CN117904110A - 用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用 - Google Patents

用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117904110A
CN117904110A CN202311802122.8A CN202311802122A CN117904110A CN 117904110 A CN117904110 A CN 117904110A CN 202311802122 A CN202311802122 A CN 202311802122A CN 117904110 A CN117904110 A CN 117904110A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sirna
nucleotide sequence
sense strand
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311802122.8A
Other languages
English (en)
Inventor
杜宏
陶棋
张佩琢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Genepharma Co ltd
Original Assignee
Suzhou Genepharma Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Genepharma Co ltd filed Critical Suzhou Genepharma Co ltd
Priority to CN202311802122.8A priority Critical patent/CN117904110A/zh
Publication of CN117904110A publication Critical patent/CN117904110A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21106—Hepsin (3.4.21.106)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用，属于生物技术领域。本发明提供了用于抑制DPP4的siRNA，实验证明所述siRNA均对DPP4具备高抑制活性。本发明还提供了用于抑制DPP4的经修饰的siRNA，经修饰的siRNA有较好的DPP4抑制效果，在体内验证经修饰的siRNA有大于70％的抑制效果，优选的可以达到85％的抑制效果。

Description

用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用
技术领域
本发明涉及用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用，属于生物技术领域。
背景技术
在人体内，DPP-4是细胞表面的一种跨膜丝氨酸蛋白酶，主要在小肠、肝、肾、胰腺、脾、胎盘中表达。DPP-4基本结构主要包括：细胞外N末端区域，跨膜区域，胞外区域。胞外区域根据结构及功能特点又分为α/β水解酶区域和八片层β螺旋区域。α/β水解酶区域含有催化三联体Ser630-Asp708-His740，并优先作用于以脯氨酸或丙氨酸作为倒数第二个N端残基的多肽(如GLP-1)，将其水解。
在营养物质特别是在葡萄糖刺激下，肠道细胞可分泌一种葡萄糖浓度依赖性的“胰高血糖素样肽-1”(GLP-1)。GLP-1进入血液后，可刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，而且抑制胰高血糖素的分泌，降低血糖水平。而DPP-4在人体中的主要作用便是参与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的水解，从而升高人体血糖水平，一旦DPP-4的活性被抑制，则可以解除DPP-4对GLP-1的水解，有利于血糖水平的降低。
DPP-4抑制剂能够抑制DPP-4对GLP-1的降解，提高内源性GLP-1的水平。这类药物的作用特点并不是一味机械地降低血糖，而是可以根据患者体内的血糖水平来“灵活”的进行调整，从而更贴近自身的代谢机制：当血糖高时它通过对GLP-1的分解来促进胰岛β细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，降低血糖；而当血糖浓度恢复正常时，由于GLP-1只在当人体进食血糖升高时才会产生，因此在正常血糖和低血糖时不会产生GLP-1，此时DPP-4抑制剂也不会发生降糖的作用，从而避免出现低血糖。
DPP-4抑制剂除了降糖作用外还有其他药理作用。DPP-4抑制剂对心血管有潜在的保护作用，包括降低动脉粥样硬化的风险；对肾脏疾病的发展也有保护作用，包括改善肾的纤维化与降低蛋白尿。因此，DPP-4抑制剂在糖尿病及其各种并发症患者中具有广泛的潜在应用前景。
小干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)，通常是长度20到25个核苷酸长度的双链RNA，主要通过RNA干扰(RNAi)机制，以带有专一性的方式调节基因的表达，实现治疗疾病的目的。因此，开发出一种siRNA抑制DPP4的生成，将是一种治疗糖尿病及其各种并发症的有效方式。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于抑制DPP4的siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链至少部分地反向互补形成双链区，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.4所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.6所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.8所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.10所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.12所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.14所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.16所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.18所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.20所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.22所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.24所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.26所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.28所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.30所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.32所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.34所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.36所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.38所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.40所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.42所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.44所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.46所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