CN117925877A - 抗虫耐除草剂水稻转化事件chos07的核酸分子、检测方法及其应用 - Google Patents
抗虫耐除草剂水稻转化事件chos07的核酸分子、检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925877A CN117925877A CN202311299596.5A CN202311299596A CN117925877A CN 117925877 A CN117925877 A CN 117925877A CN 202311299596 A CN202311299596 A CN 202311299596A CN 117925877 A CN117925877 A CN 117925877A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- rice
- plant
- sequence
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 89
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 89
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 83
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 32
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 12
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 113
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 39
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 8
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 claims 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 9
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 6
- 239000011540 sensing material Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 5
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 101100007609 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai cry1Fa gene Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 1
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000009683 detection of insect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012770 industrial material Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 1
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种抗虫耐除草剂水稻转化事件CHOS07的核酸分子、检测方法及其应用，所述水稻转化事件CHOS07的核酸分子包括SEQ ID NO:1所示序列或其反向互补序列、或者SEQ ID NO:2所示序列或其反向互补序列。本发明水稻CHOS07具有抗虫和耐草铵膦除草剂特性且农艺性状优良，检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含转基因水稻事件CHOS07的DNA分子。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，涉及抗虫耐除草剂水稻转化事件CHOS07的核酸分子、检测方法及其应用，特别是涉及一种抗虫和耐受草铵膦除草剂施用的转基因水稻事件CHOS07和用于检测生物样品中是否包含特定转基因水稻事件CHOS07的核酸序列及其检测方法。
背景技术
Cry1F可用于控制许多鳞翅目害虫，包括草地贪夜蛾、玉米螟和棉铃虫，并且对黏虫、斜纹夜蛾、大螟有活性。草地贪夜蛾是2018年末由云南入侵我国的新型农业害虫，寄主植物达19种之多。近年来，斜纹夜蛾、草地贪夜蛾和大螟等危害水稻的茎、叶和穗，对稻田产量也造成了巨大的影响。陶氏益农、隆平高科和大北农等单位开发了多种抗虫玉米和大豆产品。但是，Cry1F用于水稻抗虫的产品很少。
用超表达载体驱动杀虫基因在植物体内的表达效率，能极大的提高Bt蛋白的杀虫活性。常用的策略是使用植物内源的超表达启动子驱动杀虫基因表达(如玉米、水稻内源的Ubiquitin启动子)或是来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的过表达启动子35S。例如，转基因玉米产品TC1507和BFL4-2中抗虫基因cry1F表达盒均使用了玉米内源的Ubiquitin，而大北农开发的抗虫大豆转化体(专利申请号2019100980178)中cry1F基因是由来源于拟南芥的启动子AtUbi10驱动。
为了测试不同启动子在水稻植物体内对抗虫基因的驱动效率，以及不同启动子构成的杀虫表达盒对靶标害虫的杀虫活性，本发明将cry1F与不同来源的启动子连接成多种不同的表达盒，并与耐除草剂的筛选标记表达盒连接，构建成植物表达载体，使其在转基因水稻中表达。通过抗虫性生测试验，结合农艺性状筛选，从中挑选出具有更高的杀虫活性和经济价值的抗虫水稻产品。
