CN117940152A - 缀合物 - Google Patents

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乌尔夫·特德巴克
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Abstract

提供了一种缀合物，其包含至少一个含有B细胞表位序列的多肽和至少一个含有CD4+T细胞表位序列的多肽。CD4+T淋巴细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域或与所述区域具有至少80％序列同一性的序列，并且CD4+T细胞表位在至少50％的群体中具有免疫原性。至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸。B细胞表位的序列不同于CD4+T细胞表位的序列，对B细胞表位特异性的抗体与该缀合物结合。

Description

缀合物
技术领域
本发明涉及缀合物、多肽、核酸分子和载体。本发明还涉及包含第一产物和第二产物以及多个缀合物的混合物的组合。本发明还涉及包含缀合物、多个缀合物的混合物、核酸分子、多肽或组合的药物组合物。此外，本发明涉及用于医学的缀合物、多个缀合物的混合物、核酸分子、多肽、组合、第一产物或第二产物。此外，本发明涉及核心、中间缀合物和制备缀合物的方法。本发明还涉及确定在已施用缀合物的受试者中针对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在的方法。
背景技术
癌症是一种异质性疾病，其特征是个体内出现新的、异常的和/或不受控制的细胞增殖。通常，不同类型的癌症之间以及患有相同癌症类型的个体之间存在高度的多样性。因此，提供对患者群体都有效的癌症治疗是一项挑战。
已经提出了许多治疗癌症的方法。一种方法是提供癌症疫苗，例如包括包含肿瘤相关抗原片段的抗原肽的疫苗。这种抗原肽，当施用于个体时，能够引起CD8+(MHC I类限制的)或CD4+(MHC II类限制的)T细胞针对表达肿瘤相关抗原的细胞的应答。
WO 2011/101173公开了用于治疗癌症的来自人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的多种多肽。WO 2017/207814进一步公开了来自hTERT的多肽与免疫检查点抑制剂联合用于治疗癌症。
仍然需要提供进一步的抗癌治疗，包括进一步的抗原多肽(以及编码这种多肽的核酸分子)。
WO 2011/115483涉及疫苗缀合物，其包含源自破伤风毒素(TTx)的肽，该肽缀合至抗原、免疫原或包含抗原或免疫原的载体。
在人群中经常出现针对TTx的循环抗体，因为大多数人在生命早期接种了破伤风疫苗，特别是在西方世界。据世界卫生组织统计，在2015年，全世界约86％的婴儿接种了破伤风疫苗。破伤风疫苗包括破伤风类毒素(TTd)，其制备方法是用福尔马林处理蛋白质使TTx脱毒。虽然TTd是TTx的一种修饰形式(并且因此是一种不同的蛋白质)，但TTd能够诱导针对破伤风的保护性免疫，这意味着TTd疫苗接种产生的抗体可以识别TTx。TTd用于针对三种传染病(白喉、百日咳和破伤风)的儿童百白破联合疫苗。此外，许多人在以后的生活中面临着破伤风的挑战，因为抗破伤风疫苗接种是在怀疑可能导致破伤风感染的伤害之后的一项常见程序，而且在一些国家也建议每10年接种一次加强疫苗。因此，抗TTx/TTd抗体存在于工业化国家相当大比例的人群中。
据提议，个体中的循环抗体将与源自TTx的肽结合，并将缀合物靶向抗原呈递细胞(APC)，以提供强大的免疫应答。WO 2011/115483公开了源自TTx的多种多肽。没有提出包含与癌症相关的抗原的缀合物的具体实例或数据。
Mangsbo等人，Mol Immunol.2018Jan；93：115-124公开了源自TTx的肽，包括一个18聚体肽序列。构建了包含与源自卵清蛋白(OVA)的CD8+T细胞表位或源自人糖蛋白100(hgp100)的CD8+T细胞表位缀合的18聚破伤风表位的肽缀合物。
Fletcher等人，J Immunol.2018July 1；2011(1)：87-97公开了源自TTx的18聚肽序列，如Mangsbo等人，2018所述。构建了包含与合成的长肽缀合的18聚破伤风表位的缀合物，该合成的长肽包含来自CMV或流感的CD8+T细胞表位。
应当理解，为了使CD8+和/或CD4+T细胞应答发生，抗原肽必须存在于MHC分子上。MHC I类分子存在于大多数细胞的表面，并且通常结合长度在8-10个氨基酸残基之间的多肽。MHC I类分子向CD8+T细胞(也称为细胞毒性T细胞或CTL)呈递多肽，以引发CD8+T细胞应答，这些多肽通过蛋白水解作用源自细胞膜蛋白质。相比之下，MHC II类分子存在于抗原呈递细胞和活化的T细胞表面，并结合通常较长的多肽，长度通常在12至24个氨基酸之间。MHCII类分子将多肽呈递给CD4+T细胞(也称为辅助性T细胞或Th细胞)，以引发CD4+T细胞应答，这些多肽源自通过内吞作用已被内化和消化的细胞外蛋白。
在人类群体中，MHC分子的变异范围很大。特别是，不同的个体有不同的HLA等位基因(即其编码人MHC分子)，这些等位基因对多肽的结合亲和力不同，这取决于多肽的氨基酸序列。因此，具有特定HLA等位基因的个体可能具有将结合特定序列的多肽的MHC分子，而缺乏HLA等位基因的其他个体将具有无法结合并呈递多肽的MHC分子(或者，至少，他们的MHC分子将对多肽的亲和力非常低，因此将以相对较低的水平将其呈递)。
仍然需要抗原多肽(和编码这些多肽的核酸分子)以及涉及这些成分的进一步方法，这些成分在多个个体和/或更大比例的群体中引发有效的免疫应答。此外，仍然需要监测这种免疫应答的方法。
本发明旨在减轻一个或多个上述问题。
发明概述
本发明的各方面源于鉴定缀合物的性质，该缀合物包含含有B细胞表位序列的多肽和含有来自通用肿瘤抗原(例如hTERT)的CD4+T细胞表位序列的多肽。当这种缀合物被施用于个体时，识别B细胞表位的抗体(既可以是预先存在的(例如，来自用B细胞表位的先前接种)，也可以是由施用缀合物产生的)导致抗体介导的缀合物的摄取。这具有双重作用：首先是一种正反馈机制，涉及进一步产生对缀合物的B细胞表位特异性的抗体；其次是树突细胞将CD4+T细胞表位呈递给CD4+辅助性T细胞。活化的CD4+T细胞对表达通用肿瘤抗原的肿瘤细胞是特异性的，正反馈机制驱动CD4+T细胞活化的机制，从而在传递抗肿瘤CD4+T细胞免疫应答方面特别有效。
本发明的其他方面源于这样的观察，即这种双重作用的另一个结果是，对缀合物的B细胞表位特异性的抗体的抗体滴度(其对于个体可以相对容易地确定)指示了对缀合物的T细胞表位特异性的活化CD4+T细胞的水平(其在其他方面对于个体难以确定)。
本发明的其他方面源于鉴定可用于连接上述缀合物的B细胞表位和CD4+T细胞表位的核心的某些结构。
本发明的其他方面源于观察到hTERT蛋白序列的某些多肽含有特别高数量的临床相关表位，因此将适合用于可在很大比例的群体中诱导免疫应答的疫苗。
根据本发明的第一方面，提供了一种缀合物，该缀合物包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，其中CD4+T细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域或与所述区域具有至少80％序列同一性的序列，并且其中CD4+T细胞表位在至少50％的群体中具有免疫原性，其中至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸，
其中B细胞表位序列与CD4+T细胞表位序列不同，并且
其中，对B细胞表位特异性的抗体与缀合物结合。
方便地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过核心连接，
其中所述核心在连接之前包括：
主体部分；
附接到主体部分的一个或多个第一连接基团；和
附接到主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中第一连接基团和第二连接基团彼此正交；
并且其中第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件。
优选地，第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；和/或第一连接元件和第二连接元件独立地选自1，2，3-三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键。
根据本发明的第二方面，提供了一种确定已施用缀合物的受试者中针对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在的方法，该缀合物包含至少一个含有B细胞表位序列的多肽和至少一个含有CD4+T细胞表位序列的多肽，所述方法包括以下步骤：
(a)在施用所述缀合物之前，检测在源自所述受试者的样品中对B细胞表位特异性的抗体的量或缺失，其中在第一水平检测抗体的量或缺失；以及
(b)在一次或多次施用所述缀合物之后，检测在源自所述受试者的样品中对B细胞表位特异性的抗体的量或缺失，其中在第二水平检测抗体的量或缺失，以及
其中，相对于第一水平的抗体的量或缺失，第二水平的抗体的量的增加表明受试者中存在针对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答。
优选地，步骤(b)包括在两次或更多次施用、优选三次或更多次施用、更优选四次施用之后，检测在源自受试者的样品中对B细胞表位特异性的抗体的量或缺失。
方便地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽是包含B细胞表位序列的第一和第二多肽，优选包含B细胞表位序列的第一、第二和第三多肽。
有利地，B细胞表位包含选自以下的序列：
(i)包含至少10个在SEQ ID NO：3中连续的氨基酸的序列，优选包含至少10个在SEQ IDNO：5中连续的氨基酸的序列；或
(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列。
优选地，B细胞表位包含选自以下的序列：
(i)包含至少10个在SEQ ID NO：5中连续的氨基酸的序列，并且包含序列表中SEQID NO：6表示的氨基酸序列GITELKKL；或
(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列
方便地，B细胞表位包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：7；或
(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列。
有利地，在本发明的第二方面中，CD4+T细胞表位包含自身抗原或肿瘤相关抗原的至少12个氨基酸的区域，或与该区域具有至少80％序列同一性的序列，并且其中至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽长度等于或小于500个氨基酸，优选地，其中自身抗原或肿瘤相关抗原是通用肿瘤抗原。
或者，在本发明的第二方面中，CD4+T细胞表位包含内源性蛋白或病毒或细菌蛋白质的至少12个氨基酸的区域。优选地，CD4+T细胞表位包含细胞内蛋白的至少12个氨基酸的区域。
方便地，通用肿瘤抗原选自由端粒酶逆转录酶、存活蛋白、DNA拓扑异构酶2-α、细胞色素P450 1B1和E3泛素蛋白连接酶Mdm2组成的组中。
优选地，通用肿瘤抗原是端粒酶逆转录酶，并且其中CD4+T细胞表位包含选自以下的一个或多个序列：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)SEQ ID NO：116；
(iii)SEQ ID NO：117；
(iv)包含至少12个氨基酸的(i)、(ii)或(iii)的免疫原性片段的序列；和/或
(v)与(i)、(ii)、(iii)或(iv)具有至少80％序列同一性的序列。
有利地，至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽包含另一种T细胞表位的序列，其中另一种T细胞表位是另一种CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。
方便地，该缀合物包含另一种物质。
优选地，该另一种物质是包含表位序列的另一种多肽，更优选地，其中所述表位是另一种T细胞表位，更优选地，所述另一种T细胞表位是另一种CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。
有利地，CD4+T细胞表位包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：1：
(ii)包含至少12个氨基酸的(i)的免疫原性片段的序列；或
(iii)与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列，
并且其中所述另一种CD4+T细胞表位包含选自以下的序列：
(iv)SEQ ID NO：116；
(v)包含至少12个氨基酸的(iv)的免疫原性片段的序列；或
(vi)与(iv)或(v)具有至少80％序列同一性的序列。
根据本发明的第三方面，提供了包含第一和第二不同缀合物的缀合物混合物，其中第一缀合物和/或第二缀合物各自为本发明的缀合物。
方便地，第一缀合物包含CD4+T细胞表位，该表位包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)包含至少12个氨基酸的(i)的免疫原性片段的序列；或
(iii)与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列，
并且其中第二缀合物包含CD4+T细胞表位，所述表位包含选自以下的序列：
(iv)SEQ ID NO：116；
(v)包含至少12个氨基酸的(iv)的免疫原性片段的序列；或
(vi)与(iv)或(v)具有至少80％序列同一性的序列。
有利地，CD4+T细胞表位在至少60％的群体中是免疫原性的，优选至少65％的群体。
方便地，CD4+T细胞表位与人群中存在的以下HLA等位基因中的一个或多个结合：HLA-DRB1*15、HLA-DRB1*07、HLA-DRB1*04、HLA-DQB1*06、HLA-DQB1*03、HLA-DQB1*05、HLA-DPB1*04和/或HLA-DPB1*01。
根据本发明的第四方面，提供了一种缀合物，该缀合物包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，其中所述CD4+T细胞表位包含选自以下的一个或多个序列：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)SEQ ID NO：116：
(iii)SEQ ID NO：117；
(iv)包含至少12个氨基酸的(i)、(ii)或(iii)的免疫原性片段的序列；和/或
(v)与(i)、(ii)、(iii)或(iv)具有至少80％序列同一性的序列，
其中B细胞表位的序列与CD4+T细胞表位序列不同，并且
其中，对B细胞表位特异性的抗体与缀合物结合。
根据本发明的第五方面，提供了一种分子，其包含编码包含本发明的B细胞表位序列的多肽的第一核苷酸序列和/或编码包含本发明的CD4+T细胞表位的序列的多肽的第二核苷酸序列。
优选地，所述分子是核酸分子。
根据本发明的第六方面，提供了一种多肽，其包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：116；
(ii)与(i)具有至少91％序列同一性的序列；
(iii)SEQ ID NO：117；或
(iv)与(iii)具有至少95％序列同一性的序列，
其中，包含选自(i)或(ii)的序列的多肽的长度等于或小于170个氨基酸，并且其中包含选自(iii)或(iv)的序列的多肽的长度等于或小于40个氨基酸。
有利地，包含选自(i)或(ii)的序列的多肽的长度等于或小于150、125、100、75或50个氨基酸。
或者，包含选自(iii)或(iv)的序列的多肽的长度等于或小于35、34、33、32或31个氨基酸。
根据本发明的第七方面，提供了一种核酸分子，其由编码本发明多肽的核苷酸序列组成。
根据本发明的第八方面，提供了一种包含本发明的核酸分子的载体。
根据本发明的第九方面，提供了一种包含第一产物和第二产物的组合，其中第一产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述免疫原性片段包含至少8个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，所述缀合物包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第二产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(vii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述免疫原性片段包含至少17个氨基酸；
(viii)与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，所述缀合物包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第一产物和所述第二产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第一产物和第二产物为单一多肽，并且第一产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及第二产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第一产物和第二产物为单一产物，并且第一产物如(v)中所定义以及第二产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度小于1500个核苷酸。
优选地，所述组合包含多肽的混合物，其中所述第一产物是如上文中第(i)、(ii)或(iii)部分所定义的多肽，并且其中所述第二产物是如上文中第(vi)、(vii)或(viii)部分所定义的多肽。
有利地，所述组合包含核酸分子的混合物，其中第一产物是如上文中第(v)部分中所定义的核酸分子，第二产物是如上文中第(x)部分中所定义的核酸分子。
方便地，这种或每种多肽或这种或每种核酸分子与另一种物质相连。
根据本发明的第十方面，提供了通过与第二产物同时、单独或顺序施用在医学中应用的第一产物，其中第一产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述免疫原性片段包含至少8个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，所述缀合物包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第二产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(ii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述免疫原性片段包含至少17个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，所述缀合物包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第一产物和所述第二产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第一产物和第二产物为单一多肽，并且第一产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及第二产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第一产物和第二产物是单一产物，并且第一产物如(v)中所定义以及第二产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。
根据本发明的第十一方面，提供了通过与第一产物同时、单独或顺序施用在医学中应用的第二产物，其中第二产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述免疫原性片段包含至少17个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，所述缀合物包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第一产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(vii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述免疫原性片段包含至少8个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，所述缀合物包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第二产物和所述第一产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第二产物和第一产物为单一多肽，并且第二产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及所述第一产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则所述单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第二产物和第一产物为单一产物，并且第二产物如(v)中所定义以及第一产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。
根据本发明的第十二方面，提供了用于医学的本发明的缀合物、本发明的缀合物的混合物、本发明的核酸分子、本发明的多肽或本发明的组合。
优选地，第一产物、第二产物、缀合物、缀合产物的混合物、核酸分子、多肽或组合用于治疗或预防癌症。
根据本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的缀合物、本发明的缀合物的混合物、本发明的核酸分子、本发明的多肽或本发明的组合和药学上可接受的稀释剂，赋形剂或佐剂以及任选的另一种治疗成分。
方便地，药物组合物用于医学，优选用于治疗或预防癌症。
优选地，本发明的缀合物、本发明的缀合物的混合物、包含上述的本发明的组合或药物组合物或编码上述任何一种的本发明核酸分子用于施用了诱导针对B细胞表位的B细胞应答的疫苗的受试者。
有利地，诱导针对B细胞表位的B细胞应答的疫苗已至少两次施用于受试者。
方便的是，诱导针对B细胞表位的B细胞应答的疫苗是破伤风疫苗。
根据本发明的第十四方面，提供了一种治疗或预防受试者中癌症的方法，其包括以治疗有效量施用本发明的缀合物、本发明的缀合物的混合物、本发明的核酸分子、本发明的多肽、本发明的组合和/或本发明的药物组合物。
根据本发明的第十五方面，提供了一种治疗或预防患者中癌症的方法，其包括与第二产物同时、单独或顺序地施用第一产物，其中所述第一产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，其中所述免疫原性片段包含至少8个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，其包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第二产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(vii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，其中所述免疫原性片段包含至少17个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，其包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第一产物和所述第二产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第一产物和第二产物为单一多肽，并且第一产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及所述第二产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第一产物和第二产物是单一产物，并且第一产物如(v)中所定义以及第二产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。
其中第一产物和/或第二产物各自以治疗有效量施用。在一些实施方案中，第一产物在第二产物之前施用；在其他实施方案中第一产物是在第二产物之后施用。
优选地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过共价连接。
有利地，在连接之前，第一连接基团和第二连接基团中的至少一个包括两个或更多第一连接基团或第二连接基团。
优选地，在连接之前，第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；更优选其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基基独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、炔烃和α-卤代羰基。
方便地，在连接之前，所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽和所述至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽独立地包含硫醇基、叠氮化物基、炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺和α-卤代羰基。优选地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽独立地包含硫醇基或叠氮化物基。
有利地，第一连接元件和第二连接元件独立地选自1，2，3-三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键(例如由亚硫醇反应形成)。特别优选的是，第一连接元件和第二连接元件独立地选自1，2，3-三唑键和硫化物键。
优选地，第一连接元件和第二连接元件独立地选自：
其中：
X1选自-(CH2)ax11-和-(CH2)ax12-X12-：
其中X12选自O、NR12或S；
R12选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基和任选地取代的的杂芳基；优选地氢和任选地取代的烷基；
X2选自N或CH；
ax11和ax12独立地选自0至12，并且
波浪线表示与至少一个包含B细胞表位序列的多肽或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽和/或核心的连接点。
根据本发明的第十六方面，提供了一种核心，该核心包括：
主体部分；
附接到主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
第一连接基团和第二连接基团中的至少一个包括两个或更多第一连接基团或第二连接基团，和
第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；优选地其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基。
其中核心不是：
/>
优选地，核心包括两个或三个第一连接基团，优选三个第一连接基团。
方便地，核心包括一个或两个第二连接基团，优选一个第二连接基团。
有利地，第一连接基团和第二连接基团独立地选自：
其中X12是O、NR12或S；
R12选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选取代的芳基和任选地取代的杂芳基：优选地氢和任选地取代的烷基；和
ax11和ax12独立地从0到12中选择。
优选地，主体部分由式1和式2之一表示：
式1
式2
其中在式1中：
L11和L12是接头(linker)；
R13选自氢、羟基、任选地取代的氨基、卤素、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选的取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a11表示附接到碳原子上的[(L11)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a12表示附接到碳原子上的[(L12)-**]基团的数目，并且选自1、2或3；
a13表示附接到碳原子上的R13基团的数目，并且选自0或1；
a11+a12+a13是4；
*表示与第一连接基团的连接点；
**表示与第二连接基团的连接点；和
其中在式2中：
AA表示氨基酸；
n表示独立选择的AA基团的数目，并且选自1至12；
L21和L22是接头；
R23选自氢、羟基、任选地取代的氨基、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选的取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地替代的杂芳基；
a21表示附接到[(AA)]n上的[(L21)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a22表示附接到[(AA)]n上的[(L22)-**]基团的数目，并且选自1、2或3；
a23表示在C端和/或N端附接到[(AA)]n上的R23基团的数目，并且选自0、1或2；
*表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第一连接基团的连接点；
**表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第二连接基团的连接点。
根据本发明的第十七方面，提供了根据本发明第一方面的缀合物或根据本发明第二方面的核心，其中主体部分由式1和式2之一表示：
式1
式2
其中在式1中：
L11和L12是接头；
R13选自氢、羟基、任选地取代的氨基、卤素、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选的取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a11表示附接到碳原子上的[(L11)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a12表示附接到碳原子上的[(L12)-**]基团的数目，并且选自1、2或3；
a13表示附接到碳原子上的R13基团的数目，并且选自0或1；
a11+a12+a13是4；
*表示与第一连接基团的连接点；
**表示与第二连接基团的连接点；和
其中在2中：
AA表示氨基酸；
n表示独立选择的AA基团的数目，并且选自1至12；
L21和L22是连接基团；
R23选自氢、羟基、任选地取代的氨基、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a21表示附接到[(AA)]n上的[(L21)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a22表示连接到[(AA)]n上的[(L22)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a23表示在C-端和/或N-端附接到[(AA)]n上的R23基团的数目，并且选自0、1或2；
*表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第一连接基团的连接点；
**表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第二连接基团的连接点。
方便地，主体部分由式2表示。
优选地，L11、L12、L21和L22独立地选自-(任选取代的亚烷基)-，-O-，-(CONH)-，-(NHCO)-，-(CH2CH2O)w-，-(CO)-，-(任选取代的亚烷基)-O-，-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-，-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-，-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-，-(任选取代的亚烷基)-(CO)-，-O-(任选取代的亚烷基)-，-O-(CONH)-，-O-(NHCO)-，-O-(CH2CH2O)w-，-O-(CO)-，-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-，-(CONH)-O-，-(CONH)-(NHCO)-，-(CONH)-(CH2CH2O)w-，-(CONH)-(CO)-，-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-，-(NHCO)-O-，-(NHCO)-(CONH)-，-(NHCO)-(CH2CH2O)w-，-(NHCO)-(CO)-，-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-，-(CH2CH2O)w-O-，-(CH2CH2O)w-(CONH)-，-(CH2CH2O)w-(NHCO)-，-(CH2CH2O)w-(CO)-，-(CO)-(任选取代的亚烷基)，-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-，-(CO)-(NHCO)-，-(CO)-(CH2CH2O)w-，-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-，-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-，-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-，-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-，-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-，-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-，-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-，-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-，-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。
方便地，根据式2的主体部分包含一个或多个AA基团，所述AA基团具有包含任选取代的氨基的侧链。优选地，包含氨基的侧链可以是-(任选取代的亚烷基)-(任选被取代的氨基)基团。
有利地，包含氨基的侧链可以包含一个或多个赖氨酸基团，优选三个赖氨酸基团。
优选地，n为2至10，优选2至6，更优选3或4，甚至更优选3。
有利地，连接到C端的R23基团选自羟基、任选取代的氨基和任选取代的烷氧基；优选羟基和任选取代的氨基；更优选任选取代的氨基。
优选地，与第一连接基团的连接点是通过AA基团之一的侧链。
方便地，与每个第一连接基团的连接点是通过独立选择的AA基团的侧链。
有利地，与第二连接基团的连接点是经由N端。
优选地，该核心还包括附接于主体部分的第三连接基团，其中第三连接基团与第一连接基团和第二连接基团正交：更优选地，其中第三连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物。
方便地，与第三连接基团的连接点是通过其中一个AA基团的侧链(例如在丝氨酸基团上)，或通过C端。优选地，与第三连接基团的连接点是经由C端。
根据本发明的第十八方面，提供了一种缀合物，该缀合物包括：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)至少一个包含CD4+T细胞序列的多肽；
其中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接到一个核心，其中核心在连接之前包括：
主体部分；
附接到主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
其中核心不是：
并且其中第一连接基团与包含B细胞表位序列的至少一个多肽连接以形成第一连接元件，或第二连接基团与包含CD4+T细胞表位的序列的至少一个多肽连接以形成第二连接元件。
优选地，提供了一种缀合物，该缀合物包括：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)至少一个包含CD4+T细胞序列的多肽；
并且其中第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位的序列的多肽连接以形成第二连接元件。
优选地，核心如以上任意一项中所定义。
方便地，B细胞表位和/或CD4+T细胞表位如以上任一项中所定义。
根据本发明的第十九方面，提供了一种制备缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)提供至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，并将至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接到至少一个包含B细胞表位序列的多肽，
其中CD4+T淋巴细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域或与所述区域具有至少80％序列同一性的序列，并且其中CD4+T细胞表位在至少50％的群体中具有免疫原性，其中至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸，
其中B细胞表位序列与CD4+T细胞表位序列不同，并且
其中，对B细胞表位特异性的抗体与缀合物结合。
方便地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过核心连接，
其中核心在连接之前包括：
主体部分；
附接到主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中第一连接基团和第二连接基团彼此正交；
并且其中第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件。
根据本发明的第二十方面，提供了一种制备缀合物的方法，包括以下步骤：
(a)提供核心，其包括：
主体部分；
附接到主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
第一连接基团和第二连接基团中的至少一个包括两个或更多第一连接基团或第二连接基团，和
第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇或叠氮化物；优选其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基团基独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基。
其中核心不是：
/>
优选地，其中核心如以上任意一项中所定义。
(b)提供至少一个包含B细胞表位序列的多肽，或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽；并将核心与至少一个包含B细胞表位序列的多肽反应形成第一连接元件，或将核心与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽反应形成第二连接元件。
优选地，该方法进一步包括以下步骤：
(c)提供步骤(b)中未提供的至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽或至少一个包括B细胞表位序列的多肽中的另一个；以及如果在步骤(b)中形成第一连接元件，则使核心与所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽反应以形成第二连接元件；或者如果在步骤(b)中形成第二连接元件，则使核心与所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽反应以形成第一连接元件。
根据本发明的第二十一方面，提供了一种多肽，其包含选自以下的序列：
(i)UV36(SEQ ID NO：166)，UV57(SEQ ID NO：167)，UV58(SEQ ID NO：168)，UV59(SEQ ID NO：169)，UV60(SEQ ID NO：170)，UV64(SEQ ID NO：171)，UV65(SEQ ID NO：172)或UV66(SEQ ID NO：173)的序列；
(ii)包含至少8个氨基酸的(i)的免疫原性片段的序列；或
(iii)与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列，
其中多肽的长度等于或小于25、22、20、18、15或10个氨基酸。
优选地，多肽不由SEQ ID NO：126或171的序列组成或不包含SEQ ID NO：126或171的序列。
根据本发明的第二十二方面，提供了核酸分子，其由编码根据本发明第二十一方面的多肽的核苷酸序列组成。
根据本发明的第二十三方面，提供了本发明第二十一方面的多肽或本发明第二十二方面的核酸分子，其用于医学，优选用于诱导免疫应答，更优选用于治疗或预防癌症。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基(包括线性、环状、部分环状或多重环状)的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰的残基或非天然存在的残基的氨基酸聚合物，例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在一个实施方案中，该术语还包括包含侧链延伸的氨基酸聚合物。在一个实施方案中，主链和/或侧链延伸包括除酰胺键以外的键。在一个实施方案中，多肽或其片段中的中断基团(interrupting group)不是氨基酸。
本文中使用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有与天然存在的氨基酸类似的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中翻译后修饰的氨基酸(如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构元件(与氢结合的α-碳、羧基、氨基和R基团)但具有修饰的R基团或修饰的主链(例如高丝氨酸、β-丙氨酸、PNA、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的化合物。短语“氨基酸模拟物”是指与天然氨基酸具有不同结构但功能相似的化合物。因此，在一个实施方案中，氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物提供与天然存在的氨基酸类似的生物学特性，尽管具有结构上的差异。
本文中与多肽相关使用的术语“片段”是指形成多肽部分的连续的氨基酸系列。多肽的“免疫原性片段”是先前定义的片段，当施用于受试者时能够引起免疫应答，例如T细胞应答。在一个实施方案中，当施用于受试者时，“免疫原性片段”能够引发CD4+T细胞应答。在一个实施方案中，当施用于受试者时，“免疫原性片段”能够引发CD4+和/或CD8+T细胞免疫应答。在一些实施方案中，免疫原性片段至少包含其来源的多肽的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。
术语“基因”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，以指代多个核苷酸的聚合物。核酸分子可以包括天然存在的核酸，或者可以包括人工核酸，例如肽核酸(PNA)、吗啉代(morpholino)(PMO)和锁定核酸以及二醇核酸和苏糖核酸。“寡核苷酸”还可以包括非核酸衍生物，例如聚合物主链、非主链修饰。
本文中使用的术语“核苷酸”是指被例如细胞酶识别的天然存在的核苷酸和合成的核苷酸类似物。
本文中使用的术语“癌症”和“肿瘤”是指受试者中存在表现出新的、异常的和/或不受控制的增殖的细胞。在一个实施方案中，细胞具有侵入邻近组织和/或扩散到身体中其他部位的能力(即细胞能够转移)。在一个实施方案中，癌症细胞是肿瘤(即异常组织块)的形式。本文中使用的术语“肿瘤”包括良性和恶性肿瘤。
本文使用的术语“治疗”是指任何部分或完全的治疗，并且包括：抑制疾病或症状，即阻止其发展；缓解疾病或症状(即导致疾病或症状消退)。
本文使用的术语“预防”是指为预防疾病发作而采取的措施。在一个实施方案中，该疾病是癌症。
本文使用的术语“抗原”是指能够在受试者中引发免疫应答的分子。在一个实施方案中，“抗原”是蛋白质或多肽，或源自蛋白质或多肽。在一个实施方案中，“抗原”能够被抗体、B细胞受体和/或T细胞受体识别。
本文使用的术语“表位”是指被抗体、B细胞受体和/或T细胞受体识别的抗原部分。本文使用的术语“表位”包括构象表位(即其由在序列上分离但通过蛋白质折叠结合在一起的氨基酸残基组成)和线性表位(例如，其为氨基酸残基的线性序列)。
本文所用的术语“抗体”是指能够特异性结合特定抗原的免疫球蛋白分子或其片段。本文所用的术语“抗体”包括选自五类免疫球蛋白中任一类的抗体：免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgA、IgD和IgE。
本文使用的术语“B细胞”(也称为“B淋巴细胞”)是指具有细胞表面B细胞受体的免疫系统的细胞。
本文使用的术语“B细胞表位”是指抗原内能够被抗体和/或B细胞受体结合的位点。在一个实施方案中，B细胞表位包含SEQ ID NO：7的序列(也称为“最小破伤风毒素表位”或“MTTE”)。
本文使用的术语“T细胞”(也称为“T淋巴细胞”)是指具有细胞表面T细胞受体的免疫系统的细胞。在一个实施方案中，术语“T细胞”包括不同类型的T细胞，例如：CD4+T细胞(也称为辅助性T细胞或Th细胞)、CD8+T细胞(也称为细胞毒性T细胞或CTL)、记忆性T细胞和调节性T细胞(Tregs)。本文使用的术语“CD4+T细胞”是指在其细胞表面上包含CD4糖蛋白的T细胞。本文使用的术语“CD8+T细胞”是指在其细胞表面上包含CD8糖蛋白的T细胞。
本文使用的术语“T细胞表位”是指抗原内能够被T细胞受体识别的位点。T细胞受体在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下识别表位。
本文使用的术语“MHC分子”是指与多肽组装并能够在细胞表面向T细胞展示多肽的蛋白质结构。MHC分子由主要组织相容性复合体内的基因编码。在一些实施方案中，术语“MHC分子”是指MHC I类分子和/或MHC II类分子。
本文使用的术语“人白细胞抗原(HLA)”是指人主要组织相容性复合体(MHC)。主要的人HLAI类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C。主要的人HLA II类基因包括HLA-DPA、HLA-DPB、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DRA和HLA-DRB。本文使用的术语“HLA等位基因”是指存在于HLA基因座的基因的替代形式。
本文使用的术语“CD4+T细胞表位”是指能够被CD4+T细胞识别的表位。CD4+T细胞表位或其一部分能够由MHC II类分子呈递并与CD4+T细胞的T细胞受体结合。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含选自SEQ ID NO：1、116和/或117的一个或多个序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：1、116和/或117的免疫原性片段，其包含SEQ ID NO：1、116和/或117的至少12个氨基酸。
本文使用的术语“CD8+T细胞表位”是指能够被CD8+T细胞识别的表位。CD8+T细胞表位或其一部分能够由MHC I类分子递呈并与CD8+T淋巴细胞的T细胞受体结合。在一个实施方案中，CD8+T细胞表位源自前列腺酸性磷酸酶(PAP)。在一个实施方案中，CD8+T细胞表位包含序列“NPILLWQPIPV”(SEQ ID NO：119)。在另一个实施方案中，CD8+T细胞表位包含选自SEQ ID NO：155至159的序列。
本文所用的术语“缀合物”是指两种或多种组分的偶联或连接，例如在包含B细胞表位序列的多肽和包含CD4+T细胞表位的序列的多肽之间。在一个实施方案中，任何两个组分之间的连接(linkage)可以是直接连接。在替代实施方案中，任何两个组分之间的连接可以是间接连接，例如通过本文定义的核心。缀合可以通过非共价连接(例如通过离子键、氢键、疏水相互作用、π-π相互作用、范德华相互作用、亲和相互作用和主客体相互作用中的一个或多个相互作用)或共价连接。在优选实施方案中，所述连接是共价连接。
本文使用的术语“混合物(cocktail)”是指两种或多种化合物的混合物。在一个实施方案中，混合物中的化合物彼此不连接或偶联。在一些实施方案中，混合物包括两种或多种不同多肽、两种或更多种不同核酸分子、两种或多种不同缀合物和/或其任何组合的混合物。在一个实施方案中，多肽、核酸分子和/或缀合物在包含不同氨基酸或核苷酸序列的意义上是不同的。
本文使用的术语“通用肿瘤抗原”是指在高比例的肿瘤类型中表达的抗原。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原在至少50％、60％或70％或所有肿瘤类型中表达，更优选在所有肿瘤类型的至少80％、85％或90％中表达。在另一个实施方案中，通用肿瘤抗原也在每种肿瘤类型中的高比例患者中表达。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原通常在每种肿瘤类型中的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的患者中表达。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原在肿瘤发生中具有直接作用。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原选自由端粒酶逆转录酶、存活蛋白、DNA拓扑异构酶2-α(Top2α)、细胞色素P4501B1(CYP1B1)和E3泛素蛋白连接酶Mdm2组成的组中选择。优选地，通用肿瘤抗原是人端粒酶逆转录酶(hTERT)。
本文所用的短语“CD4+T细胞表位在至少50％的群体中具有免疫原性”是指群体中CD4+T淋巴细胞表位能够引发免疫应答的个体的比例。在一个实施方案中，群体是全球的群体。也就是说，群体不局限于特定的地理区域。在一个实施方案中，群体是来自特定地理区域的群体。在一个实施方案中，群体是欧洲群体、北美群体、南亚和/或中美洲群体、北非、南非、东非、西非、中非和/或撒哈拉以南非洲群体、西印度群岛群体、西亚、东亚、东北亚、南亚、东南亚和/或西南亚群体、大洋洲群体和/或澳大利亚群体中的任何一个或多个。在另一个实施方案中，群体是一般群体。也就是说，群体既包括健康的个体，也包括患有癌症等疾病的个体。在替代实施方案中，群体由其是癌症患者的个体组成。在另一个实施方案中，癌症患者是具有非小细胞肺癌、前列腺癌和/或恶性黑色素瘤的患者。在一个实施方案中，该群体还包括患有胰腺癌的癌症患者。在一个实施方案中，通过使用来自个体的血液样本的T细胞增殖测定法(3H-胸苷)测量T细胞免疫应答(如先前Inderberg-Suso等人，Oncoimmunology.2012Aug 1：1(5)：670-686所述)。在一个实施方案中，如果对CD4+表位的免疫应答是背景的至少2倍(刺激指数，SI≥2)，则T细胞免疫应答被认为是阳性的。在替代实施方案中，如果对CD4+表位的免疫应答是背景的至少3倍(刺激指数，SI≥3)，则T细胞免疫应答被认为是阳性的。在一个实施方案中，群体中CD4+T细胞表位具有免疫原性的个体比例是通过测量从群体中随机选择的至少50个个体的样本中对CD4+表位的T细胞免疫应答来确定的。在另一个实施方案中，样本包括从群体中随机选择的至少100个个体。在样本中测量的T细胞免疫应答被认为是整个群体的代表。在一个实施方案中，使用替代方法来测量T细胞免疫应答。在一个实施方案中，该方法包括延迟型超敏反应(DTH)测定、ELISpot测定和/或流式细胞术。
本文所用的短语“对B细胞表位特异性的抗体结合缀合物”是指当包含在缀合物内时对B细胞表位特异性的抗体与表位相互作用的能力。在一个实施方案中，抗体是单克隆或多克隆抗体，优选多克隆抗体。在一个实施方案中，B细胞表位包含SEQ ID NO：7(MTTE)的序列，抗体是抗MTTE抗体。在一个实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方案测定对B细胞表位特异性的抗体结合缀合物的能力。在一个实施方案中，使用间接或夹心ELISA方案。在一个实施方案中，使用如实施例9或13中所述的ELISA方案。
本文所用的短语“诱导针对B细胞表位的B细胞应答的疫苗”是指能够在已施用的受试者中引发(通过B细胞)产生对B细胞表位特异性的抗体的疫苗。在一个实施方案中，针对B细胞表位的B细胞应答是使用ELISA方案通过测量源自受试者的样本中的抗体数量来确定的。合适的ELISA方案先前已经描述过，例如在Fletcher等人，J Immunol.2018Jul 1；201(1)：87-97，将其并入本文作为参考。
本文使用的术语“破伤风疫苗”是指能够在受试者中引发针对破伤风毒素的免疫应答的疫苗。在一个实施方案中，“破伤风疫苗”包括破伤风类毒素、其片段和/或破伤风毒素片段。破伤风类毒素是破伤风毒素的一种灭活形式。在一个实施方案中，破伤风疫苗与其他抗原和/或类毒素组合提供。在一个实施方案中，“破伤风疫苗”是白喉、破伤风和百日咳(DTP)组合疫苗或任何含有破伤风类毒素的疫苗方案。