.48所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.50所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.51所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.52所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.54所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.56所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.58所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.60所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.61所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.62所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.63所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.64所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.65所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.66所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.67所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.68所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.69所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.70所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.71所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.72所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.73所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.74所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.75所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.76所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.77所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.78所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.79所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.80所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.81所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.82所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.83所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.84所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.85所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.86所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.87所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.88所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.89所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.90所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.91所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.92所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.93所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.94所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.95所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.96所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.97所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.98所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.99所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQID NO.100所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.101所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQ ID NO.102所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正义链和反义链为例，所述正义链包含：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性且保留了其所源自的序列的生物学功能的核苷酸序列，所述反义链包含：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性且保留了其所源自的序列的生物学功能的核苷酸序列。剩余正义链和反义链的核苷酸序列君具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性且保留了其所源自的序列的生物学功能的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA通过固相合成或液相合成制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA中的核苷酸各自独立地为经修饰或未经修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA中的每个核苷酸均为未经修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA中的部分或全部核苷酸为经修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制DPP4基因表达的功能明显削弱或丧失。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为经修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链或反义链中的至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链和/或反义链中的全部核苷酸均为经修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制DPP4基因表达的功能明显削弱或丧失。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为经氟代修饰的核苷酸或非经氟代修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述修饰为化学修饰，所述化学修饰选自甲氧基修饰、氟代修饰或硫代磷酸酯基连接中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(1)所示的结构。所述非经氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