已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化事件的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。因此，需要对更多的转化事件进行性状鉴定和筛选，以获得综合性状表现优异，具有商业化前景的优异转化事件。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗虫耐除草剂性状优异且农艺性状优良的水稻转化事件以及用于检测水稻CHOS07的核酸分子及其检测方法。转基因水稻事件CHOS07抗虫性状优良并对草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含特定转基因水稻事件CHOS07的DNA分子。
为实现上述目的，本发明使用不同的启动子驱动cry1F基因的表达盒，与bar基因表达盒一起连接到植物表达骨架载体pCAMBIA3300上，获得了新的pCAMBIA3300-cry1F-bar表达载体，通过农杆菌介导的方法转化水稻日本晴，获得了98个阳性转化事件。通过抗虫和耐除草剂性状鉴定发现，转化事件CHOS07是耐除草剂、抗虫性表现优异且农艺性状最好的转化体，能够用来改良水稻的抗虫和耐除草剂性状。
为了表征CHOS07的身份特征，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列，或其反向互补序列。
进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示序列，或其反向互补序列。
更进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示序列，或其反向互补序列。
更进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5所示序列或其反向互补序列。
本发明还提供了用于检测水稻转化事件的探针，其特征在于，包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列或其片段或其变体或其反向互补序列。
本发明还提供了用于检测水稻转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列或其片段或其变体或其反向互补序列。
在一些实施方案中，上述引物对为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列；或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的序列。
本发明还提供了用于检测水稻转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含上述的探针和/或引物对。
本发明还提供了检测水稻转化事件的方法，其特征在于，包括利用上述的探针或上述的引物对或上述的探针和引物对或上述的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述转化事件。
本发明还提供了对水稻进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得包含上述核酸分子的水稻；
2)将步骤1)所获得的水稻通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到水稻植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，
3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗虫性状和/或除草剂抗性鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。
进一步的，本发明还提供了利用上述方法获得的水稻植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。
所述SEQ ID NO:1为转基因水稻事件CHOS07中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1跨越了水稻插入位点的左侧翼基因组DNA序列和插入序列的左边界5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其反向互补序列即可鉴定为转基因水稻事件CHOS07的存在。所述SEQ ID NO:2为转基因水稻事件CHOS07中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2跨越了插入序列的右边界3’末端的DNA序列和水稻插入位点的右侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其反向互补序列即可鉴定为转基因水稻事件CHOS07的存在。
本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其反向互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ IDNO:3或其反向互补序列中5’左侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或反向互补于包含完整的所述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:6或其反向互补序列的扩增产物时，可以诊断转基因水稻事件CHOS07或其后代的存在。
