CN117916382A - 眼底黄色斑点症(abca4)的基因疗法 - Google Patents

Abstract

本公开的方面涉及可用于向受试者递送小基因的组合物和方法。因此，本公开部分地基于分离的核酸和基因治疗载体，如病毒(例如，rAAV)载体，其包含编码治疗性基因产物(如蛋白或肽)的一个或多个基因片段(例如，小基因)。在一些实施方案中，本公开涉及编码ABCA4蛋白(例如，ABCA4基因的基因产物)或其部分的基因治疗载体。在一些实施方案中，本公开描述的组合物可用于治疗与ABCA4基因突变相关的疾病，例如眼底黄色斑点症。

Description

眼底黄色斑点症(ABCA4)的基因疗法

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年4月26日提交的美国临时申请号63/179,663以及2021年5月10日提交的美国临时申请号63/186,753的申请日的权益，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

眼底黄色斑点症(Stargardt disease)是最常见的常染色体隐性黄斑变性病症类型。这种疾病是由ABCA4基因突变引起的。人ABCA4基因的长度为～7kb，超过了包装到常规腺相关病毒(AAV)载体中进行基因递送的限值。

发明概述

本公开的方面涉及用于向受试者递送小基因(minigene)的组合物和方法。因此，本公开部分地基于分离的核酸和基因治疗载体，如病毒(例如，rAAV)载体，其包含编码治疗性基因产物(例如蛋白或肽)的一个或多个基因片段(例如，小基因)。在一些实施方案中，本公开涉及编码ABCA4蛋白(例如，ABCA4的基因产物)或其部分的基因治疗载体。在一些实施方案中，本公开描述的组合物用于治疗与ABCA4基因突变相关的疾病，例如眼底黄色斑点症。

因此，在一些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因具有SEQ ID NO：3-8和15-19任一个所示的序列。

在一些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其包含具有编码ABCA4蛋白的核酸序列的转基因，其中所述ABCA4蛋白包含SEQ ID NO：9-14和20-24任一个所示的氨基酸序列。

在一些方面，本公开提供了一种增加受试者视网膜的外核层(outer nuclearlayer，ONL)的厚度的方法。在一些方面，本公开提供了一种维持(或保持)受试者视网膜的外核层(ONL)的厚度的方法。在一些实施方案中，增加或维持受试者视网膜的外核层(ONL)的厚度的方法包括向受试者视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含含有编码ABCA4小基因的核酸序列的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24任一个所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，ONL的厚度增加3-5μm、4-6μm、5-7μm、6-8μm、7-10μm、9-12μm、11-15μm或更多(例如，相对于施用前ONL的厚度)。在一些实施方案中，ONL的厚度得到保持，使得ONL的厚度减少小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％(例如，相对于施用前ONL的厚度)。在一些实施方案中，ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9、12和13任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，ABCA4小基因编码SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV载体通过视网膜下注射施用。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有眼底黄色斑点症。

本公开的一些方面提供了一种降低受试者视网膜(例如，眼睛的腹侧中央(ventral central)、腹侧周边(ventral peripheral)、背侧中央(dorsal central)和背侧周边(dorsal peripheral))中的脂褐素(lipofuscin)浓度的方法。在一些实施方案中，降低受试者视网膜中的脂褐素浓度的方法包括向受试者视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含含有编码ABCA4小基因的核酸序列的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQID NO：9-14和20-24任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，脂褐素浓度相对于施用前受试者视网膜的脂褐素浓度是降低的。

本公开的一些方面提供了一种降低受试者视网膜中双类视黄醇(bis-retinoid)N-视黄基-N-亚视黄基乙醇胺(N-retinyl-N-retinylidene ethanolamine)(A2E)浓度的方法。在一些实施方案中，降低受试者视网膜中A2E浓度的方法包括向受试者的视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24任一个所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，转基因进一步包含与编码ABCA4小基因的核酸序列有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，任选地其中组织特异性启动子是光感受器特异性启动子。在一些实施方案中，转基因侧翼为腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，任选地其中至少一个ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，在施用AAV载体后的一段时间后，脂褐素和/或A2E的浓度降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，AAV载体通过视网膜下注射施用。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有眼底黄色斑点症。

在一些实施方案中，转基因进一步包含与编码ABCA4小基因的核酸序列有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，任选地其中组织特异性启动子是光感受器特异性启动子。在一些实施方案中，转基因侧翼为腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)，任选地其中至少一个ITR是AAV2 ITR。

附图简要说明

图1是MiniABCA4构建体的几个实施方案的示意图。显示了具有对应于SEQ ID NO：9-14的氨基酸序列的MG-1、MG-2、MG-3、MG-4、MG-5和MG-6。

图2是显示通过荧光显微镜术进行的野生型ABCA4敲除小鼠(ABCA4KO)和用miniABCA4-1注射的ABCA4敲除小鼠(其对应于图1描述的MG-4构建体)的RPE自身荧光分析。ZO-1用作细胞标志物。

图3是显示对不同年龄的未注射和注射的ABCA4敲除小鼠的RPE自身荧光分析进行定量的图。箭头指向显著改善自身荧光的ABCA4小基因版本。在P10天或P30天进行注射。分析是在对每个小基因指示的年龄进行的。与P10注射相比，P30注射显示出高度显著的改善。在该图中，AB-1对应于MG-1，AB-2对应于MG-2，AB-5对应于MG-5。

图4是MiniABCA4构建体的几个实施方案的示意图。显示了具有对应于SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列的MG-7、MG-8、MG-9、MG-10和MG-11。

图5是显示图4所示MiniABCA4在HEK细胞中的表达的免疫印迹。箭头表示预期的条带。Lipo显示仅用媒介物转染的细胞。

图6是显示视网膜下注射MG-1、MG-4或MG-5后ABCA4-KO小鼠(Abca4^-/-小鼠)的视网膜中MG-1(对应于SEQ ID NO：3)、MG-4(对应于SEQ ID NO：6)或MG-5(对应于SEQ ID NO：7)的表达的RNA电泳凝胶图像。

图7提供了视网膜下注射MG-1、MG-4、MG-5或对照(例如平衡盐溶液(BSS))后ABCA4-KO小鼠的视网膜冷冻切片的图像。还使用未注射的野生型小鼠(192sv-WT)的视网膜作为对照。视网膜用抗MYC抗体(左小图)和抗ABCA4抗体(中小图)染色。箭头表示抗体特异性信号，表明ABCA4蛋白(即MG-1、MG-4或MG-5蛋白)的存在。

图8A-8B显示了相对于未治疗的小鼠和/或用对照(BSS)治疗的小鼠，在ABCA4-KO小鼠的视网膜中视网膜下注射MG-5导致维持视网膜外核层(ONL)的厚度。图8A提供了来自野生型小鼠(129-sv-WT 14个月)、未治疗的ABCA4-KO小鼠(ABCA4 ko 13个月)、用对照治疗的ABCA4-KO小鼠(BSS 14个月)和用MG-1、MG-4或MG-5治疗的ABCA4-KO小鼠的示例小鼠视网膜的图像。图8B提供了显示来自每个测试组的小鼠的ONL厚度的定量的图。

图9A显示了野生型小鼠、未治疗的ABCA4-KO小鼠、用BSS对照治疗的ABCA4-KO小鼠和用MG-1、MG-4或MG-5治疗的ABCA4-KO小鼠的视网膜的视网膜电图(ERG)迹线。指出了暗视a波和暗视b波的位置。图9B显示了暗视a波和暗视b波的幅度的定量。****：p<0.0001；***：p<0.001。N提供了检查的视网膜数量。

图10显示了lipofectamine转染后hTERT-RPE细胞中MG-1、MG-2、MG-4和MG-5的表达。将没有转染的载体的细胞用作阴性对照。将表达MYC的空载体(pCDNA.1CMV Myc)转染至细胞中作为阳性对照。使用抗MYC抗体对细胞进行染色，并使用DAPI对细胞核进行染色。箭头标识转染的细胞。

图11A-11B显示了在指示时间点测量的RPE铺片(flat mount)中的129sv-WT和Abca4-/-小鼠的自身荧光。RPE铺片用ZO-1染色并在488nm通道下成像。这些数据证明了，相对于野生型小鼠，在生长4个月和5个月时，ABCA4^-/-中的自身荧光增加。

图12的图显示了定量在注射后的不同时间段评估的用MG-1、MG-4或MG-5注射的ABCA4敲除小鼠的RPE自身荧光。未注射的ABCA4敲除小鼠用作对照。

图13A-13D的图显示了在用MG-1、MG-4或MG-5注射的ABCA4敲除小鼠的视网膜腹侧中央、腹侧周边、背侧中央和背侧周边中的脂褐素浓度。

发明详述

在一些方面，本公开涉及可用于治疗某些遗传疾病例如眼底黄色斑点症的组合物和方法。本公开部分地基于分离的核酸和基因治疗载体，如病毒(例如，rAAV)载体，其包含编码治疗性基因产物(如MiniABCA4蛋白(例如，ABCA4小基因的基因产物))的一个或多个基因片段。

“核酸”序列是指DNA或RNA序列。在一些实施方案中，本公开的蛋白和核酸是分离的。如本文所用，术语“分离的”是指人工生产的。如本文关于核酸所用的，术语“分离的”是指：(i)通过例如聚合酶链反应(PCR)体外扩增的；(ii)通过克隆重组生产的；(iii)如通过裂解和凝胶分离纯化的；或(iv)通过例如化学合成来合成的。分离的核酸是一种易于通过本领域众所周知的重组DNA技术操作的核酸。因此，包含在载体中的核苷酸序列，其中5'和3'限制性位点是已知的，或者其聚合酶链反应(PCR)引物序列已被公开，则被认为是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列则不是。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必须的。例如，在克隆或表达载体内分离的核酸是不纯的，因为它可能仅占其所在细胞中物质的很小百分比。然而，这样的核酸是分离的，正如该术语在本文中所用的那样，因为它易于通过本领域普通技术人员已知的标准技术进行操作。如本文关于蛋白或肽所用，术语“分离的”是指已从其天然环境中分离或人工生产(例如，通过化学合成、通过重组DNA技术等)的蛋白或肽。在一些实施方案中，分离的核酸编码ABCA4蛋白，例如MiniABCA4蛋白(例如，从ABCA4基因或其部分如ABCA4小基因表达的基因产物)。

在人类中，ABCA4基因(也称为STGD)编码ATP结合盒亚家族A(ABC1)成员4蛋白，其定位于视杆和视锥的外节盘边缘(outer segment disk edge)并且可以作为向内定向(inward-directed)的翻转酶起作用。已经观察到ABCA4基因的突变会导致眼底黄色斑点症，其是一种黄斑变性形式。在一些实施方案中，ABCA4基因包含在NCBI参考序列登录号NM_000350.3中所示的核酸序列(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，ABCA4基因编码具有在NCBI参考序列登录号NP_000341.2中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白。

如本文所用，“小基因(minigene)”是指编码重组肽或蛋白的分离的核酸序列，其中编码天然存在的肽或蛋白的相应基因的一个或多个非必需元件已被去除并且其中由小基因编码的肽或蛋白保留相应的天然存在的肽或蛋白的功能。“治疗性小基因”是指编码可用于治疗遗传疾病的肽或蛋白例如抗肌萎缩蛋白(dystrophin)、dysferlin、因子VIII、淀粉样前体蛋白(APP)、酪氨酸酶(Tyr)等的小基因。小基因是本领域已知的并且例如由以下文献描述：Karpati和Acsadi(1994)Clin Invest Med 17(5):499-509；Plantier et al.(2001)Thromb Haemost.86(2):596-603；和Xiao et al.(2007)WorldJ.Gastroenterol.13(2):244-9。在一些实施方案中，小基因不包含相应的天然存在的肽或蛋白的序列。

在一些方面，本公开涉及编码ABCA4小基因的分离的核酸。通常，编码小基因(例如，治疗性小基因，如ABCA4小基因)的分离的核酸相对于编码相应的天然存在的野生型蛋白的核酸序列(例如，SEQ ID NO：1)截短约10％至约99％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约90％、约99％等)。截短可以是连续的(例如，氨基酸残基的单个、连续的截短)或不连续的(例如，氨基酸的两个或更多个截短，例如被一个或多个肽分隔的两个或更多个结构域的截短)。例如，在一些实施方案中，与野生型ABCA4基因(例如，SEQ ID NO：1)相比，编码Mini ABCA4蛋白的小基因被截短了约61％至(例如，包含约50％的所述核酸序列)。在一些实施方案中，ABCA4小基因包含SEQID NO：3-8和15-19任一个所示的核酸序列(或由其组成)。在一些实施方案中，ABCA4小基因编码包含SEQ ID NO：9-14和20-24任一个所示的氨基酸序列(或由其组成)的蛋白(称为MiniABCA4蛋白)。在一些实施方案中，编码ABCA4蛋白(例如，MiniABCA4蛋白)的核酸在编码MiniABCA4蛋白的核酸序列之前包含起始密码子(例如，核酸序列ATG)。在一些实施方案中，编码MiniABCA4蛋白的核酸序列是密码子优化的。

编码ABCA4蛋白的分离的核酸序列可以与启动子有效连接。“启动子”是指被细胞的合成机制(synthetic machinery)或引入的合成机制所识别的、启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“有效定位”、“控制之下”或“转录控制之下”是指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)[参见例如Boshart etal.,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是U6启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。

诱导型启动子允许调控基因表达并且可以通过外源提供的化合物、环境因素例如温度或存在特定生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中来调控。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的启动子调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(metallothionine，MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮素昆虫启动子(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制型系统(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)，还参见Harvey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导型系统(Wang etal.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中调控的启动子。

在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域众所周知的。在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子(例如光感受器特异性启动子)。眼特异性启动子的实例包括但不限于视网膜劈裂蛋白(retinoschisin)启动子、K12启动子、视紫红质启动子、视杆细胞特异性启动子、视锥细胞特异性启动子、视紫红质激酶启动子、GRK1启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白近端(IRBP)启动子和视蛋白(opsin)启动子(例如，红色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子等)。

在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶III(pol III)启动子。pol III启动子的非限制性实例包括U6和H1启动子序列。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶II(pol II)启动子。pol II启动子的非限制性实例包括T7、T3、SP6、RSV和巨细胞病毒启动子序列。

本公开的多个方面涉及包含如本文所述的分离的核酸的基因治疗载体。基因治疗载体可以是病毒载体(例如，慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒(Ad)载体等)、质粒、封闭端DNA(例如，ceDNA)、脂质/DNA纳米颗粒等。在一些实施方案中，基因治疗载体是病毒载体。在一些实施方案中，编码小基因的表达盒的侧翼是一个或多个病毒复制序列，例如慢病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，病毒载体是杆状病毒载体。

本文所述的分离的核酸还可以包含期望位于启动子/增强子序列和转基因之间的内含子。在一些实施方案中，内含子是合成的或人工的(例如异源的)内含子。合成的内含子的实例包括源自SV-40的内含子序列(称为SV-40T内含子序列)和源自鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列。在一些实施方案中，本公开描述的转基因包含一个或多个(1、2、3、4、5个或更多个)人工内含子。在一些实施方案中，一个或多个人工内含子位于启动子和编码转基因的核酸序列之间。

在一些实施方案中，rAAV包含转录后反应元件。如本文所用，术语“转录后反应元件(posttranscriptional response element)”是指在转录时采用增强基因表达的三级结构的核酸序列。转录后调控元件的实例包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、小鼠RNA转运元件(RTE)、猴1型逆转录病毒(SRV-1)的组成型转运元件(CTE)、来自摩-傅猴病毒(Mason-Pfizer monkey virus，MPMV)的CTE，以及人类热休克蛋白70的5'非翻译区(Hsp70 5′UTR)。在一些实施方案中，rAAV载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

在一些实施方案中，载体还包含常规控制元件，其以允许转基因元件在被载体转染或被通过本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因元件有效连接。如本文所用，“有效连接的”序列包括与目标基因相邻的表达控制序列和以反式或相距一定距离的方式作用以控制目标基因的表达控制序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以利用。

聚腺苷酸化序列通常插入在转基因序列之后以及任选地在3'AAV ITR序列之前。可用于本公开的rAAV构建体还可以含有期望位于启动子/增强子序列和转基因之间的内含子。一种可能的内含子序列源自SV-40，称为SV-40T内含子序列。另一种可以使用的载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单个基因转录物产生多于一种的多肽。IRES序列将用于产生含有多于一条多肽链的蛋白。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的[参见，例如，Sambrook et al.，以及其中在例如第3.183.26和16.17 16.27页中引用的参考文献，和Ausubel etal.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989]。

本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)或其变体的区域(例如，第一区域)。分离的核酸(例如，重组AAV载体)可以包装到衣壳蛋白内并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因及其调控序列以及5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)组成。如本文中别处所述，转基因可以包含编码一种或多种蛋白(例如人ABCA4或其片段)的一个或多个区域。转基因还可以包含编码例如miRNA结合位点和/或表达控制序列(例如poly-A尾)的区域。

通常，ITR序列的长度为约145bp。优选地，在分子中使用编码ITR的基本上完整的序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些ITR序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如，诸如Sambrook et al.,"Molecular Cloning.A LaboratoryManual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher etal.,J Virol.,70:520 532(1996)等文章)。本发明中使用的这种分子的一个实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中选定的转基因序列和相关调控元件的侧翼是5'和3'AAV ITR序列。AAV ITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，rAAV载体)包含至少一种具有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体的血清型的ITR。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码AAV2 ITR的区域(例如，第一区域)。