在本发明的一种实施方式中，所述核糖基2'位的羟基被非经氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在本发明的一种实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为2'-甲氧基(2'-OMe)修饰的核苷酸，如式(2)所示；2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰的核苷酸，如式(3)所示，2'-氨基(2'-NH2)修饰的核苷酸如式(4)所示，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(5)所示：
在本发明的一种实施方式中，所述经氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述反义链的至少第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述经氟代修饰的核苷酸位于正义链和反义链中，所述正义链中经氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述反义链中经氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，所述反义链的至少第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述正义链的第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非经氟代修饰的核苷酸，在所述反义链中，所述反义链的第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非经氟代修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，经甲氧基修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的至少第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸或无环核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述桥联的核苷酸(bridgednucleic acid，简称BNA)是指受约束的或不能接近的核苷酸，BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构，通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(6)所示，ENA如式(7)所示，cET BNA如式(8)所示：
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。
在本发明的一种实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
在本发明的一种实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(9)所示结构的硫代磷酸酯基：
在本发明的一种实施方式中，所述硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。
在本发明的一种实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。
在本发明的一种实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。
在本发明的一种实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在本发明的一种实施方式中，所述硫代磷酸酯基连接的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位为通过硫代磷酸酯基连接的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述反义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位为通过硫代磷酸酯基连接的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA通过使用具有相应修饰的核苷酸单体将修饰的核苷酸引入。
本发明还提供了一种抑制DPP4的产品，所述产品包含有效成分和药学上可接受的载体，所述有效成分为上述siRNA或上述经修饰的siRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药物组合物或试剂盒。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药物组合物，所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magneticnanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbonnanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，可以是各组分常规的含量。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物中，所述有效成分和药学上可接受的载体的重量比为1:(1～500)。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物中，所述有效成分和药学上可接受的载体的重量比为1:(1～50)。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述pH缓冲液可以为pH值7.5～8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5～8.5的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01～30重量％。
在本发明的一种实施方式中，所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。
在本发明的一种实施方式中，所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200～700毫渗/升(mOSM/L)，根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物用于静脉注射给药。
在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。
在本发明的一种实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。
在本发明的一种实施方式中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于CN108220295B(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述siRNA偶联物中药学上可接受的靶向基团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)，N-乙酰半乳糖胺是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)结合的配体，去唾液酸糖蛋白受体是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体，N-乙酰半乳糖胺作为靶向分子以将小RNA递送至肝脏。
在本发明的一种实施方式中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价；所述的一价、二价、三价、四价分别指siRNA分子与含有作为靶向基团的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的偶联基团形成siRNA偶联物后，该siRNA偶联物中siRNA分子与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的摩尔比为1:1、1:2、1:3或1:4。