所述SEQ ID NO:3为转基因水稻事件CHOS07中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1402个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3由992个核苷酸的水稻左侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1-992)、90个核苷酸的pCAMBIA3300-cry1F-bar构建体左边界DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸993-1082)和320个核苷酸的耐草铵膦基因的第一表达盒的5’末端DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1083-1402)组成，包含所述SEQ ID NO:3或其反向互补序列即可鉴定为转基因水稻事件CHOS07的存在。
所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其反向互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其反向互补序列中3’右侧翼水稻基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或反向互补于包含完整的所述SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或其反向互补序列的扩增产物时，可以诊断转基因水稻事件CHOS07或其后代的存在。
所述SEQ ID NO:4为转基因水稻事件CHOS07中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1486个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4由513个核苷酸的抗虫基因的第二表达盒的3’末端DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸1-513)、129个核苷酸的pCAMBIA3300-cry1F-bar构建体右边界DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸514-642)和844个核苷酸的水稻整合位点右侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸643-1486)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其反向互补序列即可鉴定为转基因水稻事件CHOS07的存在。
所述SEQ ID NO:5为表征转基因水稻事件CHOS07的长度为6721个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:5或其反向互补序列即可鉴定为转基因水稻事件CHOS07的存在。
表1SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件
1：单位bp。
本发明还提供了一种保护水稻植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因水稻植物的大田中，所述转基因水稻植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第993-5877位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因水稻植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因水稻植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。
本发明还提供了一种保护水稻植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因水稻植物细胞，所述转基因水稻植物细胞在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第993-5877位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因水稻植物细胞的基因组中包含SEQ ID NO:5；摄食所述转基因水稻植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述水稻植物。
本发明提供了一种用于检测水稻植物的核酸序列及其检测方法，转基因水稻事件CHOS07具有提高抗虫性状和耐受草铵膦除草剂的作用。该性状的水稻植株表达Cry1F蛋白和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)蛋白，其赋予植物抗虫和对草铵膦的耐受性。同时本发明检测方法中SEQ ID NO:1或其反向互补序列、SEQ ID NO:2或其反向互补序列、SEQ ID NO:3或其反向互补序列、SEQ ID NO:4或其反向互补序列、SEQ ID NO:6或其反向互补序列、或者SEQID NO:7或其反向互补序列可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因水稻事件CHOS07或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因水稻事件CHOS07的植物材料的存在。
转基因水稻事件CHOS07的草铵膦耐受能力强，抗虫性状突出。这些特征使得CHOS07这个转化体可以用来改良水稻的草铵膦除草剂耐受性和抗虫性状，从而培育抗虫耐除草剂的水稻新品种。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1转基因插入序列与水稻基因组结合部位的结构示意图。
图2重组表达载体pCAMBIA3300-cry1F-bar的物理图谱，以P8为例。