本文所使用的短语“诱导针对B细胞表位的B细胞应答的疫苗已至少两次施用于受试者”指的是初免(prime)-加强免疫策略。也就是说，受试者至少接种了第一(初免)剂量的疫苗，然后至少接种了第二(加强)剂量的疫苗。在一个实施方案中，用于初免剂量的疫苗的特定组成与用于一个或多个加强剂量的疫苗相同。在替代实施方案中，用于初免剂量的疫苗的特定组合物不同于用于一个或多个加强剂量的疫苗的特定组合物，前提是疫苗仍然能够诱导针对B细胞表位的B细胞应答。在一个实施方案中，在使用本发明的缀合物进行初免-加强免疫策略之前，使用含有破伤风类毒素的疫苗来增强抗破伤风(例如抗MTTE)抗体滴度。
本文所使用的短语“针对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在”是指能够识别CD4+T细胞表位的CD4+T细胞的存在。当CD4+T细胞表位或其一部分呈递于适当的MHC分子上时，CD4+T细胞识别并能够结合CD4+T细胞表位或其中的一部分。在一个实施方案中，可以通过如上所述的T细胞增殖测定(3H-胸苷)来确认“针对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在”。
本文所用的短语“检测对B细胞表位特异性的抗体的量或缺失”是指测定样品中存在的并且能够结合B细胞表位的抗体的量或缺失。在一个实施方案中，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来检测抗体的量或缺失。在一个实施方案中，计算抗体滴度。
本文使用的术语“源自受试者的样本”是指从受试者获得的样本(即其是离体的)。在一个实施方案中，样本是血液样本。在一个实施方案中，样本是血浆样本或稀释的血浆样本。
本文使用的术语“自身抗原”是指源自人体内天然存在的蛋白质的抗原。一般来说，在正常条件下，由于胸腺中T细胞的阴性选择，免疫系统不会对自身抗原产生反应。然而，在患有癌症的受试者中，自身抗原可能被免疫系统识别为外来的(例如，由于癌症细胞过表达源自自身抗原的蛋白质，或在癌症发生的组织中不适当地表达自身抗原)，并且针对自身抗原产生T细胞免疫应答。在一个实施方案中，“自身抗原”源自端粒酶逆转录酶。
本文中使用的术语“肿瘤相关抗原”是指与肿瘤或癌症细胞以及正常细胞相关的抗原。在一些实施方案中，“自身抗原”是“肿瘤相关抗原”。
本文中使用的短语“对缀合物的临床相关反应”是指癌症患者的改善的临床结果。在一个实施方案中，改善的临床结果是部分或完全反应(也称为部分或完全缓解)或稳定的疾病。完全反应是指作为对治疗的反应身体中可检测到的肿瘤或癌症消失；部分响应是指作为对治疗的反应肿瘤大小或身体中癌症的程度减少；稳定的疾病意味着身体中的肿瘤或癌症的程度或严重程度既没有减少也没有增加。
在本说明书中，使用EMBOSS针成对序列比对(EMBOSS Needle Pairwise SequenceAlignment)(Rice等人，Trends Genet.2000Jun；16(6)：276-7；Nucleic AcidsRes.2019Jul 2；47(W1)：W636-W641)来确定两个序列之间的百分比“同一性”，使用默认参数。特别是，EMBOSS Needle可以使用以下URL在互联网上访问：https：//www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/。
本文所用的术语“主体部分”是指能够附接到如本文所定义的一个或多个第一连接基团和本文所定义的一个或者多个第二连接基团的任何主链。只要主体部分将所述第一连接基团连接到所述第二连接基团，则主体部分没有特别限制。主体部分的非限制性实例包括根据式1的主体部分、氨基酸、肽(例如根据式2的主体部分)、碳水化合物、其他支架、其他生物分子或其组合。
本文中使用的术语“(AA)n”是指以下直链结构：
其中Raa表示氨基酸侧链(例如天然(包括甘氨酸即H)或非天然氨基酸的侧链)，其中单个AA基团可以在任何方向上连接到下一个AA基团(例如，一个AA基团的羰基部分连接到另一个AA基团的胺部分、一个AA基团的羰基部分通过另一个AA基团的侧链被连接、一个AA基团的胺部分通过另一个AA基团的侧链被连接、或者一个AA基团的侧链通过另一个AA基团的侧链被连接)，并且其中单个AA基团任选地通过接头彼此间隔开；或者，在单个AA基团基于具有仲胺的氨基酸(例如AA是脯氨酸)的情况下，则Raa和AA基团的N原子与它们所附接的碳原子一起形成具有以下结构的环：
在术语“(AA)n”的上下文中使用的术语“C端”指的是“(AA)n”结构的任何末端羰基。因此，当一个基团连接到C端时，它通过未附接到接头或其他AA基团的末端羰基被连接。
在术语“(AA)n”的上下文中使用的术语“N端”指的是“(AA)n”结构的末端胺基。因此，当一个基团连接到N端时，它通过未附接到接头或其他AA基团的末端胺基团被连接。
本文中使用的术语“第一连接基团”是指能够与第一反应物(例如，包括B细胞表位序列的多肽)进行偶联反应以形成非共价连接或共价连接，并且因此能够形成第一连接元件。在优选的实施方案中，所述连接是共价连接，例如通过环加成反应(例如，1，3-偶极环加成，包括铜催化的叠氮-炔烃环加成和应变促进的叠氮/炔烃环加成或叠氮-烯烃环加成；四嗪连接，例如与四嗪和环炔烃或反式环烯烃连接；Diels-Alder环加成反应)，亲核取代，迈克尔反应，或点击或点击样反应的其他实例。第一连接基团的非限制性实例包括炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物。当引用一个或多个第一连接基团时，第一连接基团中的每一个可以彼此相同或不同。在某些情况下，第一连接基团中的每一个彼此相同。
本文中使用的术语“第二连接基团”是指能够与第二反应物(例如，包括CD4+T细胞表位序列的多肽)进行偶联反应以形成非共价连接或共价连接，并且因此能够形成第二连接元件。在优选的实施方案中，所述连接是共价连接，例如通过环加成反应(例如，1，3-偶极环加成，包括铜催化的叠氮-炔烃环加成和应变促进的叠氮/炔烃环加成或叠氮-烯烃环加成：四嗪连接，例如与四嗪和环炔烃或反式环烯烃连接：Diels-Alder环加成)，亲核取代，迈克尔反应，或点击或点击样反应的其他实例。第二连接基团的非限制性实例包括炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物。当引用一个或多个第二连接基团时，第二连接基团中的每一个可以彼此相同或不同。在某些情况下，第二连接基团中的每一个彼此相同。第二连接基团可以不同于第一连接基团。第二连接基团可以与第一连接基团正交。
本文所用的术语“第三连接基团”是指能够与第三反应物(例如本文所定义的另一种物质)发生偶联反应以形成非共价连接或共价连接，并且因此能够形成第三连接元件。在优选的实施方案中，所述连接是共价连接，例如通过环加成反应(例如，1，3-偶极环加成，包括铜催化的叠氮-炔烃环加成和应变促进的叠氮/炔烃环加成或叠氮-烯烃环加成：四嗪连接，例如与四嗪和环炔烃或反式环烯烃连接：Diels-Alder环加成)，亲核取代，迈克尔反应，或点击或点击样反应的其他实例。第三连接基团的非限制性实例包括炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物。当引用一个或多个第三连接基团时，第三连接基团中的每一个可以彼此相同或不同。在某些情况下，第三连接基团中的每一个彼此相同。第三连接基团可以不同于第一连接基团。第三连接基团可以与第一连接基团正交。第三连接基团可以不同于第二连接基团。第三连接基团可以与第二连接基团正交。第三连接基团可以不同于第一连接基团和第二连接基团。第三连接基团可以与第一连接基团和第二连接基团正交。
本文中使用的术语“第一连接元件”是指在第一连接基团和第一反应物(例如包括B细胞表位序列的多肽)之间形成的非共价连接或共价连接。第一连接元件的非限制性实例包括1，2，3-三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键(例如由硫醇-烯反应形成)。在形成第一连接元件的区域异构体(例如1，2，3-三唑和/或开环马来酰亚胺-硫醇加合物的区域异构体)的情况下，本发明包括区域异构体产物的混合物，以及纯化的单独的区域异构体。
本文所用的术语“第二连接元件”是指在第二连接基团和第二反应物(例如包含CD4+T细胞表位序列的多肽)之间形成的非共价连接或共价连接。第二连接元件的非限制性实例包括1，2，3-三唑键、二氢哒嗪、哒嗪键和硫化物键(例如由硫醇-烯反应形成)。在形成第二连接元件的区域异构体(例如1，2，3-三唑和/或开环马来酰亚胺-硫醇加合物的区域异构体)的情况下，本发明包括区域异构体产物的混合物，以及纯化的单独的区域异构体。
本文使用的术语“第三连接元件”是指在第三连接基团和第三反应物(例如本文定义的另一种物质)之间形成的非共价连接或共价连接。第三连接元件的非限制性实例包括1，2，3-三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键(例如由硫醇-烯反应形成)。在形成第三连接元件的区域异构体(例如1，2，3-三唑和/或开环马来酰亚胺-硫醇加合物的区域异构体)的情况下，本发明包括区域异构体产物的混合物，以及纯化的单独的区域异构体。
本文所用的术语“正交”是指可以在另一个不同官能团(例如第二连接基团和/或第三连接基团)存在下选择性地与反应物(例如与第一反应物，例如亲电体/亲核体、二烯/亲二烯体或偶极/亲偶极体)发生反应的官能团(例如作为亲核体/亲电体、亲二烯体/二烯或亲偶极体/偶极的第一连接基团)，其中反应物基本上不与另一个官能团反应(例如由于不同类型的官能团对、反应条件的差异、富电子官能团和贫电子官能团的差异)。例如，与另一个不同官能团相比，该官能团对反应物的选择性可以是10倍或更大(例如，就反应物的转化％相对于另一个不同官能团的转化％而言)，优选15倍或更大的选择性，更优选20倍或更大的选择性，甚至更优选25倍或更大的选择性，甚至更优选30倍或更大的选择性，还甚至更优选40倍或更大的选择性，还甚至更优选50倍或更大的选择性，还甚至更优选60倍或更大的选择性，还甚至更优选70倍或更大的选择性，还甚至更优选80倍或更大的选择性，还甚至更优选90倍或更大的选择性，最优选100倍或更大的选择性。
本文中使用的术语“核心”是指包括主体部分、附接到主体部分的一个或多个第一连接基团和附接到主体部的一个或者多个第二连接基团的化合物，其中第一连接基团与第二连接基彼此正交。核心不受特别限制，只要其能够通过非共价连接或共价连接将两个或多个组分(例如包括B细胞表位序列的多肽和包括CD4+T细胞表位序列的多肽)连接起来。
术语“通过AA基团之一的侧链”是指氨基酸侧链残基(例如-NH2，OH，包括-COOH，SH)通过氨基酸侧链残基的等效自由基形式(例如-NH-，-O-，-S-)连接。
此处使用的符号：
是指以下区域异构体的区域异构体混合物：
此处使用的符号：
是指以下区域异构体的区域异构体混合物：
本文中使用的术语“末端炔烃”是指包含-C≡C-H部分的基团。
本文中使用的术语“环炔烃”是指在环中包含8-12个碳原子，例如8-10个碳原子的封闭的非芳香单环、双环或三环，并且其包含至少一个内环碳-碳三键。环中的碳原子可以被杂原子(例如氮原子)取代。环炔烃的非限制性实例可包括环辛炔、双环壬炔(例如双环[6.1.0]非-4-炔)、二苯并环辛炔和氮杂二苯并环辛炔。
本文中使用的术语“马来酰亚胺”是指以下结构：
其中R’和R”独立地选择自氢、卤素、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；和
波浪线表示与化合物其余部分的连接。
术语“α-卤代羰基”是指下列结构：
其中R’和R”独立地选择自氢、卤素、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；
X是卤素；和
波浪线表示与化合物其余部分的连接。
本文所用的术语“卤代(halo)”或“卤素(halogen)”是指氟、氯、溴或碘的任何原子团。
本文所用的术语“烷基”，其本身或作为另一基团的一部分，是指最多12个碳的直链和支链基团。例如，烷基可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子。C1-C12烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基基团。优选地，本文所用的术语“烷基”，其本身或作为另一基团的一部分，可以指包含1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子和甚至更优选1-4个碳原子的直链或支链基团。“任选取代的烷基”可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。例如，“任选取代的烷基”基团可以包括“卤代烷基”基团。
本文所用的术语“卤代烷基”，其本身或作为另一基团的一部分，是指含有至少一个卤原子的至多12个碳原子的直链和支链基团。例如，卤代烷基可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子。优选地，本文所用的术语“卤代烷基”，其本身或作为另一基团的一部分，可指包含1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子和甚至更优选1-4个碳原子的直链或支链基团，并包含至少一个卤原子。
例如，“卤代烷基”基团可以是氟烷基或全氟烷基。
优选地，“卤代烷基”基团可以是C1-C6氟烷基，或C1-C6全氟烷基。
甚至更优选地，“卤代烷基”可以是C1-C4氟烷基基团，或C1-C4全氟烷基基团。例如，“卤代烷基”基团可以包括二氟甲基、三氟甲基或五氟乙基。
本文中使用的术语“环烷基”是指包含含有3至8个碳原子，例如3至6个碳原子的闭环的烷基基团。例如，环烷基基团可以含有3、4、5、6、7或8个碳原子。环烷基基团的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、(环己基)甲基和(环己基)乙基。“任选取代的环烷基”基团可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。
本文中使用的术语“杂环烷基”是指饱和或部分饱和的3-7元单环或7-10元双环系统，其由碳原子和1-4个独立地选自由O、N和S组成的组的杂原子组成，其中氮和硫杂原子可以任选地氧化，氮可以任选地季铵化，并且包括任何双环基团，其中任何上述定义的环与苯环稠合，并且其中如果所得到的化合物是稳定的，则所述环可以在碳或氮原子上被取代。常见的饱和或部分饱和的杂环烷基基团的非限制性实例包括氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异二氢氮茚基、奎宁环基、吗啉基、异色满基、色满基、吡唑烷基、吡唑啉基、季酮酰基(tetronoyl)和四酰基(tetramoyl)基团。“任选取代的杂环烷基”可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。
本文所用的术语“烷氧基”，其本身或作为另一基团的一部分，是指如本文所定义的通过氧原子附加到母体分子部分的烷基。例如，烷氧基可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子。优选地，本文所用的术语“烷氧基”，其本身或作为另一基团的一部分，可指通过一个氧原子附加到母体分子部分的包含1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子和甚至更优选1-4个碳原子的直链或支链基团。烷氧基基团的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。“任选取代的烷氧基”可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。例如，“任选取代的烷氧基”基团可以包括“卤代烷氧基”基团。
本文所用的术语“卤代烷氧基”，其本身或作为另一基团的一部分，是指最多12个碳原子的直链自由基和支链自由基，其包括至少一个卤素原子并通过氧原子附加到母体分子部分上。例如，卤代烷氧基基团可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子。优选地，本文所用的术语“卤代烷氧基”，其本身或作为另一基团的一部分，可指包含1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子和甚至更优选1-4个碳原子的直链或支链基团，其包含至少一个卤素原子并通过一个氧原子附加到母体分子部分。
例如，“卤代烷氧基”可以是氟烷氧基或全氟烷氧基基团。
优选地，“卤代烷氧基”基团可以是C1-C6氟烷氧基或C1-C6全氟烷氧基基团。
甚至更优选的是，“卤代烷氧基”基团可以是C1-C4氟烷氧基基团，或C1-C4全氟烷氧基基团。例如，“卤代烷氧基”基团可包括二氟甲氧基、三氟甲氧基或五氟乙氧基。
本文所用的术语“烷酰基”，其本身或作为另一基团的一部分，是指如本文所定义的烷基，并通过氧原子通过Rx-C(＝O)O-基团附加到母体分子部分上，其中Rx表示烷基基团。例如，烷酰基基团可以含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个碳原子。优选地，本文所用的术语“烷酰基”，其本身或作为另一基团的一部分，可指包含2-8个碳原子，更优选2-6个碳原子和甚至更优选2-4个碳原子的直链或支链基团，并通过氧原子通过Rx-C(＝O)O-基团附加到母体分子部分上，其中Rx表示烷基基团。烷酰基基团的非限制性实例包括乙酰氧基，丙酰氧基，丁酰氧基和戊酰氧基。“任选取代的烷酰基”可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。
本文中单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“芳基”是指环中含有6至14个碳原子的单环，双环或三环芳族基团。常见的芳基基团包括C6-C14芳基，例如C6-C10芳基。C6-C14芳基基团的非限制性实例包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、天青烯基(azulenyl)、联苯基、联亚苯基和芴基。“任选取代的芳基”可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。
本文使用的术语“杂芳基”是指具有5至14个环原子(例如，5至10个环原子)并含有碳原子和1、2或3个氧、氮或硫杂原子的芳族基团。杂芳基基团的例子包括噻吩基(thienyl)(苯硫基(thiophenyl))、苯并[b]噻吩基、萘并[2，3-b]噻吩基、噻蒽基(thianthrenyl)、呋喃基(furyl)(呋喃基(furanyl))、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基(chromenyl)、夹氧杂蒽基、苯并氧杂蒽基(phenoxanthiinyl)、吡咯基(包括但不限于2H-吡咯基)、咪唑基、吡唑基、吡啶基(pVridyl)(吡啶基(pyridinyl))(包括但不限于2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基)、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、吡啶基(包括但不限于2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基)、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基(indolizinyl)、异吲哚基(isoindolyl)、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹啉基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基(naphthyridinyl)、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基(acrindinyl)、萘嵌间二氮杂苯基(perimidinyl)、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吩嗪基、异噻唑基(isothiazolyl)、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基(furazanyl)、吩噁嗪基(phenoxazinyl)、酞嗪-1-酮、1，4-二氢喹喔啉-2，3-二酮、7-氨基异香豆素、吡啶并[1，2-α]嘧啶-4-酮、吡唑并[1，5-α]嘧啶基，包括但不限于吡唑并[1，5-α]嘧啶-3-基、1，2-苯并异噁唑-3-基、苯并咪唑基、2-羟吲哚基和2-氧代苯并咪唑基。如果杂芳基在环中含有氮原子，则这种氮原子可以是N-氧化物的形式，例如吡啶基N-氧化物，吡嗪基N-氧化物和嘧啶基N-氧化物。“任选取代的杂芳基”基团可以包括如下所述的术语“任选取代”的取代基。
本文中使用的术语“亚烷基”是指具有1至12个碳原子的二价直链和支链基团。优选地，亚烷基基团是具有1至6个碳原子的直链或支链亚烷基，更优选具有1至4个碳原子的直链或支链亚烷基。如本文所述，亚烷基基团可以任选地包含一个或多个“取代基”。
如本文所述，化合物可以含有“任选取代的”部分。通常，术语“被取代”，无论之前是否有术语“任选地”，都意味着指定部分的一个或多个氢原子被合适的取代基取代。除非另有说明，“任选取代的”基团可以在该基团的每个可取代位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置可以被选自指定基团的多于一个取代基取代时，取代基可以在每个位置相同或不同。本发明设想的取代基组合优选是那些导致形成稳定或化学上可行的化合物的取代基组合。如本文所用，术语“稳定的”是指当经受允许其生产，检测以及在某些实施方案中其回收，纯化和用于本文所公开的一个或多个目的条件时没有实质性改变的化合物。
例如，本文使用的术语“任选取代的”可以是指当从非限制性实例中选择至少一个取代基时，例如氧代、羟基、卤素、氰基、任选取代的烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的烷氧基、卤代烷氧基、任选取代的烷酰基，任选取代的氨基，任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。
优选地，本文使用的术语“任选取代的”可指当从卤素、羟基、C1-C6烷基基团、C1-C6卤代烷基基团、C1-C6烷氧基基团和C1-C6卤代烷氧基基团中选择至少一个取代基时。
更优选地，本文使用的术语“任选取代的”可指从卤素、羟基、C1-C4烷基基团、C1-C4卤代烷基基团、C1-C4烷氧基基团和C1-C4卤代烷氧基基团中选择至少一个取代基时。
甚至更优选地，本文使用的术语“任选取代的”可指当从氟、羟基、甲基基团、三氟甲基基团、甲氧基基团和三氟甲氧基基团中选择至少一个取代基时。
本发明的缀合物可以“盐”形式提供。本文使用的术语“盐”是指本文所述化合物的盐，其来源于合适的无机和有机酸和碱。碱性基团的盐的实例包括由无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有机酸(例如三氟乙酸、乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(例如离子交换)形成的盐。其他盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐，十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸酯、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。源自适当碱的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-C4烷基)4盐。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。适当时，其他盐包括使用抗衡离子如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。“水合物”是指水分子与溶质分子或离子结合形成的复合物。“溶剂化物”是指溶剂分子与溶质分子或离子结合形成的复合物。溶剂可以是有机化合物、无机化合物或两者的混合物。溶剂化物意味着包括水合物。溶剂的一些实例包括但不限于甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜和水。通常，溶剂化形式等同于未溶剂化形式，并且包含在本公开的范围内。本公开的某些化合物可以作为固体材料存在，例如多种晶体或无定形形式。一般来说，所有物理形式对于本公开所预期的用途都是等效的，并且旨在在本公开的范围内。
“互变异构体”是指由分子中一个原子的质子转移到另一个原子的现象所产生的化合物(参见，Jerry March，Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms andStructures，第四版，John Wiley&Sons，第69-74页(1992))。互变异构体还指存在于平衡状态的并且易于从一种异构体形式转化为另一种异构体形式的两种或两种以上结构异构体中的一种。实例包括酮-烯醇互变异构体，例如丙酮/丙烯-2-醇，亚胺-烯胺互变异构体等，环链互变异构体，例如葡萄糖/2，3，4，5，6-五羟基-己醛等，含有-N＝C(H)-NH-环原子排列的杂芳基基团的互变异构形式，例如吡唑，咪唑，苯并咪唑，三唑和四唑。如果化合物含有例如酮基或肟基或芳族部分，则可能发生互变异构现象(“互变异构”)。本文所述的化合物可以具有一种或多种互变异构体，因此包括各种异构体。技术人员会认识到其他互变异构环原子排列是可能的。这些化合物的所有此类异构形式均明确包含在本公开中。
“异构体”是指具有相同分子式但其原子键的性质或顺序或其原子在空间中的排列不同的化合物。原子在空间排列不同的异构体被称为“立体异构体”。“立体异构体”和“多个立体异构体”是指具有一个或多个不对称中心或具有不对称取代的双键的以不同立体异构体形式存在的化合物，因此可以作为单独的立体异构体或作为混合物产生。立体异构体包括对映体和非对映体。不是互为镜像的立体异构体称为“非对映体”，彼此互为非重叠镜像的立体异构体称为“对映体”。例如，当一个化合物具有不对称中心时，它与四个不同的基团相连，就可能形成一对对映体。对映体的特征可以是其不对称中心的绝对构型，并且可以通过Cahn和Prelog的R和S测序规则来描述，或者通过分子旋转偏振光平面的方式来描述，并指定为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)异构体)。手性化合物可以作为单独的对映体或其混合物存在。含有相等比例对映体的混合物称为“外消旋混合物”。除非另有说明，本说明书旨在包括单独的立体异构体以及混合物。立体化学测定和立体异构体分离的方法在本领域是众所周知的(参见Advanced Organic Chemistry第4章中的讨论，第6版J.March，JohnWiley and Sons，纽约，2007)，一个或多个立体中心的手性不同。
本公开还包括本公开的同位素标记的化合物，这些化合物与本文所述的化合物相同，但事实是一个或多个原子被具有不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子所取代。可掺入本公开化合物中的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如但不限于2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。除非另有说明，当一个位置被专门指定为“H”或“氢”时，该位置被理解为具有天然丰度的氢同位素组成或其同位素，例如氘(D)或氚(3H)。本公开的某些同位素标记化合物(例如，用3H和14C标记的化合物)可用于化合物和/或底物组织分布测定。氚化(即3H)和碳-14(即14C)和氟-18(即18F)同位素因其易于制备和可检测性而有用。此外，用较重的同位素如氘(即2H)取代可以提供由更高的代谢稳定性(例如，体内半衰期增加或剂量需求减少)产生的某些治疗优势，因此在某些情况下可能是优选的。本公开的同位素标记化合物通常可以通过以下类似于本文所述的程序，通过用同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂来制备。
附图的简要说明
图1A是显示根据本发明一个实施方案的缀合物的示意图。在本实施方案中，缀合物包含三个多肽，每个多肽包含通过间隔区序列(2)连接到核心(3)的SEQ ID NO：7(1)的MTTE序列。这使得MTTE序列(SEQ ID NO：7)能够与包含源自通用肿瘤抗原的CD4+T细胞表位的多肽(4)连接。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位是SEQ ID NO：1。在其他实施方案中，通用肿瘤抗原来自具有广泛HLA覆盖的替代hTERT肽。在另一个实施方案中，包含CD4+T细胞表位的多肽包含另一个表位。图1B是显示本发明实施方案中激发免疫应答的建议的机制的示意图。首先，存在(1)合成肽缀合物的胃肠外施用，然后(2)肽缀合物通过清除剂受体和抗体介导的预先存在的抗MTTE抗体的摄取被树突细胞摄取。(3)通过表位处理和CD4+表位递呈到CD4+辅助T细胞，通过活化MTTE特异性B细胞成为产生可溶性抗破伤风抗体的浆细胞来提供额外的反馈。(4)正反馈机制通过缀合物中的CD4+T辅助表位增强抗体产生和免疫复合物形成。(5)活化的CD4+T细胞然后是肿瘤特异性的(例如端粒酶特异性的)，并且可以迁移到肿瘤以增强肿瘤中的免疫应答(表位扩散)。
图2A至2E是文氏图，其显示了特定多肽组合之间覆盖的HLA I类(图2A、2B和2D)或HLA II类等位基因(图2C和2E)的比较。图2A显示了SEQ ID NO：116(GV_LSE)和1(P719-20)之间的比较。图2B和2C显示了SEQ ID NO：116(GV_LSE)和118(C端肽)之间的比较。图2D和2E显示了SEQ ID NO：116(GV_LSE)和126(GV1001)之间的比较。
图3A和3B是显示分别基于HLA I类表位和HLA II类表位由SEQ ID NO：1(P719-20)和116(GV_LSE)的多肽提供的预测的群体覆盖度的图。
图4A和4B是显示分别基于HLA I类表位和HLA II类表位由SEQ ID NO：126(GV1001)和116(GV_LSE)的多肽提供的预测的群体覆盖度的图。
图5A和5B是显示分别基于HLA I类表位和HLA II类表位由SEQ ID NO：126(GV1001)、1(P719-2)和116(GV_LSE)多肽提供的预测的群体覆盖度的图。
图6A和6B是显示分别基于HLA I类表位和HLA II类表位由SEQ ID NO：126(GV1001)、1(P719-20)、116(GV_LSE)和118(C端肽)多肽提供的预测的群体覆盖度的图。
图7A是显示通过ELISA在雌性C57BL/6小鼠的血液样本中测量的抗MTTE IgG1抗体滴度的图，所述雌性C57BL/6小鼠已被施用包含具有氨基酸序列AVGALEGSRNQDWLGVPRQL(SEQ ID NO.54)的合成的长肽(SLP)的缀合物，其在小鼠中不包括已知的活性CD4+T细胞表位(“皮下注射的小鼠(缀合物2nmol)”)或已被施用单克隆抗MTTE IgG1抗体作为对照(“皮下注射的小鼠(aMTTE-IgG1)”)。图7B是显示通过ELISA在小鼠血液样本中测量的抗MTTE-IgG1抗体滴度的图，所述小鼠已被施用包含具有氨基酸序列ARWWWMHHNMDLIGGAKxVAAWTLKAu(SEQ ID NO.55)的SLP的缀合物，其包括通用CD4+T细胞表位“PADRE”(“缀合物：MTTE3-HY-PADRE”)或已被单独施用SLP，无缀合(“SLP：HY-PADRE”)。
图8A是实施例8实验中使用的初免-加强疫苗接种计划的示意图。图8B显示了雄性兔子的抗MTTE抗体滴度，这些兔子皮下接种了四次破伤风类毒素(TTd)疫苗(第1、3、5和7周)，然后皮下接种了低剂量、中剂量或高剂量的癌症疫苗TENDU。在第8周和第15周采集用于血清学分析的血浆样本。兔抗MTTE抗体滴度通过Capra Science抗体AB采用内部ELISA测定。使用配对t检验**P＜0.01：ns＝无显著性。图8C为提供“TENDU”疫苗中包括的LUG1-6缀合物的详细信息的表。
图9显示了GMP LUG1-6构建体与人抗MTTE抗体的结合。图9A显示了缀合物与单克隆人IgG1抗MTTE抗体的结合。将缀合物以一定浓度(0.000457-1nmol/ml)涂布在ELISA平板上。使用人重组抗MTTE-IgG1抗体作为一抗，并使用抗人κ轻链二抗进行检测。图9B显示了缀合物与含有多克隆人抗MTTE抗体的血清的结合。将缀合物以一定浓度(从0.004-1nmol/ml)涂布在ELISA平板上，并与稀释的供体血浆一起孵育。使用抗人κ轻链二抗进行检测。
图10显示了用LUG2缀合物(已知含有DR4 CD4+T细胞表位)给动物接种对抗MTTE滴度的影响(A)，以及如实施例10中所示HLA-DR4小鼠接种LUG2后T细胞应答的ELISPOT分析(B)。ELISPOT通过将脾细胞与合成的长肽UV02(SEQ ID NO：143)和UV08(SEQ ID NO：144)孵育48小时来进行。SEB用作阳性对照，未经处理的脾细胞用作阴性对照。
图11A显示了实施例11的实验设计的示意图，其中将SEQ ID NO：1的多肽施用于HLA-DR4转基因小鼠。图11B是ELISpot测定的结果图，其中在用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1与抗CD4抗体联合或作为阴性对照的单独的细胞刺激脾细胞后测量T细胞应答。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验进行统计分析：“**”表示p＜0.01，“ns”表示不显著。
图12A是显示当与作为抗原呈递细胞的EBV细胞共培养物中暴露于0.5、1.5和5μM浓度的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：52或缀合物CD12B时，对SEQ ID NO：1特异性的表达GFP的T细胞的百分比的图。每个条代表SEQ ID NO：1和CD12B的重复的平均值+/-SD，而SEQ ID NO：52作为每个浓度的单个样本运行。图12B是显示当暴露于0.5、1.5和3μM浓度的缀合物CD12B或CD20B时，或当暴露于0.5、1.5和5μM浓度SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：52时，对SEQ ID NO：1特异性的表达GFP的T细胞的百分比的图。
图13A的图和13B的表分别显示了夹心ELISA实验的结果，其中评估了缀合物与来自血浆产品TetaQuin的抗MTTE多克隆抗体的结合情况。
图14A的图和14B的表分别显示了间接ELISA实验的结果，其中评估了缀合物与含有多克隆抗体的人血清的结合情况(血清源自在血液采样前最近接种了破伤风类毒素的供体)。
图15A的图和图15B的表分别显示了间接ELISA实验的结果，其中评估了缀合物与含有多克隆抗体的人血清的结合情况(血清源自在血液采样前最近接种了破伤风类毒素的供体)。
图16A是实施例14的实验设计示意图。图16B是显示ELISpot测定结果的图，其中用SEQ ID NO：7(MTTE)或SEQ ID NO：1(P719-20)的多肽刺激从先前接种了SEQ ID NO：1/CpG或缀合物CD12B的转基因HLA-A2/HLA-DR1小鼠获得的脾细胞。使用Sidak′s多重比较检验进行统计分析(*p＜0.05：“ns”＝不显著)。图16C和16D显示了ELISpot测定结果的图，其中来自CD12B暴露动物的脾细胞分别在存在或不存在抗-CD8(图16C)或抗-CD4抗体(图16D)的情况下用来自SEQ ID NO：1的多肽刺激，所述多肽包含预测的MHC I类或II类表位。使用graphpad和Sidak′s多重比较检验进行统计分析(*p＜0.05：**p＜0.01：“ns”＝无显著性)。
图17涉及血清阳性或血清阴性HLA-DR4小鼠中CD20B缀合物的免疫原性的体内评估。图17A是如实施例15中所述实验结束时为检测小鼠中抗MTTE抗体水平而测量的光密度(OD)的图。通过Mann-Whitney检验评估显著性*p＝0.0286。图17B是显示血清阳性动物在CD20B暴露前和暴露后的抗MTTE OD值(x轴)与对UV18和UV19组合的肽混合物刺激反应的T细胞应答(y轴)之间的相关性分析的图。Pearson r＝0.9348。绘制的曲线是一条简单的回归线，具有最佳拟合线的95％置信带。使用Graph pad prism进行分析。图17C和17D是显示ELISpot测定的结果的图，该测定用于测量施用缀合物CD20B或在IFA和CpG中配制的SEQ IDNO：1多肽的小鼠的脾细胞刺激后的T细胞应答。使用UV18/19(图17C)的组合或单独使用UV16(图17D)进行刺激。
图18是显示了根据本发明一个实施方案的缀合物的示意性结构。在图的顶部示显示了包括主体部分(椭圆形)、三个第一连接基团(中空圆形矩形)和第二连接基团(空心五边形)的核心。核心可与三个B细胞表位相连，在本例中MTTE(深色填充的圆角矩形)；以及包含CD4+T细胞表位的SLP(深色填充的五边形)。这形成如图底部所示的3+1缀合物，通过第一连接元件(浅阴影的圆角矩形)连接到B细胞表位，并通过第二连接元件(淡阴影的五边形)连接到包含CD4+T细胞表位的SLP。
图19显示了合成实施例17的反相色谱图(Reprosil Gold 200 C18，柱温40℃，1mL/分钟流速；洗脱液A＝在水中的0.1％TFA，洗脱液B＝在乙腈中的0.1TFA，梯度为95：5(A：B)至2：98)。
图20显示了合成实施例17的LCMS迹线。标有“#”的峰对应于不同电荷下的产物峰(例如，[M+10H]10+为1462.2，[M+11H]11+为1329.4，[M+12H]12+为1218.6等)；预期质量为14614。
图21显示了实施例16的接种计划的示意图。CD29缀合物或3+1+1缀合物使用初免-加强-加强接种计划施用于HLA2-DR1小鼠组。第三组小鼠用UV34多肽(GVExt5-SEQ ID NO：116)在含有IFA的乳液中使用初免-加强-加强接种计划进行免疫。在每次注射之间用一周的时间使用缀合物和肽进行免疫。处死动物，收集脾细胞和引流淋巴结用于体外测定。
图22显示了ELISpot测定的结果。使用脾和淋巴结进行离体ELISpot测定，以确定释放到培养基中的肽特异性应答T细胞和IFN-γ的频率。ELISpot实验设计类似于以前的ELISpot测定。图22A显示CD29缀合物的结果；图22B显示3+1+1缀合物；和图22C显示SEQIDNO：116(UV 34-GVExt5)+IFA多肽的结果。
图23显示了施用(SEQ ID NO：126-GV1001)后针对单个多肽的T细胞应答图。水平虚线标记“截止”，这是“单独细胞”的应答水平，被视为基线。高于截止线/基线的多肽的柱被认为是针对特定多肽的T细胞应答。
图24显示了施用(SEQ ID NO：116-GVExt5)后针对单个多肽的T细胞应答图。水平虚线标记“截止”，这是“单独细胞”的应答水平，被视为基线。高于截止线/基线的多肽的柱被认为是针对特定多肽的T细胞应答。
图25显示了图23和图24的单独结果列表。
图26的图表显示了夹心ELISA测定结果，其中评估了缀合物与人血浆产品TetaQuin中的抗MTTE多克隆抗体的结合情况。捕获抗体是抗p719-20(SEQ ID NO：1)兔多克隆抗体。
图27的图表显示了夹心ELISA测定结果，其中评估了缀合物与人血浆产品TetaQuin中的抗MTTE多克隆抗体的结合情况。捕获抗体是抗GVExt5(SEQ ID NO：116)兔多克隆抗体。
图28的图显示了3种不同盐型的UVC1-017(含有p719-20的缀合物)与单克隆抗MTTE(SEQ ID NO：7)抗体在间接ELISA中结合的结果。TFA盐型的缀合物UVC1-017显示出稍微更好的结合。
图29的图显示了3种不同盐型的UVC1-017(含有p719-20的缀合物)与多克隆抗MTTE(SEQ ID NO：7)抗体在间接ELISA中结合的结果。TFA盐型的缀合物UVC1-017显示出稍微更好的结合。
图30的图显示了3种不同盐型的UVC2-001(含有GvExt5的缀合物)与单克隆抗MTTE(SEQ ID NO：7)抗体在间接ELISA中结合的结果。对于所有3种盐型都观察到类似的结合。
图31的图显示了3种不同盐型的UVC2-001(含有GvExt5的缀合物)与多克隆抗MTTE(SEQ ID NO：7)抗体在间接ELISA中结合的结果。对于所有3种盐型都观察到类似的结合。
图32为参加TENDU接种试验患者血清中测得的抗MTTE IgG浓度图。
图33是用于在转基因HLA-A2/HLA-DR1动物中以缀合物和肽+IFA形式的GVExt5肽(SEQ ID NO：116)的免疫原性的体内评估的疫苗接种计划的示意图。
图34显示了按照图33的疫苗接种计划进行的血清抗MTTE抗体研究的结果。A.是显示了实验结束时小鼠中的抗MTTE抗体滴度的图。B.是显示了单个组的小鼠在免疫过程中不同时间点的抗MTTE抗体滴度的图。
图35显示了按照图33的疫苗接种计划进行的研究结果。每个图显示了用单个肽刺激后的T细胞应答：A.UV36；B.UV58；C.UV59；D.UV60；E.UV64；F.UV65；和G.UV66。
图36显示了按照图33的疫苗接种计划进行的研究结果。A.是显示了暴露于CD29的小鼠对UV36肽内不同长度的多肽序列的T细胞应答的总和的图。B.是显示了单个小鼠的T细胞应答的图。
发明的详细描述
在本发明的实施方案中，提供了一种缀合物，其包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，其中所述CD4+T淋巴细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域或与所述区域具有至少80％序列同一性的序列。CD4+T细胞表位在至少50％的群体中是免疫原性的，并且至少一个包含CD4+T淋巴细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸。B细胞表位的序列不同于CD4+T细胞表位序列，对B细胞表位数特异性的抗体与缀合物结合。至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽任选地通过本文定义的核心连接。
在本发明的其他实施方案中，提供了不形成缀合物的一部分的多肽和核酸分子。
下面描述本发明的上述实施方案的组分的进一步细节。
多肽
根据本发明的一个方面，提供了人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白的多肽，其包含选自SEQ ID NO：116(即LSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGL)和117(即HREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDY)的序列。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO：116的序列的多肽的长度等于或小于170个氨基酸。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：116的序列的多肽的长度等于或小于150、140、130、125、120、110、100、90、80、75、60、50、40或35个氨基酸。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO：117的序列的多肽的长度等于或小于40个氨基酸。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：117的序列的多肽的长度等于或小于38、36、35、34、33、32或31个氨基酸。
在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO：116或117所示的序列组成。在其他实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：116或117所示+的序列。在一个实施方案中，在N和/或C端的任何额外的氨基酸存在于天然存在的hTERT蛋白中。在一个替代实施方案中，在N和/或C端的任何额外的氨基酸不同于天然存在的hTERT蛋白中的那些氨基酸。
在其他实施方案中，提供了上述多肽的免疫原性片段；所述片段包含SEQ ID NO：116或117的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。
端粒酶是一种具有复制真核细胞中线性DNA链端粒3’端区域功能的酶，因为这些区域不能被DNA聚合酶以正常方式延伸。端粒酶包括TERT亚单位(人中为“hTERT”)和端粒酶RNA。通过使用端粒酶RNA作为模板，TERT亚基在真核细胞的染色体3’端添加一个重复序列，以延长DNA链的3’端。全长hTERT mRNA序列列于GenBank登录号AF015950.1；氨基酸序列列于UniProt登录号O14746，也列于SEQ ID No：2。SEQ ID NO：116和117各自由hTERT蛋白的30个氨基酸片段组成。
在其他的实施方案中，多肽与前述多肽之一或其免疫原性片段不具有确切的序列同一性。相反，所述多肽包含与SEQ ID NO：116或其免疫原性片段具有至少91％序列同一性的序列。特别优选该序列与上述序列具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：117或其免疫原性片段具有至少95％序列同一性的序列。特别优选该序列与上述序列具有至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。还优选的是，氨基酸序列的任何添加或置换导致原始氨基酸侧链的性质保持不变。也就是说，置换或修饰是“保守的”。
提供功能相似氨基酸的保守置换表在本领域是众所周知的。氨基酸侧链的性质的实例是疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有以下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基基团侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。此外，以下8个基团各自包含彼此保守置换的氨基酸(参见例如Creighton，Proteins(1984)：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)：和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。
在一些实施方案中，提供多肽的混合物(cocktail)(即混合物(mixture))，其中所述混合物包含至少两种不同的多肽，所述多肽包含来自SEQ ID NO：1、116和117的序列。在一些实施方案中，所述混合物包含所述多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段包含至少8个氨基酸。在其他的实施方案中，混合物中的多肽或每种多肽包含与SEQ ID NO：1、116或117的序列或其免疫原性片段具有至少80％序列同一性的序列。特别优选该序列与上述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在优选实施方案中，混合物中的多肽包含SEQ ID NO：1和116的序列或其免疫原性片段。在这样的实施方案中，优选SEQ ID NO：1的免疫原性片段包含其至少8个氨基酸，更优选的是包含其12个氨基酸，并且SEQ ID NO：116的免疫原原性片段包含其至少17个氨基酸。在一个实施方案中，多肽的长度等于或小于500个氨基酸，优选等于或小于400、300、200、170、150、125、100、90、80、70、75、60、50、40或30个氨基酸。优选的是，所述至少两种多肽是不同的，即在基于选自SEQ ID NO：1、116和117的不同序列的意义上。
在另一个实施方案中，如上所述的多肽或每种多肽包含在缀合物内。因此，在一个实施方案中，提供缀合物的混合物(cocktail)(即混合物(mixture))。在一个实施方案中，包含本发明多肽的缀合物是如下进一步详细描述的缀合物。
在一个实施方案中，包含来自SEQ ID NO：1、116和117的序列的至少两种不同的多肽在单个多肽内提供。也就是说，提供了包含选自SEQ ID NO：1、116和117的至少两个不同序列的单个多肽链。在一些实施方案中，所述单个多肽包含所述多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段包含至少8个氨基酸。在其他的实施方案中，所述单个多肽包含与选自SEQ ID NO：1、116或117中的一个或多个或其免疫原性片段的序列具有至少80％序列同一性的序列。特别优选该序列与上述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、，95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在优选实施方案中，所述单个多肽包含SEQ ID NO：1和116的序列或其免疫原性片段。在这样的实施方案中，优选SEQ ID NO：1的免疫原性片段包含其至少8个氨基酸，更优选的是包含其12个氨基酸，并且SEQ ID NO：116的免疫原原性片段包含其至少17个氨基酸。
在一些实施方案中，如上所述的单个多肽的长度等于或小于170个氨基酸。优选地，长度等于或小于150、140、130、125、120、110、100、90、80、75或60个氨基酸。在一些实施方案中，提供包含在单个多肽内的两种不同多肽或免疫原性片段(例如SEQ ID NO：1和116)之间的间插序列。在一个实施方案中，间插序列与在天然存在的hTERT蛋白中发现的序列相同。在替代实施方案中，间插序列与天然存在的hTERT蛋白中发现的序列不同(即具有小于100％的序列同一性)。在一个实施方案中，间插序列不是来源于hTERT。在一个实施方案中，间插序列是蛋白酶体切割位点。
特别优选的是，混合物或单个多肽中的至少两种不同多肽包含能够被广泛的HLAI类和/或HLA II类等位基因识别的表位。还应理解，在一些实施方案中，混合物或单个多肽包含具有不同序列的两种以上多肽。在一个实施方案中，提供3、4、5或更多种不同的多肽。
在一些实施方案中，改变如上所述的多肽的序列以改变(例如增加)多肽与特定HLA等位基因的MHC分子的结合亲和力。在其他实施方案中，除了上面列出的那些之外，多肽在其N和/或C端具有另外的氨基酸。这种额外的氨基酸也可用于改变(例如增加)多肽与MHC分子的结合亲和力。
所述多肽(特别是其序列已如上所述改变的多肽)能够引发CD4+和/或CD8+T细胞应答。也就是说，当多肽由抗原呈递细胞(例如树突细胞)呈递时，该多肽应该能够诱导CD4+和/或CD8+T细胞。在一个实施方案中，通过T细胞增殖测定法(3H-胸苷)测量CD4+T细胞免疫应答(如先前Inderberg-Suso等人，Oncoimmunology.2012Aug 1：1(5)：670-686所述)。在一个实施方案中，如果对CD4+表位的免疫应答是背景的至少2或3倍(刺激指数，SI≥2或3)，则CD4+T细胞免疫应答被认为是阳性的。在一个实施方案中，CD8+T细胞诱导性的确认可以通过诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、巨噬细胞或树突细胞)或更具体地源自人外周血单核白细胞的树突细胞，并且在用多肽刺激后，与CD8+细胞混合，然后测量CD8+T细胞针对靶细胞产生和释放的IFN-γ来完成。作为反应系统，可以使用已经产生了表达人HLA抗原的转基因动物(例如，在BenMohamed L，Krishnan R，Longmate J，Auge C，LowL，Primus J，Diamond DJ，Hum Immunol 61(8)：764-79，2000Aug，相关文章、书籍、链接，Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice：dependence on HLA class II restricted T(H)response)。例如，可以用51Cr对靶细胞进行放射性标记，并且可以从靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。
在一个实施方案中，使用表达HLA抗原的转基因动物来评估多肽是否能够引发CD4+和/或CD8+T细胞应答。在一个实施方案中，HLA-DR4小鼠模型用于测量CD4+T细胞免疫应答。在替代的实施方案中，HLA-A2/HLA-DR1小鼠模型用于测量CD4+和/或CD8+T细胞免疫应答。
在另一个实施方案中，CD4+和/或CD8+T细胞的诱导性可以使用ELISpot测定法进行检查。在一个实施方案中，测量CD4+和/或CD8+T细胞在携带固定化肽的抗原呈递细胞存在下产生和释放的IFN-γ，并使用抗IFN-γ单克隆抗体观察培养基上的抑制区。更具体地，T细胞在含有针对IFN-γ的固定抗体的膜上培养。这些抗体捕获由相关T细胞产生的干扰素γ，然后可以通过针对干扰素γ的第二抗体来对其观察。这种抗体被酶标记，并且当添加底物时，在含有抗原反应性细胞的位点上观察到斑点。ELISpot测定的进一步实例描述如下(例如在实例10、11、14、15中)。
在本发明的一些其他的实施方案中，多肽与另一种物质连接(例如共价地)，同时保留其诱导CD4+和/或CD8+T细胞应答的能力。这些另外的物质包括脂质、糖或糖链、乙酰基基团、天然或合成聚合物等。在一个实施方案中，如下面详细描述，多肽以缀合物的形式连接到另外的多肽。在一个实施方案中，提供较长的富含抗原的多肽链(即单个多肽)，其包含本文定义的多肽或免疫原性片段和另外的多肽。在一个实施方案中，所述另外的多肽是另外的hTERT衍生的序列(例如长度为至少10、15、20、25、30或35个氨基酸)。也就是说，在一些实施方案中，两个或多个不同的hTERT衍生的多肽序列一起包含在单个多肽链内。在一个实施方案中，在两种多肽之间提供间插序列(例如接头元件)。在一个实施方案中，间插序列不是源自hTERT，或者与天然存在的hTERT序列的序列同一性小于100％。在一个实施方案中，接头元件是蛋白酶体切割位点。在某些实施方案中，多肽包含修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化。
在一些实施方案中，多肽通过本领域已知的常规方法产生。或者，所述多肽是通过切割(例如，使用溴化氰)和随后的纯化产生的端粒酶蛋白的片段。也可以使用酶切割。在其他的实施方案中，所述多肽是重组表达的多肽的形式。例如，制备包含编码可表达形式的多肽的多核苷酸(例如，对应于启动子序列的调控序列的下游)的合适载体，并将其转化到合适的宿主细胞中。然后培养宿主细胞以产生目的多肽。在其他实施方案中，多肽是使用体外翻译系统在体外产生的。
