签，并记录每个条形码的丰度(read数或UMI数)。分析仅限于输入质粒样本中存在的并且在变体序列中不包含错误的一组条形码，如通过针对输入质粒样本的变体区域的单独测序测定进行测量的。

为了聚合包装复制，对来自复制病毒产生样本的read计数进行了求和。为了聚合转导样本，对来自同一组织的样本的UMI计数进行了求和。

使用贝叶斯模型以聚合产生、生物分布和/或转导样本作为输入来计算病毒包装、组织的生物分布和转导。简而言之，使用概率编程和随机变分推理来模拟实际测试病毒颗粒与其设计的序列之间的测量过程和解耦来源(例如交叉包装、模板切换和DNA合成中的错误)，并且来计算病毒产生、生物分布和转导(在各种组织样本中)以及错误率。输出是相对于野生型(WT)AAV2的计算的分布的log2转换的平均值。因此，正值表示所测量的特性比WT更好的性能，并且负值表示比WT性能更差。转导报告于表1中。

实例2

经由贴壁HEK293T的瞬时三重转染，然后进行碘克沙醇梯度纯化，单独产生包含表2(序列)中提供的变体衣壳的病毒颗粒。每个变体衣壳都是由编码独特条形码的基因组和在普遍存在的启动子控制下的荧光报告基因产生的。如上所述评估产生效率。合并等量(vg)的每种病毒颗粒并以实例1中所用的剂量注射到非人灵长类动物(例如食蟹猴或非洲绿猴)中。例如，如实例1中所述评估病毒特性，包括生物分布和组织转导。

经由贴壁HEK293T的瞬时三重转染，然后进行碘克沙醇梯度纯化，单独产生包含衣壳(大约100个独特变体和野生型比较物)的选择的病毒颗粒，包括表2(序列)中提供的那些。最终合并的测试品内各个变体的代表性尽可能平衡在10倍范围内。每个变体衣壳都是由编码独特条形码的基因组和在普遍存在的启动子(cbh)控制下的荧光报告基因产生的。总之，每个变体都是用包含8个独特条形码的单独基因组产生的，提供了研究中生物重复的测量。所有NHP实验均按照机构政策和NIH指南进行。选择体重2.8-3kg的两只年轻成年雄性食蟹猴(Macaca fasciculis)，一只抗AAV2中和抗体血清反应阴性(基于体外NAb测定，血清NAb滴度<1:20)和一只抗AAV2中和抗体血清反应阳性(1:128)，以用于研究。在施用测试品之前，收集血液、房水(50μL)和玻璃体液(最多50μL)的样本。用氯胺酮和右美托咪定麻醉动物并接受载体文库的静脉内注射(IV；2E12vg/kg)、玻璃体内注射(IVT；在50μL中的2.63E11vg/眼)和前房内注射(IC；在50μL中的1.11E11 vg/眼)。本文所述的变体均包括在具有单独条形码的IV和IVT文库两者中，以便可以通过每种施用途径追踪每种变体。在生命期间，经由间接检眼镜检查和裂隙灯活组织显微镜检查来监测动物的眼部炎症迹象，并根据动物设施的标准操作程序(SOP)和兽医的建议根据需要经每周IM注射类固醇(甲泼尼龙，80mg)和局部类固醇(Durezol)以及阿托品进行治疗。注射后4周处死动物并收集组织用于生物分布和转导分析。解剖后，对眼部和周围组织(包括肝脏)进行称重并在干冰上快速冷冻。如实例1中所述处理组织并评估生物分布/转导。结果如表4至6所示，并且值衍生自来自两只测试动物中的每一者的指定器官的至少4个组织片(总共至少8个样本)。

来自该中通量实验的数据证实了来自实例1中描述的文库实验的发现，并且证明本文所述的病毒颗粒，如包含VAR-1、VAR-2和VAR-3的衣壳多肽的病毒颗粒，相对于通过静脉内递送包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒表现出增强的眼部转导。这些增加在视网膜的脉络膜和神经视网膜层(包括黄斑和不包括黄斑两者)中最为明显，但小梁网组织的转导相对于野生型AAV2也有所增强。有趣的是，相对于静脉内递送的AAV5和AAV2，这些变体进一步表现出显著降低的肝脏转导和生物分布，表明包含这些衣壳多肽的病毒颗粒特异性地转导眼部组织的细胞。有趣的是，当经由玻璃体内注射直接注射到眼睛中时，包含这些变体的衣壳多肽的病毒颗粒转导眼部组织的能力是经由玻璃体内施用注射的野生型AAV2的约2.5倍之内，这表明经由血流而不是玻璃体内空间转导眼部组织的能力优先增强。不受理论的束缚，这表明这些变体可能经由可能涉及穿过血脑屏障的能力的机制实现转导。这些结果表明，衣壳多肽和包含这些衣壳多肽的病毒颗粒作为针对眼部疾患的疗法的基因疗法载体，或者在至眼部区域(包括视网膜、黄斑和/或小梁网组织)的选择性和增强的转导有益的情况下，因此具有增强的实用性。