图3CHOS07事件与日本晴的抗虫性表现。A：CHOS07转化事件水稻；B：受体对照水稻日本晴。
图4CHOS07转化事件特异性PCR验证结果。M：Marker，大小标注在旁(单位：bp)；C：受体对照日本晴基因组DNA；T：转化体CHOS07基因组DNA。
LB：左边界PCR片段预期大小382bp；B：右边界PCR片段预期大小495bp。
具体实施方式
本申请涉及的转化事件CHOS07是指以日本晴为受体经过遗传转化后得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的水稻植株。在具体实施例中，转基因所用表达载体具有图2所示的物理图谱，所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:5的第993-5877位核苷酸所示序列。
实施例1构建不同启动子驱动的cry1F基因的表达载体
本发明使用2个不同版本的抗虫蛋白——Cry1Fa(氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)和Cry1Fn(氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)，两者之间仅一个氨基酸的差异。
将人工合成的2种cry1F基因cry1Fa(核酸序列如SEQ ID NO.15所示)和Cry1Fn(核酸序列如SEQ ID NO.16所示)通过同源重组的方法，分别与玉米源超表达启动子ZmUbiquitin、增强型花椰菜花叶病毒源启动子CaMV 35S promoter(enhanced)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子NOS promoter、拟南芥源超表达启动子Atubi10和水稻源超表达启动子OsUbi连接，再连接终止子TNOS，构成由10种不同启动子驱动的cry1F基因表达盒。将该表达盒分别与bar基因表达盒一起连接到骨架载体pCAMBIA3300上，获得了10种新的pCAMBIA3300-cry1F-bar表达载体P1-P10。其中P1-P5载体包含cry1Fa，P6-P10载体包含cry1Fn。载体T-DNA区表达盒的具体信息见表2。
表2 10个表达载体T-DNA区的元件信息表
实施例2转化事件的获得和性状鉴定
本发明使用表达载体P1-P10(载体物理图谱见图2，以P8载体为例)，通过农杆菌介导法转化受体水稻品种日本晴，以草铵膦作为筛选剂，10个载体共计获得了98个阳性转化事件，并对这些转化苗的T1代植株的除草剂耐性、抗虫性和相关农艺性状做了鉴定和筛选。
1、筛选抗虫耐除草剂性状优异的转化体
(1)除草剂抗性筛选
以受体日本晴为对照，通过田间喷施田间推荐浓度中量1倍的草铵膦的方法，筛选除草剂耐性较好的转化体。结果发现，喷施草铵膦的受体对照全部枯萎死亡，而所有转化体均能正常生长。
(2)抗虫性筛选
以日本晴作为阴性对照，通过离体叶片室内生测的方法筛选抗虫性较好的转化体。使用苗期水稻的离体叶片喂食斜纹夜蛾、草地贪夜蛾和大螟的初孵幼虫，对材料的抗虫性进行初筛，每个材料设置两个重复，在阴性对照死亡率不超过20％的情况下，转化体材料的平均死亡率超过40％的则初步认定为有抗性。转入10个不同载体的转化体的室内生测结果如表3所示。其中，有9个转化体同时对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和大螟具有抗性，依次命名为CHOS01-CHOS09。这其中，有6个转化体是转入P3或P8载体的水稻材料。P3和P8载体中cry1F基因均由启动子NOS promoter(核酸序列如SEQ ID NO.14所示)驱动，获得对3种虫均有抗性的转化体的比率远高于其他载体，也就是说，杀虫基因cry1F在不同启动子驱动下的杀虫活性是不一样的。令人意外的是，来源于根癌农杆菌的NOS启动子优于常用的植物源组成型启动子35S和水稻源超表达启动子OsUbi。
表3不同转化体的室内生测结果
进一步对这9个转化体的抗性等级进行评价。剪取水稻叶片4cm左右，放入培养皿中，皿底铺上用无菌水润湿的滤纸保持高湿状态。每皿接入10头待测试虫的初孵幼虫(孵化2-12h)。在温度25±1℃、湿度50％、L:D＝14:10条件下培养，于第6天检查试虫的存活情况，没发育至2龄的幼虫也视为死亡，以日本晴作为阴性对照，每个材料重复5次。根据以下公式1和公式2分别计算试虫的死亡率和校正死亡率。
结果表明，取食这9个转化体叶片的斜纹夜蛾、草地贪夜蛾和大螟的死亡率均显著高于对照(表4)，其中CHOS01、CHOS02、CHOS03、CHOS06、CHOS07和CHOS08对3种虫的抗性水平均为高抗，其余为中抗或抗。上述6种高抗转化体中的杀虫基因cry1F均由启动子NOSpromoter驱动。
表4 9个对3种虫均有抗性的转化体室内生测结果
数值以3个生物学重复的平均值±标准差表示，同列数据的差异显著性采用LSD方法分析(α＝0.05)。
(3)农艺性状调查
在对几个转化体进行抗性性状鉴定的同时，还对它们的农艺性状(如株高、叶片大小、果穗大小和籽粒重量等)做了详细记录。进行数据统计时意外的发现，抗虫等级为高抗的转化体中，CHOS01、CHOS02、CHOS03、CHOS06和CHOS08的株高和千粒重均显著低于对照日本晴，只有转化体CHOS07的农艺性状(株高和千粒重)与对照无显著差异。(表5)
表5部分农艺性状调查结果
数值来自于3个生物学重复的平均值±标准差。统计分析使用LSD进行多重比较(α＝0.05)，不同字母表示相同时期同列数据差异显著性。
综合来看，CHOS07是耐除草剂、抗虫性表现优异且农艺性状最好的水稻转化体。
2、CHOS07除草剂耐受性和抗虫性的系统鉴定
以水稻转化体CHOS07和对照日本晴为材料，在田间喷施不同浓度剂量的草铵膦和人工接虫的方式系统的鉴定转化体CHOS07的除草剂耐受性和抗虫性状。