在一些实施方案中，所述多肽不由以下任一项的序列组成：HREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREK(SEQ ID NO：120)、EARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDY(SEQ IDNO：121)、EARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYV(SEQ ID NO：122)、EARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMD(SEQ ID NO：123)或AEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGL(SEQ ID NO：124)。
核酸分子
在本发明的替代实施方案中，提供了一种核酸分子，其由编码如上所述多肽的核苷酸序列组成。在一个实施方案中，编码SEQ ID NO：1、116或117的核苷酸序列分别如SEQID NO：160至162所示。
在一些实施方案中，由编码如上所述多肽的核苷酸序列组成的核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。优选地，长度等于或小于1200、900、600、510、450、420、390、375、360、330、300、270、240、225、180、150、120、114、108、105、102、96或90个核苷酸。
在一些实施方案中，编码多肽的核苷酸序列与天然存在的hTERT序列具有小于100％的序列同一性(例如，如GenBank登录号AF015950.1所示)。在一些实施方案中，密码子优化用于改变核苷酸序列，例如用于在合适的宿主细胞内表达。在这样的实施方案中，应该理解，与天然存在的hTERT序列相比，密码子优化导致核苷酸序列的变化。在其他的实施方案中，在编码本发明多肽的核苷酸序列的3′或5′末端掺入额外的核苷酸。在一些实施方案中，这种额外的核苷酸不同于天然存在的hTERT序列中发现的核苷酸。在一个实施方案中，核酸分子包含5′帽。在一个实施方案中，提供了一种核酸分子，其包含编码如本文所定义的多肽或免疫原性片段的核苷酸序列和编码另一多肽的另一核苷酸序列。在一个实施方案中，另一核苷酸序列编码另一hTERT衍生序列(例如，编码长度至少10至200个氨基酸，使得另一核苷酸序列长度至少为30至600个核苷酸)。也就是说，在一些实施方案中，编码hTERT衍生的多肽序列的两个或多个不同核苷酸序列一起包含在单个核酸分子内。在一个实施方案中，在两个核苷酸序列之间提供间插序列(例如编码接头元件)。在一个实施方案中，间插序列不是源自hTERT，或者与天然存在的hTERT序列的序列同一性小于100％。在一个实施方案中，编码的接头元件是蛋白酶体切割位点。
在一些实施方案中，核酸分子与另一种物质(例如共价地)连接。在一个实施方案中，核酸分子与载体部分连接。在一个实施方案中，载体部分是免疫原性载体(carrier)。在一个实施方案中，核酸分子包含在脂质纳米颗粒内。
在其他的实施方案中，提供核酸分子的混合物(cocktail)(即混合物(mixture))，其中混合物包含至少两种不同的核酸分子，所述核酸分子包含编码包含SEQ ID NO：1、116或117的多肽的核苷酸序列。在替代的实施方案中，编码的多肽是SEQ ID NO：1、116或117的免疫原性片段，其中免疫原性片段包含至少8个氨基酸。在替代的变体中，编码多肽的序列与上述序列不完全相同，但是与其具有至少80％的序列同一性。优选地，与上述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在优选实施方案中，混合物中编码的多肽包含SEQ ID NOS：1和116的序列或其免疫原性片段。在这样的实施方案中，优选被编码的SEQ ID NO：1的免疫原性片段包含其至少8个氨基酸，更优选的是包含其12个氨基酸，并且被编码的SEQ ID NO：116的免疫原原性片段包含其至少17个氨基酸。在一个实施方案中，编码的多肽长度等于或小于500、400、300、200、170、150、125、100、90、80、70、75、60、50、40或30个氨基酸。优选的是，所述至少至少两个核酸分子是不同的，即在基于选自SEQ ID NO：1、116和117的不同序列的意义上。
在一个实施方案中，在单个分子内提供至少两种不同的核酸分子，所述核酸分子包含编码包含SEQ ID NO：1、116和117的多肽的核苷酸序列。也就是说，提供了一种单个分子，其包含至少两个不同的核苷酸序列，每个核苷酸序列编码选自SEQ ID NO：1、116和117的多肽。在一些实施方案中，编码的多肽是SEQ ID NO：1、116或117的免疫原性片段，其中免疫原性片段包含至少8个氨基酸。在其他实施方案中，编码的多肽的序列与上述序列不完全相同，但是与其具有至少80％的序列同一性。优选地，与上述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、，95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在优选实施方案中，单个分子包含核苷酸序列，每个核苷酸序列编码包含SEQ IDNO：1和116或其免疫原性片段的多肽。在这样的实施方案中，优选被编码的SEQ ID NO：1的免疫原性片段包含其至少8个氨基酸，更优选的是包含其12个氨基酸，并且被编码的SEQ IDNO：116的免疫原原性片段包含其至少17个氨基酸。
在一个实施方案中，单个分子是单个核酸分子。在一些实施方案中，单个核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。优选地，长度等于或小于1200、900、600、510、450、420、390、375、360、330、300、270、240、225或180个核苷酸。
在一些实施方案中，提供了包含在单个分子或核酸分子内的两个不同核苷酸序列(例如编码SEQ ID NO：1和116的核苷酸序列)之间的间隔核苷酸序列。在一个实施方案中，间插序列与编码天然存在的hTERT蛋白的核苷酸序列中发现的序列相同。在替代实施方案中，间插序列与编码天然存在的hTERT蛋白的核苷酸序列中发现的序列不同(即具有小于100％的序列同一性)。在一个实施方案中，间插序列不是源自hTERT。在一个实施方案中，间插序列编码蛋白酶体切割位点。
还应理解，在一些实施方案中，混合物包含两个以上具有不同序列的不同核酸分子，或者单个核酸分子包含两个以上不同的核苷酸序列。在一个实施方案中，提供了3、4、5或更多个不同的核酸分子或不同的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，提供包含如上所述的核酸分子或其片段的载体。要使用的特定载体可能取决于要表达核酸分子的宿主生物或细胞，将用于转化宿主细胞的方法和/或将用于蛋白质表达的方法(或载体的任何其他预期用途)。在一个实施方案中，载体包括促进核酸分子的内涵体逃逸的物质。
应当理解，由于遗传密码的简并性，编码特定多肽的核酸分子可以具有一系列多核苷酸序列。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCT都编码氨基酸丙氨酸。
核酸分子可以是DNA或RNA或其衍生物。
在一个实施方案中，提供了如上所述的任何一种多肽和/或核酸分子的组合。
缀合物
根据本发明的进一步方面，提供了一种缀合物，其包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽。
优选地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽是一个以上的包含B细胞表位序列的的多肽，特别优选2或3个包含B细胞表位序列的多肽。在一个以上的包含B细胞表位序列的多肽的一些实施方案中，这些多肽中的每一个具有相同的序列。
在第一实施方案中，缀合物的B细胞表位包含SEQ ID NO.7(即FIGITELKKLESKINKVF)的序列。在优选实施方案中，B细胞表位由SEQ ID NO.7序列组成。SEQID NO.7的长度为18个氨基酸，源自破伤风毒素(TTx)序列。TTx是一种神经毒素，由破伤风梭菌(Clostridium tetani)的营养孢子在厌氧条件下产生，可引起人类破伤风。TTx氨基酸序列列于UniProt登录号P04958和序列表SEQ ID NO.3中。TTx由破伤风梭菌(C.tetani)合成为单个多肽链，经蛋白水解产生两个片段，即来源于氨基末端的轻链(LC：也称为α链)和来源于羧基末端的重链(HC：也称为β链)。TTx轻链和重链在序列列表中分别由SEQ ID NO.4和5表示。在TTx中，轻链和重链通过二硫键连接。SEQ ID NO.7对应于TTx重链的氨基酸381至398，即SEQ ID NO.5的氨基酸381至398。
缀合物的B细胞表位的功能(如下文进一步详细描述的)是与受试者中的循环抗体结合，以将缀合物引导至抗原呈递细胞(APC)。拥有源自TTx的B细胞表位是有利的，因为大多数个体(在西方世界)在儿童时期都针对破伤风进行了免疫，因此预计相当一部分群体会有针对TTx的循环抗体。
应该理解的是，SEQ ID NO.7包含氨基酸序列“GITELKKL”(如序列表中的SEQ IDNO.6所示)；更具体地说，SEQ ID NO.6位于SEQ ID NO.7的氨基酸位置3至10，SEQ ID NO.6对应于TTx重链的氨基酸383至390，即SEQ ID NO.5的氨基酸383至390。
在第一实施方案中，至少一个包含SEQ ID NO.7的序列的多肽是包含SEQ ID NO.7的序列的第一、第二和第三多肽。换句话说，缀合物包含含有SEQ ID NO.7序列的多肽的三个拷贝。在替代实施方案中，至少一个包含SEQ ID NO.7序列的多肽是单个多肽或第一和第二多肽。在一个实施方案中，缀合物包含另一种物质。也就是说，除了至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽之外，缀合物还包含另一种物质。在一个实施方案中，另一种物质是另一种多肽。在优选实施方案中，另一种多肽包含表位的序列。在一个实施方案中，表位是能够引发免疫应答的抗原的任何序列。在一个实施方案中，表位的序列是另外的T细胞表位，优选另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。在另一个实施方案中，缀合物包含4、5、6、7、8、9、10或更多个包含SEQ ID NO.7的多肽。
在替代实施方案中，缀合物的B细胞表位具有与SEQ ID NO.7不同的序列。在一个实施方案中，B细胞表位包含含有至少10个氨基酸的不同序列，这些氨基酸在SEQ ID NO.5(即TTx重链)中是连续的，并且包含序列表中由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列“GITELKKL”。在一个实施方案中，不同序列包含在SEQ ID NO：5中至少12、15或18个连续的氨基酸的序列，所述序列包含序列表中SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列“GITELKKL”。在另一个实施方案中，B细胞表位包含在SEQ ID NO：5中至少20、25、30、35、40、45或50个连续的氨基酸的序列，所述序列包含序列表中SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列“GITELKKL”。在一个实施方案中，B细胞表位由如上所述的任何一个序列组成。
在另一个实施方案中，B细胞表位包含选自SEQ ID NO.59至115中任一个的序列。在另一个实施方案中，B细胞表位由选自SEQ ID NO.59至115中任一个的序列组成。
在另一个实施方案中，B细胞表位包含至少10个在SEQ ID NO.5中连续的氨基酸，而不包含序列表中SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列“GITELKKL”的氨基酸。也就是说，B细胞表位源自SEQ ID NO.5序列的不同区域。在又一个实施方案中，B细胞表位包含在SEQ IDNO.3中连续的至少10个氨基酸。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽不包含SEQ ID NO.5的序列。也就是说，包含B细胞表位的至少一种多肽不包含TTx重链的完整序列。在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位的多肽的长度等于或小于500、400、300、200或100个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位的多肽的长度为90、80、75、70、60、50、40或30个氨基酸或更少。
在另一个实施方案中，包含B细胞表位序列的多肽和/或B细胞表位与上述序列之一不具有完全一致的序列同一性。相反，多肽和/或B细胞表位与上述序列具有至少70％的序列同一性。优选地，与上述序列同一性为至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％。还优选的是，氨基酸序列的任何添加或置换导致原始氨基酸侧链的性质保持不变。也就是说，置换或修饰是“保守的”(如上所述)。
在一个实施方案中，尽管B细胞表位包含或由与SEQ ID NO.7具有小于100％序列同一性的序列组成，但与SEQ ID NO.7的位置3至5和11处相对应的氨基酸与SEQ ID NO.7的位置3至5和11处的氨基酸没有变化。
与上述B细胞表位的序列同一性不是100％的B细胞表位被称为“变体B细胞表位”。重要的是，源自TTx的变体B细胞表位(例如，源自SEQ ID NO.3至5中任意一个)能够被抗TTx抗体结合。在一个实施方案中，确认是源自SEQ ID NO.3至5中任意一个的变体B细胞表位与抗TTx抗体的结合是使用Tettox ELISA完成的。“Tettox ELISA”是一种针对抗TTx抗体的ELISA检测方法。本领域技术人员将理解如何进行ELISA测定以鉴定抗TTx抗体是否结合源自SEQ ID NO.3至5中任何一个的特定的目的变体B细胞表位。这种变体B细胞表位可以通过本领域已知的任何方法产生，例如化学合成。抗TTx抗体可以作为多克隆抗体血清从接受破伤风类毒素疫苗的人类供体获得。示例性Tettox ELISA试验方案在WO 2011/115483中详细描述，其通过参考并入本文。
在替代实施方案中，B细胞表位源自不是破伤风毒素的蛋白质或多肽。
本发明的缀合物还包含至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域。
通用肿瘤抗原是在高比例的肿瘤类型中表达的抗原。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原在正常(即非癌)组织中不广泛表达。在一个实施方案中，它在正常组织的有限子集中表达。在另一个实施方案中，通用肿瘤抗原在每种肿瘤类型的高比例患者中表达。癌症是一种异质性疾病，不同肿瘤类型之间以及同一肿瘤类型内的患者之间存在高度多样性。通过靶向通用肿瘤抗原，癌症治疗的适用性在整个患者群体中得到改善(即在癌症和/或肿瘤类型内和之间)。
在本发明的第一个实施方案中，通用肿瘤抗原是端粒酶的端粒酶逆转录酶亚基(对于人类为“TERT”或“hTERT”)(如上所述)。端粒酶在某些正常组织中表达，如骨髓和胃肠道中的干细胞。然而，已经观察到端粒酶在绝大多数人类癌症中被激活(例如，Kim等人，Science.1994266(5193)：2011-5；Shay&Wright，FEBS Lett.2010 584(17)：3819-25)。据信，端粒酶在绝大多数人类癌症中被激活，因为如果没有端粒酶的表达，细胞的端粒就会逐渐丢失，染色体的完整性也会随着细胞的每一轮细胞分裂而下降，最终导致细胞凋亡。因此，端粒酶的表达通常是癌症细胞发育所必需的，因为如果没有这种表达，程序性细胞死亡通常会默认发生。鉴于端粒酶激活在癌症中的作用，来自TERT/hTERT的多肽被认为是通用的肿瘤抗原。
在优选实施方案中，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：1(即ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA)、SEQ ID NO：116(即LSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGL)和/或SEQ ID NO：117(即HREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDY)的序列。优选CD4+T细胞表位由SEQ ID NO：1、116和/或117的序列组成。更优选地，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：1或116的序列或由其组成。SEQID NO：1、116或117的多肽的长度各自为30个氨基酸。SEQ ID NO：1、116和117各自由hTERT的30个氨基酸片段组成。
在其他实施方案中，提供了SEQ ID NO.1、116或117的免疫原性片段，其包含其至少12个氨基酸。在一个实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO：1、116或117的12个氨基酸组成。在替代实施方案中，免疫原性片段包含SEQ ID NO：1、116或117的至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。在另一个实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO：1、116或117的13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸组成。SEQ ID NO：1的示例性免疫原性片段包括SEQ ID NO.12至35中列出的那些片段。
在第一个实施方案中，至少一个包含SEQ ID NO：1、116或117的序列的多肽是单个多肽(即缀合物包含一个包含SEQ ID NO.1的序列的多肽)。在替代实施方案中，至少一个包含SEQ ID NO：1、116或117的序列的多肽是第一多肽，并且缀合物包含多个多肽，每个多肽编码选自SEQ ID NO：1、116或117的序列。在一个实施方案中，缀合物包含含有SEQ ID NO：1序列的多肽和含有SEQ ID NO：116序列的多肽。
在另一个实施方案中，缀合物包含另一种物质。也就是说，除了至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽之外，缀合物还包含另一种物质。在一个实施方案中，另一种物质是另一种多肽。在优选实施方案中，另一种多肽包含表位的序列。在一个实施方案中，表位是能够引发免疫应答的抗原的任何序列。在一个实施方案中，表位的序列是另外的T细胞表位，优选另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。应当理解，在一些实施方案中，另外的CD4+T细胞表位不同于包含SEQ ID NO：1、116或117的序列的表位。在一个实施方案中，另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞的表位是能够分别被CD4+T或CD8+T细胞识别的任何序列。在一个实施方案中，所述缀合物包含含有SEQ ID NO：1、116或117的序列的多肽和另外的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个多肽，每个多肽包含表位。
因此，在一些实施方案中，除了至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽之外，缀合物还包含另一种物质。
在一个实施方案中，至少一个包含SEQ ID NO：1、116或117的序列的多肽包含另外的T细胞表位的序列。在一个实施方案中，另外的T细胞表位是另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞的表位。在一个实施方案中，至少一个多肽包含SEQ ID NO：1的序列，并且另外的T细胞表位包含SEQ ID NO：116或117的序列，优选SEQ ID NO：116的序列。在替代实施方案中，另外的T细胞表位包含与SEQ ID NO：1、116或117序列不同的序列。因此，在一些实施方案中，另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞的表位是能够分别被CD4+T或CD8+T细胞识别的任何序列。在包含另外的CD4+T细胞表位的某些实施方案中，SEQ ID NO：1、116或117的序列和另外的CD4+T细胞表位序列在至少一个多肽内顺序排列和/或重叠。在包含CD8+T细胞表位的某些实施方案中，CD8+T细胞表位包含在SEQ ID NO：1、116或117的序列内；也就是说，SEQID NO：1、116或117的序列包含CD8+T细胞表位序列。在替代实施方案中，SEQ ID NO：1、116或117的序列和CD8+T细胞表位在至少一个多肽内顺序排列和/或重叠。在表位顺序排列的实施方案中，两个表位之间的间插序列可以存在，也可以不存在。
在一些实施方案中，另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表面(包含在SEQ IDNO：1、116或117的相同多肽内或包含在缀合物中的另外的多肽内)源自自身抗原、肿瘤相关抗原和/或通用肿瘤抗原。在一个实施方案中，CD8+T细胞表位源自前列腺癌相关抗原，优选来自前列腺酸性磷酸酶(PAP)。在一个实施方案中，CD8+T细胞表位包含源自PAP的序列“NPILLWQPIPV”(SEQ ID NO：119)。在优选实施方案中，至少一个多肽包含顺序排列的SEQID NO：1和SEQ ID NO：119的序列。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：119的序列按如下顺序排列：ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRANPILLWQPIPV(SEQ ID NO：125)，在另一个实施方案中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：119的顺序颠倒。
在另一个实施方案中，另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞的表位(包含在SEQID NO：1、116或117的相同多肽内或包含在缀合物中的另外的多肽内)包含在SEQ ID NO：47至51和/或45中的任何一个中。在一个实施方案中，另外的CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：39和41至45中的一个或多个。在一个实施方案中，另外的CD8+T细胞表位包含SEQ ID NO：155至159中的一个或多个。在一个实施方案中，另外的CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位包含如图8C所示的序列或其片段(“SLP”)。
应该理解的是，不同长度的多肽引起不同的T细胞应答。包含如上所述的通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的多肽具有适当的长度以呈递在MHC II类分子上，从而引发CD4+T细胞应答(即作为呈递在MHC II类分子上的多肽通常长度在12至24个氨基酸之间)。相反，为了引发CD8+T细胞应答，多肽必须呈递在MHC I类分子上，该分子通常仅结合长度在8至10个氨基酸残基之间的较短多肽。
应当注意，本发明的某些CD4+T细胞表位(例如，EO ID NO：1、116和117)比通常容纳在MHC II类分子上的更长。这种长度的多肽是合成的长肽(SLP)，已被证明可诱导更强大的免疫应答(例如，Welters等，Clin Cancer Res.2008Jan 1；14(1)：178-87；Rosalia等人，Eur J Immunol.2013Oct；43(10)：2554-65)。不希望受到理论的约束，据信在某些实施方案中，这些多肽在施用于受试者后被细胞内吞/吸收，在蛋白酶体中发生蛋白水解降解，然后呈递在MHC II类(和/或I类)分子上。因此，这种多肽能够产生MHC II类(和/或MHC I类)限制性T细胞应答。在这样的实施方案中，应该理解，本发明的CD4+T细胞表位的一部分由MHCII类分子呈递并被CD4+T细胞的T细胞受体结合以引发CD4+T细胞应答。还应该理解的是，较长的多肽在受试者体内比较短的多肽存在更长的时间，因此它们可能引发免疫应答的时间更长。这对于那些具有相对低的MHC结合亲和力的多肽特别重要。
在上述实施方案中，CD4+T细胞表位包含hTERT的至少12个氨基酸的区域。在替代实施方案中，CD4+T细胞表位包含除hTERT以外的通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原从包括存活蛋白、DNA拓扑异构酶2-α(Top2α)、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)和E3泛素蛋白连接酶Mdm2的组中选择。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原是存活蛋白(等人，Cancer Biol Ther.20087(12)：1885-7；Wobser等人，Cancer Immunol Immunother.200655(10)：1294-8)。存活蛋白(也称为杆状病毒IAP重复序列蛋白5)由人类的BIRC5基因编码，是细胞凋亡的抑制剂。存活蛋白的142个氨基酸同工型列于UniProtKB参考O15392(同工型1)，也列于SEQ ID NO.8。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原是DNA拓扑异构酶2-α(Top2α)(Park等人，Cancer Immunol Immunother.2010(5)：747-57)。DNA拓扑异构酶2-α由人类的TOP2A基因编码，并通过DNA链的瞬时断裂和随后的重新连接来控制DNA的拓扑状态。拓扑异构酶II产生双链断裂。DNA拓扑异构酶2-α的1531个氨基酸同工型列于UniProtKB参考P11388(同工型1)，也列于SEQ ID NO.9。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原是细胞色素P450 1B1(CYP1B1)(Gribben等，Clin Cancer Res.2005 11(12)：4430-6)。细胞色素P450 1B1由人类CYP1B1基因编码，参与多种异生素和内源性化合物的代谢。细胞色素P450 1B1的543个氨基酸序列列于UniProtKB参考Q16678，也列于SEQ IDNO.10。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原是E3泛素蛋白连接酶Mdm2(Gordan和Vonderheide，Cytotherapy.2002；4(4)：317-27)。E3泛素蛋白连接酶Mdm2由人类的Mdm2基因编码，是p53肿瘤抑制因子的负调节剂。E3泛素蛋白连接酶Mdm2的491个氨基酸同工型列于UniProtKB参考Q00987(同工型Mdm2)，也列于SEQ ID NO.11。
在优选实施方案中，CD4+T细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的区域。在特别优选的实施方案中，CD4+T细胞表位由通用肿瘤抗原的13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸组成。如上所述，SEQ ID NO：1、116或117各自由hTERT的30个氨基酸组成。在一个实施方案中，至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽的长度为500个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽的长度等于或小于400、300、200、170、150、125、100、90、80、70、75、60、50、40或30个氨基酸或更少。
在一个实施方案中，“通用肿瘤抗原”不是癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)和/或谷氨酸羧肽酶2(GCPII)。应该理解的是，NY-ESO-1不包含在本文使用的术语“通用肿瘤抗原”中，因为它通常不在每种肿瘤类型的高比例患者中表达(Ishihara等人，BMC Cancer.2020：20：606)。此外，应该理解的是，PAP和GCPII是前列腺癌相关蛋白，因此也不包括在本文使用的术语“通用肿瘤抗原”中。NY-ESO-1由人类CTAG1A基因编码，具有UniProt登录号P78358。NY-ESO-1的氨基酸序列列于SEQ ID NO.36中。PAP由人类的ACPP基因编码，具有UniProt登陆号P15309。PAP的氨基酸序列列于SEQ ID NO.37中。GCPII(也称为前列腺特异性膜抗原[PSMA])由人类的FOLH1基因编码，具有Uniprot登录号Q04609。GCPII的氨基酸序列列于SEQ ID NO.38中。
在一个实施方案中，包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域的CD4+T细胞表位不包含SEQ ID NOS.39至45中的任何一个的序列。SEQ ID NO.39(即GQDLFGIWSKVYDPL)和40(即TEDTMTKLRELSELS)源自PAP；SEQ ID NO.41至44(即分别为GKVFRGNKVKNAQLA、TGNFSTQKVKMHIHS、NYTLRVDCTPLMYSL、RQIYVAAFTVQAAAE)源自GCPII；SEQ ID NO.45(即GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELA)源自NY-ESO-1。
除了包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸外，CD4+T细胞表位还在至少50％的群体中具有免疫原性。也就是说，CD4+T细胞表位能够在群体中50％或更多的个体中引发免疫应答。在优选实施方案中，CD4+T细胞表位在55％或更多或60％或更多的群体中具有免疫原性。在特别优选的实施方案中，CD4+T细胞免疫应答在65％或更多的群体中具有免疫原性。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：1的序列，并且在65％或更多的群体中具有免疫原性。在另一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：117和/或117的序列，并且在至少50％的群体中具有免疫原性。应该理解的是，包含SEQ ID NO：116或117的序列的多肽包含EARPALLTSRLRFIPK(SEQ ID NO：126)的序列，据报道该序列在至少50％的接种疫苗的个体中诱导免疫应答(参见例如Bernhardt等人，Br J Cancer.2006Dec 4；95(11)：1474-82；Inderberg-Suso等人.2012；和Kyte等人.Clin Cancer Res July 1 2011(17)(13)4568-4580)。在实施例5和6中进一步分析了这些序列。
在第一个实施方案中，群体是一般群体。也就是说，群体既包括健康的个体，也包括患有癌症等疾病的个体。在替代实施方案中，群体由癌症患者个体组成。在另一个实施方案中，癌症患者是具有非小细胞肺癌、前列腺癌和/或恶性黑色素瘤的患者。在一个实施方案中，该群体还包括患有胰腺癌的癌症患者。
应当理解，为了使群体具有免疫原性，CD4+T细胞表位(或其一部分)必须能够呈递在(即结合)群体内存在的HLAII类分子上。表1显示了全球不同地区HLA II类等位基因的频率(改编自Dosset等人，Cancers.2020Jun 25；12(6)：E1687)。“频率”是指携带每个等位基因的群体中个体的比例。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位(或其一部分)与群体中以10％或更高频率存在的一个或多个HLA II类等位基因结合。在一个实施方案中，以10％或更高频率存在于群体中的HLA II类等位基因从由DRB1*01，DPA1*01，DPA1*02，DPB1*02，DPB1*03，DPB1*04，DQA1*01，DQA1*02，DQA1*03，DQB1*02和DQB1*03组成的组中选择。在另一个实施方案中，CD4+T细胞表位(或其一部分)与一个或多个HLA II类等位基因结合，该等位基因以40％或更高，优选50％或更高，更优选60％，70％，80％，90％，95％或更高或100％的频率存在于群体中。在一个实施方案中，以40％或更高频率存在于群体中的HLA II类等位基因从由DPA1*01，DPA1*02，DPB1*02，DPB1*03，DPB1*04，DQA1*01，DQA1*03，DQB1*02和DQB1*03组成的组中选择。
在一个实施方案中，CD4+T细胞表位(或其一部分)由一个或多个HLA II类等位基因结合，该等位基因从由HLA-DRB1*15，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*04，HLA-DQB1*06，HLA-DQB1*03，HLA-DQB1*05，HLA-DPB1*04和HLA-DPB1*01组成的组中选择。在特别优选的实施方案中，CD4+T细胞表位(或其一部分)由一个或多个HLA II类等位基因结合，该等位基因从由HLA-DRB1*15：01，HLA-DRB1*07：01，HLA-DRB1*04：01，HLA-DQB1*06：02，HLA-DQB1*03：02，HLA-DQB1*05：01，HLA-DPB1*04：01，HLA-DPB1*04：02和HLA-DPB1*01：01组成的组中选择。在又一优选实施方案中，CD4+T细胞表位(或其一部分)由一个或多个HLA II类等位基因结合，该等位基因从由HLA-DRB1*15：01，HLA-DRB1*07：01，HLA-DRB1*04：01，HLA-DQB1*06：02，HLA-DQB1*05：01，HLA-DPB1*04：01，HLA-DPB1*04：02，甚至更优选HLA-DRB1*15：01和/或HLA-DRB1*07：01组成的组中选择。已显示具有上述HLA II类等位基因的个体引发对SEQ IDNO：1多肽的免疫应答。
应该理解(例如，参考表1)，群体中HLAII类等位基因的频率可能因地理区域而异。在一个实施方案中，群体是欧洲群体。在替代实施方案中，群体是北美群体、南美/中美洲群体、北非群体、撒哈拉以南非洲群体、西亚群体、东北亚群体、东南亚群体和/或澳大利亚群体。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位(或其一部分)与一个或多个HLA II类等位基因结合，该HLA II类等位基因以10％或更高，优选40％或50％或更高，更优选60％，70％，80％，90％，95％或更高或100％的频率存在于上述群体之一中。
在一个实施方案中，其中群体是欧洲群体，HLA II类等位基因是从由DPA1*01，DPB1*03，DPB1*04，DQA1*01和DQB1*02组成的组中选择的至少一个。在一个实施方案中，其中群体是北美群体，HLA II类等位基因是从由DPA1*01，DPB1*04，DQA1*03和DQB1*03组成的组中选择的一个或多个。在一个实施方案中，其中群体是南/中美洲群体，HLA II类等位基因是从由DPA1*01，DPA1*02，DPB1*04，DQA1*01，DQA1*03和DQB1*03组成的组中选择的一个或多个。在一个实施方案中，其中群体是北非群体，HLA II类等位基因是DQB1*02。在一个实施方案中，其中群体是撒哈拉以南非洲群体，HLA II类等位基因是从由DPA1*01，DPA1*02，DPB1*04，DQA1*01和DQB1*03组成的组中选择的一个或多个。在一个实施方案中，其中群体是西亚群体，HLA II类等位基因是从由DPB1*04，DQA1*01，DQB1*02和DQB1*03组成的组中选择的一个或多个。在一个实施方案中，其中群体是东北亚群体，HLA II类等位基因是从由DPA1*01，DPA1*02，DPB1*02，DPB1*04，DQA1*01，DQA1*03和DQB1*03组成的组中选择的一个或多个。在一个实施方案中，其中群体是东南亚群体，HLA II类等位基因是从由DPA1*01，DPA1*02，DPB1*04，DQA1*01和DQB1*03组成的组中选择的一个或多个。从表1可以理解，上述HLA II类等位基因在上述群体中通常以40％或更高的频率存在。
应当理解，CD4+T细胞表位(或其一部分)可以被群体中的多个不同HLA II类等位基因结合。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位被上述不同HLA II类等位基因的多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多或全部)结合。优选与群体中以较高频率存在的一个或多个HLAII类等位基因结合，因为它表明CD4+T细胞表位在较高比例的群体中具有免疫原性，即群体中较高比例的个体将携带适当的HLA II类等位基因，其上可以呈递CD4+T细胞表位(或其一部分)以引发CD4+T细胞应答。
表1：全球最常见(≥10％频率)HLA II类分子的流行率(改编自Dosset等， Cancers.2020Jun 25；12(6)：E1687)
在另一个实施方案中，包含CD4+T细胞表位和/或CD4+T细胞表位序列的多肽与上述序列之一不具有完全一致的序列同一性。相反，多肽和/或CD4+T细胞表位与上述序列具有至少80％的序列同一性。优选地，与上述序列同一性为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。还优选的是，氨基酸序列的任何添加或置换导致原始氨基酸侧链的性质保持不变。也就是说，置换或修饰是“保守的”(如上所述)。
CD4+T细胞表位(特别是其序列如上文所述被改变的表位、)能够诱导CD4+T细胞应答。也就是说，当被抗原呈递细胞(例如树突细胞)在适当的MHC II类分子上呈递时，CD4+T细胞表位应该能够诱导CD4+(辅助)T细胞。如上所述，可以使用T细胞增殖测定(3H-胸苷)完成对CD4+T细胞免疫应答被诱导的确认。
缀合物可以含有上述多肽的任何组合，只要它包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含如上所述的CD4+T细胞表位序列的多肽。应当理解，B细胞表位的序列不同于CD4+T细胞表位的序列。在一个实施方案中，B细胞表位的序列不包含CD4+T细胞表位的序列。在另一个实施方案中，CD4+T细胞表位的序列不包含B细胞表位的序列。
在另一个实施方案中，提供了本文定义的任何一种缀合物的混合物(cocktail)(即混合物(mixture))。在一些实施方案中，缀合物的混合物包含至少两种不同的缀合物，其包含选自SEQ ID NO：1、116和117的CD4+T细胞表位序列。在一些实施方案中，混合物包含含有所述CD4+T细胞表位的免疫原性片段的缀合物，其中免疫原性片段包含至少12个氨基酸。在其他的实施方案中，混合物中的所述缀合物或每种缀合物包含CD4+T细胞表位的序列，其与SEQ ID NO：1、116或117的序列或其免疫原性片段具有至少80％的序列同一性。特别优选该序列与上述序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在优选实施方案中，混合物中的缀合物包含SEQ ID NO：1和116的CD4+T细胞表位序列或其包含至少12个氨基酸的免疫原性片段。在一个实施方案中，包含在每个缀合物内的CD4+T细胞表位序列的多肽长度等于或小于500个氨基酸，优选等于或小于400、300、200、170、150、125、100、90、80、70、75、60、50、40或30个氨基酸。优选的是，所述至少两种缀合物是不同的，即在基于选自SEQ ID NO：1、116和117的不同CD4+T细胞表位的意义上。
在一些实施方案中，提供了一种分子，其包含编码包含B细胞表位序列的多肽的第一核苷酸序列和/或编码包含CD4+T细胞表位的序列的肽的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二核苷酸序列编码包含B细胞表位和/或CD4+T细胞表位序列的多肽片段。在一个实施方案中，分子是核酸分子。在某些实施方案中，分子或核酸分子包含第一和第二核苷酸序列之间的间插序列。
在另一个实施方案中，提供包含如上所述的核酸分子或其片段的载体。要使用的特定载体可能取决于要表达核酸分子的宿主生物或细胞，将用于转化宿主细胞的方法和/或将用于蛋白质表达的方法(或载体的任何其他预期用途)。在一个实施方案中，载体用于将核酸分子递送到细胞中和/或用于将核酸分子施用于受试者。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以是非共价连接或共价连接的。优选地，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以通过共价连接。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以直接连接。在另一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以间接连接。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以通过一个核心连接，
其中所述核心在连接之前包括：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交；
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件。
在优选实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过本文定义的核心结构在缀合物内连接。也就是说，在优选实施方案中，B细胞表位的序列和CD4+T细胞表位的序列不在单个多肽链内顺序排列和/或重叠。
图18显示了根据本发明实施方案的缀合物的示意结构。
在一个实施方案中，在连接之前，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以独立地包含反应性官能团，该反应性官能团被配置为分别与本文定义的第一连接基团和本文定义的第二连接基团进行偶联反应。例如，反应性官能团可以存在于天然氨基酸残基(例如半胱氨酸残基的巯基)上。在其他情况下，天然氨基酸残基可以修饰为包括活性官能团(例如叠氮赖氨酸残基的叠氮化物基团或炔烃(例如末端炔烃)，烯烃(例如末端烯烃，降冰片烯)，环炔，反式环烯烃，四嗪，共轭二烯，马来酰亚胺或α-卤代羰基)。反应性官能团的优选实例包括硫醇基团和叠氮化物基团。
在一个实施方案中，反应性官能团可在至少一个包含B细胞表位序列的多肽和/或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的C端提供。在另一个实施方案中，反应性官能团可以提供在至少一个包含B细胞表位序列的多肽和/或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的N端。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以独立地包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以独立地仅包含一个半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以独立地包含叠氮赖氨酸(即K(N3))残基。在一些实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以独立地仅包含一个叠氮赖氨酸残基。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽可以独立地包含间隔序列。在替代实施方案中，间隔区包含在核心内(例如在主体部分和第一连接基团之间，或主体部分和第二连接基团之间)。至少一个包含B细胞表位序列或CD4+T细胞表位序列的多肽可以分别包含B细胞表位或CD4+T细胞表位的N端和/或C端的间隔序列。在一个实施方案中，间隔序列位于反应性官能团和表位序列之间。在一些实施方案中，间隔序列包含在至少一个包含B细胞表位序列的多肽内。在优选实施方案中，间隔序列包含氨基酸序列。在一个实施方案中，间隔序列的长度为10个氨基酸。在其他实施方案中，间隔序列包含1至20、1至15或1至12个氨基酸，优选3至12、6至12或9至12个氨基酸。在一些实施方案中，间隔区包含或由AEKYARVRAK(SEQ ID NO：127)，AAKYARVRAK(SEQID NO：128)，AAKYARVRAKC(SEQ ID NO：129)或SSAFADVEAA(SEQ ID NO：154)的序列或与其具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％序列同一性的序列组成。优选地，间隔序列包含或由AEKYARVRAK序列(SEQ ID NO：127)组成。然而，间隔序列不限于上述序列，本领域技术人员将知道替代的间隔序列。在一个实施方案中，间隔序列有助于缀合物的性质(例如溶解度和/或结构性质)。
在一个实施方案中，第一连接元件和第二连接元件独立地选自1，2，3-三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键(例如由硫醇-烯反应形成)。优选地，第一连接元件和第二连接元件独立地选自1，2，3-三唑键和硫化物键。更优选地，第一连接元件和第二连接元件独立地选自：
其中：
X1选自-(CH2)ax11-和-(CH2)ax12-X12-：
其中X12选自O、NR12或S；
R12选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选取代的芳基和任选地取代的杂芳基；优选氢和任选地取代的烷基；
X2选自N或CH；
ax11和ax12独立地选自0至12，并且
波浪线表示与至少一个包含B细胞表位序列的多肽或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽和/或核心的连接点。
在一个实施方案中，第三连接元件选自1，2，3-三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键(例如由硫醇-烯反应形成)。优选地，第三连接元件选自1，2，3-三唑键。更优选地，第三连接元件独立地选自：
其中：
X1选自-(CH2)ax11-和-(CH2)ax12-X12-：
其中X12选自O，NR12或S；
R12选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；优选氢和任选地取代的烷基；
X2选自N或CH；
ax11和ax12独立地选自0至12，并且
波浪线表示与至少一个包含B细胞表位序列的多肽或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽和/或核心的连接点。
优选地，ax11和ax12独立地从1到12中选择。更优选地，ax11和ax12独立地从1到6中选择。甚至更优选地，ax11和ax12独立地从1到4中选择。
优选地，X12可以是O或NR12。更优选地，X12可以是O。
关于核心的其他优选实施方案在下面进一步详细描述，并且同样适用于缀合物。
根据本发明的另一方面，提供了一种缀合物，该缀合物包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽：和
(a)至少一个包含CD4+T细胞序列的多肽；和
其中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过核心连接，其中核心在连接之前包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
其中所述核心不是：
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的的多肽连接以形成第二连接元件。上面已经描述了关于缀合物的其他优选实施方案，并且同样适用于该缀合物。关于核心的其他优选实施方案在下面进一步详细描述，并且同样适用于该缀合物。
根据本发明的另一方面，提供了一种中间缀合物，其包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；或
(b)至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽；
其中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽或包至少一个含CD4+T细胞表位序列的多肽连接到一个核心，其中核心在连接之前包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
其中所述核心不是：
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，或所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件。上面已经描述了关于缀合物的其他优选实施方案，并且同样适用于中间缀合物。关于核心的其他优选实施方案在下面进一步详细描述，并且同样适用于中间缀合物。
在一个实施方案中，缀合物可以选自：
/>
/>
核心
根据本发明的另一方面，提供了一种核心，其包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交。
在一个实施方案中，主体部分的配置使得当包含B细胞表位的多肽连接到一个或多个第一连接基团时，对B细胞表位特异的抗体能够结合B细胞表位。
在一个实施方案中，该核心不是：
任选地，这也可以适用于本发明的缀合物、中间缀合物或方法：然而，本发明的缀合物、中间缀合物或方法不一定限于此。
在涉及核心本身的实施方案中，核心不是：
/>
任选地，这也可以适用于本发明的缀合物、中间缀合物或方法：然而，本发明的缀合物、中间缀合物或方法不一定限于此。
根据本发明的核心通常比其他核心(例如以下核心)更有效地合成：
特别是，上述核心合成的总收率约为0.5％，完成合成需要约14天。
相比之下，根据本发明的核心(特别是对于具有式2主体部分的化合物)可以以更高的收率(通常高达0.5％以上的60倍)和更短的时间尺度(通常约5天)合成。此外，根据本发明的核心可以使用更少的反应步骤以及更少的纯化步骤(特别是色谱，例如尺寸排阻色谱和结晶)来合成。此外，使用此核心可以避免使用水合肼，叠氮化钠和二氯甲烷等危险化学品。
此外，本发明的核心允许实现更高的结合效率。
具有式2的主体部分的核心可以基于天然氨基酸。
在一个实施方案中，第一连接基团和第二连接基团中的至少一个可以包含两个或多个第一连接基团或第二连接基团。
在一个实施方案中，第一连接基团可被配置为可连接至B细胞表位。例如，第一连接基团可以被配置为可连接到包含B细胞表位序列的多肽。
在一个实施方案中，核心可以包含两个或更多个第一连接基团。优选地，核心可以包含两到四个第一连接基团。更优选地，核心可以是两个或三个第一连接基团。甚至更优选地，核心可以包含三个第一连接基团。
在一个实施方案中，第二连接基团可被配置为可连接至T细胞表位。例如，第二连接基团可以被配置为可连接到包含T细胞表位序列的多肽。优选地，T细胞表位是CD4+和/或CD8+T细胞表位。
在一个实施方案中，核心可以包括一到四个第二连接基团。优选地，核心可以包含一个或两个第二连接基团。更优选地，核心可以包含一个第二连接基团。
在一个实施方案中，核心包括三个第一连接基团和至少一个第二连接基团。在一个实施方案中，三个第一连接基团各自被配置为可连接到包含B细胞表位序列的多肽。在一个实施方案中，至少一个第二连接基团被配置为可连接到包含CD4+T细胞表位序列的多肽。
在一个实施方案中，核心可以另外包括附件到主体部分的第三连接基团，其被配置为可连接到如本文所定义的另外的物质。第三连接基团可以不同于第一连接基团和第二连接基团。第三连接基团可以与第一连接基团和第二连接基团正交。核心可以包含一到四个第三连接基团，优选一个第三连接基团。
在一个实施方案中，第一连接基团和第二连接基团可以独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；优选其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基。
在一个实施方案中，第三连接基团可以独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；优选其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第三连接基团选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基。
在一个实施方案中，第一连接具体和第二连接具体可以独立地选自：
其中X12是O、NR12或S；
R12选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选取代的芳基和任选地取代的杂芳基：优选氢和任选地取代的烷基；和
ax11和ax12独立地从0到12中选择。
在一个实施方案中，第三连接基团可以独立地选自：
其中X12是O、NR12或S；
R12选自氢、任选地取代的烷基、任选地被取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基和任选地被取代的杂芳基：优选氢和任选取代的烷基；和
ax11和ax12独立地从0到12中选择。
优选地，ax11和ax12独立地从1到12中选择。更优选地，ax11和ax12独立地从1到6中选择。甚至更优选地，ax11和ax12独立地从1到4中选择。
优选地，X12可以是O或NH。更优选地，X12可以是O。
在一个实施方案中，第一连接基团可以选自炔烃(例如末端炔烃)、马来酰亚胺和α-卤代羰基。优选地，第一连接基团可以选自炔烃(例如末端炔烃)和α-卤代羰基。
在一个实施方案中，第一连接基团可以选自：
其中X12、ax11和ax12如本文所定义。
优选地，第一连接具体可以选自
其中X12、ax11和ax12如本文所定义。
在一个实施方案中，第二连接基团可以选自炔烃(例如末端炔烃)和环炔烃。
在一个实施方案中，第二连接基团可以选自：
其中X12、ax11和ax12如本文所定义。
在一个实施方案中，第三连接基团可以是炔烃(例如末端炔烃)。