在一些实施方案中，分离的核酸还包含含有第二AAV ITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，第二AAV ITR具有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体的血清型。在一些实施方案中，第二AAVITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，第二ITR是缺乏功能性末端解离位点(TRS)的突变ITR。术语“缺乏末端解离位点”可以指包含废除ITR的末端解离位点(TRS)的功能的突变(例如，有义突变，如非同义突变或错义突变)的AAV ITR，或缺乏编码功能性TRS的核酸序列的截短的AAV ITR(例如ΔTRS ITR或ΔITR)。不希望受任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性TRS的ITR的rAAV载体产生自我互补的rAAV载体，例如如McCarthy(2008)Molecular Therapy16(10):1648-1656所述。

重组腺相关病毒(rAAV)

在一些方面，本公开提供分离的腺相关病毒(AAV)。如本文关于AAV所用，术语“分离的”是指人工生产或获得的AAV。可以使用重组方法生产分离的AAV。这样的AAV在本文中被称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，使得rAAV的核酸酶和/或转基因将被特异性地递送至一个或多个预定组织。AAV衣壳是决定这些组织特异性靶向能力的重要因素。因此，可选择具有适合被靶向的组织的衣壳的rAAV。

获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域公知的。(参见，例如，US2003/0138772，其内容通过引用以其整体并入本文)。通常，这些方法包括培养含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因的重组AAV载体；和足以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的辅助功能的宿主细胞。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白：病毒粒子蛋白1至3(命名为VP1、VP2和VP3)，所有这些蛋白都是经由选择性剪接从单个cap基因转录而来的。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译时，衣壳蛋白围绕病毒基因组形成球形的60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。

在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有选自由AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9和AAV10组成的组的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有源自非人灵长类动物的血清型，例如AAVrh8血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有对受试者眼睛具有向性(tropism)的血清型，例如比其他AAV衣壳蛋白更有效地转导受试者的眼细胞的AAV(例如，AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43)。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有AAV8血清型。

在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可以由稳定的宿主细胞提供，使用本领域技术人员已知的方法已将该宿主细胞工程化为含有一种或多种所需组分。最合适地，这样的稳定的宿主细胞将含有处于诱导型启动子控制之下的所需组分。然而，所需组分可以处于组成型启动子控制之下。在讨论适合与转基因一起使用的调控元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选定的稳定的宿主细胞可以含有处于组成型启动子控制之下的选定组分和处于一个或多个诱导型启动子控制之下的其他选定组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其源自293细胞(其含有处于组成型启动子控制之下的E1辅助功能)但含有处于诱导型启动子控制之下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员可以产生其他稳定的宿主细胞。

在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码蛋白(例如，MiniABCA4蛋白)的编码序列。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞)或昆虫细胞(例如，SF9细胞)。在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物还包含冷冻保存剂。

可以使用任何合适的遗传元件(载体)将生产本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。选定的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher et al.,J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745。

在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)生产重组AAV。通常，通过用待包装到AAV颗粒中的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞来生产重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即，rep和cap)，其以反式起作用，用于生产性AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产而不产生任何可检测的野生型AAV病毒粒子(即，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。适合与本公开一起使用的载体的非限制性实例包括美国专利号6,001,650中描述的pHLP19和美国专利号6,156,303中描述的pRep6cap6载体，这两个专利的全部内容通过引用整体并入本文。附属功能载体编码具有非AAV衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于这些功能进行复制(即“附属功能”)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与激活AAV基因转录、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒1型除外)和牛痘病毒。

在一些方面，本公开提供转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA，当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如，Graham et al.(1973)Virology,52:456，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York，Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier，和Chu et al.(1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子引入合适的宿主细胞中。

“宿主细胞”是指包含或能够包含目标物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作AAV辅助构建体、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV生产相关的其他转移DNA的受体。该术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然、偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学或基因组或总DNA补体方面可能不一定与原始亲本完全相同。

如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域还已知，在此类克隆群体的储存或转移期间，核型可发生自发或诱导的变化。因此，源自所提及细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，所提及细胞系包括此类变体。

如本文所用，术语“重组细胞”是指其中已引入了外源DNA片段(例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸(例如RNA)生产的DNA片段)的细胞。

如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且其可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。

方法

本文提供了将转基因递送至受试者的眼(例如，光感受器，例如视杆细胞或视锥细胞、视网膜细胞等)组织或耳朵的方法。该方法通常包括向受试者施用有效量的包含用于在受试者中表达转基因(例如，MiniABCA4蛋白)的核酸的rAAV。rAAV的“有效量”是足以感染受试者靶组织的足够数量细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼(例如，光感受器、视网膜等)组织。在一些实施方案中，将转基因递送至光感受器细胞(photoreceptor cell)或视网膜色素上皮(RPE)。

在一些实施方案中，本公开涉及向受试者施用有效量的rAAV的方法，所述rAAV包含编码MiniABCA4蛋白(例如，MG-1、MG-4或MG-5；具有SEQ ID NO：9、12和13任一个所示的氨基酸的MiniABCA4蛋白)的核酸。在一些实施方案中，施用有效量的包含编码MiniABCA4蛋白(例如，MG-1、MG-4或MG-5)的核酸的rAAV向受试者提供治疗益处。

在一些实施方案中，治疗益处是相对于对照(例如，未治疗的受试者或施用前的受试者)，视网膜的外核层(ONL)的厚度增加。在一些实施方案中，ONL增加至野生型水平(例如，正常健康个体的ONL的厚度)。在一些实施方案中，ONL增加至少25％、40％、50％、60％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，疾病受试者的ONL增加，使得rAAV的施用提供在表型上与野生型视网膜无法区分的视网膜。在一些实施方案中，相对于对照受试者(例如，未治疗的受试者)，ONL增加3-5μm、4-6μm、5-7μm、6-8μm、7-10μm、9-12μm、11-15μm或更多。

在一些实施方案中，治疗益处是保持或维持视网膜外核层(ONL)的厚度。在一些实施方案中，ONL被保持或维持在野生型水平(例如，正常健康个体的ONL的厚度)。在一些实施方案中，保持或维持ONL的厚度使得ONL的厚度减少小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％、或小于1％(例如，相对于施用前ONL的厚度)。在一些实施方案中，保持或维持疾病受试者的ONL，使得rAAV的施用提供在表型上与野生型视网膜无法区分的视网膜。

在一些实施方案中，在(i)施用本文所述的rAAV之前和(ii)施用rAAV后约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月，或约24个月，测量视网膜ONL的厚度。

在一些实施方案中，施用本文所述的rAAV后的视网膜ONL的厚度为约55-70μm、约55-65μm、约60-70μm或约60-65μm。在一些实施方案中，施用本文所述的rAAV后约6个月、约12个月、约18个月或约24个月的视网膜ONL的厚度为约55-70μm、约55-65μm、约60-70μm或约60-65μm。在一些实施方案中，施用本文所述的rAAV后视网膜ONL的厚度为至少55μm或至少60μm。在一些实施方案中，施用本文所述的rAAV后视网膜ONL的厚度为约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70μm。在一些实施方案中，施用本文所述的rAAV后视网膜ONL的厚度与健康和/或野生型视网膜的厚度大致相同。

在一些实施方案中，施用有效量的如本文所述的包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV导致受试者视网膜中的脂褐素相对于对照(例如，未治疗的受试者或施用前的受试者)减少。在一些实施方案中，施用有效量的包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV使受试者视网膜中的脂褐素积累逆转，所述脂褐素积累是由与失调或突变的ABCA4相关的视网膜疾病(例如，眼底黄色斑点症)引起的。在一些实施方案中，本文公开的ABCA4小基因、载体(例如，重组AAV载体)、病毒和组合物还可用于治疗特征在于脂褐素积累的非眼部疾病、病况或病症(例如，眼睛外部的疾病、病况或病症)。因此，在一些实施方案中，施用有效量的包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV使受试者的由非眼部疾病、病况或病症引起的脂褐素积累逆转。在一些实施方案中，可以使用本文公开的ABCA4小基因、载体(例如，重组AAV载体)、病毒和组合物治疗的非眼部疾病包括神经元蜡样质脂褐质沉积症(neuronal ceroidlipofuscinoses)(例如，巴滕病(Batten disease))、阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease)、帕金森病(Parkinson's disease)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)、某些溶酶体疾病、肢端肥大症(acromegaly)、去神经性萎缩(denervationatrophy)、脂质肌病(lipid myopathy)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease)、中心核肌病(centronuclear myopathy)和结肠黑变病(melanosiscoli)(例如，由结肠中脂褐素积累引起)。此外，在一些实施方案中，本文公开的ABCA4小基因、载体(例如，重组AAV载体)、病毒和组合物可用于减少与年龄相关的脂褐素积累。技术人员可以适当修改本文提供的公开内容以用于以适合于疾病或病况的递送模式治疗非眼部病况，例如上面列出的那些。

在一些实施方案中，在施用包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV后，脂褐素减少至少25％、40％、50％、60％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，施用有效量的包含MiniABCA4蛋白的rAAV导致脂褐素水平降低，类似于“Radu,R.A.,et.al.,Proc Natl AcadSci U S A.2003Apr 15；100(8):4742–4747”中描述的那些。

在一些实施方案中，在(i)施用本文所述的rAAV之前和(ii)施用rAAV后约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月或约24个月，测量脂褐素水平。

在一些实施方案中，施用有效量的如本文所述的包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV导致受试者视网膜中的双类视黄醇N-视黄基-N-亚视黄基乙醇胺(A2E)相对于对照(例如，未治疗的受试者)减少。在一些实施方案中，施用有效量的包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV导致受试者视网膜中的A2E积累逆转，所述A2E积累是由与失调或突变的ABCA4相关的视网膜疾病(例如，眼底黄色斑点症)引起的。在一些实施方案中，A2E在施用包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的rAAV后减少至少25％、40％、50％、60％、75％、100％或更多。

在一些实施方案中，在(i)施用本文所述的rAAV之前和(ii)施用rAAV后约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月或约24个月，测量A2E水平。

在一些实施方案中，施用有效量的如本文所述的包含编码MiniABCA4基因的核酸的rAAV与治疗益处之间存在一段时间。在一些实施方案中，在施用步骤和视网膜外核层(ONL)的增加、脂褐素浓度的降低和/或双类视黄醇N-视黄基-N-亚视黄基乙醇胺(A2E)的减少之间存在一段时间。在一些实施方案中，一段时间是1-12小时、6-24小时、24-48小时、36-72小时、1-2天、2-5天、2-10天、1-2周、1-5周、2-4周、6-12周或更长。

可以使用视网膜电图(ERG)来确定视网膜细胞对光刺激的电反应，以测量受试者的视网膜和视网膜组织的功能。ERG可用于确定包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的AAV的施用是否为视网膜提供了治疗益处。例如，ERG可用于测量视网膜反应的差异，并评估眼睛疾病(例如眼底黄色斑点症)和视网膜变性的潜在治疗。在一些实施方案中，可以在向视网膜施用包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的AAV之前和/或之后对受试者的视网膜进行ERG。在一些实施方案中，可以在向视网膜施用包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的AAV之前和之后约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月或约24个月对受试者的视网膜进行ERG。在一些实施方案中，ERG可用于确定本文所述的ABCA4小基因的功效。

在一些实施方案中，在向视网膜施用包含编码MiniABCA4蛋白的核酸的AAV之后，使用ERG评估的暗视a波和/或暗视b波的振幅增加(例如，相对于未治疗的视网膜或用对照(例如BSS)治疗的视网膜)。在一些实施方案中，使用ERG评估的暗视a波和/或暗视b波的振幅增加至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、100％或更多。在一些实施方案中，暗视a波和/或暗视b波的增加指示ABCA4小基因的功效。

rAAV的有效量可以是足以在受试者中具有治疗益处的量，例如改善受试者的疾病的一种或多种症状，例如眼底黄色斑点症(例如，与ABCA4基因的缺失或突变相关的疾病)的症状。ABCA4基因中的突变的实例包括导致ABCA4蛋白中的氨基酸取代G1961E和D2177N的突变。有效量将取决于多种因素，例如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和要靶向的眼组织，并因此可能因受试者和组织而异。有效量还可以取决于所使用的rAAV。

在某些实施方案中，rAAV的有效量为10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个基因组拷贝/kg。在某些实施方案中，rAAV的有效量为每个受试者10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵个基因组拷贝。

本公开的多个方面涉及治疗有需要的受试者的眼底黄色斑点症的方法。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、狗、猫、非人灵长类动物等。在一些实施方案中，受试者是人。

如本文所用，术语“治疗”是指向表现出眼底黄色斑点症的一种或多种体征或症状(例如，视力模糊或斜视、低光下不能视物、色觉丧失、ABCA4基因中的一个或多个突变等)的受试者应用或施用组合物(例如，如本文所述的分离的核酸或rAAV)，目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、拯救、改善、好转或影响病症、疾病的症状或对眼底黄色斑点症的预先倾向性(predisposition)。

减轻眼底黄色斑点症包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。减轻疾病并不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延迟”眼底黄色斑点症的发展是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，取决于疾病史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或延迟疾病的发作的方法是与不使用该方法相比时，在给定的时间范围内降低出现疾病的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内降低症状的程度的方法。此类比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以得出具有统计学意义的结果。

疾病的“发展”或“进展”是指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域众所周知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。

有效量还可以取决于施用方式。例如，在某些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织可能需要与通过另一种方法(例如，全身施用、局部施用)靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织不同(例如，更高或更低)的剂量。在一些实施方案中，基质内注射(IS)具有某些血清型(例如，AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39和AAVrh.43)的rAAV介导眼(例如，角膜、光感受器、视网膜等)细胞的有效转导。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(IS)。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选地视网膜下注射或玻璃体内注射或脉络膜上注射。在一些实施方案中，注射是局部施用(例如，局部施用于眼睛)。在一些情况下，施用多个剂量的rAAV。

可以根据本领域已知的任何适当的方法将rAAV以组合物形式递送给受试者。rAAV，优选悬浮在生理学上相容的运载体中(即，在组合物中)，可以施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(例如猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。

将rAAV递送至哺乳动物受试者可以通过例如眼内注射或局部施用(例如滴眼液)。在一些实施方案中，眼内注射包括基质内注射、结膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射不是局部施用。也可使用施用方法的组合(例如，局部施用和基质内注射)。

本公开的组合物可以包含单独的rAAV，或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因例如编码不同的MiniABCA4蛋白的转基因的第二rAAV)组合的rAAV。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的rAAV，每一种均具有一个或多个不同的转基因。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的运载体。考虑到rAAV针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的运载体。例如，一种合适的运载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)一起配制。

其他示例性运载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载体的选择不构成对本发明的限制。

任选地，除了rAAV和(一种或多种)运载体之外，本公开的组合物还可以含有其他药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

rAAV以足够的量施用以转染目标组织(例如眼组织，例如光感受器、视网膜等组织)的细胞并提供足够的基因转移和表达水平，而不会产生过度的副作用。药学上可接受的施用途径的实例包括但不限于直接递送至所选器官(例如视网膜下递送至眼睛)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、瘤内和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以将施用途径组合起来。

实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒粒子的剂量，例如以基因组拷贝/千克体重(GC/kg)为剂量单位，将根据多种因素而变化，包括但不限于：rAAV病毒粒子的施用途径、达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症，以及基因或RNA产物的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒粒子的剂量范围。

rAAV的有效量是足以靶向感染动物、靶向目标组织的量。有效量将主要取决于诸如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织等因素，并因此可以因动物和组织而异。例如，rAAV的有效量通常在约1ml至约100ml含有约10⁹至10¹⁶个基因组拷贝的溶液的范围内。在一些情况下，约10¹¹至10¹³个rAAV基因组拷贝之间的剂量是适当的。在某些实施方案中，10⁹个rAAV基因组拷贝有效靶向眼组织(例如，角膜组织)。

在一些实施方案中，当施用于受试者的眼睛时，比10⁹rAAV基因组拷贝更浓的剂量是有毒的。在一些实施方案中，有效量由多个剂量的rAAV产生。在一些实施方案中，在施用rAAV之前向受试者施用一种或多种免疫抑制剂(例如，皮质类固醇类、氨甲蝶呤(methotrexate)、环孢素A(cyclosporine A)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、他克莫司(tacrolimus)、利妥昔单抗(Rituximab)、西罗莫司(sirolimus)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、CTLA4Ig、非消耗性CD4 Ab和T细胞消耗性抗胸腺细胞γ-球蛋白(ATG)等)。

在一些实施方案中，以每个日历日(例如，24小时周期)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。在一些实施方案中，以每2、3、4、5、6或7个日历日不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。在一些实施方案中，以每个日历周(例如，7个日历日)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。在一些实施方案中，以不超过每两周一次(例如，在两个日历周期中一次)的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。在一些实施方案中，以每个日历月不超过一次(例如，在30个日历日中一次)的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。在一些实施方案中，以每六个日历月不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。在一些实施方案中，以每个日历年(例如，365天或闰年时366天)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的rAAV。

在一些实施方案中，rAAV组合物被配制成减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高rAAV浓度(例如，～10¹³GC/ml或更高)的情况下。可以使用用于减少聚集的合适方法，包括例如添加表面活性剂、pH调节、盐浓度调节等(参见，例如，Wright FR,et al.,Molecular Therapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。)。

