CN117919413A - 一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用 - Google Patents
一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用，涉及纳米材料的制备和协同肿瘤治疗技术领域。制备方法包括如下步骤：S1、以硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠等为原料制备硫化铁纳米片，S2、将AIPH负载于硫化铁纳米片上制备纳米平台。本发明采用上述一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用，硫化铁纳米片具有良好的生物可降解性和优异的光热转化能力，其介导的光热治疗促进AIPH分解为烷基自由基，协同光热治疗促进缺氧肿瘤细胞的凋亡；纳米平台进入肿瘤细胞中分解产生Fe2+同肿瘤细胞中的H2O2发生芬顿反应，产生大量的羟基自由基，进一步促进肿瘤细胞的死亡。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料的制备和协同肿瘤治疗技术领域，尤其是涉及一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用。
背景技术
光热治疗（PTT）是一种将光能转化为热能，利用光热试剂在近红外（NIR）照射下在高温下消融肿瘤的治疗策略。PTT作为一种非侵入性的局部治疗，可以实现对肿瘤组织的可控照射。已经证明，与单独的PTT相比，光热治疗与其他治疗组合显示出增强的抗癌功效。
近年来，热力学疗法（TDT）作为一种新兴的动态疗法引起了相当大的关注。通常，偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐（AIPH）作为热不稳定的和水溶性的偶氮引发剂，在高温刺激下可迅速分解产生烷基自由基（·R）。由于高时空分辨率、低副作用和非侵入性的优点，光热疗法（PTT）已被认为是与TDT组合的理想方式。
化学动力学疗法（CDT）作为一种经典的基于活性氧（ROS）的抗癌方式，可以通过芬顿/类芬顿反应将内源性H2O2催化成高度细胞毒性的·OH，而不依赖于局部氧含量或外部能量。
PTT联合自由基介导的细胞凋亡是一种安全有效的肿瘤治疗方式，因此，开发具有协同治疗能力的纳米材料在肿瘤治疗方面有巨大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用，基于PTT联合自由基介导的细胞凋亡的肿瘤治疗方式，开发具有协同治疗能力的纳米材料。
为实现上述目的，本发明提供了一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用，包括如下步骤：
S1、以硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠等为原料制备硫化铁纳米片FeS；
S2、将AIPH负载于步骤S1制得的硫化铁纳米片FeS上制备纳米平台。
优选地，步骤S1中，制备硫化铁纳米片的具体步骤为：
S1-1、将硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠溶于乙二醇溶液中，得到溶液A；配置100 mg/mL聚乙烯亚胺的乙二醇溶液，将聚乙烯亚胺的乙二醇溶液加至溶液A中室温下搅拌反应120min，得到溶液B；
S1-2、配置0.05 M硫代乙酰胺的乙二醇溶液，将硫代乙酰胺的乙二醇溶液加至溶液B中室温下搅拌反应1~5 min，得到溶液C；
S1-3、向溶液C中加入三乙醇胺，室温下搅拌反应1~5 min，产物进行溶剂热反应24小时，经离心、无水乙醇洗涤后得到硫化铁纳米片FeS。
优选地，步骤S2中，将AIPH负载于步骤S1制得的硫化铁纳米片FeS上的具体步骤为：将mPEG-SH、FeS、AIPH依次加入无水乙醇中，冰浴搅拌反应5小时，经离心、无水乙醇洗涤后制得硫化铁负载AIPH的制剂FeS-PEG/AIPH。
优选地，步骤S1-1中，溶液A中，硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠、乙二醇的添加量之比为0.6 mmol∶0.2 mmol∶15 mL；溶液A与聚乙烯亚胺的乙二醇溶液的体积比为3∶1。
优选地，步骤S1-2中，硫代乙酰胺的乙二醇溶液与溶液B的体积比为3∶4。
优选地，步骤S1-3中，三乙醇胺与溶液C的体积比为1∶14。
优选地，步骤S1-3中，溶剂热反应在特氟龙内衬的高压反应釜中进行，温度为200℃。
优选地，步骤S2-1中，mPEG-SH、FeS、AIPH、无水乙醇的质量体积比为2 mg∶1 mg∶2mg∶2 mL。