在一个实施方案中，第三连接基团可以选自：
其中X12、ax11和ax12如本文所定义。
在一个实施方案中，核心可包括根据式1的主体部分：
式1
其中在式1中：
L11和L12是接头；
R13选自氢、羟基、任选地取代的氨基、卤素、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选的取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a11表示附接到碳原子上的[(L11)-*]基团的数目，并且选自1、2或3：
a12表示附接到碳原子上的[(L12)-**]基团的数目，并且选自1、2或3；
a13表示附接到碳原子上的R13基团的数目，并且选自0或1；
a11+a12+a13是4；
*表示与第一连接基团的连接点；
**表示与第二连接基团的连接点。
用于L11和L12的接头类型不受特别限制，前提是它们能够连接到第一连接具体或第二连接接头。非限制性实例包括亚烷基键、亚芳基键、PEG键、基于羰基的键(例如酮、酯、酰胺)或其他键的组合。在一个实施方案中，接头是不可切割的接头。在另一个实施方案中，接头是可切割的接头。
在一个实施方案中，L11和L12各自独立地包括1到6个单元，每个单元独立地选自：
-(任选取代的亚烷基)-，-O-，-(CONH)-，-(NHCO)-，-(CH2CH2O)w-，-(CO)-，-(任选取代的亚烷基CO)-和-(CO任选取代的亚烷基)-，
其中w从1到6中选择。
在一个实施方案中，L11和L12各自可以独立地包含2到6个单元。优选地，L11和L12各自可独立地包含3至6个单元。更优选地，L11和L12各自可独立地包含4至6个单元。
在一个实施方案中，L11和L12中的任何两个相邻单元可以彼此不同。
在一个实施方案中，L11和L12可以独立选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHC0)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，L11和L12可以独立地选自-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。更优选地，L11和L12可以独立地选自-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、和-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。本文所指的L11和L12从左到右的单位顺序可以分别从碳原子到连接点(*)到第一连接基团和连接点(**)到第二连接基团读取。
在一个实施方案中，L11可以选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-，-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-，-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(C0)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，L11可以选自-任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、和-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-。更优选地，L11可以是-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-。
在一个实施方案中，L12可以选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代亚烷基)-(CO)-、-(任选取代亚烷基)-(NHCO)-(任选取代亚烷基)-，-(任选取代亚烷基)-(CONH)-(任选取代亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，L12可以选自-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。更优选地，L12可以是-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。
在一个实施方案中，L11和L12的w可以从1到4中独立选择。
在一个实施方案中，R13可选自氢、卤素、任选取代的烷基和任选取代的环烷基。优选地，R13可选自氢，任选取代的烷基。更优选地，R13可以是氢。
在一个实施方案中，a11可以是2或3。优选地，a11可以是3。
在一个实施方案中，a12可以是1或2。优选地，a12可以是1。
在一个实施方案中，a13可以是0。在另一个实施方案中，a13可以是1。
在一个实施方案中，核心可包含根据式2的主体部分：
式2
其中在式2中：
AA表示氨基酸；
n表示独立选择的AA基团的数目，并且选自1至12；
L21和L22是接头；
R23选自氢、羟基、任选地取代的氨基、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选的取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a21表示附接到[(AA)]n上的[(L21)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a22表示附接到[(AA)]n上的[(L22)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a23表示在C端和/或N端附接到[(AA)]n上的R23基团的数目，并且选自0、1或2；
*表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第一连接基团的连接点；
**表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第二连接基团的连接点。
L21和L22的接头类型不受特别限制，前提是它们能够连接到第一连接基团或第二连接基团。非限制性实例包括亚烷基键、亚芳基键、PEG键、基于羰基的键(例如酮、酯、酰胺)或其他键的组合。在一个实施方案中，接头是不可切割的接头。在另一个实施方案中，接头是可切割的接头。
在一个实施方案中，L21和L22各自独立地包括0到6个单元，每个单元独立地选自：
-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基-CO)-和-(CO-任选取代的亚烷基)-，
其中w从1到6中选择。
其中L21和/或L22包含0个单元，这是指当第一连接基团或第二连接基团直接连接到其中一个AA基团的N端，C端或侧链时。
在一个实施方案中，根据式2的主体部分可以包含一个或多个AA基团，所述AA基团具有包含任选取代的氨基的侧链。优选地，包含氨基基团的侧链可以是-(任选取代的亚烷基)-(任选取代的氨基)基团。
在一个实施方案中，包含氨基基团的侧链可以包含一个或多个赖氨酸基团。优选地，根据式2的主体部分可包含一至四个赖氨酸基团。更优选地，根据式2的主体部分可包含三个赖氨酸基团。甚至更优选地，根据式2的主体部分可以由三个赖氨酸基团(Lys-Lys-Lys)组成，或者由三个赖氨酸基团和一个丝氨酸基团(例如Lys-Lys-Lys-Ser)组成。
在一个实施方案中，n可以从2到10中选择。优选地，n可以选自2至6。更优选地，n可以选自3至6。甚至更优选地，n可以是3或4。甚至更优选地，n可以是3。
在一个实施方案中，任意两个AA基团可以通过接头分离。任何两个AA基团之间的接头的类型没有特别限制，只要它们能够连接到两个AA基团即可。非限制性实例包括亚烷基键、亚芳基键、PEG键、基于羰基的键(例如酮、酯、酰胺)或其他键的组合。在一个实施方案中，接头是不可切割的接头。在另一个实施方案中，接头是可切割的接头。
任何两个AA基团之间的接头可以包括0至6个单元，每个单元独立地选自：
-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基-CO)-和-(CO-任选取代的亚烷基)-，
其中w从1到6中选择。
优选地，任意两个AA基团之间的接头选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-，-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。
在一个实施方案中，任意两个AA基团可以彼此直接连接。
在一个实施方案中，所有“(AA)n”中的任意两个AA基团彼此直接连接。
在一个实施方案中，一个AA基团的羰基部分可以连接到另一个AA基团的胺部分，一个AA基团的羰基部分可经由另一AA基团的侧链连接，一个AA基团的胺部分可经由另一AA基团的侧链连接，或一个AA基团的侧链经由另一个AA基团的侧链连接(任选地具有如本文所定义的一个AA基团和另一AA基团之间的接头)。
在一个实施方案中，“(AA)n”可以是AA基团的线性序列，其中每个AA基团连接到下一个AA基团，使得一个AA基团的羰基部分连接到另一AA基团的胺部分(任选地，如本文所定义的，具有在一个AA和另一AA基团之间的接头)。在一些实施方案中，AA基团的线性序列可以连接成使得任意两个AA基团直接彼此连接(即在任意两个AA基团之间没有接头)。
在一个实施方案中，L21和L22各自可以独立地包含0到5个单元。优选地，L21和L22各自可独立地包含0至3个单元。
在一个实施方案中，L21和L22中的任何两个相邻单元可以彼此不同。
在一个实施方案中，L21和L22中的每个单元可以独立地选自
-(任选取代的亚烷基)-和-(CO)-。
在一个实施方案中，L21和L22可以独立选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-，-(NHCO)-O-，-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代亚烷基)-(CO)-、-(任选取代亚烷基)-(NHCO)-(任选取代亚烷基)-，-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(COH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，L21和L22可以独立地从-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)-和-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-中选择。本文所指的L21和L22从左到右的单位顺序可以分别从(AA)n基团到连接点(*)到第一连接基团和连接点(**)到第二连接基团读取。
在一个实施方案中，L21可以选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-，-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代亚烷基)-(CO)-、-(任选取代亚烷基)-(NHCO)-(任选取代亚烷基)-、-(任选取代亚烷基)-(CONH)-(任选取代亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2o)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(COH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(COH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，L21可以选自-(CO)-和-(CO)-(任选取代的亚烷基)-。
在一个实施方案中，L22可以选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-，-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-、-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，L22可以从-(CO)-和-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-中选择。
在一个实施方案中，L21和L22的w可以从1到4中独立选择。
在一个实施方案中，连接到C端的R23基团可以从羟基、任选取代的氨基和任选取代的烷氧基中选择。优选地，连接到C端的R23基团可以从羟基和任选取代的氨基中选择。更优选地，连接到C端的R23基团可以是任选取代的氨基。甚至更优选地，连接到C端的R23基团可以是-NH2。
在一个实施方案中，连接到N端的R23基团可以选自氢、任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。优选地，连接到N端的R23基团可以选自氢和任选取代的烷基。更优选地，连接到N端的R23基团可以是氢。
在一个实施方案中，a21可以是2或3。优选地，a21可以是3。
在一个实施方案中，a22可以是1或2。优选地，a22可以是1。
在一个实施方案中，a23可以是0。在另一个实施方案中，a23可以是1。
在一个实施方案中，与第一连接基团的连接点可以是通过AA基团之一的侧链。在存在多于一个第一连接基团的实施方案中，与第一连接基团(一个或多个)的至少一个连接点可以经由至少一个AA基团的侧链。优选地，在存在多于一个第一连接基团的情况下，与第一连接基团中的每个连接点是经由独立选择的AA基团的侧链。在一些实施方案中，单个AA基团可以连接至多一个第一连接基团。
在一个实施方案中，与第二连接基团的连接点可以经由C端或N端。优选地，与第二连接基团的连接点可以经由N端。
当存在时，与第三个连接基团的连接点可以是经由其中一个AA基团的侧链(例如在丝氨酸基团上)，或经由C端。优选地，与第三连接基团的连接点可以是经由C末端。
当存在时，第三连接基团可以直接连接到主体部分。在其他实施方案中，第三连接基团可以经由接头间接连接到主体部分。在这种情况下，用于第三连接基团的接头的类型没有特别限制，只要接头能够将第三连接基团(共价地)连接到主体部分即可。非限制性实例包括亚烷基键、亚芳基键、PEG键、基于羰基的键(例如酮、酯、酰胺)或其他键的组合。在一个实施方案中，接头是不可切割的接头。在另一个实施方案中，接头是可切割的接头。
在一个实施方案中，用于第三连接基团的接头可以选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(NH)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-，-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-、-O-(CO)-、-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-，-(CONH)-O-，-(CONH)-(NHCO)-，-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-，-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代亚烷基)-(CO)-、-(任选取代亚烷基)-(NHCO)-(任选取代亚烷基)-、-(任选取代亚烷基)-(CONH)-(任选取代亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。优选地，与第三连接基团的接头可以是-(NH)-(任选取代的亚烷基)-。这里所指的第三连接基团的单元从左到右的顺序可以从(AA)n基团到第三连接基团的连接点读取。
在一个实施方案中，核心选自：
/>
制备方法
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供了至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)提供至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，并将至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接到至少一个包含B细胞表位序列的多肽，
其中CD4+T淋巴细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域或与所述区域具有至少80％序列同一性的序列，并且其中CD4+T细胞表位在至少50％的群体中具有免疫原性，其中至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸，
其中B细胞表位的序列与CD4+T细胞表位的序列不同，并且
其中，对B细胞表位的特异性抗体与缀合物结合。
在一个实施方案中，至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过一个核心连接，
其中所述核心在连接之前包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交；
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供一个核心，其包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
第一连接基团和第二连接基团中的至少一个包含两个或更多第一连接基团或第二连接基团，和
第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、，硫醇和叠氮化物：优选其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基：更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基基独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基。
其中所述核心不是：
优选地，其中核心如本文所定义；
(b)提供至少一个包含B细胞表位序列的多肽，或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽；并将所述核心与至少一个包含B细胞表位序列的多肽反应形成第一连接元件，或将所述核心与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽反应形成第二连接元件。关于至少一个包含B细胞表位序列的多肽和/或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的其他优选实施例如上所述，并且同样适用于该方法。关于核心的其他优选实施方案在上面进一步详细描述，并且同样适用于该方法。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括以下步骤：
(c)提供步骤(b)中未提供的至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽或至少一个包括B细胞表位的序列的多肽中的另一个；以及如果在步骤(b)中形成第一连接元件，则使所述核心与所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽反应以形成第二连接元件；或者如果在步骤(b)中形成第二连接元件，则使所述核心与所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽反应以形成第一连接元件。
在一个实施方案中，步骤(b)可涉及形成非共价键或共价键。优选地，步骤(b)可以涉及共价键的形成。
在一个实施方案中，步骤(b)可以涉及点击反应。优选地，该反应涉及环加成反应(例如，1，3-偶极环加成，包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成和应变促进的叠氮化物-炔烃环加成或叠氮化物-烯烃环加成；四嗪连接，例如与四嗪和环炔烃或反式环烯烃的连接；Diels-Alder环加成反应)，亲核取代，迈克尔反应，或点击反应的其他示例。
在一个实施方案中，步骤(c)可涉及形成非共价键或共价键。优选地，步骤(c)可以涉及共价键的形成。
在一个实施方案中，步骤(c)可以涉及点击反应。优选地，该反应涉及环加成反应(例如，1，3-偶极环加成，包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成和应变促进的叠氮化物-炔烃环加成或叠氮化物-烯烃环加成；四嗪连接，例如与四嗪和环炔烃或反式环烯烃的连接；Diels-Alder环加成反应)，亲核取代，迈克尔反应，或点击反应的其他示例。
在一个实施方案中，在核心包括第三连接基团的情况下，该方法还可以包括以下步骤：
(d)提供本文所定义的另一种物质，并使所述核心与所述另一种物质反应以形成第三连接元件。
在一个实施方案中，步骤(d)可以在步骤(c)之后进行。
在一个实施方案中，步骤(d)可涉及形成非共价键或共价键。优选地，步骤(d)可以涉及共价键的形成。
在一个实施方案中，步骤(d)可以涉及点击反应。优选地，该反应涉及环加成反应(例如，1，3-偶极环加成，包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成和应变促进的叠氮化物-炔烃环加成或叠氮化物-烯烃环加成；四嗪连接，例如与四嗪和环炔烃或反式环烯烃的连接；Diels-Alder环加成反应)，亲核取代，迈克尔反应，或点击反应的其他示例。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括打开马来酰亚胺-硫醇加合物环(即打开琥珀酰亚胺环)的步骤。在一个实施方案中，打开马来酰亚胺-硫醇加合物环的步骤可以在步骤(b)之后提供。在另一个实施方案中，打开马来酰亚胺-硫醇加合物环的步骤可以在步骤(c)之后提供。在另一个实施方案中，打开马来酰亚胺-硫醇加合物环的步骤可以在步骤(d)之后提供。
附加组分
在其他实施方案中，提供了一种组合物、药物组合物和/或试剂盒，其包含多肽、多肽的混合物、核酸分子、核酸分子的混合物、缀合物、缀合物的混合物和/或如上所述的上述的组合(下文称为“药物”或“多种药物”)。在某些实施方案中，所述组合包含如上所述的多肽和/或核酸分子和/或缀合物中的任何一种的混合物，但在替代实施方案中各自的组分以试剂盒的形式提供在单独的容器中。在其他实施方案中，提供了如下所述的第一产物和第二产物，它们以混合物的形式提供，或者，可替换地，第一和第二产物以试剂盒的形式提供在单独的容器中。
在一个实施方案中，药物组合物和/或试剂盒包含药学上可接受的佐剂、稀释剂和/或赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物和/或试剂盒包括药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂。应当理解的是，在一些实施方案中，药学上可接受的佐剂、稀释剂和/或赋形剂作为组分与药物一起提供，而在其他实施方案中，药学上可接受的佐剂、稀释剂和/或赋形剂以试剂盒的形式提供在与药物分开的容器中。优选的是，所提供的组分以单一制剂的形式混合。
还应理解的是，在试剂盒中的单独容器中提供组分的情况下，在一些实施方案中，当使用试剂盒时，在给个体施用之前将组分组合，而在其他实施方案中当使用试剂时，将组分单独给个体施用。
示例性佐剂包括Poly I：C(Hiltonol)、CpG、脂质体、微球、病毒样颗粒(免疫刺激复合物，ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(IFA)、弗氏完全佐剂(CFA)、磷酸铝、氢氧化铝、明矾和/或细菌毒素(例如霍乱毒素和/或沙门氏菌毒素)或任何种类的纳米粒子制剂。在一个实施方案中，佐剂是一种或多种佐剂的组合。在一个实施方案中，佐剂是IFA和CpG。进一步的示例性佐剂包括咪喹莫特、吡喃葡萄糖基和/或脂质A。优选的佐剂是GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)。在一个实施方案中，GM-CSF是沙格司亭。用于靶向免疫系统的T细胞臂的疫苗的示例性佐剂在Petrovsky和Aguilar，Immunol cell Biol.2004 82(5)：488-96中有详细描述，其通过引用并入本文。
示例性稀释剂和赋形剂包括灭菌水、生理盐水、培养液和/或磷酸盐缓冲液或脂质和/或基于纳米粒子的制剂。
还应当理解，在特定实施方案中，药物是核酸分子，并且这是在脂质或纳米粒子制剂中提供的。
在一些实施方案中，药物组合物和/或试剂盒还包括另外的治疗成分。示例性的进一步的治疗成分包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介蛋白-12(IL-12)、另外的多肽(也就是说，除了上述那些之外的多肽)、化疗剂、止痛药、抗炎剂和/或抗癌剂。
药物组合物和/或试剂盒的附加组分的进一步细节可以在Remington’spharmaceutical Sciences and US Pharmacopic，1984，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA中找到。
本发明的方法
在使用中，如上所述的缀合物、缀合物的混合物、多肽、多肽的混合物、核酸分子、核酸分子的混合物、组合、组合物或药物组合物(“药物”)被施用于受试者。
在提供包含本发明的缀合物、多肽、多肽的混合物、核酸分子、核酸分子的混合物和/或组合的试剂盒的实施方案中，在使用中，将试剂盒的每个组分施用于受试者。如上所述的试剂盒的组分同时、单独或顺序施用于受试者。在一个实施方案中，试剂盒包括如上所述的另外的治疗成分。在这样的实施方案中，缀合物、多肽、多肽的混合物、核酸分子、核酸分子的混合物和/或组合与另外的治疗成分同时、单独或顺序地施用于受试者。
在其他实施方案中，第一产物和第二产物被施用于受试者，并且在这方面，第一产物与第二产物可以一起被认为是“药物”，尽管它们不一定是单个产物。第一种产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少8个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，其由(i)至(iii)中任一项所定义的多肽组成；和
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成。
第二产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(ii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少17个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，其包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；和
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成。
在本实施方案的一些变体中，第一产物和第二产物同时、顺序或单独施用。在这些变体中，第一产物可以在第二产物之前施用，或者第二产物可以在第一产物之前施用。在本实施方案的一些可供选择的变体中，第一产物和第二产物组合为单个产物(即混合物)并作为单个产物施用，并且在这些可供选择变体中，以下条件适用：
(a)其中第一产物和第二产物为单个多肽，且第一产物如(i)至(iii)中任一项所定义且所述第二产物如(vi)至(viii)中任一项所定义，则所述单个多肽的长度等于或小于170个氨基酸；和
(b)其中第一产物和第二产物是单个产物并且第一产物如(v)中所定义并且第二产物如(x)中所定义，则单个核酸分子的长度小于1500个核苷酸。
例如，在一个实施方案中，第一产物是包含SEQ ID NO：1序列的多肽，第二产物是包含SEQ ID NO：116序列的多肽，第一产物和第二产物混合但保持为分离的分子。在另一个实施方案中，第一产物是包含SEQ ID NO：1序列的第一多肽，第二产物是包含SEQ ID NO：116序列的第二多肽，第一多肽和第二多肽一起形成长度等于或小于170个氨基酸残基的单个融合蛋白。在另一个实施方案中，第一产物是编码包含SEQ ID NO：1的序列的多肽的核酸分子，第二产物是编码包含SEQ ID NO：116的序列的多肽的核酸分子，其中第一产物和第二产物混合但保持为分离的分子。在另一个实施例中，第一产物是编码包含SEQ ID NO：1序列的多肽的第一核酸分子，第二产物是编码包含SEQ ID NO：116序列的多肽的第二核酸分子，第一和第二核酸分子一起形成长度小于1500个核苷酸的单个核酸分子。
在一个实施方案中，受试者是需要治疗的患者。在另一个实施方案中，患者是癌症患者。在替代实施方案中，药物或试剂盒的组分在任何疾病症状之前施用于受试者，以提供预防性治疗。在一个实施方案中，所述疾病是癌症，并且在癌症的任何症状之前向受试者施用药物或试剂盒的组分，以便提供针对癌症的保护性免疫。
如上所述，本发明的缀合物包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽。在一个实施方案中，要施用药物或试剂盒组分的受试者具有预先存在的、对B细胞表位特异性的循环抗体。在替代实施方案中，受试者不具有预先存在的、对B细胞表位特异性的循环抗体。在另一个实施方案中，受试者具有对B细胞表位特异性的预先存在的循环抗体，但希望提高抗体的水平。在受试者不具有预先存在的循环抗体或希望提高其水平的实施方案中，在施用药物或试剂盒的组分之前，给受试者施用疫苗以诱导B细胞对B细胞表位的应答(从而诱导抗体产生)。在一个实施方案中，在施用缀合物之前测定待施用缀合体的受试者中对B细胞表位特异性的抗体的存在和/或抗体水平。在一个实施方案中，在施用药物或试剂盒的组分之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周施用诱导B细胞对B细胞表位的应答的疫苗。
在一个替代实施方案中，对受试者被动施用对B细胞表位特异性的抗体，以在受试者中提供对B细胞表位的被动体液免疫应答。在一个实施方案中，将对B细胞表位特异性的抗体与药物或试剂盒的组分同时、单独或顺序施用于受试者。在一个实施方案中，在溶液或血清中提供对B细胞表位特异性的抗体。
在其中B细胞表位源自SEQ ID NO：3至5中任意一个，诱导B细胞对B细胞表位应答的疫苗是破伤风疫苗。在一个实施方案中，破伤风疫苗包含破伤风类毒素(TTd)、其片段和/或破伤风毒素(TTx)的片段。在另一个实施方案中，“破伤风疫苗”是白喉、破伤风和百日咳(DTP)组合疫苗或任何含有破伤风类毒素的疫苗。在一个替代实施方案中，抗TTx/TTd抗体与药物或试剂盒的组分同时、单独或顺序被动地施用于受试者。在一个实施方案中，给受试者施用包含抗TTx/TTd抗体的溶液或血清，例如Tetaquin或等效的抗TTx/TTPd抗体制剂。在一个实施方案中，给受试者施用来自高滴度抗TTx/TTd供体的分离的IgG级分。在一个实施方案中，在施用缀合物之前测定待施用缀合物的受试者中抗TTx/TTd抗体的存在和/或抗体水平。在优选实施方案中，如上所述的Tetox ELISA用于测定抗TTx/TTd抗体的存在和/或水平。
在一个实施方案中，诱导B细胞对B细胞表位应答的疫苗至少两次施用于受试者。因此，受试者至少接种了第一(初免)剂量和至少第二(加强)剂量的疫苗。在一个实施方案中，受试者在儿童时期已经接受了至少第一(初免)剂量和至少第二(加强)剂量，并且在施用缀合物之前施用至少另一个加强剂量。在一个实施方案中，在施用药物或试剂盒的组分之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周施用至少一个加强剂量。
在不希望被理论束缚的情况下，认为在施用缀合物时，受试者中的循环抗体(即预先存在的、接种疫苗后诱导的或被动转移的)与B细胞表位结合以形成免疫复合物(IC)，其将缀合物直接导向/靶向到抗原呈递细胞(APC)。因此，每个缀合物包含一个以上包含B细胞表位的多肽是有利的，因为多个抗体然后能够同时与每个缀合物结合，从而促进免疫复合物的形成。在一个实施方案中，与B细胞表位结合的抗体的Fc部分与APC上的Fc受体结合。在另一个实施方案中，补体和C1q结合促进补体受体阳性APC或清除剂受体对缀合物的吸收。缀合物经由Fc受体和/或补体受体靶向APC并结合到APC(在一个实施方案中，APC是树突细胞(DC))促进APC的活化，伴随着活化的APC对缀合物的内化和细胞内处理。以这种方式，CD4+T细胞表位通过APC上的MHC II类分子呈递给相关的CD4+T淋巴细胞，并引发CD4+T应答。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位通过引流缀合物施用位点的淋巴结中APC上的MHC II类分子呈递给相关CD4+T细胞(在一个方案中，施用位点是疫苗注射位点)。因此，该缀合物能够有效地靶向APC，促进CD4+T细胞表位的加工和呈递给相关CD4+T细胞。在一个实施方案中，所述缀合物避免了与外部佐剂(例如GM-CSF)预刺激和/或共刺激的需要。
此外，包含对缀合物的B细胞表位具有特异性的B细胞受体的B细胞可通过B细胞受体介导的内化作用结合并内化缀合物。通过这种方式，B细胞还处理并呈递(在MHC II类分子上)缀合物的CD4+T细胞表位给相关CD4+T细胞。
通过将APC呈递给相关CD4+T细胞，至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽能够产生针对CD4+T细胞表位从其衍生的通用肿瘤抗原的辅助性T细胞应答。这支持产生针对通用肿瘤抗原的CD4+T细胞表位的特异性免疫应答。在一个实施方案中，至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽促进Th1免疫应答。Th1免疫应答对于针对癌细胞的免疫应答是重要的，因此有助于癌症的治疗或预防。在一个实施方案中，至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽产生T记忆细胞应答。T记忆细胞应答对于促进癌症的长期监测非常重要。
由缀合物的CD4+T细胞表位促进的T辅助应答，支持在已施用缀合物的受试者体内形成抗体调节的反馈环。更具体地说，由缀合物的CD4+T细胞表位刺激的辅助T细胞能够共刺激对缀合物的B细胞表位特异的B细胞。受刺激的B细胞产生对B细胞表位特异的抗体，从而在施用缀合物后增加受试者中对B细胞表位特异性的抗体水平。在一个实施方案中，对B细胞表位特异性的抗体水平的增加是对B细胞表位特异性的IgG抗体水平的增加。对B细胞表位特异性的抗体水平的增加改善了IC的形成和缀合物对APC的靶向。因此，这种抗体调节的反馈环改善了至少一个包含B细胞表位的多肽的佐剂功能。
图1B显示了本发明实施方案中激发免疫应答的建议的机制。
在缀合物包含CD8+T细胞表位的实施方案中，应理解的是，由于活化的APC对缀合物进行细胞内加工，CD8+T细胞表位可以与MHC I类分子以复合体在细胞表面上进行呈递，从而引发CD8+T细胞应答。
在药物包含多肽的实施方案中，多肽被抗原呈递细胞内吞，可以进行抗原加工，然后与MHC I类或II类分子以复合体在细胞表面上进行呈递。通过与T细胞表面上的T细胞受体相互作用，引发CD4+或CD8+T细胞应答。在药物包含核酸分子的实施方案中，核酸分子也被内吞，然后被转录(如果核酸分子是DNA)，并且编码的多肽通过内源性细胞途径合成。随后，如果靶细胞是抗原呈递细胞，则编码的多肽被加工并呈递在MHC分子上以引发T细胞应答，如前所述。或者，如果靶细胞是另一种细胞，例如肌肉细胞，成纤维细胞和其他非抗原呈递细胞，则编码的多肽将被抗原呈递细胞分泌和吸收。因此，该药物可用作疫苗以引发CD4+或CD8+T细胞免疫。
原则上，可以使用药物或试剂盒组分的任何施用方式，但特别优选注射。在一个实施方案中，通过肠胃外途径向受试者施用药物或试剂盒的组分，即通过皮内，皮下，肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内或病灶内途径施用。在优选实施方案中，药物或试剂盒的组分通过皮内，皮下或肌内途径施用。在一个实施方案中，弹丸注射的施用是有用的。
在药物是多肽的实施方案中，多肽的合适剂量在100和700μg之间，尽管偶尔可能需要超出该范围的剂量(例如1-1500μg)。在一个实施方案中，多肽与佐剂(优选GM-CSF，最优选沙格司亭)同时、单独或顺序施用。合适剂量的GM-CSF，优选沙格莫司汀，在20至100μg之间。在一个实施方案中，剂量为37.5μg，在优选实施方案中，剂量为75μg。
在药物是核酸分子的实施方案中，核酸分子的合适剂量在10至1000μg之间，尽管偶尔可能需要超出该范围的剂量(例如1-1500μg)。
在药物是本发明缀合物的实施方案中，缀合物的合适剂量在100和2000微克之间，尽管偶尔可能需要超出该范围的剂量(例如1-5000μg)。
在一个实施方案中，在向个体施用本发明缀合物之前至少7天向个体施用破伤风加强疫苗。这样，在接受本发明的缀合物之前，个体对最小破伤风毒素表位序列的免疫应答得到加强。
在某些实施方案中，提供了多种药物，并将其同时、单独或顺序地施用于个体。也就是说，可以在不同的时间以及基本上同时的方式施用药物。本文使用的术语“同时”是指同时施用一种以上的药物。同时包括同时施用，即在同一时期。在某些实施方案中，药物在同一小时内同时施用或在同一天内同时施用。在一些实施方案中，术语“顺序”是指药物在彼此之间的30天内施用。
应当理解，由于CD4+T细胞表位源自在高比例的肿瘤类型中表达的通用肿瘤抗原，因此本发明的功效不限于任何特定类型的肿瘤/癌症。原则上，在通用肿瘤抗原为hTERT的实施方案中，可以将药物或试剂盒的组分施用于患有端粒酶基因被激活的任何类型癌症的患者。或者，可以将药物或试剂盒的组分预防性地施用于有端粒酶基因被激活的任何类型癌症风险的受试者。端粒酶基因被激活的癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌和胆道癌。然而，由于端粒酶在绝大多数癌症中表达，因此应该理解，本发明的功效不限于任何特定类型的癌症。
端粒酶在绝大多数癌症中都有表达，这已在例如Kim等人，Science.1994Dec 23；266(5193)：2011-5和Bearss等人.Oncogene.2000Dec 27；19(56)：6632-41的研究中证明(两者均通过引用并入本文)。
Kim等人1994已经证明，在代表18种不同人体组织的培养细胞中，100个永生群体中有98个呈端粒酶阳性，而22个死亡群体中没有一个呈端粒酶阳性。来自具有端粒酶活性的永生细胞系的人体组织包括：皮肤，结缔组织，脂肪，乳房，肺，胃，胰腺，卵巢，宫颈，肾脏，膀胱，结肠，前列腺，中枢神经系统，视网膜和血液。因此，本发明适用于对抗来源于这些组织的癌症。同样，101例活检中有90例代表12种人类肿瘤类型，而50例正常体细胞组织中没有一例呈端粒酶阳性。表现出端粒酶活性的人类肿瘤类型包括：肝细胞癌，结肠癌，鳞状细胞癌(头颈部)，肾母细胞瘤，乳腺癌(导管和小叶，淋巴结阳性)，乳腺癌(腋窝淋巴结阴性)，前列腺癌，前列腺上皮内瘤变3型，良性前列腺增生，神经母细胞瘤，脑肿瘤，肺小细胞癌，横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血液系统恶性肿瘤(包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤(成人))，
Bearss等人2000进一步证明，直接从多种癌症类型的患者身上采集的肿瘤细胞中存在端粒酶活性。这些肿瘤类型包括：血液系统恶性肿瘤(包括急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病(早期)，慢性淋巴细胞白血病(晚期)，骨髓瘤，低度淋巴瘤，高度淋巴瘤)；乳腺；前列腺；肺(包括非小细胞和小细胞)；结肠；卵巢；头颈部；肾脏；黑色素瘤；成神经细胞瘤；胶质母细胞瘤；肝细胞癌；胃和膀胱。
应当理解，由于端粒酶在上述癌症类型中被激活，因此本发明适用于针对这些类型的癌症中的任何一种(实际上是端粒酶被激活的任何癌症类型)。此外，很明显，由于端粒酶的激活是癌症类型之间共有的共同特性，因此本发明不限于任何特定类型的癌症。
还应该理解的是，受试者通常会对自身抗原的表位产生一定程度的免疫耐受，例如端粒酶逆转录，通过一个过程，与这些表位反应的T细胞在T细胞发育过程中在受试者的胸腺中被破坏。因此，在本发明的一些实施方案中，需要具有相对低的MHC结合亲和力的表位。这是因为具有较低MHC结合亲和力的表位将以较低的速率暴露于成熟的T细胞，因此不太可能从受试者的T细胞库中删除与表位反应的所有受试者T细胞。因此，在一些实施方案中，具有相对低的MHC结合亲和力的表位能够更容易地克服免疫耐受。
在一些实施方案中，药物或试剂盒组分的施用导致“表位扩散”，由此免疫应答扩展至其他二级表位(Gulley等人，J Natl Cancer Inst.2017Apr 1；109(4))。
测定方法
根据本发明的另一方面，提供了一种测定受试者对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在的方法，所述受试者已被施用了缀合物，所述缀合物包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T淋巴细胞表位序列序列的多肽。本发明人惊讶地发现，施用这种缀合物导致对缀合物特异性的抗体水平增加(例如对缀合物中的B细胞表位特异的抗体)，但仅当缀合物包含B细胞表位和CD4+T细胞表位时发生这种情况。例如，这如实施例7所示，其中包含B细胞表位和CD8+T细胞表位的缀合物不能驱动对B细胞表位特异性的抗体水平的增加，而包含B细胞表位和CD4+T细胞表位的缀合物能够这样做。
不希望受到理论的约束，认为对缀合物特异性的抗体水平(例如对缀合物中的B细胞表位特异的抗体)的增加是由CD4+T细胞识别缀合物的CD4+T细胞表位引起的。特别地，由缀合物的CD4+T细胞表位刺激的CD4+T细胞能够共刺激对缀合物特异的B细胞(例如对缀合物的B细胞表位特异的抗体)，导致受刺激的B细胞产生对缀合物特异的抗体，从而增加该抗体的水平。本发明人已经惊讶地认识到，对缀合物特异性的抗体水平可以用作在施用缀合物的受试者中存在对缀合物的CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的生物标志物。
在本发明的方法中，从受试者采集血液样本。在第一实施方案中，在施用缀合物之前采集血液样本，所述缀合物包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽。在第一实施方案中，缀合物的B细胞表位包含SEQ ID NO：7的序列和CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：1的序列。在第一实施方案中，至少一个包含SEQ ID NO.7的序列的多肽是包含SEQ ID NO.7的序列的第一、第二和第三多肽。然后将缀合物施用于受试者至少一次。在优选实施方案中，受试者接受缀合物的一个施用周期，其中施用周期包括缀合物的多次注射，优选4次注射。因此，在一些实施方案中，应理解术语“施用”包括施用周期。在一些实施方案中，在缀合物的第一次施用或施用周期之前从受试者采集血液样本(即受试者是“首次用于实验的”受试者)。在替代实施方案中，在缀合物的进一步施用或施用周期之前采集血液样本(即受试者不是“首次用于实验的”受试者)。在第一实施方案中，在第一时间点施用缀合物后从受试者采集血液样本。在一个实施方案中，在施用缀合物后1、2、3、4、5、10、15、20、25或30天采集血液样本。
在另一个实施方案中，在施用缀合物之前采集的血液样本是在至少一次施用疫苗以诱导B细胞对B细胞表位的应答之后采集的。也就是说，受试者接受至少一次疫苗施用以诱导B细胞应答，然后采集血液样本。在优选的实施方案中，受试者接受2、3、4、5次或更多次的疫苗施用以诱导B细胞应答。因此，被施用缀合物的受试者是对B细胞表位具有免疫应答的受试者。应当理解，这样的样本包括在术语“源自在施用缀合物之前的受试者的样本”中。在优选实施方案中，在采集血液样本之前至少两次施用诱导B细胞对B细胞表位的应答的疫苗。在第一实施方案中，其中B细胞表位具有SEQ ID NO：7的序列，诱导对其B细胞应答的疫苗是破伤风疫苗(例如，如本文所定义)。在一个实施方案中，在至少一次施用疫苗以诱导B细胞对B细胞表位的应答后1、2、3、4、5、10、15、20、25或30天采集血液样本。
在第一实施方案中，在该缀合物的施用或施用周期之前和之后，源自受试者的样本分别与平板接触，平板上固定了包含SEQ ID NO.7序列的多肽。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO.7的序列的多肽被生物素化并固定在链霉亲和素包被的平板上。在第一实施方案中，通过ELISA检测每个血液样本中对SEQ ID NO.7序列特异的抗体的数量或抗体缺失。ELISA步骤先前已经描述过，例如在Fletcher等人，J Immunol.2018Jul 1；201(1)：87-97，通过引用将其并入本文。简而言之，一旦每个样本与平板接触，对SEQ ID NO.7序列具有特异性并存在于样本中的任何抗体都会与包含SEQ ID NO.7序列的固定的多肽结合。在一个实施方案中，对SEQ ID NO.7序列具有特异性的抗体是IgG抗体。然后洗涤并封闭平板以防止任何非特异性结合。将与酶缀合的二抗与平板接触，该酶催化反应产生可检测的信号，并通过洗涤除去任何过量的二抗。在一个实施方案中，其中待检测的抗体是IgG抗体，二抗是抗IgG抗体。在一个实施方案中，与二抗缀合的酶是辣根过氧化物酶(HRP)，并且通过四甲基联苯胺(TMB)的氧化产生可检测的信号，其产生颜色变化。检测该信号并用于确定每个样本中对SEQ ID NO.7序列特异的抗体的数量或缺失。在一个实施方案中，通过在分光光度计上测量450nm处的吸光度来检测信号。
通过上述方法，可以在施用缀合物之前在第一水平检测来源于受试者的样本中对SEQ ID NO.7序列特异的抗体的数量或缺失。通过上述方法，可以在施用缀合物之后在第二水平检测来源于受试者的样品中对SEQ ID NO.7序列特异的抗体的数量或缺失。在第一实施方案中，比较了第二水平和第一水平。相对于第一水平，第二水平的增加意味着在施用缀合物之后来源于受试者的样本中存在的抗体量高于施用缀合物之前来源于受试者的样本中的抗体量。在一个实施方案中，增加是统计学上显著的增加。这种增加表明受试者中存在对SEQ ID NO.1多肽的CD4+T细胞应答。这被认为是因为SEQ ID NO.1的多肽通过刺激CD4+T细胞共刺激了对SEQ ID NO.7序列特异的B细胞，从而产生了对SEQ ID NO.7序列特异的抗体。
相反，如果第二水平和第一水平的比较显示没有变化，小于10％的变化和/或无统计学上显著的变化，则这表明受试者中不存在CD4+T细胞对SEQ ID NO.1多肽的应答。
在另一实施方案中，在施用缀合物后的第二时间点从受试者采集血液样本。在一个实施方案中，第二时间点在上述第一时间点之前。也就是说，它在时间上更接近缀合物的施用。在一个实施方案中，第二时间点在施用缀合物后小于1天或1、2、3、4或5天。通过上述方法在第三水平检测在第二时间点来源于受试者的样本中对SEQ ID NO.7序列特异的抗体的数量或缺失。比较了第三水平和第二水平。相对于第三水平，第二水平的增加意味着在第一时间点(即从施用缀合物的时间更远)来自受试者的样本中存在的抗体量高于在第二时间点(即在时间上更接近施用缀合物)来源于受试者的样本中存在的抗体量。在一个实施方案中，增加是统计学上显著的增加。这种增加表明受试者中存在对SEQ ID NO.1多肽的CD4+T细胞应答。这被认为是因为在两个时间点之间的中间时间段内，SEQ ID NO.1的多肽通过刺激CD4+T细胞共刺激了对SEQ ID NO.7序列特异的B细胞，导致产生了对SEQ ID NO.7序列特异的抗体。
相反，如果第二水平和第三水平的比较显示没有变化，小于10％的变化和/或无统计学上显著的变化，则这表明受试者中不存在CD4+T细胞对SEQ ID NO.1多肽的应答。
在上述实施方案中，在施用缀合物后的第一和第二时间点采集血液样本。在另一实施例中，在施用缀合物后的3、4、5、6、7、8、9或10或更多时间点采集血液样本。应该理解的是，可以在这些时间点中的任何两个之间比较抗体的量或缺失，和/或可以比较每个时间点的抗体的量或缺失，从而绘制受试者中抗体随时间变化的水平。
在第一实施方案的变体中，在如上所述施用缀合物之后但不在施用缀合物之前采集血液样本。通过上述方法，可以在一种水平检测来源于在施用缀合物之后受试者的样品中对SEQ ID NO.7序列特异的抗体的数量或缺失。如果该水平高于阈值，则表明受试者中存在对SEQ ID NO.1多肽的CD4+T细胞应答。在一个实施方案中，阈值由来自多个受试者的数据的排序确定。
在上述实施方案中，从受试者采集血液样本。在一个实施方案中，血液样本在用于本发明方法之前被进一步处理，例如，以获得血浆样本或稀释的血浆样本。源自含有抗体的受试者的任何合适的样本都可以用于本发明的方法中。
在上述实施方案中，检测到的对SEQ ID NO.7序列特异的抗体是IgG抗体。在优选实施方案中，抗体是IgG1抗体或IgG4抗体。在替代实施方案中，待检测的抗体来自不同的免疫球蛋白类别(即除IgG之外)。
在上述实施方案中，ELISA步骤用于检测对B细胞表位特异的抗体。对于本领域技术人员来说，对上述ELISA步骤的各种修改将是显而易见的。在替代实施方案中，使用ELISA以外的步骤来检测对B细胞表位特异的抗体的量或缺失。在一个这样的替代实施方案中，使用试纸测定、斑点测定、侧向流体测定和/或中尺度测定(Meso-Scale assay)。
应当理解，用于诱导B细胞表位的B细胞应答的缀合物和/或疫苗可能已经给受试者施用了不止一次，例如，用于诱导B细胞应答的缀合物和/或疫苗可能已经给受试者施用了两次(或更多)。如果计划多次施用缀合物和/或疫苗以诱导B细胞应答，则在一些实施方案中，在最终计划施用之后从受试者采集血液样本。因此，在一些实施方案中，在最终计划施用缀合物和/或疫苗以诱导B细胞应答后1、2、3、4、5、10、15、20、25或30天采集血液样本。在替代实施方案中，在每次施用缀合物和/或疫苗以诱导B细胞应答后采集血液样本。应该理解的是，可以使用这些额外的样本来提供关于受试者中发展的免疫应答的更详细信息。
在上述实施方案中，两个检测到的抗体水平之间的增加，表明存在CD4+T细胞应答，是统计学上显著的增加。在一个实施方案中，使用配对t检验和≤0.05的p值(优选≤0.01的p值)确定统计学上显著的增加。在一个实施方案中，两个检测到的水平之间的增加是两倍的增加。在一些实施方案中，指示存在CD4+T细胞应答的增加是至少50％的增加，优选至少75％，100％，150％，200％的增加。
在上述第一实施方案中，已施用于受试者的缀合物的B细胞表位包含SEQ ID NO.7的序列。在替代实施方案中，B细胞表位包含不同的序列。在一个实施方案中，B细胞表位包含与SEQ ID NO.7的序列具有至少70％序列同一性的序列，优选与其至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性。在另一个实施方案中，B细胞表位包含源自破伤风毒素(SEQ ID NO.3)或破伤风毒素重链(SEQID NO.5)的序列，而不是SEQ ID NO.7的序列。在一个实施方案中，B细胞表位包括：(i)包含至少10个氨基酸的序列，这些氨基酸在SEQID NO.5中是连续的，并且包含氨基酸序列GITELKKL(如序列表中的SEQ ID NO.6所示)：或(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列，优选与(i)的序列同一性至少75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％。在一个实施方案中，B细胞表位不包含TTx重链的完整序列(SEQ ID NO.5)。在一个实施方案中，B细胞表位选自上述部分中描述的任何一种B细胞表位。
在上述第一实施方案中，已经施用于受试者的缀合物的CD4+T细胞表位包含SEQID NO.1的序列。在替代实施方案中，CD4+T细胞表位包含不同的序列。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO：116或117的序列。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含SEQ ID NO.1、116或117的免疫原性片段序列，其包含至少12个氨基酸。在另一实施方案中，CD4+T细胞表位包含与SEQ ID NO.1、116或117的序列或其免疫原性片段具有至少80％序列同一性的序列，优选至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在又一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含端粒酶逆转录酶的至少12个氨基酸的区域(SEQ ID NO.1、116或117的序列除外)或与该区域具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位包含不同自身抗原，不同肿瘤相关抗原和/或不同通用肿瘤抗原(即端粒酶逆转录酶除外)的至少12个氨基酸的区域或与该区域具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，通用肿瘤抗原选自存活蛋白，DNA拓扑异构酶2-α(Top2o)，细胞色素P4501B1(CYP1B1)和E3泛素蛋白连接酶Mdm2。在优选实施方案中，与上述任何一个区域的序列同一性为至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％。在一个实施方案中，包含CD4+T细胞表位的多肽的长度为500个氨基酸或更少。在另一个实施方案中，至少一个包含CD4+T细胞表位的多肽的长度等于或小于400、300、200、170、150、125、100、90、80、70、75、60、50、40或30。在一个实施方案中，CD4+T细胞表位选自上述部分中描述的任何一种CD4+T细胞表位。
特别优选的是，CD4+T细胞表位来自天然存在的蛋白质(例如来自内源性蛋白质的表位)或病毒或细菌蛋白质(例如与肿瘤微环境相关的)。还优选的是，CD4+T细胞表位是细胞内肽，例如作为肿瘤抗原或细胞内来源的细菌或病毒抗原的一部分的肽。在一些实施方案中，CD4+T细胞表位作为内源性肿瘤抗原存在。通过这种方式，对缀合物特异性的抗体的测量作为针对肿瘤或(任选的肿瘤相关)病原体(病毒或细菌)的T细胞应答相关的生物标志物。