(1)除草剂耐受性鉴定
草铵膦喷施时间为水稻4叶1心时，分别在喷后1周、2周和喷后4周调查各药害等级植株数(含无药害植株)和株高，结果如表6所示。日本晴在喷施草铵膦后1周时所有植株均出现4～5级药害，植株大部分死亡，成苗率0.00％，受害率达100.00％；CHOS07在不同剂量下皆能100.00％成苗，但有一定药害产生，药害率达2.3％～4.1％，2周后药害症状消失。进一步调查其农艺性状表现，不同剂量下转化体农艺性状没有显著性差异。
表6CHOS07对草铵膦除草剂耐受性
数值以3个生物学重复的平均值±标准差表示。0×、1×、2×、4×分别表示喷施草铵膦推荐剂量中量的倍数。同列数据差异显著性分析使用LSD分析比较(α＝0.05)。
(2)抗虫性鉴定
参照《农业农村部953号公告-8.1-2007转基因植物及其产品环境安全检测抗虫水稻第1部分：抗虫性》执行。草地贪夜蛾在水稻苗期、分蘖期进行生测，大螟和斜纹夜蛾在水稻分蘖期、孕穗期进行生测。接虫1周后调查试虫的存活和发育情况。
对斜纹夜蛾的抗性鉴定结果(表7和图3)：
分蘖期调查结果发现，日本晴的试虫死亡率为5.2％，存活试虫发育正常，抗性级别为感，说明该材料为感虫材料，本次生测的质量可以满足抗性鉴定要求；同时，CHOS07的试虫校正死亡率为98.0％，存活试虫几乎不发育，抗性级别为高抗。
孕穗期调查结果发现，日本晴的试虫死亡率为2.5％，存活试虫发育正常，抗性级别为感，说明该材料为感虫材料，本次生测的质量可以满足抗性鉴定要求；同时，CHOS07的试虫校正死亡率为97.5％，存活试虫几乎不发育，抗性级别为高抗。
表7CHOS07对斜纹夜蛾的抗性鉴定
数值以平均值表示，同列数据的差异显著性采用t-test方法分析(α＝0.05)。分蘖期转化体接虫30株，对照30株；孕穗期转化体接虫50株，对照32株。
对草地贪夜蛾的抗性鉴定结果(表8和图3)：
苗期调查结果发现，日本晴的试虫死亡率为0％，存活试虫发育正常，抗性级别为感，说明该材料为感虫材料，本次生测的质量可以满足抗性鉴定要求；同时，CHOS07的试虫校正死亡率为99.1％，存活试虫几乎不发育，抗性级别为高抗。
分蘖期调查结果发现，日本晴的试虫死亡率为0％，存活试虫发育正常，抗性级别为感，说明该材料为感虫材料，本次生测的质量可以满足抗性鉴定要求；同时，CHOS07的试虫校正死亡率为99.6％，存活试虫几乎不发育，抗性级别为高抗。
表8CHOS07对草地贪夜蛾的抗性鉴定
数值以平均值表示，同列数据的差异显著性采用t-test方法分析(α＝0.05)。苗期转化体接虫30株，对照30株；分蘖期转化体接虫40株，对照25株。
对大螟的抗性鉴定结果(表9和图3)：
分蘖期调查结果发现，日本晴的试虫死亡率为3.1％，存活试虫发育正常，抗性级别为感，说明该材料为感虫材料，本次生测的质量可以满足抗性鉴定要求；同时，CHOS07的试虫校正死亡率为96.5％，存活试虫几乎不发育，抗性级别为高抗。
孕穗期调查结果发现，日本晴的试虫死亡率为4.8％，存活试虫发育正常，抗性级别为感，说明该材料为感虫材料，本次生测的质量可以满足抗性鉴定要求；同时，CHOS07的试虫校正死亡率为95.1％，存活试虫几乎不发育，抗性级别为高抗。
表9CHOS07对大螟的抗性鉴定
数值以平均值表示，同列数据的差异显著性采用t-test方法分析(α＝0.05)。分蘖期转化体接虫30株，对照30株；孕穗期转化体接虫30株，对照30株。
鉴定结果表明，转化体CHOS07可以耐受4倍田间推荐剂量中剂量的草铵膦，对斜纹夜蛾、草地贪夜蛾和大螟均可以达到高抗级别，且株高等农艺性状与对照没有显著差异。因此，CHOS07这个转化体可以用来改良水稻的草铵膦除草剂耐受性和抗虫性状，从而培育抗虫耐除草剂的水稻新品种。
实施例3转化事件CHOS07分子特征鉴定
为了进一步明确转化事件CHOS07的身份特征，本发明对CHOS07外源序列在水稻基因组上插入位点的侧翼序列进行了分析。
取100mg植株叶片，液氮快速研磨后采用CTAB法提取总DNA。将基因组DNA进行浓度测定后，保证DNA总量>2μg。利用基因组重测序，每个Reads长度150bp，得到至少10Gb数据，并保证数据质量指标Q30≥80％(即：测序错误率大于0.1％的碱基所占的比例低于20％)。根据基因组重测序结果，利用BWA软件以转基因载体T-DNA序列作为模板，与测序得到的全部序列进行序列同源性比较筛选(BWA,http://bio-bwa.sourceforge.net/，默认设置)。将筛选得到的序列进一步拼装筛选，将序列全部为载体序列的Reads去掉，最终得到一类Reads序列，其特点是一半为基因组序列，另一半为载体序列。根据得到的基因组序列，在水稻基因组网站(https://www.OsGDB.org/)进行Blast序列比对，得到该基因组序列在基因组上的具体位置，即为可能的插入位点。
将测序结果分别与参考基因组和外源T-DNA序列进行比对，获得外源插入片段插入位置信息。随后，在插入位点左右边界处的基因组侧翼序列和外源插入序列上分别设计正向和反向引物，通过PCR扩增的方法对插入位点进行了验证，并对PCR产物进行了测序分析。
以转基因水稻株系基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应在20μL体系中进行。扩增循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸一定时间(按产物片段大小设置)，35个循环；72℃延伸5min。
根据侧翼序列和插入位置的结果利用基因组上游引物(SEQ ID NO:8)与载体左边界引物(SEQ ID NO:9)扩增以及载体右边界引物(SEQ ID NO:10)与基因组下游引物(SEQID NO:11)对CHOS07转化事件进行PCR扩增，以验证外源片段插入位置。结果见图4。结果证明CHOS07外源片段稳定插入到水稻基因组Chr08:18420671-18420683bp位置处。进一步通过重叠PCR扩增和测序分析，获得插入序列和上下游基因组侧翼序列片段，序列组装如图1所示。序列分析结果显示，插入序列大小为4885bp。