因此，本发明采用上述一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用，具有如下技术效果：
（1）本发明提供的硫化铁纳米片负载AIPH纳米制剂，其中硫化铁纳米片具有良好的生物可降解性和优异的光热转换能力，一方面可以用于高效的肿瘤光热治疗，另一方面可以促进AIPH分解为非氧依赖性的细胞毒性自由基，进一步促进缺氧肿瘤细胞的凋亡；
（2）硫化铁纳米片在肿瘤微环境中分解产生Fe2+，同肿瘤细胞中的H2O2发生芬顿反应，产生大量的羟基自由基，进一步促进肿瘤细胞的死亡。
附图说明
图1为实施例一制得的硫化铁纳米片FeS的透射电镜图片；
图2为实施例一制得的FeS、FeS-PEG、FeS-PEG/AIPH的Zeta电位分析图；
图3为实施例一制得的不同浓度的FeS的光热升温曲线；
图4为实施例一制得的FeS在不同功率条件下的光热升温曲线；
图5为实施例一制得的FeS在1.5 W/cm2下的光热升温曲线及光热转换效率；
图6为TMB检测实施例一制得的不同浓度的FeS与H2O2共孵育后的·OH产生情况；
图7为TMB检测实施例一制得的FeS-PEG、FeS-PEG/AIPH光热激发烷基自由基产生情况；
图8为荧光倒置显微镜检测LLC细胞与不同浓度的FeS-PEG共孵育后的细胞摄取情况；
图9为通过MTT实验检测不同浓度的FP对LLC细胞的细胞毒性测定结果图；
图10为通过MTT实验检测不同浓度的FP对HUVEC细胞的生物相容性测定结果图；
图11为DCFH-DA荧光探针检测不同处理后产生·OH的荧光图像；
图12为Calcein AM/PI荧光探针检测不同处理后LLC细胞活/死细胞染色的荧光图像。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例一
一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，包括如下步骤：
S1、硫化铁纳米片的制备
将0.6 mmol的硫酸亚铁铵和0.2 mmol的柠檬酸三钠溶解于15 mL乙二醇中，得到溶液A；将500 mg的聚乙烯亚胺（PEI）溶于5 mL乙二醇溶液中，将PEI的乙二醇溶液加入到混合溶液中，在常温、800 rpm的磁力搅拌下反应120 min，得到溶液B；
将58.3475 mg的硫代乙酰胺溶于15 mL乙二醇溶液，然后加入到溶液B中，在常温、800 rpm的磁力搅拌下反应5 min，得到溶液C；
向溶液C中加入0.5 mL的三乙醇胺，在常温、800 rpm的磁力搅拌下反应5 min。
搅拌结束后，将产物转移到特氟龙内衬的高压釜中，在200 ℃下保持24 h。
最后，以 14000 rpm，10 min离心收集，用无水乙醇洗3遍，最终产物分散在无水乙醇中，即得硫化铁纳米片（FeS）。
S2、取1 mg硫化铁纳米片FeS与2 mg巯基-聚乙二醇-甲氧基（mPEG-SH）溶于2 mL无水乙醇中，在冰浴条件下搅拌6 h。搅拌结束后，以14000 rpm、10 min离心收集沉淀，将沉淀用无水乙醇洗2遍，最终产物分散在无水乙醇中，即得硫化铁纳米片制剂（FeS-PEG，简写为FP）。
S3、硫化铁负载AIPH制剂的制备
取mPEG-SH 2mg，FeS 1mg，AIPH 2 mg加入2 mL无水乙醇中，冰浴搅拌5 h，随后以14000 rpm，10 min离心收集，用无水乙醇洗2遍，最终产物分散在无水乙醇中，即得硫化铁负载AIPH的制剂（FeS-PEG/AIPH，简写为FPA）。
试验测试
（一）如图1所示，取适量硫化铁纳米片超声处理后滴加至铜网上，烘干制备成透射电镜样品，并用透射电子显微镜观察，所制备的硫化铁纳米材料为二维薄片状结构，粒径约为120 nm。
（二）如图2所示，对FeS、FP和FPA的Zeta电位进行检测，由于FeS含有大量胺基，显示出约+17.9 mV的正电荷，对其进行PEG修饰后，电位略有下降，为+16.5 mV，负载AIPH后电位升高至+20.9 mV，表明AIPH的成功负载。
（三）如图3所示，分别配置0，20，40，80，160 μg/mL的FeS溶液，使用808 nm激光对其照射5 min，用热电偶记录溶液每秒的温度变化，绘制温度变化曲线，结果表明随着FeS溶液浓度的增加，温度变化也会随之升高。
（四）如图4所示，配置三份160 μg/mL的FeS溶液，分别使用1.0，1.5，2.0 W/cm2的808 nm激光对其照射5 min，用热电偶记录溶液每秒的温度变化，绘制温度变化曲线，结果显示功率越高，温度上升越明显。表明FeS有良好的光热能力。
（五）如图5所示，配置160 μg/mL的FeS溶液，使用1.5 W/cm2的808 nm激光对其照射直至升至最高温度，关闭808 nm激光器，等待溶液降至室温，用热电偶记录溶液每30秒的温度变化，计算FeS的光热转换效率，结果显示FeS光热转换效率为37.42%，表明FeS具有良好的光热性能，是一种优良的光热转换剂。