药学上可接受的赋形剂和运载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的，并且开发用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适给药和治疗方案也是本领域技术人员熟知的。通常，这些制剂可以含有至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管(一种或多种)活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地在总制剂重量或体积的约1或2％至约70％或80％之间或更多之间。自然地，每个治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以这样的方式制备，即在化合物的任何给定单位剂量中将获得合适的剂量。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑等因素，并且因此，各种剂量和治疗方案可能是期望的。

在一些实施方案中，将rAAV以本文公开的适当配制的药物组合物的形式直接递送至靶组织，例如直接递送至眼组织(例如，光感受器、视网膜等组织)。然而，在某些情况下，可能需要单独地或另外地经由另一途径，例如皮下、胰内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌肉内、鞘内或经口、腹膜内或通过吸入递送基于rAAV的治疗构建体。在一些实施方案中，可以使用如美国专利号5,543,158、5,641,515和5,399,363(各自通过引用的方式明确并入本文)中所述的施用方式来递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过玻璃体内注射或视网膜下注射。

适合注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，该形式是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。运载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣剂例如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持所需的粒径、以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

例如，对于可注射水性溶液的施用，如果需要，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适合用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用合适的无菌水性介质。例如，一个剂量可以溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并添加到1000ml皮下灌注液(hypodermoclysis fluid)中或在建议的输注部位注射，(参见例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的情况，剂量必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将决定个体宿主的适当剂量。

通过将所需量的活性rAAV与本文列举的各种其他成分(需要时)一起掺入合适的溶剂中随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种经过灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和来自上面列举的那些中的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。

本文公开的rAAV组合物也可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)以及与无机酸例如盐酸或磷酸或者有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用。该制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。

如本文所用，“运载体(carrier)”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物(vehicle)、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。对药物活性物质使用此类介质和药剂是本领域公知的。补充活性成分也可以掺入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。

可以使用诸如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等的递送媒介物将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，rAAV载体递送的转基因可以被配制成封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中进行递送。

此类制剂可以优选用于引入本文公开的核酸或rAAV构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了作为潜在药物运载体的脂质体和脂质体样制剂的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。

脂质体已成功用于许多通常对其他程序的转染具有抗性的细胞类型。此外，脂质体没有基于病毒的传递系统典型存在的DNA长度限制。脂质体已被有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了几项考查脂质体介导的药物递送的有效性的成功临床试验。

脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致形成直径在200至范围内的小单层囊泡(SUV)，其在核心中含有水性溶液。

或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定和可重复的方式捕获物质。为避免细胞内聚合物过载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。

实施例

实施例1：miniABCA4基因构建体MG-1至MG-6

本实施例描述了具有ABCA4的一个或多个结构域(例如，ABCA4小基因及其基因产物，“MiniABCA4”)的AAV载体(和rAAV)的鉴定和生产，所述结构域保留光感受器中的功能(例如，部分ABCA4功能)。通过在培养的HEK293细胞中将miniABCA4蛋白表达为MYC标记的蛋白版本来测试miniABCA4蛋白的表达和稳定性。将表现出最佳表达和稳定性的版本体内注射到Abca4^-/-小鼠。病毒颗粒是假型化的(例如，AAV2/8)，并且表达由主要靶向光感受器的启动子驱动。使用视网膜下注射施用MiniABCA4构建体。图1和SEQ ID NO：3-8显示了MiniABCA4构建体MG-1至MG-6的实施方案。SEQ ID NO：9-14显示了MG-1至MG-6的MiniABCA4蛋白的实施方案。

视网膜色素上皮(RPE)背景自身荧光的减少被用作替代测定以测试miniABCA4候选物的功效。将Abca4^-/-小鼠在出生后30天注射Abca4-1(MG-1)构建体，并通过荧光显微镜术测量RPE自身荧光。RPE细胞用标志物ZO-1染色。代表性数据显示在图2中。与野生型对照相比，Abca4^-/-小鼠在4个月大时在488nM波长处显示出更高的RPE自身荧光。注射miniABCA4-1导致488nM波长处的自身荧光显著下降，表明miniABCA4-1具有拯救作用。

使用RPE自身荧光测定测试其他ABCA4小基因构建体，结果在图3中定量。对Abca4^-/-小鼠注射miniABCA4-1(MG-1)、miniABCA4-2(MG-2)、miniABCA4-4(MG-4)或miniABCA4-5(MG-5)。注射是在出生后10天或30天(P10或P30)进行的，并在图上指定的年龄时间测量RPE自身荧光。数据表明，与未接受注射的Abca4^-/-小鼠相比，几种miniABCA4构建体显著降低了RPE自身荧光，并且与P10时的注射相比，P30时的注射更好地改善了RPE自身荧光。

实施例2：miniABCA4基因构建体MG-7至MG-11

本实施例描述了其他的ABCA4小基因设计，称为MG-7至MG-11，以及表达这些ABCA4小基因的AAV载体(和rAAV)的生产。通过在培养的HEK293细胞中将miniABCA4蛋白表达为该蛋白的MYC标记版本来测试miniABCA4蛋白的表达和稳定性(图5)。使用微管蛋白作为加载对照。图4和SEQ ID NO：15-19显示了MiniABCA4构建体MG-7至MG-11的实施方案。SEQ IDNO：20-24显示了MG-7至MG-11的MiniABCA4蛋白的实施方案。

实施例3.

视网膜下注射后，选择的ABCA4小基因(MG-1、MG-4和MG-5，其分别对应于SEQ IDNO：3、6和7)在ABCA4-KO小鼠(Abca4^-/-小鼠)的视网膜中表达。对四至六周龄的ABCA4-KO小鼠视网膜下注射对照(BSS)、包含MG-1的rAAV、包含MG-4的rAAV或包含MG-5的rAAV。包含ABCA4小基因的rAAV利用(i)具有内部核糖体进入位点(IRES)上游的CMV/鸡β-肌动蛋白启动子、ABCA4小基因和β-球蛋白内含子的AAV2载体骨架，其中ABCA4小基因的侧翼是AAV2ITR；和(ii)AAV8衣壳蛋白。其他对照包括未治疗的ABCA4-KO小鼠和未治疗的野生型小鼠(192sv-WT)。将小鼠在13-14个月大(即视网膜下注射后12-13个月)时处死。从经注射小鼠的视网膜中提取RNA和蛋白。

使用对MYC标签表位和ABCA4小基因特异的引物，在RT酶存在(+)或不存在(-)的情况下，对提取的RNA进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。如在从注射小基因的小鼠中提取并使用RT酶扩增的RNA样品中ABCA4小基因引物(229个碱基对)的扩增所示，在经注射小鼠的视网膜中可以检测到所有小基因(MG-1、MG-4、MG-5)的基因表达(图6)。作为RT-PCR步骤内的对照，观察到从注射了小基因的小鼠中提取的RNA样品中的小鼠GAPDH引物(209个碱基对)的扩增。RT-PCR反应也在不存在DNA的情况下(即无DNA对照)进行。这些数据证明了，MG-1、MG-4和MG-5小基因全都可以视网膜下注射到视网膜中，并且这些视网膜随后可以表达MG-1、MG-4和MG-5小基因。

观察视网膜中ABCA4小基因蛋白的表达(图7)。在注射了小基因的视网膜中的光感受器的外段区域中检测到小基因表达。使用针对MYC表位的抗体以及抗ABCA4抗体进行检测。检测到MG-1、MG-4和MG-5蛋白，表明这些小基因蛋白在视网膜下注射其相应的核酸序列后表达。值得注意的是，在仅注射对照(BSS)的视网膜中没有检测到表达。将注射了BSS或所示小基因的小鼠的视网膜冷冻切片用抗MYC和抗ABCA4抗体染色。箭头表示每个实验的抗体特异性信号。这些数据表明，在视网膜下注射相应的核酸到视网膜中后，MG-1、MG-4和MG-5小基因蛋白(分别对应于SEQ ID NO：9、12和13)全都可以在细胞中表达。

对注射了MG-1、MG-4、MG-5或BSS的小鼠使用眼底镜检查/光学相干断层扫描(OCT)，来观察mini-ABCA4小基因的治疗潜力。如图8A-8B所示，使用ImageJ测量所有注射了小基因的小鼠的外核层(ONL)的厚度，并与注射了BSS的小鼠(对照)进行比较。图8A的眼底图像中的水平线对应于OCT图像中使用的区域。箭头表示该实验中使用ImageJ测量的外核层(ONL)区域。对每个视网膜的ONL厚度进行定量(图8B)。进行单向ANOVA多重比较和Dunnett多重比较检验以确定统计学显著性。****：p<0.0001。未治疗的野生型小鼠(4只小鼠)的平均ONL厚度为约62μm。与此同时，未治疗的ABCA4-KO小鼠(4只小鼠)的ONL厚度要小得多，为约53μm。然而，用MG-5(5只小鼠)小基因治疗的ABCA4-KO小鼠的ONL厚度保持在与野生型小鼠相同的水平，为约63μm。这些数据证明，MG-5提供了显著的治疗益处，并挽救了未治疗的ABCA4-KO小鼠的表型(例如ONL厚度减少)。

通过观察视网膜下注射包含MG-1、MG-4或MG-5的rAAV的ABCA4-KO小鼠(14个月)的ERG的改善来进一步评估治疗潜力(图9A-9B)。注射了包含MG-1的rAAV的小鼠的视网膜的暗视a波和暗视b波振幅表现出～55mV的暗视a波和～200mV的暗视b波，这与BSS对照治疗相比可以是显著的增加。

实施例4.

由于视网膜色素上皮自身荧光(RPE)的增加与ABCA4介导的病理相关，因此检查了MG小基因对RPE自身荧光的影响。使用lipofectamine将包含(i)MG-1、MG-2、MG-4或MG-5和(ii)MYC标签的构建体转染到hTERT-RPE细胞中。将没有转染载体的细胞用作阴性对照。将表达MYC的空载体(pCDNA.1CMV Myc)转染到细胞中作为阳性对照。转染后，使用抗MYC抗体(以鉴定包含构建体的细胞)和DAPI(以对细胞核进行染色)对细胞进行染色。如图10所示，细胞成功转染了每种测试的小基因构建体，这通过对于每种小基因在多个细胞中检测到MYC标签来证明。没有转染载体的细胞不显示任何MYC标签。

实施例5.

向Abca4^-/-小鼠注射包含MG-1、MG-4或MG-5的构建体。未注射的ABCA4敲除小鼠用作对照。在注射后的不同时间段后，通过荧光显微镜术测量RPE自身荧光(在488nM波长处)(图12)。未注射的ABCA4^-/-小鼠在生命的所有阶段都显示出更高的488nM波长处RPE自身荧光。注射任何一种测试的小基因都会导致不同时间段中每一时间段的自身荧光的统计学显著下降。注射后3个月和10个月，相对于未注射的小鼠，注射MG-1导致RPE自身荧光减少。注射后5个月和7个月，相对于未注射的小鼠，注射MG-4导致RPE自身荧光减少。注射后3个月和10个月，相对于未注射的小鼠，注射MG-5导致RPE自身荧光减少。这些数据证明了小基因在挽救细胞中RPE自身荧光效应方面的效用。

实施例6.

将包含MG-1、MG-4或MG-5的构建体注射到Abca4^-/-小鼠的腹侧中央视网膜区域(N分别＝4、3和3)。未注射的ABCA4^-/-小鼠、未注射的野生型小鼠和注射了平衡盐溶液(BSS)的ABCA4^-/-小鼠用作对照(每个对照组N＝3)。ABCA4^-/-小鼠的年龄为12-15个月，而野生型小鼠的年龄为15个月。

注射后，通过电子显微镜术测量腹侧中央视网膜区域(图13A)、腹侧周边区域(图13B)、背侧中央区域(图13C)和背侧周边区域(图13D)中的脂褐素颗粒的量。相对于野生型小鼠，未注射的ABCA4^-/-小鼠显示出更高的脂褐素浓度。相对于用BSS治疗的Abca4^-/-小鼠，向Abca4^-/-小鼠注射每种测试的小基因导致腹侧中央脂褐素浓度的统计学显著下降。这些数据证明了小基因在体内降低(例如视网膜中)脂褐素浓度方面的效用。

序列

在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含SEQID NO：3-8和15-19任一个所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含与SEQ ID NO：3-8和15-19任一个所示的序列互补(例如，是其补体)的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含为SEQ ID NO：3-8和15-19任一个所示序列的反向补体的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开描述的分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含SEQ ID NO：3-8和15-19任一个所示的序列的部分或由其组成。部分可以包含SEQ ID NO：3-8和15-19任一个所示序列的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本公开描述的核酸序列是核酸有义链(例如，5'至3'链)，或在病毒序列的情况下是正(+)链。在一些实施方案中，本公开描述的核酸序列是核酸反义链(例如，3'至5'链)，或在病毒序列的情况下是负(-)链。

另外的实施方案

以下编号的段落涵盖了本公开的另外的实施方案。

1.一种分离的核酸，其包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因具有SEQID NO：3-8和15-19任一个所示的序列。

2.段落1所述的分离的核酸，其中转基因还包含有效连接至ABCA4小基因序列的启动子。

3.段落2所述的分离的核酸，其中启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，任选地其中组织特异性启动子是光感受器特异性启动子。

4.段落1至3中任一项所述的分离的核酸，其中转基因的侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

5.段落4所述的分离的核酸，其中至少一个ITR是AAV2 ITR。

6.段落4或5所述的分离的核酸，其中至少一个ITR缺乏末端解离位点，任选地其中ITR是ΔITR。

7.一种分离的核酸，其包含具有编码ABCA4蛋白的核酸序列的转基因，其中所述ABCA4蛋白包含SEQ ID NO：9-14和20-24任一个所示的氨基酸序列。

8.段落7所述的分离的核酸，其中转基因还包含有效连接至编码ABCA4蛋白的核酸序列的启动子。

9.段落8所述的分离的核酸，其中启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子，任选地其中组织特异性启动子是光感受器特异性启动子。

10.段落7至9中任一项所述的分离的核酸，其中转基因的侧翼是腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

11.段落10所述的分离的核酸，其中至少一个ITR是AAV2 ITR。

12.段落10或11所述的分离的核酸，其中至少一个ITR缺乏末端解离位点，任选地其中ITR是ΔITR。

13.一种载体，其包含段落1至12中任一项所述的分离的核酸。

14.段落13所述的载体，其中所述载体是质粒DNA、或封闭端DNA、或脂质/DNA纳米颗粒、或病毒载体。

15.段落14所述的载体，其中病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒(Ad)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或杆状病毒载体。

16.一种宿主细胞，其包含段落1至12中任一项所述的分离的核酸，或段落13至15中任一项所述的载体。

17.段落16所述的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物(人)细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

18.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：

(i)段落1至12中任一项所述的分离的核酸；和

(ii)AAV衣壳蛋白。

19.段落18所述的rAAV，其中衣壳蛋白具有对眼细胞的向性。

20.段落18或19所述的rAAV，其中衣壳蛋白是AAV8衣壳蛋白。

21.段落18至20中任一项所述的rAAV，其中rAAV被配制用于递送至眼睛，任选地其中rAAV被配制用于递送至光感受器细胞或视网膜色素上皮(RPE)。

22.一种组合物，其包含段落1至12中任一项所述的分离的核酸或段落18至21中任一项所述的rAAV，以及药学上可接受的赋形剂。

23.一种用于将转基因递送至细胞的方法，所述方法包括向细胞施用段落1至12中任一项所述的分离的核酸或段落18至21中任一项所述的rAAV。

24.段落23所述的方法，其中所述细胞位于受试者中，任选地位于哺乳动物(人)受试者中。

25.段落23或24所述的方法，其中所述细胞是眼细胞。

26.段落25所述的方法，其中所述眼细胞是光感受器细胞或视网膜色素上皮(RPE)。

27.一种用于治疗有需要的受试者的眼底黄色斑点症的方法，所述方法包括向受试者施用段落1至12中任一项所述的分离的核酸或段落18至21中任一项所述的rAAV。

28.段落27所述的方法，其中受试者是哺乳动物，任选地其中受试者是人。

29.段落27或28所述的方法，其中受试者的特征在于在ABCA4基因中具有一个或多个突变。

30.段落27至29中任一项所述的方法，其中施用是经由注射，任选地经由视网膜下注射或玻璃体内注射或脉络膜上注射。

31.段落27至29中任一项所述的方法，其中施用是局部施用至受试者的眼睛。

等同方案

虽然本文已经描述和说明了本发明的若干实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或本文描述的一个或多个优点的各种其他装置和/或结构，并且，这些变化和/或修改中的每一个均被认为是在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导使用的一个或多个特定应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。因此，应该理解，前述实施方案仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。

除非明确相反指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个(种)”应理解为表示“至少一个(种)”。

如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的要素中的“一个或两个”，即在一些情况下要素共同存在，以及在其他情况下分开存在。除了“和/或”从句所具体标识的要素之外，可以任选存在其他要素，而不论与具体标识的那些要素相关还是不相关，除非明确相反指出。因此，作为一个非限制性实例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以是指A且无B(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指B且无A(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指A和B两个(任选地包括其他要素)；等等。