实例3

为了进一步研究包含本文所述的衣壳多肽的病毒颗粒穿过血脑屏障的能力，从实例2中描述的对抗野生型AAV2中和抗体血清反应阴性的一种非人灵长类动物中分离两个脑组织样本，一个样本来自中脑并且一个样本来自小脑。对来自这些样本的组织进行处理，并在静脉内施用后测量包含来自VAR-1、VAR-2和VAR-3的衣壳多肽的病毒颗粒的转导，如前述实例中所述。表7总结了这些病毒颗粒相对于仅包含静脉内递送的野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒的转导。结果表明，静脉内施用后，包含本文所述的衣壳多肽的病毒颗粒使得总体中脑组织中的转导水平是来自包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒的转导水平的170倍与372倍之间，并且在总体小脑组织中的转导水平是来自包含野生型AAV2衣壳多肽的病毒颗粒的转导水平的20倍与46倍之间。我们在这里注意到，与小脑样本中相比，野生型AAV2在中脑样本中的转导要低得多。虽然总体野生型AAV2转导率在中脑中是可测量的，足以建立归一化基线，但由于整体野生型率较低，相对中脑转导率可能具有额外的不确定性。这并不影响这些变体以比野生型AAV2显著更高的转导率转导中脑样本的发现。最后，当与来自静脉内递送的AAV9(一种已用于针对脑的靶细胞的批准和临床疗法的衣壳)的两个脑样本中的转导水平相比时，包含本文所述的衣壳多肽的病毒颗粒实现的相对转导率为AAV9的相对转导率的32％(VAR-1)、48％(VAR-2)和72％(VAR-3)，表明转导水平与通过治疗和临床基因疗法所实现的水平相似。与本文所述的其他结果一起，这些结果表明本文所述的衣壳多肽当并入病毒颗粒中时，能够跨脑并向眼部组织以高效率引导转导并提高转基因表达的水平。与观察到的相对较低的肝脏转导相结合，包含本文所述的这些衣壳多肽的基因疗法特别可用于经由全身性(例如，静脉内)施用来治疗CNS和/或眼部疾患。适合用包含本文所述的病毒颗粒和衣壳多肽的基因疗法治疗的一类特定疾病是神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)，例如Batten病。

Claims

2.根据权利要求1所述的变体衣壳多肽，其中变体是与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽(AAV2)相同的血清型。

3.根据权利要求1所述的变体衣壳多肽，其中变体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的多肽(AAV2)相比是不同的血清型。

4.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的585、586、587、588、589、590、591、593、597、600、608中的一个或多个位置处的突变的突变，任选地其中所述突变包括插入、缺失或取代。

5.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含：

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置586处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置587处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置588处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置589处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置590处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置591处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置593处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置597处的突变的突变；

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置600处的突变的突变；或

对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置608处的突变的突变。

6.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、588、589、590、593、597和608处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或所有突变)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、586、587、588、589、590、591、593和600处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有突变)。

8.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于在与SEQ ID NO:1相比的位置585、588、590、591和597处的突变的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个或所有突变)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含与SEQ IDNO:1相比的R585V、R588T、Q589G、A590P、A593G、T597I和D608N中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或所有突变)。

10.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含与SEQID NO:1相比的R585S、G586S、N587I、R588T、Q589A、A590P、A591G、A593G和V600C中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或所有突变)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含与SEQID NO:1相比的R585N、R588T、A590P、A591T和T597H中的一个或多个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个或所有突变)。

12.一种变体衣壳多肽，其包含：(a)以下中任一者的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4；(b)以下中任一者的VP2或VP3序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4；(c)包含与其(例如，与(a)或(b)的多肽)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽，其中相对于SEQ ID NO:1，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)；或(d)相对于(a)或(b)的所述多肽，具有至少1个、但不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过3个或不超过2个氨基酸突变的多肽，其中相对于SEQ ID NO:1，所述多肽包含与SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:4中任一者相关的突变中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)。

13.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自与SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少或约95％、96％、97％、98％或99％相同，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

14.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约20个突变，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

15.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约10个突变，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

16.一种包含VP1、VP2或VP3或其任意组合的变体衣壳多肽，其各自具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽相比的约1至约5个突变，并且包含VAR-1至VAR-3中的任一者的所有突变差异。

17.一种变体衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列。

18.一种变体衣壳多肽，其由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VP1、VP2或VP3序列组成。