（六）如图6所示，使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）检测FeS的过氧化物酶活性。将FeS、TMB、过氧化氢三者混合，分别配置FeS终浓度为0.25，0.5，1 μg/mL的溶液，TMB终浓度为1 mM，过氧化氢的终浓度为100 µM，0.5 h后，使用紫外分光光度计检测溶液在550-750nm之间的吸收光谱，并拍照记录溶液颜色变化。
结果显示，随着FeS浓度的升高，混合溶液的蓝色逐渐加深，550-750 nm之间的吸收峰逐渐增高，说明FeS能够将过氧化氢催化为·OH，具有随浓度增强的过氧化物酶活性。
（七）如图7所示，使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）检测FeS-PEG、FeS-PEG/AIPH光热激发烷基自由基产生的能力。
实验分组为FP、FPA、FP+NIR、FPA+NIR组。FP+NIR、FPA+NIR组使用1.5 W/cm2、808nm激光器照射5 min，将FP，FPA，FP+NIR，FPA+NIR分别与TMB、过氧化氢混合，使Fe离子的终浓度为5 μg/mL，TMB终浓度为1 mM，过氧化氢的终浓度为100 µM。10 min后，使用紫外分光光度计检测溶液在550-750 nm之间的吸收光谱。
结果显示，FP+NIR组的吸收峰高于FP组，表明光热增强了Fe离子的释放，FPA+NIR组吸收峰高于FP+NIR组，表明了光热激发了AIPH分解为烷基自由基。
（八）如图8所示，荧光倒置显微镜检测不同浓度的FP被肿瘤细胞摄取的能力。将FP-Cy5.5分别以5、10 µg/mL的浓度与LLC细胞共孵育，在孵育4 h后使用荧光倒置显微镜观察MnS@PDA的摄取情况。
结果显示，随着浓度的增加，红色荧光强度逐渐增强，说明LLC对FP的摄取呈浓度依赖性。
（九）如图9所示，通过MTT实验检测不同浓度的FP对肿瘤细胞的杀伤效果。
取对数生长期的LLC细胞消化，以1×104/孔接种于96孔板中，在含有5% CO2的37℃恒温培养箱中培养24 h。实验分组为Control组、NIR组、FP组、FP+NIR组、FPA+NIR组，NIR组在孵育6 h时进行808 nm激光照射。随后吸去培养液，每孔加入MTT培养基100 μL孵育3h，随后弃去培养基，每孔加入150 µL DMSO，振荡10 min使紫色结晶物全部溶解，利用酶标仪读取各个浓度在490 nm处的吸光值，由吸光值经计算细胞存活率与纳米材料和NIR的关系。
结果显示，LLC细胞的存活率在纳米材料浓度为40 μg/mL，FP+NIR组约为50%左右，负载有AIPH的FPA组细胞存活率更低，说明FPA对LLC细胞具有很好的细胞毒性，光热增强了对LLC细胞的杀伤效果。
（十）如图10所示，通过MTT实验检测不同浓度的FP对正常细胞的毒性作用。
取对数生长期的HUVEC细胞消化，以1×104/孔接种于96孔板中，在含有5% CO2的37℃恒温培养箱中培养24 h，将FP以最终浓度为0、12.5、25、50、100 μg/mL分别与HUVEC细胞共孵育24 h。此后，吸去培养液，每孔加入MTT培养基100 μL孵育3 h，随后弃去培养基，每孔加入150 µL DMSO，振荡10 min使紫色结晶物全部溶解，利用酶标仪读取各个浓度在490 nm处的吸光值，由吸光值计算细胞存活率与纳米材料浓度的关系。
结果显示，HUVEC细胞的存活率在纳米材料浓度低于100 μg/mL时均大于80%，说明FP对正常细胞具有良好的生物相容性。
（十一）如图11所示，使用DCFH-DA荧光探针检测不同处理诱导ROS生成的能力。
取对数生长期的LLC细胞消化，以30×104/孔将LLC细胞接种在6孔板中，在含有5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养24 h。随后将细胞分为Control组、NIR组、FP组、FP+NIR组和FPA+NIR组，含NIR的分组在孵育6 h后进行808 nm激光照射。4 h后弃去培养液，加入1 mL的DCFH-DA检测工作液，避光在37 ℃下孵育20 min。随后，在荧光显微镜下观察绿色荧光的分布情况。
结果显示，与Control组相比，FP+NIR组绿色荧光增强，表明了FP能够诱导产生ROS；相比于FP+NIR组，FPA+NIR组绿色荧光进一步增强，进一步说明光热增强了AIPH产生ROS的能力。