在本发明的一种实施方式中，siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的偶联基团偶联时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价或四价。
在本发明的一种实施方式中，siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的偶联基团偶联时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价。
在本发明的一种实施方式中，靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。
在本发明的一种实施方式中，接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式，可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本文。
在本发明的一种实施方式中，GalNAc和siRNA分子所形成的siRNA偶联物，其结构如下式(10)所示：
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中的siRNA、药学上可接受的载体和/或辅料可以单独存在，以其中两种或两种以上的混合物的形式存在，或者以最终药物组合物的形式存在。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中，药学上可接受的载体为含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中，药学上可接受的载体为混合物或独立存在。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中的siRNA、药学上可接受的载体和/或辅料以液体形式、干燥形式或冻干形式提供。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中的siRNA、药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中，包含用于提供siRNA的容器、用于提供含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的一个或多个容器，任选地，包含用于提供辅料的容器。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种特定应用所必需或有益的组分，所述组分选自：
一种或多种用于实现所希望的细胞转染的组分；
一种或多种用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分；
一种或多种缓冲剂；
阳性或阴性对照样品；
赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在本发明的一种实施方式中，所述一种或多种用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分为一种或多种额外的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包含无菌水、生理盐水和PBS中的一种或多种。
本发明还提供了上述siRNA或上述产品在制备预防、诊断和/或治疗由DPP4引起的病理状况或疾病的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述由DPP4引起的疾病为糖尿病。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了用于抑制DPP4的经修饰的siRNA，所述修饰包括甲氧基修饰、氟代修饰和硫代磷酸酯基连接，通过GalNAc偶联后，在单次给药的小鼠体内验证，3mg/kg的剂量下通过对由如SEQ ID NO.1所示的正义链和如SEQ ID NO.2所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA、通过对由如SEQ ID NO.7所示的正义链和如SEQ ID NO.8所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA、通过对由如SEQ ID NO.29所示的正义链和如SEQ IDNO.30所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA、通过对由如SEQ ID NO.49所示的正义链和如SEQ ID NO.50所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA、通过对由如SEQID NO.91所示的正义链和如SEQ ID NO.92所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA有非常突出的抑制效果(抑制率大于70％)，其中通过对由如SEQ ID NO.29所示的正义链和如SEQ ID NO.30所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA的抑制率大于85％。
通过多剂量实验验证得到通过对由如SEQ ID NO.91所示的正义链和如SEQ IDNO.92所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA有非常突出的抑制效果(抑制率大于75％)。
通过对由如SEQ ID NO.1、7、29、49或91所示的正义链和如SEQ ID NO.2、8、30、50或92所示的反义链化学修饰后得到的经修饰的siRNA与目的基因片段的靶向关系，得到5条经修饰的siRNA均具备明显的量效关系，且在0.1nM的浓度下依旧有较好的DPP4抑制效果。
附图说明
图1：用于抑制DPP4的经修饰的siRNA偶联物(DPP4-4M、DPP4-22M、DPP4-183M、DPP4-493M、DPP4-239M)在小鼠体内的多剂量试验qPCR检测结果。
图2：用于抑制DPP4的经修饰的siRNA偶联物(DPP4-4M、DPP4-22M、DPP4-183M、DPP4-493M、DPP4-239M)在Hep 3B细胞中qPCR检测结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中，DPP4 mRNA是指具有GeneBank注册号为NM_001935.4、NM_001379605.1、NM_001379606.1、XM_005573317.3、XM_005573318.3、XM_015432296.2、NM_010074.3、NM_001159543.1所示序列的mRNA。进一步地，若无其它说明，本公开中所使用的术语“靶基因”是指转录上述DPP4mRNA的基因，术语“靶mRNA”是指上述DPP4 mRNA。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中大写字母C、G、U、A表示核糖核苷酸；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基修饰。
下述实施例中“经修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
下述实施例中“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U)相配对)；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出链的序列。
下述实施例中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA偶联物的制备方法时，除非特别说明，核苷单体(nucleoside monomer)是指，根据欲制备的siRNA或siRNA偶联物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
下述实施例中“偶联”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“偶联物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA偶联物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA偶联物应根据上下文，理解为多个siRNA偶联物的总称或者某个化学式所示的siRNA偶联物。在本公开的上下文中，“偶联分子”应当理解为可通过反应偶联至siRNA，最终形成本公开的siRNA偶联物的特定化合物。