如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选的其他未列出的项目。只有明确相反地指出的术语，例如“仅一个”或“唯一一个”，或“由...组成”当用于权利要求中时，将指的是包含许多要素或要素列表中的唯一一个要素。一般而言，在排他性术语之前，如“任一”、“之一”、“仅一个”或“唯一一个”，本文所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而不是两个”)。“基本上由......组成”在用于权利要求时，应具有其在专利法领域中使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个要素的列表，短语“至少一个”应理解为表示从要素列表中任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许任选地存在短语“至少一个”所指要素列表内所具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地“A或B中的至少一个”；或等同地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个，任选地包括多于一个A但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个B但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个A，以及至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。

在权利要求书中以及在上述说明书中，所有过渡短语，如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等应理解为开放式的，即表示包括但不限于。只有过渡短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述。

在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一权利要求要素的任何优先权、优先级或顺序或方法的动作执行的时间顺序，而是仅用作标签以将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但用于顺序术语)的另一个要素区分开来以区分权利要求要素。

数值前面的术语“约”和“基本上”代表所述数值的±10％。

序列表

<110> 马萨诸塞大学（University of Massachusetts）

<120> 眼底黄色斑点症(ABCA4)的基因疗法

<130> U0120.70165WO00

<140> 尚未指定

<141> 同上

<150> US 63/179,663

<151> 2021-04-26

<150> US 63/186,753

<151> 2021-05-10

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7328

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

ggacacagcg tccggagcca gaggcgctct taacggcgtt tatgtccttt gctgtctgag 60

gggcctcagc tctgaccaat ctggtcttcg tgtggtcatt agcatgggct tcgtgagaca 120

gatacagctt ttgctctgga agaactggac cctgcggaaa aggcaaaaga ttcgctttgt 180

ggtggaactc gtgtggcctt tatctttatt tctggtcttg atctggttaa ggaatgccaa 240

cccactctac agccatcatg aatgccattt ccccaacaag gcgatgccct cagcaggaat 300

gctgccgtgg ctccagggga tcttctgcaa tgtgaacaat ccctgttttc aaagccccac 360

cccaggagaa tctcctggaa ttgtgtcaaa ctataacaac tccatcttgg caagggtata 420

tcgagatttt caagaactcc tcatgaatgc accagagagc cagcaccttg gccgtatttg 480

gacagagcta cacatcttgt cccaattcat ggacaccctc cggactcacc cggagagaat 540

tgcaggaaga ggaatacgaa taagggatat cttgaaagat gaagaaacac tgacactatt 600

tctcattaaa aacatcggcc tgtctgactc agtggtctac cttctgatca actctcaagt 660

ccgtccagag cagttcgctc atggagtccc ggacctggcg ctgaaggaca tcgcctgcag 720

cgaggccctc ctggagcgct tcatcatctt cagccagaga cgcggggcaa agacggtgcg 780

ctatgccctg tgctccctct cccagggcac cctacagtgg atagaagaca ctctgtatgc 840

caacgtggac ttcttcaagc tcttccgtgt gcttcccaca ctcctagaca gccgttctca 900

aggtatcaat ctgagatctt ggggaggaat attatctgat atgtcaccaa gaattcaaga 960

gtttatccat cggccgagta tgcaggactt gctgtgggtg accaggcccc tcatgcagaa 1020

tggtggtcca gagaccttta caaagctgat gggcatcctg tctgacctcc tgtgtggcta 1080

ccccgaggga ggtggctctc gggtgctctc cttcaactgg tatgaagaca ataactataa 1140

ggcctttctg gggattgact ccacaaggaa ggatcctatc tattcttatg acagaagaac 1200

aacatccttt tgtaatgcat tgatccagag cctggagtca aatcctttaa ccaaaatcgc 1260

ttggagggcg gcaaagcctt tgctgatggg aaaaatcctg tacactcctg attcacctgc 1320

agcacgaagg atactgaaga atgccaactc aacttttgaa gaactggaac acgttaggaa 1380

gttggtcaaa gcctgggaag aagtagggcc ccagatctgg tacttctttg acaacagcac 1440

acagatgaac atgatcagag ataccctggg gaacccaaca gtaaaagact ttttgaatag 1500

gcagcttggt gaagaaggta ttactgctga agccatccta aacttcctct acaagggccc 1560

tcgggaaagc caggctgacg acatggccaa cttcgactgg agggacatat ttaacatcac 1620

tgatcgcacc ctccgcctgg tcaatcaata cctggagtgc ttggtcctgg ataagtttga 1680

aagctacaat gatgaaactc agctcaccca acgtgccctc tctctactgg aggaaaacat 1740

gttctgggcc ggagtggtat tccctgacat gtatccctgg accagctctc taccacccca 1800

cgtgaagtat aagatccgaa tggacataga cgtggtggag aaaaccaata agattaaaga 1860

caggtattgg gattctggtc ccagagctga tcccgtggaa gatttccggt acatctgggg 1920

cgggtttgcc tatctgcagg acatggttga acaggggatc acaaggagcc aggtgcaggc 1980

ggaggctcca gttggaatct acctccagca gatgccctac ccctgcttcg tggacgattc 2040

tttcatgatc atcctgaacc gctgtttccc tatcttcatg gtgctggcat ggatctactc 2100

tgtctccatg actgtgaaga gcatcgtctt ggagaaggag ttgcgactga aggagacctt 2160

gaaaaatcag ggtgtctcca atgcagtgat ttggtgtacc tggttcctgg acagcttctc 2220

catcatgtcg atgagcatct tcctcctgac gatattcatc atgcatggaa gaatcctaca 2280

ttacagcgac ccattcatcc tcttcctgtt cttgttggct ttctccactg ccaccatcat 2340

gctgtgcttt ctgctcagca ccttcttctc caaggccagt ctggcagcag cctgtagtgg 2400

tgtcatctat ttcaccctct acctgccaca catcctgtgc ttcgcctggc aggaccgcat 2460

gaccgctgag ctgaagaagg ctgtgagctt actgtctccg gtggcatttg gatttggcac 2520

tgagtacctg gttcgctttg aagagcaagg cctggggctg cagtggagca acatcgggaa 2580

cagtcccacg gaaggggacg aattcagctt cctgctgtcc atgcagatga tgctccttga 2640

tgctgctgtc tatggcttac tcgcttggta ccttgatcag gtgtttccag gagactatgg 2700

aaccccactt ccttggtact ttcttctaca agagtcgtat tggcttggcg gtgaagggtg 2760

ttcaaccaga gaagaaagag ccctggaaaa gaccgagccc ctaacagagg aaacggagga 2820

tccagagcac ccagaaggaa tacacgactc cttctttgaa cgtgagcatc cagggtgggt 2880

tcctggggta tgcgtgaaga atctggtaaa gatttttgag ccctgtggcc ggccagctgt 2940

ggaccgtctg aacatcacct tctacgagaa ccagatcacc gcattcctgg gccacaatgg 3000

agctgggaaa accaccacct tgtccatcct gacgggtctg ttgccaccaa cctctgggac 3060

tgtgctcgtt gggggaaggg acattgaaac cagcctggat gcagtccggc agagccttgg 3120

catgtgtcca cagcacaaca tcctgttcca ccacctcacg gtggctgagc acatgctgtt 3180

ctatgcccag ctgaaaggaa agtcccagga ggaggcccag ctggagatgg aagccatgtt 3240

ggaggacaca ggcctccacc acaagcggaa tgaagaggct caggacctat caggtggcat 3300

gcagagaaag ctgtcggttg ccattgcctt tgtgggagat gccaaggtgg tgattctgga 3360

cgaacccacc tctggggtgg acccttactc gagacgctca atctgggatc tgctcctgaa 3420

gtatcgctca ggcagaacca tcatcatgtc cactcaccac atggacgagg ccgacctcct 3480

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ccagagccaa aggaaaggca gtgaggggac ctgcagctgc tcgtctaagg gtttctccac 3660

cacgtgtcca gcccacgtcg atgacctaac tccagaacaa gtcctggatg gggatgtaaa 3720

tgagctgatg gatgtagttc tccaccatgt tccagaggca aagctggtgg agtgcattgg 3780

tcaagaactt atcttccttc ttccaaataa gaacttcaag cacagagcat atgccagcct 3840

tttcagagag ctggaggaga cgctggctga ccttggtctc agcagttttg gaatttctga 3900

cactcccctg gaagagattt ttctgaaggt cacggaggat tctgattcag gacctctgtt 3960

tgcgggtggc gctcagcaga aaagagaaaa cgtcaacccc cgacacccct gcttgggtcc 4020

cagagagaag gctggacaga caccccagga ctccaatgtc tgctccccag gggcgccggc 4080

tgctcaccca gagggccagc ctcccccaga gccagagtgc ccaggcccgc agctcaacac 4140

ggggacacag ctggtcctcc agcatgtgca ggcgctgctg gtcaagagat tccaacacac 4200

catccgcagc cacaaggact tcctggcgca gatcgtgctc ccggctacct ttgtgttttt 4260

ggctctgatg ctttctattg ttatccctcc ttttggcgaa taccccgctt tgacccttca 4320

cccctggata tatgggcagc agtacacctt cttcagcatg gatgaaccag gcagtgagca 4380

gttcacggta cttgcagacg tcctcctgaa taagccaggc tttggcaacc gctgcctgaa 4440

ggaagggtgg cttccggagt acccctgtgg caactcaaca ccctggaaga ctccttctgt 4500

gtccccaaac atcacccagc tgttccagaa gcagaaatgg acacaggtca acccttcacc 4560

atcctgcagg tgcagcacca gggagaagct caccatgctg ccagagtgcc ccgagggtgc 4620

cgggggcctc ccgccccccc agagaacaca gcgcagcacg gaaattctac aagacctgac 4680

ggacaggaac atctccgact tcttggtaaa aacgtatcct gctcttataa gaagcagctt 4740

aaagagcaaa ttctgggtca atgaacagag gtatggagga atttccattg gaggaaagct 4800

cccagtcgtc cccatcacgg gggaagcact tgttgggttt ttaagcgacc ttggccggat 4860

catgaatgtg agcgggggcc ctatcactag agaggcctct aaagaaatac ctgatttcct 4920

taaacatcta gaaactgaag acaacattaa ggtgtggttt aataacaaag gctggcatgc 4980

cctggtcagc tttctcaatg tggcccacaa cgccatctta cgggccagcc tgcctaagga 5040

caggagcccc gaggagtatg gaatcaccgt cattagccaa cccctgaacc tgaccaagga 5100

gcagctctca gagattacag tgctgaccac ttcagtggat gctgtggttg ccatctgcgt 5160

gattttctcc atgtccttcg tcccagccag ctttgtcctt tatttgatcc aggagcgggt 5220

gaacaaatcc aagcacctcc agtttatcag tggagtgagc cccaccacct actgggtgac 5280

caacttcctc tgggacatca tgaattattc cgtgagtgct gggctggtgg tgggcatctt 5340

catcgggttt cagaagaaag cctacacttc tccagaaaac cttcctgccc ttgtggcact 5400

gctcctgctg tatggatggg cggtcattcc catgatgtac ccagcatcct tcctgtttga 5460

tgtccccagc acagcctatg tggctttatc ttgtgctaat ctgttcatcg gcatcaacag 5520

cagtgctatt accttcatct tggaattatt tgagaataac cggacgctgc tcaggttcaa 5580

cgccgtgctg aggaagctgc tcattgtctt cccccacttc tgcctgggcc ggggcctcat 5640

tgaccttgca ctgagccagg ctgtgacaga tgtctatgcc cggtttggtg aggagcactc 5700

tgcaaatccg ttccactggg acctgattgg gaagaacctg tttgccatgg tggtggaagg 5760

ggtggtgtac ttcctcctga ccctgctggt ccagcgccac ttcttcctct cccaatggat 5820

tgccgagccc actaaggagc ccattgttga tgaagatgat gatgtggctg aagaaagaca 5880

aagaattatt actggtggaa ataaaactga catcttaagg ctacatgaac taaccaagat 5940

ttatccaggc acctccagcc cagcagtgga caggctgtgt gtcggagttc gccctggaga 6000

gtgctttggc ctcctgggag tgaatggtgc cggcaaaaca accacattca agatgctcac 6060

tggggacacc acagtgacct caggggatgc caccgtagca ggcaagagta ttttaaccaa 6120

tatttctgaa gtccatcaaa atatgggcta ctgtcctcag tttgatgcaa ttgatgagct 6180

gctcacagga cgagaacatc tttaccttta tgcccggctt cgaggtgtac cagcagaaga 6240

aatcgaaaag gttgcaaact ggagtattaa gagcctgggc ctgactgtct acgccgactg 6300

cctggctggc acgtacagtg ggggcaacaa gcggaaactc tccacagcca tcgcactcat 6360

tggctgccca ccgctggtgc tgctggatga gcccaccaca gggatggacc cccaggcacg 6420

ccgcatgctg tggaacgtca tcgtgagcat catcagagaa gggagggctg tggtcctcac 6480

atcccacagc atggaagaat gtgaggcact gtgtacccgg ctggccatca tggtaaaggg 6540

cgcctttcga tgtatgggca ccattcagca tctcaagtcc aaatttggag atggctatat 6600

cgtcacaatg aagatcaaat ccccgaagga cgacctgctt cctgacctga accctgtgga 6660

gcagttcttc caggggaact tcccaggcag tgtgcagagg gagaggcact acaacatgct 6720

ccagttccag gtctcctcct cctccctggc gaggatcttc cagctcctcc tctcccacaa 6780

ggacagcctg ctcatcgagg agtactcagt cacacagacc acactggacc aggtgtttgt 6840

aaattttgct aaacagcaga ctgaaagtca tgacctccct ctgcaccctc gagctgctgg 6900

agccagtcga caagcccagg actgatcttt cacaccgctc gttcctgcag ccagaaagga 6960

actctgggca gctggaggcg caggagcctg tgcccatatg gtcatccaaa tggactggcc 7020

agcgtaaatg accccactgc agcagaaaac aaacacacga ggagcatgca gcgaattcag 7080

aaagaggtct ttcagaagga aaccgaaact gacttgctca cctggaacac ctgatggtga 7140

aaccaaacaa atacaaaatc cttctccaga ccccagaact agaaaccccg ggccatccca 7200

ctagcagctt tggcctccat attgctctca tttcaagcag atctgctttt ctgcatgttt 7260

gtctgtgtgt ctgcgttgtg tgtgattttc atggaaaaat aaaatgcaaa tgcactcatc 7320

acaaacta 7328

<210> 2

<211> 2273

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gly Phe Val Arg Gln Ile Gln Leu Leu Leu Trp Lys Asn Trp Thr

1 5 10 15

Leu Arg Lys Arg Gln Lys Ile Arg Phe Val Val Glu Leu Val Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Ile Trp Leu Arg Asn Ala Asn Pro Leu

35 40 45

Tyr Ser His His Glu Cys His Phe Pro Asn Lys Ala Met Pro Ser Ala

50 55 60

Gly Met Leu Pro Trp Leu Gln Gly Ile Phe Cys Asn Val Asn Asn Pro

65 70 75 80

Cys Phe Gln Ser Pro Thr Pro Gly Glu Ser Pro Gly Ile Val Ser Asn

85 90 95

Tyr Asn Asn Ser Ile Leu Ala Arg Val Tyr Arg Asp Phe Gln Glu Leu

100 105 110

Leu Met Asn Ala Pro Glu Ser Gln His Leu Gly Arg Ile Trp Thr Glu

115 120 125

Leu His Ile Leu Ser Gln Phe Met Asp Thr Leu Arg Thr His Pro Glu

130 135 140

Arg Ile Ala Gly Arg Gly Ile Arg Ile Arg Asp Ile Leu Lys Asp Glu

145 150 155 160

Glu Thr Leu Thr Leu Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Leu Ser Asp Ser

165 170 175

Val Val Tyr Leu Leu Ile Asn Ser Gln Val Arg Pro Glu Gln Phe Ala

180 185 190

His Gly Val Pro Asp Leu Ala Leu Lys Asp Ile Ala Cys Ser Glu Ala

195 200 205

Leu Leu Glu Arg Phe Ile Ile Phe Ser Gln Arg Arg Gly Ala Lys Thr

210 215 220

Val Arg Tyr Ala Leu Cys Ser Leu Ser Gln Gly Thr Leu Gln Trp Ile

225 230 235 240

Glu Asp Thr Leu Tyr Ala Asn Val Asp Phe Phe Lys Leu Phe Arg Val

245 250 255

Leu Pro Thr Leu Leu Asp Ser Arg Ser Gln Gly Ile Asn Leu Arg Ser

260 265 270

Trp Gly Gly Ile Leu Ser Asp Met Ser Pro Arg Ile Gln Glu Phe Ile

275 280 285

His Arg Pro Ser Met Gln Asp Leu Leu Trp Val Thr Arg Pro Leu Met

290 295 300

Gln Asn Gly Gly Pro Glu Thr Phe Thr Lys Leu Met Gly Ile Leu Ser

305 310 315 320

Asp Leu Leu Cys Gly Tyr Pro Glu Gly Gly Gly Ser Arg Val Leu Ser

325 330 335

Phe Asn Trp Tyr Glu Asp Asn Asn Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Ile Asp

340 345 350

Ser Thr Arg Lys Asp Pro Ile Tyr Ser Tyr Asp Arg Arg Thr Thr Ser

355 360 365

Phe Cys Asn Ala Leu Ile Gln Ser Leu Glu Ser Asn Pro Leu Thr Lys

370 375 380

Ile Ala Trp Arg Ala Ala Lys Pro Leu Leu Met Gly Lys Ile Leu Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Asp Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ile Leu Lys Asn Ala Asn Ser