（十二）如图12所示，分别用钙黄绿素乙酰氧基甲酯Calcein-AM和碘化丙啶PI两种荧光染料标记活细胞和死亡细胞，取对数生长期的LLC细胞消化，以30×104/孔将LLC细胞接种在6孔板中，在含有5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养24 h。随后将细胞分为Control组、NIR组、FP组、FP+NIR组和FPA+NIR组，含NIR的分组在孵育6 h后进行808 nm激光照射。4h后弃去培养液，加入1 mL的Calcein AM/PI检测工作液，避光在37 ℃下孵育30分钟。随后，在荧光显微镜下观察红色荧光（PI:Ex/Em=535/617 nm）和绿色荧光（Calcein AM:Ex/Em=494/517 nm）的分布情况。
结果显示，与Control组相比，FP组红色荧光增加，绿色荧光减弱，表明了FP对LLC细胞的毒性作用，相比于FP组，FP+NIR组红色荧光增强，绿色荧光越来越弱，进一步说明光热增强了FP对LLC细胞的杀伤效果，FPA+NIR组红色荧光进一步增强，表明光热激活了AIPH产生了自由基，进一步促进了肿瘤细胞凋亡。
因此，本发明采用上述一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法与应用，硫化铁纳米片具有良好的生物可降解性和优异的光热转化能力，其介导的光热治疗促进AIPH分解为非氧依赖性细胞毒自由基（烷基自由基），协同光热治疗促进缺氧肿瘤细胞的凋亡；另外，当该纳米平台进入肿瘤细胞中时，分解产生Fe2+，同肿瘤细胞中的H2O2发生芬顿反应，产生大量的羟基自由基，进一步促进肿瘤细胞的死亡；该纳米平台具有多功能协同抗肿瘤的能力，具有优异的肿瘤治疗作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠等为原料制备硫化铁纳米片FeS；
S2、将AIPH负载于步骤S1制得的硫化铁纳米片FeS上制备纳米平台。
2.根据权利要求1所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于，步骤S1中，制备硫化铁纳米片的具体步骤为：
S1-1、将硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠溶于乙二醇溶液中，得到溶液A；配置100 mg/mL聚乙烯亚胺的乙二醇溶液，将聚乙烯亚胺的乙二醇溶液加至溶液A中室温下搅拌反应120 min，得到溶液B；
S1-2、配置0.05 M硫代乙酰胺的乙二醇溶液，将硫代乙酰胺的乙二醇溶液加至溶液B中室温下搅拌反应1~5 min，得到溶液C；
S1-3、向溶液C中加入三乙醇胺，室温下搅拌反应1~5 min，产物进行溶剂热反应24小时，经离心、无水乙醇洗涤后得到硫化铁纳米片FeS。
3.根据权利要求1所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于，步骤S2中，将AIPH负载于步骤S1制得的硫化铁纳米片FeS上的具体步骤为：将mPEG-SH、FeS、AIPH依次加入无水乙醇中，冰浴搅拌反应5小时，经离心、无水乙醇洗涤后制得硫化铁负载AIPH的制剂FeS-PEG/AIPH。
4.根据权利要求2所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于：步骤S1-1中，溶液A中，硫酸亚铁铵、柠檬酸三钠、乙二醇的添加量之比为0.6 mmol∶0.2 mmol∶15 mL；溶液A与聚乙烯亚胺的乙二醇溶液的体积比为3∶1。
5.根据权利要求2所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于：步骤S1-2中，硫代乙酰胺的乙二醇溶液与溶液B的体积比为3∶4。
6.根据权利要求2所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于：步骤S1-3中，三乙醇胺与溶液C的体积比为1∶14。
7.根据权利要求2所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于：步骤S1-3中，溶剂热反应在特氟龙内衬的高压反应釜中进行，温度为200 ℃。
8.根据权利要求1所述的一种可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法，其特征在于：步骤S2-1中，mPEG-SH、FeS、AIPH、无水乙醇的质量体积比为2 mg∶1 mg∶2 mg∶2 mL。
9.一种如权利要求1~8任一项所述的可同时触发羟基自由基和烷基自由基产生的纳米平台制备方法所制备的纳米平台FeS-PEG/AIPH，其特征在于：FeS-PEG/AIPH在促进肿瘤细胞凋亡中的应用。
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