通过分析左右侧翼的边界序列可知，外源序列的插入造成了水稻基因组11bp的序列删除，同时载体的左边界序列缺失15bp，右边界序列缺失44bp。
实施例4利用转化事件CHOS07产生抗虫耐除草剂水稻植株的方法
通过前期试验发现CHOS07的抗性及其他农艺性状都很优良，故可用该事件快速转育改良生产上应用所属同一类群的骨干亲本，以提高这些骨干亲本的抗虫和除草剂耐受性。以空育131为实例进行快速改良的具体方法为：2020年开始做杂交获得F1，然后与空育131回交3代，再自交2代以上，每一代通过对靶标害虫抗性或草铵膦耐受性下进行选择，再结合其他农艺性状选择优良单株和穗行留种，直至获得性状稳定纯合的CHOS07-空育131。该转基因水稻保留了空育131原有优良性状的基础上增加了抗虫和耐草铵膦性状(表10)。
表10抗虫性和除草剂耐受性鉴定
数值以平均值表示，同列数据的差异显著性采用t-test方法分析(α＝0.05)。
利用本发明提供的方法还可以为品种的选育提供分子辅助手段，也可以用来鉴定水稻品种中是否含有CHOS07转化事件。以下方法为鉴定CHOS07的具体实例。
对含有CHOS07的自交系进行分子检测，以确认这些材料中包含转化事件CHOS07。根据基因序列设计PCR引物对，通过检测转化事件左右两个边界的存在以确定转化事件CHOS07的存在。
其中一个检测方法为：利用PCR方法对上述含有CHOS07的水稻样本的基因组DNA特异性边界序列进行检测，所用的PCR引物对分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11，PCR反应体系：
反应程序为：
94℃，5min；(94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，60sec)×35循环；72℃，5min；4℃，5min。
取PCR产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，结果见图4。含CHOS07转化事件的样本DNA可以扩增得到预期的目标条带(分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)。而且该PCR方法能够追踪转化事件的存在，从而应用于育种工作。
综上所述，本发明转基因水稻事件CHOS07可提高植物抗虫性并对草铵膦除草剂具有较高的耐受性，而且可将其用于改良其他水稻种质、创制新的水稻杂交组合。其检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因水稻事件CHOS07的DNA分子。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种核酸分子，其特征在于，包括如下任意一种：
i)包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列，或其反向互补序列；
ii)包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示序列，或其反向互补序列；
iii)包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示序列，或其反向互补序列；
iv)包含SEQ ID NO:5所示序列，或其反向互补序列。
2.用于检测水稻转化事件的探针，其特征在于，包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列或其片段或其变体或其反向互补序列。
3.用于检测水稻转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含权利要求2所述的序列；
任选地，所述引物对为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列；或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的序列。
4.用于检测水稻转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含权利要求2所述的探针和/或权利要求3所述的引物对。
5.检测水稻转化事件的方法，其特征在于，包括利用以下任一项来检测待测样品中是否存在所述转化事件：
i)权利要求2所述的探针；
ii)权利要求3所述的引物对；
iii)权利要求2所述的探针和权利要求3所述的引物对；
iv)权利要求4所述的试剂盒或微阵列。
6.对水稻进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获得包含权利要求1所述核酸分子的水稻；
2)将步骤1)所获得的水稻通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到水稻植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，
3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗虫性状的评估和/或除草剂的抗性鉴定，并利用权利要求5所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。
7.由权利要求6的方法获得的水稻植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。