405 410 415

Thr Phe Glu Glu Leu Glu His Val Arg Lys Leu Val Lys Ala Trp Glu

420 425 430

Glu Val Gly Pro Gln Ile Trp Tyr Phe Phe Asp Asn Ser Thr Gln Met

435 440 445

Asn Met Ile Arg Asp Thr Leu Gly Asn Pro Thr Val Lys Asp Phe Leu

450 455 460

Asn Arg Gln Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Ala Glu Ala Ile Leu Asn

465 470 475 480

Phe Leu Tyr Lys Gly Pro Arg Glu Ser Gln Ala Asp Asp Met Ala Asn

485 490 495

Phe Asp Trp Arg Asp Ile Phe Asn Ile Thr Asp Arg Thr Leu Arg Leu

500 505 510

Val Asn Gln Tyr Leu Glu Cys Leu Val Leu Asp Lys Phe Glu Ser Tyr

515 520 525

Asn Asp Glu Thr Gln Leu Thr Gln Arg Ala Leu Ser Leu Leu Glu Glu

530 535 540

Asn Met Phe Trp Ala Gly Val Val Phe Pro Asp Met Tyr Pro Trp Thr

545 550 555 560

Ser Ser Leu Pro Pro His Val Lys Tyr Lys Ile Arg Met Asp Ile Asp

565 570 575

Val Val Glu Lys Thr Asn Lys Ile Lys Asp Arg Tyr Trp Asp Ser Gly

580 585 590

Pro Arg Ala Asp Pro Val Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Trp Gly Gly Phe

595 600 605

Ala Tyr Leu Gln Asp Met Val Glu Gln Gly Ile Thr Arg Ser Gln Val

610 615 620

Gln Ala Glu Ala Pro Val Gly Ile Tyr Leu Gln Gln Met Pro Tyr Pro

625 630 635 640

Cys Phe Val Asp Asp Ser Phe Met Ile Ile Leu Asn Arg Cys Phe Pro

645 650 655

Ile Phe Met Val Leu Ala Trp Ile Tyr Ser Val Ser Met Thr Val Lys

660 665 670

Ser Ile Val Leu Glu Lys Glu Leu Arg Leu Lys Glu Thr Leu Lys Asn

675 680 685

Gln Gly Val Ser Asn Ala Val Ile Trp Cys Thr Trp Phe Leu Asp Ser

690 695 700

Phe Ser Ile Met Ser Met Ser Ile Phe Leu Leu Thr Ile Phe Ile Met

705 710 715 720

His Gly Arg Ile Leu His Tyr Ser Asp Pro Phe Ile Leu Phe Leu Phe

725 730 735

Leu Leu Ala Phe Ser Thr Ala Thr Ile Met Leu Cys Phe Leu Leu Ser

740 745 750

Thr Phe Phe Ser Lys Ala Ser Leu Ala Ala Ala Cys Ser Gly Val Ile

755 760 765

Tyr Phe Thr Leu Tyr Leu Pro His Ile Leu Cys Phe Ala Trp Gln Asp

770 775 780

Arg Met Thr Ala Glu Leu Lys Lys Ala Val Ser Leu Leu Ser Pro Val

785 790 795 800

Ala Phe Gly Phe Gly Thr Glu Tyr Leu Val Arg Phe Glu Glu Gln Gly

805 810 815

Leu Gly Leu Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ser Pro Thr Glu Gly Asp

820 825 830

Glu Phe Ser Phe Leu Leu Ser Met Gln Met Met Leu Leu Asp Ala Ala

835 840 845

Val Tyr Gly Leu Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Gln Val Phe Pro Gly Asp

850 855 860

Tyr Gly Thr Pro Leu Pro Trp Tyr Phe Leu Leu Gln Glu Ser Tyr Trp

865 870 875 880

Leu Gly Gly Glu Gly Cys Ser Thr Arg Glu Glu Arg Ala Leu Glu Lys

885 890 895

Thr Glu Pro Leu Thr Glu Glu Thr Glu Asp Pro Glu His Pro Glu Gly

900 905 910

Ile His Asp Ser Phe Phe Glu Arg Glu His Pro Gly Trp Val Pro Gly

915 920 925

Val Cys Val Lys Asn Leu Val Lys Ile Phe Glu Pro Cys Gly Arg Pro

930 935 940

Ala Val Asp Arg Leu Asn Ile Thr Phe Tyr Glu Asn Gln Ile Thr Ala

945 950 955 960

Phe Leu Gly His Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Leu Ser Ile Leu

965 970 975

Thr Gly Leu Leu Pro Pro Thr Ser Gly Thr Val Leu Val Gly Gly Arg

980 985 990

Asp Ile Glu Thr Ser Leu Asp Ala Val Arg Gln Ser Leu Gly Met Cys

995 1000 1005

Pro Gln His Asn Ile Leu Phe His His Leu Thr Val Ala Glu His

1010 1015 1020

Met Leu Phe Tyr Ala Gln Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Glu Ala

1025 1030 1035

Gln Leu Glu Met Glu Ala Met Leu Glu Asp Thr Gly Leu His His

1040 1045 1050

Lys Arg Asn Glu Glu Ala Gln Asp Leu Ser Gly Gly Met Gln Arg

1055 1060 1065

Lys Leu Ser Val Ala Ile Ala Phe Val Gly Asp Ala Lys Val Val

1070 1075 1080

Ile Leu Asp Glu Pro Thr Ser Gly Val Asp Pro Tyr Ser Arg Arg

1085 1090 1095

Ser Ile Trp Asp Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Arg Thr Ile

1100 1105 1110

Ile Met Ser Thr His His Met Asp Glu Ala Asp Leu Leu Gly Asp

1115 1120 1125

Arg Ile Ala Ile Ile Ala Gln Gly Arg Leu Tyr Cys Ser Gly Thr

1130 1135 1140

Pro Leu Phe Leu Lys Asn Cys Phe Gly Thr Gly Leu Tyr Leu Thr

1145 1150 1155

Leu Val Arg Lys Met Lys Asn Ile Gln Ser Gln Arg Lys Gly Ser

1160 1165 1170

Glu Gly Thr Cys Ser Cys Ser Ser Lys Gly Phe Ser Thr Thr Cys

1175 1180 1185

Pro Ala His Val Asp Asp Leu Thr Pro Glu Gln Val Leu Asp Gly

1190 1195 1200

Asp Val Asn Glu Leu Met Asp Val Val Leu His His Val Pro Glu

1205 1210 1215

Ala Lys Leu Val Glu Cys Ile Gly Gln Glu Leu Ile Phe Leu Leu

1220 1225 1230

Pro Asn Lys Asn Phe Lys His Arg Ala Tyr Ala Ser Leu Phe Arg

1235 1240 1245

Glu Leu Glu Glu Thr Leu Ala Asp Leu Gly Leu Ser Ser Phe Gly

1250 1255 1260

Ile Ser Asp Thr Pro Leu Glu Glu Ile Phe Leu Lys Val Thr Glu

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Asp Ser Asp Ser Gly Pro Leu Phe Ala Gly Gly Ala Gln Gln Lys

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Arg Glu Asn Val Asn Pro Arg His Pro Cys Leu Gly Pro Arg Glu

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1310 1315 1320

Ala Pro Ala Ala His Pro Glu Gly Gln Pro Pro Pro Glu Pro Glu

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Cys Pro Gly Pro Gln Leu Asn Thr Gly Thr Gln Leu Val Leu Gln

1340 1345 1350

His Val Gln Ala Leu Leu Val Lys Arg Phe Gln His Thr Ile Arg

1355 1360 1365

Ser His Lys Asp Phe Leu Ala Gln Ile Val Leu Pro Ala Thr Phe

1370 1375 1380

Val Phe Leu Ala Leu Met Leu Ser Ile Val Ile Pro Pro Phe Gly

1385 1390 1395

Glu Tyr Pro Ala Leu Thr Leu His Pro Trp Ile Tyr Gly Gln Gln

1400 1405 1410

Tyr Thr Phe Phe Ser Met Asp Glu Pro Gly Ser Glu Gln Phe Thr

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Val Leu Ala Asp Val Leu Leu Asn Lys Pro Gly Phe Gly Asn Arg

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Cys Leu Lys Glu Gly Trp Leu Pro Glu Tyr Pro Cys Gly Asn Ser

1445 1450 1455

Thr Pro Trp Lys Thr Pro Ser Val Ser Pro Asn Ile Thr Gln Leu

1460 1465 1470

Phe Gln Lys Gln Lys Trp Thr Gln Val Asn Pro Ser Pro Ser Cys

1475 1480 1485

Arg Cys Ser Thr Arg Glu Lys Leu Thr Met Leu Pro Glu Cys Pro

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1520 1525 1530

Leu Val Lys Thr Tyr Pro Ala Leu Ile Arg Ser Ser Leu Lys Ser

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Lys Phe Trp Val Asn Glu Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ile Gly

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Gly Lys Leu Pro Val Val Pro Ile Thr Gly Glu Ala Leu Val Gly

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Phe Leu Ser Asp Leu Gly Arg Ile Met Asn Val Ser Gly Gly Pro

1580 1585 1590

Ile Thr Arg Glu Ala Ser Lys Glu Ile Pro Asp Phe Leu Lys His

1595 1600 1605

Leu Glu Thr Glu Asp Asn Ile Lys Val Trp Phe Asn Asn Lys Gly

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Trp His Ala Leu Val Ser Phe Leu Asn Val Ala His Asn Ala Ile

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Leu Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Arg Ser Pro Glu Glu Tyr Gly

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Ile Thr Val Ile Ser Gln Pro Leu Asn Leu Thr Lys Glu Gln Leu

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Ser Glu Ile Thr Val Leu Thr Thr Ser Val Asp Ala Val Val Ala

1670 1675 1680

Ile Cys Val Ile Phe Ser Met Ser Phe Val Pro Ala Ser Phe Val

1685 1690 1695

Leu Tyr Leu Ile Gln Glu Arg Val Asn Lys Ser Lys His Leu Gln

1700 1705 1710

Phe Ile Ser Gly Val Ser Pro Thr Thr Tyr Trp Val Thr Asn Phe

1715 1720 1725

Leu Trp Asp Ile Met Asn Tyr Ser Val Ser Ala Gly Leu Val Val

1730 1735 1740

Gly Ile Phe Ile Gly Phe Gln Lys Lys Ala Tyr Thr Ser Pro Glu

1745 1750 1755

Asn Leu Pro Ala Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu Tyr Gly Trp Ala

1760 1765 1770

Val Ile Pro Met Met Tyr Pro Ala Ser Phe Leu Phe Asp Val Pro

1775 1780 1785

Ser Thr Ala Tyr Val Ala Leu Ser Cys Ala Asn Leu Phe Ile Gly

1790 1795 1800

Ile Asn Ser Ser Ala Ile Thr Phe Ile Leu Glu Leu Phe Glu Asn

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Asn Arg Thr Leu Leu Arg Phe Asn Ala Val Leu Arg Lys Leu Leu

1820 1825 1830

Ile Val Phe Pro His Phe Cys Leu Gly Arg Gly Leu Ile Asp Leu

1835 1840 1845

Ala Leu Ser Gln Ala Val Thr Asp Val Tyr Ala Arg Phe Gly Glu

1850 1855 1860

Glu His Ser Ala Asn Pro Phe His Trp Asp Leu Ile Gly Lys Asn

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Leu Phe Ala Met Val Val Glu Gly Val Val Tyr Phe Leu Leu Thr

1880 1885 1890

Leu Leu Val Gln Arg His Phe Phe Leu Ser Gln Trp Ile Ala Glu

1895 1900 1905

Pro Thr Lys Glu Pro Ile Val Asp Glu Asp Asp Asp Val Ala Glu

1910 1915 1920

Glu Arg Gln Arg Ile Ile Thr Gly Gly Asn Lys Thr Asp Ile Leu

1925 1930 1935

Arg Leu His Glu Leu Thr Lys Ile Tyr Pro Gly Thr Ser Ser Pro

1940 1945 1950

Ala Val Asp Arg Leu Cys Val Gly Val Arg Pro Gly Glu Cys Phe

1955 1960 1965

Gly Leu Leu Gly Val Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Phe Lys

1970 1975 1980

Met Leu Thr Gly Asp Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Ala Thr Val

1985 1990 1995

Ala Gly Lys Ser Ile Leu Thr Asn Ile Ser Glu Val His Gln Asn

2000 2005 2010

Met Gly Tyr Cys Pro Gln Phe Asp Ala Ile Asp Glu Leu Leu Thr

2015 2020 2025

Gly Arg Glu His Leu Tyr Leu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Val Pro

2030 2035 2040

Ala Glu Glu Ile Glu Lys Val Ala Asn Trp Ser Ile Lys Ser Leu

2045 2050 2055

Gly Leu Thr Val Tyr Ala Asp Cys Leu Ala Gly Thr Tyr Ser Gly

2060 2065 2070

Gly Asn Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Ile Ala Leu Ile Gly Cys

2075 2080 2085

Pro Pro Leu Val Leu Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Met Asp Pro

2090 2095 2100

Gln Ala Arg Arg Met Leu Trp Asn Val Ile Val Ser Ile Ile Arg

2105 2110 2115

Glu Gly Arg Ala Val Val Leu Thr Ser His Ser Met Glu Glu Cys

2120 2125 2130

Glu Ala Leu Cys Thr Arg Leu Ala Ile Met Val Lys Gly Ala Phe

2135 2140 2145

Arg Cys Met Gly Thr Ile Gln His Leu Lys Ser Lys Phe Gly Asp

2150 2155 2160

Gly Tyr Ile Val Thr Met Lys Ile Lys Ser Pro Lys Asp Asp Leu

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Leu Pro Asp Leu Asn Pro Val Glu Gln Phe Phe Gln Gly Asn Phe

2180 2185 2190

Pro Gly Ser Val Gln Arg Glu Arg His Tyr Asn Met Leu Gln Phe

2195 2200 2205

Gln Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala Arg Ile Phe Gln Leu Leu Leu

2210 2215 2220

Ser His Lys Asp Ser Leu Leu Ile Glu Glu Tyr Ser Val Thr Gln

2225 2230 2235

Thr Thr Leu Asp Gln Val Phe Val Asn Phe Ala Lys Gln Gln Thr

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Glu Ser His Asp Leu Pro Leu His Pro Arg Ala Ala Gly Ala Ser

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Arg Gln Ala Gln Asp

2270

<210> 3

<211> 3816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 3

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

tggttaagga atgccaaccc gctctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180

atgccctcag caggaatgct gccgtggctc caggggatct tctgcaatgt gaacaatccc 240

tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300

atcttggcaa gggtatatcg agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag 360

caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420

actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480

gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540

ctgatcaact ctcaagtccg tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg 600

aaggacatcg cctgcagcga ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc 660

ggggcaaaga cggtgcgcta tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata 720

gaagacactc tgtattcttt catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg 780

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<212> DNA

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<220>

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tcaggcaccc cactcttcct gaagaactgc tttggcacag gcttgtactt aaccttggtg 3060

ggcgaatacc ccgctttgac ccttcacccc tggatatatg ggcagcagta caccttcttc 3120

agcatggatg aaccaggcag tgagcagttc acggtacttg cagacgtcct cctgaataag 3180

ccaggctttg gcaaccgctg cctgaaggaa gggtggcttc cggagtaccc ctgtggcaac 3240

tcaacaccct ggaagactcc ttctgtgtcc ccaaacatca cccagctgtt ccagaagcag 3300

aaatggacac aggtcaaccc ttcaccatcc tgcaggtgca gcaccaggga gaagctcacc 3360

atgctgccat taaggctaca tgaactaacc aagatttatc caggcacctc cagcccagca 3420

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gtggagcagt tcttccaggg gaacttccca ggcagtgtgc agagggaggt gtttgtaaat 3660

tttgcttga 3669

<210> 7

<211> 3069

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 7

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

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gatgccaccg tagcaggcat caaatccccg aaggacgacc tgcttcctga cctgaaccct 2940

gtggagcagt tcttccaggg gaacttccca ggcagtgtgc agagggagag gcactacaac 3000

atgctccagt tccaggtctc ctcctcctcc ctggcgagga tcttccaggt gtttgtaaat 3060

tttgcttga 3069

<210> 8

<211> 4401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 8

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

tggttaaggg ccaacgtgga cttcttcaag ctcttccgtg tgcttcccac actcctagac 180

agccgttctc aaggtatcaa tctgagatct tggggaggaa tattatctga tatgtcacca 240

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ctcatgcaga atggtggtcc agagaccttt acaaagctga tgggcatcct gtctgacctc 360

ctgtgtggct accccgaggg aggtggctct cgggtgctct ccttcaactg gtatgaagac 420

aataactata aggcctttct ggggattgac tccacaagga aggatcctat ctattcttat 480

gacagaagaa caacatcctt ttgtaatgca ttgatccaga gcctggagtc aaatccttta 540

accaaaatcg cttggagggc ggcaaagcct ttgctgatgg gaaaaatcct gtacactcct 600

gattcacctg cagcacgaag gatactgaag aatgccaact caacttttga agaactggaa 660

cacgttagga agttggtcaa agcctgggaa gaagtagggc cccagatctg gtacttcttt 720

gacaacagca cacagatgaa catgatcaga gataccctgg ggaacccaac agtaaaagac 780

tttttgaata ggcagcttgg tgaagaaggt attactgctg aagccatcct aaacttcctc 840

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cagagccttg gcatgtgtcc acagcacaac atcctgttcc accacctcac ggtggctgag 2040

cacatgctgt tctatgccca gctgaaagga aagtcccagg aggaggccca gctggagatg 2100

gaagccatgt tggaggacac aggcctccac cacaagcgga atgaagaggc tcaggaccta 2160

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gtgattctgg acgaacccac ctctggggtg gacccttact cgagacgctc aatctgggat 2280

ctgctcctga agtatcgctc aggcagaacc atcatcatgt ccactcacca catggacgag 2340

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accccactct tcctgaagaa ctgctttggc acaggcttgt acttaacctt ggtgcgcaag 2460