在上述实施方案中，已施用于受试者的缀合物包含含有B细胞表位的第一、第二和第三多肽和含有CD4+T细胞表位的第一多肽。在一个实施方案中，本发明的方法使用源自受试者的样本，该受试者已被施用缀合物，该缀合物包含含有B细胞表位的第一、第一和第二或第一、第二和第三多肽以及含有CD4+T细胞表位的第一、第一和第二或第一、第二和第三多肽的任何组合。在一个实施方案中，至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽包含另外的T细胞表位序列。在一个实施方案中，另外的T细胞表位是CD8+T细胞和/或另外的CD4+T细胞表位。在另一个实施方案中，本发明的方法使用源自受试者的样本，该受试者已被施用缀合物，该缀合物包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽，至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽和至少一个包含另一表位序列的多肽。上面进一步详细描述了这种缀合物。
在一个实施方案中，本发明的方法使用源自受试者的样本进行，所述受试者已经施用了包含多个缀合物的疫苗。在一个实施方案中，多个缀合物是如本文所定义的缀合物的混合物。在另一个实施方案中，包含多个缀合物的疫苗是“TENDU”疫苗。TENDU疫苗包含6个SLP(称为“LUG1-6”)，其包含SEQ ID NO.47至51和45的序列，其含有源自PAP，GCPII/PSMA和NY-ESO-1的表位(如图8C所示)。6个SLP中的每一个都通过核心(核心1.0，参考合成实施例6)与包含SEQ ID NO.7的序列的三个拷贝缀合，更具体地说，与由SEQ ID NO.46组成的序列的三个拷贝缀合。
应当理解，本发明的方法不限于上述特定缀合物。通常，本发明的方法适用于包含至少一个B细胞表位和至少一个CD4+T细胞表位的任何缀合物，其中CD4+T细胞表位能够促进T辅助应答，其支持已施用缀合物的受试者中抗体调节的反馈环。也就是说，CD4+T细胞表位能够引发CD4+T细胞免疫应答，其共同刺激对缀合物的B细胞表位特异的B细胞，使得它们产生抗体，从而增加对受试者中缀合物特异性的抗体水平。通过这种方式，对缀合物特异性的抗体的量可以用作在已施用缀合物的受试者中存在CD4+T细胞应答的生物标志物。
应该理解的是，与直接测量CD4+T细胞应答相反，测量对缀合物特异性的抗体作为CD4+T细胞应答存在的生物标志物具有许多优点。通常，测量一定量的抗体需要从受试者身上采集较小体积的血液，并且测量一定量抗体的方法更快，更不复杂，成本更低。
在一个实施方案中，已被施用缀合物并从其获得样本的受试者是癌症患者。在CD4+T细胞表位是通用肿瘤抗原并且因此预期对多种癌症类型有效的实施方案中，患者所患的癌症不限于任何特定类型的癌症(如上所述)。如果受试者已经施用了TENDU疫苗(如上所述)，则癌症患者是前列腺癌患者。
本发明的方法能够提供关于癌症患者中缀合物的CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在(或不存在)的信息。在一个实施方案中，该信息用于在患者群体中对癌症患者进行分层和/或告知癌症患者接受的后续治疗和/或程序。在一个实施方案中，对缀合物的CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在表明癌症患者对缀合物的临床相关反应。也就是说，这种应答与癌症患者的临床结果改善有关。在一个实施方案中，改善的临床结果是部分或完全应答(也称为部分或完全缓解)或稳定的疾病。因此，本发明的方法可用于鉴定预期(或不预期)癌症患者的改善的临床情况。在一个实施方案中，本发明的方法用于研究(例如在临床试验中)根据本发明的缀合物与另一种物质的组合。
优选对检测到的对缀合物特异性的抗体是对缀合物中的B细胞表位特异性的抗体。
实施例
在下文中，将参考实施例对本发明进行具体描述。然而，这些实施例并不限制本发明的技术范围。
实施例1：SEQ ID NO：1在65％接种癌症疫苗UV1的患者中具有免疫原性。
背景
癌症疫苗UV1是三种hTERT多肽的混合物，该三种hTERT多肽的序列为SEQ ID NO.1(ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA；p719-20)，SEQ ID NO.52(RTFVLRVRAQDPPPE；p725)和SEQ ID NO.53(AERLTSRVKALFSVL；p728)。在非小细胞肺癌(NSCLC)(UV1/hTERT-2012-L)或前列腺癌(UV1/hTERT-2012-P)患者的两项临床研究中，已经研究了UV1特异性免疫应答作为单一疗法，并与抗CTLA-4抗体伊匹木单抗联合用于恶性黑色素瘤(UV1/hTERT MM)患者。研究共治疗了52名患者，其中51名可用于监测免疫应答。
材料与方法
在UV1疫苗接种之前，期间和之后收获的外周血单核细胞(PBMC)的再刺激后，使用标准T细胞增殖测定法(通过3H-胸苷掺入测量增殖：如先前在Inderberg-Suso等人，Oncoimmunology.2012Aug 1：1(5)：670-686所述)测量疫苗特异性免疫应答。用UV1疫苗混合物和单个疫苗肽(p719-20，p725和p728)对PBMC进行再刺激。如果至少一种疫苗肽或UV1疫苗混合物的肽应答至少是背景(刺激指数，SI≥3)的3倍，则认为特异性T细胞应答为阳性。
结果
表2显示了针对单个UV1肽(即p719-20，p725和p728)，UV1疫苗(即p719-20，p725和p728的混合物)或单个UV1肽或UV1疫苗的免疫应答。数据包括首次UV1疫苗接种后两年的随访。
表2：接种UV1的患者对UV1疫苗和单个UV1肽的免疫应答
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参考表2，免疫监测数据显示78％的患者可检测到UV1特异性免疫应答(即那些对单个肽或UV1疫苗之一表现出免疫应答的患者：参见标题为“p719-20，p728，p725或UV1”的栏)。在单个肽水平上，65％的患者识别p719-20肽(SEQ ID NO.1)，24％识别p728肽(SEQ IDNO.53)，39％识别p725肽(SEQ ID NO.52)。
在个体患者水平上，20％的患者识别出所有三种单独的UV1肽，20％识别出两种肽，40％识别出一种肽或UV1疫苗。在仅识别一种肽的患者中，有13位识别出p719-20(SEQID NO.1)，1位识别出p728(SEQ ID NO.53)，1位仅识别出p725(SEQ ID NO.52)。
讨论
表2中显示的数据表明，具有SEQ ID NO.1序列的多肽在65％的患者中具有免疫原性。患者群体由NSCLC、前列腺癌或恶性黑色素瘤患者组成，这些患者已被施用UV1癌症疫苗作为单一疗法或与抗CTLA-4抑制剂伊匹木单抗联合施用。
实施例2：UV1疫苗接种患者群体中HLA等位基因类型的频率代表欧洲群体
背景
对接种UV1癌症疫苗的患者(即实施例1中所述的52名患者)进行HLA等位基因分型，以确认该患者群体中存在的HLA等位基因频率在一般欧洲群体中具有代表性，并调查在使用HLA等位基因呈递UV1多肽的T细胞表位时是否存在任何偏倚迹象。
材料与方法
通过PCR序列特异性寡核苷酸确定所有接种UV1的患者的HLA等位基因分型，以将主要等位基因组解析为4位数。回顾性地进行了分析(即在将患者纳入临床试验之后)。对从患者血液样本中分离的PBMC进行分析。HLA等位基因分型数据来自52名非HLA选择的接种UV1的患者群体中的48名患者。
结果
表3显示了接种UV1的患者群体中存在的最常见的HLA等位基因的频率，以及这些等位基因在整个欧洲群体中的相应频率(括号中以粗体显示)。HLA等位基因频率是从等位基因频率数据库(http：//www.allelefrequencies.net/default.asp)中获得。
表3：最常见的HLA等位基因的频率
参考表3，HLA分型数据表明，接种UV1的患者群体中存在多种HLA等位基因类型。此外，在患者人群中观察到的频率与普通高加索/欧洲群体中记录的频率相当(http：//www.allelefrequencies.net/default.asp)。这些结果与临床试验招募患者不是基于HLA分型的事实一致。
讨论
表3中的数据表明，接种UV1疫苗的患者群体中HLA等位基因类型的频率代表了一般欧洲群体。
实施例3：在具有一系列常见HLA II类等位基因的患者中产生针对具有SEQ ID NO.1序列的多肽的免疫应答
背景
进一步分析实施例2的HLA等位基因分型数据，以研究已证明对p719-20肽(SEQ IDNO.1)有免疫应答的UV1疫苗接种患者中HLA II类等位基因的分布。
结果
表4显示了患者数量(n＝)和具有三种最常见的HLA-DR，-DQ和-DP单倍型(等位基因)的相应百分比(即表中三行中显示的上部的一组数字)。表4还显示了携带每个等位基因的患者数量，这些患者对具有SEQ ID NO.1(n＝：下划线)序列的多肽有反应，以及携带每个等位基因的患者对具有SEQ ID NO.1(括号中)序列的多肽有反应的百分比(即表中三行中显示的下部的一组数字)。
表4：分布最频繁的HLA II类等位基因与针对具有序列SEQ ID NO.1的多肽的免疫 应答数据相结合
参考表4中的数据，对个体患者进行的HLA等位基因测定和SEQ ID NO.1多肽的免疫应答分析表明，在所有最常见的HLA II类单倍型患者中都产生了针对SEQ ID NO.1多肽的免疫应答，在9种最常见的单倍型中，有7种具有>50％的应答者。
讨论
表4中的数据表明，SEQ ID NO.1的多肽能够被欧洲一般群体中常见的一系列HLAII类等位基因识别。该观察结果以及完全杂合的患者表达9种不同的HLA II类单倍型的事实，解释了在3个不同的患者群体中，针对SEQ ID NO.1多肽的免疫应答者的比例很高(如实施例1所述)。因此，源自通用肿瘤抗原hTERT的SEQ ID NO.1多肽预期在广泛(或全部)癌症适应症中提供广泛的群体覆盖。
实施例4：来自UV1疫苗接种患者的不同T细胞克隆识别SEQ ID NO.1内的不同区域
背景
人类受试者的T细胞免疫应答由两种细胞类型(APC和T细胞)决定，其特异性由3种分子(HLA I/II类，肽和T细胞受体(TCR))决定。在单个个体中，可以表达6种不同的HLA I类和6种HLA II类分子，而在群体基础上存在数千种不同的多态性变体。不同肽的数量实际上是无限的。单个个体中不同TCR的数量也非常高。
用于HLA I类结合的肽的加工在蛋白酶体中受到高度调节，并产生短肽(8至10聚体)。蛋白酶体切割位点限制了从给定蛋白质产生的8至10聚体的数量。将肽加载到HLA I类中也通过转运蛋白和蛋白伴侣等进行高度调节。相反，用于HLA II类结合的肽的加工非常复杂(Stem LJ，Santambrogio L，Curr Opin Immunol.2016；40：70-77)，最初被认为仅发生在内体中。内体代表了用于蛋白质分选和降解的高度动态和多样化的系统。内体在蛋白质降解中的一项主要任务是提供单个氨基酸以重新用于蛋白质合成。这一目标是通过使用多种内、外蛋白酶的组合来实现的。II类分子到达内体，其结合位点受恒定链(1i)保护，恒定链在溶酶体中被切割，使结合位点开放以捕获具有适合特定II类分子的氨基酸序列/结合基序的肽。因此，HLA II类分子使这些分子免于进一步降解，并被转运到细胞表面。肽的核心结合基序对于结合是必需的，但是肽洗脱后的质谱分析表明，这些肽具有在核心结合基序的两个位点处延伸的“不规则的末端”(Muntasell等人，J Immunol.2002Nov 1；169(9)：5052-60.)。单个CD4+T细胞克隆的识别需要通过核心结合基序与相关的II类分子结合，但受侧翼氨基酸的影响。
因此，源自多肽(例如SEQ ID NO：1)和具有相同结合基序的的不同长度的肽可以活化不同的T细胞。肽与不同HLA II类分子结合的混杂性将进一步扩大活化的不同T细胞克隆的数量。因此，长肽，例如嵌入了几个核心结合基序的SEQ ID NO：1，将扩大疫苗的群体覆盖率。
结果
表5显示了T细胞克隆的精细基因定位以及SEQ ID NO：1中被每个克隆识别的序列。数据基于源自对UV1疫苗接种有反应的患者的T细胞克隆。表5中列出的所有克隆在体外测试时都对SEQ ID NO：1的多肽有反应(使用如实施例1中所述的T细胞增殖测定法)。此外，使用源自SEQ ID NO：1的一系列重叠肽对T细胞克隆进行了测试。如表5所示，HLA-DR分子优先呈递存在于具有至少2个等位基因(DR12和DR7)的SEQ ID NO：1的30聚多肽的N端一半中的肽，而DQ2和DQ7等位基因呈递C端部分。数据显示，源自SEQ ID NO：1的30聚多肽的一系列14聚肽由不同的HLA II类分子呈递，并且可以被不同的T细胞克隆识别。
单个T细胞克隆识别由表5中所示的14聚肽表示的SEQ ID NO：1的不同“框架”。因此，三个DR12限制性克隆仅识别第一个N端14聚体。当去除N端丙氨酸并添加C端甘氨酸时，反应性丧失。DR7限制性克隆的偏好各不相同。当去除N端丝氨酸并添加C端甘氨酸时，克隆4、12、21和92的反应性丧失。另一方面，克隆15仍然识别该肽，但当去除N端缬氨酸并添加C端天冬氨酸时，识别被取消。相反，来自患者5的克隆109识别出6种不同的14聚肽，并且似乎仅取决于“NYERARRPG”的9聚体核心结合序列(SEQ ID NO：163)的存在。这些克隆的初步DR特异性是HLA-DR8。用HLA-DQ7限制性T细胞克隆观察到类似的结果：克隆8似乎需要“RRPGLLGAS”的9聚体核心结合序列(SEQ ID NO：164)，而克隆10不识别克隆8识别的前两个肽。因此，C端亮氨酸需要到位才能获得该克隆的识别。克隆52识别由核心结合区“LLGASVLGLDDI”(SEQ ID NO：165)组成的C端框架。
表5：识别来自SEQ ID NO：1的肽的T细胞克隆的精细基因定位
序列(SEQ ID NO.) HLA II类等位基因，T细胞克隆
ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA(SEQ ID NO：1) 所有克隆
ALFSVLNYERARRP(SEQ ID NO：12) DR12，克隆44，38，6
LFSVLNYERARRPG(SEQ ID NO：13) p5-克隆109
FSVLNYERARRPGL(SEQ ID NO：14) p5-克隆109
SVLNYERARRPGLL(SEQ ID NO：15) DR7，克隆4，12，21，15，92，p5-克隆109
VLNYERARRPGLLG(SEQ ID NO：16) DR7，克隆15，p5-克隆109
LNYERARRPGLLGD(SEQ ID NO：17) p5-克隆109
NYERARRPGLLGAS(SEQ ID NO：18) p5-克隆109
NYERARRPGLLGAS(SEQ ID NO：18) DQ7，克隆8
YERARRPGLLGASV(SEQ ID NO：19) DQ7，克隆8
ERARRPGLLGASVL(SEQ ID NO：20) DQ7，克隆8，10
RARRPGLLGASVLG(SEQ ID NO：21) DQ7，克隆8，10
ARRPGLLGASVLGL(SEQ ID NO：22) DQ7，克隆8，10
RRPGLLGASVLGLD(SEQ ID NO：23) DQ7，克隆8，10
PGLLGASVLGLDDI(SEQ ID NO：25) DQ2，克隆52
GLLGASVLGLDDIH(SEQ ID NO：26) DQ2，克隆52
LLGASVLGLDDIHR(SEQ ID NO：27) DQ2，克隆52
讨论
数据不仅指出了多肽的HLA结合的作用，其中不同的HLA II类分子基于对“核心结合”序列的偏好从较长的多肽中选择单个“框架”，但也强调了侧翼区域的组成在确定多肽(如SEQ ID NO：1)在癌症患者中产生的免疫应答的功效中的作用。因此，诸如SEQ ID NO：1的多肽在其总序列内包含被不同T细胞克隆识别的不同区域，这可能有助于该多肽的高免疫原性(例如，如实施例1中所述)。
实施例5：SEQ ID NO：116的多肽含有大量能够引发T细胞免疫应答的表位
材料与方法
对来自接种了GV1001(n＝4)或用hTERT mRNA(n＝3)转染的树突细胞(DC)并被鉴定为临床应答者的癌症患者的样本进行了表位分析(如WO 2011/101173和Inderberg-Suso等人，Cancer Immunol Immunother.2011Jun；60(6)：809-18所述，通过引用并入本文)。癌症患者包括黑色素瘤，肺癌，结肠癌和胰腺癌患者。简而言之，用重叠的hTERT肽文库刺激接种期间不同时间点的外周血单核细胞(PMBC)，然后使用731、713、714、730、715、729、722、709，726、727、732、723的肽在T细胞增殖测定中测试特异性T细胞应答(如Bernhardt等人，2006中所述，通过引用并入本文)。
结果
表6显示了经过表位分析的hTERT的活性位点区域的序列。在T细胞增殖测定中测试的单个肽被编号并加下划线(即731、713、714、730、715、729、722、709、726、727、732、723)和GV1001序列(SEQ ID NO：126，16聚多肽)，SEQ ID NO：116(30聚多肽)和SEQ ID NO：118(30聚多肽)的C端参考序列被突出显示并加下划线。由于GV1001疫苗接种后表位扩散(4名患者)或由于hTERT mRNA的转染DC疫苗接种(3名患者)产生阳性免疫应答的多肽，如果它们与SEQ ID NO：116共享8个氨基酸的最小序列(被认为是最小表位/核心结合区)，则被认为含有嵌入在(例如SEQ ID NO：116)中的表位。每种多肽的这种命中次数显示在下面的表6和表7中。
表7：T细胞对单个多肽的应答
讨论
表6和表7中的数据表明，在DC和GV1001接种的患者中，与GV1001和SEQ ID NO：118的C端参考序列相比，SEQ ID NO：116包含最高数量的能够增加T细胞免疫应答的表位。使用两种不同类型的患者材料对表位进行了重要验证。值得注意的是，由于GV1001疫苗接种和mRNA疫苗接种的表位扩散都依赖于hTERT蛋白的单个表位的加工，因此这些数据鉴定了真正天然加工的hTERT表位。在不同患者身上鉴定的几个表位的观察为这些表位提供了独立的验证。与SEQ ID NO：118的C端参考序列相比，SEQ ID NO：116和GV1001的应答者数量差异在GV1001接种的患者中相对高于DC接种的患者，这是由于与GV1001的直接疫苗应答的重叠。
这项分析是在已确定为临床应答者的患者样本上进行的，这表明针对本文分析的多肽的检测到的T细胞应答代表了临床相关的表位。因此，SEQ ID NO：116的多肽似乎含有大量临床相关的表位，并且如表6和表7中包含的数据所显示，表位的数量高于GV1001或SEQID NO：118的C端参考序列。
实施例6：预测的T细胞表位计数和群体覆盖率
背景
可以通过观察T细胞表位含量和群体HLA频率来估计用于癌症治疗的治疗性肽的群体覆盖率。在许多情况下，肽或肽混合物含有能够引发CD4+和CD8+T细胞活化的肽。这反过来意味着HLAI类和HLAII类结合都是相关的。如下表8所示，评估了一些肽的群体覆盖率。为了估算覆盖率，将HLA-肽结合的计算机预测与群体HLA等位基因频率数据一起使用。
材料与方法
群体HLA等位基因频率
使用来自等位基因频率网数据库(Gonzalez-Galarza等人，Nucleic AcidsRes.2020Jan 8；48(D1)：D783-D788)的HLA频率数据。该数据库包含来自超过1000多万供体的超过1600多个群体的信息。一个挑战是根据较小的研究选择具有代表性的高水平的群体(例如欧洲人，亚洲人)，这些研究在许多情况下是区域性的或侧重于某个种族群体。以澳大利亚为例，澳裔欧洲人与澳裔原住民有很大不同。但是，将美籍欧洲人与德籍人群进行比较，发现等位基因分布非常相似。为了将较小的研究结合到高水平的群体组中，使用了Bui等人(BMC Bioinformatics.2006Mar 17；7：153)使用的策略，其中更新的方法将数据分为16个地理区域。
HLA肽结合/T细胞表位的计算机预测
HLA I类和HLA II类结合的预测是使用SciCross内部算法完成的。对于经常出现的HLA等位基因，预测模型的准确性通常很高。这是由于算法训练数据的良好可用性。对于稀有等位基因，使用类似于Tepitopepan的方法进行HLAII类预测(Zhang等，PLoSOne.2012；7(2)：e30483)。
等位基因覆盖率
等位基因覆盖率分两步计算，最终分析分别地分为HLA I类和HLA II类的覆盖率：(i)使用目的肽对所有等位基因进行HLA结合预测。如果预测得分在模型得分分布的前5％百分位数中，则考虑等位基因特异性结合剂(binder)。如果预测至少有一个9聚体亚肽结合剂，则认为肽是给定的HLA等位基因的结合剂。输出是许多等位基因，其中肽具有至少一个预测的结合剂。(ii)预测的等位基因用于计算不同群体中的覆盖率。该步骤中使用的方法是Bui等人2006描述的方法的实施。此外，多肽组合的群体覆盖率可通过结合覆盖的其各自的等位基因来计算。
分析中使用的肽序列
如下表8所示，计算了五个肽/组合肽组的群体覆盖率和总表位计数。此外，如下文a)至c)所述，在HLA I类和II类等位基因覆盖率和群体覆盖率方面对肽进行了一些具体的比较。
表8：分析中使用的肽序列和组合
肽的具体比较：
a)SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：116及其组合；
b)SEQ ID NO：116与SEQ ID NO：118；
c)SEQ ID NO：116与SEQ ID NO：126(和与SEQ ID NO：1)；和
结果：
预测的表位总数
表9显示了如上表8所示的五种肽/肽组合的预测的表位总数。括号中给出了所涵盖的独特HLA等位基因的总数。如表9所示，SEQ ID NO：116似乎包含特别多的预测I类表位。此外，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：116的组合似乎产生了大量的预测I类和II类表位，这表明这些肽的组合有望具有高水平的功效。
表9：预测的表位的总数
具体比较
a)SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：116及其组合：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：116的HLAI类和HLAII类等位基因的预测覆盖率不同。对于I类等位基因，SEQ ID NO：116的覆盖率高于SEQ ID NO：1，而对于II类等位基因，SEQID NO：1的覆盖率高于SEQ ID NO：116(表9)。图2A显示了SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：116之间覆盖的HLA I类等位基因的比较。将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：116结合，有望获得更高的I类等位基因覆盖率。SEQ ID NO：116的肽贡献了最高数量的I类表位(它覆盖了19个独特的等位基因，见图2A)。与单独的每种多肽相比，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：116的组合为I类和II类表位两者(表9)提供了更高的总预测的表位计数。图3显示了基于HLA I类(图3A)和HLAII类等位基因(图3B)的SEQ ID NO：1和116的群体覆盖率。预计这两种多肽都将基于HLA II类等位基因提供高群体覆盖率(SEQ ID NO：1通常比SEQ ID NO：116提供略高的覆盖率)。SEQ ID NO：116基于HLA I类等位基因提供了特别高的群体覆盖率。
b)SEO ID NO：116与SEQ ID NO：118：
与SEQ ID NO：118相比，SEQ ID NO：116具有更高的预测的表位计数和更好的HLAI类等位基因覆盖率。图2B显示了所覆盖的I类等位基因之间的重叠情况。在这里可以看出，SEQ ID NO：118覆盖的大多数等位基因也被SEQ ID NO：116覆盖。SEQ ID NO：116和118之间HLAII类等位基因的总覆盖率相当接近。图2C显示了SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：118之间覆盖的HLAII等位基因的比较。覆盖的等位基因有很大的重叠，但每个单独的肽也覆盖了一组特定的等位基因。在群体覆盖率方面也注意到类似的结果模式(图6A和6B，比较“GV_LSE”和“C-ter-pep”)，SEQ ID NO：116预计将提供更高的群体覆盖率，特别是基于HLAI类表位。
SEQ ID NO：116与SEQ ID NO：126(和与SEQ ID NO：1)：
图2D和2E分别显示了SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：126之间覆盖的HLA I类等位基因和HLA II类等位基因的比较。尽管覆盖的HLA I类和II类等位基因之间存在一些重叠，但与SEQ ID NO：126相比，SEQ ID NO：116贡献了大量独特的等位基因，特别是与HLA II类等位基因有关。图4A和4B表明，与SEQ ID NO：126相比，SEQ ID NO：116将基于HLA I类表位(图4A)和HLA II类表位(图4B)提供更高的群体覆盖率。图5A和5B进一步显示了对于SEQ IDNO：116，126和SEQ ID NO：1，基于HLA I类和II类表位的群体覆盖率。如上所讨论的，SEQ IDNO：1基于HLAII类等位基因提供了特别高的群体覆盖率。
请注意，中美洲的HLA频率数据很少，这意味着无法从任何看似低的覆盖率中得出任何结论。
讨论
预测的T细胞表位和群体覆盖率数据表明，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：116，特别是这些多肽的组合，预期在广泛的(全球)人群中提供高水平的功效。
实施例7：向小鼠施用具有或不具有CD4 + T细胞表位的缀合物
实施例7a)：没有CD4 + 表位的缀合物不会驱动小鼠中对B细胞表位的抗体应答
材料与方法
给雌性C57BL/6小鼠施用缀合物，所述缀合物包含含有B细胞表位序列的多肽(MTTE：SEQ ID NO.7)和包含以下序列的多肽：AVGALEGSRNQDWLGVPRQL(SEQ ID NO.54)，其含有mgp100的鼠CD8+T细胞表位。缀合物不包含任何已知的完整CD4+T细胞表位或来自通用肿瘤抗原的任何CD4+T细胞表位。缀合物的施用进行了3次，每次皮下(SC)施用2nmol缀合物的间隔为1周。在最后一次施用缀合物后23天后，从小鼠中抽取血液，并用MTTE包被的链霉亲和素平板进行抗MTTE IgG ELISA检测，以评估小鼠是否产生了抗MTTE抗体。在注射缀合物的同一时间点，还向几只小鼠注射了单克隆抗MTTE IgG1抗体(皮下注射300μ0)作为对照。ELISA通过用浓度为1nmol/ml的含生物素化的MTTE的肽在4℃下过夜包被链亲和素平板来进行。之后，将平板用0.05％吐温溶液洗涤三次，然后用含有10％FBS和0.05％吐温的溶液封闭。将稀释的血浆样本在室温下孵育2小时，然后再次洗涤三次。使用二抗多克隆抗小鼠IgG1/HRP抗体检测与平板结合的抗MTTE抗体。将二级检测抗体在室温下孵育1小时，随后洗涤平板，并使用TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)显影平板。使用1M H2SO4终止反应。在450nm波长处读取吸光度。
结果
图7A显示缺乏CD4+T细胞表位的缀合物没有诱导内源性抗MTTE IgG1抗体(参见图7A，“皮下注射的小鼠(缀合物2nmol)”)。注射抗MTTE IgG1的动物在循环中显示抗MTTE抗体(参见图7A，“皮下注射的小鼠(aMTTE IgG1)”)。因此，只有注射被动转移的单克隆抗MTTEIgG1抗体的小鼠显示出可测量的抗MTTE抗体滴度。
讨论
图7A中显示的数据表明，施用没有已知CD4+T细胞表位的缀合物不能驱动小鼠中抗MTTE抗体的产生。
实施例7b)：包含CD4+表位的缀合物能够驱动小鼠中对B细胞表位的抗体应答
材料与方法
给小鼠施用缀合物，其包含含有B细胞表位序列的多肽(MTTE：SEQ ID NO.7)和含有序列ID NO.55的多肽，其含有非内源性通用CD4+T细胞表位，称为“PADRE”。
SEQ ID NO.55：ARWWWMHHNMDLIGGAKxVAAWTLKAu
其中：
x代表环己基-Ala；
u代表D-Ala；
ARWW(SEQ ID NO.56)是TAP序列(TAP序列是能够介导TAP驱动的多肽向宿主细胞内质网转运的序列)；
WMHHNMDLI(SEQ ID NO.57)是次要HY抗原的鼠CD8+T细胞表位；
GG是蛋白酶体切割位点；并且
AKxVAAWTLKAu(SEQ ID NO.58)是PADRE序列(即非内源性通用CD4+T细胞表位)。
向小鼠皮下注射1nmol的缀合物或单独的SEQ ID NO：55的裸肽(即不与MTTE序列缀合)。注射进行3次，每次间隔1周，最后一次施用缀合物或裸肽后9天，从小鼠抽血，并用MTTE包被的链霉亲和素平板进行抗MTTE IgG ELISA检测，如实施例1a)所述，以评估小鼠是否产生了抗MTTE抗体。
结果
图7B显示包含通用PADRE序列(即CD4+T细胞表位)的缀合物能够驱动针对缀合物的抗MTTE IgG1抗体的产生，因为暴露于缀合物的所有小鼠具有可测量的抗MTTE IgG1抗体滴度(参见图7B，“缀合物：MTTE3-HY-PADRE”)。与此相反，只暴露于含有PADRE序列的SEQ IDNO.55的裸肽(即未与MTTE序列缀合)的小鼠没有对MTTE序列的抗体(见图7B，″SLP：HY-PADRE″)(这是意料之中的，因为它们没有暴露于MTTE序列)。
讨论
图7B中显示的数据表明，将CD4+T细胞表位掺入缀合物中驱动小鼠中抗MTTE抗体的产生。因此，缀合物中CD4+T细胞表位(在本例中为PADRE序列)的存在导致抗MTTE抗体水平升高，尽管小鼠先前未暴露于破伤风疫苗接种。这可以与实施例7a)形成对比，其中没有CD4+T细胞表位的缀合物不能驱动小鼠中抗MTTE抗体的产生。
实施例8：包含含有B细胞表位和CD4 + T细胞表位的缀合物的疫苗(“TENDU”)能够驱 动兔子中对B细胞表位的抗体应答
材料与方法
TENDU疫苗包含缀合物，每个缀合物含有三个拷贝的B细胞表位(MTTE：SEQ IDNO.7)和包含CD4+T细胞表位的SLP(关于TENDU疫苗结构的进一步细节在图8C中提供)。它由Meditox(捷克共和国，科纳罗维斯)在雄性兔子中进行了测试。用破伤风类毒素(TTd)疫苗(T vet.≥30IU/ml，Orion Pharma Animal Health)皮下接种兔子四次(间隔两周)，以产生循环的抗MTTE抗体(图8A)。两周后，以低剂量(10μg/缀合物，n＝5)，中等剂量(100μg/缀合物，n＝5)或高剂量(240μl/缀合物，n＝8)对兔子皮下接种四次TENDU(间隔两周)。两个对照组是仅接受TTd疫苗(n＝5)的兔子和仅接受高剂量TENDU(n＝5)而不接受T vet的兔子。TTd疫苗接种周期(第8周)和TENDU疫苗接种周期(第15周)结束后，采集血液样本进行血清学分析，以检测MTTE特异性抗体的产生，这是由Capra Science(瑞典)进行的。兔抗MTTE滴度由Capra Science antibodies AB在内部ELISA中测定，其中使用生物素化的MTTE包被的链霉亲和素平板检测TTd疫苗接种前后以及TENDU疫苗接种前后诱导的兔抗MTTE抗体。与碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG作为二抗。使用底物4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物(1mg/ml)。在405nm处测量吸光度，并使用曲线拟合来确定疫苗接种前后的滴度。
结果
图8B显示TTd在兔子中诱导低水平的抗MTTE抗体滴度，这在中等剂量和高剂量的TENDU疫苗缀合物中通过TENDU疫苗接种大大增强(图8B)。与由TTd疫苗接种诱导的预先存在的抗MTTE抗体应答的组相比，仅用TENDU疫苗接种的兔子(图8B，“无TTd”)具有低水平的抗MTTE抗体。因此，兔子的抗MTTE滴度应答显示出差异，这取决于它们是否具有由TTd暴露诱导的预先存在的抗MTTE应答。具有预先存在的抗MTTE应答的兔子在高剂量TENDU疫苗接种周期(配对t检验：p＝0.0013)之前与之后显示出显著升高的抗MTTE抗体滴度，这在暴露于相同高剂量TENDU但没有预先存在的对MTTE序列的抗体的动物中没有这种情况。
讨论
TENDU疫苗不是专门设计用于携带兔特异性T细胞表位的，但兔MHC分子仍然可以呈递来自TENDU疫苗缀合物中包含的合成的长肽的肽，因此这些长肽可以在兔子中驱动产生抗MTTE抗体。在具有预先存在的抗体的兔子中，可以发生免疫复合体的形成，其应该根据如图1所示的作用模式诱导免疫应答。滴度数据表明活性物质已经在临床相关模型中施用，并且包含含有MTTE B细胞表位和CD4+T细胞表位的缀合物的疫苗可以驱动模型中抗MTTE抗体的产生。数据证实了递送途径和所选剂量的作用方式。它还支持在开始用包含(MTTE)B细胞表位和CD4+T细胞表位(在本例中为TENDU疫苗)的缀合物接种之前使用TTd加强疫苗。但是，就抗体产生而言，进一步注射缀合物可能会产生与使用TTd加强剂相似的作用。
实施例9：通过抗MTTE抗体评估缀合物结合
材料与方法
GMP LUG1-6构建体与人单克隆抗MTTE IgG1抗体的结合
使用内部ELISA确认GMP产生的LUG1-6缀合物与重组人单克隆抗MTTE IgG1抗体的结合。ELISA平板用一定浓度范围内(0.000457-1nmol/ml，每孔单个缀合物)在Milli-Q水中稀释的100μl/孔缀合物包被。将平板覆盖并在4℃下孵育过夜。随后将平板洗涤四次，并用含有10％BSA和0.05％吐温20的200μl/孔PBS封闭，并在室温(RT)下孵育1小时。洗涤后，在补充有1％BSA和0.05％吐温20的PBS中，以0.1μg/ml加入人嵌合抗MTTE IgG1抗体(瑞士Evitria AG定制，单体含量＞99％，内毒素＜0.1EU/mg)。将平板用含有0.05％吐温20的250μ5/孔PBS洗涤四次，然后在所有孔(100μl/孔)中加入在补充有1％BSA的PBS中以1∶8000稀释的二抗(抗人κ轻链二抗，Thermo Fisher Scientific#A18853)。在黑暗中于室温孵育1小时后，洗涤平板，并向孔中加入100μ00TMB。用100μl/孔1M H2SO4终止反应，并在450-570nm波长下测量吸光度。
GMP LUG1-6构建体与人多克隆抗MTTE抗体的结合
使用与上述相同的内部ELISA来确认GMP产生的LUG1-6构建体与来自先前确认具有抗MTTE抗体的人供体的血浆的人多克隆抗MTTE抗体的结合。ELISA平板用在Milli-Q水中稀释的一定浓度范围的(0.004，0.03，0.4和1nmol/ml，每孔单个缀合物)100μl/孔缀合物包被。将平板覆盖并在室温下孵育2小时。然后将平板用含有0.05％吐温20的250μl/孔PBS洗涤4次。然后在室温下用200μl/孔Superblock T20(Thermo Scientific)将平板封闭3次，持续5分钟。将平板用含有0.05％吐温20的250μl/孔PBS洗涤4次。将供体人血浆在补充有1％BSA和0.05％吐温20的PBS中以1∶200稀释，并将100μl/孔施加到平板上，然后在室温下孵育2小时。将平板再次用含有0.05％吐温20的250μl/孔PBS洗涤四次，然后在所有孔(100μl/孔)中加入在补充有1％BSA的PBS中以1：8000的稀释的二抗(抗人κ轻链二抗，ThermoFisher Scientific#A18853)。在黑暗中于室温孵育1小时后，洗涤平板，并向孔中加入100，洗TMB。用100μl/孔1M H2SO4终止反应，并在450-570nm波长下测量吸光度。
结果与讨论
图9A和9B显示了缀合物LUG1-6各自可以包被在ELISA平板上，并通过单克隆抗MTTE抗体(图9A)和来自具有确认的抗MTTE抗体的供体的人血浆的多克隆抗体(图9B)检测。因此，随着浓度的增加，每个LUG1-6缀合物显示出结合单克隆抗MTTE抗体和来自特定供体的内源性多克隆抗体。数据表明，当包含在缀合物中时，抗MTTE抗体(单克隆和多克隆)能够结合MTTE序列。
实施例10：向人源化HLA-DR4小鼠施用LUG2缀合物
材料与方法
人源化HLA-DR4小鼠中表位特异性T细胞应答的评估
从Taconic(Germantown，MD，美国)获得C57BL/6背景(研究开始时12周龄)的雌性HLA-DR4转基因小鼠。HLA-DR4动物在尾基部皮下施用LUG2构建体(20μg)，然后在两周后施用加强剂。一周后处死小鼠，采集脾脏以产生单细胞悬液，如下所述通过ELISPOT进行分析。暴露于LUG2后，进行心脏放血以分析抗MTTE滴度。未暴露于LUG2的尾静脉采样的HLA-DR4动物用作对照用于基线滴度评估(未暴露的动物)。
免疫应答的评估
使用内部ELISA测定针对MTTE序列的抗体滴度。链霉亲和素平板(ThermoScientific)用具有FIGITELKKLESKINKVFSSAFADVEAA(SEQ ID NO.142)序列的肽包被，在其C端进行生物素化，在4℃下过夜。用PBS(0.05％吐温)洗涤平板，并在室温下用PBS(10％BSA和0.05％吐温)封闭1小时。将小鼠血清在PBS(1％BSA和0.05％吐温)中连续稀释，施加到平板上，并在室温下孵育2小时。用HRP缀合的二抗：山羊抗小鼠IgG(来自Dako的多克隆抗体：1：4000稀释)检测小鼠MTTE特异性IgG抗体。将HRP缀合的二抗在PBS(1％BSA)中稀释，并在室温下在平板上孵育1小时。反应用底物TMB(Dako)展开，并用1M H2SO4终止。使用iMark酶标仪(Bio-Rad)在450-570nm处读取吸光度。
通过用含有嵌入的HLA-DR4序列的SLP刺激脾细胞来评估HLA-DR4表位的免疫原性。这是使用离体IFNγELISpot测定法(用于小鼠IFNγ/3321-2A的ELISpot试剂盒，Mabtech，斯德哥尔摩，瑞典)进行的。具有TAP序列的LUG2 SLP具有氨基酸序列：ARWWLLHETDSAVAAARQIYVAAFTVQAAAE(SEQ ID NO.143)，没有TAP序列的LUG2-SLP具有氨基酸序列：LLHETDSAVAAARQIYVAAFTVQAAAE(SEQ ID NO.144)；均包含嵌入的HLA-DR4序列。在采集脾脏前一天，根据制造商的方案，用捕获抗体预包被用于IFN-γELISpot测定的96孔ELISpot平板(Millipore)。用PBS/吐温洗涤5次后，用T细胞培养基封闭至少30分钟，该培养基包括RPMI 1640(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)，其中含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GE Healthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega)，将0.5×106/孔新鲜分离的脾细胞与100μl各自的SLP以10μg/ml的终浓度一式三份接种到平板中。然后将细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育48小时，然后用DPBST洗涤平板5次。然后加入针对小鼠IFNγ的50μl/孔生物素化的检测抗体(1/1000稀释度)，并将平板在室温下孵育2小时。然后将板用DPBST洗涤5次，然后加入50μl/孔链霉亲和素碱性磷酸酶(1/1000稀释)。然后将平板在室温下孵育1小时30分钟。孵育后，将板再次用DPBST洗涤6次，然后加入50μl/孔显影液(BCIP/NBT，BioRad)。将平板在室温下置于在黑暗中，直到可以看到斑点。一旦出现斑点，用自来水冲洗平板即可停止反应。然后将板晾干，并使用ELISpot酶标仪(Cellular Technology Limited，Shaker Heights，OH，美国)对斑点进行定量。使用SEB，葡萄球菌肠毒素-B(2.5μg/ml)作为阳性对照，未刺激的脾细胞(单独的细胞)作为每个ELISpot测定的阴性对照。所有实验一式三份进行。当单独的细胞孔中的斑点数量不超过20个并且当含有肽的孔中的反应至少是对照孔平均值的标准偏差的两倍时，将动物评分为具有阳性反应。
结果与讨论
LUG2包括HLA-DR4限制性PSMA表位，因此有可能使动物暴露于LUG2缀合物并评估CD4+T细胞初免。HLA-DR4小鼠接受带有LUG2构建体的初免/加强疫苗接种计划。图10A显示，从未暴露(对照)和LUG2暴露的动物采集的血清中，暴露于LUG2的小鼠显示有其抗MTTE滴度的增加。图10B显示，用包含在LUG2构建体中的SLP(UV02，SEQ ID NO：143)或不含TAP ARWW序列的SLP(UV08，SEQ ID NO：144)处理接种了LUG2的动物脾细胞时，观察到产生IFN-γ的T细胞数量增加。图10显示了从接种20μg LUG2的小鼠获得的结果；从接种5μg LUG1的小鼠获得了类似的结果模式(数据未显示)。因此，对HLA-DR4小鼠施用包含B细胞表位和源自前列腺癌相关抗原的CD4+T细胞表位的缀合物导致暴露小鼠相对于未暴露小鼠中对B细胞表位特异的性抗体(抗MTTE抗体)的滴度升高，并且导致T细胞对缀合物的CD4+T细胞表位产生应答。数据还证明，在用缀合物接种疫苗之前不需要加强疫苗接种，以便观察当CD4+T细胞表位结合在缀合物中时体内抗体水平和T细胞应答的增加。此外，数据表明，源自天然前列腺癌相关抗原的CD4+T细胞表位可以实现类似于非内源性PADRE序列的抗MTTE抗体的诱导。
合成实施例1-22
以下合成实施例描述了根据本发明实施方案的核心化合物和包含核心化合物的缀合物的合成。
核心合成-合成实施例1-10
以下合成实施例描述了根据本发明的实施方案的核心化合物的合成。
合成实施例1：DBCO核心A：
在DMF中使用PyOxim/Oxyma纯品和DIPEA活化DBCO酸，并在DMF中与氨基-PEG4-Tris-PEG4-炔烃(核心A)反应。通过快速色谱法对产物进行纯化(方案1)。
LCMS特征数据：MW理论＝1510.8；MW发现的＝1511.7[M+H+]
方案1.DBCO酸与核心A的偶联。
合成实施例2：PG-[Lys(Br)]3
从Rink酰胺树脂开始，使用SPPS条件将Fmoc-Lys(Boc)-OH连续偶联三次。去除Fmoc后，在DMF中使用DIPEA偶联氯甲酸炔丙基酯，并使用TFA从树脂上裂解下核心。溴乙酸在DMF中使用DIC偶联，产物通过RP-HPLC纯化进行纯化并冷冻干燥(方案2)。
SPPS条件：在DMF中以5倍过量的DIC/Oxyma纯品和DIPEA将氨基酸偶联至接头衍生化的标准肽合成树脂。使用NMP中的20％哌啶除去Fmoc。
LCMS特征数据：MW理论＝845.0；MW发现的＝846.0[M+H+]
方案2：包括从树脂上裂解的PG-[Lys(Br)]3的SPPS。
合成实施例3：PG-[Lys(Mal)]3
使用与合成实施例2中相同的步骤，不同之处在于使用6-马来酰氨基己酸代替溴乙酸(方案3)。
LCMS特征数据：MW理论＝1062.5；MW发现的＝1063.8[M+H+]
方案3：包括从树脂上裂解的PG-[Lys(Mal)]3的SPPS。
合成实施例4：DBCO-[Lys(Br)]3
从Sieber树脂开始，使用SPPS条件将Fmoc-Lys(Mtt)-OH连续偶联三次。去除Fmoc后，使用DIC/Oxyma纯品和DIPEA在DMF中偶联DBCO酸，并使用TFA从树脂上裂解下核心。溴乙酸在DMF中使用DIC偶联，产物通过RP-HPLC纯化进行纯化并冷冻干燥(方案4)。
LCMS特征数据：MW理论＝1050.0；MW发现的＝1051.0[M+H+]
方安4：包括从树脂上裂解的DBCO-[Lys(Br)]3。
合成实施例5：DBCO-[Lys(PG)]3
从Rink酰胺树脂开始，使用SPPS条件将Fmoc-Lys(Boc)-OH连续偶联三次。将核心从树脂上裂解下，并在DMF中使用DIPEA偶联氯甲酸丙酯。在DMF中使用20％哌啶去除Fmoc后，中间体通过RP-HPLC纯化进行纯化并冷冻干燥。DBCO酸在DMF中使用DIC/Oxyma纯品和DIPEA偶联，产物通过RP-HPLC纯化进行纯化并冷冻干燥(方案5)。
LCMS特征数据：MW理论＝934.4；MW发现的＝935.5[M+H+]
方案5：包括从树脂上裂解的DBCO-[Lys(PG)]3。
参考合成实施例6：核心1.0
核心1.0是如EP 2547364 B1的[113]-[121]中所述合成的。
合成实施例7：DBCO-核心B
/>
在DMF中使用PyOxim/Oxyma纯品和DIPEA活化DBCO酸，并在DMF中与氨基-PEG4-Bis-PEG4-炔烃(核心B)反应。通过快速色谱法对产物进行纯化(方案6)。
LCMS特征数据：MW理论＝1196.62；MW发现的＝1197.10[M+H+]
方案6.DBCO酸与核心B的偶联。
合成实施例8：DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG
Fmoc的脱保护条件：MeCN，1-5当量Et2NH和/或哌啶。
偶联条件：1当量氨基酸，1当量PyOxim，1当量Oxyma纯品，2当量，在MeCN中：1-2小时。
使用偶联条件将丙炔胺偶联至Fmoc-Lys(Mtt)-OH，以产生Fmoc-Lys-NH-PG。使用Fmoc条件将Fmoc-Lys(Mtt)-NH-PG脱保护，然后使用偶联条件将其偶联至Fmoc-Lys(Mtt)一OH，以产生Fmoc-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-NH-PG。使用Fmoc条件将Fmoc-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-NH-PG脱保护，然后使用偶联条件将其偶联至Fmoc-Lys(Mtt)-OH，以产生Fmoc-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-NH-PG。
使用Fmoc条件将Fmoc-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-NH-PG脱保护，然后使用偶联条件将其偶联至DBCO酸，以产生DBCO-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-NH-PG。使用过量的TFA去除Mtt，然后提供DBCO-Lys(NH2)-Lys(NH2)-Lys(NH2)-NH-PG，对其进行纯化和冷冻干燥。
将纯化并冷冻干燥的DBCO-Lys(NH2)-Lys(NH2)-Lys(NH2)-NH-PG溶于少量DMF中。将溴乙酸溶解在DMF中并加入DIC。搅拌混合物直到其变成浑浊状，并将其加入到核心中。搅拌混合物直到反应完成(过夜)。用DCM稀释反应物并用水洗涤数次以除去DMF。
蒸发DCM并立即通过RP纯化来纯化产物，并冷冻干燥含有产物的级分(方案7)。
LCMS特征数据：MW理论＝1089.19；MW发现的＝1089.05[M+H+]
方案7.DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG的合成。
合成实施例9：DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PEG1-PG
/>
使用与合成实施例8中相同的步骤，不同之处在于使用2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙烷-1-胺代替丙炔胺(方案8)。
LCMS特征数据：MW理论＝1133.22；MW发现的＝1133.13[M+H+]
方案8.DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PEG1-PG的合成。
合成实施例10：DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-Ser(PG)-NH2
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将500mg(0.3mmol)Fmoc-Sieber聚苯乙烯树脂(0.61mmol/g负载量)在DMF中溶胀2小时。在NMP中用20％哌啶除去Fmoc，并用NMP和DMF洗涤树脂。在DMF中使用DIC/Oxyma纯品和DIPEA以5倍过量加载第一个氨基酸(Fmoc-Ser(PG)-OH)。将氨基酸偶联6小时，第二次偶联14小时，两次偶联都使用5倍过量。将Fmoc裂解(NMP/哌啶)，然后将氨基酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)偶联6小时，第二次偶联14小时，两次偶联都使用5倍过量。Fmoc去除和与(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)偶联的步骤重复两次以上。
组装后，裂解Fmoc，并使用DIC/Oxyma纯品和DIPEA在DMF中偶联2当量DBCO酸6小时。此外，在DMF中使用DIC/Oxyma纯品和DIPEA第二次偶联2当量DBCO酸14小时。使用TFA/TIS/DCM/MeOH(1∶2∶45∶45)将侧链保护基和序列同时裂解90分钟。将裂解的混合物浓缩并再溶于乙醚/水(1∶1)中。将级分分离，并将水相冷冻干燥。将溴乙酸(16当量)以10mg/mL的浓度溶解在DMF中，并向混合物中加入DIC(8当量)。将混合物搅拌20-30分钟，直到其变成浑浊。将DBCO-[Lys(NH2)]3Ser(PG)-NH2以20mg/mL的浓度溶解在DMF中，并加入预活化的溴乙酸。使用LCMS监测反应。使用Bio C18 D-Duo/>20μi色谱柱和0-40％B梯度(A：0.1％TFA在水中，B：0.1％TFA在ACN中)通过RP纯化对产物进行纯化。将含有纯产物的级分合并并冷冻干燥，得到产率为30％的产物(方案9)。
LCMS特征数据：MW理论＝1176.22；MW发现的＝1176.20[M+H+]
方案9.包括从树脂中裂解DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-Ser(PG)-NH2的SPPS。
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合成实施例11：使用DBCO核心A合成3+1构建体CD12B
将DBCO核心A和719-20K混合并溶解在ACN/水中。搅拌混合物直至反应完成，并通过RP-HPLC纯化0+1中间体并冷冻干燥。将0+1中间体和TET001K混合并溶解在ACN/水中，并加入Cu(I)。搅拌混合物直到反应完成，并通过RP-HPLC纯化产物并冷冻干燥(方案10)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝15248.9；MW发现的＝15248.6
方案10.使用核心DBCO-核心A合成3+1构建体CD12B
合成实施例12：使用DBCO-核心A合成3+1构建体CD31
使用与合成实施例11中相同的步骤，不同之处在于使用GVExt13M代替719-20K(方案11)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝15500.3；MW发现的＝15499.8
方案11：使用核心、DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD31
合成实施例13：使用DBCO-核心A合成3+1构建体CD28
使用与合成实施例11中相同的步骤，不同之处在于使用PEP3242代替719-20K(方案12)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝16519.8；MW发现的＝16519.5
方案12：使用核心DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD28
合成实施例14：使用DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD20B
将TET001C和DBCO-[Lys(Br)]3混合并溶解在ACN/水中。使用0.5M NaHCO3将pH调节至8.5。偶联完成后(约15分钟)，用5％AcOH将pH降至5，加入719-20K，搅拌反应直至偶联完成。通过RP-HPLC纯化产物并冷冻干燥(方案13)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝14394.0；MW发现的＝14392.6
方案13：使用核心DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD20B
合成实施例15：使用DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD29
使用与合成实施例14中相同的步骤，不同之处在于使用GVExt5代替719-20K(方案14)。
方案14：使用核心DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD29去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝14568.2；MW发现的＝14567.4
合成实施例16：使用DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD30
使用与合成实施例14中相同的步骤，不同之处在于使用GVExt13M代替719-20K(方案15)。
方案15：使用核心DBCO-[Lys(Br)]3合成3+1构建体CD30去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝14644.4；MW发现的＝14643.4
合成实施例17：使用核心1.0合成3+1构建体CD32
将乙腈中的核心1.0加入到在脱气水中的TET001C的溶液和避光的脱气的0.5MNaHCO3水溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。加入肽719-20K在DMSO中的溶液，并在室温下继续搅拌过夜。
将4.2％的NaHCO3水溶液加入到反应混合物中，并在40℃下搅拌3天。在室温下加入AcOH和TCEP，将混合物搅拌15分钟，转移到制备型LC-MS小瓶中，通过反相色谱法纯化并冷冻干燥(方案16)。
反相色谱和LCMS谱图如图19和图20所示。
方案16：使用核心1.0合成3+1构建体CD32
合成实施例18：使用DBCO-[Lys(PG)]3合成3+1构建体CD20
将DBCO-[Lys(PG)]3核心悬浮在85％的ACN水中，并转移到含有溶解在水中的719-20K肽的小瓶中。添加额外的ACN以澄清乳白色溶液。在确认IPC(LC-MS，2.5h)后，在C18柱上纯化反应混合物以产生中间体0+1构建体，其用于下一步骤而无需进一步表征。向溶解/悬浮在水中的0+1中间构建体中加入溶解在水中的TET001K，随后加入氨基胍盐酸盐、CuSO4和THPTA(CAS 760952-88-3)的水溶液，得到蓝色反应混合物。通过加入抗坏血酸钠溶液来活化反应。连续加入CuSO4和抗坏血酸钠溶液后，24小时后实现完全转化。在C4 RP柱上纯化3+1构建体(方案17)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝14647.2；MW发现的＝14646.4