下述实施例中“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代”的“烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
下述实施例中“治疗”、“减轻”或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
下述实施例中“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种病理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
除非特别说明，下述实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照《分子生物学(第四版)》(亚历山大·麦克伦南(AlexanderMcLennan)等编著,2019)所记载的方法进行。
下述实施例中涉及的实验细胞为Hep3B，购自中国科学院细胞库；
实验动物为C57BL/6J小黑鼠，雌性，4～6周和6～8周，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，所有实验动物都被饲养在苏州吉玛基因股份有限公司SPF级动物房。动物昼夜12小时光暗变替，食物与水自由摄取，动物适应环境1周后开始实验。研究用实验动物是的使用和操作均符合苏州吉玛基因股份有限公司动物管理委员会关于实验动物与动物福利的要求。
下述实施例中涉及的siRNA为通过亚磷酰胺固相合成的siRNA序列。
下述实施例中涉及的针对DPP4基因的siRNA、siRNA偶联物或作为阴性对照的siRNA、siRNA偶联物转染细胞时，使用Lipofectamine 2000(购自Invitrogen)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。进行qPCR检测时，使用HiScript III RT SuperMixfor qPCR(购自Vazyme)作为反转录试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
实施例1：一种用于抑制DPP4的siRNA
本实施例提供了一种用于抑制DPP4的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列基于靶mRNA设计得到，见表1，由苏州吉玛基因股份有限公司合成了具有以下序列的siRNA分子。
表1.抑制DPP4的siRNA的核苷酸序列
实施例2：一种用于抑制DPP4的经修饰的siRNA
本实施例提供了一种用于抑制DPP4的经修饰的siRNA，所述经修饰的siRNA包括DPP4-4M至DPP4-566M，所述DPP4-4M至DPP4-566M的正义链分别为通过对选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQID NO.51、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQID NO.63、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73、SEQID NO.75、SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.85、SEQID NO.87、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQID NO.99和SEQ ID NO.101所示序列化学修饰后得到的，按照5'末端到3'末端的方向，第1位与第2位、第2位与第3位的核苷酸通过硫代磷酸酯基连接，第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸。DPP4-4M至DPP4-566M的反义链分别为通过对选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.52、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.74、SEQ IDNO.76、SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.86、SEQ IDNO.88、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.96、SEQ ID NO.98、SEQ IDNO.100和SEQ ID NO.102所示序列化学修饰后得到的，按照5'末端到3'末端的方向，第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位的核苷酸通过硫代磷酸酯基连接，第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸。
实验例1：经修饰的siRNA在小鼠体内的单剂量试验(3mg/kg)
本实验例提供了经修饰的siRNA在小鼠体内的单剂量试验，所述剂量水平为3mg/kg，实验过程如下：
阿尔尼拉姆公司(Alnylampharmaceuticals,Inc.)首次报道了基于GalNAc缀合技术的siRNA在小鼠体内发挥干扰活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)，文献报道了偶联至三簇GalNAc的siRNA，在体内和体外实验中均展现了良好的递送活性，参照上述文献中的制备方法，使用GalNAc偶联实施例2所示的DPP4-4M～DPP4-566M，得到GalNAc偶联siRNA：DPP4-4MG～DPP4-566MG在每组1只C57BL/6J小黑鼠(雌性，4～6周龄)单次皮下施用3mg/kg的单次剂量的GalNAc偶联siRNA或生理盐水对照。
于施用后的第14天，牺牲小黑鼠，收集肝脏样本并于液态氮中速冻，提取肝脏mRNA并通过RT-qPCR方法进行分析，RT-qPCR的检测步骤如下：
步骤一：RNA提取：
1)取小鼠肝组织20mg，加入1mL Trizol Lysis Buffer(购自Life technology，货号为410701)后研磨裂解组织，将溶解完全的混合液转移至RNase-free的1.5mL离心管；剧烈震荡15s左右使组织细胞充分裂解，室温(25℃)静置5min；
2)小心打开管盖，加入200μL三氯甲烷(购自上海凌峰化学试剂有限公司，货号为20140925)；剧烈震荡20s，室温(25℃)静置3min；4℃，12000×g，离心20min；
3)离心结束后，小心取出离心管到离心管架上，吸取上清水相到新的2.0mL离心管中，加入上清水相1.5倍体积的无水乙醇(购自江苏强盛功能化学股份有限公司，货号为20210802)，颠倒混匀；
4)取带有收集管的纯化柱(购自VWI公司，货号为11822AG0627)，向其加入700μL步骤3)的混合液，静置2min；4℃，10000×g，离心1min，弃去滤液；剩余混合液重复上述步骤操作；
5)向纯化柱中加入700μL 80％(v/v)的乙醇，4℃，10000×g，离心1min，弃去滤液；
6)向纯化柱中加入700μL 80％(v/v)的乙醇，4℃，10000×g，离心1min，弃去滤液；
7)将纯化柱4℃，10000×g，空离心2min；
8)离心结束后，小心取出带有收集管的纯化柱(如收集管内有液体，请注意液体切勿溅到纯化柱上)，弃收集管，将纯化柱放入新的1.5mL离心管中，向纯化柱中加入100μLDEPC水，室温(25℃)静置2min；4℃，10000×g，离心1min；
9)收集步骤8)中的RNA溶液用于后续实验；
步骤二：RNA反转录
使用HiScript III RT SuperMix for qPCR(购自诺唯赞公司，货号为R323-01)实验步骤参照产品说明书；按试剂盒说明书中反转录操作步骤配制反转录反应体系20μL，对细胞的总RNA进行反转录；反转录的条件为：将反转录反应体系置于37℃孵育15min，然后85℃孵育5s，向各反转录反应体系加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液；
步骤三：qPCR反应体系配置