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gctcttataa gaagcagctt aaagagcaaa ttctgggtca atgaacagag gtatggagga 2820

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ttaagcgacc ttggccggat catgaatgtg agcgggggcc ctatcactag agaggcctct 2940

aaagaaatac ctgatttcct taaacatcta gaaactgaag acaacattaa ggtgtggttt 3000

aataacaaag gctggcatgc cctggtcagc tttctcaatg tggcccacaa cgccatctta 3060

cgggccagcc tgcctaagga caggagcccc gagaacttcc tctgggacat catgaattat 3120

tccgtgagtg ctgggctggt ggtgggcatc ttcatcgggt ttcagaagaa agcctacact 3180

tctccagaaa accttcctgc ccttgtggca ctgctcctgc tgtatggatg ggcggtcatt 3240

cccatgatgt acccagcatc cttcctgttt gatgtcccca gcacagccta tgtggcttta 3300

tcttgtgcta atctgttcat cggcatcaac agcagtgcta ttaccttcat cttggaatta 3360

tttgagaata accggacgct gctcaggttc aacgccgtgc tgaggaagct gctcattgtc 3420

ttcccccact tctgcctggg ccggggcctc attgaccttg cactgagcca ggctgtgaca 3480

gatgtctatg cccggtttgg tgaggagcac tctgcaaatc cgttccactg ggacctgatt 3540

gggaagaacc tgtttgccat ggtggtggaa ggggtggtgt acttcctcct gaccctgctg 3600

gtccagcgcc acttcttcct ctcccaatgg attgccgagc ccactaagga gcccattgtt 3660

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gacatcttaa agagtatttt aaccaatatt tctgaagtcc atcaaaatat gggctactgt 3780

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accacaggga tggaccccca ggcacgccgc atgctgtgga acgtcatcgt gagcatcatc 4080

agagaaggga gggctgtggt cctcacatcc cacagcatgg aagaatgtga ggcactgtgt 4140

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agtcgacaag cccaggactg a 4401

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 9

Met Gly Phe Val Arg Gln Ile Gln Leu Leu Leu Trp Lys Asn Trp Thr

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Leu Met Asn Ala Pro Glu Ser Gln His Leu Gly Arg Ile Trp Thr Glu

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Arg Ile Ala Gly Arg Gly Ile Arg Ile Arg Asp Ile Leu Lys Asp Glu

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Val Val Tyr Leu Leu Ile Asn Ser Gln Val Arg Pro Glu Gln Phe Ala

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His Gly Val Pro Asp Leu Ala Leu Lys Asp Ile Ala Cys Ser Glu Ala

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Leu Leu Glu Arg Phe Ile Ile Phe Ser Gln Arg Arg Gly Ala Lys Thr

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Val Arg Tyr Ala Leu Cys Ser Leu Ser Gln Gly Thr Leu Gln Trp Ile

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Glu Asp Thr Leu Tyr Ser Phe Met Ile Ile Leu Asn Arg Cys Phe Pro

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His Gly Arg Ile Leu His Tyr Ser Asp Pro Phe Ile Leu Phe Leu Phe

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Leu Leu Ala Phe Ser Thr Ala Thr Ile Met Leu Cys Phe Leu Leu Ser

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Tyr Phe Thr Leu Tyr Leu Pro His Ile Leu Cys Phe Ala Trp Gln Asp

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Ala Phe Gly Phe Gly Thr Glu Tyr Leu Val Arg Phe Glu Glu Gln Gly

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Glu Phe Ser Phe Leu Leu Ser Met Gln Met Met Leu Leu Asp Ala Ala

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Leu Asn Ile Thr Phe Tyr Glu Asn Gln Ile Thr Ala Phe Leu Gly His

485 490 495

Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Leu Ser Ile Leu Thr Gly Leu Leu

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Pro Pro Thr Ser Gly Thr Val Leu Val Gly Gly Arg Asp Ile Glu Thr

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Ser Gly Arg Thr Ile Ile Met Ser Thr His His Met Asp Glu Ala Asp

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Gln Phe Thr Val Leu Ala Asp Val Leu Leu Asn Lys Pro Gly Phe Gly

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Asn Arg Cys Leu Lys Glu Gly Trp Leu Pro Glu Tyr Pro Cys Gly Asn

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Ile Ile Arg Glu Gly Arg Ala Val Val Leu Thr Ser His Ser Met

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Leu Leu Leu Ser His Lys Asp Ser Leu Leu Ile Glu Glu Tyr Ser

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<210> 10

<211> 1267

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 10

Met Gly Phe Val Arg Gln Ile Gln Leu Leu Leu Trp Lys Asn Trp Thr

1 5 10 15

Leu Arg Lys Arg Gln Lys Ile Arg Phe Val Val Glu Leu Val Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Ile Trp Leu Arg Asn Ala Asn Pro Leu

35 40 45

Tyr Ser His His Glu Cys His Phe Pro Asn Lys Ala Met Pro Ser Ala

50 55 60

Gly Met Leu Pro Trp Leu Gln Gly Ile Phe Cys Asn Val Asn Asn Pro

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Cys Phe Gln Ser Pro Thr Pro Gly Glu Ser Pro Gly Ile Val Ser Asn

85 90 95

Tyr Asn Asn Ser Ile Leu Ala Arg Val Tyr Arg Asp Phe Gln Glu Leu

100 105 110

Leu Met Asn Ala Pro Glu Ser Gln His Leu Gly Arg Ile Trp Thr Glu

115 120 125

Leu His Ile Leu Ser Gln Phe Met Asp Thr Leu Arg Thr His Pro Glu

130 135 140

Arg Ile Ala Gly Arg Gly Ile Arg Ile Arg Asp Ile Leu Lys Asp Glu

145 150 155 160

Glu Thr Leu Thr Leu Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Leu Ser Asp Ser

165 170 175

Val Val Tyr Leu Leu Ile Asn Ser Gln Val Arg Pro Glu Gln Phe Ala

180 185 190

His Gly Val Pro Asp Leu Ala Leu Lys Asp Ile Ala Cys Ser Glu Ala

195 200 205

Leu Leu Glu Arg Phe Ile Ile Phe Ser Gln Arg Arg Gly Ala Lys Thr

210 215 220

Val Arg Tyr Ala Leu Cys Ser Leu Ser Gln Gly Thr Leu Gln Trp Ile

225 230 235 240

Glu Asp Thr Leu Tyr Val Cys Val Lys Asn Leu Val Lys Ile Phe Glu

245 250 255

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Glu Asp Thr Leu Tyr Ser Phe Met Ile Ile Leu Asn Arg Cys Phe Pro

245 250 255

Ile Phe Met Val Leu Ala Trp Ile Tyr Ser Val Ser Met Thr Val Lys

260 265 270

Ser Ile Val Leu Glu Lys Glu Leu Arg Leu Lys Glu Thr Leu Lys Asn

275 280 285

Gln Gly Val Ser Asn Ala Val Ile Trp Cys Thr Trp Phe Leu Asp Ser

290 295 300

Phe Ser Ile Met Ser Met Ser Ile Phe Leu Leu Thr Ile Phe Ile Met

305 310 315 320

His Gly Arg Ile Leu His Tyr Ser Asp Pro Phe Ile Leu Phe Leu Phe

325 330 335

Leu Leu Ala Phe Ser Thr Ala Thr Ile Met Leu Cys Phe Leu Leu Ser

340 345 350

Thr Phe Phe Ser Lys Ala Ser Leu Ala Ala Ala Cys Ser Gly Val Ile

355 360 365

Tyr Phe Thr Leu Tyr Leu Pro His Ile Leu Cys Phe Ala Trp Gln Asp

370 375 380

Arg Met Thr Ala Glu Leu Lys Lys Ala Val Ser Leu Leu Ser Pro Val

385 390 395 400

Ala Phe Gly Phe Gly Thr Glu Tyr Leu Val Arg Phe Glu Glu Gln Gly

405 410 415

Leu Gly Leu Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ser Pro Thr Glu Gly Asp

420 425 430

Glu Phe Ser Phe Leu Leu Ser Met Gln Met Met Leu Leu Asp Ala Ala

435 440 445

Val Tyr Gly Leu Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Gln Val Leu Thr Glu Glu

450 455 460

Thr Glu Asp Pro Glu His Pro Glu Gly Ile His Asp Ser Phe Phe Glu

465 470 475 480

Arg Glu His Pro Gly Trp Val Pro Gly Val Cys Val Lys Asn Leu Val

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Lys Ile Phe Glu Pro Cys Gly Arg Pro Ala Val Asp Arg Leu Asn Ile

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Thr Phe Tyr Glu Asn Gln Ile Thr Ala Phe Leu Gly His Asn Gly Ala

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Gly Lys Thr Thr Thr Leu Ser Ile Leu Thr Gly Leu Leu Pro Pro Thr

530 535 540

Ser Gly Thr Val Leu Val Gly Gly Arg Asp Ile Glu Thr Ser Leu Asp

545 550 555 560

Ala His Lys Asp Phe Leu Ala Gln Ile Val Leu Pro Ala Thr Phe Val

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Pro Ala Leu Thr Leu His Pro Trp Ile Tyr Gly Gln Gln Tyr Thr Phe

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Phe Ser Met Asp Glu Pro Gly Ser Glu Gln Phe Thr Val Leu Ala Asp

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Trp Leu Pro Glu Tyr Pro Cys Gly Asn Ser Thr Pro Trp Lys Thr Pro

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Ser Val Ser Pro Asn Ile Thr Gln Leu Phe Gln Lys Gln Lys Trp Thr

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Val Pro Ser Thr Ala Tyr Val Ala Leu Ser Cys Ala Asn Leu Phe Ile

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Asn Arg Thr Leu Leu Arg Phe Asn Ala Val Leu Arg Lys Leu Leu Ile

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Ser Gln Ala Val Thr Asp Val Tyr Ala Arg Phe Gly Glu Glu His Ser

820 825 830

Ala Asn Pro Phe His Trp Asp Leu Ile Gly Lys Asn Leu Phe Ala Met

835 840 845

Val Val Glu Gly Val Val Tyr Phe Leu Leu Thr Leu Leu Val Gln Arg

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His Phe Phe Leu Ser Gln Trp Ile Ala Glu Pro Thr Lys Glu Pro Ile

865 870 875 880

Val Asp Glu Asp Asp Asp Val Ala Glu Glu Arg Gln Arg Ile Ile Thr

885 890 895

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<210> 14

<211> 1466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 14

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225 230 235 240

Asp Asn Ser Thr Gln Met Asn Met Ile Arg Asp Thr Leu Gly Asn Pro

245 250 255

Thr Val Lys Asp Phe Leu Asn Arg Gln Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr

260 265 270

Ala Glu Ala Ile Leu Asn Phe Leu Tyr Lys Gly Pro Arg Glu Ser Gln

275 280 285

Ala Asp Asp Met Ala Asn Phe Asp Trp Arg Asp Ile Phe Asn Ile Thr

290 295 300

Asp Arg Thr Leu Arg Leu Val Asn Gln Tyr Leu Glu Cys Leu Val Leu

305 310 315 320

Asp Lys Phe Glu Ser Tyr Asn Asp Glu Thr Gln Leu Thr Gln Arg Ala

325 330 335

Leu Ser Leu Leu Glu Glu Asn Met Phe Trp Ala Gly Val Val Phe Pro

340 345 350

Asp Met Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Leu Pro Pro His Val Lys Tyr Lys

355 360 365

Ile Arg Met Asp Ile Asp Val Val Glu Lys Thr Asn Lys Ile Lys Asp

370 375 380

Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Pro Arg Ala Asp Pro Val Glu Asp Phe Arg

385 390 395 400

Tyr Ile Trp Gly Gly Phe Ala Tyr Leu Gln Asp Met Val Glu Gln Gly

405 410 415

Ile Thr Arg Ser Gln Val Gln Ala Glu Ala Pro Val Gly Ile Tyr Leu

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Val Ser Met Thr Val Lys Ser Ile Val Leu Glu Lys Glu Leu Arg Leu

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Lys Glu Thr Leu Lys Asn Gln Gly Val Ser Asn Ala Val Ile Trp Cys

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Leu Cys Phe Leu Leu Ser Thr Phe Phe Ser Lys Ala Ser Leu Ala Ala

545 550 555 560

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565 570 575

Cys Phe Ala Trp Gln Asp Arg Met Thr Ala Glu Leu Lys Lys Ala Val

580 585 590

Ser Leu Leu Ser Pro Val Ala Phe Gly Phe Gly Thr Glu Tyr Leu Val

595 600 605

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 15

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

tggttaagga atgccaaccc actctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180

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tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300

atcttggcaa gggtatatcg agattttcaa gaactcctca tgaatgcacc agagagccag 360

caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420

actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480

gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540

ctgatcaact ctcaagtccg tccagagcag ttcgctcatg gagtcccgga cctggcgctg 600

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ggggcaaaga cggtgcgcta tgccctgtgc tccctctccc agggcaccct acagtggata 720

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ctagacagcc gttctcaagg tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg 840

tcaccaagaa ttcaagagtt tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc 900

aggcccctca tgcagaatgg tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct 960

gacctcctgt gtggctaccc cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat 1020

gaagacaata actataaggc ctttctgggg attgactcca caaggaagga tcctatctat 1080

tcttatgaca gaagaacaac atccttttgt aatgcattga tccagagcct ggagtcaaat 1140

cctttaacca aaatcgcttg gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac 1200

actcctgatt cacctgcagc acgaaggata ctgaagaatg ccaactcaac ttttgaagaa 1260

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ttctttgaca acagcacaca gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta 1380

aaagactttt tgaataggca gcttggtgaa gaaggtatta ctgctgaagc catcctaaac 1440

ttcctctaca agggccctcg ggaaagccag gctgacgaca tggccaactt cgactggagg 1500

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ctggcatgga tctactctgt ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg 2040

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catggaagaa tcctacatta cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc 2220

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tga 3483

<210> 16

<211> 2754

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 16

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

atcgtgctcc cggctacctt tgtgtttttg gctctgatgc tttctattgt tatccctcct 120

tttggcgaat accccgcttt gacccttcac ccctggatat atgggcagca gtacaccttc 180

ttcagcatgg atgaaccagg cagtgagcag ttcacggtac ttgcagacgt cctcctgaat 240

aagccaggct ttggcaaccg ctgcctgaag gaagggtggc ttccggagta cccctgtggc 300

aactcaacac cctggaagac tccttctgtg tccccaaaca tcacccagct gttccagaag 360

cagaaatgga cacaggtcaa cccttcacca tcctgcaggt gcagcaccag ggagaagctc 420

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tatggaggaa tttccattgg aggaaagctc ccagtcgtcc ccatcacggg ggaagcactt 660

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gaggcctcta aagaaatacc tgatttcctt aaacatctag aaactgaaga caacattaag 780

gtgtggttta ataacaaagg ctggcatgcc ctggtcagct ttctcaatgt ggcccacaac 840

gccatcttac gggccagcct gcctaaggac aggagccccg aggagtatgg aatcaccgtc 900

attagccaac ccctgaacct gaccaaggag cagctctcag agattacagt gctgaccact 960

tcagtggatg ctgtggttgc catctgcgtg attttctcca tgtccttcgt cccagccagc 1020

tttgtccttt atttgatcca ggagcgggtg aacaaatcca agcacctcca gtttatcagt 1080

ggagtgagcc ccaccaccta ctgggtgacc aacttcctct gggacatcat gaattattcc 1140

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gtctatgccc ggtttggtga ggagcactct gcaaatccgt tccactggga cctgattggg 1560

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aggctgtgtg tcggagttcg ccctggagag tgctttggcc tcctgggagt gaatggtgcc 1860

ggcaaaacaa ccacattcaa gatgctcact ggggacacca cagtgacctc aggggatgcc 1920

accgtagcag gcaagagtat tttaaccaat atttctgaag tccatcaaaa tatgggctac 1980

tgtcctcagt ttgatgcaat tgatgagctg ctcacaggac gagaacatct ttacctttat 2040

gcccggcttc gaggtgtacc agcagaagaa atcgaaaagg ttgcaaactg gagtattaag 2100

agcctgggcc tgactgtcta cgccgactgc ctggctggca cgtacagtgg gggcaacaag 2160

cggaaactct ccacagccat cgcactcatt ggctgcccac cgctggtgct gctggatgag 2220

cccaccacag ggatggaccc ccaggcacgc cgcatgctgt ggaacgtcat cgtgagcatc 2280

atcagagaag ggagggctgt ggtcctcaca tcccacagca tggaagaatg tgaggcactg 2340

tgtacccggc tggccatcat ggtaaagggc gcctttcgat gtatgggcac cattcagcat 2400

ctcaagtcca aatttggaga tggctatatc gtcacaatga agatcaaatc cccgaaggac 2460

gacctgcttc ctgacctgaa ccctgtggag cagttcttcc aggggaactt cccaggcagt 2520

gtgcagaggg agaggcacta caacatgctc cagttccagg tctcctcctc ctccctggcg 2580

aggatcttcc agctcctcct ctcccacaag gacagcctgc tcatcgagga gtactcagtc 2640

acacagacca cactggacca ggtgtttgta aattttgcta aacagcagac tgaaagtcat 2700

gacctccctc tgcaccctcg agctgctgga gccagtcgac aagcccagga ctga 2754

<210> 17

<211> 3459

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 17

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

tggttaagga atgccaaccc actctacatg ccctacccct gcttcgtgga cgattctttc 180

atgatcatcc tgaaccgctg tttccctatc ttcatggtgc tggcatggat ctactctgtc 240

tccatgactg tgaagagcat cgtcttggag aaggagttgc gactgaagga gaccttgaaa 300

aatcagggtg tctccaatgc agtgatttgg tgtacctggt tcctggacag cttctccatc 360

atgtcgatga gcatcttcct cctgacgata ttcatcatgc atggaagaat cctacattac 420

agcgacccat tcatcctctt cctgttcttg ttggctttct ccactgccac catcatgctg 480

tgctttctgc tcagcacctt cttctccaag gccagtctgg cagcagcctg tagtggtgtc 540

atctatttca ccctctacct gccacacatc ctgtgcttcg cctggcagga ccgcatgacc 600

gctgagctga agaaggctgt gagcttactg tctccggtgg catttggatt tggcactgag 660

tacctggttc gctttgaaga gcaaggcctg gggctgcagt ggagcaacat cgggaacagt 720

cccacggaag gggacgaatt cagcttcctg ctgtccatgc agatgatgct ccttgatgct 780

gctgtctatg gcttactcgc ttggtacctt gatcaggtgt ttccaggaga ctatggaacc 840

ccacttcctt ggtactttct tctacaagag tcgtattggc ttggcggtga agggtgttca 900

accagagaag aaagagccct ggaaaagacc gagcccctaa cagaggaaac ggaggatcca 960

gagcacccag aaggaataca cgactccttc tttgaacgtg agcatccagg gtgggttcct 1020

ggggtatgcg tgaagaatct ggtaaagatt tttgagccct gtggccggcc agctgtggac 1080

cgtctgaaca tcaccttcta cgagaaccag atcaccgcat tcctgggcca caatggagct 1140

gggaaaacca ccaccttgtc catcctgacg ggtctgttgc caccaacctc tgggactgtg 1200

ctcgttgggg gaagggacat tgaaaccagc ctggatgcag tccggcagag ccttggcatg 1260

tgtccacagc acaacatcct gttccaccac ctcacggtgg ctgagcacat gctgttctat 1320

gcccagctga aaggaaagtc ccaggaggag gcccagctgg agatggaagc catgttggag 1380

gacacaggcc tccaccacaa gcggaatgaa gaggctcagg acctatcagg tggcatgcag 1440

agaaagctgt cggttgccat tgcctttgtg ggagatgcca aggtggtgat tctggacgaa 1500

cccacctctg gggtggaccc ttactcgaga cgctcaatct gggatctgct cctgaagtat 1560

cgctcaggca gaaccatcat catgtccact caccacatgg acgaggccga cctccttggg 1620

gaccgcattg ccatcattgc ccagggaagg ctctactgct caggcacccc actcttcctg 1680

aagaactgct ttggcacagg cttggacttc ctggcgcaga tcgtgctccc ggctaccttt 1740

gtgtttttgg ctctgatgct ttctattgtt atccctcctt ttggcgaata ccccgctacc 1800

acctactggg tgaccaactt cctctgggac atcatgaatt attccgtgag tgctgggctg 1860

gtggtgggca tcttcatcgg gtttcagaag aaagcctaca cttctccaga aaaccttcct 1920

gcccttgtgg cactgctcct gctgtatgga tgggcggtca ttcccatgat gtacccagca 1980

tccttcctgt ttgatgtccc cagcacagcc tatgtggctt tatcttgtgc taatctgttc 2040

atcggcatca acagcagtgc tattaccttc atcttggaat tatttgagaa taaccggacg 2100

ctgctcaggt tcaacgccgt gctgaggaag ctgctcattg tcttccccca cttctgcctg 2160

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atggtggtgg aaggggtggt gtacttcctc ctgaccctgc tggtccagcg ccacttcttc 2340

ctctcccaat ggattgccga gcccactaag gagcccattg ttgatgaaga tgatgatgtg 2400

gctgaagaaa gacaaagaat tattactggt ggaaataaaa ctgacatctt aaggctacat 2460

gaactaacca agatttatcc aggcacctcc agcccagcag tggacaggct gtgtgtcgga 2520

gttcgccctg gagagtgctt tggcctcctg ggagtgaatg gtgccggcaa aacaaccaca 2580

ttcaagatgc tcactgggga caccacagtg acctcagggg atgccaccgt agcaggcaag 2640

agtattttaa ccaatatttc tgaagtccat caaaatatgg gctactgtcc tcagtttgat 2700

gcaattgatg agctgctcac aggacgagaa catctttacc tttatgcccg gcttcgaggt 2760

gtaccagcag aagaaatcga aaaggttgca aactggagta ttaagagcct gggcctgact 2820

gtctacgccg actgcctggc tggcacgtac agtgggggca acaagcggaa actctccaca 2880

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gctgtggtcc tcacatccca cagcatggaa gaatgtgagg cactgtgtac ccggctggcc 3060

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ggagatggct atatcgtcac aatgaagatc aaatccccga aggacgacct gcttcctgac 3180

ctgaaccctg tggagcagtt cttccagggg aacttcccag gcagtgtgca gagggagagg 3240

cactacaaca tgctccagtt ccaggtctcc tcctcctccc tggcgaggat cttccagctc 3300

ctcctctccc acaaggacag cctgctcatc gaggagtact cagtcacaca gaccacactg 3360

gaccaggtgt ttgtaaattt tgctaaacag cagactgaaa gtcatgacct ccctctgcac 3420

cctcgagctg ctggagccag tcgacaagcc caggactga 3459

<210> 18

<211> 3780

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 18

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

tggttaagga atgccaaccc actctacagc catcatgaat gccatttccc caacaaggcg 180

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tgttttcaaa gccccacccc aggagaatct cctggaattg tgtcaaacta taacaactcc 300

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caccttggcc gtatttggac agagctacac atcttgtccc aattcatgga caccctccgg 420

actcacccgg agagaattgc aggaagagga atacgaataa gggatatctt gaaagatgaa 480

gaaacactga cactatttct cattaaaaac atcggcctgt ctgactcagt ggtctacctt 540

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aaggacatcg cctgcagcga ggccctcctg gagcgcttca tcatcttcag ccagagacgc 660

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gaagacactc tgtatgccaa cgtggacttc ttcaagctct tccgtgtgct tcccacactc 780

ctagacagcc gttctcaagg tatcaatctg agatcttggg gaggaatatt atctgatatg 840

tcaccaagaa ttcaagagtt tatccatcgg ccgagtatgc aggacttgct gtgggtgacc 900

aggcccctca tgcagaatgg tggtccagag acctttacaa agctgatggg catcctgtct 960

gacctcctgt gtggctaccc cgagggaggt ggctctcggg tgctctcctt caactggtat 1020

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cctttaacca aaatcgcttg gagggcggca aagcctttgc tgatgggaaa aatcctgtac 1200

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ctggaacacg ttaggaagtt ggtcaaagcc tgggaagaag tagggcccca gatctggtac 1320

ttctttgaca acagcacaca gatgaacatg atcagagata ccctggggaa cccaacagta 1380

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gacatattta acatcactga tcgcaccctc cgcctggtca atcaatacct ggagtgcttg 1560

gtcctggata agtttgaaag ctacaatgat gaaactcagc tcacccaacg tgccctctct 1620

ctactggagg aaaacatgtt ctgggccgga gtggtattcc ctgacatgta tccctggacc 1680

agctctctac caccccacgt gaagtataag atccgaatgg acatagacgt ggtggagaaa 1740

accaataaga ttaaagacag gtattgggat tctggtccca gagctgatcc cgtggaagat 1800

ttccggtaca tctggggcgg gtttgcctat ctgcaggaca tggttgaaca ggggatcaca 1860

aggagccagg tgcaggcgga ggctccagtt ggaatctacc tccagcagat gccctacccc 1920

tgcttcgtgg acgattcttt catgatcatc ctgaaccgct gtttccctat cttcatggtg 1980

ctggcatgga tctactctgt ctccatgact gtgaagagca tcgtcttgga gaaggagttg 2040

cgactgaagg agaccttgaa aaatcagggt gtctccaatg cagtgatttg gtgtacctgg 2100

ttcctggaca gcttctccat catgtcgatg agcatcttcc tcctgacgat attcatcatg 2160

catggaagaa tcctacatta cagcgaccca ttcatcctct tcctgttctt gttggctttc 2220

tccactgcca ccatcatgct gtgctttctg ctcagcacct tcttctccaa ggccagtctg 2280

gcagcagcct gtagtggtgt catctatttc accctctacc tgccacacat cctgtgcttc 2340

gcctggcagg accgcatgac cgctgagctg aagaaggctg tgagcttact gtctccggtg 2400

gcatttggat ttggcactga gtacctggtt cgctttgaag agcaaggcct ggggctgcag 2460

tggagcaaca tcgggaacag tcccacggaa ggggacgaat tcagcttcct gctgtccatg 2520

cagatgatgc tccttgatgc tgctgtctat ggcttactcg cttggtacct tgatcaggtg 2580

gttcctgggg tatgcgtgaa gaatctggta aagatttttg agccctgtgg ccggccagct 2640

gtggaccgtc tgaacatcac cttctacgag aaccagatca ccgcattcct gggccacaat 2700

ggagctggga aaaccaccac cttgtccatc ctgacgggtc tgttgccacc aacctctggg 2760

actgtgctcg ttgggggaag ggacattgaa accagcctgg atgcagtccg gcagagcctt 2820

ggcatgtgtc cacagcacaa catcctgttc caccacctca cggtggctga gcacatgctg 2880

ttctatgccc agctgaaagg aaagtcccag gaggaggccc agctggagat ggaagccatg 2940

ttggaggaca caggcctcca ccacaagcgg aatgaagagg ctcaggacct atcaggtggc 3000

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gacgaaccca cctctggggt ggacccttac tcgagacgct caatctggga tctgctcctg 3120

aagtatcgct caggcagaac catcatcatg tccactcacc acatggacga ggccgacctc 3180

cttggggacc gcattgccat cattgcccag ggaaggctct actgctcagg caccccactc 3240

ttcctgaaga actgctttgt gaccaacttc ctctgggaca tcatgaatta ttccgtgagt 3300

gctgggctgg tggtgggcat cttcatcggg tttcagaaga aagcctacac ttctccagaa 3360

aaccttcctg cccttgtggc actgctcctg ctgtatggat gggcggtcat tcccatgatg 3420

tacccagcat ccttcctgtt tgatgtcccc agcacagcct atgtggcttt atcttgtgct 3480

aatctgttca tcggcatcaa cagcagtgct attaccttca tcttggaatt atttgagaat 3540

aaccggacgc tgctcaggtt caacgccgtg ctgaggaagc tgctcattgt cttcccccac 3600

ttctgcctgg gccggggcct cattgacctt gcactgagcc aggctgtgac agatgtctat 3660

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ctgtttgcca tggtggtgga aggggtggtg tacttcctcc tgaccctgct ggtccagtga 3780

<210> 19

<211> 3498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 19

atgggcttcg tgagacagat acagcttttg ctctggaaga actggaccct gcggaaaagg 60

caaaagattc gctttgtggt ggaactcgtg tggcctttat ctttatttct ggtcttgatc 120

tggttaagga atgccaacgt ggacgattct ttcatgatca tcctgaaccg ctgtttccct 180

atcttcatgg tgctggcatg gatctactct gtctccatga ctgtgaagag catcgtcttg 240

gagaaggagt tgcgactgaa ggagaccttg aaaaatcagg gtgtctccaa tgcagtgatt 300

tggtgtacct ggttcctgga cagcttctcc atcatgtcga tgagcatctt cctcctgacg 360

atattcatca tgcatggaag aatcctacat tacagcgacc cattcatcct cttcctgttc 420

ttgttggctt tctccactgc caccatcatg ctgtgctttc tgctcagcac cttcttctcc 480

aaggccagtc tggcagcagc ctgtagtggt gtcatctatt tcaccctcta cctgccacac 540

atcctgtgct tcgcctggca ggaccgcatg accgctgagc tgaagaaggc tgtgagctta 600

ctgtctccgg tggcatttgg atttggcact gagtacctgg ttcgctttga agagcaaggc 660

ctggggctgc agtggagcaa catcgggaac agtcccacgg aaggggacga attcagcttc 720

ctgctgtcca tgcagatgat gctccttgat gctgctgtct atggcttact cgcttggtac 780

cttgatcagg tgttcctggc gcagatcgtg ctcccggcta cctttgtgtt tttggctctg 840

atgctttcta ttgttatccc tccttttggc gaataccccg ctttgaccct tcacccctgg 900

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gtacttgcag acgtcctcct gaataagcca ggctttggca accgctgcct gaaggaaggg 1020

tggcttccgg agtacccctg tggcaactca acaccctgga agactccttc tgtgtcccca 1080

aacatcaccc agctgttcca gaagcagaaa tggacacagg tcaacccttc accatcctgc 1140

aggtgcagca ccagggagaa gctcaccatg ctgccagagt gccccgaggg tgccgggggc 1200

ctcccgcccc cccagagaac acagcgcagc acggaaattc tacaagacct gacggacagg 1260

aacatctccg acttcttggt aaaaacgtat cctgctctta taagaagcag cttaaagagc 1320

aaattctggg tcaatgaaca gaggtatgga ggaatttcca ttggaggaaa gctcccagtc 1380

gtccccatca cgggggaagc acttgttggg tttttaagcg accttggccg gatcatgaat 1440

gtgagcgggg gccctatcac tagagaggcc tctaaagaaa tacctgattt ccttaaacat 1500

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agctttctca atgtggccca caacgccatc ttacgggcca gcctgcctaa ggacaggagc 1620

cccgaggagt atggaatcac cgtcattagc caacccctga acctgaccaa ggagcagctc 1680

tcagagatta cagtgctgac cacttcagtg gatgctgtgg ttgccatctg cgtgattttc 1740

tccatgtcct tcgtcccagc cagctttgtc ctttatttga tccaggagcg ggtgaacaaa 1800

tccaagcacc tccagtttat cagtggagtg agccccacca cctactgggt gaccaacttc 1860

ctctgggaca tcatgaatta ttccgtgagt gctgggctgg tggtgggcat cttcatcggg 1920

tttcagaaga aagcctacac ttctccagaa aaccttcctg cccttgtggc actgctcctg 1980

ctgtatggat gggcggtcat tcccatgatg tacccagcat ccttcctgtt tgatgtcccc 2040

agcacagcct atgtggcttt atcttgtgct aatctgttca tcggcatcaa cagcagtgct 2100

attaccttca tcttggaatt atttgagaat aaccggacgc tgctcaggtt caacgccgtg 2160

ctgaggaagc tgctcattgt cttcccccac ttctgcctgg gccggggcct cattgacctt 2220

gcactgagcc aggctgtgac agatgtctat gcccggtttg gtgaggagca ctctgcaaat 2280

ccgttccact gggacctgat tgggaagaac ctgtttgcca tggtggtgga aggggtggtg 2340

tacttcctcc tgaccctgct ggtccagcgc cacttcttcc tctcccaatg gattgccgag 2400

cccactaagg agcccattgt tgatgaagat gatgatgtgg ctgaagaaag acaaagaatt 2460

attactggtg gaaataaaac tgacatctta aggctacatg aactaaccaa gatttatcca 2520

ggcacctcca gcccagcagt ggacaggctg tgtgtcggag ttcgccctgg agagtgcttt 2580

ggcctcctgg gagtgaatgg tgccggcaaa acaaccacat tcaagatgct cactggggac 2640

accacagtga cctcagggga tgccaccgta gcaggcaaga gtattttaac caatatttct 2700

gaagtccatc aaaatatggg ctactgtcct cagtttgatg caattgatga gctgctcaca 2760

ggacgagaac atctttacct ttatgcccgg cttcgaggtg taccagcaga agaaatcgaa 2820

aaggttgcaa actggagtat taagagcctg ggcctgactg tctacgccga ctgcctggct 2880

ggcacgtaca gtgggggcaa caagcggaaa ctctccacag ccatcgcact cattggctgc 2940

ccaccgctgg tgctgctgga tgagcccacc acagggatgg acccccaggc acgccgcatg 3000

ctgtggaacg tcatcgtgag catcatcaga gaagggaggg ctgtggtcct cacatcccac 3060

agcatggaag aatgtgaggc actgtgtacc cggctggcca tcatggtaaa gggcgccttt 3120

cgatgtatgg gcaccattca gcatctcaag tccaaatttg gagatggcta tatcgtcaca 3180

atgaagatca aatccccgaa ggacgacctg cttcctgacc tgaaccctgt ggagcagttc 3240

ttccagggga acttcccagg cagtgtgcag agggagaggc actacaacat gctccagttc 3300

caggtctcct cctcctccct ggcgaggatc ttccagctcc tcctctccca caaggacagc 3360

ctgctcatcg aggagtactc agtcacacag accacactgg accaggtgtt tgtaaatttt 3420

gctaaacagc agactgaaag tcatgacctc cctctgcacc ctcgagctgc tggagccagt 3480

cgacaagccc aggactga 3498

<210> 20

<211> 1160

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 20

Met Gly Phe Val Arg Gln Ile Gln Leu Leu Leu Trp Lys Asn Trp Thr

1 5 10 15

Leu Arg Lys Arg Gln Lys Ile Arg Phe Val Val Glu Leu Val Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Ile Trp Leu Arg Asn Ala Asn Pro Leu

35 40 45

Tyr Ser His His Glu Cys His Phe Pro Asn Lys Ala Met Pro Ser Ala

50 55 60

Gly Met Leu Pro Trp Leu Gln Gly Ile Phe Cys Asn Val Asn Asn Pro

65 70 75 80

Cys Phe Gln Ser Pro Thr Pro Gly Glu Ser Pro Gly Ile Val Ser Asn

85 90 95

Tyr Asn Asn Ser Ile Leu Ala Arg Val Tyr Arg Asp Phe Gln Glu Leu

100 105 110

Leu Met Asn Ala Pro Glu Ser Gln His Leu Gly Arg Ile Trp Thr Glu

115 120 125

Leu His Ile Leu Ser Gln Phe Met Asp Thr Leu Arg Thr His Pro Glu

130 135 140

Arg Ile Ala Gly Arg Gly Ile Arg Ile Arg Asp Ile Leu Lys Asp Glu

145 150 155 160

Glu Thr Leu Thr Leu Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Leu Ser Asp Ser

165 170 175

Val Val Tyr Leu Leu Ile Asn Ser Gln Val Arg Pro Glu Gln Phe Ala

180 185 190

His Gly Val Pro Asp Leu Ala Leu Lys Asp Ile Ala Cys Ser Glu Ala

195 200 205

Leu Leu Glu Arg Phe Ile Ile Phe Ser Gln Arg Arg Gly Ala Lys Thr

210 215 220

Val Arg Tyr Ala Leu Cys Ser Leu Ser Gln Gly Thr Leu Gln Trp Ile

225 230 235 240

Glu Asp Thr Leu Tyr Ala Asn Val Asp Phe Phe Lys Leu Phe Arg Val

245 250 255

Leu Pro Thr Leu Leu Asp Ser Arg Ser Gln Gly Ile Asn Leu Arg Ser

260 265 270

Trp Gly Gly Ile Leu Ser Asp Met Ser Pro Arg Ile Gln Glu Phe Ile

275 280 285

His Arg Pro Ser Met Gln Asp Leu Leu Trp Val Thr Arg Pro Leu Met

290 295 300

Gln Asn Gly Gly Pro Glu Thr Phe Thr Lys Leu Met Gly Ile Leu Ser

305 310 315 320

Asp Leu Leu Cys Gly Tyr Pro Glu Gly Gly Gly Ser Arg Val Leu Ser

325 330 335

Phe Asn Trp Tyr Glu Asp Asn Asn Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Ile Asp

340 345 350

Ser Thr Arg Lys Asp Pro Ile Tyr Ser Tyr Asp Arg Arg Thr Thr Ser

355 360 365

Phe Cys Asn Ala Leu Ile Gln Ser Leu Glu Ser Asn Pro Leu Thr Lys

370 375 380

Ile Ala Trp Arg Ala Ala Lys Pro Leu Leu Met Gly Lys Ile Leu Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Asp Ser Pro Ala Ala Arg Arg Ile Leu Lys Asn Ala Asn Ser

405 410 415

Thr Phe Glu Glu Leu Glu His Val Arg Lys Leu Val Lys Ala Trp Glu

420 425 430

Glu Val Gly Pro Gln Ile Trp Tyr Phe Phe Asp Asn Ser Thr Gln Met

435 440 445

Asn Met Ile Arg Asp Thr Leu Gly Asn Pro Thr Val Lys Asp Phe Leu

450 455 460

Asn Arg Gln Leu Gly Glu Glu Gly Ile Thr Ala Glu Ala Ile Leu Asn

465 470 475 480

Phe Leu Tyr Lys Gly Pro Arg Glu Ser Gln Ala Asp Asp Met Ala Asn

485 490 495

Phe Asp Trp Arg Asp Ile Phe Asn Ile Thr Asp Arg Thr Leu Arg Leu

500 505 510

Val Asn Gln Tyr Leu Glu Cys Leu Val Leu Asp Lys Phe Glu Ser Tyr

515 520 525

Asn Asp Glu Thr Gln Leu Thr Gln Arg Ala Leu Ser Leu Leu Glu Glu

530 535 540

Asn Met Phe Trp Ala Gly Val Val Phe Pro Asp Met Tyr Pro Trp Thr

545 550 555 560

Ser Ser Leu Pro Pro His Val Lys Tyr Lys Ile Arg Met Asp Ile Asp

565 570 575

Val Val Glu Lys Thr Asn Lys Ile Lys Asp Arg Tyr Trp Asp Ser Gly

580 585 590

Pro Arg Ala Asp Pro Val Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Trp Gly Gly Phe

595 600 605

Ala Tyr Leu Gln Asp Met Val Glu Gln Gly Ile Thr Arg Ser Gln Val

610 615 620

Gln Ala Glu Ala Pro Val Gly Ile Tyr Leu Gln Gln Met Pro Tyr Pro

625 630 635 640

Cys Phe Val Asp Asp Ser Phe Met Ile Ile Leu Asn Arg Cys Phe Pro

645 650 655

Ile Phe Met Val Leu Ala Trp Ile Tyr Ser Val Ser Met Thr Val Lys

660 665 670

Ser Ile Val Leu Glu Lys Glu Leu Arg Leu Lys Glu Thr Leu Lys Asn

675 680 685

Gln Gly Val Ser Asn Ala Val Ile Trp Cys Thr Trp Phe Leu Asp Ser

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Phe Ser Ile Met Ser Met Ser Ile Phe Leu Leu Thr Ile Phe Ile Met

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<400> 24

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Leu Arg Lys Arg Gln Lys Ile Arg Phe Val Val Glu Leu Val Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Ile Trp Leu Arg Asn Ala Asn Val Asp

35 40 45

Asp Ser Phe Met Ile Ile Leu Asn Arg Cys Phe Pro Ile Phe Met Val

50 55 60

Leu Ala Trp Ile Tyr Ser Val Ser Met Thr Val Lys Ser Ile Val Leu

65 70 75 80

Glu Lys Glu Leu Arg Leu Lys Glu Thr Leu Lys Asn Gln Gly Val Ser

85 90 95

Asn Ala Val Ile Trp Cys Thr Trp Phe Leu Asp Ser Phe Ser Ile Met

100 105 110

Ser Met Ser Ile Phe Leu Leu Thr Ile Phe Ile Met His Gly Arg Ile

115 120 125

Leu His Tyr Ser Asp Pro Phe Ile Leu Phe Leu Phe Leu Leu Ala Phe

130 135 140

Ser Thr Ala Thr Ile Met Leu Cys Phe Leu Leu Ser Thr Phe Phe Ser

145 150 155 160

Lys Ala Ser Leu Ala Ala Ala Cys Ser Gly Val Ile Tyr Phe Thr Leu

165 170 175

Tyr Leu Pro His Ile Leu Cys Phe Ala Trp Gln Asp Arg Met Thr Ala

180 185 190

Glu Leu Lys Lys Ala Val Ser Leu Leu Ser Pro Val Ala Phe Gly Phe

195 200 205

Gly Thr Glu Tyr Leu Val Arg Phe Glu Glu Gln Gly Leu Gly Leu Gln

210 215 220

Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ser Pro Thr Glu Gly Asp Glu Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Leu Ser Met Gln Met Met Leu Leu Asp Ala Ala Val Tyr Gly Leu

245 250 255

Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Gln Val Phe Leu Ala Gln Ile Val Leu Pro

260 265 270

Ala Thr Phe Val Phe Leu Ala Leu Met Leu Ser Ile Val Ile Pro Pro

275 280 285

Phe Gly Glu Tyr Pro Ala Leu Thr Leu His Pro Trp Ile Tyr Gly Gln

290 295 300

Gln Tyr Thr Phe Phe Ser Met Asp Glu Pro Gly Ser Glu Gln Phe Thr

305 310 315 320

Val Leu Ala Asp Val Leu Leu Asn Lys Pro Gly Phe Gly Asn Arg Cys

325 330 335

Leu Lys Glu Gly Trp Leu Pro Glu Tyr Pro Cys Gly Asn Ser Thr Pro

340 345 350

Trp Lys Thr Pro Ser Val Ser Pro Asn Ile Thr Gln Leu Phe Gln Lys

355 360 365

Gln Lys Trp Thr Gln Val Asn Pro Ser Pro Ser Cys Arg Cys Ser Thr

370 375 380

Arg Glu Lys Leu Thr Met Leu Pro Glu Cys Pro Glu Gly Ala Gly Gly

385 390 395 400

Leu Pro Pro Pro Gln Arg Thr Gln Arg Ser Thr Glu Ile Leu Gln Asp

405 410 415

Leu Thr Asp Arg Asn Ile Ser Asp Phe Leu Val Lys Thr Tyr Pro Ala

420 425 430

Leu Ile Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Phe Trp Val Asn Glu Gln Arg

435 440 445

Tyr Gly Gly Ile Ser Ile Gly Gly Lys Leu Pro Val Val Pro Ile Thr

450 455 460

Gly Glu Ala Leu Val Gly Phe Leu Ser Asp Leu Gly Arg Ile Met Asn

465 470 475 480

Val Ser Gly Gly Pro Ile Thr Arg Glu Ala Ser Lys Glu Ile Pro Asp

485 490 495

Phe Leu Lys His Leu Glu Thr Glu Asp Asn Ile Lys Val Trp Phe Asn

500 505 510

Asn Lys Gly Trp His Ala Leu Val Ser Phe Leu Asn Val Ala His Asn

515 520 525

Ala Ile Leu Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Arg Ser Pro Glu Glu Tyr

530 535 540

Gly Ile Thr Val Ile Ser Gln Pro Leu Asn Leu Thr Lys Glu Gln Leu

545 550 555 560

Ser Glu Ile Thr Val Leu Thr Thr Ser Val Asp Ala Val Val Ala Ile

565 570 575

Cys Val Ile Phe Ser Met Ser Phe Val Pro Ala Ser Phe Val Leu Tyr

580 585 590

Leu Ile Gln Glu Arg Val Asn Lys Ser Lys His Leu Gln Phe Ile Ser

595 600 605

Gly Val Ser Pro Thr Thr Tyr Trp Val Thr Asn Phe Leu Trp Asp Ile

610 615 620

Met Asn Tyr Ser Val Ser Ala Gly Leu Val Val Gly Ile Phe Ile Gly

625 630 635 640

Phe Gln Lys Lys Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Asn Leu Pro Ala Leu Val

645 650 655

Ala Leu Leu Leu Leu Tyr Gly Trp Ala Val Ile Pro Met Met Tyr Pro

660 665 670

Ala Ser Phe Leu Phe Asp Val Pro Ser Thr Ala Tyr Val Ala Leu Ser

675 680 685

Cys Ala Asn Leu Phe Ile Gly Ile Asn Ser Ser Ala Ile Thr Phe Ile

690 695 700

Leu Glu Leu Phe Glu Asn Asn Arg Thr Leu Leu Arg Phe Asn Ala Val

705 710 715 720

Leu Arg Lys Leu Leu Ile Val Phe Pro His Phe Cys Leu Gly Arg Gly

725 730 735

Leu Ile Asp Leu Ala Leu Ser Gln Ala Val Thr Asp Val Tyr Ala Arg

740 745 750

Phe Gly Glu Glu His Ser Ala Asn Pro Phe His Trp Asp Leu Ile Gly

755 760 765

Lys Asn Leu Phe Ala Met Val Val Glu Gly Val Val Tyr Phe Leu Leu

770 775 780

Thr Leu Leu Val Gln Arg His Phe Phe Leu Ser Gln Trp Ile Ala Glu

785 790 795 800

Pro Thr Lys Glu Pro Ile Val Asp Glu Asp Asp Asp Val Ala Glu Glu

805 810 815

Arg Gln Arg Ile Ile Thr Gly Gly Asn Lys Thr Asp Ile Leu Arg Leu

820 825 830

His Glu Leu Thr Lys Ile Tyr Pro Gly Thr Ser Ser Pro Ala Val Asp

835 840 845

Arg Leu Cys Val Gly Val Arg Pro Gly Glu Cys Phe Gly Leu Leu Gly

850 855 860

Val Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Phe Lys Met Leu Thr Gly Asp

865 870 875 880

Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Ala Thr Val Ala Gly Lys Ser Ile Leu

885 890 895

Thr Asn Ile Ser Glu Val His Gln Asn Met Gly Tyr Cys Pro Gln Phe

900 905 910

Asp Ala Ile Asp Glu Leu Leu Thr Gly Arg Glu His Leu Tyr Leu Tyr

915 920 925

Ala Arg Leu Arg Gly Val Pro Ala Glu Glu Ile Glu Lys Val Ala Asn

930 935 940

Trp Ser Ile Lys Ser Leu Gly Leu Thr Val Tyr Ala Asp Cys Leu Ala

945 950 955 960

Gly Thr Tyr Ser Gly Gly Asn Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Ile Ala

965 970 975

Leu Ile Gly Cys Pro Pro Leu Val Leu Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly

980 985 990

Met Asp Pro Gln Ala Arg Arg Met Leu Trp Asn Val Ile Val Ser Ile

995 1000 1005

Ile Arg Glu Gly Arg Ala Val Val Leu Thr Ser His Ser Met Glu

1010 1015 1020

Glu Cys Glu Ala Leu Cys Thr Arg Leu Ala Ile Met Val Lys Gly

1025 1030 1035

Ala Phe Arg Cys Met Gly Thr Ile Gln His Leu Lys Ser Lys Phe

1040 1045 1050

Gly Asp Gly Tyr Ile Val Thr Met Lys Ile Lys Ser Pro Lys Asp

1055 1060 1065

Asp Leu Leu Pro Asp Leu Asn Pro Val Glu Gln Phe Phe Gln Gly

1070 1075 1080

Asn Phe Pro Gly Ser Val Gln Arg Glu Arg His Tyr Asn Met Leu

1085 1090 1095

Gln Phe Gln Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala Arg Ile Phe Gln Leu

1100 1105 1110

Leu Leu Ser His Lys Asp Ser Leu Leu Ile Glu Glu Tyr Ser Val

1115 1120 1125

Thr Gln Thr Thr Leu Asp Gln Val Phe Val Asn Phe Ala Lys Gln

1130 1135 1140

Gln Thr Glu Ser His Asp Leu Pro Leu His Pro Arg Ala Ala Gly

1145 1150 1155

Ala Ser Arg Gln Ala Gln Asp

1160 1165

Claims (21)

1.一种增加有需要的受试者的视网膜外核层(ONL)厚度的方法，所述方法包括向受试者的视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24中任一项所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ONL的厚度增加3-5μm、4-6μm、5-7μm、6-8μm、7-10μm、9-12μm、11-15μm或更多。

3.一种维持有需要的受试者的视网膜外核层(ONL)厚度的方法，所述方法包括向受试者的视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24中任一项所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在施用所述AAV之后，所述ONL的厚度为约55-70μm、约55-65μm、约60-70μm或约60-65μm。

5.一种降低有需要的受试者的视网膜中脂褐素浓度的方法，所述方法包括向受试者的视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24中任一项所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在施用所述AAV载体后的一段时间后，脂褐素的浓度降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

7.一种降低有需要的受试者的视网膜中双类视黄醇N-视黄基-N-亚视黄基乙醇胺(A2E)浓度的方法，所述方法包括向受试者的视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24中任一项所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在施用所述AAV载体后的一段时间后，A2E的浓度降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

9.一种维持有需要的受试者的视网膜中的外核层(ONL)厚度的方法，所述方法包括：

向受试者的视网膜施用腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含编码ABCA4小基因的转基因，所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9-14和20-24中任一项所示的氨基酸序列，其中向视网膜施用所述AAV载体有效维持ONL厚度；以及

评估受试者视网膜中的脂褐素和/或A2E浓度，

其中脂褐素和/或A2E浓度的降低指示ONL厚度的维持。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在施用所述AAV后至少6个月、至少12个月、至少18个月或至少24个月，所述ONL的厚度为约55-70μm、约55-65μm、约60-70μm或约60-65μm。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述转基因进一步包含有效连接至所述ABCA4小基因的启动子。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组成型启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、增强的鸡β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子或EF1α启动子。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织特异性启动子是眼特异性启动子，任选地是光感受器特异性启动子。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述眼特异性启动子是视网膜劈裂蛋白启动子、K12启动子、视紫红质启动子、视杆细胞特异性启动子、视锥细胞特异性启动子、视紫红质激酶启动子、GRK1启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白近端(IRBP)启动子和视蛋白启动子。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述转基因的侧翼为腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一个ITR是AAV2 ITR。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：9、12和13中任一项所示的氨基酸序列。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述ABCA4小基因编码SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

20.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述AAV载体通过视网膜下注射施用。

21.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或怀疑患有眼底黄色斑点症。