方案17：使用DBCO-[Lys(PG)]3合成3+1构建体CD20
合成实施例19：使用DBCO-核心B合成2+1构建体CD14
将719-20-b-1溶解在ACN/水中(1∶3)，并与溶解在ACN/水(1∶1)中的DBCO-核心B混合。反应通过LCMS监测，并在18小时内完成。将混合物用水稀释，并使用BioC4 D-Duo/>20μm色谱柱和0-30％B梯度(A：0.1％TFA在水中，B：0.1％TFA在ACN中)通过RP纯化进行纯化。将含有纯产物的级分合并，并冷冻干燥，分离产物。
将719-20-b-1-DBCO-核心B溶解在水中，并与溶解在ACN/水(4∶1)中的TET005-PEG2-K(N3)-OH混合。将CuBr.SMe2和THPTA溶于水中并加入反应混合物中。将DIPEA加入反应中，反应通过LCMS监测。完成后，加入EDTA(11当量)。将混合物用水稀释，并使用Bio C4D-Duo/>20μm色谱柱和0-40％B梯度(A：0.1％TFA在水中，B：0.1％TFA在ACN中)通过RP进行纯化。将含有纯产物的级分合并，并冷冻干燥，分离产物(方案18)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝9430.0；MW发现的＝9429.5
方案18使用核心DBCO核心B合成2+1构建体CD14
合成实施例20：使用DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG(批号21E3299/ PD00723)合成3+1+1构建体
将DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG核心以2mg/mL的浓度溶解在ACN/水(1∶1)中，并与以浓度5mg/mL溶解在ACN/水(4：1)中的TET001C(3.5当量)混合。使用0.5MNaHCO3将pH调节至8。反应通过LCMS监测。完全偶联后，使用5％乙酸水溶液和以浓度5mg/mL溶解在ACN/水(4∶1)中的719-20K(1.1当量)，将pH降至5。反应通过LCMS监测，完成后加入TCEP(3当量)。将混合物用水稀释，并使用Bio C4 D-Duo/>20μm色谱柱和0-40％B梯度(A：0.1％TFA在水中，B：0.1％TFA在ACN中)通过RP纯化进行纯化。将含有纯中间体3+1+0产物的级分合并并冷冻干燥并用于下一步。
将3+1+0中间体和GVExt5(1.5当量)在N2下以2mg/mL的浓度溶解在脱气水中。将溴化铜(I)二甲基硫醚络合物(20当量)和三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)(20当量)与脱气水在N2下以1mg/mL的浓度混合到反应混合物中。在室温下搅拌30分钟。使用N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(20当量)将pH调节至7。反应通过LCMS监测。完全偶联后，将反应混合物用EDTA(25当量)在水中淬灭，并使用在水中的5％三氟消旋酸将pH降至4。将混合物用水稀释，并使用Bio C4 D-Duo/>20μm色谱柱和0-40％B梯度(A：0.1％TFA在水中，B：0.1％TFA在ACN中)通过RP纯化进行纯化。将含有纯产物的级分合并，并冷冻干燥(方案19)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝18042.2；MW发现的＝18041.8
方案19使用核心DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG合成批号为21E3299的3+1+1构建体
合成实施例21：使用DBCO-LysfBr)-LysfBr)-LysfBr)-NH-PEG1-PPG(批号 21E3300/PD00724)合成3+1+1构建体
使用与合成实施例20相同的步骤，不同之处在于使用DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PEG1-PG代替DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG(方案20)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝18084.2；MW发现的＝18082.3
方案20.使用核心DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PEG1-PG合成批号为21E3300的3+1+1构建体
合成实施例22：使用DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-Ser(PPG)-NH2(批号 21E3301/PD00725)合成3+1+1构建体
使用与合成实施例20相同的步骤，不同之处在于使用DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-Ser(PG)-NH2代替DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-NH-PG(方案21)。
去卷积的HRMS特征数据：MW理论＝18127.3；MW发现的＝18125.5
方案21.使用核心DBCO-Lys(Br)-Lys(Br)-Lys(Br)-Ser(PG)-NH2合成批号为21E3301的3+1+1构建体
实施例11：SEQ ID NO：1在转基因HLA-DR4小鼠中具有免疫原性材料与方法
该研究旨在研究在雌性B6.129S2-H2-Ab1tm1GruTg(HLADRA/H2Ea，HLA-DRB1*0401/H2 Eb)1Kito品系小鼠中，剂量为30μg(9nmol)的具有SEQ ID NO：1序列的hTERT多肽和25μg的CpG 1826与IFA混合的免疫原性。从Taconic Biosciences A/S获得B6.129S2-H2-Ab1tm1GruTg(HLA-DRA/H2 Ea，HLADRB1*0401/H2 Eb)1Kito品系小鼠。将IFA与肽/CpG以1：1的比例混合，剩余体积由单独的肽或肽加CpG占据。
如图11A所示，使用初免加强疫苗接种时间表施用测试材料，在第一次和第二次免疫之间约2周，然后在第二次免疫后1周，处死动物并进行尸检。使用脾脏进行离体ELISpots，并显示反应性T细胞和IFN-γ释放到培养基(完全生长培养基)中的频率。使用含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GE Healthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega))的T细胞培养基(RPMI1640，LifeTechnologies/Thermo Fisher Scientific)冲洗脾脏，然后将它们通过过滤器以除去组织碎片并以300g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数和铺板。来自BioXCell的抗CD4抗体用于在离体再刺激期间阻断CD4+T细胞活化。所有肽的终浓度均为10μg/mL。使用鼠IFN-γELISpot试剂盒(Mabtech)测定体外刺激48小时后疫苗诱导的应答细胞的频率。为此，根据制造商的方案，用捕获抗体预包被跨膜96孔微孔平板。对于每个实验，将0.5x106个脾细胞/孔接种在4孔+/-10μg/mL肽+/-抗CD4抗体中。葡萄球菌肠毒素B(SEB)用作阳性对照。培养基中的细胞仅用作阴性对照。然后对细胞进行计数。
结果
图11B显示了每组的个体小鼠(n＝8)，并代表了在不同时间点运行的3个不同实验汇集的小鼠。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn′s多重比较检验进行统计分析：“**”表示p＜0.01，“ns”表示不显著。图11B显示了来自用SEQ ID NO：1，用SEQ ID NO：1与抗CD4抗体组合刺激的细胞或单独的细胞作为阴性对照的数据。未显示SEB作为阳性对照，但显示出强烈的细胞活化。数据显示，使用SEQ ID NO：1对再刺激产生有效的CD4驱动的T细胞活化反应，因为与单独的细胞相比，斑点数量显着增加。抗CD4抗体影响活化，因此反应可能是CD4+T细胞介导的。
讨论
图11B所示的数据表明，剂量为9nmol的具有SEQ ID NO：1的多肽在雌性B6.129S2-H2-Ab1tm1GruTg(HLADRA/H2 Ea，HLA-DRB1*0401/H2 Eb)1Kito品系小鼠中具有免疫原性。尽管在该剂量下反应不均匀(观察到无反应者和反应者)，但进一步的实验表明，所有小鼠似乎都对22nmol剂量有反应(例如，参见下面的实施例15)。因此，这些数据表明转基因HLA-DR4小鼠适合用于涉及SEQ ID NO：1和包含SEQ ID NO：1的缀合物的体内实验。
实施例12：具有较高分子量的肽缀合物被加工并同样有效地呈递给T细胞
目的是评估具有较高分子量(例如>14kDa)的肽缀合物是否可以以与溶液中具有SEQ ID NO：1的多肽相同的程度被加工并呈递给T细胞。据报道，全蛋白的加工效率低于合成的长肽(Rosalia等人，Eur J Immunol.2013Oct；43(10)：2554-65)。使用基于两种稳定转染的细胞系的测定方法。
材料与方法
Jurkat衍生物细胞系J76已被UT1稳定转染，UT1是对SEQ ID NO：1具有特异性的TCR。J76缺乏TCRa和TCRb链的表达。UT1是从一个个体的T细胞中克隆出来的，该个体在涉及多肽(SEQ ID NOS：1、52和53)的UV1混合物的临床试验中显示出SEQ ID NO：1的特异性T细胞应答。用报告基因NFAT-GFP稳定转染相同的细胞系。NFAT是一种在T细胞活化中起重要作用的转录因子。GFP表达的上调可用于分析响应于UT1对SEQ ID NO：1的识别产生的细胞系J761439907的特异性活化。第二种细胞系是表达HLA-DQ的EB病毒(EBV)-淋巴母细胞系(LCL)，HLA-DQ与UT1匹配并从同一个体(EBV LCL 802)克隆。
在无菌水中，将SEQ ID NO：1或52的多肽重构至500uM。在无菌水中，将包含SEQ IDNO：1的多肽的缀合物(CD12B或CD20B；见表10)重构至1mg/ml(52.9uM)。通过离心洗涤J76和EBV细胞，并重悬于含有25％FBS的RPMI中，并加入到96孔组织培养处理的平板中，总体积为150μl，每孔100000个J76细胞和200000个EBV细胞。仅J76和EBV细胞的孔也被评估为阴性对照。将肽(SEQ ID NO：1或52)和肽缀合物(CD12B或CD20B)加入到普通RPMI 1640培养基中的5x浓缩储备溶液(每孔50μl)中，然后将肽(SEQ ID NO：1或52)和肽缀合物(CD12B或CD20B)加入细胞中。在一个实验中，加入缀合物(CD12B)和肽(SEQ ID NO：1或52)至终浓度为0.5、1.5和5μM。在第二个实验中，添加SEQ ID NO：1和52至终浓度为0.5、1.5和5μM，并添加CD12B和CD20B至终浓度为0.5、1.5和3μM。细胞和肽共孵育的终体积为250μl。将平板在37℃下孵育24小时。SEQ ID NO：52的多肽被用作阴性对照肽，因为它不应该活化SEQ ID NO：1特异性的T细胞。
之后，将细胞转移到V形96孔平板中，用抗体染色，然后进行流式细胞术分析。通过离心洗涤细胞，并在染色前重悬三次。在室温下染色25分钟，洗涤后，在Cytoflex ADP分析仪上分析细胞。使用活/死标记来隔离(gate away)死细胞。用别藻蓝蛋白(APC)标记的抗CD3抗体和藻红蛋白(PE)标记的抗CD19抗体对细胞进行染色。使用单染色珠(使用用于细胞染色的APC和PE标记的抗体)进行补偿。
结果与讨论
图12A显示了当暴露于三种不同浓度的肽(SEQ ID NO：1：“719-20”或SEQ ID NO：52：“p725”)或肽缀合物(“CD12b”)时，表达GFP的CD3阳性细胞(通过门控鉴定)。每个柱代表SEQ ID NO：1(“p719-20”)和包含SEQ ID NO：1的缀合物(“CD12b”)的重复的平均值+/-SD，而SEQ ID NO：52(“p725”)作为每个浓度的单个样本运行。当EBV细胞呈递来自SEQ ID NO：1的表位时，J76细胞被活化。活化导致GFP表达的增加。图12A显示，包含SEQ ID NO：1(“p719-20”)的多肽和包含与B细胞表位连接的SEQ ID NO：1多肽的缀合物(“CDl2b”)，当以等摩尔剂量使用时，可以同样好地活化T细胞。当培养物中不存在抗原呈递细胞(EBV)时，未发现T细胞活化(数据未显示)。图12B显示缀合物CD20B在相同测定中同样有效。因此，缀合物的较大分子量不会阻碍SEQ ID NO：1多肽的加工及其向T细胞的呈递。
实施例13：包含源自hTERT的B细胞表位和CD4+T细胞表位的缀合物被对B细胞表位 特异性的多克隆抗体结合
通过ELISA测试包含SEQ ID NO：7(MTTE)的B细胞表位和源自hTERT的CD4+T细胞表位(SEQ ID NO：1、116或117)的缀合物，以评估对SEQ ID NO：7特异性的抗体与缀合物的结合。上述表10列出了包含源自hTERT的序列的缀合物的进一步细节。
材料与方法
使用如下方案采用间接和夹心ELISA法评估多克隆抗体与缀合物的结合。应该理解的是，在间接ELISA中，将待测试的缀合物包被在平板上，而在夹心ELISA中，将包含待测试的SEQ ID NO：1多肽的缀合物通过对SEQ ID NO：1特异性的兔多克隆抗体捕获到平板上。
夹心ELISA：夹心ELISA由瑞典Capra Science根据以下步骤进行。使用ThermoScientificTM透明的平底免疫非无菌96孔平板(Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile96-Well Plate)，并用多克隆兔抗p719-20(SEQ ID NO：1)抗体(每孔0.5μg)包被，总共50μl/孔，并在4℃下孵育过夜。在室温下1小时，使用无蛋白封闭溶液(Pierce)封闭平板，随后使用PBS和0.05％吐温洗涤溶液洗涤。将缀合物加入平板并按所示浓度进行连续稀释，并在室温下孵育1小时。随后用洗涤液洗涤平板，然后与基于(来自高滴度抗破伤风供体的多克隆人IgG)的抗MTTE抗体或单克隆重组嵌合抗MTTE抗体孵育。用洗涤液洗涤平板，然后在含有1％BSA的PBS溶液中加入二抗山羊抗人κ-HRP。孵育1小时后，再次洗涤平板，然后加入底物TMB以进行测定，并在使用吸光度读取平板之前加入1M H2SO4的终止溶液。
间接ELISA：间接ELSIA根据以下步骤在内部进行。将缀合物溶解并稀释在微孔平板，96孔，PS，U底透明非结合板中，并将100μl制备的溶液加入ELISA Corning costar 96孔平板中，并在室温下孵育2小时。用250μl/孔PBS+0.05％+吐温20(PBST)洗涤平板。用Superblock T20(Thermo Scientific)将平板用200μl封闭并孵育5分钟。清空平板，重复加入封闭溶液共3次。用PBST溶液再次洗涤平板。MTTE的检测是通过从接种TTd的个体或单克隆重组嵌合抗MTTE抗体中采集的稀释血清进行的，每孔100μl，并在室温下孵育2小时。用PBST洗涤平板。使用HRP山羊抗人κ轻链二抗检测抗体，并在室温下孵育1小时。洗涤后，将TMB加入孔中并监测显色，并通过加入100μl 1M H2SO4终止反应并读取吸光度。
结果
图13A和13B显示了使用包含SEQ ID NO：1的多肽作为CD4+T细胞表位的缀合物的夹心ELISA实验的结果。CD09不包含CD4+T细胞表位，并用作阴性对照。如图13A和13B所示，包含SEQ ID NO：1的CD12B，CD20和CD20B的每个缀合物都被识别MTTE(SEQ ID NO：7)的人多克隆抗体(来自血浆产物TetaQuin)结合。
图14A和14B显示了使用包含SEQ ID NO：1的多肽作为CD4+T细胞表位的缀合物(CD20B)，使用包含SEQ ID NO：116的多肽作为CD4+T细胞表位的缀合物(CD29)或使用包含SEQ ID NO：117的多肽作为CD4+T细胞表位的缀合物(CD30，CD31)的间接ELISA实验的结果。包含源自NY-ESO-1的SEQ ID NO：45的缀合物LUG6用作阳性对照。如图14A和14B所示，CD29(包含SEQ ID NO：116)，CD30和CD31(包含SEQ ID NO：117)或CD20B(包含SEQ ID NO：1)的每种缀合物均被人多克隆抗体结合，该人多克隆抗体源自含有识别MTTE(SEQ ID NO：7)的多克隆抗体的血清。
图15A和15B显示了使用包含SEQ ID NO：1的多肽作为CD4+T细胞表位的缀合物(CD12B，CD28，CD20B)或使用包含SEQ ID NO：116的多肽作为CD4+T细胞表位的缀合物(CD32)的间接ELISA实验的结果。缀合物CD28包含SEQ ID NO：1加上源自PAP的CD8+T细胞表位(NPILLWQPIPV：SEQ ID NO：119)的序列。如图15A和15B所示，CD12B，CD28，CD20B(包含SEQID NO：1)或CD32(包含SEQ ID NO：116)的每种缀合物均被源自含有识别MTTE(SEQ ID NO：7)的多克隆抗体的血清的人多克隆抗体结合。在该实验中，CD32与人多克隆抗体血清的结合相对较弱。
讨论
包含MTTE序列(SEQ ID NO：7)作为B细胞表位和源自hTERT的CD4+T细胞表位(SEQID NO：、116或117)的缀合物被对SEQ ID NO：7特异性的多克隆抗体结合。因此，当包含在上述缀合物中时，抗MTTE抗体能够识别SEQ ID NO：7的MTTE序列。
实施例14：包含SEQ ID NO：1的缀合物在转基因HLA-A2/HLA-DR1小鼠中诱导升高 的T细胞应答
材料与方法
根据图16A所示的时间表，将品系B2m，Tg(HLA-A/H2-D/B2m)1Bpe，Tg(HLA-DRA*0101，HLA-DRBl*0101)1Dma，H2-Ab1(EMMA保存，奥尔良，法国)的雌性小鼠在尾基部用以下任一种进行免疫(初免/加强)：与CpG(作为参考佐剂，TLR9激动剂)混合的SEQ ID NO：1多肽(第1组：SEQ ID NO：1(20ug)加CpG(25ug)(50μL/小鼠)；n＝3)或化合物CD12B(见表10)，包含三种MTTE(SEQ ID NO：7)多肽和SEQ ID NO：1多肽的缀合物(第2组：CD12B，20ug/小鼠(100μL/小鼠)；n＝3)。在终止当天，收集脾脏并制备脾细胞的单细胞悬液。
使用含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GEHealthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega))的T细胞培养基(RPMI1640，Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)冲洗脾脏，然后将它们通过过滤器以除去组织碎片并以300g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数和铺板。
使用鼠IFN-γELISpot试剂盒(Mabtech)测定体外用选定的多肽刺激48小时后疫苗诱导的应答细胞的频率(如表11所示)。为此，根据制造商的方案，用捕获抗体预包被跨膜96孔微孔板。对于每个实验，将0.5x106个脾细胞/孔接种在4孔+/-10μg/mL肽+/-抗CD4或CD8抗体中。葡萄球菌肠毒素B(SEB)用作阳性对照。培养基中的细胞仅用作阴性对照。
表11：用于体外刺激的多肽：
SEQ ID NO： 多肽序列(HLA基因座) 多肽参考名称
1 ALSVLNYERARRPGLLGASVLGDDIHRA P719-20
SEQ ID NO：147 LLGASVLGL(HLA-A2) UV13
SEQ ID NO：148 GLLGASVLGL(HLA-A2) UV14
SEQ ID NO：149 VLGLDDIHRA(HLA-A2) UV15
SEQ ID NO：150 FSVLNYERARRPGLL(HLA-DR1) UV16
SEQ ID NO：151 RARRPGLLGASVLGL(HLA-DR1) UV17
SEQ ID NO：152 VLNYERARRPGLLGA(HLA-DR1) UV18
7 FIGITELKKLESKINKVF UV30(MTTE)
结果
图16B显示，当单独使用SEQ ID NO：7(MTTE序列)刺激来自CD12B暴露的动物的脾细胞时，不会诱导T细胞应答，这表明SEQ ID NO：7本身在这些小鼠中不提供T细胞表位。在测试剂量下使用Sidak′s多重比较检验(*p＜0.05)，与接种了SEQ ID NO：1/CpG疫苗的动物相比，用SEQ ID NO：1多肽刺激在暴露于CD12B的动物诱导了可测量的、显著升高的T细胞应答。
为了评估T细胞应答是CD4+还是CD8+衍生的，用含有预测的MHC I类表位(UV13至15，表11)或预测的MHC II类表位(UV16至UV18，表11)的多肽刺激来自CD12B暴露的动物的脾细胞。I类衍生的刺激是在有或没有抗CD8抗体的情况下进行的，II类表位衍生的刺激是使用抗CD4衍生的抗体进行的。使用graph pad和Sidak′s多重比较检验进行统计分析(*p＜0.05：**p＜0.01：“ns”＝不显著)。图16D显示CD12B缀合物诱导DR1衍生的CD4+T细胞应答，因为抗CD4抗体(“+aCD4”)能够显著降低对UV17和UV18的T细胞应答。这在较长的SEQ IDNO：1肽刺激培养物中也可以看到(数据未显示)。图16C显示抗CD8抗体(“+aCD8”)似乎不影响T细胞活化，表明在这种情况下，没有诱导可测量的CD8+T细胞应答。
讨论
CD12B化合物可以在表达HLA-A2/HLA-DR1的转基因小鼠中诱导CD4+T细胞应答，与施用未连接形式的SEQ ID NO：1并与溶液中与佐剂CpG结合的SEQ ID NO：1相比，CD12B导致改善的T细胞应答。小鼠尚未预先接种疫苗以诱导抗MTTE抗体：似乎可以在具有预先存在的抗MTTE抗体的动物中改善对CD12B的免疫应答。数据表明，MTTE序列本身不包含可诱导DRB*01连接的T细胞应答的CD4+T细胞表位。
实施例15：在血清阳性或血清阴性HLA-DR4动物中体内评估CD20B缀合物的免疫原 性
材料与方法
在血清阳性或血清阴性的雌性B6.129S2-H2-Ab1tm1GruTg(HLADRA/H2-Ea，HLA-DRB1*0401/H2-Eb)1Kito品系小鼠中研究了CD20B缀合物的免疫原性，该缀合物包含3个拷贝的作为B细胞表位的SEQ ID NO：7(MTTE)和作为CD4+T细胞表位的SEQ ID NO：1(参见表10)。从Taconic Biosciences A/S获得B6.129S2-H2-Ab1tm1GruTg(HLA-DRA/H2-Ea，HLADRB1*0401/H2-Eb)1Kito品系小鼠。血清学状态是指小鼠中是否存在预先存在的MTTE抗体。在IFA中使用肽(SEQ ID NO：7，MTTE)半抗原化的卵清蛋白(OVA)进行预接种。因此，MTTE-OVA被用作免疫原对小鼠进行免疫，以获得针对MTTE序列的抗体，从而获得血清阳性动物。使用75μgMTTE-OVA在PBS中的溶液进行免疫，该溶液在IFA中以1：1的比例乳化。对于血清阳性组，在第0天和第14天在小鼠尾部皮下施用，而血清阴性组不暴露于MTTE-OVA/IFA。在最后一次MTTE-OVA施用6天后，血清阳性和血清阴性组两者在尾基部施用在无菌缓冲溶液中的60μg(约3nmol)的CD20B作为初免注射剂。在第一次注射CD20B后7天施用加强注射CD20B。最后一次注射后7天，处死小鼠并分离脾细胞用于进一步分析。在MTTE-OVA疫苗接种之前和之后以及每次CD20B施用之前和之后采集血样，并在终点日当天进行心脏出血。
使用脾脏进行离体ELISPOT，并显示反应性T细胞和IFN-γ释放到培养基(完全生长培养基)中的频率。使用含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GEHealthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega))的T细胞培养基(RPMI1640，Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)冲洗脾脏，然后将它们通过过滤器以除去组织碎片并以300g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数和铺板。所有肽的终浓度均为10μg/mL。使用鼠IFN-γELISpot试剂盒(Mabtech)测定体外刺激48小时后疫苗诱导的应答细胞的频率。为此，根据制造商的方案，用捕获抗体预包被跨膜96孔微孔板。对于每个实验，将0.5x106个脾细胞/孔接种在4孔+/-10μg/mL肽中。葡萄球菌肠毒素B(SEB)用作阳性对照。培养基中的细胞仅用作阴性对照。
以下肽用于ELISpot分析中的刺激：
SEQ ID NO：1(P719-20)：
ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA(96％纯)
SEQ ID NO：150(UV16)：FSVLNYERARRPGLL(95％纯)(HLA-DR4)
SEQ ID NO：152(UV18)：VLNYERARRPGLLGA(95％纯)(HLA-DR4)
SEQ ID NO：153(UV19)：RPGLLGASVLGLDDI(95％纯)(HLA-DR4)
根据以下方案进行抗MTTE抗体滴度的ELISA测定：
1.根据平板布局，将链霉亲和素包被的ELISA平板用100μl生物素化的肽(在PBS1nmol/ml中稀释的MTTE生物素)包被，并在4℃下孵育过夜。
2.然后将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
3.将平板用的200μl PBS/10％BSA和0.05％吐温20封闭，并在室温(RT)下孵育1小时。
4.将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
5.将血浆在PBS/1％BSA/0.05％吐温20(首先1：50，然后2倍稀释，产生100倍和20倍稀释，产生1000倍)中稀释。每孔加入100μl稀释的上清液，并在室温下孵育2小时。
6.将平板用含有250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
7.每孔加入100μl二抗山羊抗小鼠Ig-HRP，在PBS/1％BSA中以1∶5000稀释，并在黑暗中于RT中孵育1小时。
8.将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
9.每孔加入100μl TMB，并用100μl 1M H2SO4终止反应。在450-570nm波长处读取吸光度。用来自MTTE-OVA免疫的小鼠血清平板的显影时间为3分钟，用CD20B免疫的小鼠血清平板的显影时间为4分钟。
结果
图17A显示了实验结束时小鼠中的抗MTTE抗体水平。这些小鼠要么已经用MTTE-OVA预接种过疫苗，要么没有用MTTE-OVA预接种过疫苗，但都在初免加强环境中暴露于PBS中的60μg CD20b。通过Mann-Whitney检验评估显著性*p＝0.0286。如图16A所示，未暴露于MTTE-OVA的小鼠不产生针对MTTE序列的抗体，并且在随后暴露于CD20B缀合物时不能对MTTE序列产生抗体应答。然而，暴露于MTTE-OVA的小鼠在MTTE-OVA/CD20B疫苗接种周期后具有高滴度的抗MTTE抗体。
为了评估针对来自SEQ ID NO：1的肽片段(UV18和UV19)的T细胞应答是否与CD20B暴露前后抗MTTE滴度增加相关，进行了相关性分析，如图17B所示。参考图17B，x轴显示血清阳性动物在CD20B暴露前后(评估抗体应答时血清稀释度为1∶1000)的抗MTTE OD值的倍数变化及其与响应UV18和UV19结合的肽混合物的刺激的T细胞应答的相关性。相关性很高，Pearson r为0.9348。绘制的曲线是一条简单的回归线，具有最佳拟合线的95％置信带。使用Graph pad prism进行分析。因此，抗MTTE滴度的增加与T细胞对来自SEQ ID NO：1的肽的应答之间存在很强的相关性。
图17C和17D显示了用来自SEQ ID NO：1的肽，UV18/19的组合(图17C)或单独的UV16(图17D)刺激后的T细胞应答。血清阴性组出现异常值，在使用ROUT(Q＝2％)进行异常值分析后，在上述分析中删除了异常值。如图17C和17D所示，在暴露于3nmol剂量的CD20B的血清阳性动物中观察到T细胞应答。相反，通过对UV18/UV19或UV16刺激的应答进行测量，暴露于CD20B的血清阴性动物没有产生T细胞应答。暴露于CD20B的血清阳性动物中的T细胞应答与接受单独(即非缀合)在IFA和CpG中配制的更高剂量(22nmol)的SEQ ID NO：1(P719-20)肽的动物中测得的T细胞应答大致相同。
讨论
数据支持转基因HLA-DR4小鼠在接种CD20B缀合物时可以对SEQ ID NO：1(P719-20)产生有效的T细胞应答。T细胞应答仅存在于血清阳性动物中，表明抗原/抗体复合物的形成是细胞(即T细胞)免疫应答的驱动因素。施用包含SEQ ID NO：1(CD20B)的缀合物能够以比SEQ ID NO：1的非缀合肽所需的剂量低约7倍的剂量促进有效的T细胞应答。
与CD20B暴露前相比，CD20B暴露后(初免/加强疫苗接种)抗体水平的增加与血清阳性小鼠中的T细胞应答相关。这支持了与施用缀合物之前相比，施用缀合物之后增加的抗体水平可用于指示T细胞免疫应答的存在。因此，缀合物暴露后这种抗体的增加可以替代更复杂的细胞测定读数，从而简化临床试验中的免疫应答者读数。
实施例16
本实施例涉及在转基因HLA-A2/HLA-DR1动物中以3+1缀合物或3+1+1缀合物或GVExt5肽+IFA形式对SEQ ID NO：116(UV 34-GVExt5)肽的免疫原性的体内评估。
材料与方法
以下形式的GVExt5肽的免疫原性：CD29(3+1)[包含3个拷贝的UV30(MTTE)(SEQ IDNO：7)作为B细胞表位，UV34(GVExt5)(SEQ ID NO：116)T细胞表位]或TFA-3+1+1缀合物[包含3个拷贝的UV30(MTTE)作为B细胞表位，p719-20(SEQ ID NO：1)和UV34(GVExt5)作为T细胞表位]。血清学状态是指在用与卵清蛋白(OVA)缀合的MTTE肽接种后，小鼠中是否存在预先存在的MTTE抗体。
在血清阴性的雌性和雄性(研究开始时为08-09周龄)B2m，Tg(HLA-A/H2-D/B2m)1Bpe，Tg(HLA-DRA*0101，HLA-DRB1*0101)1Dma，H2-Ab1(EMMA Repository，Orleans，FRANCE)品系小鼠中研究了UV34(GVExt5)裸肽(SEQ ID NO：116)。
在IFA中使用与卵清蛋白(OVA)缀合的MTTE肽对计划随后接受CD29(4.1nmol)或3+1+1(3.7nmol)缀合物形式的UV34的小鼠组进行预接种。因此，MTTE-OVA被用作免疫原对小鼠进行免疫，以诱导针对MTTE序列的抗体。使用以1∶1的比例在IFA中乳化的PBS中的75μgMTTE-OVA进行免疫。血清反应呈阳性组的小鼠在第0天在尾基部皮下施用乳剂。计划接受PBS中的裸UV34的血清阴性对照组，以乳液形式与IFA以1∶1的比例混合加上CpG(25ug)(作为参考佐剂)被施用，仅作为预接种。
MTTE-OVA施用(接种前)后21天，血清阳性组施用缀合物CD29[60μg/小鼠＝4.1nmol：100μL/小鼠，n＝4]或TFA-3+1+1[3+1+1112.5μg/小鼠＝3.7nmol：90μL/小鼠，n＝4]。血清阴性小鼠施用UV34[14ug/小鼠＝4.1n mol：100μL/小鼠：n＝4]。将缀合物和多肽作为初免注射剂在尾基部皮下注射给小鼠(在各组中)。根据图21所示时间表，施用CD29、TFA-3+1+1缀合物和多肽UV34进行两次加强注射(给各组中的小鼠)，每个加强剂之间的间隔1周。在终止日当天，收集脾脏和引流淋巴结(髂骨的，腹股沟的和辅助的)，并分别为每只小鼠制备这些器官的合并的单细胞悬液。
疫苗接种时间表如图21所示。
使用含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GEHealthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega))的T细胞培养基(RPMI1640，Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)冲洗脾脏，然后将它们通过过滤器以除去组织碎片并以300g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数和铺板。
首先将淋巴结挤压到含有2mL T细胞培养基的培养皿中，然后使用无菌注射器的背面通过100μ0的EASY过滤器，然后用1mL T细胞培养基冲洗过滤器。将细胞以300g离心10分钟。将沉淀重悬于2mL T细胞培养基中用于计数和铺板。
使用鼠IFN-γELISpot试剂盒(Mabtech)测定体外用选定的多肽刺激48小时后疫苗诱导的应答细胞的频率(如表12所示)。在采集脾脏和淋巴结前一天，根据制造商的方案，用捕获抗体预包被用于IFN-γELISpot测定的96孔ELISpot平板(Millipore)。用PBS/吐温洗涤5次后，用T细胞培养基封闭至少30分钟，该培养基包括RPMI 1640(LifeTechnologies/Thermo Fisher Scientific)，其中含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GE Healthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega)，将0.5×106/孔新鲜分离的脾细胞+淋巴结细胞与100μl各自的SLP以10μg/ml或1μ/mml(对于肽UV64和UV65)的终浓度一式三份接种到平板中。然后将细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育48小时，然后用DPBST洗涤平板5次。然后加入针对小鼠IFNγ的50μl/孔生物素化检测抗体(1/1000稀释度)，并将平板在室温下孵育2小时。然后将板用DPBST洗涤5次，然后加入50μl/孔链霉亲和素碱性磷酸酶(1/1000稀释)。然后将平板在室温下孵育1小时30分钟。孵育后，将平板再次用DPBST洗涤6次，然后加入50μl/孔显影液5(BCIP/NBT，BioRad)。将平板在室温下置于在黑暗中，直到可以看到斑点。一旦出现斑点，用自来水冲洗平板即可停止反应。然后将板晾干，并使用ELISpot酶标仪(Cellular Technology Limited，ShakerHeights，OH，USA)对斑点进行定量。伴刀豆球蛋白A(ConA)是一种凝集素(从矮刀豆(Jackbean)，(白刀豆)Canavlia ensiformis中分离出来)，可结合各种糖蛋白，糖脂和糖中发现的α-D-葡萄糖和α-D-甘露糖部分，是一种有效的白细胞有丝分裂原，其以1μl/ml浓度用作阳性对照。未刺激的脾细胞(单独的细胞)用作每个ELISpot测定的阴性对照。所有实验一式三份进行。
表12-UV34(GVExt5)多肽和体外刺激测定中使用的多肽的序列
名称 序列 来源 SEQ ID NO
1. UV34(GVExt5) LSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGL 116
2. UV36 EARPALLTSRLRFIPKPDGL GVExt5 166
3. UV57 QHLKRVQLRELSEAE GVExt5 167
4. UV58 LSEAEVRQHREARPA GVExt5 168
5. UV59 EARPALLTSRLRFIP GVExt5 169
6. UV60 LRFIPKPDGLRPIVN GVExt5 170
7. UV64 LLTSRLRFI GVExt5 171
8. UV65 ALLTSRLRFI GVExt5 172
9. UV66 REARPALLTSRLRFI GVExt5 173
10. UV80 EARPALLTSRLRFIPK GVExt5 126
结果
图22A和B显示了脾细胞-淋巴结培养物的合并T细胞应答与单个多肽培养物刺激的组合结果。使用Mann-Whitney检验*p＝0.033，结果显示与不存在肽(仅细胞)相比，CD29和TFA-3+1+1(缀合物)暴露的动物具有可测量且显著升高的T细胞应答。图22C显示了与仅细胞相比的比较，用UV34多肽+IFA免疫的小鼠对用多肽UV34内不同长度的单个多肽序列刺激的培养物的脾细胞-淋巴结共培养应答的总和之间的比较。
讨论
数据表明，当用包含3个拷贝的作为B细胞表位的UV30(MTTE)(SEQ ID NO：7)的CD29或3+1+1缀合物接种时，来自转基因HLA-DR1血清阳性小鼠的脾细胞-淋巴结培养物对UV34(GVExt5)(SEQ IDNO：116)衍生的肽(表位)产生强烈且显著升高的免疫应答。.
实施例17
本实施例涉及鉴定用GV1001(UV80-SEQ ID NO：126)和用GVExt5(UV 34-SEQ IDNO：116)进行疫苗接种的差异。
给小鼠施用SEQ ID NO：126(GV1001-UV80)或SEQ ID NO：116(UV 34-GVExt5)的多肽。使用与实施例16相同的方案，不同之处在于施用的肽的浓度为16.4nmol并且小鼠均为雌性(n＝4)。
结果
图23和24是显示T细胞对单个肽的反应的图。水平虚线标记“截止”，这是“单独细胞”的响应水平，被视为基线。高于截止线/基线的多肽的柱被认为是针对特定多肽的T细胞应答。每组中的“单独细胞”作为一个内部截止点。
图23中高于阈值的肽(施用SEQ ID NO：126-GV1001)为：UV 57。图24中高于阈值的肽(施用SEQ ID NO：116-GVExt5)为：UV36、UV57、UV58、UV59、UV60、UV64和UV66。
单个结果如图25所示，说明了如何计算T细胞对每种肽的平均应答。
表14-肽的汇总
研究结果的描述：
GV 1001(UV80)接种组：
由于ELISPOT平板中的真菌污染，无法评估小鼠M10。在3只可评估的小鼠中，通常没有/弱的免疫反应。M9和12对任何测试的肽都没有应答。M11证明了对UV57的边际免疫应答，但由于该肽与用于疫苗接种的GV1001没有任何序列同源性，弱反应性可能是背景变异的结果。
结论：当与小鼠使用的标准佐剂联合使用时，GV1001在HLA-A2/DR1转基因小鼠中显示出边际免疫应答。
GV1001 Extension-5(UV34)接种组：
小鼠M16显示出对UV57和UV65的边际免疫应答，UV57与UV34和UV65具有5个氨基酸重叠，UV65是嵌合在UV34中10聚肽衍生的，具有HLA-A2结合基序。
小鼠M15的应答稍微更广泛，并识别出UV58，该UV58在GV1001序列的Extension 5N端中含有一个新的表位，并且与GV1001有5个氨基酸重叠。来自该小鼠的细胞也对UV59作出反应，UV59除了不存在C端K之外与GV1001相同。有趣的是，GV1001未被识别，这表明GV1001中存在的该氨基酸(即C端赖氨酸残基)可能不利于与HLA-DR1结合。肽UV60也被识别。该肽具有与GV1001的6个氨基酸重叠和UV34特有的10个氨基酸，因此代表GV Extension 5(SEQID NO：116)中的新表位。
小鼠M13和小鼠M14表现出相当强的反应性，具有相似的肽识别模式。它们都能识别UV36、UV57、UV58、UV64和UV66。UV36包含完整的GV1001序列，具有UV34特有的另外4个氨基酸。由于这两只小鼠未能识别GV1001(UV80)，我们将这些数据解释为，将来自Extension5的这4个氨基酸与GV1001中的氨基酸结合，产生了在HLA-DR1呈递背景下识别的新表位。与UV34具有5个氨基酸重叠的UV57作为唯一共有的氨基酸表明这些氨基酸可以代表短但特别强的结合基序。UV58也是一个很好的表位，因为所有3只应答的小鼠都能识别这种肽(见上文)。UV64是一个9聚体HLA-A2表位，也被这些小鼠识别，从而鉴定为新的HLA-A2抗原表位。最后，两只小鼠都识别出与GV1001重叠14个氨基酸的UV66，修饰是添加了来自Extension 5的N端R残基并从C端去除PK。同样，令人感兴趣的是，这些修饰被两只小鼠识别，而GV1001没有。显示出最广泛的识别库和最高数量的斑点形成细胞的小鼠M14也识别UV59和UV60。UV59是GV1001的一种没有C端K残基的版本。这再次表明该氨基酸的存在与HLA-DR1呈递不相容。有关UV60的识别，请参见上文M15。
结论：GV1001 Extension 5(SEO ID NO：116)在HLA-DR1/A2转基因小鼠中具有高度免疫原性。如免疫小鼠的反应模式所揭示的，通过在该疫苗肽内存在多个表位来获得强的免疫原性。这些表位部分地由存在于GV1001 Extension 5(SEQ ID NO：116)中但不存在于GV1001(SEQ ID NO：126)中的氨基酸，以及令人惊讶地还存在于GV1001中的表位(例如UV59和UV66)组成。我们认为接种GV1001疫苗后，针对后一组肽的免疫应答缺乏，与抗原加工细胞中肽的加工有关，最有可能的是从GV1001中去除C端碱性氨基酸赖氨酸(K)的能力，因为这可能取决于GV1001 Extension 5C端部分存在但GV1001中没有的其他氨基酸。重要的是，被设计为HLA-A2结合肽的肽UV64(9聚体)和UV65(10聚体)在用GV1001 Extension 5接种后也被识别，将该疫苗肽的功效扩展到包括CTL应答的诱导。
实施例18
本实施例证明了包含B细胞表位和两个源自hTERT的CD4+T细胞表位的3+1+1缀合物被对B细胞表位特异性的多克隆抗体结合。
通过ELISA测试包含B细胞表位(MTTE-SEQ ID NO：7)和源自hTERT(p719-20(SEQID NO：1)和GVExt5(UV34：SEQ ID NO：116)的两个CD4+T细胞表位的缀合物，以评估缀合物与对MTTE特异性的抗体的结合。
材料与方法
使用如下方案，采用夹心ELISA法评估人多克隆抗体与缀合物的结合。应该理解的是，在间接ELISA中，将待测试的30缀合物包被在平板上，而在夹心ELISA中，将待测试的包含SEQ ID NO：1多肽的缀合物通过特异于SEQ ID NO：1的兔多克隆抗体捕获到平板上。
夹心ELISA：夹心ELISA由瑞典Capra Science根据以下步骤进行。使用ThermoScientificTM透明的平底免疫非无菌96孔平板，并用多克隆兔抗p719-20或多克隆兔抗GVExt5抗体(0.5μg/孔)包被，总共50μl/孔，并在4℃下孵育过夜。在室温下1小时5，使用无蛋白封闭溶液(Pierce)封闭平板，随后使用PBS和0.05％吐温洗涤溶液洗涤。将缀合物以指定的浓度加入平板并连续稀释，并在室温下孵育1小时。随后用洗涤溶液洗涤平板，然后与基于(来自高滴度抗破伤风供体的多克隆人IgG)的抗MTTE抗体或10单克隆重组嵌合抗MTTE抗体孵育。用洗涤溶液洗涤平板，然后在含有1％BSA的PBS溶液中加入二抗山羊抗人κ-ALP。在与二抗孵育1小时后，再次用洗涤缓冲液洗涤平板，并与底物PNPP(1mg/ml)在室温下孵育1个小时以进行测定。
结果
表15
缀合物 肽 结合剂 EC50
3+1+1Ba21E3299(PD00723) P719-20&GVExt5 是 0.2763
3+1+1Ba21E3300(PD00724) P719-20&GVExt5 是 0.2258
3+1+1Ba21E3301(PD00725) P719-20&GVExt5 是 0.2601
CD29(PD00696) GVExt5 是 0.1545
CD09 N/A 否 -
表16
缀合物 肽 结合剂 EC50
3+1+1Ba21E3299(PD00723) P719-20&GVExt5 是 0.2763
3+1+1Ba21E3300(PD00724) P719-20&GVExt5 是 0.2258
3+1+1Ba21E3301(PD00725) P719-20&GVExt5 是 0.2601
CD29(PD00696) GVExt5 是 0.1545
CD09 N/A 否 -
图26和27是图表，表15和16是表格，这些证明了在使用包含多肽p719-20(SEQ IDNO：1)和GVExt5(SEQ ID NO：116)作为CD4+T细胞表位的缀合物的夹心ELISA测定中抗MTTE多克隆抗体的结合。对于图26和表15，捕获抗体是抗p719-20兔多克隆抗体。对于图27和表16，捕获抗体是抗GVExt5兔多克隆抗体。CD09不包含CD4+T细胞表位，并用作阴性对照。如图26和27所示，来自3批21E3299(合成实施例20)、21E330(合成实施方案21)和21E3301(合成实施方式22)中每一批的包含多肽p719-20(SEQ ID NO：1)和GVExt5(SEQ ID NO：116)的3+1+1缀合物被识别MTTE的人多克隆抗体(来自血浆产物TetaQuin)结合。
实施例19
本实施例涉及结合测定以评估TFA、HCL和乙酸盐型的缀合物的结合。
实验步骤
缀合物UVC2-001(即CD29，含有GVExt5(SEQ ID NO：116)的缀合物)和UVC1-017(即CD20B，含有p719-20(SEQ ID NO：1)的缀合物)的重构：优先使用，E-toxate水
包被缓冲液：PBS
·一抗：CD01(单克隆hIgG1-抗MTTE)或FF10(人多克隆抗MTTE血清)
·二抗：山羊抗Hu Kappa轻链HRP
·读取：吸光度(450nm-570nm)
表17显示了缀合物的pH值。对于每种盐型，两种缀合物(UVC1-017(CD20B)和UVC2-001(CD29))在水中重构后缀合物的pH相同。工作溶液在PBS中稀释，所有测试的缀合物的pH为7。结果也如图28至31所示。
表17
实施例20
本实施例涉及在已接受TENDU的患者中测量的抗MTTE-IgG抗体，TENDU是一种肽缀 合物疫苗，其包含与含有CD4 + 和CD8 + T细胞表位的合成的长肽(SLP)缀合的B细胞表位MTTE。
材料与方法
接种疫苗
TENDU疫苗包含缀合物，每个缀合物包含三个拷贝的B细胞表位(MTTE)和包含CD4+和CD8+T细胞表位的SLP。TENDU试验中的所有患者在筛查访视时，即TENDU疫苗接种开始前1周，接受了一剂Boostrix，然后接受了4剂TENDU疫苗，每剂之间间隔2周。在本实施例中，TENDU疫苗包含缀合物，每个缀合物包含3个MTTE(SEQ ID NO：46)肽作为B细胞表位和以下之一作为CD4+T细胞表位：LUG1(SEQ ID NO：47)、LUG3(SEQ ID NO：49)、LUG4(SEQ ID NO：50)和LUG5(SEQ IDNO：51)肽。该试验是一项剂量递增试验，旨在建议TENDU疫苗的剂量和安全边界：队列#1、队列#2和队列#3分别施用40、400和960μg。在筛查访视、访视2、访视4、访视5和安全访视(最后一剂疫苗接种后30天)时采集样本。迄今为止，只有一名患者被纳入队列#3的所有时间点并进行采样。
ELISA
将链霉亲和素包被的平板(Thermo Scientific，目录号15501)用在包被缓冲液(0.2％HSA，0.05％吐温20，PBS)中稀释的1μM生物素化的MTTE或p725肽(SEQ ID NO：52)(参考阴性对照肽)在4℃下包被过夜。第二天早上，用PBS/0.05％吐温20洗涤平板四次，并在室温下用0.5mg/mL生物素-D(溶于0.2％HSA、0.05％吐温20、PBS中)包被1小时。然后清空平板(不洗涤)并在室温下用不含Pierce蛋白的封闭溶液(Thermo Scientific，目录号37572)封闭1小时，并用洗涤缓冲液(PBS/0.05％吐温20)洗涤5次。将在血浆稀释缓冲液(0.2％HSA，0.05％吐温20，PBS)中稀释的抗MTTE-IgG抗体标准品、患者血清样品和对照品加入孔中，一式两份，并在室温下孵育2小时。洗涤后，添加稀释在血浆稀释缓冲液中的Fc特异性山羊抗人IgG过氧化物酶抗体(Sigma-Aldrich，目录号A0170a)，并将平板在室温下孵育1小时。再次洗涤平板，并将底物溶液加入孔中。30分钟后在415nM下读取吸光度。
使用GraphPad Prism 9.3.1版软件(GraphPad软件)绘制基于抗MTTE IgG抗体的标准曲线，并用于计算所有患者样本和对照的总IgG浓度。对于所有样品，选择1∶25的稀释度来计算血清IgG浓度。
结果与讨论
数据(见图32)显示，与筛查和访视2时观察到的浓度相比，抗MTTE浓度在访视4时显著升高。在访视2时，即在Boostrix后7天，但在患者接受第一剂TENDU疫苗之前的时间点，未观察到抗MTTE浓度的显著增加。可以观察到，大多数患者的抗MTTE浓度增加并且在来自访视4(TENDU疫苗接种开始后)和随后的时间点的样本中保持升高，但队列#1和#2的浓度仍然较低。对于队列#3，血清抗MTTE浓度高度升高，很可能是剂量增加的结果，导致足够的药物暴露以发生免疫激活，从而允许T细胞介导的(CD4辅助表位)驱动的针对B细胞表位的抗体应答。数据与兔子研究(实施例8)一致，其中所有暴露于破伤风类毒素的兔子在最高剂量下表现出显著升高的抗MTTE浓度，而与暴露于TENDU之前的水平相比，较低剂量或破伤风初免的兔子的抗MTTE抗体水平不能产生持续增加。
实施例21
本实施例涉及在转基因HLA-A2/HLA-DR1动物中以缀合物和肽+IFA形式的GVExt5肽(SEQ ID NO：116)的免疫原性的体内评估。
材料与方法
研究在血清阳性雌性B2m，Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe，Tg(HLA-DRA*0101，HLA-DRB1*0101)1Dma，H2-Ab1(EMMA库，奥尔良，法国)品系小鼠中CD29缀合物[包含3个拷贝的UV30(MTTE)(SEQ ID NO：7)作为B细胞表位和UV34(GVExt5)(SEQ ID NO：116)T细胞表位]形式中的GVExt5肽(SEQ ID NO：116)的免疫原性或在血清阴性雌性B2m，Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe，Tg(HLA-DRA*0101，HLA-DRB1*0101)1Dma，H2-Ab1(EMMA库，奥尔良，法国)品系小鼠中裸肽+IFA形式中的GVExt5肽(SEQ ID NO：116)的免疫原性。血清学状态是指在使用与卵清蛋白(OVA)缀合的MTTE肽接种后，小鼠中是否存在预先存在的MTTE抗体。
疫苗接种时间表如图33所示，总结如下：
4x组1：在颈背部用1∶1IFA中的MTTE-OVA(75ug)预接种，然后用CD29(60ug，4.1nmol)以100uL/小鼠预接种。免疫接种在尾部底部，两侧。
4x组2：在颈背部用IFA预接种，然后用IFA(1∶1)中的UV34(14ug/小鼠，4.1nmol)/小鼠以50uL/小鼠进行预接种。免疫接种在尾部底部，两侧。
使用在IFA中与卵清蛋白(OVA)缀合的MTTE肽进行预接种。因此，MTTE-OVA被用作免疫原对小鼠进行免疫，以获得针对MTTE序列的抗体，从而获得血清阳性动物。使用75μgMTTE-OVA在PBS中的溶液进行免疫，该溶液在IFA中以1∶1的比例乳化。血清反应阳性组的小鼠在第0天在尾基部进行皮下注射。血清阴性组未暴露于MTTE-OVA/IFA。
MTTE-OVA施用后21天(疫苗接种前)，血清阳性组施用缀合物[第1组：CD29，60ug/小鼠＝4.1n mol(100μL/小鼠)n＝4]。血清阴性组施用与IFA(作为参考佐剂)混合的多肽UV34(与第1组中的小鼠为等摩尔)[第2组：UV34，14ug/小鼠＝4.1nmol(100μL/小鼠)：n＝4]。将缀合物和多肽作为初免注射剂在尾基部皮下注射给小鼠(在各组中)。根据图33所示的时间表，在初免(primer)注射后7天(第一次加强针)和14天(第二次加强针，(为各组的小鼠)施用CD29缀合物和多肽UV34的两次加强注射(两次不同的后续注射)。在终止日当天，收集脾脏和引流淋巴结(髂骨的，腹股沟的和辅助的)，并制备这些器官的单细胞悬液。
使用含有1％w/v L-谷氨酰胺(SLS/Lonza)，10％v/v FBS(Fisher/GEHealthcare)，2％HEPES(SLS/Lonza)，0.1％v/v两性霉素B(Promega))的T细胞培养基(RPMI1640，Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)冲洗脾脏，然后将它们通过过滤器以除去组织碎片并以300g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数和铺板。
首先将淋巴结挤压到含有2mL T细胞培养基的培养皿中，然后使用无菌注射器的背面通过100μM的EASY过滤器，然后用1mL T细胞培养基冲洗过滤器。将细胞以300g离心10分钟。将沉淀重悬于2mL T细胞培养基中用于计数和铺板。
使用鼠IFN-γELISpot试剂盒(Mabtech)测定体外用选定多肽刺激48小时后疫苗诱导的应答细胞的频率(如表13所示)。为此，根据制造商的方案，用捕获抗体预包被跨膜96孔微孔板。对于每个实验，将0.5x106个细胞(0.25x106个脾细胞+0.25x106个合并的引流LN细胞-共培养)/孔接种在3孔+/-10μg/mL的肽中。使用伴刀豆球蛋白A(ConA)作为阳性对照。培养基中的细胞仅用作阴性对照。
根据以下方案进行抗MTTE抗体滴度的ELISA测定：
10.根据平板布局，将链霉亲和素包被的ELISA平板用100μl生物素化的肽(在PBS1nmol/ml中稀释的MTTE生物素)包被，并在4℃下孵育过夜。
11.将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
12.将平板用200μl PBS/10％BSA/0.05％吐温20封闭，并在室温(RT)下孵育1小时。
13.将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
14.将血浆在PBS/1％BSA/0.05％吐温20(首先1∶50，然后2倍稀释，产生100倍和20倍稀释，产生1000倍)中稀释。每孔加入100μl稀释的上清液，并在室温下孵育2小时。
15.将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
16.每孔加入100μl二抗山羊抗小鼠Ig-HRP，在PBS/1％BSA中以1∶5000稀释，并在黑暗中于RT中孵育1小时。
17.将平板用250μl PBS/0.05％吐温20洗涤4次。
18.每孔加入100μl TMB，并用100μl 1M H2SO4终止反应。在450-570nm波长处读取吸光度。用MTTE-OVA免疫的小鼠血清平板的显影时间为90秒，用UV34免疫的小鼠血清平板的显影时间为150秒。
结果