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液4μL做模板，使用AceQUniversal SYBR qPCR MasterMix试剂盒(购自Vazyme，货号为Q511-02)提供的试剂，在冰盒上按表2配置qPCR反应体系20μL，其中，Primer1和Primer2分别为用于扩增目标基因DPP4和内参基因GAPDH的PCR引物序列(如表3所示)，将各qPCR反应体系置于ABIStepOnePlusReal-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因DPP4和内参基因GAPDH的产物W；产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因DPP4和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因DPP4和内参基因GAPDH的Ct值。
表2.RNA扩增反应体系
试剂名称 单孔体积(μL)
2×AceQUniversalSYBRqPCRMasterMix 10
Primer1(10μM) 0.4
Primer2(10μM) 0.4
TemplateDNA/cDNA 4
ddH2O 5.2
总体积 20ul
表3.引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因DPP4进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组4个样本各自的ΔCt(对照组)的算术平均值；从而，测试组和对照组的每个样本均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组DPP4 mRNA的表达水平进行归一化，定义对照组DPP4mRNA表达水平为100％。
测试组DPP4 mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
测试组DPP4 mRNA抑制率＝1-测试组DPP4 mRNA相对表达水平
将DPP4 mRNA水平与内参基因GAPDH进行比较，将该值归一化为生理盐水对照组的平均值，数据表示为相对于生理盐水对照组的百分比。
表4.siRNA的抑制率
51条siRNA的在靶活性结果如表4所示，可知DPP4-4MG、DPP4-22MG、DPP4-183MG、DPP4-493MG和DPP4-239MG共5条siRNA偶联物均具备高抑制活性，抑制率＞70％，其中DPP4-183MG的抑制率＞85％。
实验例2：经修饰的siRNA在小鼠体内的多剂量试验
本实验例提供了经修饰的siRNA在小鼠体内的多剂量试验，所述剂量水平为9mg/kg和3mg/kg，实验过程如下：
根据实验例1的结果，选用实施例2所示的使用GalNAc偶联的DPP4-4M、DPP4-22M、DPP4-183M、DPP4-493M、DPP4-239M即DPP4-4MG、DPP4-22MG、DPP4-183MG、DPP4-493MG和DPP4-239MG，对每组各3只C57BL/6J小黑鼠(雌性，6～8周)皮下施用3mg/kg或9mg/kg剂量的GalNAc偶联siRNA或生理盐水组和NC-005组做对照，NC-005组为siRNA为与DPP4无关的阴性对照siRNA，其正义链为(5’-3’)：CfsAmsCfUmUfAmCfGmCfUmGfAmGfUmAfCmUfUmCfGmAf，反义链为：UmsCfsGmAfAmGfUmAfCmUfCmAfGmCfGmUfAmAfGmUfGmsAfsUm。
施用要求如表5所示，施用后的第14天，牺牲小黑鼠，收集肝脏样本并于液态氮中速冻，提取肝脏mRNA并通过RT-qPCR方法进行分析。
表5.3mg/kg多剂量试验施用要求
根据图1，在多剂量给药的小鼠体内验证，DPP4-493MG依旧有非常突出的抑制效果。
实验例3：用于抑制DPP4的经修饰的siRNA的在细胞Hep3B活性检测
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，以下称qPCR)对本发明的siRNA化合物在细胞Hep3B中对DPP4 mRNA的相对抑制水平进行了测定：
1.将人肝癌细胞Hep3B铺于96孔板的新鲜MEM培养基(购自Gibco，货号11095-080)中培养24小时。将所培养的细胞用无PS(青霉素链霉素混合液)的MEM培养基重悬，制成密度为5.55×104/ml的细胞悬液，铺到96孔板中，每孔加90μL细胞悬液，即5000个细胞/孔。
2.将待测siRNA的干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水(ULtraPureDistilledWater)溶解，配制成100μM siRNA母液。
3.配制0.1nM的siRNA转染稀释液
(1)10μM siRNA贮备液配制：取100μM上述siRNA母液2μl，加入18μl超纯蒸馏水，得到浓度为10μM siRNA贮备液；
(2)0.1nM siRNA转染稀释液配制：取10μM siRNA贮备液2μl，加入18μl超纯蒸馏水，得到浓度为1μM siRNA稀释液；取1μM siRNA稀释液2μl，加入18μl超纯蒸馏水，得到浓度为0.1μM siRNA稀释液；再取0.1μM siRNA稀释液2μl，加入98μl超纯蒸馏水，得到浓度为2nMsiRNA稀释液；再加入等体积的Lipofectaine RNAiMax转染试剂稀释液(将LipofectaineRNAiMax转染试剂3μl，加入97μl Opti-medium，得到Lipofectaine RNAiMax转染试剂稀释液)得到1nM siRNA稀释液；取上述1nM siRNA稀释液10μl加入96孔板中所转染培养的Hep3B细胞，得siRNA终浓度为0.1nM。
4.转染后培养细胞48小时，设置三个复孔。另外设置MOCK，NC05作为对照，MOCK组为只加Lipofectamine RNAiMAX试剂不加任何siRNA的组别；NC05组为siRNA为与DPP4无关的阴性对照siRNA，其正义链为(5’-3’)：CfsAmsCfUmUfAmCfGmCfUmGfAmGfUmAfCmUfUmCfGmAf，反义链为：UmsCfsGmAfAmGfUmAfCmUfCmAfGmCfGmUfAmAfGmUfGmsAfsUm。
5.利用磁珠法细胞总RNA提取试剂盒(购自苏州吉玛基因股份有限公司，货号E31008)根据试剂盒说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。
6.RNA反转录
使用HiScript III RT SuperMix for qPCR(购自诺唯赞公司，货号为R323-01)实验步骤参照产品说明书；按试剂盒说明书中反转录操作步骤配制反转录反应体系20μL，对细胞的总RNA进行反转录；反转录的条件为：将反转录反应体系置于37℃孵育15min，然后85℃孵育5s，向各反转录反应体系加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液；
7.qPCR反应体系配置
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液4μL做模板，使用AceQUniversal SYBR qPCR MasterMix试剂盒(购自Vazyme，货号为Q511-02)提供的试剂，在冰盒上按表6配置qPCR反应体系20μL，其中，Primer1和Primer2分别为用于扩增目标基因DPP4和内参基因GAPDH的PCR引物序列(如表7所示)，将各qPCR反应体系置于ABIStepOnePlusReal-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因DPP4和内参基因GAPDH的产物W；产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因DPP4和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因DPP4和内参基因GAPDH的Ct值。
表6.RNA扩增反应体系
试剂名称 单孔体积(μL)
2×AceQUniversalSYBRqPCRMasterMix 10
Primer1(10μM) 0.4
Primer2(10μM) 0.4
TemplateDNA/cDNA 4
ddH2O 5.2
总体积 20ul
表7.引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因DPP4进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组4个样本各自的ΔCt(对照组)的算术平均值；从而，测试组和对照组的每个样本均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组DPP4 mRNA的表达水平进行归一化，定义对照组DPP4mRNA表达水平为100％。