8.一种保护水稻植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因水稻植物的大田中，所述转基因水稻植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第993-5877位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因水稻植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因水稻植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。
9.一种保护水稻植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因水稻植物细胞，所述转基因水稻植物细胞在其基因组中依次包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5第993-5877位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因水稻植物细胞的基因组中包含SEQ ID NO:5；摄食所述转基因水稻植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述水稻植物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311299596.5A CN117925877A (zh) | 2023-10-09 | 2023-10-09 | 抗虫耐除草剂水稻转化事件chos07的核酸分子、检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311299596.5A CN117925877A (zh) | 2023-10-09 | 2023-10-09 | 抗虫耐除草剂水稻转化事件chos07的核酸分子、检测方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925877A true CN117925877A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90767469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311299596.5A Pending CN117925877A (zh) | 2023-10-09 | 2023-10-09 | 抗虫耐除草剂水稻转化事件chos07的核酸分子、检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925877A (zh) |
-
2023
- 2023-10-09 CN CN202311299596.5A patent/CN117925877A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112852801B (zh) | 转基因玉米事件lp007-1及其检测方法 | |
| US11479790B2 (en) | Insect-resistant herbicide-tolerant corn transformation event | |
| WO2024060732A1 (zh) | 转基因玉米事件lp026-2及其检测方法 | |
| CN112831584B (zh) | 转基因玉米事件lp007-2及其检测方法 | |
| AU2014378946A1 (en) | Modified plants | |
| CN112831585B (zh) | 转基因玉米事件lp007-4及其检测方法 | |
| CN101027396A (zh) | Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定 | |
| CN113151533B (zh) | 转基因玉米事件lp007-6及其检测方法 | |
| CN104878091A (zh) | 用于检测玉米植物dbn9978的核酸序列及其检测方法 | |
| CN109971880B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法 | |
| CN112877454B (zh) | 转基因玉米事件lp007-3及其检测方法 | |
| CN116144817A (zh) | 转基因玉米事件lp026-4及其检测方法 | |
| CN116144671A (zh) | 转基因玉米事件lp026-3及其检测方法 | |
| CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
| CN116287384B (zh) | 抗虫耐除草剂玉米转化事件ld05的核酸分子、检测方法及其应用 | |
| CN114525277B (zh) | 一种用于检测棉花中17l397-1的核酸序列及其检测方法 | |
| CN116144672A (zh) | 转基因玉米事件lp026-1及其检测方法 | |
| CN117925877A (zh) | 抗虫耐除草剂水稻转化事件chos07的核酸分子、检测方法及其应用 | |
| CN117248067A (zh) | 玉米转化事件chmz12的核酸序列及其检测方法 | |
| CN116640761B (zh) | 转基因玉米事件lp018-1及其检测方法 | |
| CN116694626B (zh) | 转基因玉米事件lp035-2及其检测方法 | |
| CN116200529B (zh) | 玉米转化事件lg11的核酸序列及其检测方法 | |
| CN116694629B (zh) | 转基因玉米事件lp038-1及其检测方法 | |
| CN116694627B (zh) | 转基因玉米事件lp035-1及其检测方法 | |
| CN116694628B (zh) | 转基因玉米事件lp038-2及其检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |