CN117887766A - 线粒体障碍和脑钙化模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以线粒体缺陷为核心的细胞学病理的用于模拟脑钙化沉积的细胞模型或动物模型的制备方法。具体地,本发明提供了一种CMPK2基因缺失、降低表达或失活的动物模型,使之表达缺失或蛋白产物的线粒体定位功能丢失。本发明还提供了一种Cmpk2基因抑制剂的用途。本发明的模型是一种有效的、典型的线粒体缺陷研究模型,并伴随有脑实质钙化、异常炎症反应等病理表现。本发明的模型对于研究线粒体核酸代谢、炎症性疾病和脑钙化病等疾病的发生发展机制具有重要意义,并可以用于特定药物的筛选和测试试验。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地涉及一种以线粒体缺陷为核心的用于模拟脑钙化沉积的细胞或动物模型及其制备方法。
背景技术
脑钙化是一种较为常见的与衰老相关的影像学征象,发病率约6.6‰。中老年人群的颅脑CT显示,有10%以上会出现点状钙化,2%以上伴有斑片状钙化,但脑钙化征象却常常被临床医生与患者所忽视。此外,一些神经系统退行性疾病,如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)等,有20%以上的患者出现了脑钙化,而且病灶随着年龄增长而扩大。此外,一些脑钙化患者在SPECT(单光子发射计算机断层扫描)核素显像上表现为多巴胺能递质系统失调。因此,脑钙化的研究有助于解析部分神经退行性疾病的发病机制。
遗传性脑钙化症是由于基因突变引起的神经退行性疾病,其病理特征是基底节、丘脑和小脑的双侧钙化,偶尔出现皮层下钙化灶,随病程进展钙化灶可连接成大片状,病理上表现为钙盐颗粒在脑内终末小动脉、静脉和毛细血管附近空间的沉积。遗传性脑钙化症的临床症状呈多种多样,主要表现为运动障碍、精神障碍、认知障碍、癫痫发作、头晕、头痛等,严重者则会出现人格及行为改变,终致精神病或痴呆,也有部分患者终生无明显症状。遗传性脑钙化症呈散发或家族性发病,具有高度的遗传异质性,其治疗主要是对症治疗,目前没有有效的药物能够去除或者减少异常钙沉积。因此只有系统地揭示遗传性脑钙化症的致病基因,才能一方面实现其早期和准确诊断,进而及早有效控制患者的临床症状以延缓病程;另一方面指导产前诊断或辅助生殖阻断患病儿的出生。
遗传性脑钙化症包括多种类型,例如,原发性家族性脑钙化症(Primary FamilialBrain Calcification,PFBC)、Aicardi-Goutières综合征(AGS)、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(Mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes,MELAS)等。在过去十年中,人类遗传学研究表明,PFBC的致病基因包括:SLC20A2、XPR1、PDGFB、PDGFRB、MYORG和JAM2。
目前对于脑钙化致病机制的假说主要有两种:首先,BBB(血脑屏障)结构的完整性受损或周细胞覆盖率降低导致了BBB通透性增加,与该通路相关的患者可能存在PDGFRB、PDGFB、JAM2或MYORG等基因突变,这些基因均在构成神经血管单元的细胞中有所表达;第二种途径是无机磷酸根(PO4、H2PO4、HPO4)在大脑中的运输障碍,属于该途径的患者可能存在SLC20A2或XPR1基因的突变,并且通常显示出CSF(脑脊液)无机磷水平显著升高。此外,AGS也具有非常明显的脑钙化征象,除此之外还伴有脑白质营养不良、小头畸形、干扰素-α增高等,其致病基因包括:ADAR1、SAMHD1、IFIH1、TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、LSM11和RNU7-1。目前认为AGS的发病原因是由于一些编码核酸外切酶的基因突变后,体内DNA或RNA等核酸产物蓄积,激活了I型干扰素途径。对于MELAS而言,它是一种系统性的综合征,表现为线粒体脑肌病、乳酸酸中毒、卒中样发作,也常合并脑钙化,主要是由于线粒体基因突变而致病。
综上所述,现阶段对PFBC的致病基因和发病机制的解析十分有限,对该病的认知还处于前期阶段。发现新的致病基因,廓清其病理机制,开发新型的动物模型,并以此为基础开发新的治疗手段,是当前的迫切任务。
因此,本领域迫切需要开发出一种方便且有效地进行线粒体缺陷与脑钙化研究的工具。
发明内容
本发明的目的就是提供一种脑钙化动物模型的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种脑钙化动物模型的应用。
在本发明的第一方面,提供了一种脑钙化动物非人哺乳动物的制备方法,所述方法包括:使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活。
在另一优选例中,使用选自下组的方法使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活:基因敲除、基因编辑、RNA干扰、表观遗传学抑制、以抗CMPK2蛋白或其同源蛋白的抗体阻断或抑制CMPK2蛋白或其同源蛋白的活性。
在另一优选例中,所述的基因敲除包括:基于同源重组的干细胞打靶技术、基因编辑技术、化学分子诱变基因组突变、转座子定点失活,或其组合。
在另一优选例中,所述的基因编辑包括:CRISPR/cas9及类似编辑器、spf1、TALEN、锌指核酸酶、碱基编辑。
在另一优选例中,使用基因编辑的方法使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活;较佳地,通过基因编辑产生碱基缺失、插入,从而导致蛋白质编码框提前终止。
在另一优选例中,所述的基因编辑靶向CMPK2基因,从而造成编码区序列缺失,导致CMPK2表达缺失。
在另一优选例中,在CMPK2基因中引入特定基因突变,造成CMPK2蛋白在无法定位在线粒体中发挥功能。
在另一优选例中,对应于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3,在起始密码子部位引入c.2T>C或c.1A>C,造成CMPK2野生型基因编码蛋白第1-26位点的氨基酸片段发生缺失,从而使突变蛋白产物无法进入线粒体。
在另一优选例中,所述的动物包括啮齿类动物、非人灵长类动物。
在另一优选例中,所述的啮齿类动物包括小鼠或大鼠。
在另一优选例中,所述非人灵长类动物包括猕猴或绒猴。
在另一优选例中,所述的使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活包括:模拟人脑钙化病患者的CMPK2基因致病突变。
在另一优选例中,所述的CMPK2基因为人的CMPK2基因。
在另一优选例中,通过基因编辑产生碱基缺失使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活,所述方法包括步骤:
(a)体外转录合成sgRNAs和Cas9 mRNA;
(b)将sgRNA和Cas9 mRNA共注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,在囊胚期将其植入代孕雌性小鼠,从而获得F0代小鼠。
在另一优选例中,所述sgRNA的靶向位点序列sgRNA1、sgRNA2和/或sgRNA3,其中,所述sgRNA1的靶向核酸序列如SEQ ID NO:39所示;所述sgRNA2的靶向核酸序列如SEQ IDNO:40所示;所述sgRNA3的靶向核酸序列如SEQ ID NO:41所示。
在另一优选例中,通过插入供体寡核苷酸的方法使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活,所述方法包括步骤:
(a)体外转录合成sgRNAs和Cas9 mRNA;
(b)将供体寡核苷酸与sgRNA和Cas9 mRNA共同注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,在囊胚期将其植入代孕雌性小鼠,从而获得F0代小鼠。
在另一优选例中,所述供体寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:42所示。
在另一优选例中,所述方法还包括对F0代小鼠进行基因分型。
在另一优选例中,所述基因鉴定为PCR鉴定及琼脂糖凝胶电泳显影。
在另一优选例中,所述方法包括对Cmpk2基因缺失(Cmpk2-KO)动物模型进行选自下组的一项或多项检测:
(a)评估脑钙化水平;或
(b)检测Cmpk2蛋白的变化;或
(c)检测动物神经元细胞中ATP水平;或
(d)检测动物神经元细胞内Pi水平;或
(e)检测神经元中mtDNA编码呼吸链酶复合体IV(COX IV)和细胞色素C水平;或
(f)观察线粒体嵴的形态。
在本发明的第二方面,提供了一种Cmpk2基因抑制剂的用途,用于制备作为脑钙化细胞模型或非人哺乳动物模型的试剂盒。
在另一优选例中,所述的抑制剂包括基因编辑试剂、基因敲除试剂、基因编辑试剂、RNA干扰试剂、表观遗传性抑制试剂、小分子化合物。
在另一优选例中,所述试剂使所述模型的基因组中CMPK2基因缺失、降低表达或失活、或缺失线粒体定位能力。
在另一优选例中,使模型基因组中CMPK2基因缺失、线粒体定位功能失活的试剂含有CRIPSR/cas9基因编辑试剂。
在另一优选例中,所述的动物模型为非人哺乳动物,较佳地啮齿动物,更佳地小鼠或大鼠。
在另一优选例中,所述的基因编辑试剂,通过表达所述载体被导入细胞。
在另一优选例中,所述的表达载体为病毒载体、哺乳动物细胞载体。
在本发明的第三方面,提供了一种线粒体缺陷的动物细胞,所述动物细胞中内源性Cmpk2基因缺失、表达下调或失活;
并且与未下调Cmpk2基因表达的原始细胞相比,所述动物细胞中Cmpk2蛋白的表达是下调的。
在另一优选例中,所述的动物细胞包括人和非人哺乳动物细胞。
在另一优选例中,所述的动物细胞为大脑细胞。
在另一优选例中,所述的大脑细胞选自神经元细胞、脑血管内皮细胞。
在另一优选例中,所述的动物细胞中含有外源导入的基因编辑试剂,所述的基因试剂包括:
(a)第一基因表达盒,所述第一基因表达盒用于表达靶向Cmpk2基因的靶向sgRNA;
(b)第二基因表达盒,所述第二基因表达盒用于表达基因编辑酶;
其中,在所述的靶向sgRNA存在下,所述的基因编辑酶对Cmpk2基因序列进行基因编辑,从而使得内源性Cmpk2基因表达被下调。
在另一优选例中,所述的动物细胞中内源性Cmpk2基因的表达量为C1,与所述原始细胞内源性Cmpk2的表达量C2的比值Re(即E1/E0)≤30%,较佳地≤10%,更佳地≤1%。
在另一优选例中,所述Cmpk2基因是来自人的Cmpk2基因。
在另一优选例中,所述Cmpk2基因的DNA序列为SEQ ID NO:1所示的序列,氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示的序列。
在另一优选例中,所述的基因编辑酶包括CRISPR/Cas9基因编辑。
在另一优选例中,所述的sgRNA引导基因编辑蛋白特异性结合于Cmpk2基因的核苷酸序列。
如本发明第一方面所述的方法制备的脑钙化非人哺乳动物模型,如本发明第三方面所述的动物细胞,用于制备试剂,其中,所述试剂用于:
(i)研究脑钙化的发生机制;
(ii)研究脑钙化的发展机制;
(iii)筛选治疗神经系统疾病的候选药物或治疗剂;和/或
(iv)评估治疗神经系统疾病的候选药物或治疗剂的疗效。
在另一优选例中,所述的神经系统疾病包括:原发性家族性脑钙化症、神经系统相关的自身免疫性疾病、线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作、神经退行性疾病(包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症)。
在另一优选例中,所述的神经系统相关的自身免疫性疾病包括Aicardi-Goutières综合征(AGS)。
在另一优选例中,所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了钙化病人的Cmpk2基因突变的造成线粒体定位或功能异常。其中,图a显示了家族1中的CMPK2 c.2T>C以及家族2中CMPK2 c.1A>C和c.1241A>G的的测序图谱,突变体用红色标记,het表示杂合子,hom表示纯合子。图b显示了CMPK2起始密码子丢失的示意图,其中CMPK2(c.1A>C p.M1?;从随后的ATG密码子(p.M27),导致CMPK2蛋白中mTP的丢失(△N26)。mTP,线粒体靶向肽序列;CMPK,CMP-UMP激酶结构域。图c显示了免疫荧光分析CMPK2蛋白的亚细胞定位。用标记的CMPK2野生型(WT)、C.1A>C、C.2T>C和C.1241A>G突变质粒转染Cos-7细胞,并用抗标记抗体(绿色)和线粒体标记COX IV(红色)免疫染色。用DAPI(蓝色)进行核染色。比例尺,5μm。图d显示了用Western-blot分析CMPK2的线粒体和细胞质表达的结果。图e显示了原代培养的大鼠神经元蛋白定量统计图,其中p<0.0001。
图2显示了Cmpk2基因突变的钙化病人家中成员脑钙化CT影像,其中脑实质中的白色区域为脑钙化灶,并分布于苍白球、丘脑、小脑、尾状核、室周白质和大脑皮层。
图3显示了小鼠神经元中Cmpk2的表达。其中,图a显示了成年小鼠大脑矢状面Cmpk2表达的原位杂交结果。图b显示了Cmpk2在海马、丘脑和小脑中的表达放大图,细胞核DAPI(蓝色)染色。图c和d分别显示了小鼠丘脑(c)和小脑齿状核(d)中Cmpk2(红色)与谷氨酸能神经元标记Vglut2(绿色)的双重原位杂交。图e和f分别显示了小鼠丘脑(e)和小脑PCL(f)的Cmpk2(红色)与gaba能神经元标记Gad1(绿色)的双重原位杂交结果。(g和h)在丘脑(g)和海马DG(h)中Cmpk2(红色)和星形胶质细胞标记物S100β(绿色)的双重荧光标记。Hip表示海马状突起;Thal表示丘脑;Crb表示小脑。DG表示齿状回;PCL表示Pukinje细胞层;GCL表示颗粒细胞层。图a比例尺为500μm,图b-f比例尺为50μm。
图4显示了Cmpk2缺乏损害小鼠神经元线粒体功能。其中,图a显示了基于ddPCR的WT与Cmpk2-KO小鼠皮层组织mtDNA拷贝数分析结果。图b显示了WT和Cmpk2-KO小鼠原代培养皮质神经元线粒体代表性图像,带有抗线粒体标记ATP合酶β链抗体(绿色)和抗细胞骨架蛋白MAP2抗体(红色);用DAPI(蓝色)进行核染色。比例尺,5μm。图c显示了WT和Cmpk2-KO小鼠原代培养皮质神经元COX IV和细胞色素c的Western blot检测结果。图d显示了定量COX IV和细胞色素c蛋白水平的变化。图e显示了WT和Cmpk2-KO小鼠神经元的ATP水平的测定结果。图f-g分别显示了WT和Cmpk2-KO小鼠神经元(f)、脑脊液(CSF)和血清(g)中的Pi水平。图h显示了WT和Cmpk2-KO小鼠原代培养皮层神经元线粒体形态的代表性透射电镜图。图i-j分别显示了WT和Cmpk2-KO小鼠原代培养皮层神经元嵴覆盖率的统计图。
图5显示了Cmpk2-KO和KI小鼠脑内有广泛的钙化沉积。其中,图a显示了用H&E、VonKossa、茜素红、过碘酸希夫染色(PAS)和阿尔新蓝染色的14月龄WT和Cmpk2-KO小鼠的大脑切片。图b显示了13月龄Cmpk2-KO小鼠大脑冠状位和矢状位显微CT扫描。图c显示了Cmpk2-KO小鼠在10、12和14月龄时大脑中脑钙化沉积的逐渐发展。用茜素红和Von Kossa染色显示钙化。图5d显示了Cmpk2基因C.2T>C突变的Cmpk2-KI小鼠模型的基因图。图5e显示了用H&E、Von Kossa、茜素红、PAS、Alcian蓝染色的12月龄时的Cmpk2-KI小鼠脑切片。钙化体积显示在一系列连续的脑切片的左下方。图a和c的比例尺为100μm。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,首次意外地开发了一种脑改化动物模型。具体地,本发明提供了一种Cmpk2基因的敲除动物,或模拟病人突变的定点敲入模型动物,其可以作为脑钙化动物模型。本发明的动物模型再现了一系列病理改变,包括钙沉积、线粒体能量合成降低、细胞形态异常,是一种可用于研究研究脑钙化的发生发展机理以及潜在疾病的药物筛选、疗效评估的可重复性高的专一性动物模型。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。如本申请中所使用的,除非本文另有明确规定,否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
CMPK2基因
CMPK2基因位于人类染色体2:6,840,570-6,866,635(GRCh38)上,编码一种含有449个氨基酸的蛋白质,称为UMP-CMP激酶2。它作为一种单磷酸激酶,参与线粒体基因组DNA复制所需要的dUTP和dCTP产生的补救途径。
在本发明中,优选的CMPK2基因包括人和小鼠的CMPK2基因。
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示:
SEQ ID NO:1(人CMPK2)
ATGGCCTTCGCCCGCCGGCTCCTGCGCGGGCCACTGTCGGGGCCGCTGCTCGGGCGGCGCGGGGTCTGCGCTGGGGCCATGGCTCCGCCGCGCCGCTTCGTCCTGGAGCTTCCCGACTGCACCCTGGCTCACTTCGCCCTAGGCGCCGACGCCCCCGGCGACGCAGACGCCCCCGACCCCCGCCTGGCGGCGCTGCTGGGGCCCCCGGAGCGCAGCTACTCGCTGTGCGTGCCCGTGACCCCGGACGCCGGCTGCGGGGCCCGGGTCCGGGCGGCGCGGCTGCACCAGCGCCTGCTGCACCAGCTGCGCCGCGGCCCCTTCCAGCGGTGCCAGCTGCTCAGGCTGCTCTGCTACTGCCCGGGCGGCCAGGCCGGCGGCGCACAGCAAGGCTTCCTGCTGCGCGACCCCCTGGATGACCCTGACACCCGGCAAGCGCTGCTCGAGCTGCTGGGCGCCTGTCAGGAGGCACCACGCCCGCACTTGGGCGAGTTCGAGGCCGACCCGCGCGGCCAGCTGTGGCAGCGCCTCTGGGAGGTGCAAGACGGCAGGCGGCTGCAGGTGGGCTGCGCACAGGTCGTGCCCGTCCCGGAGCCCCCGCTGCACCCGGTGGTGCCAGACTTGCCCAGTTCCGTGGTCTTCCCGGACCGGGAAGCCGCCCGGGCCGTTTTGGAGGAGTGTACCTCCTTTATTCCTGAAGCCCGGGCAGTGCTTGACCTGGTCGACCAGTGCCCAAAACAGATCCAGAAAGGAAAGTTCCAGGTTGTTGCCATCGAAGGACTGGATGCCACGGGTAAAACCACGGTGACCCAGTCAGTGGCAGATTCACTTAAGGCTGTCCTCTTAAAGTCACCACCCTCTTGCATTGGCCAGTGGAGGAAGATCTTTGATGATGAACCAACTATCATTAGAAGAGCTTTTTACTCTTTGGGCAATTATATTGTGGCCTCCGAAATAGCTAAAGAATCTGCCAAATCTCCTGTGATTGTAGACAGGTACTGGCACAGCACGGCCACCTATGCCATAGCCACTGAGGTGAGTGGGGGTCTCCAGCACCTGCCCCCAGCCCATCACCCTGTGTACCAGTGGCCAGAGGACCTGCTCAAACCTGACCTTATCCTGCTGCTCACTGTGAGTCCTGAGGAGAGGTTGCAGAGGCTGCAGGGCCGGGGCATGGAGAAGACCAGGGAAGAAGCAGAACTTGAGGCCAACAGTGTGTTTCGTCAAAAGGTAGAAATGTCCTACCAGCGGATGGAGAATCCTGGCTGCCATGTGGTTGATGCCAGCCCCTCCAGAGAAAAGGTCCTGCAGACGGTATTAAGCCTAATCCAGAATAGTTTTAGTGAACCGTAG
SEQ ID NO:2(人CMPK2(c.1A>C)):基于野生型人CMPK2(SEQ ID NO:1)核苷酸序列第1位A突变为C
CTGGCCTTCGCCCGCCGGCTCCTGCGCGGGCCACTGTCGGGGCCGCTGCTCGGGCGGCGCGGGGTCTGCGCTGGGGCCATGGCTCCGCCGCGCCGCTTCGTCCTGGAGCTTCCCGACTGCACCCTGGCTCACTTCGCCCTAGGCGCCGACGCCCCCGGCGACGCAGACGCCCCCGACCCCCGCCTGGCGGCGCTGCTGGGGCCCCCGGAGCGCAGCTACTCGCTGTGCGTGCCCGTGACCCCGGACGCCGGCTGCGGGGCCCGGGTCCGGGCGGCGCGGCTGCACCAGCGCCTGCTGCACCAGCTGCGCCGCGGCCCCTTCCAGCGGTGCCAGCTGCTCAGGCTGCTCTGCTACTGCCCGGGCGGCCAGGCCGGCGGCGCACAGCAAGGCTTCCTGCTGCGCGACCCCCTGGATGACCCTGACACCCGGCAAGCGCTGCTCGAGCTGCTGGGCGCCTGTCAGGAGGCACCACGCCCGCACTTGGGCGAGTTCGAGGCCGACCCGCGCGGCCAGCTGTGGCAGCGCCTCTGGGAGGTGCAAGACGGCAGGCGGCTGCAGGTGGGCTGCGCACAGGTCGTGCCCGTCCCGGAGCCCCCGCTGCACCCGGTGGTGCCAGACTTGCCCAGTTCCGTGGTCTTCCCGGACCGGGAAGCCGCCCGGGCCGTTTTGGAGGAGTGTACCTCCTTTATTCCTGAAGCCCGGGCAGTGCTTGACCTGGTCGACCAGTGCCCAAAACAGATCCAGAAAGGAAAGTTCCAGGTTGTTGCCATCGAAGGACTGGATGCCACGGGTAAAACCACGGTGACCCAGTCAGTGGCAGATTCACTTAAGGCTGTCCTCTTAAAGTCACCACCCTCTTGCATTGGCCAGTGGAGGAAGATCTTTGATGATGAACCAACTATCATTAGAAGAGCTTTTTACTCTTTGGGCAATTATATTGTGGCCTCCGAAATAGCTAAAGAATCTGCCAAATCTCCTGTGATTGTAGACAGGTACTGGCACAGCACGGCCACCTATGCCATAGCCACTGAGGTGAGTGGGGGTCTCCAGCACCTGCCCCCAGCCCATCACCCTGTGTACCAGTGGCCAGAGGACCTGCTCAAACCTGACCTTATCCTGCTGCTCACTGTGAGTCCTGAGGAGAGGTTGCAGAGGCTGCAGGGCCGGGGCATGGAGAAGACCAGGGAAGAAGCAGAACTTGAGGCCAACAGTGTGTTTCGTCAAAAGGTAGAAATGTCCTACCAGCGGATGGAGAATCCTGGCTGCCATGTGGTTGATGCCAGCCCCTCCAGAGAAAAGGTCCTGCAGACGGTATTAAGCCTAATCCAGAATAGTTTTAGTGAACCGTAG
SEQ ID NO:3(人CMPK2(c.2T>C)):基于野生型人CMPK2(SEQ ID NO:1)核苷酸序列第2位T突变为C
ACGGCCTTCGCCCGCCGGCTCCTGCGCGGGCCACTGTCGGGGCCGCTGCTCGGGCGGCGCGGGGTCTGCGCTGGGGCCATGGCTCCGCCGCGCCGCTTCGTCCTGGAGCTTCCCGACTGCACCCTGGCTCACTTCGCCCTAGGCGCCGACGCCCCCGGCGACGCAGACGCCCCCGACCCCCGCCTGGCGGCGCTGCTGGGGCCCCCGGAGCGCAGCTACTCGCTGTGCGTGCCCGTGACCCCGGACGCCGGCTGCGGGGCCCGGGTCCGGGCGGCGCGGCTGCACCAGCGCCTGCTGCACCAGCTGCGCCGCGGCCCCTTCCAGCGGTGCCAGCTGCTCAGGCTGCTCTGCTACTGCCCGGGCGGCCAGGCCGGCGGCGCACAGCAAGGCTTCCTGCTGCGCGACCCCCTGGATGACCCTGACACCCGGCAAGCGCTGCTCGAGCTGCTGGGCGCCTGTCAGGAGGCACCACGCCCGCACTTGGGCGAGTTCGAGGCCGACCCGCGCGGCCAGCTGTGGCAGCGCCTCTGGGAGGTGCAAGACGGCAGGCGGCTGCAGGTGGGCTGCGCACAGGTCGTGCCCGTCCCGGAGCCCCCGCTGCACCCGGTGGTGCCAGACTTGCCCAGTTCCGTGGTCTTCCCGGACCGGGAAGCCGCCCGGGCCGTTTTGGAGGAGTGTACCTCCTTTATTCCTGAAGCCCGGGCAGTGCTTGACCTGGTCGACCAGTGCCCAAAACAGATCCAGAAAGGAAAGTTCCAGGTTGTTGCCATCGAAGGACTGGATGCCACGGGTAAAACCACGGTGACCCAGTCAGTGGCAGATTCACTTAAGGCTGTCCTCTTAAAGTCACCACCCTCTTGCATTGGCCAGTGGAGGAAGATCTTTGATGATGAACCAACTATCATTAGAAGAGCTTTTTACTCTTTGGGCAATTATATTGTGGCCTCCGAAATAGCTAAAGAATCTGCCAAATCTCCTGTGATTGTAGACAGGTACTGGCACAGCACGGCCACCTATGCCATAGCCACTGAGGTGAGTGGGGGTCTCCAGCACCTGCCCCCAGCCCATCACCCTGTGTACCAGTGGCCAGAGGACCTGCTCAAACCTGACCTTATCCTGCTGCTCACTGTGAGTCCTGAGGAGAGGTTGCAGAGGCTGCAGGGCCGGGGCATGGAGAAGACCAGGGAAGAAGCAGAACTTGAGGCCAACAGTGTGTTTCGTCAAAAGGTAGAAATGTCCTACCAGCGGATGGAGAATCCTGGCTGCCATGTGGTTGATGCCAGCCCCTCCAGAGAAAAGGTCCTGCAGACGGTATTAAGCCTAATCCAGAATAGTTTTAGTGAACCGTAG
SEQ ID NO:4(人CMPK2 c.1241A>G)):基于野生型人CMPK2(SEQ ID NO:1)核苷酸序列第1241位A突变为G
ATGGCCTTCGCCCGCCGGCTCCTGCGCGGGCCACTGTCGGGGCCGCTGCTCGGGCGGCGCGGGGTCTGCGCTGGGGCCATGGCTCCGCCGCGCCGCTTCGTCCTGGAGCTTCCCGACTGCACCCTGGCTCACTTCGCCCTAGGCGCCGACGCCCCCGGCGACGCAGACGCCCCCGACCCCCGCCTGGCGGCGCTGCTGGGGCCCCCGGAGCGCAGCTACTCGCTGTGCGTGCCCGTGACCCCGGACGCCGGCTGCGGGGCCCGGGTCCGGGCGGCGCGGCTGCACCAGCGCCTGCTGCACCAGCTGCGCCGCGGCCCCTTCCAGCGGTGCCAGCTGCTCAGGCTGCTCTGCTACTGCCCGGGCGGCCAGGCCGGCGGCGCACAGCAAGGCTTCCTGCTGCGCGACCCCCTGGATGACCCTGACACCCGGCAAGCGCTGCTCGAGCTGCTGGGCGCCTGTCAGGAGGCACCACGCCCGCACTTGGGCGAGTTCGAGGCCGACCCGCGCGGCCAGCTGTGGCAGCGCCTCTGGGAGGTGCAAGACGGCAGGCGGCTGCAGGTGGGCTGCGCACAGGTCGTGCCCGTCCCGGAGCCCCCGCTGCACCCGGTGGTGCCAGACTTGCCCAGTTCCGTGGTCTTCCCGGACCGGGAAGCCGCCCGGGCCGTTTTGGAGGAGTGTACCTCCTTTATTCCTGAAGCCCGGGCAGTGCTTGACCTGGTCGACCAGTGCCCAAAACAGATCCAGAAAGGAAAGTTCCAGGTTGTTGCCATCGAAGGACTGGATGCCACGGGTAAAACCACGGTGACCCAGTCAGTGGCAGATTCACTTAAGGCTGTCCTCTTAAAGTCACCACCCTCTTGCATTGGCCAGTGGAGGAAGATCTTTGATGATGAACCAACTATCATTAGAAGAGCTTTTTACTCTTTGGGCAATTATATTGTGGCCTCCGAAATAGCTAAAGAATCTGCCAAATCTCCTGTGATTGTAGACAGGTACTGGCACAGCACGGCCACCTATGCCATAGCCACTGAGGTGAGTGGGGGTCTCCAGCACCTGCCCCCAGCCCATCACCCTGTGTACCAGTGGCCAGAGGACCTGCTCAAACCTGACCTTATCCTGCTGCTCACTGTGAGTCCTGAGGAGAGGTTGCAGAGGCTGCAGGGCCGGGGCATGGAGAAGACCAGGGAAGAAGCAGAACTTGAGGCCAACAGTGTGTTTCGTCAAAAGGTAGAAATGTCCTGCCAGCGGATGGAGAATCCTGGCTGCCATGTGGTTGATGCCAGCCCCTCCAGAGAAAAGGTCCTGCAGACGGTATTAAGCCTAATCCAGAATAGTTTTAGTGAACCGTAG
SEQ ID NO:5(人CMPK2(deltaN26))野生型人CMPK2(SEQ ID NO:6)氨基酸序列N端前26位缺失
MAPPRRFVLELPDCTLAHFALGADAPGDADAPDPRLAALLGPPERSYSLCVPVTPDAGCGARVRAARLHQRLLHQLRRGPFQRCQLLRLLCYCPGGQAGGAQQGFLLRDPLDDPDTRQALLELLGACQEAPRPHLGEFEADPRGQLWQRLWEVQDGRRLQVGCAQVVPVPEPPLHPVVPDLPSSVVFPDREAARAVLEECTSFIPEARAVLDLVDQCPKQIQKGKFQVVAIEGLDATGKTTVTQSVADSLKAVLLKSPPSCIGQWRKIFDDEPTIIRRAFYSLGNYIVASEIAKESAKSPVIVDRYWHSTATYAIATEVSGGLQHLPPAHHPVYQWPEDLLKPDLILLLTVSPEERLQRLQGRGMEKTREEAELEANSVFRQKVEMSYQRMENPGCHVVDASPSREKVLQTVLSLIQNSFSEP
SEQ ID NO:6(人CMPK2(WT))
MAFARRLLRGPLSGPLLGRRGVCAGAMAPPRRFVLELPDCTLAHFALGADAPGDADAPDPRLAALLGPPERSYSLCVPVTPDAGCGARVRAARLHQRLLHQLRRGPFQRCQLLRLLCYCPGGQAGGAQQGFLLRDPLDDPDTRQALLELLGACQEAPRPHLGEFEADPRGQLWQRLWEVQDGRRLQVGCAQVVPVPEPPLHPVVPDLPSSVVFPDREAARAVLEECTSFIPEARAVLDLVDQCPKQIQKGKFQVVAIEGLDATGKTTVTQSVADSLKAVLLKSPPSCIGQWRKIFDDEPTIIRRAFYSLGNYIVASEIAKESAKSPVIVDRYWHSTATYAIATEVSGGLQHLPPAHHPVYQWPEDLLKPDLILLLTVSPEERLQRLQGRGMEKTREEAELEANSVFRQKVEMSYQRMENPGCHVVDASPSREKVLQTVLSLIQNSFSEP
SEQ ID NO:7(小鼠CMPK2(WT))
ATGGCCCTAATAAGCCGCCCTCGAGCCCCACTGTGGCTCGGGCGTCTGTCGCGGAGGCTGTGCGGGCGACACCAGGCCTGCATGGGGACCATGGCTCGGCCGCGGCGCTTCACTGTGGAGCTGCCAGATTGCTCCCTGACTCACTTCGTCCTGGGGGATGCAACAGACCACAGGGATGCACGCCTGGCAGAGCTGCTCGGCCCCCCAGGGCGCAGCTACGCGCTGTGTGTGCCCCTGGCTCCAGGCGAAGGCTGCGGGCCCCGGGTGCAGGCGGCCCGGGTGCACCATCGCCTGCTGCAGCAGCTGCGCCGGGGTCCTTTACAGAGATGCCAACTGAGCAAGCTTCTGGGCTATGGTCCGGGCGATCAGGCCGGCGAAGCCCAGCATGGCTTCCTGCTGCGGGACCCTTGCGACCACCCGGACACTCGGCGCGACTTGCTCCAGCTTCTGGGCTCCTGCCAGGAGGCGGCGCGCCCGCAGTTGGCCGAGTTCCAGGCCGACTCCCAGGGTTTGCTGTGGCAGCGTCTGTGGGAGTTGCAGGGAGACAGGCAGGTGCAGGTGGACTGCGCATGCGTCCTGCCGGCACAGGAACCTCATCTGCACCCATTGCTGCCAGATCTGCTTAACTCTGCGGTGTTCCAAGACCGGGACGCGGCAAGGGCTGTCTTGGAAGAGTGCACATCCTTTATTCCAGAAGCCCGGGCAGTACTTGACCTAGTTGACCAGTGCCCAAAGGAGGTCCAGAAAGGGAAGTTCCAGGTCATTGCCATTGAAGGACTGGATGCCACTGGTAAGACCACACTGACGCAGTCAGTGTCAGAGTCTCTCAAGGCTGTCCTCCTACAGTCGCCACCCCCCTGTATCAGCCAGTGGAGGAAGATCTTTGATGATGAACCTACTATCATTCGAAGAGCCTTTTATTCTTTGGGCAATTATCTCGTGGCTTCTGAAATAGCTAAAGAATCAACCAACTTTCCTGTTATTGTAGACAGGTACTGGCATAGCACAGCCACCTACGCCATAGCTACTGAGGTGAGTGGAGGCCTACAGTACCTACCCCCTGCCCACCACCCTGTGTACCAGTGGCCAGGGGACCTGCTGAAGCCCGACTTGGTCCTGCTGCTGACTGTGAATTCTGAGGAGAGAGTGCGGAGACTGCAGGGCCGGGGTCAGGAGAAAACTAAAGAAGAGGCTGAACTTGAGGCCAATAATGTGTTTCGTCAGAAGGTGGAAATGACGTACCAGCGTATGGAGAACCCAAGCTGCCATCTGGTGGATGCCAGCCCCTCGAGAGAGACAGTCCTGCAGAAGGTTTTAGAGCTGATCCAGAGTTCTGGTCGTTAA
SEQ ID NO:8(小鼠CMPK2(c.2T>C)):野生型小鼠CMPK2(SEQ ID NO:7)核苷酸序列第2位突变为C
ACGGCCCTAATAAGCCGCCCTCGAGCCCCACTGTGGCTCGGGCGTCTGTCGCGGAGGCTGTGCGGGCGACACCAGGCCTGCATGGGGACCATGGCTCGGCCGCGGCGCTTCACTGTGGAGCTGCCAGATTGCTCCCTGACTCACTTCGTCCTGGGGGATGCAACAGACCACAGGGATGCACGCCTGGCAGAGCTGCTCGGCCCCCCAGGGCGCAGCTACGCGCTGTGTGTGCCCCTGGCTCCAGGCGAAGGCTGCGGGCCCCGGGTGCAGGCGGCCCGGGTGCACCATCGCCTGCTGCAGCAGCTGCGCCGGGGTCCTTTACAGAGATGCCAACTGAGCAAGCTTCTGGGCTATGGTCCGGGCGATCAGGCCGGCGAAGCCCAGCATGGCTTCCTGCTGCGGGACCCTTGCGACCACCCGGACACTCGGCGCGACTTGCTCCAGCTTCTGGGCTCCTGCCAGGAGGCGGCGCGCCCGCAGTTGGCCGAGTTCCAGGCCGACTCCCAGGGTTTGCTGTGGCAGCGTCTGTGGGAGTTGCAGGGAGACAGGCAGGTGCAGGTGGACTGCGCATGCGTCCTGCCGGCACAGGAACCTCATCTGCACCCATTGCTGCCAGATCTGCTTAACTCTGCGGTGTTCCAAGACCGGGACGCGGCAAGGGCTGTCTTGGAAGAGTGCACATCCTTTATTCCAGAAGCCCGGGCAGTACTTGACCTAGTTGACCAGTGCCCAAAGGAGGTCCAGAAAGGGAAGTTCCAGGTCATTGCCATTGAAGGACTGGATGCCACTGGTAAGACCACACTGACGCAGTCAGTGTCAGAGTCTCTCAAGGCTGTCCTCCTACAGTCGCCACCCCCCTGTATCAGCCAGTGGAGGAAGATCTTTGATGATGAACCTACTATCATTCGAAGAGCCTTTTATTCTTTGGGCAATTATCTCGTGGCTTCTGAAATAGCTAAAGAATCAACCAACTTTCCTGTTATTGTAGACAGGTACTGGCATAGCACAGCCACCTACGCCATAGCTACTGAGGTGAGTGGAGGCCTACAGTACCTACCCCCTGCCCACCACCCTGTGTACCAGTGGCCAGGGGACCTGCTGAAGCCCGACTTGGTCCTGCTGCTGACTGTGAATTCTGAGGAGAGAGTGCGGAGACTGCAGGGCCGGGGTCAGGAGAAAACTAAAGAAGAGGCTGAACTTGAGGCCAATAATGTGTTTCGTCAGAAGGTGGAAATGACGTACCAGCGTATGGAGAACCCAAGCTGCCATCTGGTGGATGCCAGCCCCTCGAGAGAGACAGTCCTGCAGAAGGTTTTAGAGCTGATCCAGAGTTCTGGTCGTTAA
SEQ ID NO:9(小鼠CMPK2(WT))
MALISRPRAPLWLGRLSRRLCGRHQACMGTMARPRRFTVELPDCSLTHFVLGDATDHRDARLAELLGPPGRSYALCVPLAPGEGCGPRVQAARVHHRLLQQLRRGPLQRCQLSKLLGYGPGDQAGEAQHGFLLRDPCDHPDTRRDLLQLLGSCQEAARPQLAEFQADSQGLLWQRLWELQGDRQVQVDCACVLPAQEPHLHPLLPDLLNSAVFQDRDAARAVLEECTSFIPEARAVLDLVDQCPKEVQKGKFQVIAIEGLDATGKTTLTQSVSESLKAVLLQSPPPCISQWRKIFDDEPTIIRRAFYSLGNYLVASEIAKESTNFPVIVDRYWHSTATYAIATEVSGGLQYLPPAHHPVYQWPGDLLKPDLVLLLTVNSEERVRRLQGRGQEKTKEEAELEANNVFRQKVEMTYQRMENPSCHLVDASPSRETVLQKVLELIQSSGR
SEQ ID NO:10(小鼠CMPK2(deltaN27)):野生型小鼠CMPK2氨基酸序列(SEQ IDNO:9)N端前27位缺失
MGTMARPRRFTVELPDCSLTHFVLGDATDHRDARLAELLGPPGRSYALCVPLAPGEGCGPRVQAARVHHRLLQQLRRGPLQRCQLSKLLGYGPGDQAGEAQHGFLLRDPCDHPDTRRDLLQLLGSCQEAARPQLAEFQADSQGLLWQRLWELQGDRQVQVDCACVLPAQEPHLHPLLPDLLNSAVFQDRDAARAVLEECTSFIPEARAVLDLVDQCPKEVQKGKFQVIAIEGLDATGKTTLTQSVSESLKAVLLQSPPPCISQWRKIFDDEPTIIRRAFYSLGNYLVASEIAKESTNFPVIVDRYWHSTATYAIATEVSGGLQYLPPAHHPVYQWPGDLLKPDLVLLLTVNSEERVRRLQGRGQEKTKEEAELEANNVFRQKVEMTYQRMENPSCHLVDASPSRETVLQKVLELIQSSGR
脑钙化
脑钙化是一种较为常见的与衰老相关的影像学征象,发病率约6.6‰。中老年人群的颅脑CT显示,有10%以上会出现点状钙化,2%以上伴有斑片状钙化。一些神经系统退行性疾病,如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等,有20%以上的患者出现了脑钙化,而且病灶随着年龄增长而扩大。
基因失活
对于功能未知基因的研究可采用许多方法,例如使有待研究的基因失活,分析所得的遗传修饰的表型变化,进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联,从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中,基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。
如本文所用,术语“基因失活”、“基因敲除”可互换使用,指通过对某一目的基因进行中断、敲除等遗传操作,从而使得该目的基因的表达和/或性大幅下降甚至完全丧失。
脑钙化动物模型
本发明提供了两种脑钙化动物模型,尤其是Cmpk2-KO和Cmpk2-KI动物模型。
如本文所用,术语“本发明的动物模型”、“本发明的Cmpk2敲除”、“本发明的Cmpk2-KO动物模型”等可互换使用,均指利用基因编辑技术敲除小鼠神经元细胞中Cmpk2基因后的动物模型。
人类疾病的动物模型(animal model of human disease)是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物,按产生原因分类自发性动物模型和诱发性或实验性动物模型。
自发性动物模型(Spontaneous Animal Models)是指实验动物未经任何有意识的人工处置,在自然情况下所发生的疾病。包括突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤疾病模型。利用这类动物疾病模型来研究人类疾病的最大优点,在于疾病的发生、发展与人类相应的疾病很相似,均是在自然条件下发生的疾病,具有更高的应用价值,但是这类模型来源较困难。
在本发明中,提供了一种非人哺乳动物的脑钙化动物模型,所述模型如发明第一方面所述。
本发明将具有Cmpk2基因敲除的动物模型为研究对象,通过micro-CT和多种组织学染色定期分析Cmpk2 KO小鼠的脑钙化水平,研究小鼠的脑病理形态,初步判断药物是否具有抗Cmpk2基因相关的脑钙化的效果。鉴于Cmpk2敲除动物模型的表型优势,本发明的方法可以快速高效地对药物的有效性进行初步评价,进而推动药物的开发。
CRISPR/Cas9碱基编辑
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相应的CRISPR RNAs(比如gRNAs)来指导同源序列的降解,从而提供免疫性。
此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的gRNA(single-guide RNA),足以引导Cas9对DNA的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白,Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor),能够共定位RNA、DNA和蛋白。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合,并表达适当的gRNA,可靶定任何dsDNA序列,而gRNA的末端可连接到目标DNA,不影响Cas9的结合。因此,Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统。
CRISPR/Cas9技术载体设计较为简单,进行基因编辑时需要20-30bp地向导RNA(sgRNA)于靶序列进行结合,募集Cas9蛋白,发挥剪切基因组DNA的作用。Cas9发挥剪切基因组DNA会产生缺口,造成的双链断裂会引发细胞内的DNA修复机制以维持细胞的正常存活。最常见的DNA修复机制为同源重组修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ),后者为非保真性的修复方式,可导致基因组DNA产生错误修复甚至导致移码突变,达到基因敲除的目的。
在本发明中,通过筛选实现,SEQ ID No:1或2所示的gRNA具有优异的靶向基因编辑效率,极低的脱靶率。
本发明的基于CRISPR/Cas9系统的基因敲入和基因敲除是由两部分组成。第一部分是CRISPR/Cas9系统在确定的靶点处进行切割,产生双链断裂缺口。在这个过程中,CRISPR/Cas9系统的切割效率会对基因敲入造成巨大影响,切割后留下的双链缺口的类型也极为重要。第二部分是细胞启动修复机制,以外源donor DNA为同源模板,进行同源修复从而将donor DNA上带有Cmpk2表达盒插入到靶点缺口完成基因敲入过程。
本发明脑钙化动物模型的制备方法
本发明还提供本发明的制备方法。
以动物模型为例,可如本发明第一方面所述的方法制备。
以细胞模型为例,可如本发明第三方面所述。
优选地,在本发明中,通过CRISPR-CAS9等技术而使靶基因Cmpk2失活。
优选地,本发明的模型动物为基因改造小鼠模型。
一种优选的制备Cmpk2基因敲除小鼠的方法,包括以下步骤:
1.胚胎干细胞同源重组技术,通过基因打靶获得基因敲除的胚胎干细胞,体外扩增后,将其注射到小鼠囊胚腔,注射后的囊胚移植到假孕小鼠子宫内,从而获得嵌合小鼠。
2.人工核酸酶基因编辑技术,如CRISPR-Cas9技术。当靶向目的基因的sgRNA和Cas9核酸酶在小鼠体内共表达,sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别靶基因序列并进行切割产生双链末端断裂DNA,引发胞内同源介导修复(Homology directed repair,HDR)或者非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)两种DNA修复途径。当细胞通过NHEJ途径进行修复时,在连接处有碱基的缺失与插入,会产生开放阅读框的移码突变使靶基因失活,实现基因敲除。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明首次发现,将神经元细胞和脑血管内皮细胞中的Cmpk2基因进行条件性敲除,可用于制备脑钙化的动物模型。
(2)本发明的脑钙化动物模型可用于抗脑钙化药物的筛选。
(3)本发明以Cmpk2基因敲除小鼠为研究对象,通过分析小鼠的脑钙化水平,研究小鼠脑病理形态,初步判断药物是否具有抗Cmpk2相关的脑钙化的效果。鉴于Cmpk2条件性敲除小鼠的明确的表型优势,此方法可以快速高效的对药物的有效性进行初步评价,进而推动药物的开发和上市。
(4)本发明首次发现,敲除Cmpk2基因的小鼠再现了Cmpk2缺乏症患者的脑钙化表型,因此使用该方法构建的小鼠模型去开发和筛选疾病治疗药物,将大大提高药物研发效率和准确性,降低临床研究失败的风险。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1患者遗传学分析和颅脑CT扫描
1.1遗传学分析
在117个家庭和365例零星的中国汉族脑钙化患者中,共有45个家庭和334例散发的患者对之前报道的6个PFBC致病基因(SLC20A2、PDGFRB、PDGFB、XPR1、MYORG和JAM2)检测呈阴性。在两个FBC家族中确定了CMPK2的潜在致病性变异,随后将检查扩大到所有43个家族和334例通过桑格测序基因诊断为阴性的散发患者,以及500名健康对照个体。入组前获得所有参与者的知情书面同意。本研究获得福建医科大学第一附属医院(MRCTA,FMU ECFAH[2019]198)和浙江大学第二附属医院(I2019001149)机构伦理委员会的批准。
采用标准方法从外周血白细胞中提取人类基因组DNA。对于WES,使用AgilentSureSelect All exon 50MB(V6)捕获试剂盒制备了整个外显子库和整个基因组库。测序采用Illumina HiSeq 3000平台,WES平均覆盖深度为100×,WGS平均覆盖深度为30×。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将测序读数与人类基因组构建38(GRCh38)进行比对。变异使用基因组分析工具包(GATK)调用,并用ANNOVAR进行注释。在ESP、ExAC、10000基因组和gnomAD数据库中,根据其遗传模式进一步筛选频率<0.01的变异作为可能的致病突变。最后,基于常染色体隐性遗传模型分析致病变异。
对于CMPK2靶向分析,Sanger测序用于检测CMPK2位点的编码外显子和从CMPK2转录本反转录的CMPK2 cDNA分子,存在于全血白细胞(NM_207315)中。引物见补充表1。用PyMOL软件进行CMPK2蛋白结构分析。根据制造商说明,使用TRIzol(Invitrogen,USA)从患者和健康对照组的外周血单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,然后进行DNase I处理以去除DNA污染。
对于RNA文库的制备和测序,根据Illumina协议,使用TruSeq RNA Sample PrepKit处理剩余的mRNA。然后,根据生产厂家的说明书,构建mRNA文库并进行质量检测。在Illumina Hiseq 4000平台上对RNA文库进行测序,得到150bp的对端reads。使用fastqcv0.10.1(http://www.bioinformatics)对原始读取的数据处理进行质量检查。babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和修剪低质量的底座和适配器,如果有必要,使用TrimGalor(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)。使用HISAT2 v2.0.4将Clean reads映射到参考基因组。利用DESeq2包分析各差异基因的表达谱,发现表达水平>0和p值<0.05发生倍性变化的基因为差异表达基因。
结果
根据Sanger测序排除已知脑钙化相关基因的参与。随后,为了寻找潜在的潜在FBC发展的新的遗传因素,对家族1的I-1、I-2、II-3和II-5进行了WES检查。假设常染色体隐性遗传模式的假设,采用策略搜索受影响的患者,但没有从未受影响的兄弟姐妹。通过这种方式,通过全基因组序列(WGS)确定了两个具有双等位基因v168变异的候选基因(CMPK2(c.2T>C,p.M1?)和LPIN1(c.1100C>G),导致家族1II-5的基因,但未检测到可疑变异,CMPK2纯合空变体(C.2T>C,p.M1?)被预测为功能缺失变体。
隐性遗传家族2的WES分析也发现CMPK2基因的复合杂合变异(C.1A>C,p.M1?;c.1241A>G,p.Y414C),II-1型伴严重脑钙化。然后进行Sanger测序,成功确认了两个家族中具有脑钙化表型的双等位基因CMPK2变体共分离(图1a)。
C.1A>C(p.M1?)和C.2T>C(p.M1?)变异导致CMPK2开放阅读框起始密码子的丢失,这表明这种突变的CMPK2 mRNA转录本的任何翻译可能被中断,或以其他方式从后续的ATG密码子重新启动(C.79_81,p.M27)(图1b)。
为了进一步验证上述突变的后果,我们在Cos-7细胞中过表达CMPK2的标记变体(ΔN26(C.1A>C和C.2T>C)和Y414C(C.1241A>G)。使用抗Flag抗体和线粒体标记COX IV进行免疫荧光分析,发现野生型(WT)CMPK2和CMPK2-Y414C,而不是CMPK2-ΔN26定位于线粒体(图1c)。转染CMPK2-ΔN26的培养神经元线粒体片段的Western blotting也证实了线粒体定位的破坏(图1d,1e)。
在培养的神经元中,与WT形式相比,所有三种变体都显示出CMPK2蛋白表达水平的显著降低,这表明这些突变也可能产生无意义介导的mRNA衰减(NMD)效应,这将加剧突变导致的CMPK2缺乏。这些结果支持了CMPK2线粒体位置和功能缺失可能是上述家族脑钙化的病理基础的观点。
1.2患者颅脑CT扫描
对两个CMPK2基因突变的家系1和2中的遗传性脑钙化患者分别进行颅脑成像,观察其脑钙化水平。
结果如图2所示,脑实质中的白色区域为脑钙化灶。脑钙化分布于苍白球、丘脑、小脑、尾状核、室周白质和大脑皮层。
实施例2Cmpk2基因在小鼠脑中的表达
为了进一步阐明Cmpk2基因的功能,采用原位杂交技术分析了Cmpk2mRNA在WT小鼠脑中的表达模式。在原位杂交之前,所有仪器和试剂都经过清洗或焦碳酸二乙酯(DEPC)预处理。用4%多聚甲醛(PFA)灌流两个月大的小鼠,用15%和30%蔗糖连续脱水,制备20μm厚的脑片,然后将其安装在Superfrost玻片(Fisher公司)上。
对于双重原位杂交,RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2(Advanced Cell Diagnostics公司,Cat.323100)与Cmpk2探针C1结合使用,使用或不使用Gad1 C2、Slc17a6 C2(Vglut2)或Aldh1i1 C2探针。
对于原位杂交结合免疫荧光的双重标记,首先用Cmpk2基因探针对脑切片进行原位杂交,然后用抗S100β抗体(1:300,ab868,Abcam公司)孵育。使用带有40×物镜(Olympus公司)的VS120显微镜获取全脑原位杂交图像。
对于共定位成像,在40×物镜Olympus FV3000激光共聚焦显微镜上,使用488/468nm激光和0.4μm的Z轴叠加模式对原位杂交切片进行成像。
每个样本的原位杂交分析重复三次。
结果
单探针杂交显示Cmpk2基因在所有脑区都广泛表达(图3a)。在CA1(Cornu Ammonis1)锥体神经元的胞体层、海马齿状回(granule cell layer,DG)的颗粒细胞层(granulecell layer,GCL)以及小脑的浦肯野细胞层(Pukinje cell layer,PCL)和GCL(图3b)中均出现了强烈的Cmpk2信号富集,这表明其在神经元中大量富集。
为了确定表达Cmpk2基因的细胞类型,将Cmpk2基因探针与针对其他细胞类型的标记基因探针相结合进行双重杂交检测。
Cmpk2信号与GABA能神经元特异性的Gad1阳性细胞共同定位于丘脑和小脑PCL上(图3e,f)。此外,Cmpk2基因标记还与丘脑和小脑齿状核中的谷氨酸能神经元特异性Slc17a6(Vglut2)阳性细胞标记相重叠(图3c,d)。此外,根据已发表的单细胞转录组数据,发现Cmpk2基因在周细胞或小胶质细胞中也没有明显表达(http://betsholtzlab.org/VascularSingleCells/database.html)。
相比之下,在这项单细胞RNAseq研究中发现了血管内皮细胞(vascularendothelial cells,vECs)中Cmpk2基因的强烈表达,这一点再次得到了另一项独立研究的证实(http://celltypes.org)。
总之,Cmpk2基因在神经元和脑血管内皮细胞中的高表达支持Cmpk2基因缺陷可能导致包括脑钙化在内的脑疾病。
实施例3Cmpk2 KO小鼠和Cmpk2 c.2T>C(p.M1?)KI小鼠模型构建
进一步地,构建Cmpk2 KO小鼠和Cmpk2 c.2T>C(p.M1?)KI小鼠模型深入探究Cmpk2突变基因的机能。通过CRISPR/Cas9方法构建Cmpk2 KO小鼠和Cmpk2 c.2T>C(p.M1?)KI小鼠,并对F0代小鼠进行基因分型。
对于KO小鼠,通过MEGAshortscriptTM和mMESSAGE mMACHINETM T7超转录试剂盒(Invitrogen公司)合成sgRNAs和Cas9 mRNA(100ng/μL),并将sgRNAs和Cas9 mRNA共同注入C57BL/6J受精卵,然后在囊胚期将受精卵植入代孕雌性小鼠。
对于KI小鼠,供体寡核苷酸与sgRNA和Cas9 mRNA共同注射。
提取F0代小鼠尾部基因组DNA,对基因编辑的Cmpk2基因组序列进行PCR扩增,并克隆到T载体(Promega公司,A137A)中。
对每个F0小鼠进行至少20个克隆子的测序,以评估Cmpk2基因敲除情况。选择Cmpk2 KO F0小鼠和纯合Cmpk2 c.2T>C(p.M1?)KI纯合子小鼠用于后续实验。表1列出了sgRNA序列、供体寡核苷酸序列和基因分型引物。F0代小鼠经过四代以上的与野生型C57小鼠配对进行纯化后,用于后续的研究。
所有P0 Sprague-Dawley(SD)小鼠均购自上海SLAC实验动物有限公司。所有小鼠均保存在中国科学院上海脑科学与智能技术卓越创新中心的动物中心内。小鼠被安置在标准的12小时光/暗循环环境中,可以自由获得标准的啮齿动物的食物和水。
所有研究均包含雄性和雌性小鼠,未观察到性别偏差。所有实验程序均经中国科学院神经科学研究所的动物饲养和使用委员会批准。
表1本发明所用的引物或寡聚物序列
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实施4质粒构建细胞培养和转染
根据表1,使用Mut快速突变试剂盒V2(Vazyme)将标记的人CMPK2cDNA序列克隆到pCMV-Entry中。
在12孔板(Corning)中使用添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养Cos-7细胞,含或不含盖玻片。按照制造商的说明,使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)转染CMPK2质粒。原代培养如前所述。用6μg的CMPK2-Flag、CMPK2-c.1A>C-Flag、CMPK2-c.2T>C-Flag或CMPK2-c.1241A>G-Flag的质粒(AMAXA Nucleofector,Lonza)转染分离的大鼠神经元,并与GFP共转染。电穿孔取1×107细胞进行后续生化测定。
4.1细胞免疫荧光分析
为了进行细胞免疫荧光分析,首先用4%PFA固定盖玻片15分钟,然后用0.1%Triton X-100在含5%BSA的PBS溶液中渗透和封闭15分钟。
接下来,将盖玻片与抗Flag(1:2000,F7425,Sigma)、COX IV(1:2000,ab33985,abcam)、ATP合酶(1:50 00,MAB3494,Sigma)和MAP2(1:1000,sc20172,Santa cruz)在4℃孵育过夜。
第二天,用PBS冲洗三次,然后与相应的二抗(Alexa Fluor,Invitrogen)在室温下孵育2小时。
最后,用Hoechst(Beyotime)对盖玻片进行染色,再用PBS洗涤三次,然后安装在玻片上。
采用60×物镜Olympus FV3000激光共聚焦显微镜进行荧光成像,采用488/468nm激光,z间隔0.4μm。这些成像分析均重复进行了三次。
4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(Western blotting)
使用细胞线粒体分离试剂盒(Beyotime)收集电穿孔后原代培养的大鼠神经元(体外3天,DIV 3)。将WT和Cmpk2-KO小鼠的初级小鼠神经元(DIV 5)收集在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中,裂解液在14000g离心15分钟。用13%SDS-PAGE凝胶分离蛋白精,并吸附在PVDF膜上。用5%脱脂牛奶阻塞细胞膜,然后用Flag(1:5000,F1804,Sigma-Aldrich)、CMPK2(1:1000,PA5-59570,ThermoFisher)、COX IV(1:2000,#4850,细胞信号传导)、细胞色素c(1:20 50,sc13156,次级hrp结合抗体(1:2000,细胞信号传导)检测。用ECL(TIANGEN)显影,并用Image J软件测量。
4.3线粒体DNA拷贝数分析
采用液滴数字PCR(ddPCR)法定量测定mtDNA拷贝数。方法如下:
从Cmpk2-KO和WT小鼠脑组织中提取总DNA(TIANGEN;Gene Tech)。然后,根据制造商的协议,使用QX200 AutoDG液滴数字PCR系统(Bio-Rad)与TaqMan引物/探针组进行ddPCR反应。ddPCR的探针和引物均购自ThermoFisher(4458367,见表1)。
通过归一化总mtDNA水平来确定mtDNA拷贝数,对三份基因组样本进行分析。
结果
与WT同窝小鼠相比,Cmpk2-KO小鼠大脑中mtDNA(Nd1)与核DNA(β-actin或Tfrc)的比值降低了25-30%(图4a)。神经元作为高能量消耗的细胞类型,更容易受到线粒体损伤。考虑到在神经元中稳健表达Cmpk2的结果,以及Cmpk2变异产生线粒体靶向缺陷,因此推测Cmpk2缺陷神经元可能与脑钙化病理有关。
Cmpk2-KO小鼠的神经元中mtDNA编码呼吸链酶复合体IV(COX IV)和细胞色素C水平明显下调(图4c,d)。线粒体标记ATP合酶β链的免疫荧光染色显示其信号强度降低(图4b),从形态学上支持Cmpk2-KO小鼠神经元线库的下降。
4.4细胞内磷和ATP的测定
原代培养将WT和Cmpk2-KO神经元原代培养3次,测定测定细胞内磷。然后用无磷裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1%TritonX-100)裂解细胞。然后用裂解物检测无机磷酸盐(Pi)释放(303-0030,Innova Biosciences)。将原代培养的WT和Cmpk2-KO神经元分别接种于96孔细胞培养板上,测定细胞内ATP含量。在DIV 6中,根据制造商的说明,用发光分析法(ab113849,Abcam)检测ATP水平。
结果
结果如图4e所示,Cmpk2-KO小鼠神经元中ATP水平显著降低。表明Cmpk2-KO确实导致线粒体功能不足。
此外,Cmpk2-KO小鼠神经元细胞内Pi水平明显高于WT同窝小鼠(图4f)。然而,Cmpk2-KO小鼠脑脊液和血清中Pi浓度未发现明显变化(图4g)。因此,这些结果表明,CMPK2的丢失会破坏线粒体功能和细胞内Pi稳态。
4.5透射电镜(TEM)
用透射电镜(TEM)对来自P0-P1 WT和Cmpk2-KO小鼠的原代培养的小鼠锥体神经元进行成像。方法如下:
将神经元镀在Thermanox塑料盖套中(ThermoFisher),在2.5%戊二醛中固定DIV7,然后用1%OsO4固定(TED PELLA,18451),并用4%的醋酸铀染色。然后,通过增加乙醇浓度脱水,然后是环氧丙烷,然后嵌入树脂。超薄切片用超金刚石刀(瑞士Diatome)在超微切片机(EM UC7,Leica,德国)上切割至70nm,并安装在铜网格上。然后用TEM(JEM-1230,JEOL,日本)和CCD相机(Gatan Orius SC,200w,2048×2048)观察和拍摄切片。
采用双盲法观察线粒体嵴,并由训练有素的观察员评估其覆盖面积。测量线粒体中嵴覆盖区域的长度和宽度,并计算了其面积,以及线粒体面积。嵴覆盖面积与整个线粒体面积的比值即为嵴覆盖<40%、40-60%、>60%。在三个独立实验中,原代培养皮层神经元的线粒体形态定量分析(来自TEM图像)检测了40个WT神经元和48个Cmpk2-KO神经元。
结果
Cmpk2-KO小鼠培养的神经元中有相当大比例的线粒体嵴形态异常(如不规则排列、疏松破碎、嵴扭曲),且线粒体嵴缺失(图4h)。Cmpk2-KO神经元的嵴覆盖低于40%的线粒体比例更高(KO神经元的比例为68.8%,WT神经元为37.8%,图4h-j)。
上述结果支持了Cmpk2在某种程度上维持正常的神经元线粒体嵴形态。
实施例5Cmpk2-KO和KI小鼠大脑中的钙化沉积
为了测试小鼠中的Cmpk2基因缺陷是否会导致与患者表型相似的大脑钙化,以实施例2中通过CRISPR-Cas9策略制备的Cmpk2-KO和Cmpk2-KI小鼠为研究模型。使用Micro-CT和多种组织学染色(包括茜素红、冯·科萨、阿尔辛蓝和高碘酸希夫(PAS)以及H&E)定期分析Cmpk2 KO小鼠是否出现钙化沉积。
用水合氯醛麻醉小鼠,并在PBS中灌注4%PFA48。在石蜡包埋之前,对纯合的Cmpk2-KO和WT小鼠的大脑进行一系列乙醇脱水,以制备厚度为4μm的切片。采用组织学染色评估脑钙化水平(使用alizarin red,Von Kossa,Alcian blue和periodic acid-Schiff(PAS)染料)。
通过基于X射线的Micro-CT扫描(Quantum GX,Perkinlemer公司)来获得小鼠大脑的三维图像,在高分辨率模式下评估石蜡包埋小鼠大脑,X射线管电压为90kV,电流为88μa,体素大小为72μm。
每个样本的分析重复三次。
结果
结果显示,在14个月时,Cmpk2-KO小鼠的丘脑中观察到了密集的钙化沉积,但在WT小鼠中未观察到(图5a)。且13个月大的Cmpk2 KO小鼠中,可以通过显微CT检测到钙化结节(图5b)。钙化进展的时间分析显示,最初的单点钙化沉积在10月龄左右开始,并在12和14月龄检查的小鼠丘脑中发展为多个更大的病灶(图5c)。
为了进一步研究Cmpk2基因突变与脑钙化的潜在因果关系,通过将患者Cmpk2基因突变(c.2T>C,p.M1?)敲入其编码序列的方式构建了Cmpk2 KI小鼠模型。这种突变导致mTP的丢失,并推测蛋白翻译将在随后的ATG密码子(p.M31)处重新启动(5d)。从12个月开始,在纯合Cmpk2 KI小鼠的丘脑中也发现了明显的钙化沉积(图5e)。
这些结果证实了Cmpk2基因缺陷是小鼠脑内钙化沉积物形成的原因,并进一步支持Cmpk2基因突变可以解释患者的脑钙化表型。
讨论
本发明通过对2个特定的遗传性脑钙化症家族进行遗传分析,首次发现了与脑钙化共分离的CMPK2突变基因,相关实验显示CMPK2突变基因导致了线粒体DNA拷贝数下降、线粒体形态和功能障碍,同时破坏了CMPK2蛋白的线粒体靶向性。并且在纯合CMPK2基因敲除小鼠以及携带该脑钙化家族突变的CMPK2基因敲入小鼠中,出现随年龄进展的脑钙化沉积。
因此CMPK2被证实是脑钙化症的遗传致病因子,遗传性脑钙化症的致病机制由此进一步拓展到CMPK2基因缺陷引起的线粒体功能失调。这将对CMPK2基因的功能解析及应用提供基础和依据,特别是对脑钙化发病机制探究以及诊治和筛查提供新的分子靶标及理论基础。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种脑钙化非人哺乳动物的制备方法,其特征在于,所述方法包括:使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,使用选自下组的方法使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活:基因敲除、基因编辑、RNA干扰、表观遗传学抑制、以抗CMPK2蛋白或其同源蛋白的抗体阻断或抑制CMPK2蛋白或其同源蛋白的活性。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,使用基因编辑的方法使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活;较佳地,通过基因编辑产生碱基缺失、插入,从而导致蛋白质编码框提前终止。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在CMPK2基因中引入特定基因突变,造成CMPK2蛋白在无法定位在线粒体中发挥功能。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,对应于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3,在起始密码子部位引入c.2T>C或c.1A>C,造成CMPK2野生型基因编码蛋白第1-26位点的氨基酸片段发生缺失,从而使突变蛋白产物无法进入线粒体。
6.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,通过基因编辑产生碱基缺失使动物基因组中的CMPK2基因缺失、降低表达或失活,所述方法包括步骤:
(a)体外转录合成sgRNAs和Cas9 mRNA;
(b)将sgRNA和Cas9 mRNA共注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,在囊胚期将其植入代孕雌性小鼠,从而获得F0代小鼠。
7.一种Cmpk2基因抑制剂的用途,其特征在于,用于制备作为脑钙化细胞模型或非人哺乳动物模型的试剂盒。
8.如权利要求7所述的Cmpk2基因抑制剂的用途,其特征在于,所述的抑制剂包括基因编辑试剂、基因敲除试剂、基因编辑试剂、RNA干扰试剂、表观遗传性抑制试剂、小分子化合物。
9.一种线粒体缺陷的动物细胞,其特征在于,所述动物细胞中内源性Cmpk2基因缺失、表达下调或失活;
并且与未下调Cmpk2基因表达的原始细胞相比,所述动物细胞中Cmpk2蛋白的表达是下调的。
10.如权利要求1所述的方法制备的脑钙化非人哺乳动物模型,如权利要求9所述的动物细胞,其特征在于,用于制备试剂,其中,所述试剂用于:
(i)研究脑钙化的发生机制;
(ii)研究脑钙化的发展机制;
(iii)筛选治疗神经系统疾病的候选药物或治疗剂;和/或
(iv)评估治疗神经系统疾病的候选药物或治疗剂的疗效。
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