图34A表示实验结束时小鼠的抗MTTE抗体滴度。小鼠已经用MTTE-OVA预接种，然后用缀合物CD29(组1)免疫，或者没有用MTTE-OVA预接种并且仅暴露于IFA(1∶1v/v)中的等摩尔量的多肽UV34(SEQ ID NO：116)。缀合物和肽+IFA的免疫方案采用初始-加强-加强的方式。未暴露于MTTE-OVA然后暴露于缀合物CD29的小鼠没有产生针对MTTE序列的抗体，并且在暴露于UV34+IFA时不能对MTTE序列产生抗体应答。然而，暴露于MTTE-OVA的小鼠在MTTE-OVA/CD29疫苗接种周期后具有高滴度的抗MTTE抗体，通过Mann-Whitney检验*p＝0.0286评估显著性。图34B显示了第1组小鼠个体的抗MTTE抗体滴度。在实验期间，小鼠1和3在三次施用CD29(初免-加强-加强)后显示出抗MTTE抗体滴度的逐渐增加，尽管抗体滴度有不同程度的增加。在小鼠2中，最初的高抗体滴度随着时间的推移略有下降。
图35显示，与以测试剂量的多肽UV34+IFA接种的动物(血清阴性)相比，用七种单独的多肽UV36、UV58、UV59、UV60、UV64、UV65和UV66(见表13)共培养的脾细胞LN的刺激在CD29(缀合物)暴露的动物(血清学阳性)中诱导了可测量的和显著升高的T细胞应答，使用Mann-Whitney检验*p＝0.0286。图36A显示，与暴露于多肽UV34+IFA的小鼠的T细胞应答总和相比，暴露于CD29的小鼠对UV36肽内不同长度的多肽序列的T细胞应答总和显著升高，使用Mann-Whitney检验*p＝0.0286。
讨论
数据表明，与用等摩尔UV34肽和IFA作为佐剂接种的血清阴性小鼠相比，当用包含3个拷贝的MTTE B细胞表位的UV34缀合物(CD29)接种时，转基因HLA-DR1血清阳性小鼠对UV34(GVExt5-SEQ ID NO：116)衍生的肽(表位)产生出众的T细胞应答。
GVext5(SEQ ID NO：116)是GV1001(SEQ ID NO：126)的延伸版本，具有源自hTERT序列的9个N端氨基酸和4个C端氨基酸。GVExt5的长度比GV1001长81％。
当用长度为20、15、14、10或9个氨基酸的七种特异性单个肽刺激来自接种疫苗的动物的细胞时，观察到T细胞应答，见表13。与IFA中的Extension 5相比，对于每一种测试的肽，在用Extension 5缀合物接种的动物中观察到出众的T细胞应答。有趣的是，这些实验还鉴定了GV1001序列中的核心结合基序，该基序由UV64表示(表13)，并且存在于除UV58和UV60外的所有测试肽中(图13)。重要的是，这两种肽包含存在于Extension 5中的10个N端氨基酸(UV58)和4个C端氨基酸(UV60)，它们不存在于GV1001中。接种Extension 5缀合物后，这两种肽的识别表明Extension 5包含分别由N-和C端侧翼氨基酸定义的新表位。这些数据提供了进一步的证据，证明Extension 5的免疫原性优于GV1001。有趣的是，UV60的识别意味着向GV1001添加4个C端氨基酸PDGL(SEQ ID NO：178)导致识别含有5个氨基酸(RPIVN(SEQ ID NO：177))的额外C端“尾部”的肽，该肽存在于hTERT序列中，但不存在于用于疫苗接种的Extension 5肽序列中。这代表了疫苗接种设计可以拓宽能够识别靶抗原的特异性T细胞库的进一步机制。
该实施例证明，仅在接受OVA-MTTE预疫苗和随后CD29缀合物的小鼠中，在实验结束时抗MTTE抗体滴度升高，图36A。单只小鼠中的抗MTTE抗体滴度(图34B)对应于每只小鼠引发的总T细胞应答，图36B。
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序列表
<110> 阿尔特有限公司
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<151> 2021-06-09
<160> 178
<170> PatentIn version 3.5
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165 170 175
Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
180 185 190
Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu
195 200 205
Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr
210 215 220
Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys
225 230 235 240
Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu
245 250 255
Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr
260 265 270
Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu
275 280 285
Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys
290 295 300
Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn
305 310 315 320
Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
325 330 335
Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met
340 345 350
Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys
355 360 365
Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
370 375 380
Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr
385 390 395 400
Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn
405 410 415
Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu
420 425 430
Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser
435 440 445
Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys
450 455 460
Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys
465 470 475 480
Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser
485 490 495
Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr
500 505 510
Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu
515 520 525
Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile
530 535 540
Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg
545 550 555 560
Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe
565 570 575
Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn
580 585 590
Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg
595 600 605
Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn
610 615 620
Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn
625 630 635 640
Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe
645 650 655
Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr
660 665 670
Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile
675 680 685
Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys
690 695 700
Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile
705 710 715 720
Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly
725 730 735
Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val
740 745 750
Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu
755 760 765
Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu
770 775 780
Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu
785 790 795 800
Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly
805 810 815
Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp
820 825 830
Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe
835 840 845
Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp
850 855
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌（Clostridium tetani）
<400> 6
Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu
1 5
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌（Clostridium tetani）
<400> 7
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 8
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
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100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 9
<211> 1531
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met Glu Val Ser Pro Leu Gln Pro Val Asn Glu Asn Met Gln Val Asn
1 5 10 15
Lys Ile Lys Lys Asn Glu Asp Ala Lys Lys Arg Leu Ser Val Glu Arg
20 25 30
Ile Tyr Gln Lys Lys Thr Gln Leu Glu His Ile Leu Leu Arg Pro Asp
35 40 45
Thr Tyr Ile Gly Ser Val Glu Leu Val Thr Gln Gln Met Trp Val Tyr
50 55 60
Asp Glu Asp Val Gly Ile Asn Tyr Arg Glu Val Thr Phe Val Pro Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Lys Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala Ala Asp Asn Lys
85 90 95
Gln Arg Asp Pro Lys Met Ser Cys Ile Arg Val Thr Ile Asp Pro Glu
100 105 110
Asn Asn Leu Ile Ser Ile Trp Asn Asn Gly Lys Gly Ile Pro Val Val
115 120 125
Glu His Lys Val Glu Lys Met Tyr Val Pro Ala Leu Ile Phe Gly Gln
130 135 140
Leu Leu Thr Ser Ser Asn Tyr Asp Asp Asp Glu Lys Lys Val Thr Gly
145 150 155 160
Gly Arg Asn Gly Tyr Gly Ala Lys Leu Cys Asn Ile Phe Ser Thr Lys
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195 200 205
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210 215 220
Lys Phe Lys Met Gln Ser Leu Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Met Val
225 230 235 240
Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Ala Gly Ser Thr Lys Asp Val Lys Val Phe
245 250 255
Leu Asn Gly Asn Lys Leu Pro Val Lys Gly Phe Arg Ser Tyr Val Asp
260 265 270
Met Tyr Leu Lys Asp Lys Leu Asp Glu Thr Gly Asn Ser Leu Lys Val
275 280 285
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290 295 300
Glu Lys Gly Phe Gln Gln Ile Ser Phe Val Asn Ser Ile Ala Thr Ser
305 310 315 320
Lys Gly Gly Arg His Val Asp Tyr Val Ala Asp Gln Ile Val Thr Lys
325 330 335
Leu Val Asp Val Val Lys Lys Lys Asn Lys Gly Gly Val Ala Val Lys
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Ala Ala Ile Gly Cys Gly Ile Val Glu Ser Ile Leu Asn Trp Val Lys
405 410 415
Phe Lys Ala Gln Val Gln Leu Asn Lys Lys Cys Ser Ala Val Lys His
420 425 430
Asn Arg Ile Lys Gly Ile Pro Lys Leu Asp Asp Ala Asn Asp Ala Gly
435 440 445
Gly Arg Asn Ser Thr Glu Cys Thr Leu Ile Leu Thr Glu Gly Asp Ser
450 455 460
Ala Lys Thr Leu Ala Val Ser Gly Leu Gly Val Val Gly Arg Asp Lys
465 470 475 480
Tyr Gly Val Phe Pro Leu Arg Gly Lys Ile Leu Asn Val Arg Glu Ala
485 490 495
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500 505 510
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595 600 605
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645 650 655
Gln Ile Asp Asp Arg Lys Glu Trp Leu Thr Asn Phe Met Glu Asp Arg
660 665 670
Arg Gln Arg Lys Leu Leu Gly Leu Pro Glu Asp Tyr Leu Tyr Gly Gln
675 680 685
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690 695 700
Leu Phe Ser Asn Ser Asp Asn Glu Arg Ser Ile Pro Ser Met Val Asp
705 710 715 720
Gly Leu Lys Pro Gly Gln Arg Lys Val Leu Phe Thr Cys Phe Lys Arg
725 730 735
Asn Asp Lys Arg Glu Val Lys Val Ala Gln Leu Ala Gly Ser Val Ala
740 745 750
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755 760 765
Ile Asn Leu Ala Gln Asn Phe Val Gly Ser Asn Asn Leu Asn Leu Leu
770 775 780
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785 790 795 800
Ala Ser Pro Arg Tyr Ile Phe Thr Met Leu Ser Ser Leu Ala Arg Leu
805 810 815
Leu Phe Pro Pro Lys Asp Asp His Thr Leu Lys Phe Leu Tyr Asp Asp
820 825 830
Asn Gln Arg Val Glu Pro Glu Trp Tyr Ile Pro Ile Ile Pro Met Val
835 840 845
Leu Ile Asn Gly Ala Glu Gly Ile Gly Thr Gly Trp Ser Cys Lys Ile
850 855 860
Pro Asn Phe Asp Val Arg Glu Ile Val Asn Asn Ile Arg Arg Leu Met
865 870 875 880
Asp Gly Glu Glu Pro Leu Pro Met Leu Pro Ser Tyr Lys Asn Phe Lys
885 890 895
Gly Thr Ile Glu Glu Leu Ala Pro Asn Gln Tyr Val Ile Ser Gly Glu
900 905 910
Val Ala Ile Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Ile Ser Glu Leu Pro Val
915 920 925
Arg Thr Trp Thr Gln Thr Tyr Lys Glu Gln Val Leu Glu Pro Met Leu
930 935 940
Asn Gly Thr Glu Lys Thr Pro Pro Leu Ile Thr Asp Tyr Arg Glu Tyr
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His Thr Asp Thr Thr Val Lys Phe Val Val Lys Met Thr Glu Glu Lys
965 970 975
Leu Ala Glu Ala Glu Arg Val Gly Leu His Lys Val Phe Lys Leu Gln
980 985 990
Thr Ser Leu Thr Cys Asn Ser Met Val Leu Phe Asp His Val Gly Cys
995 1000 1005
Leu Lys Lys Tyr Asp Thr Val Leu Asp Ile Leu Arg Asp Phe Phe
1010 1015 1020
Glu Leu Arg Leu Lys Tyr Tyr Gly Leu Arg Lys Glu Trp Leu Leu
1025 1030 1035
Gly Met Leu Gly Ala Glu Ser Ala Lys Leu Asn Asn Gln Ala Arg
1040 1045 1050
Phe Ile Leu Glu Lys Ile Asp Gly Lys Ile Ile Ile Glu Asn Lys
1055 1060 1065
Pro Lys Lys Glu Leu Ile Lys Val Leu Ile Gln Arg Gly Tyr Asp
1070 1075 1080
Ser Asp Pro Val Lys Ala Trp Lys Glu Ala Gln Gln Lys Val Pro
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Lys Ser Asp Ser Val Thr Asp Ser Gly Pro Thr Phe Asn Tyr Leu
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Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu Thr Lys Glu Lys Lys Asp Glu
1130 1135 1140
Leu Cys Arg Leu Arg Asn Glu Lys Glu Gln Glu Leu Asp Thr Leu
1145 1150 1155
Lys Arg Lys Ser Pro Ser Asp Leu Trp Lys Glu Asp Leu Ala Thr
1160 1165 1170
Phe Ile Glu Glu Leu Glu Ala Val Glu Ala Lys Glu Lys Gln Asp
1175 1180 1185
Glu Gln Val Gly Leu Pro Gly Lys Gly Gly Lys Ala Lys Gly Lys
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Lys Thr Gln Met Ala Glu Val Leu Pro Ser Pro Arg Gly Gln Arg
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Val Ile Pro Arg Ile Thr Ile Glu Met Lys Ala Glu Ala Glu Lys
1220 1225 1230
Lys Asn Lys Lys Lys Ile Lys Asn Glu Asn Thr Glu Gly Ser Pro
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Gln Glu Asp Gly Val Glu Leu Glu Gly Leu Lys Gln Arg Leu Glu
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Lys Lys Gln Lys Arg Glu Pro Gly Thr Lys Thr Lys Lys Gln Thr
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Thr Leu Ala Phe Lys Pro Ile Lys Lys Gly Lys Lys Arg Asn Pro
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Trp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Arg Ser Ser Asp Glu Ser Asn Phe
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Asp Val Pro Pro Arg Glu Thr Glu Pro Arg Arg Ala Ala Thr Lys
1310 1315 1320
Thr Lys Phe Thr Met Asp Leu Asp Ser Asp Glu Asp Phe Ser Asp
1325 1330 1335
Phe Asp Glu Lys Thr Asp Asp Glu Asp Phe Val Pro Ser Asp Ala
1340 1345 1350
Ser Pro Pro Lys Thr Lys Thr Ser Pro Lys Leu Ser Asn Lys Glu
1355 1360 1365
Leu Lys Pro Gln Lys Ser Val Val Ser Asp Leu Glu Ala Asp Asp
1370 1375 1380
Val Lys Gly Ser Val Pro Leu Ser Ser Ser Pro Pro Ala Thr His
1385 1390 1395
Phe Pro Asp Glu Thr Glu Ile Thr Asn Pro Val Pro Lys Lys Asn
1400 1405 1410
Val Thr Val Lys Lys Thr Ala Ala Lys Ser Gln Ser Ser Thr Ser
1415 1420 1425
Thr Thr Gly Ala Lys Lys Arg Ala Ala Pro Lys Gly Thr Lys Arg
1430 1435 1440
Asp Pro Ala Leu Asn Ser Gly Val Ser Gln Lys Pro Asp Pro Ala
1445 1450 1455
Lys Thr Lys Asn Arg Arg Lys Arg Lys Pro Ser Thr Ser Asp Asp
1460 1465 1470
Ser Asp Ser Asn Phe Glu Lys Ile Val Ser Lys Ala Val Thr Ser
1475 1480 1485
Lys Lys Ser Lys Gly Glu Ser Asp Asp Phe His Met Asp Phe Asp
1490 1495 1500
Ser Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ser Val Arg Ala Lys Lys Pro
1505 1510 1515
Ile Lys Tyr Leu Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp Leu Phe
1520 1525 1530
<210> 10
<211> 543
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Met Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Asp Pro Trp Pro Leu Asn Pro Leu
1 5 10 15
Ser Ile Gln Gln Thr Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Thr
20 25 30
Val His Val Gly Gln Arg Leu Leu Arg Gln Arg Arg Arg Gln Leu Arg
35 40 45
Ser Ala Pro Pro Gly Pro Phe Ala Trp Pro Leu Ile Gly Asn Ala Ala
50 55 60
Ala Val Gly Gln Ala Ala His Leu Ser Phe Ala Arg Leu Ala Arg Arg
65 70 75 80
Tyr Gly Asp Val Phe Gln Ile Arg Leu Gly Ser Cys Pro Ile Val Val
85 90 95
Leu Asn Gly Glu Arg Ala Ile His Gln Ala Leu Val Gln Gln Gly Ser
100 105 110
Ala Phe Ala Asp Arg Pro Ala Phe Ala Ser Phe Arg Val Val Ser Gly
115 120 125
Gly Arg Ser Met Ala Phe Gly His Tyr Ser Glu His Trp Lys Val Gln
130 135 140
Arg Arg Ala Ala His Ser Met Met Arg Asn Phe Phe Thr Arg Gln Pro
145 150 155 160
Arg Ser Arg Gln Val Leu Glu Gly His Val Leu Ser Glu Ala Arg Glu
165 170 175
Leu Val Ala Leu Leu Val Arg Gly Ser Ala Asp Gly Ala Phe Leu Asp
180 185 190
Pro Arg Pro Leu Thr Val Val Ala Val Ala Asn Val Met Ser Ala Val
195 200 205
Cys Phe Gly Cys Arg Tyr Ser His Asp Asp Pro Glu Phe Arg Glu Leu
210 215 220
Leu Ser His Asn Glu Glu Phe Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Ser Leu
225 230 235 240
Val Asp Val Met Pro Trp Leu Gln Tyr Phe Pro Asn Pro Val Arg Thr
245 250 255
Val Phe Arg Glu Phe Glu Gln Leu Asn Arg Asn Phe Ser Asn Phe Ile
260 265 270
Leu Asp Lys Phe Leu Arg His Cys Glu Ser Leu Arg Pro Gly Ala Ala
275 280 285
Pro Arg Asp Met Met Asp Ala Phe Ile Leu Ser Ala Glu Lys Lys Ala
290 295 300
Ala Gly Asp Ser His Gly Gly Gly Ala Arg Leu Asp Leu Glu Asn Val
305 310 315 320
Pro Ala Thr Ile Thr Asp Ile Phe Gly Ala Ser Gln Asp Thr Leu Ser
325 330 335
Thr Ala Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Phe Thr Arg Tyr Pro Asp Val
340 345 350
Gln Thr Arg Val Gln Ala Glu Leu Asp Gln Val Val Gly Arg Asp Arg
355 360 365
Leu Pro Cys Met Gly Asp Gln Pro Asn Leu Pro Tyr Val Leu Ala Phe
370 375 380
Leu Tyr Glu Ala Met Arg Phe Ser Ser Phe Val Pro Val Thr Ile Pro
385 390 395 400
His Ala Thr Thr Ala Asn Thr Ser Val Leu Gly Tyr His Ile Pro Lys
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Asp Thr Val Val Phe Val Asn Gln Trp Ser Val Asn His Asp Pro Leu
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Lys Trp Pro Asn Pro Glu Asn Phe Asp Pro Ala Arg Phe Leu Asp Lys
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Lys Asp Leu Thr Ser Arg Val Met Ile Phe Ser
450 455 460
Val Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Glu Leu Ser Lys Met Gln Leu
465 470 475 480
Phe Leu Phe Ile Ser Ile Leu Ala His Gln Cys Asp Phe Arg Ala Asn
485 490 495
Pro Asn Glu Pro Ala Lys Met Asn Phe Ser Tyr Gly Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Pro Lys Ser Phe Lys Val Asn Val Thr Leu Arg Glu Ser Met Glu Leu
515 520 525
Leu Asp Ser Ala Val Gln Asn Leu Gln Ala Lys Glu Thr Cys Gln
530 535 540
<210> 11
<211> 491
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr
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Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr
35 40 45
Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys
50 55 60
Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp
65 70 75 80
Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His
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Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln
100 105 110
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115 120 125
Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu Leu Gln Glu
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser
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Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser
245 250 255
Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp
260 265 270
Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp Thr
275 280 285
Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys
290 295 300
Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn
305 310 315 320
Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys
325 330 335
Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln
340 345 350
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355 360 365
Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln
370 375 380
Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser
385 390 395 400
Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg
405 410 415
Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu
420 425 430
Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly
435 440 445
Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys
450 455 460
Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln
465 470 475 480
Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro
485 490
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu
1 5 10
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala
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<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile
1 5 10
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His
1 5 10
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
1 5 10
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
<210> 36
<211> 180
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp
1 5 10 15
Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly
20 25 30
Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala
35 40 45
Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro
50 55 60
His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala
65 70 75 80
Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe
85 90 95
Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp
100 105 110
Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val
115 120 125
Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln
130 135 140
Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met
145 150 155 160
Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser
165 170 175
Gly Gln Arg Arg
180
<210> 37
<211> 386
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Met Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Ala Arg Ala Ala Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gly Phe Leu Phe Leu Leu Phe Phe Trp Leu Asp Arg Ser Val Leu Ala
20 25 30
Lys Glu Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Ile Asp Thr Phe Pro Thr Asp Pro Ile Lys Glu Ser Ser Trp Pro
50 55 60
Gln Gly Phe Gly Gln Leu Thr Gln Leu Gly Met Glu Gln His Tyr Glu
65 70 75 80
Leu Gly Glu Tyr Ile Arg Lys Arg Tyr Arg Lys Phe Leu Asn Glu Ser
85 90 95
Tyr Lys His Glu Gln Val Tyr Ile Arg Ser Thr Asp Val Asp Arg Thr
100 105 110
Leu Met Ser Ala Met Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro Glu Gly
115 120 125
Val Ser Ile Trp Asn Pro Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val His
130 135 140
Thr Val Pro Leu Ser Glu Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Pro Phe Arg Asn
145 150 155 160
Cys Pro Arg Phe Gln Glu Leu Glu Ser Glu Thr Leu Lys Ser Glu Glu
165 170 175
Phe Gln Lys Arg Leu His Pro Tyr Lys Asp Phe Ile Ala Thr Leu Gly
180 185 190
Lys Leu Ser Gly Leu His Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys
195 200 205
Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Cys Glu Ser Val His Asn Phe Thr Leu Pro
210 215 220
Ser Trp Ala Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu
225 230 235 240
Leu Ser Leu Leu Ser Leu Tyr Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser
245 250 255
Arg Leu Gln Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Ile Leu Asn His Met Lys
260 265 270
Arg Ala Thr Gln Ile Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Met Tyr Ser Ala
275 280 285
His Asp Thr Thr Val Ser Gly Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn
290 295 300
Gly Leu Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe
305 310 315 320
Glu Lys Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln
325 330 335
His Glu Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro
340 345 350
Leu Glu Arg Phe Ala Glu Leu Val Gly Pro Val Ile Pro Gln Asp Trp
355 360 365
Ser Thr Glu Cys Met Thr Thr Asn Ser His Gln Gly Thr Glu Asp Ser
370 375 380
Thr Asp
385
<210> 38
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys Val Tyr Asp Pro Leu
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu Leu Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
Thr Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met
1 5 10 15
Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala
20 25
<210> 46
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe Ala Glu Lys Tyr Ala Arg Val Arg Ala Lys Cys
20 25
<210> 47
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Ala Arg Trp Trp Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Gln Gln Gln
1 5 10 15
Pro Pro Pro Gly Gln Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys Val Tyr Asp
20 25 30
Pro Leu
<210> 48
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Ala Arg Trp Trp Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu
20 25 30
<210> 49
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Ala Arg Trp Trp Ser Leu Ser Leu Gly Phe Leu Phe Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala
20 25 30
<210> 50
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Ala Arg Trp Trp Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Thr Gly Asn
1 5 10 15
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser
20 25
<210> 51
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Ala Arg Trp Trp Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu
20 25
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 52
Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu
1 5 10 15
<210> 54
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 54
Ala Val Gly Ala Leu Glu Gly Ser Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val
1 5 10 15
Pro Arg Gln Leu
20
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> 环己基-Ala
<220>
<221> u
<222> (27)..(27)
<223> D-Ala
<400> 55
Ala Arg Trp Trp Trp Met His His Asn Met Asp Leu Ile Gly Gly Ala
1 5 10 15
Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Xaa
20 25
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
Ala Arg Trp Trp
1
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
Trp Met His His Asn Met Asp Leu Ile
1 5
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> 环己基-Ala
<220>
<221> U
<222> (12)..(12)
<223> D-Ala
<400> 58
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Xaa
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 64
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10 15
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 65
Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 66
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 66
Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser
1 5 10 15
Lys Ile
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Lys Leu Glu Ser
20
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 68
Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Glu Ser Lys Ile
20
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Lys Leu Glu Ser Lys Ile
20
<210> 70
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe Ser Thr
20
<210> 71
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe Ser
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 73
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 74
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 75
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn
1 5 10 15
<210> 76
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 76
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn
1 5 10
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 77
Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10
<210> 78
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> K
<222> (8)..(8)
<223> 甲酰化的 Lys8
<400> 78
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> K
<222> (9)..(9)
<223> Ly9 甲酰化的
<400> 79
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> K
<222> (13)..(13)
<223> Lys13 甲酰化的
<400> 80
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> K
<222> (8)..(8)
<223> Lys8 甲酰化的
<220>
<221> K
<222> (9)..(9)
<223> Lys9 甲酰化的
<400> 81
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> K
<222> (9)..(9)
<223> 甲酰化的 Lys9
<220>
<221> K
<222> (13)..(13)
<223> 甲酰化的 Lys13
<400> 82
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 83
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 83
Ala Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 84
Phe Ala Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 85
Phe Ile Ala Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 86
Phe Ile Gly Ile Thr Ala Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 87
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Ala Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 88
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 89
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Ala Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 90
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Ala Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 91
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 91
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Ala Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 92
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 92
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ala Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 93
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 93
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Ala Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 94
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ala Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 95
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 95
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Ala Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 96
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 96
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Ala
1 5 10 15
Val Phe
<210> 97
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 97
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Ala Phe
<210> 98
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 98
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Ala
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 99
Tyr Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 100
Phe Leu Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 101
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 101
Phe Ile Ser Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 102
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 102
Phe Ile Gly Leu Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 103
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 103
Phe Ile Gly Ile Ser Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 104
Phe Ile Gly Ile Thr Asp Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 105
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Ile Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 106
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 106
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 107
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 107
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Arg Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 108
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 108
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Ile Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 109
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 109
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Thr Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 110
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 110
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Arg Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 111
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 111
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Leu Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 112
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 112
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Gln Lys
1 5 10 15
Val Phe
<210> 113
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 113
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Arg
1 5 10 15
Val Phe
<210> 114
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 114
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Leu Phe
<210> 115
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 115
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Tyr
<210> 116
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 116
Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 117
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 117
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr
20 25 30
<210> 118
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 118
Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro
1 5 10 15
Gln Asp Arg Leu Thr Arg Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro
20 25 30
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 119
Asn Pro Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val
1 5 10
<210> 120
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 120
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
1 5 10 15
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
20 25 30
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys
35 40
<210> 121
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 121
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr
20 25
<210> 122
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 122
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val
20 25
<210> 123
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 123
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp
20 25
<210> 124
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 124
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu
20 25
<210> 125
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 125
Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Asn Pro
20 25 30
Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val
35 40
<210> 126
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 126
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 127
Ala Glu Lys Tyr Ala Arg Val Arg Ala Lys
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 128
Ala Ala Lys Tyr Ala Arg Val Arg Ala Lys
1 5 10
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 129
Ala Ala Lys Tyr Ala Arg Val Arg Ala Lys Cys
1 5 10
<210> 130
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 130
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
1 5 10 15
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 131
Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu
1 5 10 15
<210> 132
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 132
Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro
1 5 10 15
<210> 133
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 133
Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 134
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 134
Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp
1 5 10 15
<210> 135
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 135
Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly
1 5 10 15
<210> 136
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 136
Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 137
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 137
Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr
1 5 10
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 138
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr
1 5 10 15
<210> 139
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 139
Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
1 5 10 15
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 140
Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu
1 5 10 15
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 141
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro
1 5 10 15
<210> 142
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 142
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe Ser Ser Ala Phe Ala Asp Val Glu Ala Ala
20 25
<210> 143
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 143
Ala Arg Trp Trp Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu
20 25 30
<210> 144
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 144
Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Ala Ala Arg Gln Ile Tyr
1 5 10 15
Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu
20 25
<210> 145
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 145
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe Ala Glu Lys Tyr Ala Arg Val Arg Ala Lys
20 25
<210> 146
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的
<400> 146
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys
1 5 10 15
Val Phe Ala Glu Lys Tyr Ala Arg Val Arg Ala Lys Cys
20 25
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 147
Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
1 5
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 148
Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 149
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala
1 5 10
<210> 150
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 150
Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu
1 5 10 15
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 151
Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
<210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 152
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
<210> 153
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 153
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile
1 5 10 15
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 154
Ser Ser Ala Phe Ala Asp Val Glu Ala Ala
1 5 10
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 155
Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 156
Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 157
Ser Leu Ser Leu Gly Phe Leu Phe Leu
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 158
Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 159
Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys
1 5
<210> 160
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 160
gcactgttca gcgtgctcaa ctacgagcgg gcgcggcgcc ccggcctcct gggcgcctct 60
gtgctgggcc tggacgatat ccacagggcc 90
<210> 161
<211> 93
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 161
ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 60
ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cgg 93
<210> 162
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 162
catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc gcttcatccc caagcctgac 60
gggctgcggc cgattgtgaa catggactac 90
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 163
Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly
1 5
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 164
Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
1 5
<210> 165
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 165
Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile
1 5 10
<210> 166
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 166
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys
1 5 10 15
Pro Asp Gly Leu
20
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 167
Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu
1 5 10 15
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 168
Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
1 5 10 15
<210> 169
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 169
Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro
1 5 10 15
<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 170
Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn
1 5 10 15
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 171
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
1 5
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 172
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
1 5 10
<210> 173
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 173
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
1 5 10 15
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 174
Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val
1 5 10 15
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 175
Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly
1 5 10 15
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 176
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val
1 5 10 15
<210> 177
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 177
Arg Pro Ile Val Asn
1 5
<210> 178
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 178
Pro Asp Gly Leu
1

Claims (41)

1.缀合物，其包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；和
(b)至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，其中所述CD4+T细胞表位包含通用肿瘤抗原的至少12个氨基酸的区域或与所述区域具有至少80％序列同一性的序列，并且其中所述CD4+T细胞表位在至少50％的群体中具有免疫原性，其中所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸，
其中所述B细胞表位序列与所述CD4+T细胞表位序列不同，并且
其中，对B细胞表位特异性的抗体与缀合物结合。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽和所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽通过核心连接，
其中在连接之前，所述核心包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团；以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交；
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件；优选地其中：
(i)第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；和/或
(ii)第一连接元件和第二连接元件独立地选自1，2，3三唑键、二氢哒嗪键、哒嗪键和硫化物键。
3.测定受试者中对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答的存在的方法，所述受试者已被施用了缀合物，所述缀合物包含至少一个包含B细胞表位序列的多肽和至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽，所述方法包括以下步骤：
(a)在施用所述缀合物之前，在源自所述受试者的样本中检测对缀合物特异性的抗体的量或缺失，其中在第一水平检测所述抗体的量或缺失；以及
(b)在一次或多次施用所述缀合物之后，在源自所述受试者的样本中检测对缀合物特异性的抗体的量或缺失，其中在第二水平检测所述抗体的量或缺失，以及
其中，相对于第一水平抗体的量或缺失，第二水平抗体的量增加表明受试者中存在对CD4+T细胞表位的CD4+T细胞应答。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(b)包括在两次或更多次施用缀合物、优选三次或更多次施用缀合物、优选四次施用缀合物之后，在来自受试者的样本中检测对缀合物特异性的抗体的量或缺失。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述对缀合物特异性的抗体是对B细胞表位特异性的抗体。
6.根据权利要求1或2所述的缀合物或根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽是包含B细胞表位序列的第一和第二多肽，优选包含B细胞表位序列的第一、第二和第三多肽。
7.根据权利要求1、2或6中任一项所述的缀合物或根据权利要求3-6中任一项的方法，其中所述B细胞表位包含选自以下的序列：
(i)包含在SEQ ID NO：3中连续的至少10个氨基酸的序列，优选包含在SEQ ID NO：5中连续的至少10个氨基酸的序列；或
(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列。
8.根据权利要求7所述的缀合物或方法，其中所述B细胞表位包含选自以下的序列：
(i)包含在SEQ ID NO：5中连续的至少10个氨基酸的序列，所述序列包含序列表中SEQID NO：6表示的氨基酸序列GITELKKL；或
(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列。
9.根据权利要求8所述的缀合物或方法，其中所述B细胞表位包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：7；或
(ii)与(i)具有至少70％序列同一性的序列。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述CD4+T细胞表位包含自身抗原或肿瘤相关抗原的至少12个氨基酸的区域，或与该区域具有至少80％序列同一性的序列，并且其中至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽的长度等于或小于500个氨基酸，优选地，其中所述自身抗原或肿瘤相关抗原是通用肿瘤抗原。
11.根据权利要求1、2或6-9中任一项所述的缀合物或根据权利要求10所述的方法，其中所述通用肿瘤抗原选自由端粒酶逆转录酶、存活蛋白、DNA拓扑异构酶2-α、细胞色素P4501B1和E3泛素蛋白连接酶Mdm2组成的组中。
12.根据权利要求11所述的缀合物或方法，其中所述通用肿瘤抗原是端粒酶逆转录酶，并且其中所述CD4+T细胞表位包含选自以下的一个或多个序列：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)SEQ ID NO：116；
(iii)SEQ ID NO：117；
(iv)包含至少12个氨基酸的(i)、(ii)或(iii)的免疫原性片段的序列；和/或
(v)与(i)、(ii)、(iii)或(iv)具有至少80％序列同一性的序列。
13.根据权利要求1、2、6至9，11或12中任一项的缀合物或根据权利要求3至12中任一项的方法，其中所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽包含另一种T细胞表位序列，其中所述另一种T细胞表位是另一种CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。
14.根据权利要求1、2、6至9或11至13中任一项的缀合物或根据权利要求3至13中任一项的方法，其中所述缀合物包含另一种物质，优选所述另一种物质是包含表位序列的另一种多肽，更优选所述表位是另一种T细胞表位，更优选所述另一种T细胞表位是另一种CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。
15.根据权利要求13或14所述的缀合物或方法，其中所述CD4+T细胞表位包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)包含至少12个氨基酸的(i)的免疫原性片段的序列；或
(iii)与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列，
并且其中所述另一种CD4+T细胞表位包含选自以下的序列：
(iv)SEQ ID NO：116；
(v)包含至少12个氨基酸的(iv)的免疫原性片段的序列；或
(vi)与(iv)或(v)具有至少80％序列同一性的序列。
16.包含第一和第二不同缀合物的缀合物的混合物，其中所述第一缀合物和/或所述第二缀合物是根据权利要求1、2、6至9或11至15中任一项所述的缀合物。
17.根据权利要求16所述的缀合物的混合物，其中所述第一缀合物包含CD4+T细胞表位，所述表位包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：1；
(ii)包含至少12个氨基酸的(i)的免疫原性片段的序列；或
(iii)与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列，
并且其中所述第二缀合物包含CD4+T细胞表位，所述表位包含选自以下的序列：
(iv)SEQ ID NO：116；
(v)包含至少12个氨基酸的(iv)的免疫原性片段的序列；或
(vi)与(iv)或(v)具有至少80％序列同一性的序列。
18.核酸分子，其包含编码权利要求1(a)部分中定义的多肽的第一核苷酸序列和编码权利要求1(b)部分中定义的多肽的第二核苷酸序列。
19.多肽，其包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：116；
(ii)与(i)具有至少91％序列同一性的序列；
(iii)SEQ ID NO：117；或
(iv)与(iii)具有至少95％序列同一性的序列，
其中，包含选自(i)或(ii)的序列的多肽的长度等于或小于100个氨基酸，并且其中包含选自(iii)或(iv)的序列的多肽的长度等于或小于40个氨基酸。
20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述包含选自(i)或(ii)的序列的多肽的长度等于或小于75或50个氨基酸。
21.根据权利要求19所述的多肽，其中所述包含选自(iii)或(iv)的序列的多肽的长度等于或小于35、34、33、32或31个氨基酸。
22.核酸分子，其由编码根据权利要求19至21中任一项所述的多肽的核苷酸序列组成。
23.载体，其包含根据权利要求18或22所述的核酸分子。
24.包含第一产物和第二产物的组合，其中所述第一产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少8个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，其包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第二产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(vii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少17个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，其包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第一产物和所述第二产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第一产物和第二产物为单一多肽，并且且第一产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及所述第二产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则所述单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第一产物和第二产物为单一产物，并且第一产物如(v)中所定义以及第二产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度小于1500个核苷酸。
25.根据权利要求24所述的组合，其包含多肽的混合物，其中所述第一产物是如权利要求24部分(i)、(ii)或(iii)中所定义的多肽，并且其中所述第二产物是如权利要求24部分(vi)、(vii)或(viii)中所定义的多肽。
26.根据权利要求24所述的组合，其包含核酸分子的混合物，其中所述第一产物是如权利要求24部分(v)中所定义的核酸分子，所述第二产物是如权利要求24部分(x)中所定义的核酸分子。
27.根据权利要求19或20所述的多肽，根据权利要求21所述的核酸分子或根据权利要求24至26中任一项所述的组合，其中所述多肽或每个多肽或所述核酸分子或每个核酸分子与另一种物质连接。
28.第一产物，其通过与第二产物同时、单独或顺序施用在医学中应用，其中所述第一产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少8个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，其包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第二产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(vii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少17个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，其包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第一产物和所述第二产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第一产物和第二产物为单一多肽，并且第一产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及所述第二产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则所述单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第一产物和第二产物为单一产物，并且第一产物如(v)中所定义以及第二产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。
29.第二产物，其通过与第一产物同时、单独或顺序施用在医学中应用，其中第二产物选自以下(i)至(v)：
(i)包含SEQ ID NO：116的序列的多肽；
(ii)包含(i)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少17个氨基酸；
(iii)包含与(i)或(ii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(iv)缀合物，其包含(i)至(iii)中任一项所定义的多肽；
(v)核酸分子，其由编码如(i)至(iii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
并且其中所述第一产物选自以下(vi)至(x)：
(vi)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(vii)包含(vi)的免疫原性片段的多肽，所述片段包含至少8个氨基酸；
(viii)包含与(vi)或(vii)具有至少80％序列同一性的序列的多肽；
(ix)缀合物，其包含(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽；
(x)核酸分子，其由编码如(vi)至(viii)中任一项所定义的多肽的核苷酸序列组成，
其中所述第二产物和所述第一产物任选地是受以下条件限制的单一产物：
(a)当第二产物和第一产物为单一多肽，并且第二产物如(i)至(iii)中任一项所定义以及所述第一产物如(vi)至(viii)中任一项所定义时，则所述单一多肽的长度等于或小于170个氨基酸；
(b)当第二产物和第一产物是单一产物，并且第二产物如(v)中所定义以及第一产物如(x)中所定义时，则单一核酸分子的长度等于或小于1500个核苷酸。
30.根据权利要求1、2、6至9或11至15中任一项所述的缀合物，根据权利要求16或17所述的缀合物的混合物，根据权利要求18、21或27所述的核酸分子，根据权利权利要求19、20或27所述的多肽，或根据权利要求24至27中任一项的组合，其用于医学。
31.根据权利要求28所述的第一产物、根据权利要求29所述的第二产物、或根据权利要求30所述的缀合物、缀合物的混合物、核酸分子、多肽或组合，其用于治疗或预防癌症。
32.药物组合物，其包含根据权利要求1、2、6至9或11至15中任一项所述的缀合物，根据权利要求16或17所述的缀合物的混合物，根据权利要求18、21或27所述的核酸分子，根据权利权利要求19、20或27所述的多肽，或根据权利要求24至27中任一项的组合和药学上可接受的稀释剂，赋形剂或佐剂以及任选的另一种治疗成分。
33.核心，其包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团；以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
所述第一连接基团和第二连接基团中的至少一个包括两个或更多第一连接基团或第二连接基团，和
所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物；优选地其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基；
其中所述核心不是：
34.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求6至9或11至15中任一项所述的缀合物或根据权利要求33所述的核心，其中所述主体部分由式1和式2之一表示：
式1
式2
其中在式1中：
L11和L12是接头；
R13选自氢、羟基、任选地取代的氨基、卤素、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a11表示附接到碳原子上的[(L11)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a12表示附接到碳原子上的[(L12)-**]基团的数目，并且选自1、2或3；
a13表示附接到碳原子上的R13基团的数目，并且选自0或1；
a11+a12+a13是4；
*表示与第一连接基团的连接点；
**表示与第二连接基团的连接点；和
其中在式2中：
AA表示氨基酸；
n表示独立选择的AA基团的数目，并且选自1至12；
L21和L22是接头；
R23选自氢、羟基、任选地取代的氨基、任选地取代的烷基、-S-(任选地取代的烷基)、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的烷酰基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基；
a21表示附接到[(AA)]n上的[(L21)-*]基团的数目，并且选自1、2或3；
a22表示附接到[(AA)]n上的[(L22)-**]基团的数目，并且选自1、2或3；
a23表示在C端和/或N端附接到[(AA)]n上的R23基团的数目，并且选自0、1或2；
*表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第一连接基团的连接点；
**表示经由AA基团之一的N端、C端或侧链与第二连接基团的连接点。
35.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求6至9或11至15中任一项所述的缀合物或根据权利要求33或34所述的核心，其中L11、L12、L21和L22独立地选自-(任选取代的亚烷基)-、-O-、-(CONH)-、-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-、-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-O-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-、-(任选取代的亚烷基)-(CH2CH2O)w-、-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-O-(任选取代的亚烷基)-、-O-(CONH)-、-O-(NHCO)-、-O-(CH2CH2O)w-，-O-(CO)-，-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-O-、-(CONH)-(NHCO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-、-(CONH)-(CO)-、-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(NHCO)-O-，-(NHCO)-(CONH)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-、-(NHCO)-(CO)-、-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CH2CH2O)w-O-、-(CH2CH2O)w-(CONH)-、-(CH2CH2O)w-(NHCO)-、-(CH2CH2O)w-(CO)-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)、-(CO)-O-，-(CO)-(CONH)-、-(CO)-(NHCO)-、-(CO)-(CH2CH2O)w-、-(CO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(任选取代的亚烷基)-O-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-O-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(CONH)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(CONH)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-、-(NHCO)-(CH2CH2O)w-(任选取代的亚烷基)-(NHCO)-(任选取代的亚烷基)-(CO)-。
36.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求6至9或11至15中任一项所述的缀合物或根据权利要求33至35中任一项所述的核心，其中所述主体部分由式2表示。
37.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求6至9或11至15中任一项所述的缀合物或根据权利要求33至36中任一项的核心，其中所述核心还包含附接于主体部分的第三连接基团，其中所述第三连接基团与第一连接基团和第二连接基团正交：优选地，其中所述第三连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、反式环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇和叠氮化物。
38.缀合物，其包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽；或
(b)至少一个包含CD4+T细胞序列的多肽；
其中，所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽或所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接到核心，其中在连接之前，所述核心包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团：以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
其中所述核心不是：
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，或者所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件；
优选地，其中核心如权利要求33至37中任一项所定义。
39.根据权利要求38所述的缀合物，其中所述缀合物包含：
(a)至少一个包含B细胞表位序列的多肽：和
(b)至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽；
并且其中所述第一连接基团与至少一个包含B细胞表位序列的多肽连接以形成第一连接元件，并且所述第二连接基团与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽连接以形成第二连接元件。
40.制备缀合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供核心，所述核心包含：
主体部分；
附接到所述主体部分的一个或多个第一连接基团；以及
附接到所述主体部分的一个或多个第二连接基团，
其中所述第一连接基团和第二连接基团彼此正交，
所述第一连接基团和第二连接基团中的至少一个包括两个或更多第一连接基团或第二连接基团，和
所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、烯烃(例如末端烯烃、降冰片烯)、环炔烃、环烯烃、四嗪、共轭二烯、马来酰亚胺、α-卤代羰基、硫醇或叠氮化物；优选地其中所述第一连接基团和所述第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃、马来酰亚胺和α-卤代羰基；更优选地其中所述第一连接基团和第二连接基团独立地选自炔烃(例如末端炔烃)、环炔烃和α-卤代羰基；
其中所述核心不是：
优选地，其中核心如权利要求33至37中任一项所定义；
(b)提供至少一个包含B细胞表位序列的多肽，或至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽；并将所述核心与至少一个包含B细胞表位序列的多肽反应以形成第一连接元件，或将所述核心与至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽反应以形成第二连接元件。
41.根据权利要求40所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(c)提供步骤(b)中未提供的至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽或至少一个包含B细胞表位序列的多肽中的另一个；以及如果在步骤(b)中形成第一连接元件，则使所述核心与所述至少一个包含CD4+T细胞表位序列的多肽反应以形成第二连接元件；或者如果在步骤(b)中形成第二连接元件，则使所述核心与所述至少一个包含B细胞表位序列的多肽反应以形成第一连接元件。
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