测试组DPP4 mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
将DPP4 mRNA水平与内参基因GAPDH进行比较，将该值归一化为生理盐水对照组的平均值，数据表示为相对于生理盐水对照组的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差，结果见图2，本申请的siRNADPP4-4MG、DPP4-183MG和DPP4-493MG均具备明显的量效关系，在0.1nM下均可显著抑制DPP4基因的表达，其中，DPP4-183MG在0.1nM下的抑制效果最好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.用于抑制DPP4的siRNA，其特征在于，所述siRNA含有正义链和反义链，所述正义链能够和反义链至少部分地反向互补形成双链区，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQ IDNO.30所示的核苷酸序列，或，
其中，所述正义链包含如SEQ ID NO.91所示的核苷酸序列，所述反义链包含如SEQ IDNO.92所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为经修饰的核苷酸。
3.如权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述修饰为化学修饰，所述化学修饰选自甲氧基修饰、氟代修饰和硫代磷酸酯基修饰中的一种或多种。
4.如权利要求2～3中任一项所述的siRNA，其特征在于，经氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第7、8、9位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸，所述反义链的至少第2、6、14、16位的核苷酸为经氟代修饰的核苷酸。
5.如权利要求2～3中任一项所述的siRNA，其特征在于，经甲氧基修饰的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的至少第1、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21位的核苷酸为经甲氧基修饰的核苷酸。
6.如权利要求2～3中任一项所述的siRNA，其特征在于，所述硫代磷酸酯基连接的核苷酸位于核苷酸序列反义链和正义链中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接，所述反义链的至少第1位与第2位、第2位与第3位、第19位与第20位、第20位与第21位的核苷酸之间通过硫代磷酸酯基连接。
7.如权利要求2～3所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链3’末端偶联有配体，所述配体为GalNAc。
8.一种抑制DPP4的产品，其特征在于，所述产品包含有效成分和药学上可接受的载体，所述有效成分为权利要求1～7中任一项所述的siRNA。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为药物组合物或试剂盒。
10.权利要求1～7中任一项所述的siRNA或权利要求8～9中任一项所述的产品在制备预防、诊断和/或治疗由DPP4引起的病理状况或疾病的产品中的应用。
CN202311802122.8A 2023-12-26 2023-12-26 用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用 Pending CN117904110A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311802122.8A CN117904110A (zh) 2023-12-26 2023-12-26 用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311802122.8A CN117904110A (zh) 2023-12-26 2023-12-26 用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117904110A true CN117904110A (zh) 2024-04-19

Family

ID=90690405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311802122.8A Pending CN117904110A (zh) 2023-12-26 2023-12-26 用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117904110A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106535917B (zh) 用于抑制α-1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法
CN113748208A (zh) 用于抑制中枢神经系统中的基因表达的组合物和方法
CN110799647A (zh) 双尾自递送sirna及相关的方法
KR20180104075A (ko) IL4Rα, TRPA1, 또는 F2RL1을 표적화하는 RNA 복합체를 사용한 아토피 피부염 및 천식의 치료
TW202120689A (zh) 用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子
WO2023041079A1 (zh) Lpa抑制剂及其用途
CN115851723A (zh) 一种抑制lpa基因表达的rna抑制剂及其应用
TW202020152A (zh) 調節rtel1表現之寡核苷酸
WO2023134705A1 (zh) 抑制angptl3表达的rna干扰剂及其用途
CN117070517A (zh) 用于抑制血管紧张素原表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
CN111378657B (zh) 抑制COL1A1基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
CN116769780A (zh) 用于抑制补体因子B表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及其用途
CN117858949A (zh) 用于抑制粘蛋白5AC(MUC5AC)的表达的RNAi试剂、其组合物及其使用方法
CN117904110A (zh) 用于抑制DPP4的siRNA及其修饰物与应用
CN116478997B (zh) 用于抑制FGL1的siRNA及其修饰物与应用
EP4023297A1 (en) Nucleic acid medicine for targeting gastric cancer molecule
KR20210144601A (ko) 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 코로나바이러스감염증-19〔covid-19〕치료용 조성물
CN114901821A (zh) Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
EP4446414A1 (en) Antisense oligonucleotide complex
CN111378658B (zh) 抑制TIMP-1基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
WO2023176920A1 (ja) コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸
RU2822093C1 (ru) Нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии lpa в клетке
WO1998049287A2 (en) Antisense oligonucleotides specific for thymidylate synthase
KR20240116658A (ko) Gfral을 표적으로 하는 안티센스 올리고머 및 이의 용도
WO2024160147A1 (zh) 抑制血管生成素样蛋白8基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination