CN117897391A

CN117897391A - 制备肽文库或肽的方法

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Publication number: CN117897391A
Application number: CN202280050149.3A
Authority: CN
Inventors: C·海尼斯; S·哈贝希安; G·K·莫图库里; M·许特尔; M·默茨; G·桑古阿尔; Z·博格纳尔; A·L·尼尔森
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2024-04-16
Also published as: EP4341272A1; JP2024518615A; KR20240007926A; BR112023023738A2; AU2022275977A1; WO2022242993A1; CA3216301A1

Abstract

本发明涉及一种制备肽文库或分离肽的方法，所述方法包括(a)从固相释放一种或多种线性二硫醇肽，其在所述一种或多种肽的N末端区域中携带巯基，并且通过所述一种或多种肽的C末端区域中的二硫键固定在所述固相上，所述释放是通过以下进行的：(i)还原所述二硫键，从而从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽的物质，其中所述物质是挥发性的并且可通过蒸发除去，或(ii)碱，其使所述一种或多种线性二硫醇肽的N末端区域中的巯基去质子化，从而诱导分子内二硫键交换，从而以一种或多种环肽的形式从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽。

Description

制备肽文库或肽的方法

本发明涉及一种用于制备肽文库或分离肽(isolated peptide)的方法，所述方法包括(a)从固相释放一种或多种线性二硫醇肽(linear dithiol peptide)，其在所述一种或多种肽的N-末端区域携带巯基，并且通过所述一种或多种肽的C末端区域中的二硫键固定在所述固相上，所述释放是通过以下进行的：(i)还原所述二硫键(disulfide bridge)，从而从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽的物质(agent)，其中所述物质是挥发性的并且可通过蒸发除去，或(ii)碱，其使所述一种或多种线性二硫醇肽的N末端区域中的巯基去质子化，从而诱导分子内二硫键交换(disulfide exchange)，从而以一种或多种环肽(cyclic peptide)的形式从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽。

在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和制造商手册。这些文献的公开内容虽然被认为与本发明的专利性无关，但其全部内容援引加入本文。更具体地，所有参考文献均援引加入，其程度如同每个单独的文献被具体且单独地指示援引加入一样。

肽文库、特别是环肽文库(一类大环分子)受到了制药行业的极大关注，因为可以对其筛选出具有与挑战性靶标结合的能力的肽，因为基于传统小分子很难甚至不可能生成配体。

目前，已有40多种环肽被批准作为药物，100多种正在临床试验的不同阶段进行评估(A.Zorzi等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2017,38,24-29)。基于蛋白质表位设计环肽配体或从基因编码的肽的大型组合文库中分离靶特异性环肽的创新策略为该领域的发展增添了额外的活力(A.Luther等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2017,38,45-51；C.Sohrabi等人,Nat.Rev.Chem.,2020,4,90-101)。

特别令人感兴趣的是大环分子，其尺寸足够小，理想情况下远低于一千道尔顿(kDA)，并且极性表面积小，使细胞内靶标触手可及。高度关注的大环分子包括小环肽、不基于肽的大环结构、或含有肽和非肽组分的大环结构。然而，由于商业提供的大环化合物的数量相对较少，或者缺乏有效合成新大环化合物文库的方法，因此难以开发与感兴趣的靶标结合并可渗透膜以到达细胞内靶标的大环配体。

大环化合物合成中的一个困难步骤是将线性分子转变为环状分子。大多数反应的大环化产率远低于90％，并且不同前体(例如不同的线性肽序列)的产率存在很大差异，这是文库合成中的一个问题。如Asinex、ChemBridge或Polyphor等领先供应商提供的大环化合物文库均基于在大环化步骤后单独纯化的分子，因为未经纯化的产物对于大多数化合物而言纯度不够。纯化的需要限制了可以并行产生的大环化合物的数量，从而限制了文库规模，对于商业提供的文库而言低于30,000个分子。

大环化反应通常在较宽的底物范围内表现出高环化产率，通常高于90％，是通过双亲电试剂如双(溴甲基)苯(S_N2反应)、双(溴乙酰胺)苯(S_N2反应)、卤代丙酮(S_N2反应)、乙烯基亚砜(Michael加成)或六氟苯(S_NAr反应)，通过位于肽远端的两个硫醇基团对所述肽进行环化(H.Jo等人,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,17704–17713；P.Timmerman等人,ChemBioChem,2005,6,821–824；N.Assem等人,Angew.Chemie-Int.Ed.,2015,54,8665–8668；S.S.Kale等人,Nat.Chem.,2018,10,715–723)。这种反应用于开发模拟线性或非线性表位的(双)环肽(P.Timmerman等人,ChemBioChem,2005,6,821–824)，通过噬菌体展示或其他展示技术进化(双)环肽(C.Heinis等人,Nat.Chem.Biol.,2009,5,502-507)，以稳定螺旋构象中的α-螺旋肽(H.Jo等人,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,17704-17713)，或出于其他目的将肽环化。

最近，通过用大约20种不同的双亲电试剂组合环化大量线性二硫醇肽，合成了分子量低于1千道尔顿的大型环肽文库(Laboratory of Therapeutic Proteins andPeptides,EPFL,Group Heinis的未公布的结果)。将二硫醇肽和环化试剂的不同组合在384微孔板的不同孔中混合。高环化产率使我们能够筛选环肽以与蛋白质靶标结合，而无需事先纯化。省略限制通量的纯化步骤使得可以筛选大型文库。

使用双亲电试剂的组合肽环化策略需要大量具有不同序列的二硫醇肽。

与用于鉴定先导肽的方法无关，肽文库和肽药物的开发通常涉及合成数十到数百种肽变体的多个迭代环化，以改善关键性质，例如结合亲和力、特异性、稳定性、药代动力学性质等，从而制备大量的肽。

环肽疗法开发中的另一个主要瓶颈是合成后肽的色谱纯化，即使是自动化和优化的，由于每种肽的顺序处理和高试剂消耗(溶剂)，其成本也很高。需要纯化的主要原因是大环化反应，这通常是环肽合成中最困难的步骤(C.J.White等人,Nat.Chem.,2011,3,509-524)。大多数大环化反应的产率低于90％，并且效率通常根据肽序列和长度而有很大差异。还需要进行色谱纯化以去除为肽释放而添加的试剂和清除剂，以及在整体脱保护期间产生的侧链保护基副产物。

从上文明显看出，迫切需要新方法，特别是需要不太复杂的制备步骤来产生大型肽文库或可以加入到肽文库中的一种或多种肽的方法，其中随后可以针对肽疗法对所述肽文库进行筛选。本发明解决了这种需要。

本发明在第一方面涉及用于制备肽文库或分离肽的方法，所述方法包括(a)从固相释放一种或多种线性二硫醇肽，其在所述一种或多种肽的N末端区域中携带巯基，并且通过所述一种或多种肽的C末端区域中的二硫键固定在所述固相上，所述释放是通过以下进行的：(i)还原所述二硫键，从而从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽的物质，其中所述物质是挥发性的并且可通过蒸发除去，或(ii)碱，其使所述一种或多种线性二硫醇肽的N末端区域中的巯基去质子化，从而诱导分子内二硫键交换，从而以一种或多种环肽的形式从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽。

术语“包含/包括”通常以包括的含义使用，也就是说允许存在一个或多个特征或组分。术语“包含”和“包括”还涵盖更受限制的术语“由……组成”。

如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括其复数指代物，除非上下文另外明确指出。

如本文所用，术语“肽”是指包含至少一个氨基酸和至少一个肽键的聚合物。所述肽优选包含多个氨基酸，例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个氨基酸。所述肽还可以包含非氨基酸分子砌块(building block)和非肽键。所附实施例中描述的许多肽在其末端含有诸如巯基丙酸(MPA)和半胱胺(MEA)的分子砌块，它们不是氨基酸，因为它们不含有氨基(在MPA的情况下)或不含有羧酸(在MEA的情况下)。

含有硫醇基团并适合掺入肽中、特别是掺入C末端的非氨基酸分子砌块(如MEA)的进一步实例是3-氨基丙烷-1-硫醇、3-(甲基氨基)丙烷-1-硫醇、(Z)-4-氨基丁-2-烯-1-硫醇、哌啶-4-硫醇、4-(巯甲基)哌啶和3-(巯甲基)氮杂环丁烷；参见下表和结构式。在这些非氨基酸分子砌块中，具有仲胺的分子砌块特别优选用于开发可透过膜的大环化合物，因为仲胺和(相邻氨基酸的)羧酸的偶联产生酰胺键而不用氢键供电子团。

编号	名称
		1	3-氨基丙烷-1-硫醇
2	3-(甲基氨基)丙烷-1-硫醇
		3	(Z)-4-氨基丁-2-烯-1-硫醇
4	哌啶-4-硫醇
		5	4-(巯甲基)哌啶
6	3-(巯甲基)氮杂环丁烷

含有硫醇基团并适合掺入肽中、特别是掺入在N-末端的非氨基酸分子砌块(如MPA)的进一步实例是2-巯基乙酸、(R)-2-巯基丙酸、5-(巯甲基)呋喃-2-羧酸和3-(巯甲基)苯甲酸；参见下表和结构式。

编号	名称
		1	2-巯基乙酸
2	(R)-2-巯基丙酸
		3	5-(巯甲基)呋喃-2-羧酸
4	3-(巯甲基)苯甲酸

各种其他非氨基酸分子砌块也适合掺入二硫醇肽中，特别是在内部位置。例如，分子砌块A-COOH可以与固相上先前残基的氨基偶联，然后可以附加分子砌块B-NH₂，其中A和B中的官能团彼此反应形成共价键。这个后一反应可以产生不是肽键的连接。这种反应的一个实例是已建立的所谓“亚单体(sub-monomer)”策略，其中卤代乙酸(通常是活化(例如通过二异丙基碳二亚胺活化)的溴乙酸)首先与固相上的生长肽的氨基偶联(代表分子砌块A-COOH的卤代乙酸)。在第二个步骤和化学反应中，胺(代表B-NH₂)置换卤素，形成N-取代的甘氨酸残基(通过传统的SN2反应)。亚单体方法允许使用任何可商购或可合成的胺，这是非常有利的，因为可以并行使用许多胺并且可以产生大量的肽多样性。可以使用许多其他试剂代替卤代乙酸，包括作为优选实例的4-(溴甲基)苯甲酸、3-(溴甲基)苯甲酸、2-(氯甲基)唑-4-羧酸、2-(氯甲基)噻唑-4-羧酸、5-(溴甲基)异/>唑-3-羧酸、5-(溴甲基)吡嗪-2-羧酸、2-(溴甲基)呋喃-3-羧酸、(R,E)-5-氯代-2,4-二甲基戊-3-烯酸和(S,E)-5-氯代-2,4-二甲基戊-3-烯酸；参见下表和结构式。

术语“肽”优选指通过肽键连接的氨基酸短链。此外，通过肽键连接的氨基酸短链在其末端可以含有非氨基酸分子砌块，例如MPA和半胱胺MEA。肽基于大小而区别于蛋白质或多肽，并且越来越优选包含少于50个氨基酸并且越来越优选包含少于40个氨基酸、少于30个氨基酸、少于20个氨基酸、少于10个氨基酸和少于5个氨基酸。

如本文所用，术语“分离肽”是指未与固相结合而是已从固相释放的肽。分离肽通常是游离肽的形式，例如在溶液中。在溶液中可以存在所述分离肽的一个或多个拷贝。因此，在所述肽被分离之前，在固相上可以存在待分离肽的一个或多个拷贝。

如本文所用，术语“氨基酸”是指由胺(-NH₂或-NH)和羧酸(-COOH)官能团构成的有机化合物，通常还具有各氨基酸特有的侧链。最简单的氨基酸甘氨酸没有侧链(分子式H₂NCH₂COOH)。在具有连接到α-碳的碳链的氨基酸(例如赖氨酸)中，所述碳以α、β、γ、δ等的顺序标记。在一些氨基酸中，氨基可以连接至例如α-、β-或γ-碳，因此这些氨基酸分别被称为α-、β-或γ-氨基酸。术语“氨基酸”优选描述的是通常具有通式H₂NCHRCOOH(其中R是被称为“侧链”的有机取代基)的α-氨基酸(也称为2-或α-氨基酸)，以及β-、γ-和δ-氨基酸，其在胺和羧酸之间含有多个碳原子。在最简单的α-氨基酸丙氨酸(分子式：H₂NCHCH₃COOH)中，侧链是甲基。根据本发明，所述氨基酸是L-氨基酸或D-氨基酸。

氨基酸包括所谓的标准或规范氨基酸。这21种α-氨基酸由通用遗传密码的密码子直接编码。它们是在真核生物中发现的蛋白原α-氨基酸。这些氨基酸在本文中以所谓的单字母代码表示：

如所述及的，在α-氨基酸连接于α-碳原子的情况中，氨基酸的侧链是有机取代基。因此，侧链是氨基酸母体结构的分支。氨基酸通常根据其侧链的性质进行分类。例如，侧链可以使氨基酸是弱酸性的(例如氨基酸D和E)或弱碱性的(例如氨基酸K和R)，并且如果侧链是极性的则成为亲水性的(例如氨基酸L和I)或如果侧链是非极性则成为疏水性的(例如氨基酸S和C)。脂族氨基酸的侧链为脂族基团。脂族基团使氨基酸成为非极性和疏水性的。脂族基团优选是未取代的支链或直链烷基。脂族氨基酸的非限制性实例是A、V、L和I。在环状氨基酸中，侧链中的一个或多个系列原子连接形成环。环状氨基酸的非限制性实例是P、F、W、Y和H。应当理解，所述环必须与环肽情况下形成的环保持不同，如下文将进一步详述。虽然环状氨基酸的前一个环是单个氨基酸侧链的一部分，但后一个环是在二硫醇肽的两个硫醇基团之间形成。芳族氨基酸是环状氨基酸的优选形式。在芳族氨基酸中，所述环是芳环。就分子的电子性质而言，芳香性描述了不饱和键、孤对电子或空分子轨道的共轭环表现出比单独的共轭稳定所预期的更强的稳定性。芳香性可以被认为是环化离域和共振的表现。疏水性氨基酸具有非极性侧链，使所述氨基酸具有疏水性。疏水性氨基酸的非限制性实例是M、P、F、W、G、A、V、L和I。极性不带电荷的氨基酸具有不带电荷残基的非极性侧链。极性不带电荷的氨基酸的非限制性实例是S、T、N、Q、C、U和Y。极性带电荷氨基酸具有带有至少一个带电荷残基的非极性侧链。极性带电荷氨基酸的非限制性实例是D、E、H、K和R。

“二硫醇肽”是含有两个或更多个且优选仅含有两个硫醇基团的肽。所述硫醇基团是所述肽的氨基酸或非氨基酸分子砌块的一部分。携带硫醇基团的氨基酸或非氨基酸分子砌块可以是以下之一：

-半胱氨酸或半胱氨酸类似物，例如高半胱氨酸、青霉胺或D-半胱氨酸，

-含有硫醇基团和羧酸的分子砌块，例如巯基丙酸(MPA)，

-含有硫醇基团和胺的分子砌块，例如半胱胺(MEA)。

当线性二硫醇肽被固定在固相上时，有一个硫醇基团是“游离的”，最初是受保护的巯基(R-S-PG；PG＝保护基团)，在除去硫醇保护基团后是巯基(R-SH)，而另一个硫醇基团参与将所述肽连接到固相的二硫键(R¹-S-S-R²)。当来自一个含硫醇分子砌块(连接至固相)的硫原子与来自所述肽C末端区域中的含硫醇分子砌块的硫原子形成单共价键时，产生二硫键。通过二硫键固定于固相以合成肽的方式和方法是本领域已知的，在下文中进一步详述并通过所附实施例进行说明。

术语“线性肽”指通过肽键连接的氨基酸的线性短链，其还可以含有如上文与根据本发明的“肽”相关描述的非氨基酸和非肽键。在线性肽中，所述肽中没有一系列原子连接形成大环或环。

术语“环肽”是指所述肽中一系列12个或更多个原子连接形成大环或环。所述环肽优选为单环肽，这意味着所述肽中仅两个位点连接形成环状物或环。根据本发明，通过涉及二硫醇肽的两个硫醇基团来形成所述环状物或环。如果两个硫醇基团直接键合，则所述环状物或环由二硫键形成。二硫醇肽的两个硫醇基团也可以通过双亲电试剂连接，如下文更详细地解释。

肽文库是指包含多种不同肽的组合物或生产制品(article of manufacture)。

在文库是组合物的情况下，所述组合物包含不同肽的混合物。所述组合物优选是溶液，更优选DMSO或水溶液。可以例如通过冻干或离心真空蒸发(例如使用SpeedVac系统)来干燥所述溶液。在这种情况下，所述组合物可以是可以被期望的溶剂溶解的干燥粉末的形式。在这种组合物的情况下，文库中不同肽的数量可以通过固定在固体支持物上的不同肽的数量和/或通过混合在其上合成一种或两种或更多种不同肽的固体支持物来确定。

生产制品包含不同的孔并且优选为微量滴定板，更优选为96孔板、384孔板、1536孔板或3456孔板。不同的肽优选在不同的孔中平行合成(通常在固体支持物上)，使得每个孔可以发现一种类型的肽(许多拷贝)。所述生产制品的多个孔一起形成肽文库。优选生产制品形式的文库，因为在筛选此类文库的特定靶分子(如下文所述)的结合剂或抑制剂的情况下，可立即知道在哪个孔中可以找到期望的文库成员，并且不需要对所需的文库成员进行进一步复杂的分离或鉴定。

虽然优选每孔一种肽，但也可以在每个孔中平行合成多于一种肽，例如每孔两种、三种、四种或五种不同的肽(通常在固体支持物上)，从而获得每孔有两种、三种、四种或五种不同的肽的孔。每孔的不同肽的数量可以根据需要进行调整，例如通过固定在固体支持物上的不同肽的数量和/或通过混合在其上合成一种或两种或更多种不同肽的固体支持物。

不同肽的文库越来越优选包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种、至少20种、至少50种、至少96种、至少100种、至少384种、至少500种、至少1000种、至少1536种、至少3456种、至少10000种和至少100000种不同的肽。

N-末端区域优选指定一种或多种线性二硫醇肽的至多三个N-末端氨基酸或分子砌块之一，更优选至多两个N-末端氨基酸或分子砌块之一，并且最优选指定至多一个N-末端氨基酸或分子砌块。在最优选的情况下，巯基是所述一种或多种线性二硫醇肽的N-末端位置处的氨基酸或分子砌块的一部分。

同样地，C末端区域优选指定一种或多种线性二硫醇肽的至多三个C末端氨基酸或分子砌块之一，更优选至多两个C末端氨基酸或分子砌块之一，并且最优选至多一个C末端氨基酸或分子砌块。在最优选的情况下，所述一种或多种肽通过C末端的二硫键被固定于固相。

术语“固相”指可以通过二硫键、例如通过固相肽合成法(SPPS)合成的肽的任何固体材料或支持物。

如本文所用，术语“物质”指能够还原二硫键、从而从固相释放一种或多种线性二硫醇肽的任何分子。因此，所述物质也可以称为还原剂或释放剂。现有技术中已知多种还原剂。在生物化学中，硫醇如β-巯基乙醇(β-ME)或二硫苏糖醇(DTT)用作还原剂。根据本发明，所述物质是挥发性的并且可通过蒸发除去，优选通过真空蒸发并且最优选通过离心真空蒸发除去。挥发性物质很容易通过蒸发变成气体。蒸发是液体转变为气相时在其表面发生的一种汽化。液体分子蒸发的能力很大程度上取决于单个颗粒可能拥有的动能的量。虽然蒸发速率在较高温度下增加，但即使在较低温度下，如果液体的各个分子具有超过汽化所需动能的最小量，则也可以蒸发。使用挥发性且可通过蒸发去除的物质在技术上是有利的，因为可以从包含待通过本发明的方法制备的肽文库或分离肽的组合物中去除该物质。通过物质从固相支持物去除一种或多种肽在本文中也称为“还原释放(reductive release)”并且如图1b所示。从图1b可以看出，所述一种或多种肽通过所述物质以一种或多种线性肽的形式被释放，其中两个硫醇基团是“游离的”巯基。

碱是一种可以接受质子(例如碱)、提供电子(例如Lewis碱)的物质或在水溶液中产生氢氧根离子(OH^-)的任何化合物。根据本发明使用的碱能够使所述一种或多种线性二硫醇肽的N-末端区域中的巯基去质子化(R-S^-)。去质子化的巯基诱导分子内二硫键交换，由此所述一种或多种线性二硫醇肽以一种或多种环肽的形式从固相被释放。去质子化的巯基包含反应性S，其充当亲核剂，诱导在二硫键处的硫醇-二硫键交换反应。通过碱从固相支持物去除一种或多种肽在本文中也称为“环化释放(cyclative release)”并且如图1a所示。从图1a可以看出，所述一种或多种肽通过碱以环肽的形式被释放，其中二硫醇肽的两个硫醇基团通过二硫键连接。

如上所述，权利要求1的项目(i)的方法是产生线性二硫醇肽的“还原释放”方法，而权利要求1项目(ii)的方法是产生环状二硫醇肽的“环化释放”方法。从下文中将显而易见，这两种选项都显著推进了用于制备肽文库或分离肽的现有技术方法。

其中通过二硫键固定在固体支持物上的二硫醇肽通过树脂中的二硫键还原而从所述固相中释放的“还原释放”策略如图1b所示。与环化释放相反，还原释放的效率与肽的长度和氨基酸组成无关。特别是，这种方法还有效地利用不能通过二硫键形成而有效环化的短肽(但可以通过双亲电接头环化，由于通过接头在大环主链上加入额外原子导致这种环化在空间上要求较低)。还原性肽释放(reductive peptide release)的一个挑战是需要在肽中添加还原剂，而该试剂会干扰随后使用双亲电试剂的环化反应(即与亲电基团反应)。通过使用可通过蒸发从肽中去除(例如在真空下以相对简单的步骤蒸发去除)的挥发性还原剂克服了这个缺点。例如，可以通过在96孔板中离心真空蒸发肽来去除挥发性还原剂。

少量研究描述了通过还原性破坏二硫键从固相释放肽，所有这些研究都释放具有单个硫醇基团的肽，并考虑到其他应用，例如肽-蛋白质缀合物的生成(J.Mery等人,Int.J.Pept.Protein Res.,1993,42,44-52)、肽异源二聚体的合成(A.Taguchi等人,Org.Biomol.Chem.,2015,13,3186-3189)、含有硫醇柄的头尾环化肽的产生(W.Tegge等人,J.Pept.Sci.,2007,13,693-699)、通过一个硫醇基团对肽的环化(A.A.Virgilio等人,Tetrahedron Lett.,1996,37,6961-6964)、通过质谱法对释放的肽的鉴定(O.Lack等人,Helv.Chim.Acta,2002,85,495-501)，以及在肽合成期间的瞬时固定(D.S.Kemp等人,J.Org.Chem.,1986,51,1821-1829)。这些方法中的大多数均使用还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)(J.Mery等人,Int.J.Pept.Protein Res.,1993,42,44-52；A.A.Virgilio等人,Tetrahedron Lett.,1996,37,6961–6964)、二硫苏糖醇(DTT)(J.Mery等人,Int.J.Pept.Protein Res.,1993,42,44-52；W.Tegge等人,J.Pept.Sci.,2007,13,693–699)和三正丁基膦(P(n-Bu)₃)(D.S.Kemp等人,J.Org.Chem.,1986,51,1821-1829)，因此试剂无法通过蒸发去除，需要纯化步骤。仅在其中一项研究中，使用挥发性还原剂β-巯基乙醇(β-Me)从固体支持物上释放二硫键连接的肽(O.Lack等人,Helv.Chim.Acta,2002,85,495-501)。然而，在这个应用中，所述肽是从单个珠(bead)释放的，并且是从极性(PEGA)、低荷载量(0.2mmol/g)和高溶胀体积的树脂中少量释放，这不适合目前设想的应用。没有一项研究报告了二硫醇肽的合成和还原释放，也没有一项研究应用该方法来生成环肽文库。

据本发明人所知，环化二硫键释放的策略是全新的并且尚未用于环肽的生成。最接近环化释放的策略是硫醚固定的肽的氧化释放(B.H.Rietman等人,Int.J.Pept.ProteinRes.,1994,44,199–206；T.Zoller等人,Tetrahedron Lett.,2000,41,9989–9992)。然而，这些方法不适用于文库生成，因为产量低、二聚体副产物以及洗脱产物中存在需要通过纯化去除的氧化剂。在此，环化释放是由使N-末端巯基去质子的碱触发的。如果使用挥发性碱，则可以通过蒸发将其除去，使得反应管或微量滴定板孔中的唯一产物是一种或多种纯的环肽。如果使用非挥发性碱，也可以用酸中和。环化策略的一个重要要求是所述肽可以通过二硫键固定在固相上合成，其中二硫键需要在肽合成期间、特别是在通过哌啶进行Fmoc脱保护期间足够稳定。一些研究报告了二硫键固定的肽的固相合成，其应用范围从肽-蛋白质缀合物的生成到用于质谱鉴定的肽的还原释放(J.Mery等人,Int.J.Pept.ProteinRes.,1993,42,44–52；A.Taguchi等人,Org.Biomol.Chem.,2015,13,3186–3189；W.Tegge等人,J.Pept.Sci.,2007,13,693–699；A.A.Virgilio等人,Tetrahedron Lett.,1996,37,6961–6964；O.Lack等人,Helv.Chim.Acta,2002,85,495–501；D.S.Kemp等人,J.Org.Chem.,1986,51,1821-1829)。Mery,J.及其同事报告了二硫键的稳定性取决于靠近硫以及带有庞大甲基的接头NH₂-CH₂-CH₂-S-S-C(CH₃)₂-COOH(这对于Fmoc肽合成而言足够稳定)的碳原子上的取代基(J.Mery等人,Int.J.Pept.Protein Res.,1993,42,44-52；W.Tegge等人,J.Pept.Sci.,2007,13,693–699；J.Mery等人,Pept.Res.,1992,5,233–240)。之前合成了通过二硫键接头NH₂-CH₂-CH₂-S-S-CH₂-C(NH₂)H-COOH的二硫键固定的肽，并且发现，在短肽的情况下，尽管接头相当不受阻碍，但没有大量的肽，这可能是由于所述珠暴露于哌啶的次数有限所致(Y.Wu等人,Chem.Commun.,2020,56,2917–2920)。

根据本发明第一方面的优选实施方案，所述方法包括在步骤(a)之后通过蒸发除去所述物质的步骤。

如上所述，在权利要求中使用的物质是挥发性的并且可通过蒸发除去。根据这个优选实施方案，通过蒸发去除物质的步骤构成所述方法的一部分。所述蒸发优选在真空下进行(例如使用SpeedVac系统)。最优选通过离心真空蒸发除去所述物质。

此外，根据本发明的碱优选是挥发性的并且可通过蒸发除去。在这种情况下，本发明第一方面的方法优选包括在步骤(a)之后通过蒸发除去所述碱的步骤。

作为通过蒸发去除所述物质的替代方案，还可以通过冻干去除所述物质。

根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，所述方法进一步包括环化通过所述物质释放的一种或多种线性二硫醇肽的步骤(b)。

如上所述，在通过所述物质“还原释放”的情况下，所述一种或多种肽通过所述物质以线性肽的形式释放，其中两个硫醇基团是“游离”巯基。所述两个巯基可用于使所述肽环化。

根据本发明第一方面的一个更优选的实施方案，通过至少一种双亲电试剂或通过二硫键氧化(disulfide oxidation)对所述一种或多种二硫醇肽进行环化。

两个巯基可以直接连接形成二硫键(二硫键氧化)，或者通过连接分子、特别是通过双亲电试剂连接。一系列不同的双亲电试剂可商购，或者可以通过常规化学反应轻松合成。不同的双亲电试剂可用于平行反应，以从一种二硫醇肽产生许多不同的环肽。

亲电试剂在形成新键时充当电子对受体。在亲核取代的情况下，离去基团作为带负电荷的物质离开。双亲电试剂是包含至少两个可与两个巯基反应的官能团的化合物，由此巯基通过双亲电试剂连接。

二硫键氧化产生连接二硫醇肽的两个巯基的直接二硫键。

根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，项目(ii)的一种或多种环肽的二硫键被还原，并且通过双亲电试剂使所述肽再环化。

如上文所讨论的，根据本发明第一方面的项目(ii)，所述一种或多种肽通过碱以环肽的形式释放，其中二硫醇肽的两个硫醇基团通过二硫键连接。

这些二硫键可以被还原，优选通过与本发明第一方面的项目(i)相关描述的物质来还原，从而获得具有两个“游离”巯基的线性肽。然后可以通过双亲电试剂将这些线性肽再环化，如上文所解释。

根据本发明第一方面的另一优选实施方案，所述物质选自1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇、2,4-戊二硫醇、乙烷-1-硫醇、丙烷-1-硫醇、丁烷-1-硫醇、丙烷-2-硫醇、2-甲基-1-丙硫醇、丁烷-2-硫醇、2-甲基丙烷-2-硫醇、2-羟基-1-乙硫醇、1,2-乙二硫醇、2-丙烯-1-硫醇、3-甲基-1-丁硫醇、苯硫酚、苄硫醇、2-丁烯-1-硫醇、3-丁烯-1-硫醇、2-甲基-2-丙烯-1-硫醇和3-甲基-2-丁烯-1-硫醇，优选1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇或2,4-戊二硫醇，最优选1,4-丁二硫醇(BDT)，和/或所述碱选自叔胺、仲胺或伯胺，氢化硼、氢化铝或氢化硅(aboron,aluminium or silicon hydride)，以及具有氧、氮或碳阴离子的碱，并且优选叔胺、仲胺或伯胺，更优选叔胺，甚至更优选三烷基胺，最优选N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。

可通过蒸发除去的还原剂的优选实例示于表1中。

表1

*)这些还原剂是优选的，因为它们不生成加合物。化合物1至20的化学结构为：

1,4-丁二硫醇(BDT)用作所附实施例中的物质，因此是最优选的物质。

用于使巯基去质子以诱导二硫键交换和环化肽释放的碱的优选实例示于表2中。

表2

/>

表2中的列表并不详尽，但提供了每种类型/亚型的可用试剂的示例。优选的是三烷基叔胺并且特别是其具体实例。N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)在所附实施例中用作碱，因此是最优选的碱。

根据本发明第一方面的进一步优选的实施方案，所述方法包括在步骤(a)之前的在固相上合成线性二硫醇肽的步骤(a’)。

固相肽合成(SPPS)是一种肽合成的常用技术。通常，在SPPS方法中，肽是从氨基酸链的羰基侧(C末端)至氨基侧(N末端)合成的，但是肽在细胞中以相反的方向生物合成。在肽合成中，使氨基保护的氨基酸与固相材料结合，在羰基与固相材料之间形成共价键。然后所述氨基被脱保护并与下一个N-保护的氨基酸的羰基反应。所述固相现在带有二肽。重复这个循环以形成所需的肽链。

根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，所述线性二硫醇肽的氨基酸侧链受到保护基团的保护，并且所述方法进一步包括在步骤(a)之前和如果存在步骤(a’)的话在步骤(a’)之后当所述线性二硫醇肽被固定在所述固相上时去除所述保护基团。

由于氨基酸具有多个反应基团，因此必须仔细进行肽合成，以避免可能减少长度并导致肽链支化的副反应。为了以最小的副反应促进肽的形成，已经开发了与氨基酸反应基团结合并阻止或保护官能团免于非特异性反应的化学基团。

通常使纯化的、用于合成肽的各个氨基酸在合成前与这些保护基团反应，然后在偶联后立即从新添加的氨基酸中除去特定的保护基团(称为脱保护的步骤)，以允许下一个引入的氨基酸以正确的方向与不断增长的肽链结合。一旦肽合成完成，所有剩余的保护基团都会从新生肽中被除去。

本领域通常使用三种类型的保护基团，这取决于肽合成的方法，并且如下所述。

氨基酸N末端受到被称为“临时”保护基团的保护，因为它们相对容易被除去以允许肽键形成。两个常见的N末端保护基团是叔丁氧基羰基(Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，每个基团都具有决定其用途的独特特征。Boc需要中等强度的酸如三氟乙酸(TFA)而从新添加的氨基酸中被去除，而Fmoc是碱不稳定的保护基团，用弱碱如哌啶将其去除。Boc化学作用需要酸性条件才能脱保护，而在二十年后才报道Fmoc在弱碱条件下被裂解。由于脱保护条件温和，因此Fmoc化学更常用于商业环境，因为其具有更高的质量和更高的产量，而Boc更适合复杂肽合成或需要碱敏感的非天然肽或类似物时。

C末端保护基的使用取决于使用的肽合成的类型；液相肽合成需要保护第一个氨基酸的C末端(C末端氨基酸)，而固相肽合成则不需要，因为固体支持物(例如树脂)充当唯一需要被保护的C末端氨基酸的保护基团。

氨基酸侧链代表了广泛的官能团，因此是肽合成期间相当大的侧链反应性的位点。因此，需要许多不同的保护基团，尽管它们通常基于苄基(Bzl)或叔丁基(tBu)。在指定肽的合成期间可以使用的特定保护基团根据所述肽序列和使用的N末端保护类型而变化。侧链保护基团被称为永久保护基团，因为它们可以在合成阶段承受多次化学处理循环，并且只有在合成完成后用强酸处理时才会被去除。

根据本发明第一方面的进一步优选的实施方案，至少一些线性二硫醇肽包含伯胺或仲胺，并且所述方法还包括用羧酸修饰伯胺或仲胺，其中所述环肽包含伯胺或仲胺，并且所述羧酸优选通过声学分配(acoustic dispensing)被转移。

通过用羧酸修饰伯胺或仲胺，可以进一步增加肽文库的复杂性；即所述文库中不同肽的数量可以显著增加。在筛选所述肽文库中特定靶分子的结合剂或抑制剂的情况中，这反过来又增加了鉴定理想的抑制剂或结合分子的机会。这将在下面结合本发明的第二方面进行更详细的解释。

声学分配是一种液体转移技术，其允许以非常小的体积进行反应，并且如实施例3所示，以仅80纳升的体积进行反应。声学分配通过使用声学超声波能量转移液体，实现非接触式、高精度、高速的液体处理。

用羧酸修饰伯胺或仲胺，其中环肽包含伯胺或仲胺，并且所述羧酸也是如下文所述的本发明第二方面的主题。本发明第二方面的优选实施方案和定义经必要修改后适用于本发明第一方面的上述进一步优选实施方案。

根据本发明第一方面的又一个优选实施方案，所述方法进一步包括(c)优选在没有预先纯化肽文库的情况下使所述肽文库与靶分子接触，和(d)筛选所述肽文库的与所述靶分子结合并优选抑制所述靶分子的肽。

用于筛选肽文库中与靶分子结合并调节靶分子、优选抑制靶分子的肽的方式和方法是本领域已知的。在优选的实施方案中，所述靶标是基于氨基酸的靶标，例如蛋白质。一般而言，所述靶标还可以是非基于氨基酸的化合物，例如寡核苷酸或多核苷酸。

在这方面，术语“抑制靶分子”是指生物活性被抑制并且优选被完全消除。生物活性是特定分子实体对靶标实现限定的生物效应的能力。它是根据产生所述效应所需的分子实体的效力或浓度来衡量的。生物活性通过生物测定来测定。

根据本发明第一方面的更优选实施方案，步骤(c)和(d)在其中伯胺或仲胺已用羧酸修饰的相同孔中进行。

这种方法可以节省材料和时间。所述孔可以是例如多孔板的形式，例如96孔板、384孔板或1536孔板。

根据本发明第一方面的进一步更优选的实施方案，所述靶分子是蛋白质或核酸分子，并且优选是蛋白质。

在这些选项中，所述靶标优选是基于氨基酸的靶标，例如蛋白质。

根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，所述固相包含树脂，优选非极性树脂，更优选聚苯乙烯树脂。

用于肽合成的几种树脂是已知的并且可商购。非限制性实例是由2-丙烯酰氨基丙-1-基-(2-氨基丙-1-基)聚乙二醇800组成的PEGA树脂、与癸二酸交联的聚-ε-赖氨酸的树脂、交联的羟乙基聚苯乙烯和聚乙二醇的树脂，基于聚乙二醇的树脂。任何上述树脂基质可以用反应性基团官能化，所述反应性基团包括但不限于氨甲基-、硫甲基-、硫乙基-、氯烷基-、三苯甲基氯、HMBA和Rink酰胺。优选聚苯乙烯树脂，因为其用于本申请的实施例中。

根据本发明第一方面的另一个优选实施方案，线性二硫醇肽包含分子量小于1000Da、优选小于600Da的线性二硫醇肽，和/或包含3或4个氨基酸或分子砌块且优选3个氨基酸或分子砌块的线性二硫醇肽。

这个优选实施方案的二硫醇肽特别适用于所要求保护的方法的第(i)项的“还原释放”。这是因为在这种肽中，二硫醇肽中的两个硫醇基团彼此靠近，因此由于构象限制不能通过环化释放而被有效地释放。

在如图1a所示的环化释放策略中，肽通过二硫键在固相上被合成，并通过环化二硫键交换反应被释放。环化释放的一个主要限制是，由于通过构象受限的二硫键环化肽的路径所致，无法有效地产生特别短的二硫醇肽。如图1a所示，由一个氨基酸和每侧的含硫醇分子砌块(总共三个分子砌块/氨基酸)构成的肽无法被有效释放。如果肽的构象灵活性受到限制(例如通过具有Phi和Psi角度限制的氨基酸)，甚至某些在含硫醇分子砌块(总共4个分子砌块/氨基酸)之间含有两个氨基酸的肽也不能被有效释放。环释放方法的局限性在于只能递送长于三个或四个分子砌块的二硫醇肽，这阻止了分子量低于约600Da的大环化合物的生成，因此阻止了对于开发口服或细胞渗透性药物特别有吸引力的大环化合物。

因此，用于根据所要求保护的方法的第(ii)项的“环化释放”的二硫醇肽优选具有高于600Da的分子量，和/或包含多于3个氨基酸，更优选更多氨基酸。

本发明在第二方面涉及用于使大环化合物文库、优选环肽文明库多样化的方法，其中至少一些大环化合物、优选环肽包含伯胺或仲胺，其中所述方法包括用一种或多种羧酸修饰伯胺或仲胺。

本发明第一方面的定义和优选实施方案只要可修改为本发明第二方面，则经必要修改后适用于本发明第二方面。

术语“大环分子”是指其中一系列12个或更多个原子连接形成大环或环的分子。大环分子优选是如根据本发明的第一方面所定义的环肽，但所述大环分子不一定基于肽并且大环分子还可以具有含有肽和非肽组分的结构。非肽组分的实例包括烃、醚、酯、酰胺、芳基化合物、糖类、酮、环氧化物和胺。非肽大环化合物的实例包括雷帕霉素(rapamycin)、大环内酯类抗生素、劳拉替尼(lorlatinib)和西咪匹韦(simeprevir)。

所使用的羧酸的性质没有特别限制，优选的实例示于图8c和10a中。所述文库的复杂性可以通过使用的不同羧酸的数量来调整。

使待修饰的环肽或大环化合物优选与2倍至20倍、优选3倍至15倍、最优选4倍至12倍过量的羧酸接触，因为这种过量增加反应效率。

所述羧酸优选是活化的羧酸。活化的羧酸是比游离羧基更容易受到亲核攻击的羧基衍生物，例如酸酐、酰氯、硫酯和酯。

为了活化羧酸，可以使用酸活化剂。由此本发明第二方面的方法优选包括能够活化一种或多种羧酸的酸活化剂。

实施例中使用的酸活化剂优选是HBTU((2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐；六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲)。可以使用的其他合适的酸活化剂是HATU((1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)、HSTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚氨基)六氟磷酸脲)、TSTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚氨基)四氟硼酸脲)、TPTU(O-(2-氧代-1(2H)吡啶基)-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐、和DMTMM BF₄(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐)。

本发明第二方面的方法优选包括碱。所述碱有助于羧酸的活化和偶联。下面描述了其优选实例。

环肽或大环化合物优选包含伯胺或仲胺作为外周基团(如图8所示)或主链内的仲胺。在环肽的情况下，可以通过氨基酸侧链或通过N末端氨基酸引入氨基。

基于大环化合物的配体的产生目前因缺乏大型大环化合物文库而受到阻碍，注意到从文库中分离与选定靶标具有高亲和力的基于大环化合物的配体的机会随着所述文库中不同的潜在结合配偶体的数量而增加。本发明第二方面的方法克服了获得大型大环化合物文库的限制。这种方法基于以组合方式将化学上不同的片段束缚到结构不同的大环化合物支架(scaffold)的外周基团。在概念验证中，通过将>104种羧酸片段缀合至192个大环化合物支架，生成了19,968个大环化合物的文库，如实施例3所示。所述酰化反应的高反应效率和少量副产物使得可以进行高通量筛选(HTS)文库而无需事先纯化。实施例3还示例说明从文库成功分离了低纳摩尔凝血酶抑制剂(K_i＝44nM)和高纳摩尔MDM2/p53蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂(K_i＝390nM)。

本发明第二方面的方法提供了大环化合物合成和筛选速率的显著提高，并且通常适用于任何靶标。

根据本发明的第二方面的优选实施方案，所述文库是如根据本发明的第一方面所描述的生产制品的形式。

根据第一方面描述的生产制品的优选实施方案经必要修改后适用于第二方面。根据本发明第二方面的这个优选实施方案，使包含伯胺或仲胺的环肽或大环化合物与生产制品的孔中的羧酸反应。

根据本发明第二方面的更优选的实施方案，通过声学分配将一种或多种环肽、一种或多种羧酸、酸活化剂和/或碱转移至生产制品。

关于声学分配的进一步详细描述已经在上文结合第一方面进行了描述。声学分配的使用在下面的实施例3.2中示例说明。

声学分配使用声波并且优选地是声学液滴喷射技术。声学分配的一大优点是可以无接触地转移试剂，特别是纳摩尔体积的试剂，无需移液头，从而加快了分配速度，减少了浪费和成本。

根据本发明第二方面的进一步优选的实施方案，在多样化之后筛选大环化合物，优选环肽，而不需要预先纯化。

所述筛选优选包括(a)使大环化合物、优选环肽文库与靶分子接触，和(b)筛选大环化合物、优选环肽文库中与靶分子结合并优选抑制靶分子的化合物，优选肽，所述靶分子如上文结合本发明的第一方面进行了描述。

关于本发明的第二方面，特别是上述未经预先纯化的优选实施方案，优选所述环肽文库已通过本发明第一方面的环化释放产生，或者第二方面的方法包括在环肽文库多样化之前进行根据本发明第一方面产生环肽文库的步骤。

还可以无需预先纯化筛选通过本发明第一方面的环化释放产生的环肽文库。因此，在所述环肽文库已经通过本发明第一方面的环化释放产生或者第二方面的方法包括在环肽文库多样化之前进行根据本发明的第一方面产生环肽文库的步骤的情况中，可以产生所述环肽文库并使其多样化，而无需在筛选之前进行纯化步骤。

根据本发明第二方面的一个更优选的实施方案，因此将所述大环化合物、优选环肽用一种或多种羧酸进行修饰，并在合成其的生产制品的相同孔中进行筛选。

这可以通过将靶分子(例如蛋白质)和任选存在的其他所需的筛选测定试剂分配到孔中并例如通过读板器测量结合来实现。在本文中的环化再次优选根据本发明第一方面的环化释放进行。

根据本发明第二方面的进一步优选的实施方案，所述碱是DABCO、HEPES的钠盐或NMM，并且最优选DABCO。

虽然也可以使用诸如DIPEA的挥发性碱，但挥发性碱在分配时可能会蒸发，特别是通过声波分配在2.5nl液滴中的情况中。因此，本文优选使用非挥发性碱，例如DABCO(1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷)或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)的钠盐。在挥发性碱中，如果用量较大，NMM(N-甲基吗啉)被发现是合适的。使用DABCO获得了最佳结果；见实施例3所述。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如有冲突，以包括定义的本专利说明书为准。

关于在本说明书中、特别是在权利要求中表征的实施方案，旨在从属权利要求中提到的每个实施方案与所述从属权利要求所从属的每个权利要求(独立的或从属的)的每个实施方案组合。例如，如果独立权利要求1描述了3个备选方案A、B和C，从属权利要求2描述了3个备选方案D、E和F，而权利要求3从属于权利要求1和2，并描述了3个备选方案G、H和I，则应当理解为本说明书明确公开了对应于组合A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I的实施方案，除非另有特别说明。

类似地，且还在独立权利要求和/或从属权利要求未描述替代方案的情况下，则应当理解为如果从属权利要求引用多个前述权利要求，则由此涵盖的主题的任何组合被认为是明确公开的。例如，在独立权利要求1、引用权利要求1的从属权利要求2以及引用权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，则权利要求3和1的主题的组合清楚且明确地公开为权利要求3、2和1的主题的组合。在存在引用权利要求1至3中任一项的进一步从属权利要求4的情况中，则权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合是被清楚且明确公开的。

上述考虑因素经必要修改后适用于所有所附权利要求。

附图简述

图1：通过二硫键在固相上合成的肽的还原释放策略。(a)最近开发的“环化二硫键释放”反应。短肽(例如在两个侧翼含硫醇结构之间仅含有一个氨基酸的那些短肽(三个分子砌块))由于构象限制(由虚线表示)而无法有效释放。(b)通过还原二硫键释放短的二硫醇肽。

图2：通过二硫键连接至固相的肽的还原释放。(a)用于测试肽从固相还原释放的四种肽的化学结构。(b)使用BDT(100mM)在含有碱TEA(100mM TEA)的DMF中通过还原二硫键而释放的四种肽的HPLC色谱图(左)。将相同的固定的肽暴露于在DMSO中的TEA(100mM)，条件是之前用于通过环化释放以分离二硫醇肽的条件，导致仅洗脱少量二硫键二聚肽(右)。期望的肽的峰以红色突出显示。观察到的唯一副产物是通过二硫键而二聚化的肽(二聚体)。

图3：通过二硫键连接至固相的二硫醇肽的还原释放。(a)固相上二硫醇肽的结构。(b)通过使用BDT(100mM)在含有碱TEA(100mM)的DMF中还原二硫键而释放的八种二硫醇肽的HPLC色谱图。期望的肽以红色突出显示。示出了BDT和副产物。

图4：双亲电试剂对二硫醇肽的环化。(a)用Mpa-Trp-Mea和试剂1,3-双(溴甲基)吡啶(1)示例说明环化反应。(b)双亲电试剂2-10。(c)大环化合物的化学结构和环化反应的HPLC色谱分析。期望的环状产物以红色突出显示。副产物s1至s7在补充图7中示出。L＝双亲电环化试剂。L*是水解的L。

图5：环化二硫键释放策略。(a)所述策略的示意图。在固相上通过二硫键合成短肽。去除固相上的保护基团(红色)使得可以有效去除。用碱处理使N末端硫醇去质子化，从而诱导分子内二硫键交换，得到环状产物。(b)经二硫键连接到固体支持物和使用的商业树脂的测试肽Mpa-Gly-Gln-Trp-Mea的化学结构。(c)回收在树脂4和5上合成并用在DMSO中的150mM DIPEA释放的二硫键环化肽Mpa-Gly-Gln-Trp-Mea。通过测量280nm处的吸光度来测定浓度。一式三份进行反应。(d)d组二硫键环化肽的纯度。通过LCMS测定纯度，测量所有物质在220nm UV吸光度下的AUC。

图6：具有可变序列的肽的环化释放。(a)期望的四种环肽的化学结构。这些肽基于线性序列Mpa-Gly-Ala-Xaa-Mea，其中Xaa是主链中具有可变构象灵活性的氨基酸。(b)在环化释放后粗制肽的HPLC分析色谱图。右侧的色谱图示出用TCEP还原二硫键后的肽。对于未识别的杂质，显示质量(假设该物质带单电荷)。(c)与已识别杂质的分子质量相符的化学结构的示例。

图7：文库设计、通过吸收量化肽回收以及环肽文库的凝血酶抑制。(a)包含96种不同肽的文库的设计和文库中使用的非天然氨基酸的结构。(b)通过280nm处的吸收量化的96种合成的环肽的环肽浓度(在DMSO中的mM)散点图。图表上显示了平均回收率以及该值的1.5×和0.67×。(c)在平均环肽浓度为11μM测量的凝血酶抑制。所述肽根据其在第一次筛选中的凝血酶抑制活性进行排序(黑点；从最高到最低活性)。绿点表示在第二次筛选中使用相同条件测量的相同环肽的凝血酶抑制。示出了最具活性的抑制剂的化学结构(K_i＝13±1μM)。

图8：通过将片段组合附加到外周基团来实现大环化合物的多样化。a，方法的一般原则。b，通过酰化修饰含有外周伯胺的模型大环化合物。c，模型大环化合物与指定酸的反应。上面的数字显示通过移液在4μL体积中的转化，下面的数字显示在80nl和声学液体转移中的转化，第一个数字使用DIPEA，第二个数字使用DABCO。示出在96孔板中两个液滴的图像以证明规模差异。所述液滴含有荧光素，并暴露在紫外线下以进行可视化。

图9：含有外周氨基的大环化合物的制备。a，侧链脱保护肽的环化二硫键释放。b，文库1中支架的形式。c，用于支架文库合成的氨基酸。d，通过吸收测量确定的45个含色氨酸支架的产率。

图10：针对凝血酶的大环化合物文库的筛选和命中(hit)鉴定。a，与酸1至3一起使用羧酸9至16以使支架文库1a-f多样化(如图2所示)。b，通过声学液体转移合成大环化合物文库的示意性操作。示出了反应条件。c，示出每个大环化合物的凝血酶抑制热图。所有大环化合物的氨基酸组成如补充表1所示。d，所有含有酸14的化合物的复制反应和筛选。e，前三个命中M1至M3的化学结构和活性。显示了三个独立测量的平均值和标准差。f，产生M1的色谱分离酰化反应和凝血酶抑制物质的级分分析。

图11：凝血酶筛选。根据我们之前描述的操作合成了384个大环化合物(使用Fmoc氨基酸，其相应的单字母代码显示在补充图1b中)。使每个大环化合物与12种羧酸反应。在反应和猝灭后，将凝血酶和荧光底物加入孔中，并测量30分钟内荧光的增加。最终大环化合物浓度为10μM。通过将每个孔的荧光强度随时间的斜率除以不含大环化合物的对照孔的相应斜率来确定残余凝血酶活性。

图12：MDM2结合剂。a，产生M6至M8的色谱分离酰化反应以及凝血酶抑制物质的级分分析。b，通过使用荧光偏振法测试荧光MDM2探针(线性肽)的位移来测量纯化的大环化合物与MDM2的结合。显示了三个独立测量的平均值和标准差。c，用荧光素(F)标记并通过荧光偏振法测量的与MDM2结合的大环化合物的化学结构。显示了三个独立测量的平均值和标准差。

图13：通过将片段组合附加到外周基团来实现大环化合物的多样化。a，大环化合物的化学结构，均含有氨基。b，用于使大环化合物多样化的羧酸。c，反应产率。

图14：Ro5边缘的大环化合物文库的合成策略。(a)之前的大环化合物策略和本文报告的改进策略。圆圈代表三组分子砌块：氨基酸(灰色)、半胱胺和类似物(红色)以及双亲电接头(白色)。(b)通过使双亲电试剂与末端硫醇基团反应来环化线性肽的策略的示意图。显示了新开发的半胱胺类似物的化学结构，该类似物用作线性前体中的C末端分子砌块。(c)合成携带通过二硫键连接的半胱胺类似物的聚苯乙烯树脂的策略。所述半胱胺类似物作为活化的硫代磺酸酯分子砌块加载到树脂上。

图15：由苯基砜活化的半胱胺分子砌块的合成以及无需色谱步骤的纯化。(a)二硫醇树脂的合成示意图。X＝Br或Cl。(b)二硫醇肽的免纯化合成的简化示意图。(c)使用7种不同树脂分子砌块合成的模型肽(MPA-Trp-Ala)的粗制肽质量的堆叠HPLC色谱图(UV220)。

图16：专为生成胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂而设计的大环化合物文库。(a)设计的环肽文库的形式。(b)用于文库合成的氨基酸和接头。(c)生成的大环化合物文库的选定性质的直方图。使用DataWarrior(版本5.5.0)计算的大环化合物文库的预测理化性质。绿色标记的是根据ro5的区域和/或在预测允许细胞可渗透的大环化合物的范围内的区域。

图17：文库生成的实验步骤。在微量滴定板中合成大环化合物文库的工作流程。

图18：MDM2:p53抑制剂的亲和力优化。a，文库3的支架基于M8，其中蓝色显示的氨基酸是多样化的。氨基酸分子砌块在三个框中显示。b，MDM2与63个支架结合的热图，这些支架在30pmol级别用15种羧酸组合酰化。通过在浓度为750nM的大环化合物对荧光肽探针的置换测定来测量与MDM2的结合。c，基于之前筛选的最佳9个支架和另外15种羧酸对文库4进行筛选。d，通过FP测量的荧光素标记的和HPLC纯化的大环化合物M10(F-M10)与MDM2的结合。显示了三个独立测量的平均值和标准差。e，通过SPR测量的未标记大环化合物M8和M10与MDM2的结合。

图19：使用DIPEA作为碱通过移液(4μl体积)和声学转移(80nl体积)进行酰化反应的比较。将反应用水稀释100倍，并使用RP柱和0-60％ MeCN/H₂O梯度在5分钟内通过LC-MS分析5μl样品。在反应体积为80nl的情况下，合并两个样品。

图20：使用声学分配和不同的碱在80nl体积中进行酰化反应。测试了两种浓度为80mM的非挥发性碱(DABCO和HEPES钠盐)和浓度为500mM的挥发性碱(NMM)代替80mM DIPEA，通过三种羧酸对模型支架的酰化。用水将反应稀释100倍，并使用RP柱和0-60％ MeCN/H₂O梯度在5分钟内通过LC-MS分析5μl样品(两个合并反应)。虽然与DIPEA的反应未完成，但所有其他碱均导致定量转化为产物。

图21：使用声学分配和DABCO作为碱在80nL体积中进行酰化反应的比较。使用DABCO作为碱(80mM)，在80nl体积，模型支架1与羧酸1-8反应。用水将反应稀释100倍，并使用RP柱和0-60％ MeCN/H₂O梯度在5分钟内通过LC-MS分析5μl样品(两个合并反应)。

图22：在80nl体积，模型支架2至5的酰化和声学分配。a，模型支架的LC-MS分析。将反应用水稀释100倍，并分析5μl样品。溶剂B梯度：对于模型支架2为0-60％ MeCN，5分钟；对于模型支架3-5为10-100％ MeCN，5分钟。b，酸的LC-MS分析。将反应用水稀释100倍，并分析5μl样品。溶剂B梯度：0-60％ MeCN，5分钟。TMU＝四甲基脲。c-f，模型支架2(c)、3(d)、5(e)和5(f)的酰化反应的UHPLC分析。用水将反应稀释100倍，并分析5μL样品。溶剂B梯度：对于模型支架2为0-60％ MeCN，5分钟；对于模型支架3-5为10-100％ MeCN，5分钟。

图23：含有N-末端氨基的环肽支架的制备。a，六种不同的支架形式。b，用于支架合成的氨基酸。

图24：文库1(凝血酶筛选)和文库2(MDM2筛选)的理化性质。使用DataWarrior软件计算所述性质。符合Kihlberg渗透性规则(P.Matsson等人,Adv.Drug Deliv.Rev.2016,101,42–61；B.Doak等人,Chem.Biol.2014,21,1115-1142)的区域以绿色标示。这两个文库的大部分都位于预计细胞可渗透的空间内。MW＝分子量，cLogP＝计算的正辛醇/水分配系数，HBD＝氢键供体，HBA＝氢键受体，PSA＝极性表面积，NRotB＝可旋转键的数量。a，文库1(用于凝血酶筛选)。b，文库2(用于MDM2筛选)。

图25：凝血酶抑制剂M1至M5。a，使用0-100％ MeCN/H₂O梯度在15分钟内获得的化学结构和分析性HPLC色谱图。b，对于所有大环化合物，以50μl体积进行18点、两倍连续稀释。加入凝血酶(50μl，2nM终浓度)，10分钟后加入荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(50μl，50μM终浓度)。测量在30分钟内荧光的增加。通过将每个孔的荧光强度随时间的斜率除以不含大环化合物的对照孔的相应斜率来测定残余凝血酶活性。示出了三个独立测量的平均值和标准差。

图26：与凝血酶结合的M1的结构。a，与凝血酶结合的M1的X射线结构。M1被放大并显示出氢键相互作用。b，M1的化学结构以及与凝血酶形成的氢键相互作用。

图27：为文库2合成的支架(MDM2筛选)。a，文库2中支架的形式。b，用于支架文库合成的氨基酸。合成了四种二氨基酸、四种主链氨基酸、两种侧链氨基酸和六种子文库形式的所有组合。c，环化释放后含色氨酸支架的产率。通过纳米滴吸光度测定支架的平均浓度为12.9mM。通过LC-MS测得的平均纯度为约90％。

图28：用于酰化环肽支架中外周胺的羧酸概述。

图29：通过竞争结合实验研究M10的结合位点。a，通过荧光偏振法测量的M10和nutlin-3a对FP53线性肽探针的置换。b，M10和nutlin-3a对F-M10大环化合物探针的置换。

图30：通过SPR测量的大环化合物与MDM2的结合。a，荧光素标记的大环化合物、阳性对照nutlin-3a(未经荧光素标记)和阴性对照(凝血酶抑制剂；未经荧光素标记)的单循环SPR传感图。RU，应答单元。b，一式三份进行的大环化合物M6、M7、M8和M10(未经荧光素标记)的单循环SPR传感图。

实施例

实施例示例说明了本发明。

实施例1：还原释放

1.1.从固相还原释放二硫键固定的肽

首先评估通过二硫键固定在固体支持物上的肽是否可以用挥发性还原剂定量释放。为此，合成了图2a所示的四种肽Ala-Trp-Mea、Trp-Ala-Mea、Ala-Tyr-Mea和Tyr-Ala-Mea(Mea＝2-巯基乙胺，也称为半胱胺)。这些肽含有色氨酸或酪氨酸残基，使得可以通过在220或280nm处的吸光度测量来精确测定释放的肽的量。我们省略了在二硫醇肽中发现的N末端硫醇基团，以量化通过二硫键还原而不是通过任何其他机制(例如环二硫键交换)释放的肽。这些肽是在具有高荷载能力(约1mmol/g)并通常用于肽合成的聚苯乙烯(PS)树脂上合成的。首先，通过将PS硫醇树脂与过量吡啶基二硫乙胺温育来建立二硫键，并通过标准Fmoc化学合成肽。所有肽均在96孔板的孔中以5μmol级别合成，以测试计划稍后以高通量合成二硫醇肽文库的条件。

通过将珠与含有20当量β-Me(0.5M)和20当量三甲胺(TEA；0.5M)的200μl DMF温育过夜来测试二硫键固定肽从PS树脂的释放。对所述肽的LC-MS分析显示有效释放，但约40％的产物以与β-Me的二硫化物加合物形式出现。据推测，通过使用较大摩尔过量的β-Me和/或通过重复还原，有可能降低加合物的程度，但这需要额外的工作步骤，因此不是最有吸引力的途径。为了一步从树脂中释放肽并消除二硫化物加合物，有人建议使用二硫苏糖醇(DTT)等还原剂，它不会形成二硫化物加合物，因为它通过形成环状DTT而自身消除。将携带肽Ala-Trp-Mea或Tyr-Ala-Mea的树脂与4当量DTT温育有效释放肽，而不形成肽-还原剂加合物，但DTT无法通过在标准speedvac中通过真空蒸发去除。一种相关的还原剂在195℃时蒸发，因此沸点较低，其是1,4-丁二硫醇(BDT)(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1_4-Butanedithiol，Accessed 20.04.21)。将5μmol树脂连接的肽与含有4当量BDT(100mM)和4当量TEA(100mM)的200μl DMF温育。作为对照，进行平行反应，其中将这四种树脂结合的肽用环状释放的条件(DMSO中的250mM TEA)处理。通过LC-MS分析，BDT有效释放了所述肽。对于所有这四种肽，观察到与所需产物相对应的主峰(图2b)。在两种肽中发现的唯一副产物是肽二聚体，其数量不足3％。期望的产物的产率分别为3.4、1.3、4.2和4.3μmol，相当于68％、25％、84％和86％的产率(假设所述珠上合成的肽量为5μmol)。

1.2.从固相还原释放短二硫醇肽

接下来，合成了一组Mpa-Xaa-Mea(Mpa＝巯基丙酸)形式的8个短二硫醇肽，其中Xaa氨基酸为Trp、Tyr、Ser、His、Phe、Arg、Asp和Ala。对于这些肽，预计它们是通过二硫键的还原而释放的，但通过二硫键环化机制不能有效地释放。作为对照，还合成了较长的肽Mpa-Lys-Trp-Gly-βAla-Mea，预计其可通过二硫键环化有效释放。将树脂与还原剂BDT一起温育可有效释放所有肽(图3)。主要产物是期望的二硫醇肽。仅发现少量副产物，并且是带有三苯甲基和叔丁基保护基团的二硫醇肽(图3)。将树脂与TEA在DMSO中一起温育以环状释放，产生的短肽数量减少了约10至100倍，并产生了更多副产物。正如预期的那样，较长的肽Mpa-Lys-Trp-Gly-βAla-Mea通过环状释放机制有效释放，很可能是由于较小的构象限制所致。可以通过在280nm处的吸光度测量来定量的肽Mpa-Trp-Mea和Mpa-Trp-Mea的产率分别为3.6和4.3μmol，这对应于假设树脂上肽存在量为5μmol的71％和85％的产率。

1.3.真空下蒸发溶剂和还原剂

接下来测试还原剂BDT是否可以通过真空下离心而被去除。将以5μmol级别合成并在含有100mM BDT和100mM TEA的200μl DMF中释放的肽在96孔板的孔中于0.1mbar、30℃和400×g下离心。如果微孔板的所有孔都被填满，则溶剂在一小时内被有效去除。对所述肽的LC-MS分析显示所有BDT均被去除。然而，还发现对于某些肽，产物中高达10％的部分被反向氧化。据推测，所述氧化是由于高pH值促成的，并因此将相对于TEA的2当量TFA(200mM TFA)在真空离心蒸发之前加入每个孔中。通过这个过程，可以有效地抑制氧化的肽部分。

1.4.通过双亲电试剂环化二硫醇肽

测试了短二硫醇肽Mpa-Trp-Mea和Mpa-Tyr-Mea是否可以被双亲电试剂环化，如图4a所示。如果在稀释浓度下进行，所述肽约为1mM(或更低)，并且环化试剂用量稍过量，则通过亲电接头试剂经由两个或三个半胱氨酸对肽进行的环化是非常高效的和清洁的(P.Timmerman等人,ChemBioChem,2005,6,821–824；S.S.Kale等人,Nat.Chem.,2018,10,715–723)。将所述肽溶解在1ml的1:1乙腈:水中，加入3ml 90％ NH₄HCO₃缓冲液(100mM，pH8.0)、10％乙腈，并立即加入1ml双亲电试剂的乙腈溶液(10mM)。总共测试了10种双亲电试剂，如图4b中所示。肽和环化试剂的最终浓度分别约为1mM和2mM。所述肽Mpa-Trp-Mea环化反应的HPLC色谱图如图4c所示。在大多数反应中，二硫醇肽几乎定量地被环化，产率高于90％。少量副产物主要是与仅一个硫醇基反应的肽，因为其中之一被三苯甲基保护。为了淬灭过量的双亲电试剂，加入6当量(相对于肽)的β-Me，其与这些试剂反应但不影响大环。

1.5.讨论

本文建立了固相肽合成和洗脱策略，以高纯度和高浓度提供二硫醇肽，以便其可以容易地被双亲电试剂环化以合成大环化合物和文库。所述策略的关键要素是i)通过二硫键接头合成肽，ii)在固相上侧链的脱保护，iii)通过二硫键还原释放所述肽，以及iv)使用可以通过蒸发除去的挥发性还原剂，以便可以用双亲电试剂环化。在合成二硫醇肽和通过双亲电试剂环化后省略纯化步骤，使得可以获得大量大环化合物及其用于高通量筛选的应用。

1.6.材料和方法

2-(2-吡啶基二硫代)乙胺盐酸盐的合成

向在MeOH(16ml，含2％[v/v]AcOH)中的2,2’-二吡啶基二硫化物(4.41g，20mmol)的搅拌溶液中加入溶解在MeOH(10ml，含2％[v/v]AcOH)中的半胱胺盐酸盐(1.14g，10mmol)，逐滴加入将其溶解在10ml具有2％(v/v)AcOH的MeOH中，历时15分钟。将反应混合物在室温(RT)下搅拌过夜并减压浓缩，得到黄色油腻油状物。将残余物溶解在MeOH(16ml)中，分配到8个50ml falcon管中，并通过加入冰冷的乙醚(48ml/管)沉淀。将所述管在-20℃温育30分钟，并在4℃以3400×g(4000rpm，使用配备Sorvall 75006445转子的ThermoScientific Heraeus Multifuge 3L-R离心机，半径＝19.2cm；防爆)离心30分钟。重复沉淀8次后得到无色产物(产率＝90％)。

半胱胺-聚苯乙烯树脂的制备

以下操作描述了通过二硫键接头固定的携带约2mmol半胱胺的聚苯乙烯树脂的制备，其以5μmol级别足以合成4×96肽。向四个20ml塑料注射器中的每一个中加入563mg树脂(Rapp Polymere PolystyreneASH树脂，200-400目，0.95mmol/g荷载量)。将树脂用DCM(15ml)洗涤，然后在MeOH/DCM(7:3；15ml)中溶胀20分钟。将吡啶基-半胱胺二硫化物(2.10g，9.42mmol，4.4当量)溶解在MeOH(23ml)中，然后溶解在DCM(53ml)中。然后加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA；410μl)。将19ml体积的该溶液吸入每个注射器中，然后将注射器在室温下摇动3小时。弃去吡啶基-半胱胺溶液，用MeOH/DCM(7:3；2×20ml)洗涤树脂，然后用DMF(2×20ml)洗涤。将树脂作为在DMF中的悬浮液合并到单个注射器中，用在DMF(11.8ml)中的1.2M DIPEA溶液洗涤5分钟，以确保所有胺都被中和。弃去该溶液，用DMF(2×20ml)洗涤树脂，接着用DCM(4×20ml)洗涤，然后在真空下保持过夜，得到自由流动的粉末。

在96孔板中的Fmoc肽合成

使用自动肽合成仪(Intavis MultiPep RSi)在96孔肽合成滤板(Orochem，目录号#OF1100)中以5μmol级别合成肽。将半胱胺-PS树脂(约5mg，0.95mmol/g，5μmol量级)以粉末形式分配到所述板的每个孔中。用DMF(3×225μl)洗涤树脂。在这个步骤和所有后续洗涤步骤中，将树脂温育1分钟。将以下试剂按指定顺序转移至试管中，混合，温育1分钟，转移至微孔板中的树脂中，并在不摇动的情况下温育45分钟。试剂：50μl HATU(在DMF中500mM，5当量)、5μl N-甲基吡咯烷酮(NMP)、12.5μl N-甲基吗啉(在DMF中的NMM，4M，10当量)和53μl氨基酸(在DMF中500mM，5.3当量)。偶联反应的最终体积为120.5μl，试剂的最终浓度为208mMHATU、415mM NMM和220mM氨基酸。进行两次偶联。用DMF(1×225μl)洗涤树脂。通过与在DMF(100μl)中的5％乙酸酐和6％的2,6-二甲基吡啶一起在不摇动的情况下温育5分钟以封端未反应的氨基。用DMF(8×225μl)洗涤树脂。通过与含有20％(v/v)哌啶的DMF(120μl)温育两次，每次在不摇动的情况下温育5分钟，以去除Fmoc基团。对于较长肽序列的合成，温育时间从5分钟减少到2分钟，以减少暴露于所述碱。用DMF(8×225μl)洗涤树脂。肽合成结束时，用DCM(2×200μl)洗涤树脂。

在96孔板中进行肽侧链脱保护

为了从氨基酸侧链以及从Mea去除保护基团，通过将所述板压到柔软的厚度6mm的乙烯-醋酸乙烯酯垫上来密封96孔合成板的底部，并将每个孔中的树脂与TFA:TIPS:H₂O溶液(95:2.5:2.5[v/v/v]，约300μl)一起温育。将所述板用粘合密封膜(iST Scientific，QuickSeal Micro，目录号#IST-125-080-LS)覆盖，然后通过在顶部放置重物(1kg)压低以防止泄漏。温育1小时后，将所述合成板置于2ml深孔板上，并沥干TFA混合物。再次密封所述合成板并重复脱保护操作。用DCM(3×500μl；用注射器加入)清洗孔，DCM通过重力流动流过孔。通过将所述合成板放入真空歧管中5分钟来干燥树脂。

通过β-Me、DTT或BDT的还原肽释放

为了从树脂中释放肽，通过将96孔合成板压在柔软的厚度6mm的乙烯-醋酸乙烯酯垫上密封底部，并将每个孔中的树脂与含有500mMβ-Me或100mM DTT或100mM BDT及含有100mM TEA的200μl DMF溶液在室温温育4小时。此后，通过在250×g(在配备Sorvall75006445转子，半径＝19.2cm转子的Thermo Scientific Heraeus Multifuge 3L-R离心机上以1100rpm)在室温离心2分钟，将样品收集在96深孔板中。

肽的环化释放

如上述密封96孔合成板，并通过与含有250mM TEA(10当量)的200μl DMSO溶液在室温下温育过夜，从树脂中释放肽。此后，通过在250×g(在配备Sorvall 75006445转子，半径＝19.2cm转子的Thermo Scientific Heraeus Multifuge 3L-R离心机上以1100rpm)在室温离心2分钟，将样品收集在96深孔板中。

在固相释放或环化后对肽进行的LC-MS分析

对于从固相释放的肽(在DMF或DMSO中浓度高达25mM)，将1μl肽在60μl含有0.05％甲酸的milliQ H₂O中稀释。对于来自环化反应的肽(浓度约为1mM)，将10μl反应混合物与10μl含有0.05％甲酸的milliQ H₂O混合。使用反相C18色谱柱(Phenomenex2.6μm，50×2.1mm)，在Shimadzu 2020单四极杆LC-MS系统上对样品(注入10μl)进行分析，溶剂B(MeCN，0.05％甲酸)相对于溶剂A(H₂O，0.05％甲酸)的线性梯度在5分钟内从0％至60％，流速为1ml/min。在220nm处记录吸光度并以阳性模式分析质量。

还原剂和溶剂的真空离心蒸发

以下示例描述了还原释放后浓度为20mM的肽。在通过还原(在含有100mM BDT和100mM TEA的DMF中)从固相释放的200μl肽中，将5μl(0.1μmol)转移至V形底96孔板的孔中(Ratiolab，6018321，PP，未灭菌)。将7μl的1％ TFA水溶液(v/v)加入每个孔中以达到相对于TEA的2当量TFA。使用Christ RVC 2-33CDplus IR仪器对该样品进行真空离心蒸发，以除去溶剂(DMF)和还原剂(BDT)。将样品在0.1mbar、30℃和400×g(1750rpm，在带有124708板支架插入件的Christ 124700转子中，半径＝10.5cm)离心。在这个步骤后，所述肽不可见。

肽的环化

将还原并干燥的肽(0.1μmol)溶解在20μl的50％乙腈、50％ H₂O中，以达到5mM的浓度。向该溶液中加入60μl反应缓冲液(100mM碳酸氢铵，pH 8.0，含有10％乙腈[v/v])，然后加入20μl的10mM环化接头的乙腈溶液(2当量)。该反应中的最终浓度为1mM肽、2mM环化接头、60mM碳酸氢铵缓冲液和35％乙腈。将所述板用箔纸密封盖住并将反应物在室温下温育2小时。

环化反应中接头试剂的淬灭

在环化反应完成后，将4μl的150mMβ-Me的乙腈溶液(0.6μmol，相对于所述肽为6当量)加入反应混合物中，并在室温下温育1小时。使用Christ RVC 2-33CDplus IR仪器通过真空离心蒸发除去溶剂(MeCN)、缓冲液(碳酸氢盐)和过量的β-Me。将样品在0.1mbar、30℃和400×g(1750rpm，在带有124708板支架插入件的Christ 124700转子中，半径＝10.5cm)离心。在这个步骤后，所述肽不可见。

实施例2：环化释放

2.1.结果与讨论

在第一个实验中，测试了不同树脂合成通过二硫键连接至固相的短肽。在五种不同的树脂上合成了肽Mpa-Gly-Gln-Trp-Mea，其中Mpa是巯基丙酸(不含氨基的半胱氨酸)，Mea是2-巯基乙胺(半胱胺；不含羧酸的半胱氨酸)(图5b)。使用两种极性的聚乙二醇(PEG)树脂(1，2)、一种也是极性的PEG修饰的聚苯乙烯(PS)树脂和两种非极性的PS树脂(4和5)。树脂5已经含有硫醇基团，而对于树脂1至4则是通过酰胺化附加三苯甲基保护的Mpa引入硫醇基团。通过将树脂与过量的2-(2-吡啶基二硫代)-乙胺一起温育来引入二硫键连接的Mea。在碱或酸存在下，在甲醇(MeOH)/二氯甲烷(DCM)混合物和在DMF中测试二硫键交换反应，发现在30％ MeOH、70％ DCM和1当量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA；相对于2-(2-吡啶基二硫代)-乙胺)的条件下进行效果最好。使用标准Fmoc化学作用附加三个氨基酸Trp、Gln和Gly以及Mpa，并通过将树脂与95％ TFA、2.5％ TIS和2.5％水温育一小时去除侧链保护基团。

接下来，使用DIPEA作为碱，通过将所述肽N末端的巯基去质子化来测试环化二硫键的释放。在非极性树脂4和5的情况下，将所述树脂在DMSO中与150mM DIPEA温育可实现高效释放(图5c)。洗脱液中肽的浓度分别为5.1mM(树脂4)和11.6mM(树脂5)。释放的肽量分别为基于树脂荷载量预计合成量的21±5％(树脂4)和44±4％(树脂5)。鉴于二硫键接头的装配很可能不是定量的，即使对于已经携带硫醇基团的树脂(树脂5)，通过环化释放机制回收的肽的百分比也可能高于44％。对产物的LC-MS分析显示二硫键环化肽的纯度高达95±4％(树脂4)和93±1％(树脂5)(图5d)。唯一的副产物是环肽二聚体，平均含量仅为6％。所述二聚体环状产物很可能是通过二硫键交换介导的树脂上一个肽转移到相邻肽以及随后环状二聚体的环化释放而形成的。

为了评估环化二硫键释放策略的底物范围，合成了25μmol级别的Mpa-Gly-Ala-Xaa-Mea形式的四种肽(图6a)。在四种肽中的三种肽的“Xaa”位置，插入了氨基酸分子砌块，从而对肽的主链施加了刚性。对通过碱诱导的环化释放获得的产物进行HPLC分析，显示所述四种肽中的每一种肽都有一个主峰，并且MS分析证实这些主要产物是期望的环肽。吸光度测量显示所有四种肽均以两位数毫摩尔浓度获得。过度冻干后通过称重对产物进行定量示出产率范围为13.5至26μmol，相当于基于树脂荷载量的预期产率的54％至100％。对于所有四种肽，仅观察到有限数量的副产物，且量很少(图6b和6c)。主要副产物是环状二聚体，这次洗脱为两个接近的峰，这最有可能对应于两种可能的二聚体，一种是头对头/尾对尾连接，一种是头对尾连接。用TCEP对产物进行线性化，并且HPLC分析显示对于肽1-4，所述线性肽产物的纯度分别为96％、96％、100％和92％(图6b，右侧色谱图)。TCEP-线性化实验表明，可以通过还原和随后在有利于分子内环化的浓度下的氧化再环化来去除二聚体环肽。为了测试是否可以根据所述环化释放策略生成更短的肽，用缩短一个氨基酸的Mpa-Ala-Xaa-Mea形式的四种肽重复该实验。所述四种肽也被有效释放，并且HPLC谱中的主峰是期望的环肽。环状二聚体的比例总体上稍高，很可能是由于短主链及由此产生的构象限制阻碍导致环化效率较低。

为了评估环状二硫键释放策略是否可用于文库合成和筛选，在96孔板中和在5μmol级别设计并合成了环肽。制备了三种形式的96个随机二硫键环化肽，如图7a所示。这些肽包含三个随机氨基酸Xaa，两侧为Mpa和Mea。每个肽中的两个随机氨基酸选自四个结构不同的氨基酸，这导致了高度多样化的环肽主链。所述随机氨基酸之一是Trp或Tyr，可以通过在280nm处的吸收测量来定量肽产率。通过在200μl DMSO中加入150mM DIPEA进行肽的环化释放，随后的吸收测量显示较高的平均肽浓度，为13.3mM，以及所述肽中的90个肽的较窄的浓度分布，为8.9mM(低于平均值1.5倍)至20mM(平均值的1.5倍)。其中三个肽根本没有被合成或释放。通过LC-MS分析随机挑选的12个环肽，结果显示平均纯度高达84％。

尽管数量相对较少，只有96个环肽，因此发现活性化合物的机会很小，但我们使用大约10μm的化合物浓度针对凝血酶进行筛选，所述凝血酶是开发抗凝治疗剂的重要靶标。最具活性的肽使凝血酶活性降低52％，考虑到肽不包含与凝血酶特异性袋S1结合的氨基酸Arg和Lys，这种作用是显著的(图7C)。重复筛选鉴定了与最具活性的苗头化合物(hit)相同的环肽(图7C中的绿点)。HPLC纯化的二硫键环化肽Mpa-Tyr-II-Pro-Mea抑制凝血酶，K_i为13±1μm。小规模筛选表明，大多数环肽不会影响凝血酶活性，这表明在环化释放后没有干扰生物学测定的肽洗脱组分，包括存在于肽原液中的DMSO和DIPEA。生物筛选通常以约10μm的化合物浓度进行，这意味着在约10mM肽原液中的100％ DMSO和150mM DIPEA稀释1000倍以分别达到0.1％和150μM的浓度，这不太可能影响大多数生物测定。

2.2.结论

总之，本文基于二硫键交换反应开发了环化肽释放策略，所述二硫键交换反应开直接从固体支持物产生高纯度的二硫键环化肽。据我们所知，这是第一种使用可通过蒸发去除的裂解试剂以高纯度释放环肽文库，以便可以使用生物测定轻松筛选肽而无需事先纯化的方法。重要的是，具有不同序列的肽的产率显示出较窄的分布，甚至无需确定或调整浓度即可筛选所述环肽。表明所述方法适用于生成包含数百个肽的文库。

实施例3：环肽文库规格的大规模扩展

3.1.通过外周胺对环肽支架进行酰化

为了使大环文库组合多样化，如图8a所示，选择修饰作为外周基团的胺和作为羧酸的片段。N-乙酰化反应高效且具有选择性，已广泛应用于DNA编码的化学文库的合成(P.R.Fitzgerald等人,Chem.Rev.,2020)。N-乙酰化还用于通过在溶液中的一组羧酸来使先导结构多样化，然后进行活性筛选粗制反应(A.Brik等人,Chem.Biol.,2002,9,891-896)或者甚至X-射线晶体学分析(M.R.Bentley等人,J.Med.Chem.,2020,63,6863-6875)。使用模型支架环(Mea-Lys-Xaa-Mpa)测试反应，该模型支架带有作为外周基团的伯胺(图8b)和八个结构不同的羧酸(图8c)。为了有效地将支架转化为期望的产物，选择使其与4倍摩尔过量的羧酸反应。期望将支架近定量地转化为产物，因为如果未修饰的支架比酰化支架更富集则其可能较弱结合并干扰筛选。过量的羧酸会导致筛选中出现未反应的羧酸，但据推测，大多数羧酸由于尺寸小而本身不会与靶标结合。预期酰化反应的副产物仅是过量的羧酸、HOBt和四甲基脲，其中任何一个都不会与生化测定不相容。使用HBTU作为活化剂和DIPEA作为碱，将环肽支架(终浓度为10mM)与4倍摩尔过量的8种酸(体积为4μl)一起温育3小时，发现所述支架完全转化为几乎所有酸(图8c中的顶部数字)。

3.2.纳升体积的大环化合物文库合成

随后在80nl中测试相同环肽支架的组合多样化，因此体积小了50倍。这个步骤至关重要，因为计划以小体积生成纳摩尔级别的文库，以便微摩尔量的支架(可以在96孔板的孔中轻松合成(5μmol级别))足以从一个支架合成超过100个大环化合物。此外，它的目的是应用声学分配技术来转移试剂，该技术适合转移纳升体积，但不适用于微升体积。声学分配的一大优点是可以无接触地转移试剂，不需要移液头，加快分液速度，减少浪费和成本。应用相同的反应条件导致产率低得多(图8c中两个较低数字中的第一个)，需要优化酰化反应。假设低产率与DIPEA的使用有关，因为碱相对不稳定，并且在通过声波分配为2.5nl液滴时会部分损失。使用非挥发性碱DABCO和HEPES钠盐以及在所用溶剂体系中具有高溶解度且可以以更高浓度应用的挥发性NMM进行测试。对于所有这三种碱，将大环化合物均用测试的三种酸定量酰化，并且将DABCO应用到其他酸中表明，该条件适合环肽中外周胺的有效修饰(图8c中两个较低数字中的第二个)。

在下一步中，用其他大环化合物测试酰化反应。具体而言，选择大环支架，其中氨基暴露程度低于所述模型支架环(Mpa-Lys-Xaa-Mea)之一。为此，订购了Enamine公司提供的4种大环化合物(图13a)。所有这些化合物都是非肽大环化合物，含有氨基酸以外的其他分子砌块。使用相同反应条件和酸的酰化反应(图13b)显示大环支架有效转化为携带羧酸的大环化合物(图13c)。

3.3.携带氨基的环肽支架的合成

接下来合成具有随机结构和一个外周氨基的环肽支架，使用最近开发的方法以在96孔板中有效地产生大量小环肽。简而言之，在固相上合成短肽，并通过二硫键环化反应释放，产生不需要进一步纯化的基本上纯的支架(图9a)。生成了第一个环肽支架文库，其含有三个不同的氨基酸，一个是侧链中带有伯胺的氨基酸(选自7个氨基酸)，一个是带有随机侧链的α-氨基酸(选自15个氨基酸)，一个具有随机主链结构(选自6个氨基酸)(图9b和9c；子文库1a-f)。还合成了第二个文库，其中通过半胱氨酸残基引入伯氨基。在3,240个(文库1)和540个(文库2)理论上可以使用指定氨基酸以组合方式组装的不同支架中，随机选择了384个，并将其在四个96孔板中合成。通过吸收对45个含有Trp残基的环肽进行定量，示出大多数分子以良好的量获得(平均浓度＝8.1mM；图9d)。鉴于产率分布相对较窄，浓度未归一化以供进一步使用。

3.4.组合大环文库合成和凝血酶筛选

使所述384个支架与12种羧酸组合反应(图10a)，产生4,608个不同的大环化合物，并针对凝血蛋白酶和治疗靶标凝血酶筛选该文库。凝血酶抑制剂已在临床上作为抗血栓药物使用，但口服利用率较低。作为羧酸，选择了结构多样的分子，包括几个可能结合到凝血酶的S1(氢键)和S2(疏水相互作用)特异性口袋的片段(图10a)。已知含有正电荷的基团例如胍与S1亚位点特别结合，但它们被省略了，因为我们的兴趣在于开发具有有限极性表面且不带电荷的大环化合物，该大环化合物有可能口服施用。事实上，已批准的凝血酶抑制剂的活性形式含有这样的带正电荷的基团，需要作为前药应用，这可能是口服利用率有限的原因。使用声学分配器，将20nl支架(平均8.1mM)和20nl预活化酸(80mM)组合，以达到约4mM支架和40mM羧酸的终浓度(图10b)。选择使用10倍摩尔过量的羧酸(相对于之前的4倍)，因为支架中的一些氨基比上述模型肽中的α-氨基更难接近。5小时后，通过加入5μl 100mMTris缓冲液猝灭反应过夜，加入体积为5μl的凝血酶(2nM终浓度)，并使用荧光底物(5μl)测量剩余的凝血酶活性。筛选中大环化合物的浓度为约10μM。0.2％(9/4277)的反应物使凝血酶抑制>50％，所有反应物都是含有氯噻吩酸(14)的大环化合物(图10c)。在独立实验中重复涉及氯噻吩酸(384个支架×14)和凝血酶的所有大环合成反应，基本上鉴定了相同的热门苗头化合物，因此显示出多样化反应和活性筛选的高度重现性(图10d)。

先前报道，提供大部分苗头化合物的氯噻吩酸(14)在胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶FXa中充当S1亚位点结合基团(P.M.Fischer,J.Med.Chem.,2018,61,3799-3822)，因此预计命中的是将氯噻吩基团指向S1口袋的大环化合物。到目前为止，并非所有用酸14修饰的大环化合物均抑制凝血酶，这表明大环化合物主要有助于结合。由于酰化反应中使用了10倍过量的羧酸，因此凝血酶筛选的所有孔中未反应的14的浓度约为100μM。在这个浓度下，它不抑制凝血酶，如其中加入14但未加入大环化合物支架的对照反应所示，但是含有14和支架的384个孔中的许多孔未显示凝血酶抑制(图10c)。由于14是与氨基反应后以甲酰胺出现的，通过用氯噻吩酰胺测试凝血酶的抑制作用，发现K_i＝380μM。弱的抑制作用证实大环化合物支架主要有助于鉴定的大环化合物的活性。最佳的三个苗头化合物M1、M2和M3在结构上高度相关，全部基于环(Mpa-D3-B5-Xaa-Mea)形式的支架，其中氨基酸Xaa均是具有疏水侧链的α-氨基酸(D-Val、L-Phe、L-Val；图10e)。

3.5.酰化支架是活性物质

接下来评估在筛选中观察到的活性是否源自预期的大环化合物或副产物，例如羧酸的加合物或大环二聚体。为此，对于前两个苗头化合物M1和M2，以250倍大的级别(相同的浓度但更大的体积)重复支架与羧酸14的反应，使反应物通过RP-HPLC柱以分离20个级分，每个级分组合在一分钟内洗脱的产物，冻干级分并测量凝血酶抑制活性(图10f)。对于这两个反应，含有所需大环产物的级分显示出迄今为止最高的活性，表明苗头化合物是根据大环化合物M1和M2的活性来鉴定的。

纯化的大环化合物M1、M2和M3抑制凝血酶，其K_is分别为44、165和125nM(图10e)。根据治疗应用，本文筛选的所有支架中存在的可还原二硫键不是所期望的，因此测试它们是否可以被更稳定的键替换。合成M4和M5，其含有二硫缩醛或硫醚接头。M4和M5抑制凝血酶，其K_is分别为83±8nM和135±16nM，因此亲和力仅弱2倍和3倍。

3.6.蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的开发

大环化合物因抑制蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)而受到广泛关注，原型PPI疾病靶点是MDM2:p53，为此进行了许多尝试来开发抑制剂(M.Konopleva等人,Leukemia,2020,34,2858-2874；L.Skalniak等人,Expert Opin.Ther.Pat.,2019,29,151-170)。MDM2的过表达抑制肿瘤抑制因子p53的活性，而阻断MDM2-P53相互作用的MDM2结合剂对于开发新的抗癌疗法非常有意义(P.Chène,Nat.Rev.Cancer,2003,3,102-109)。为了测试这一具有挑战性的PPI靶点的新方法，合成了192个结构多样的环肽支架，所有这些支架都基于三种随机氨基酸，其中一种氨基酸含有用于横向多样化的氨基。为了增加鉴定结合剂的机会，在所有支架中都包括色氨酸或苯丙氨酸，这两种氨基酸在结合MDM2并抑制MDM2:p53相互作用的钉书肽(stapled peptides)中形成关键相互作用。如上针对文库1所述，在96孔板中合成环肽支架，并以12.9mM的平均浓度和90％的平均纯度获得。与之前一样，将支架通过片段酰化以组合方式进行修饰，这次使用104种羧酸。因此，支架文库的大小从192个结构扩展到19,968个大环化合物，因此扩大了100倍以上。

通过向384-微孔板中的反应分配靶蛋白MDM2和报告肽以测量大环化合物的结合来筛选文库。荧光报告肽与MDM2上的PPI界面结合(K_d＝0.5μM)，并且可以通过测量荧光偏振来跟踪其被大环化合物的置换。筛选结果再次显示在支架(垂直)和片段(水平)组合的阵列中，颜色指示报告肽从MDM2位移的程度(图11)。两组苗头化合物似乎最令人感兴趣，一组在水平线上发现，因此大环化合物共享相同的支架环(Mpa-Trp-D3-B4-Mea)，一组在垂直线上发现，因此大环化合物共享相同的羧酸(9)。使用所有192个支架和四种给出最佳命中的羧酸(9、14、25、91)重复酰化反应和筛选，证实了初始筛选的结果。在两个命中组的每一组的三个反应中进行的活性物质的分析表明，对于第一组(苗头化合物M6、M7和M8)，所述活性物质是预期的大环结构，但第二组则不是(图12a)。

3.7.纳摩尔级MDM2结合剂的鉴定

纯化的大环化合物M6、M7和M8有效地置换了MDM2中荧光肽探针，并具有类似的IC₅₀——约为1μM(图12b)，但竞争测定法不适合确定低微摩尔或纳摩尔范围内的结合常数，因为测定中需要高MDM2浓度(1.2μM)。因此，这三个大环化合物被合成为与荧光素的缀合物，该荧光素连接到肽支架的N末端区域，并在直接荧光偏振测定中测量了结合亲和力(图12c)。所述缀合物的K_d值为650±50nM(F-M6)、790±80nM(F-M7)和340±40nM(F-M8)。

3.8皮摩尔级迭代合成和筛选

大环化合物的简便合成使得可以基于可提高结合亲和力的苗头化合物迭代合成子文库。为了增强在初始筛选中确定的大环化合物M8的效力，我们使用与M8中相似的氨基酸合成了63个支架(图18a)，其为3-哌啶甲酸(Nip)的三种类似物、二氨基丙酸(Dap)的三种类似物和色氨酸(Trp)的七种类似物(3×3×7＝63)。然后，我们用14种羧酸使63个支架多样化，其中包括初始文库苗头化合物的重复(羧酸14、25、91)，以及肉桂酸类似物91的相关结构，大环苗头化合物M8的羧酸(105-115；图28)。为了鉴定具有纳摩尔亲和力的结合剂，我们以比第一次筛选低13倍的浓度(750nM)筛选了882个大环化合物(63×14)，对应于30pmol级别(图18b)。虽然最具活性的大环化合物是基于原始支架，但我们在这个筛选中鉴定出产生更有效大环化合物的羧酸，即109，它在750nM时置换了68％的报告肽(大环化合物M9)，而M8相应为21％(酸91；图18b)。尽管我们没有基于支架而改进，但我们从63个支架的筛选中收集了有意义的大环环的结构-活性关系数据，并表明所有分子砌块都是必不可少的。

随后，我们进行了第三轮文库合成和筛选，其中用15种额外的羧酸(主要是具有较大取代基的肉桂酸衍生物)酰化了先前筛选的9个最有希望的支架。我们随后鉴定了M10，它是基于原始支架的大环化合物，并用酸120酰化，在750nM时从MDM2将所用荧光探针F-M8置换84％，并且比母本化合物M8和M9更有效(图18c)。我们将大环化合物M10与荧光素缀合，并使用FP测量其与MDM2的结合，Kd为43±18nM(图18d)。使用荧光素缀合物，我们还使用与MDM2的特定疏水性口袋结合(B.Anil等人,Acta Crystallogr.Sect.DBiol.Crystallogr.2013,69,1358-1366)并且是基于nutlin的临床候选药物的前体的nutlin-3a进行竞争实验。这两个配体不竞争，表明所述大环化合物结合不同的位点并可能具有新的抑制机制(图29)。通过表面等离子共振(SPR)作为正交试验法重复进行大环化合物的结合测量，结果显示Kd为600±300nM(M6)、550±190nM(M7)、169±93nM(M8)和29±14nM(M10)，证实了FP测定发现的亲和力范围(图18e和图30)。

3.9结论

本文描述了一种使用活化的羧酸的声学分配在皮摩尔级别上使大环化合物主链多样化的方法。从SPPS开始，在短短四天内就获得了数千种不同的大环化合物作为粗制反应混合物。然后直接针对蛋白质靶标筛选这些混合物，并成功鉴定出抑制剂。纳升体积的酰化反应是稳健的，并且导致许多不同的羧酸和大环化合物的产物的高转化率。没有观察到意外的副产物。我们的自动化平台可以在一小时内完成这个最后的多样化步骤。这与需要费力纯化的传统大环化合物文库的合成形成对比。虽然声学分配过去已用于合成，但它仅限于合成反应范围的细化，而不是用于筛选化合物的直接合成。我们的反应规模较小，而且相对纯度较高，因此可以在同一微量滴定板中针对蛋白质靶标直接筛选大环化合物。事实证明，可以从这些筛选中鉴定出抑制剂，并且观察到的活性是由于所需的产物而不是杂质所致。文献中对粗制混合物的筛选仍然有限。本发明人不知道任何现有的相同级别的研究尝试，或特别与大环化合物相关的研究结果。鉴于我们方法的简便性，它应该适用于许多蛋白质靶标的筛选。此外，许多不同的化学反应可用于基于ADE的多样化；由于其简便性以及其先前用作粗制筛选的反应，因此选择酰胺键形成作为初始示例。尽管本发明人合成的最大的文库有20,000个大环化合物，但它可以相对容易地扩展到数十万个。为了将来生产更多的前导样化合物，所述方法可以应用于通过不可还原键环化的主链结构。分子砌块系列可以扩展到氨基酸之外，以进一步增加文库的药物样性质。所述方法可用于筛选更多治疗相关的靶标，期望针对其开发临床候选物。

3.10补充结果

人α-凝血酶与M1复合物的总体结构

人α-凝血酶由36个氨基酸残基(轻链)和259个氨基酸残基(重链)的两条多肽链组成，通过二硫键(H链的Cys122与L链的Cys1)共价连接。对α-凝血酶(轻链和重链)和大环化合物M1形成的晶体的X射线结构分析表明，在不对称单元中存在四个几乎相同的人α-凝血酶重链和轻链拷贝。将α-凝血酶的这四个轻/重链分别命名为A/B、C/D、E/F和H/L。H/L的结构用于所有计算和制备结构图。人α-凝血酶的轻链可以明确地从Glu1C追踪到Ile14K。氨基末端残基(Thr1H至Gly1D)和羧基末端残基Asp14L(轻链C和E除外)、Gly14M和Arg15未被定义，在Fourier图中不可见。除作为表面柔性自溶环一部分的少数氨基酸(Trp148至Val149C)外，所有残基的重链电子密度均清晰可见。羧基末端残基Glu247缺乏足够的电子密度。微小的差异发生在柔性和不太明确的环的水平或暴露的外周侧链的方向上。如果与其他人α-凝血酶结构相比，无论是apo形式还是与抑制剂的复合物修饰，与大环结合的人α-凝血酶的整体结构没有显示出任何明显的主链重排。

大环化合物M1的整体结构

大环化合物M1的电子密度明确，允许对不对称单元中存在的所有四种蛋白质复合物进行明确的基团方向指派。M1中原子的编号如图26b所示。在所述大环化合物中没有发现传统的二级结构元件和非共价分子内相互作用。所述分子看起来采用椅状构象，非常适合于催化口袋的形状。

人α-凝血酶和M1之间的相互作用

M1大环良好地适合于由活性位点和覆盖蛋白质表面的周围底物袋形成的裂缝(N.Voss等人,Nucleic Acids Res.2010,38,W555-W562)。在不对称单元中存在的四个凝血酶分子的四个活性位点中，大环化合物的构象和相互作用是等效的。M1与人α-凝血酶的大部分相互作用是由容纳在主要特异性S1口袋中的5-氯噻吩-2-甲酰胺官能团介导的。这个基团通过与Gly219主链(M1 N7与Gly219 O)和H₂O分子之间的氢键被捕获在口袋中，所述H₂O分子将M1的氧O9和Gly193 N的主链氮和Ser195的主链氮桥接起来。5-氯噻吩-2-甲酰胺进一步参与与附近Cys191(M1 O9与Cys191 O)、Glu192(M1 O9与Glu192 N)、Gly216(M1N7与Gly216 O及M1 S15与Gly216 N)、Trp215(M1 S15与Trp215 N)的主链及Cys220的侧链(M1 N7与Cys220 S)极性接触的网络。氯原子5-氯噻吩-2-甲酰胺官能团指向S1口袋的底部，在那里它可能与Tyr228的芳环形成卤素-芳香π相互作用/>M1的主链氮N4和氧O17分别与Gly216的主链氧(Gly216 O)和Gly216的氮(Gly216 N)形成氢键。此外，M1的主链氮N4和氧O17可以分别与Gly219的主链氮(Gly219 N)和Gly216的氧(Gly216 O)形成极性接触。类似地，M1的主链氮N18可以与Glu192的侧链羧基(Glu192 OE1和OE2)形成两个极性接触。最后，H₂O分子将M1的主链氮N27与Glu97A(Glu97A O)的主链氧桥接起来。重要的是，M1与人α-凝血酶的结合是通过相邻酶残基的主链和侧链的多重疏水性接触介导的。大环主链(C20-C24)包括二硫键S21-S22，朝向由残基His57、Tyr60A、Trp60D(近端S2口袋)和Leu99(远端S3口袋)的侧链形成的疏水笼。缬氨酸侧链(C28-C31)将环的另一侧弯曲至朝向由Ile174和Trp215形成的疏水性口袋。最后，C35-C40苯环位于凝血酶环(Gly216-Cys220)之上。

3.11补充材料和方法

一般考虑因素

除非另有说明，所有试剂均购自商业来源且无需进一步纯化即可使用。溶剂不是无水的，使用前也没有被干燥。使用以下缩写：DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)，DABCO(1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷)，NMM(4-甲基吗啉)，HBTU(N,N,N’,N’-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲-六氟磷酸盐)，HATU(N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲-六氟磷酸盐)，HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)。

模型支架1的合成

环肽模型支架1是使用先前描述的环化二硫键释放策略(CDR)合成的(S.Habeshian等人,ACS Chem.Biol.2022,17,181-186)。使用Rapp Polymere HA40004.0聚苯乙烯A SH树脂(200-400目)、0.95mmol/g荷载树脂，根据Habeshian,S.等人2022²所述的操作，在5ml聚丙烯合成柱(MultiSyntech GmbH，V051PE076)中以25μmol级别合成线性肽前体。如下所述释放肽。为了使侧链脱保护，将树脂与2ml的38:1:1的TFA/TIS/ddH₂O v/v/v一起温育1小时，然后用5×4ml DCM洗涤。对于环化肽释放，将树脂用含有150mM DIPEA(6当量)的1ml DMSO处理过夜。通过过滤除去树脂。通过RP-HPLC纯化粗制混合物，使用WatersHPLC系统(2489UV检测器，2535泵、Fraction Collector III)、19mm×250mm WatersXTerra MS C18 OBD Prep Column C18柱(孔径，10μm颗粒)、溶剂系统A(H₂O，0.1％v/vTFA)和B(MeCN，0.1％v/v TFA)以及30分钟内0-25％的溶剂B梯度进行。使含有模型支架的级分冻干并溶解在DMSO中以达到40mM的浓度。

通过移液试剂对模型支架1进行酰化

如下所述，将模型支架在4μl体积中以40nmol级别酰化。为支架(20μl在DMSO中40mM原液)中补充碱(20μl溶解于DMSO中160mM DIPEA)，并将2μl混合物转移至PCR板的孔中。将羧酸制备成在含有160mM DIPEA的DMSO中的160mM原液。将等体积的HBTU(160mM，在DMSO中)加入到每个酸原液中，并将2μl所得活性酯(80mM)加入到同一PCR板中。使反应在室温下进行3小时。此后，将1μl反应物转移至99μl 100mM Tris-HCl水溶液(pH 7.5)中，温育6小时，以用Tris猝灭活化的酸，并通过LC-MS分析反应。

通过声学试剂转移对模型支架1进行酰化

如下所述将模型支架以800pmol级别在80nl体积中进行酰化。为支架1(20μl在DMSO中的40mM原液)补充碱(溶解在DMSO中的20μl 160mM DIPEA、20μl 160mM DABCO、20μl160mM HEPES钠盐或20μl 1M NMM)，并将10μl混合物转移至ECHO源板(Labcyte EchoQualified 384孔低死容(low-dead-volume)微孔板)。源板中的浓度为20mM模型支架和80mM DIPEA(4当量)、或80mM DABCO(4当量)或800mM NMM(40当量)。将羧酸制备为在DMSO中的160mM原液，其中含有160mM DIPEA、160mM DABCO或1M NMM。将等体积的HBTU(160mM，在DMSO中)加入到每个酸原液中，并将活性酯(80mM)加入到同一源板中。将源板以950g(2,000rpm，使用Thermo Heraeus Multifuge 3L-R离心机)离心3分钟，以去除潜在的气泡。使用Labcyte Echo 650声学分配器，将40nl模型支架1(800pmol)转移至Nunc 384孔低容积聚苯乙烯板，然后转移40nl活性酯(3.2nmol，4当量)。所述转移以一式两份进行，以便有足够的材料用于LC-MS分析。将所述板密封，使反应在室温下进行6小时。此后，将8μl 100mMTris-HCl水溶液(pH 7.5)加入到每个重复反应中，合并重复反应，温育3小时，以用Tris猝灭活化的酸，并通过LC-MS分析反应。

通过声学试剂转移对模型支架2-5进行酰化

从Enamine购买的模型支架2-5以1.1至1.2mg粉末形式获得。将支架溶解在62至88μl DMSO中以获得40mM原液。使用DABCO作为碱对支架进行酰化，如上面关于模型支架1所述，但有以下差异：反应时间为6小时。在LC-MS分析之前，将720nl DMSO分配到每个孔中，然后分配7.2μl的100mM Tris-HCl的pH 7.5水溶液。猝灭过夜。

支架和氨基酸序列的设计

通过随机选择氨基酸序列来制备用于文库1的环肽支架。理论上可以根据所选支架形式和氨基酸分子砌块生成的不同序列的数量远大于为文库1合成的支架数量(384)，如下所述：

文库1的理论支架数量：

-含有二氨基酸的支架：3,240

#支架形式(6)×#二氨基酸(6)×#主链氨基酸(6)×#侧链氨基酸(15)

-含有半胱氨酸的支架：540

#支架形式(6)×#主链氨基酸(6)×#侧链氨基酸(15)

为了随机选择384个氨基酸序列，为所有分子砌块分配了一个字母数字标识符，并且手动枚举每种可能的排列。这些肽的编号为1至3,780。然后使用随机序列生成器(https://www.random.org/sequence/)对数字重新排序，并选择前384个进行合成。

用于文库合成的聚苯乙烯-S-S-半胱胺树脂的制备

应用以下操作制备聚苯乙烯-S-S-半胱胺树脂，用于在四个96孔板中合成5μmol级的4×96个肽，这是合成文库1支架所需的(凝血酶筛选)。向四个20ml塑料注射器(CEM，99.278)的每一个中加入589mg树脂(Rapp Polymere HA40004.0聚苯乙烯A SH树脂，200-400目)，0.85mmol/g荷载量，对应于0.5mmol级。将树脂用15mL DCM洗涤，然后在15ml的3:7的MeOH/DCM v/v中溶胀20分钟。将2-(2-吡啶基二硫代)-乙胺盐酸盐(1.96g，8.8mmol，4.4当量)溶解在21.12ml的MeOH中，然后加入49.28ml DCM和1.53ml DIPEA。将17.7ml该溶液吸入每个注射器中，然后在室温下摇动3小时。此后，弃去2-(2-吡啶基二硫代)-乙胺溶液，并将树脂用2×20ml的3:7的MeOH/DCM v/v洗涤，然后用2×20ml DMF洗涤。将树脂作为在DMF中的悬浮液合并到单个注射器中，然后用11.8ml在DMF中的1.2M DIPEA溶液洗涤5分钟，以确保所有胺均为中性。弃去该溶液，并将树脂用2×20ml DMF、4×20ml DCM洗涤，然后在真空下保持过夜以获得自由流动的粉末。对于文库支架的合成(MDM2筛选)，树脂荷载量为0.95mmol/g，因此将526mg树脂加入两个注射器的每一个中。

在96孔板中的肽文库合成

在Intavis Multipep RSi合成仪上进行自动固相肽合成。对于凝血酶文库，向50ml试管中加入565mg聚苯乙烯-S-S-半胱胺树脂(0.48mmol半胱胺，假定硫醇基团被半胱胺定量修饰)和20ml DMF。对于MDM2文库，代以加入505mg功能化树脂。摇动试管以确保树脂均匀悬浮，并将200μl(5.88mg树脂，5μmol)转移至96孔固相合成板(Orochem OF 1100)的每个孔中。将树脂用6×150μl DMF洗涤。使用53μl氨基酸(500mM，5.3当量)、50μl HATU(500mM，5当量)、12.5μl N-甲基吗啉(4M，10当量)和5μl N-甲基吡咯烷酮进行偶联。将所有组分预混合1分钟，然后加入到树脂中(反应1小时，无摇动)。偶联反应的最终体积为120.5μl，试剂的最终浓度为220mM氨基酸、208mM HATU和415N-甲基吗啉。进行两次偶联，然后将树脂用6×225μl DMF洗涤。使用120μl的1:5哌啶/DMF v/v进行Fmoc脱保护5分钟，并进行两次。将树脂用8×225μl DMF洗涤。在肽合成结束时，将树脂用2×200μl DCM洗涤。

文库侧链保护基团去除

为了去除侧链保护基团，通过将板压到柔软的厚度6mm的乙烯-醋酸乙烯酯泡沫垫(Rayher Hobby GmbH，78 263 01)上来密封96孔合成板的底部，并且将每个孔中的树脂与约500μl的38:1:1的TFA/TIS/ddH₂O v/v/v温育1小时。将所述板用聚丙烯粘合密封件覆盖，然后通过在顶部放置重物(1kg)压低，以确保不发生泄漏。1.5小时后，将合成板置于2ml深孔板(Thermo Scientific，278752)上，并使TFA混合物沥干。将孔用3×500μl DCM(用注射器加入)洗涤，然后空气干燥3小时。

96孔板中文库肽的文库环化释放

如上所述将板压入泡沫垫以堵塞开口，并向每个孔中加入200μl在DMSO中的150mMDABCO(6当量)。将板用粘合箔密封并加重物压低(1kg)，放置过夜。第二天，将合成板置于2ml深孔板(Thermo Scientific，278752)上，并以约200g(1,000rpm，使用Thermo HeraeusMultifuge 3L-R离心机)离心1分钟，以将裂解的大环化合物在DMSO中。

通过吸收对文库肽进行量化

使用Nanodrop 8000分光光度计(Thermo Scientific)在280nm波长下使用10mm光程长度进行吸光度测量。对于凝血酶文库，将含有Trp和D-Trp的裂解的肽在水中稀释250倍，对于MDM2文库则在水中稀释125倍。使用Beer-Lambert定律计算肽的浓度。使用消光系数Trpε₂₈₀＝5,500M^-1cm^-1。

LC-MS分析

通过LC-MS分析对肽进行分析，使用UHPLC和单四极杆MS系统(Shimadzu LCMS-2020)，使用C18反相色谱柱(Phenomenex Kinetex 2.1mm×50mm C18色谱柱，孔径，2.6μm颗粒)和溶剂B(乙腈，0.05％甲酸)相对于溶剂A(H₂O，0.05％甲酸)的线性梯度，流速为1ml/min。质量分析以正离子模式进行。

对于LC-MS分析，如下所述制备各个实验的样品。为了分析酰化反应概念验证，将160nl反应混合物稀释到16μl Tris-HCl缓冲液pH 7.5中，得到100μM的肽浓度。为了分析针对文库1合成的支架，将1μl DMSO/DABCO洗脱液稀释到80μl水中，得到浓度约为120μM的环肽。为了分析针对文库2合成的支架，将1μl DMSO/DABCO洗脱液稀释到128μl水中，得到约120μM的环肽浓度。对于所有分析，均注入5μl样品，通常施用在5分钟内0至60％的溶剂B梯度。

大环化合物理化性质的计算

使用DataWarrior软件(www.openmolecules.org)计算理化性质分子量、计算的水/正辛醇分配系数(cLogP)、氢键供体数量(HBD)、氢键受体数量(HBA)、极性表面积(PSA)和可旋转键数量(NRotB)。将所述支架和羧酸的结构在ChemDraw中绘制，并以SMILES字符串形式保存在SD文件中，一份为所述支架，一份为所述酸。这两个SD文件均在DataWarrior中打开。“枚举组合库”功能用于定义大环化合物支架和羧酸之间所需的酰胺键形成反应。进行如下定义：酰胺被定义为“排除基团”。氮原子被定义为不是芳环的一部分，并且氢原子计数大于0。与胺相邻的碳原子被定义为不是芳族的，并且不包含π电子。然后对起始材料和产物原子作图。在组合枚举后，从所述结构中计算出期望的性质。

支架酰化以生成文库1

将在用于从树脂中释放肽的溶剂(含有150mM DABCO的DMSO)中的环肽支架转移至Labcyte Echo合格的384孔低死容微孔板(每孔10μl)。所述环肽支架的浓度平均约为8.1mM。将羧酸溶解在含有160mM DABCO的DMSO中至160mM。将等体积的HBTU(在DMSO中160mM)加入每种酸原液中。将活性酯(80mM)加入到另一个低死容源板中。将所述源板以850g(2,000rpm，使用Thermo Heraeus Multifuge 3L-R离心机)离心3分钟，以去除潜在的气泡。使用Labcyte Echo 650声学分配器，将20nl支架(160pmol)转移至384孔低容积聚苯乙烯板(Nunc，264705)，然后转移20nl活性酯(1.6nmol，10当量)。将板密封，并使反应在室温下进行6小时。此后，使用BioTek MultiFlo微孔板分液器将5μl Tris缓冲液(100mMTris-Cl，pH 7.5，150mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM CaCl₂，0.1％w/v BSA，0.01％v/v Triton-X100)分入每个孔中。将反应在室温下猝灭过夜。

凝血酶抑制筛选

通过测量在平均终浓度为11μM的环肽存在时凝血酶的残余活性来评估文库1的大环化合物对凝血酶的抑制作用。使用pH 7.4的Tris缓冲液(100mM Tris-Cl，150mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM CaCl₂，0.1％w/v BSA，0.01％v/v Triton-X100和0.6％v/v DMSO)，使用终浓度为2nM的凝血酶和终浓度为50μM的荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC进行测定。使用BioTekMultiFlo微孔板分液器将上述Tris-Cl缓冲液中的凝血酶(5μl，6nM)加入每个肽中，并在室温下温育10分钟。使用BioTek MultiFlo微孔板分液器加入在相同缓冲液中的荧光底物(5μl，150μM)，并使用Tecan Infinite M200 Pro荧光读板器在25℃测量30分钟荧光强度(在360nm激发，在465nm发射，每3分钟读取一次。通过Excel计算每个活性测量曲线的斜率。对于阴性对照(20个含有DMSO但不含大环化合物的孔)，计算平均斜率。通过将斜率相除并将结果乘以100计算凝血酶抑制百分比。

支架酰化以生成文库2

将在用于从树脂中释放肽的溶剂(含有150mM DABCO的DMSO)中的环肽支架转移至Labcyte Echo合格的384孔聚丙烯微孔板(每孔40μL)。所述环肽支架的浓度平均约为12.9mM。将羧酸溶解在DABCO的184mM DMSO溶液中至184mM。将等体积的HBTU(在DMSO中184mM)加入每种酸原液中。将活性酯(92mM)加入同一聚丙烯源板中。将所述源板以950g(2,000rpm，使用Thermo Heraeus Multifuge 3L-R离心机)离心3分钟，以去除潜在的气泡。使用Labcyte Echo 650声学分配器，将12.5nl大环化合物(161pmol)转移至384孔低容积聚苯乙烯板(Nunc，264705)，然后转移17.5nl活性酯(1.61nmol，10当量)。将板密封，并使反应在室温下进行6小时。此后，使用Gyger Certus Flex液体分配器将5μl Tris缓冲液分配到每个孔中，并在室温下猝灭反应过夜。

MDM2结合筛选

通过测量荧光p53肽探针在平均终浓度为11μM的环肽存在下的位移来评估环肽与MDM2的结合。使用pH 7.4的PBS缓冲液(100mM Na₂HPO₄、18mM KH₂PO₄、137mM NaCl、2.7mMKCl、0.01％v/v Tween-20和3％v/v DMSO)在384孔板中进行测定，MDM2的终浓度为1.2μM，荧光p53肽探针(FP53，序列＝5(6)-FAM-GSGSSQETFSDLWKLLPEN)的终浓度为25nM。使用Gyger Certus Flex液体散装分配器将上述在PBS缓冲液中的预混合MDM2和FP53(10μl，1.8mM MDM2，37.5nM FP53)加入每个肽中，并在室温下避光温育30分钟。在25℃使用TecanInfinite F200 Pro荧光读板器(在485nm激发，在535nm发射)读取一个荧光各向异性读数。使用以下公式计算探针位移百分比：

其中N是阴性对照(无抑制)的平均各向异性，X是每个孔获得的值，P是仅探针的平均各向异性。

从苗头化合物中鉴定反应中的活性物质

通过将在含有150mM DABCO的DMSO中的5μl的8mM环肽支架与5μl的80mM羧酸、80mMHBTU和80mM DABCO在室温反应5小时，以40nmol级别重新合成在凝血酶筛选中被鉴定为苗头化合物的大环化合物。通过加入1.25ml Tris缓冲液(100mM Tris-Cl，150mM NaCl，10mMMgCl₂，1mM CaCl₂)并温育过夜来淬灭剩余的活化酯。第二天，加入240μl MeCN和1ml水，使反应在C18柱(7.8mm×300mm Waters NovaPak C-18柱，孔径，6μm颗粒)上运行20分钟，使用溶剂A(H₂O，0.1％v/v TFA)和10-80％梯度的溶剂B(MeCN，0.1％v/v TFA)，每分钟收集一次级分。将级分冻干，溶解在120μl 2％ DMSO水中。使用与上述相同的测定法，但在96孔板中测量所述级分中产物的活性。将每个级分的50μl转移至96孔测定板(Greiner,655101)，然后加入50μl凝血酶(在缓冲液中6nM)。温育10分钟后，加入50μl荧光凝血酶底物(Z-Gly-Gly-Arg-AMC，在缓冲液中150μM，1％ DMSO)，读取平板并按上述方法处理数据。通过质谱法鉴定活性级分中的化合物。

对于来自MDM2筛选的苗头化合物，以相同的方式进行反应，但级别为50nmol，并使用相同的方法纯化，但溶剂B梯度为10-80％，历时22分钟。将级分冻干并溶解在40μl DMSO中，加入160μl水，将每个级分的5μl转移至384孔板(Nunc，264705)，加入15μl预混合的MDM2/FP53肽(终浓度：1.2μM MDM2，50nM FP53，5％DMSO)。

使用M1使凝血酶结晶化

人α-凝血酶购自Haematologic Technologies(目录号：HCT-0020)。使用通过20mMTris-HCl、200mM NaCl、pH 8.0和相同缓冲液作为溶剂平衡的PD-10脱盐柱(GEHealthcare)去除蛋白质稳定剂。将缓冲液置换的人α-凝血酶与大环化合物M1以1:3的摩尔比温育，随后使用3,000MWCO Vivaspin超滤装置(Sartorius-Stedim Biotech GmbH)浓缩至7.5mg/ml。在浓缩期间进一步加入M1大环化合物，以确保保留3倍摩尔过量。所述复合物的结晶试验在293K在96孔2滴MRC板(Hampton Research，CA，USA)中使用坐滴蒸气扩散(sitting-drop vapor-diffusion)法及Morpheus和LMB结晶筛选(Molecular DimensionsLtd,Suffolk,UK)进行。使用Oryx 8结晶机器人(Douglas Instruments Ltd，Berkshire，UK)设置600nl体积的液滴(蛋白质:沉淀剂比例为1:1)，并针对80μl池液进行平衡。最好的晶体是通过对新鲜液滴进行微晶胞接种，所述液滴已经使用以下混合物作为沉淀剂平衡2-3天：20mM甲酸钠，20mM醋酸铵，20mM柠檬酸三钠二水合物，20mM酒石酸钾钠四水合物，20mM草酸钠，100mM MOPS/HEPES钠pH 7.5，12.5％w/v PEG 1000，12.5％w/v PEG 3350，12.5％v/v MPD。

结晶化、数据收集和结构确定

为了收集X射线数据，将晶体安装在LithoLoops(Molecular Dimensions Ltd，Suffolk，UK)上并在液氮中快速冷却。在Diamond Light Source Ltd(DLS，Oxfordshire，UK)的i04光束线上收集了与M1复合的人α-凝血酶的X射线衍射数据。最好的晶体衍射最大分辨率为晶体属于P2₁空间群，晶胞尺寸/>及α＝90°、β＝90.11°、γ＝90°。所述不对称单位包含四个分子，对应的Matthews系数为/>溶剂含量约为晶体体积的48％。使用软件XIA2对框架进行索引和集成，使用AIMLESS(CCP4i2晶体学软件包)进行合并和缩放(M.Winn等人,Acta Crystallogr.D 2011,67,235-242)。使用PHASER软件(A.McCoy等人,J.Appl.Crystallogr.2007,40,658-674)，使用模型6GWE(S.Kale等人,Sci.Adv.2019,5,eaaw2851)作为模板，通过分子置换来解析结构。使用REFMAC(A.Vagin等人Acta Crystallogr.D 2004,60,2184-2195)和PHENIX(P.Adams等人,Acta Crystallogr.D 2010,66,213-221)进行精细化。自第一个精细化循环以来，在电子密度图中清晰可见对应于结合配体的宽电子密度。大环化合物的构建由Molview执行，限制文件由Phenix eLBOW生成和优化。通过图形软件COOT(P.Emsley等人,Acta Crystallogr.D2010,66,486-501)手动拟合所述大环化合物。最终模型含有9,098个蛋白质原子、160个大环原子、4个Na⁺原子和399个水分子。最终晶体学R因子达到0.189(R_free 0.243)。所述模型的几何参数符合此分辨率的预期或更好。使用PISA软件和半径为/>的球形探针计算溶剂排斥体积和相应的埋藏表面。通过PROFUNC(R.Laskowski等人,Nucleic Acids Res.2005,33,W89-W93)、LIGPLOT+(R.Laskowski等人,J.Chem.Inf.Model.2011,51,2778-2786)和PYMOL软件分析分子内和分子间氢键相互作用。

支架酰化以生成文库3和4

文库3和4所需的环肽支架如文库2中所用那些所述合成。由于存在许多更难偶联的N-甲基化氨基酸，因此将200mM HOAt与HATU一起应用。将支架在DMSO中稀释至2mM，并使用声学分配转移15nL，然后转移含有羧酸(40mM，20当量)、HBTU(40mM)和DABCO(40mM)的15nL DMSO。室温反应6小时后，每孔加入370nl DMSO，然后加入5μl含有0.01％v/v Tween20的100mM Tris-Cl pH 7.4，猝灭过夜。对于MDM2结合筛选，F-M8被用作荧光探针，因为它对MDM2具有更高的亲和力，允许使用较低浓度的靶蛋白(720nM，导致约55％结合的探针)。将35μl的pH 7.4的PBS缓冲液(100mM Na₂HPO₄、18mM KH₂PO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.01％v/v Tween-20，含有28.6nM F-M8和823nM MDM2)加入每个孔，并如上所述确定报告探针的置换移。所述大环化合物的浓度为750nM。

毫克级大环化合物的合成

在Intavis Multipep RSi合成仪上进行自动固相肽合成。向5ml注射器(MultiSyntech GmbH，V051PE076)中加入25μmole聚苯乙烯-S-S-半胱胺树脂。将树脂用6×150μl DMF洗涤。使用210μl氨基酸(500mM，4.2当量)、200μl HATU(500mM，4当量)、50μl N-甲基吗啉(4M，8当量)和5μlN-甲基吡咯烷酮进行偶联。将所有组分预混合1分钟，然后加入树脂(反应1小时，无摇动)。偶联反应的最终体积为465μl，试剂的最终浓度为226mM氨基酸、215mM HATU和430N-甲基吗啉。进行两次偶联，然后将树脂用2×600μl DMF洗涤。使用450μl的1:5的哌啶/DMF v/v进行Fmoc脱保护5分钟，并进行两次。将树脂用7×600μl DMF洗涤。在肽合成结束时，将树脂用2×600μl DCM洗涤。

在SPPS后，将树脂与2ml的38:1:1的TFA/TIS/ddH₂O v/v/v温育1小时。弃去TFA溶液，并将树脂用5×4ml DCM洗涤。空气干燥3小时后，吸入1ml在DMSO中150mM DIPEA，并将注射器在室温下摇动过夜。第二天，将DMSO溶液推入50mL锥形管中。

通常通过加入在DMSO中的500μl预混酸(100mM，2当量)、HBTU(100mM)和DABCO(100mM)使羧酸偶联。在室温下3小时后，加入8ml水并将管冷冻，然后冻干两天以除去DMSO。将管中的内容物溶解在3ml MeCN中，然后加入7ml水。

使用Waters HPLC系统(2489UV检测器，2535泵，Fraction Collector III)、19mm×250mm Waters XTerra MS C18 OBD制备柱(孔径，10μm颗粒)、溶剂系统A(H₂O、0.1％v/v TFA)和B(MeCN、0.1％v/v TFA)，通过RP-HPLC纯化粗制混合物，通常梯度为在30分钟内30-70％溶剂B。

凝血酶抑制剂的K_is测定

将纯化的凝血酶抑制剂(在DMSO中10mM)在含有0.1％w/v BSA、0.01％v/vTriton-X100和0.2％DMSO中的125μl Tris缓冲液(100mM Tris-Cl，150mM NaCl，10mMMgCl₂，1mM CaCl₂)中稀释至80μM。将大环化合物在含有0.1％w/v BSA、0.01％v/v Triton-X100和1％ DMSO的Tris缓冲液中稀释两倍。在96孔板(Greiner,655101)中测量凝血酶活性，并如上所述在用于测量筛选苗头化合物的HPLC分离的级分活性的测定中计算残余活性。将残余活性针对相应大环化合物浓度的对数绘图，并使用GraphPad Prism 6中的以下四参数等式拟合S形曲线：

K_i值是使用Cheng-Prusoff等式根据IC₅₀值确定的(对于凝血酶和所用底物，K_m＝168μM)：

结合MDM2的大环化合物的IC₅₀测定

用上述荧光偏振竞争测定法测定MDM2大环化合物取代报告肽50％的蛋白质的浓度(IC₅₀)。将5μL体积的纯化大环化合物(在DMSO中20mM)在低死容ECHO源板中用100％ DMSO连续稀释两倍。使用声学液滴转移法，将150nl每个稀释液移至384孔低容积聚苯乙烯板(Nunc，264705)。将15μL体积的在含有1％v/v DMSO的PBS缓冲液pH 7.4(100mM Na₂HPO₄，18mM KH₂PO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.01％v/v Tween-20)中的MDM2/FP53探针预混物(1.2μM MDM2，25nM FP53探针)加入每个孔中，并在黑暗中温育30分钟。如上所述测量荧光各向异性。使用以下等式计算结合的抑制剂的百分比：

其中N是DMSO对照的平均各向异性，X是每个孔获得的各向异性值，P是未结合探针的平均各向异性。通过将结合抑制剂的百分比针对相应大环化合物浓度的对数作图来确定IC₅₀，并且如上所述在GraphPad Prism 6中拟合曲线。

荧光素标记的大环化合物的合成

基本上按照毫克级大环化合物合成操作中所述合成荧光素标记的大环化合物。对于5(6)-FAM，使用均在DMF中的4当量酸(180mM，556μl)、4当量HATU(500mM，200μl)、10当量NMM(4M，62.5μl)进行手动偶联。所述偶联进行1×2小时，然后如前所述进行洗涤。

通过FP测定荧光素标记的MDM2结合剂的K_ds

通过在999.5μl PBS中加入0.5μl荧光素标记的大环化合物原液(在DMSO中20mM)，使其稀释至10μM浓度。通过将10μl转移至990μl PBS中使这些稀释液进一步被稀释至100nM的浓度，并将7.5μl转移至384孔低容积聚苯乙烯板(Nunc，264705)的孔中。将7.5μl在PBS中MDM2的2倍稀释液的移液至所述孔中。荧光大环化合物的最终浓度为50nM。在室温下将所述板避光温育30分钟后，使用Tecan Infinite F200 Pro荧光板读数器(在485nm激发，在535nm发射)在25℃下测量荧光各向异性。将各向异性针对相应的MDM2浓度的对数作图，并如上所述拟合S形曲线。

含硫醚键的凝血酶抑制剂的合成

如上关于合成毫克级环肽所述，通过自动SPPS合成含有三个氨基酸和C末端半胱胺的线性肽，但级别为50μmol，并使用半胱胺4-甲氧基三苯甲基树脂(Novabiochem856087,200-400目，1％ DVB，0.92mmol/g)。使用N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC，500μl，500mM，10当量)作为活化剂及DMF作为溶剂，将4-溴丁酸(500μl，500mM，10当量)手动偶联至仍在树脂上的这个肽。将所述酸和偶联剂预混合1分钟，然后加入到树脂中(摇动反应1小时)。偶联反应的最终体积为1ml，试剂的最终浓度为250mM氨基酸、250mM DIC。进行两次偶联，然后将树脂用4×4ml DMF、然后用2×4ml DCM洗涤。

通过将树脂与2ml的38:1:1的TFA/TIS/ddH₂O v/v/v一起摇动温育1小时，进行侧链保护基团的去除和裂解。此后，将50ml冷乙醚加入溶液中以使所述肽沉淀。将混合物在-20℃下保存30分钟，然后在4℃下以3,800g(4,000rpm，Thermo Heraeus Multifuge 3L-R离心机)离心30分钟。倒出乙醚，将肽沉淀经空气干燥15分钟。

将所述肽溶解在50ml新鲜脱气的1:4水/乙腈中，并加入200μl(1.15mmol，23当量)纯DIPEA。使环化反应在室温下进行90分钟，然后冷冻并冻干。

如下所述使羧酸14偶联。将大环化合物重新溶解在1ml含有100mM DABCO的DMSO中。通常通过在DMSO中加入500μl预混酸(100mM，2当量)、HBTU(100mM)和DABCO(100mM)来使羧酸偶联。室温下3小时后，加入8ml水并将管冷冻并冻干2天以除去DMSO。将管中的内容物溶解在3ml MeCN中，然后加入7ml水。如上所述通过RP-HPLC纯化粗制混合物。

通过SPR确定MDM2的K_ds

使用GE Healthcare Biacore 8K仪器进行实验。将MDM2(10μg/mL)溶解在10mMMES缓冲液(pH 6.0)中，并使用在运行缓冲液(10mM PBS pH7.4、150mM NaCl、3mM KCl和0.005％v/v Tween-20)中EDC/NHS胺偶联条件固定在CM5系列S芯片(Cytiva,29104988)的三个通道上。典型的固定水平为6,000至7,000个共振单位(RU)。参考细胞以相同方式处理，不用MDM2。为了测量结合动力学和解离常数，在运行缓冲液(10mM PBS pH 7.4、150mMNaCl、3mM KCl和0.005％v/v Tween-20和0.5％v/v DMSO)中制备大环化合物的五个系列稀释液(3倍)和DMSO空白，并以单循环动力学模式进行分析，接触时间和解离时间分别为120秒和60秒。

实施例4：五规则(the rule-of-five)边缘大型大环化合物文库的合成和筛选

4.1.结果

在实施例1中，将1(图14b；也称为半胱胺)通过与过量吡啶基二硫乙胺的二硫醇交换反应缀合到硫醇官能化的树脂上。在此，使用了活化的硫代磺酸酯，因为它们无需色谱纯化步骤即可合成，因此更容易大量获得。为此，商业供应商寻找可能的分子砌块来提供N-Boc烷基卤素，它可以与苯硫代磺酸钠进行取代反应，以克级提供优异产率的Boc保护前体(87％量，参见合成的材料和方法部分)。尽管氨基卤素的商业可用性有限，但在无需硅胶柱纯化的情况下合成了六种新的多样化分子砌块。这些可以进一步进行，直接加载到高荷载的SH PS树脂上，以提供通过树脂上的二硫醇键桥固定的2-7(图15a)。

为了测试分子砌块是否与基于Fmoc的自动化SPPS兼容，在96孔板中合成了模型二硫醇肽：MPA-Trp-Ala-(1-7)(MPA＝3-巯基丙酸)(图15b)。在合成并通过TFA处理去除保护基后，将树脂连接的肽与2×200μl还原释放裂解混合物(1,4-丁二硫醇(BDT)和NEt3，均为在DMF中100mM溶液)一起温育。通过旋转真空浓缩(RVC)去除DMF和挥发性BDT后，所述肽从树脂中释放并通过HPLC-MS进行分析。所述肽被有效释放并通过LC-MS进行分析。对于所有肽，发现期望的产物质量极佳(图15c)。

有了树脂连接的多样化元件，这些片段被用于合成大环文库，以追寻针对参与凝血途径的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的结合剂。由于胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的剪切量及其在各种疾病中的作用，这些蛋白酶成为开发针对此类蛋白酶的有效特异性抑制剂的重要靶标。这项任务的复杂性源于该组许多成员所共有的结构特征，因为其能够识别和裂解带正电荷的残基，以及深埋在其S1口袋中的保守天冬氨酸。因此，希望利用这个模型系统来开发有效的选择性大环抑制，因为其结果随后可以转化为环肽研究的其他部分。

因此，通过自动SPPS在96孔过滤板中制备了5μmol级别的384个二硫醇肽。在含有随机选择的序列的三种不同的支架(1a-c，图16a)中合成肽，所述序列由七个不同的多样化元件(1-7)之一、一个随机氨基酸(来自27个不同的α、β、γ和N-甲基化氨基酸)和文献中已知的S1口袋结合基序组成。

在固相支持物上合成所述肽，并通过用TFA进行酸处理去除伴随的保护基团。随后，通过还原释放使所述肽从树脂中释放出来，得到线性二硫醇肽。在酸化并通过RVC去除挥发性还原剂后，使用Ellman试剂测定肽的浓度(平均浓度＝24.9mM，20％平均自荷载所有7种不同衍生物的均等分布肽的树脂)。

我们实验室的最新方法强调以皮摩尔级别进行文库制备，以便直接用于可随时检测的微量滴定板。化合物文库的制备预计可用于一次筛选多个靶标，因此需要一种仍然允许使用多个接头进行大型化合物多样化，同时仍然允许大型化合物制备而不需要繁琐和资源密集型的移液器转移的方法。因此，人们的注意力转向了声学液滴喷射(ADE)技术分配的使用。尽管该技术主要用于nl体积的转移，但之前的研究表明，使用该系统可以转移更大的μl体积，从而避免移液。因此，将40nmol线性肽分配到多个ADE兼容的384个聚丙烯(PP)板中(图17)。由于还原的二硫醇肽在DMSO中溶解后缓慢氧化，因此通过向孔中加入DMF:BDT溶液使所述肽迅速重新还原，在酸化和RVC后，立即在具有7种不同接头的MeCN/NH₄HCO₃缓冲液中进行环化(参见图16B的选择)。这与之前采用的方法形成鲜明对比，在之前的方法中，首先溶解线性物质，然后加入接头溶液。这种新方法将发生的再氧化量降至最低，从而产生更纯的反应混合物。最后，用β-巯基乙醇(β-ME)淬灭过量的接头。

4.2.材料和方法

所有试剂和溶剂均为分析级，从商业供应商处获得，无需进一步纯化即可使用。使用硅胶包被的板(分析型SiO₂-60、F-254)通过薄层色谱(TLC)和/或通过HPLC-MS分析监测反应。将TLC板在紫外光下或通过浸入高锰酸钾溶液(10g/L)中进行可视化，然后用热风枪进行可视化。溶剂的旋转蒸发在低于40℃的温度下减压进行。使用UHPLC和单四极杆MS系统(Shimadzu LCMS-2020)使用C18反相色谱柱(Phenomenex Kinetex 2.1×50mm C18色谱柱，孔径，2.6μm颗粒)进行HPLC-MS分析。将溶剂B(在MeCN中0.05％ HCOOH)相对于溶剂A(在水中0.05％ HCOOH)在t＝1.00-6.00分钟期间从0％线性上升到60％的线性梯度以1.00ml/min的流速应用。核磁共振(NMR)谱在配备低温冷却探头的Bruker Avance III上记录(¹H NMR和¹³C NMR分别在400和101MHz记录)。所有光谱均在298K记录。化学位移以相对于作为内标的氘化溶剂以ppm为单位报告(δ_H DMSO-d₆ 2.50ppm；δ_C DMSO 39.52ppm；δ_H CDCl₃7.26ppm；δ_C CDCl₃ 77.16ppm)。

高分辨率质谱(HRMS)测量结果记录在配有电喷雾电离(ESI)源的maXis G3四极杆飞行时间(TOF)质谱仪(Bruker Daltonics，Bremen，Germany)上。

分子砌块和氨基酸的化学合成

S-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)硫代苯磺酸酯(S1，ALN-1-31)

向在DMF(120ml)中3-(Boc-氨基)丙基溴(6.02g，25.3mmol，1.0当量)的搅拌溶液中加入苄基硫代磺酸钠(7.48g，38.0mmol，1.5当量；tech.85％)并将溶液在80℃搅拌过夜。冷却后，将反应混合物减压浓缩，重悬浮于水(100ml)中并用EtOAc:己烷(2×150ml，10:1，v/v)萃取。将合并的有机层用水(3×150ml)和盐水(150ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S1(8.21g，24.8mmol，98％)，为黄色油污状物。TLC(在己烷中25％ EtOAc)：R_f＝0.25(KMnO₄染色)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.98-7.90(m，2H)，7.70-7.61(m，1H)，7.60-7.52(m，2H)，3.16(q，J＝6.4Hz，2H)，3.02(t，J＝7.2Hz，2H)，1.83(p，J＝6.8Hz，2H)，1.43(s，9H)。

(3-氯丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(S2，VC-1-1)

将在CH₂Cl₂(150ml)中的3-氯丙基-N-甲胺盐酸盐(4.32g，30.0mmol，1.0当量)和二碳酸二叔丁酯(6.58g，30.0mmol，1.0当量)的搅拌溶液在氩气环境中冷却至0℃。历时5分钟逐滴加入NEt₃(4.16ml，30.0mmol，1.0当量)，并将溶液搅拌过夜，升温至环境温度。将反应混合物减压浓缩并重新悬浮于EtOAc(120ml)中。将溶液用HCl水溶液(1M,2×120ml)、饱和NaHCO₃(120ml)和盐水(120ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S2(6.22g，30.0mmol，quant.)，为无色结晶固体。TLC(在己烷中25％ EtOAc)：R_f＝0.45(KMnO₄染色)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ3.55(t，J＝6.5Hz，2H)，3.36(t，J＝6.8Hz，2H)，2.87(s，3H)，2.06-1.91(m，2H)，1.46(s，9H)。CAS RN：114326-14-6。

S-(3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙基)硫代苯磺酸酯(S3，VC-1-3)

向在DMF(25ml)中的VC-1-1(3.51g，16.9mmol)搅拌溶液中加入苄基硫代磺酸钠(5.50g，27.9mmol，1.65当量；tech.85％)并将溶液在80℃搅拌过夜。冷却后，将反应混合物减压浓缩，重悬浮于水(100ml)中并用EtOAc:己烷(2×75ml，10:1，v/v)萃取。将合并的有机层用水(3×75ml)和盐水(75ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S3(5.07g，16.2mmol，95％)，为黄色油污状物。TLC(在己烷中12.5％ EtOAc)：R_f＝0.30(KMnO₄染色)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ8.01–7.88(m，2H)，7.69–7.50(m，3H)，3.24(t，J＝6.7Hz，2H)，2.96(t，J＝7.3Hz，2H)，2.77(s，3H)，1.85(p，J＝6.8Hz，2H)，1.42(s，9H)。

(Z)-(4-氯丁-2-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯(S4，P1_N2_E29/E46)

将在CH₂Cl₂(75mL)中的顺式-4-氯-2-丁烯胺盐酸盐(2.50g，17.6mmol，1.0当量)和二碳酸二叔丁酯(3.84g，17.6mmol，1.0当量)的搅拌溶液在氩气气氛冷却至0℃。在5分钟时间逐滴加入NEt₃(2.45ml，17.6mmol，1.0当量)并将溶液搅拌过夜，温度升至环境温度。将反应混合物减压浓缩并重新悬浮于CH₂Cl₂(100ml)中。将溶液用HCl水溶液(1M，2×100ml)、饱和NaHCO₃(100ml)和盐水(100ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S4(3.55g，17.3mmol，98％)，为浅棕色固体。TLC(z在己烷中25％ EtOAc)：R_f＝0.30(KMnO₄染色)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ5.82–5.70(m，1H)，5.70–5.56(m，1H)，4.59(br s，1H)，4.12(d，J＝7.8Hz，2H)，3.83(t，J＝6.6Hz，2H)，1.44(s，9H)。CAS RN：123642-28-4。NMR谱与文献一致。

(Z)-S-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁-2-烯-1-基)硫代苯磺酸酯(S5，P1_N2_E30)

向在DMF(70ml)中S4(3.55g，17.3mmol，1.0当量)的搅拌溶液中加入苄基硫代磺酸钠(6.81g，34.5mmol，2.0当量；tech.85％)并将溶液在80℃搅拌过夜。冷却后，将反应混合物减压浓缩，重悬浮于水(400mL)中并用EtOAc(3×100ml)萃取。将合并的有机层用水(3×200mL)和盐水(200mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S5(5.03g，14.6mmol，85％*)，为棕色油状物。TLC(在己烷中25％ EtOAc)：R_f＝0.20(KMnO₄染色)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.94-7.87(m，2H)，7.68-7.60(m，1H)，7.60-7.49(m，2H)，5.67-5.57(m，1H)，5.51-5.40(m，1H)，4.43(br s，1H)，3.67(dq，J＝7.0，1.1Hz，2H)，3.60(t，J＝6.1Hz，2H)，1.43(s，9H)。*粗制化合物的纯度低于其他硫代磺酸酯分子砌块，但在随后的树脂荷载步骤中仍然提供优异的树脂质量。

3-(((苯磺酰基)硫代)甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(S6，ALN-1-57)

向在DMF(25ml)中1-Boc-3-溴甲基氮杂环丁烷(1.93g，7.71mmol，1.0当量)的搅拌溶液中加入苄基硫代磺酸钠(2.43g，12.3mmol，1.6当量；tech.85％)，并将溶液在80℃搅拌过夜。冷却后，将反应混合物减压浓缩，重悬浮于水(100ml)中并用EtOAc:己烷(2×75ml；10:1，v/v)萃取。将合并的有机层用水(2×75ml)、饱和NaHCO₃(75ml)和盐水(75ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S6(2.65g，7.71mmol，quant.)，为黄色油污状物。TLC(在己烷中33％ EtOAc)：R_f＝0.30(KMnO₄染色)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.93(d，J＝7.5Hz，2H)，7.66(t，J＝7.4Hz，1H)，7.58(t，J＝7.6Hz，2H)，3.96(t，J＝8.6Hz，2H)，3.52(dd，J＝9.0，5.3Hz，2H)，3.23(d，J＝7.8Hz，2H)，2.85–2.70(m，1H)，1.41(s，9H)。

4-((苯磺酰基)硫代)哌啶-1-羧酸叔丁酯

向在DMF(25mL)中的1-N-Boc-4-溴哌啶(2.25g，8.51mmol，1.0当量)的搅拌溶液中加入苄基硫代磺酸钠(2.77g，14.0mmol，1.65当量；tech.85％)并将溶液在80℃搅拌过夜。由于过夜反应不完全(通过TLC监测)，加入额外的苄基硫代磺酸钠(1.38g，7.00mmol；tech.85％)并将反应在80℃下再搅拌24小时。冷却后，将反应混合物减压浓缩，重悬浮于水(100mL)中并用EtOAc:己烷(2×75ml；10:1，v/v)萃取。将合并的有机层用水(2×75ml)、饱和NaHCO₃(75ml)和盐水(75ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S7(2.65g，7.43mmol，87％*)，为黄色油污状物。TLC(在己烷中33％ EtOAc)：R_f＝0.44(KMnO₄染色)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ8.01-7.89(m，2H)，7.71-7.61(m，1H)，7.60-7.50(m，2H)，3.89-3.63(m，2H)，3.55-3.39(m，1H)，3.11-2.91(m，2H)，1.96-1.86(m，2H)，1.64-1.51(m，2H)，1.42(s，9H)。*取代反应的进展速度明显慢于其他硫代磺酸酯分子砌块的制备。此外，粗制品纯度较低，但在后续树脂荷载步骤中仍能提供优异的树脂质量。

4-(((苯磺酰基)硫代)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(S8，ALN-1-38)

向在DMF(50ml)中的1-N-Boc-4-(溴甲基)哌啶(2.16g，7.76mmol，1.0当量)的搅拌溶液中加入苄基硫代磺酸钠(2.52g，12.8mmol，1.65当量；tech.85％)，并将溶液在80℃搅拌过夜。冷却后，将反应混合物减压浓缩，重悬浮于水(100ml)中并用EtOAc:己烷(2×75ml；10:1，v/v)萃取。将合并的有机层用水(2×75ml)、饱和NaHCO₃(75ml)和盐水(75ml)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩，得到粗制S8(2.76g，7.76mmol，quant.)，为透明油状物。TLC(在己烷中25％ EtOAc)：R_f＝0.30(KMnO₄染色)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.01-7.87(m，2H)，7.70-7.61(m，1H)，7.61-7.51(m，2H)，4.20-3.94(m，2H)，2.91(d，J＝6.5Hz，2H)，2.58(t，J＝12.8Hz，2H)，1.73-1.57(m，3H)，1.43(s，9H)，1.14-0.98(m，2H)。

(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(5-氯呋喃-2-甲酰氨基)丙酸(Thio，ALN-1-77)

该合成采用类似氨基酸的先前操作：将5-氯噻吩-2-羧酸(2.44g，15.0mmol，1.5当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(1.61g，14.0mmol，1.4当量)溶解于THF(100ml)中并在氩气环境中搅拌。将溶液冷却至0℃，然后将溶解在THF(30ml)中的DCC(2.89g，14.0mmol，1.4当量)的溶液缓慢加入反应混合物中。该溶液慢慢变浑浊，将其搅拌过夜，温度升至环境温度，然后过滤溶液。同时，将Fmoc-Dap(Boc)-OH(4.26g，10.0mmol，1.0当量)在CH₂Cl₂(20ml；浑浊溶液)中搅拌，并将TFA(20ml)缓慢加入溶液中。所述溶液立即变成淡黄色透明并形成气泡。在起泡停止后，将溶液在环境温度下再搅拌30分钟，之后在氮气流下除去溶剂。通过与CH₂Cl₂:甲苯(50ml，1:1，v/v)共蒸发除去过量的TFA。将残余物重新悬浮于THF(40ml)中，然后加入i-Pr₂Net(5.75ml，60.0mmol，6.0当量)。然后将溶液倒入含有NHS活化的噻吩的母液中并在环境温度下搅拌过夜。完成后，将溶液减压浓缩，再溶解在EtOAc:己烷(300ml，10:1，v/v)中并用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤两次。将有机层用无水Na₂SO₄干燥并减压浓缩。通过二氧化硅柱色谱法纯化粗产物，得到Fmoc-保护的氨基酸分子砌块(4.06g，8.62mmol，86％)，为米白色固体*。TLC(在CH₂Cl₂中5％ MeOH和0.5％ AcOH)：R_f＝0.2(UV)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.74(br s，1H)，8.68(t，J＝5.8Hz，1H)，7.89(d，J＝7.5Hz，2H)，7.70(d，J＝7.4Hz，2H)，7.65(d，J＝8.2Hz，1H)，7.61(d，J＝4.1Hz，1H)，7.41(t，J＝7.4Hz，2H)，7.30(q，J＝7.6Hz，2H)，7.18(d，J＝4.0Hz，1H)，4.43–4.11(m，4H)，3.68–3.50(m，2H，与残留水重叠)。¹³CNMR(101MHz，DMSO)δ171.9，160.5，156.0，143.80，143.77，140.7，138.7，133.1，128.2，128.1，127.6，127.1，125.24，125.21，120.1，65.7，53.5，46.6，40.3(与溶剂峰重叠)。C₂₃H₂₀ClN₂O₅S⁺[M+H]⁺的HRMS m/z计算值为471.0776；实际值为471.0786。

二硫醇树脂的合成

高荷载硫醇树脂的制备

预洗涤：每个25ml烧结注射器装有约0.8g(1.11mmol)氨甲基聚苯乙烯树脂(AM PS树脂；1.39mmol/g,100-200目；Aapptec，cat.#RAZ001)，并使用MeOH(2×10ml)、CH₂Cl₂(3×10ml)、在CH₂Cl₂中1％(v/v)TFA溶液(2×10ml)、在CH₂Cl₂中i-Pr2NEt溶液(1.2M；2×10ml，5分钟)、CH₂Cl₂(2×10ml)和DMF(2×10ml)进行预洗涤。偶联：用i-Pr₂NEt(1.10ml，6.66mmol，6.0当量)活化在DMF(10ml)中3-(三苯甲基硫基)丙酸(1.16g，3.33mmol，3.0当量)和HBTU(1.27g，3.33mmol，3.0当量)的溶液并加入到烧结注射器中，在环境温度下搅拌3小时。过滤树脂并用DMF(3×10ml)和CH₂Cl₂(3×10ml)洗涤，随后使所述珠干燥(首先吸干，然后在减压下过夜(<0.5mbar))。MPA(Trt)树脂的荷载约1.20mmol/g*(基于重量)。封端：将在DMF中的5％ Ac₂O和6％二甲基吡啶的溶液(12ml；v/v/v)加入到树脂中，并在环境温度下温育5分钟。将树脂沥干并用DMF(3×10ml)和CH₂Cl₂(3×10ml)洗涤。脱保护：将在CH₂Cl₂中10％ TFA和1％ TIPS的溶液(15ml，v/v/v)加入到树脂中，并在环境温度下搅拌1小时。将树脂用CH₂Cl₂(3×10ml)洗涤，重复该操作一次，得到聚苯乙烯上的高荷载的硫醇树脂(SH PS树脂)，其可用于随后的二硫键交换和半胱胺衍生物的荷载。

树脂1的制备(res 1)

二硫醇交换：每个25ml烧结注射器装有约0.4g(0.48mmol)SH PS树脂，将其在CH₂Cl₂(10ml)中溶胀，然后沥干。将2-吡啶基硫代半胱胺盐酸盐(0.48g，0.96mmol，2.0当量)溶解在MeOH:CH₂Cl₂(19ml，3:7，v/v)中，然后加入i-Pr₂NEt(167μl，0.96mmol，2.0当量)。将溶液加入到树脂中并在环境温度下搅拌3小时。将树脂沥干并用MeOH:CH₂Cl₂(2×10ml，3:7，v/v)、DMF(2×10ml)、在DMF中i-Pr2NEt溶液(1.2M；10ml持续5分钟)、DMF(3×10ml)和CH₂Cl₂(2×10ml)洗涤，然后使所述珠干燥(首先吸干，然后在减压下过夜(<0.5mbar))。质量控制：(1)Kaiser测试；所述珠完全呈紫色/蓝色。(2)珠上Ellman’s试剂；无显色。

树脂2-7的制备(res 2-7)

脱保护：将N-Boc保护的硫代磺酸酯中间体(S2、S3、S5、S6、S7或S8；约7.0mmol)溶解于CH₂Cl₂(10ml)中，然后滴加TFA直至观察到大量CO₂起泡(约10ml)。将溶液在环境温度下再搅拌1小时，然后在氮气流下除去溶剂。通过与CH₂Cl₂:MeOH溶液(1:1，v/v)共蒸发在减压下除去过量的TFA，得到用于安置在树脂上的硫代磺酸酯。二硫醇交换：每个25ml烧结注射器装有约0.8g(0.96mmol)SH PS树脂，将其在THF(15ml)中溶胀，然后沥干。将期望的硫代磺酸酯TFA盐(2.40-2.88mmol，2.5-3.0当量)溶解在THF(15ml)中，并加入NEt₃(803μl，5.76mmol，6.0当量)。将溶液加入到树脂中并在环境温度下搅拌过夜。将树脂沥干，用THF(3×15ml)和CH₂Cl₂(2×15ml)洗涤，随后使所述珠干燥(首先在吸干，然后在减压下过夜(<0.5mbar))。质量控制：(1)Kaiser测试；所述珠完全呈紫色/蓝色。(2)珠上的Ellman’s试剂；无显色。

使用板的方法

为聚丙烯(PP)96孔过滤板配备5μmol/孔的聚苯乙烯二硫醇树脂(res1-res7；估计荷载约1.20mmol/g)，并用DMF(6×225μl)洗涤。使用53μl氨基酸(500mM，5.3当量)、50μlHATU(500mM，5.0当量)、13μl N-甲基吗啉(4M，10当量)和5μl N-甲基吡咯烷酮进行偶联。对于Thio、t-acha、4amPip和2am的偶联，使用75μl氨基酸(170mM，2.55当量)、25μl HATU(500mM，2.5当量)、7μl N-甲基吗啉(4M，5.6当量)和5μl N-甲基吡咯烷酮。使所有组分预混合一分钟，然后加入树脂中(无摇动反应2小时)。进行两次偶联并用DMF(6×225μl)洗涤树脂。使用在DMF中20％(v/v)哌啶溶液(120μl，2×2分钟)进行Fmoc脱保护，并用DMF(6×225μl)洗涤树脂。在肽合成结束时，用CH₂Cl₂(2×200μl)洗涤树脂，并将树脂珠吸干。

使用注射器的方法

向5ml注射器反应器中加入聚苯乙烯二硫醇树脂(res1-res7；估计荷载量约1.20mmol/g)，并将树脂用DMF(6×150μl)洗涤。使用210μL氨基酸(500mM，4.2当量)、200μlHATU(500mM，4.0当量)、50μl N-甲基吗啉(4.0M，8.0当量)和5μl N-甲基吡咯烷酮进行偶联。使所有组分预混合一分钟，然后加入到树脂中(摇动反应2小时)。进行两次偶联，然后将树脂用DMF(2×600μl)洗涤。使用在DMF中20％哌啶溶液(450μl，2×2分钟)进行Fmoc脱保护，并将树脂用DMF(7×600μl)洗涤。肽合成结束时，将树脂用CH₂Cl₂(2×600μl)洗涤，并将树脂珠吸干。

还原释放操作

侧链保护基团去除：在自动化SPPS(5μmol/孔级别)后，通过将板压在柔软的厚度为6mm的乙烯-醋酸乙烯酯垫上来密封96孔合成板的底部。将树脂与TFA/TIPS/H₂O(300μl，95:2.5:2.5，v/v/v)一起温育1小时，并用粘性PP板盖覆盖。弃去TFA溶液，将树脂用CH₂Cl₂(3×300μl)洗涤，重复一次该操作。还原释放：在空气干燥至少1小时后，将在DMF中的1,4-丁二硫醇(BDT)和NEt₃溶液(均为100mM，200μl，相对于树脂荷载为4当量)加入到树脂中，并将所述板在环境温度下搅拌过夜。第二天，通过离心(1000rpm)将DMF溶液推入96孔深孔板中，并将所述还原释放操作重复一次共5小时，并合并到相同的96孔深孔板中。浓缩：将在milliQ-水中的TFA溶液(10％(v/v)，62μl，相对于NEt₃为2当量)加入孔中，并使用Speedvac浓缩器(30℃，1750rpm，0.1mbar)干燥所述肽。再溶解和转移：将干燥的肽沉淀溶解在DMSO(40μl)中并转移到Echo合格的384孔PP源板中。浓度测定：进行Ellman’s测定法以确定二硫醇肽原液的浓度。将Ellman’s试剂⁵(DTNB)溶解在测定缓冲液(150mM在水中NH₄HCO₃:MeCN(90:10，v/v)，pH 8)中，浓度为10mM。通过Echo使用声学液滴喷射法(ADE)将在DMSO(135nl)中的二硫醇肽转移到具有透明底部的384孔黑色微孔板中。使用CERTUS分配测定缓冲液(24μl)，然后加入DTNB溶液(6μl)。将板离心(400g，2分钟)并在TECAN M200读板器上测量吸光度(412nm)。使用先前记录的校准曲线计算二硫醇肽的浓度：

其中：abs＝在mAU中在412nm的吸光度

c＝二硫醇肽的浓度

使用注射器的方法

侧链保护基去除：在自动化SPPS(25μmol级别)后，将含有树脂的烧结注射器与TFA/TIPS/H₂O(4ml，95:2.5:2.5，v/v/v)在环境温度下温育2小时。弃去TFA溶液，并将树脂用CH₂Cl₂(5×4ml)和DMF(4ml)洗涤。还原释放：在空气干燥至少1小时后，将在DMF中的BDT和NEt₃溶液(均为100mM，2.0ml，相对于树脂荷载为4当量)加入注射器中，在环境温度下搅拌过夜。第二天，将DMF溶液推入50ml锥形falcon管中。浓缩：将在milliQ-水中的TFA溶液(10％(v/v)，312μl，相对于NEt₃为2当量)加入到肽溶液中，使用Speedvac浓缩器(30℃，1750rpm，0.1mbar)干燥以提供粗制线性二硫醇肽，为下一步立即环化做好准备。

大环化操作

使用平板的方法

转移至微量滴定板：根据测定的DMSO中每个单独的二硫醇肽的浓度，使用ADE将在DMSO中的40nmol二硫醇肽转移至384PP板(每个接头一个板)。肽还原：由于二硫醇肽在DMSO中随着时间的推移而氧化，因此通过向每个孔中加入在DMF中的BDT和NEt₃溶液(均为100mM，20μl)，然后在环境温度下温育30分钟来确保死所述肽被完全还原。将在milliQ-水中的TFA溶液(10％(v/v)，6μl，相对于NEt₃为2当量)加入到每个孔中，并使用Speedvac浓缩器(30℃，1750rpm，0.1mbar)干燥所述肽以提供完全还原的二硫醇肽颗粒。环化：将双亲电子接头(L1-L7)溶解在脱气的60mM在MeCN:H₂O中的NH₄HCO₃溶液中(1:1(v/v)，pH 8)中，至终浓度为4mM。使用分液配将制备的接头溶液(40μl，相对于二硫醇肽为4当量)加入到384PP板中，用粘性PP盖密封并在环境温度下搅拌2小时。接头猝灭：将β-巯基乙醇(β-ME)溶解在制备的环化缓冲液中至终浓度为32mM。将制备的溶液(20μl，相对于接头为4当量)加入到每个孔中，并在环境温度下无盖板盖温育1小时.浓缩和再溶解：使用Speedvac浓缩器(40℃，1750rpm，0.1mbar)除去溶剂，得到肽大环化合物沉淀，将其溶解在DMSO(10μl)中并转移至384LDV板，得到4mM大环肽文库，其可以立即应用于随后的蛋白酶筛选测定中。

在锥形管中的方法

环化：将双亲电子接头溶解在脱气的60mM在MeCN:H₂O中的NH₄HCO₃溶液中(1:1(v/v)，pH8)，至终浓度为4mM。将制备的接头溶液(12.5ml，相对于二硫醇肽为2当量)加入含有期望的二硫醇肽沉淀的锥形管中，并将溶液在环境温度下搅拌2小时。接头淬灭：反应完成后(通过LCMS测定)，通过加入β-ME(14μl，200μmol，相对于接头为4当量)将过量的接头淬灭，将其加入到锥形瓶中并搅拌至少1小时，之后进行后续的纯化。大环化合物纯化：将样品通过配备C18 RP Waters OBD柱的制备型HPLC纯化。溶剂B(在MeCN中0.1％ TFA)相对于溶剂A(在水中0.1％ TFA)在t＝2.00-32.00分钟期间从15％线性上升到60％的线性梯度以14.0ml/min的流速应用。将含有期望产物的纯级分合并并冻干，得到无色蓬松材料形式的产物。DMSO原液：将纯化的大环化合物转移至eppendorph管中，并加入DMSO以提供5mM或20mM化合物原液。

生物化学分析

大环化合物文库的蛋白酶筛选

通过测量在DMSO终浓度为1％在存在环肽(对于凝血酶的平均浓度为10μM，对于FXI、FXII、KLK5和Pkal的平均浓度为20μM)条件下的残余酶活性来评估化合物文库的酶抑制作用。将粗制的大环化合物文库(在384孔LDV板中的4mM DMSO原液)通过ADE移至1536孔微量滴定板OptiPlates中。通过PTFE注射器过滤器(0.22μm)过滤制备应用的缓冲溶液，并通过加入在补充有牛血清白蛋白(BSA；0.1％w/v)的适当缓冲液(见下面的列表)中的蛋白酶(4.41μl/孔)开始测定，使用CERTUS自动分液器进行分配。在使用CERTUS自动分液器加入在适当缓冲液(4.5μl)中的荧光底物之前，将板在环境温度下温育10分钟。将板离心(800g，2分钟)，并使用PHERAstar读板器(激发384nm，发射440nm)以150秒的时间增量在15分钟内测量荧光强度。用Microsoft Excel(版本16.56)计算荧光增加的斜率(m)。制备没有大环化合物的阴性对照。12个阴性对照的平均值用于使用下面的等式I计算残余活性：

等式I

应用的缓冲液组成和酶浓度

从苗头化合物中鉴定粗制大环产物中的活性物质

重新合成并环化来自文库筛选的选定hit(化合物195_L6、237_L6&293L6)(40nmol级别)。将干燥的大环产物溶解在MeCN:H₂O(1.5ml，1:1，v/v)中，并使用C18 NovaPak反相色谱柱(10×150mm，孔径，5μm颗粒)在Thermo Fisher Dionex UltiMate 3000系统上分级分离。在t＝2.00–22.0min期间，溶剂B(在MeCN中0.1％ TFA)相对于溶剂A(在水中0.1％TFA)的从0％线性上升至80％(对于凝血酶hit)或0％至95％(对于Pkal hit)的线性梯度以4.00mL/min的流速应用。将级分(一个级分/分钟)收集在收集管中，并使用SpeedVac浓缩器(30℃，1750rpm，0.1mbar)除去溶剂。将干燥的内容物重新溶解在DMSO(50μl)中，转移至384孔PP源板并使用SpeedVac浓缩器(30℃，1750rpm，0.1mbar)干燥。将级分重新溶解在DMSO中(对于凝血酶为5μl，对于Pkal为2μl)，随后在透明底部的黑色384孔聚苯乙烯板中进行测定。将DMSO级分溶液(0.5μl)移液至微量滴定板中，并加入适当的酶缓冲溶液(49.5μl；与前页所述的成分类似，技术上使用2nM凝血酶)并在环境温度下温育10分钟。加入在缓冲液中的底物(25μl，与前页所述的成分相似)，将板离心(800g，2分钟)，并使用PHERAstar板读数器(激发384nm，发射440nm)以150秒时间增量测量15分钟内荧光强度。使用MicrosoftExcel(版本16.56)计算荧光增加的斜率(m)。制备无DMSO(0.5μl)代之以级分样品的阴性对照。6个阴性对照的平均值用于使用等式I计算残余活性。

IC₅₀测定

半数最大抑制剂浓度(IC₅₀)值是在与文库筛选类似的测定中通过蛋白酶抑制而测定的。在384孔LDV源板中制备纯化的大环化合物的倍稀释系列，并使用ADE转移至1536孔OptiPlates中(终体积：45nl大环化合物/DMSO)。使用Certus加入酶缓冲液溶液(4.5μl)并温育10分钟。随后，加入在缓冲液中的底物(4.5μl)，并将板离心(700g，2分钟)，使用PHERAstar板读数器(激发384nm，发射440nm)在15分钟内以150秒的时间增量测量荧光强度。使用Microsoft Excel(版本16.56)计算荧光增加的斜率(m)。制备没有大环化合物的阴性对照。使用等式I将12个阴性对照的平均值用于计算残余活性。IC₅₀值是通过使用GraphPad Prism(版本6.0.1)将所得数据拟合到浓度-反应等式[约束？]而获得的，K_i值是利用Cheng-Prusoff等式¹¹基于IC₅₀计算的：

其中[S]₀是初始底物浓度，K_M是酶和底物的Michaelis-Menten常数¹²。

Claims

1.制备肽文库或分离肽的方法，所述方法包括：

(a)从固相释放一种或多种线性二硫醇肽，其在所述一种或多种肽的N末端区域中携带巯基，并且通过所述一种或多种肽的C末端区域中的二硫键固定在所述固相上，所述释放是通过以下进行的：

(i)还原所述二硫键，从而从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽的物质，其中所述物质是挥发性的并且可通过蒸发除去，或

(ii)碱，其使所述一种或多种线性二硫醇肽的N末端区域中的巯基去质子化，从而诱导分子内二硫键交换，从而以一种或多种环肽的形式从所述固相释放所述一种或多种线性二硫醇肽。

2.根据权利要求1的方法，所述方法进一步包括在步骤(a)之后通过蒸发除去所述物质的步骤。

3.根据权利要求1或2的方法，所述方法进一步包括环化通过所述物质释放的所述一种或多种线性二硫醇肽的步骤(b)。

4.根据权利要求3的方法，其中所述一种或多种二硫醇肽通过至少一种双亲电试剂或通过二硫键氧化而被环化。

5.根据权利要求1的方法，其中第(ii)项的所述一种或多种环肽的二硫键被还原并且所述肽被双亲电试剂再环化。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中

所述物质选自1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇、2,4-戊二硫醇、乙烷-1-硫醇、丙烷-1-硫醇、丁烷-1-硫醇、丙烷-2-硫醇、2-甲基-1-丙硫醇、丁烷-2-硫醇、2-甲基丙烷-2-硫醇、2-羟基-1-乙硫醇、1,2-乙二硫醇、2-丙烯-1-硫醇、3-甲基-1-丁硫醇、苯硫酚、苄硫醇、2-丁烯-1-硫醇、3-丁烯-1-硫醇、2-甲基-2-丙烯-1-硫醇和3-甲基-2-丁烯-1-硫醇，并且优选为1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇或2,4-戊二硫醇，并且最优选1,4-丁二硫醇(BDT)，

和/或

所述碱选自叔胺、仲胺或伯胺，氢化硼、氢化铝或氢化硅，以及具有氧、氮或碳阴离子的碱，并且优选为叔胺、仲胺或伯胺，更优选为叔胺，甚至更优选三烷基胺，并且最优选N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其包括在步骤(a)之前的

步骤(a’)在所述固相上合成所述线性二硫醇肽。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述线性二硫醇肽的氨基酸的侧链被保护基团保护，并且所述方法还包括在步骤(a)之前和如果存在步骤(a’)的话在步骤(a’)之后的当所述线性二硫醇肽被固定在所述固相上时去除所述保护基团。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中至少一些所述线性二硫醇肽包含伯胺或仲胺，并且所述方法还包括用羧酸修饰所述伯胺或仲胺，其中所述环肽包含伯胺或仲胺，并且所述羧酸优选通过声学分配被转移。

10.根据权利要求1至9中任一项的方法，所述方法进一步包括：

(c)优选在没有预先纯化所述肽文库的情况下使所述肽文库与靶分子接触，及

(d)筛选所述肽文库的与所述靶分子结合并优选抑制所述靶分子的肽。

11.根据权利要求10的方法，其中步骤(c)和(d)在其中所述伯胺或仲胺已用羧酸修饰的相同孔中进行。

12.根据权利要求10或11的方法，其中所述靶分子是蛋白质、肽、核酸分子、碳水化合物或脂肪酸，并且优选地是蛋白质或肽。

13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述固相包括树脂，优选非极性树脂且更优选聚苯乙烯树脂。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述线性二硫醇肽包括：

分子量小于1000Da，优选小于600Da的线性二硫醇肽，和/或

包含3或4个氨基酸，优选3个氨基酸的线性二硫醇肽。

15.使大环化合物文库、优选环肽文库多样化的方法，其中至少一些大环化合物、优选环肽包含伯胺或仲胺，其中所述方法包括用羧酸修饰所述伯胺或仲胺。