19.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述变体衣壳多肽为VP1多肽、VP2多肽或VP3多肽。

20.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽。

21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:5、6、7的序列，其片段，或其与其具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。

22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述其片段编码VP2衣壳多肽或VP3衣壳多肽。

23.一种病毒颗粒(例如，腺相关病毒(“AAV”)颗粒)，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的或由根据权利要求20至22中任一项所述的核酸分子编码的变体衣壳多肽。

24.根据权利要求23所述的病毒颗粒，其包含核酸，所述核酸包含有效载荷(例如，异源转基因)和一个或多个调控元件。

25.根据权利要求23至24中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒相对于野生型AAV2(例如，包含SEQ ID NO:1的或由SEQ ID NO:8编码的衣壳多肽的病毒颗粒)表现出增加的眼部转导，例如，如在小鼠或在NHP中测量的，例如，如本文所述。

26.根据权利要求25所述的病毒颗粒，其中所述增加的眼部转导是增加的视网膜转导。

27.根据权利要求25至26中任一项所述的病毒颗粒，其中在全身性、例如静脉内施用后表现出所述增加的眼部转导。

28.根据权利要求20至22中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是双链或单链的，并且其中所述核酸分子是线性或环状的，例如其中所述核酸分子为质粒。

29.一种产生包含变体衣壳多肽的病毒颗粒的方法，所述方法包括将根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸分子引入细胞(例如HEK293细胞)中，以及从中收获所述病毒颗粒。

30.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与(a)包含根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽和有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或(b)根据权利要求24至27中任一项所述的病毒颗粒接触。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞是眼部细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述眼部细胞位于视网膜中。

33.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽和所述有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或向所述受试者施用根据权利要求24至27中任一项所述的病毒颗粒。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述病毒颗粒将所述有效载荷递送至眼睛。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述病毒颗粒将所述有效载荷递送至视网膜。

36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒通过全身性、例如静脉内施用，或通过直接至眼动脉的静脉内施用进行施用。

37.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求33至37中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述病毒颗粒)与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛。

38.根据权利要求37所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中所述眼睛的所述一个或多个区域是视网膜，并且其中所述视网膜包括非黄斑视网膜。

39.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述病毒颗粒)与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛，并且其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、150倍、200倍或250倍。

40.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述病毒颗粒)与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，其中与包含SEQ ID NO:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中所述转导的增加对于非黄斑视网膜是特异性的。

41.根据权利要求29至40中任一项所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中向所述受试者的施用是经由全身性、例如静脉内注射，或通过直接至眼动脉的静脉内施用进行的。

42.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量向所述受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中所述依赖性细小病毒颗粒是包含根据权利要求1至19中任一项所述的或由根据权利要求20至21或28中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的病毒颗粒，或是根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒。

43.一种治疗受试者的CNS和/或眼部疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量向所述受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中所述依赖性细小病毒颗粒是包含根据权利要求1至19中任一项所述的或由根据权利要求20至21或28中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的病毒颗粒，或是根据权利要求23至27中任一项所述的病毒颗粒，任选地其中所述疾病或病症是神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)。

44.一种细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据权利要求1至27或37至41中任一项所述的衣壳多肽、核酸分子或病毒颗粒。

45.一种制备依赖性细小病毒(例如，腺相关依赖性细小病毒(AAV)颗粒的方法，所述方法包括：

提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸；以及

在适合于产生所述依赖性细小病毒颗粒的条件下培养所述细胞、无细胞体系或其他翻译体系，

从而制备所述依赖性细小病毒颗粒。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第二核酸分子，并且所述第二核酸分子被包装在所述依赖性细小病毒颗粒中，并且其中所述第二核酸包含有效载荷，例如，编码治疗产品的异源核酸序列。

47.根据权利要求45至46中任一项所述的方法，其中根据权利要求20至22或38中任一项所述的核酸介导依赖性细小病毒颗粒的产生，所述依赖性细小病毒颗粒不包含根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中根据权利要求20至22或38中任一项所述的核酸以由编码SEQ ID NO:1的核酸分子介导的生产水平的至少10％、至少20％、至少50％或至少100％的水平，或者相比由编码SEQ ID NO:1的核酸分子介导的生产水平高至少10％、高至少20％、高至少50％或高至少100％的水平，来介导依赖性细小病毒颗粒的产生。

49.一种组合物，例如药物组合物，其包含根据权利要求23至27或37至41中任一项所述的病毒颗粒或通过根据权利要求29或45至48中任一项所述的方法产生的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。

50.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求23至27或37至41中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗受试者的疾病或病症。

51.根据权利要求1至19中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求20至22或28中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求23至27或37至41中任一项所述的病毒颗粒，其用于制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物。