CN117887666A - 工程化外泌体及其在快速生成car-t细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了工程化外泌体及其在快速生成CAR‑T细胞中的应用，本发明公布的工程化外泌体经雾化吸入等方式进入体内后，可以直接靶向T细胞并将CAR mRNA递送至T细胞内，进而直接生成CAR‑T细胞。这种方法可以大幅降低CAR‑T细胞的制备周期和成本。同时，这种外泌体可以大规模生产并长期保存，解决了CAR‑T细胞规模化生成困难的缺点。本发明显示该工程化外泌体能快速生成CAR‑T细胞，且生成的CAR‑T细胞具有良好的肿瘤杀伤效果，因此有望推动CAR‑T细胞在肿瘤治疗中的应用。

Description

工程化外泌体及其在快速生成CAR-T细胞中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体的，涉及工程化外泌体及其在快速生成CAR-T细胞中的应用。

背景技术

癌症是全球健康的重大挑战，其发病率和死亡率不断升高。据世界卫生组织(WHO)报告，癌症是全球死亡的主要原因之一，每年导致数百万人死亡。传统的癌症治疗方法包括手术、放疗和化疗，但这些治疗常常伴随着重大的副作用和复发的高风险。近年来，针对特定癌症类型的靶向治疗和免疫治疗提供了新的治疗方案，但对于许多患者来说，治疗效果仍然有限。因此，迫切需要一种新型的治疗方法以改善肿瘤患者的预后。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)疗法是一种采用基因工程技术的免疫疗法。在这种疗法中，患者的T细胞被提取并通过逆转录病毒或其他载体系统转导以表达特定的嵌合抗原受体(CAR)。这些CAR是人工设计的蛋白质，能够特异性识别并结合到肿瘤细胞表面的抗原，从而激活T细胞对这些靶细胞的攻击。CAR-T细胞疗法在某些血液肿瘤治疗中取得了显著的突破，尤其是在治疗难治性或复发性的急性淋巴细胞白血病(ALL)和某些类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)中表现出高效的疗效。这些成就主要归功于CAR-T细胞对特定癌症标志物的高度特异性，如CD19，这是大多数B细胞肿瘤细胞表面表达的一个抗原。然而，CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中面临诸多挑战。实体瘤的微环境具有免疫抑制特性，限制了CAR-T细胞的渗透和功能。此外，实体瘤的异质性和缺乏高度特异性的肿瘤相关抗原增加了靶向的复杂性和安全风险。这些因素导致了CAR-T细胞在实体瘤治疗中的效率和持久性受限。重要的是，CAR-T细胞疗法的一个主要缺点是其高昂的成本和长时间的制备周期。CAR-T细胞的生产涉及复杂的生物工程技术，包括细胞采集、基因修改、扩增和质量控制等多个步骤。这一过程不仅耗时，而且需要高度专业化的设施和技术支持。此外，每个病人的CAR-T细胞都是定制化生产的，这增加了生产成本，并限制了治疗的广泛可及性。这些因素使得CAR-T细胞疗法在经济上和时间上对许多患者构成了重大负担。因此，迫切需要改进CAR-T细胞的制备方法，以降低CAR-T疗法的费用和制备时间，进而推进CAR-T疗法在实体瘤中的应用。

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是一类由细胞释放到外部环境中的膜包裹小体。它们在大小、起源和组成上有所不同，可分为几种类型，包括外泌体(Exosomes)、微泡(Microvesicles)和凋亡体(Apoptotic bodies)。EVs自然存在于多种体液中，如血液、尿液和唾液，并在细胞间的通讯中发挥作用，转运蛋白质、脂质和核酸等生物大分子。由于细胞外囊泡具有高生物相容性、低免疫原性、易修饰性和良好的负载能力，目前已作为递送载体被广泛应用。在药物递送方面，EVs特别适合用于递送不稳定的生物大分子，如mRNA。EVs能够很好地保护mRNA、防止mRNA被血液中的核酸酶降解。此外，通过基因工程技术，可以进一步增强EVs的靶向递送能力。例如，通过基因工程化技术使EVs表面表达可以识别特定肿瘤抗原的抗体或配体，可以增强其在靶向癌症治疗中的应用潜力。因此，通过基因工程改造的EVs有望用于mRNA的递送，进而用于在体内制备CAR-T细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，提供一种种可以直接制备CAR-T的工程化外泌体，该外泌体具有良好的T细胞靶向性、激活T细胞的能力和RNA结合能力。

本发明的第二个目的是提供利用该工程化外泌体制备可以表达嵌合抗原受体的T细胞。

本发明的第三个目的是提供上述可以表达嵌合抗原受体的T细胞的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种能够直接快速生成CAR-T细胞的工程化外泌体，所述工程化外泌体表面同时表达能够识别并激活T细胞的双特异性单链可变片段CD3/CD28 scFv和能与mRNA结合的RNA结合肽L7Ae/CD63；所述编码CD3/CD28 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述编码RNA结合肽L7Ae/CD63的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

信使RNA(mRNA)是一种单链RNA分子，它携带从DNA转录而来的遗传信息，并在细胞质的核糖体上指导蛋白质的合成。mRNA是从基因转录的产物，它携带特定的氨基酸序列信息，用于合成特定的蛋白质。在肿瘤治疗领域，mRNA被用作一种治疗工具，以编码抗癌蛋白或肿瘤抗原。这些编码的蛋白质可以激活患者的免疫系统，使其能够识别和攻击癌细胞。例如，mRNA疫苗可以编码肿瘤特异性抗原，激发免疫应答以针对特定的癌症。重要的是，目前已有许多研究者尝试通过将mRNA导入至T细胞，直接生成瞬时表达的CAR-T细胞。然而，这种方法仅限于体外制备。将mRNA用于体内制备CAR-T细胞尚存在许多困难。其中，mRNA的有效递送到靶细胞是实现其疗效的关键挑战之一。由于mRNA在体内不稳定，易被酶降解，并且无法轻易穿过细胞膜，因此需要使用特殊的载体进行递送。常用的递送系统包括病毒载体、脂质纳米颗粒(LNPs)、聚合物和裸露的mRNA。然而，这些载体存在一定免疫原性，且缺乏靶向性。因此，急需开发一种新型的递送载体，将mRNA递送至T细胞中，进而生成CAR-T细胞。

CD3是T细胞受体(TCR)复合体的一部分，对T细胞的激活和信号传导至关重要。CD3复合体由几个不同的蛋白亚单位组成，它与TCR共同工作，传递抗原识别信号，从而激活T细胞。CD3在所有成熟T细胞的表面上都有表达，是T细胞成熟和功能的关键组成部分。CD28是T细胞表面的一种共刺激分子，对T细胞的完全激活至关重要。CD28通过与其配体(如B7-1和B7-2)的结合，增强TCR信号，促进T细胞的增殖、分化和生存。CD28的信号途径对于有效的免疫应答和T细胞的抗肿瘤活性尤为重要。目前已开发出多种针对CD3和CD28的单克隆抗体，这些抗体主要用于增强T细胞反应。通过靶向CD3和CD28，研究人员正在开发新的方法来增强T细胞的抗肿瘤活性。例如，将抗体药物偶联物(ADCs)或其他治疗剂与针对CD3或CD28的抗体结合，可以直接将药物递送到T细胞，激活它们对抗肿瘤。在细胞治疗，尤其是在CAR-T细胞疗法的制备过程中，利用针对CD3和CD28的抗体激活和扩增T细胞是一个关键步骤。通过体外刺激T细胞，这些抗体能够增强T细胞的增殖和活化，从而为后续的遗传改造和肿瘤靶向治疗打下基础。因此，在外泌体上表达针对CD3和CD28的scFv，有望提高外泌体对T细胞的靶向性，同时激活T细胞。

RNA结合肽是一类特殊的肽类分子，能够与RNA分子特异性结合。这些肽通过识别RNA的特定序列或结构，与之结合，从而影响RNA的功能或稳定性。在自然界中，RNA结合肽参与各种生物学过程，如RNA的剪接、转运、定位和降解。其中，L7AE是一种特定的RNA结合肽，属于一类能够识别并结合到具有Kink-turn(K-turn)结构的RNA分子的肽。K-turn结构是一种在多种RNA分子中发现的特殊二级结构，L7AE通过特异性结合这种结构来影响相关RNA分子的功能。在mRNA递送领域，RNA结合肽的应用是一个创新的研究方向。这些肽可以用作功能性载体，帮助将mRNA递送到特定的细胞中。因此，在外泌体上表达RNA结合肽可有效增强外泌体封装mRNA的能力。

该工程化外泌体具有如下特征：(1)首先，该外泌体表面表达了抗CD3/CD28双特异性抗体的单链可变片段(anti-CD3/CD28 scFv)，因此该工程化外泌体不仅靶向T细胞，还可以通过anti-CD3/CD28 scFv直接激活T细胞。(2)其次，该工程化外泌体还表达了RNA结合肽(L7Ae/CD63)，因此通过L7Ae与C/D box的特异性结合，可以将修饰C/D box的CAR mRNA封装在外泌体内部。(3)最后，该工程化外泌体通过将负载的CAR mRNA递送至T细胞，可以实现CAR-T细胞的快速生成。

本发明还提供一种慢病毒表达载体，包含编码权利要求1所述的核苷酸序列SEQID NO.1和/或核苷酸序列SEQ ID NO：2。

本发明还提供所述工程化外泌体在制备嵌合抗原受体修饰的T细胞中的应用。

本发明还提供一种制备嵌合抗原受体修饰T细胞的方法，包含如下步骤：

(1)将编码识别T细胞的CD3/CD28 scFv和编码RNA结合肽L7Ae/CD63的核苷酸序列重组到慢病毒表达载体中，获得慢病毒表达质粒；

(3)将表达质粒转染至293T细胞，构建293T稳转株；经过离心获得表达识别T细胞的CD3/CD28 scFv和RNA结合肽L7Ae/CD63的工程化外泌体；

(4)使用步骤(3)得到的工程化外泌体在体外感染T淋巴细胞，在体外获得嵌合抗原受体修饰的T细胞；

或，将工程化外泌体导入人体内部，在体内获得嵌合抗原受体修饰的T细胞。

本发明还提供所述方法得到的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

传统CAR-T细胞的制备包括从患者体内分离T细胞、使用CD3/CD28抗体激活T细胞、慢病毒感染T细胞、T细胞的扩增和细胞的再回输等程序，具有制备时间周期长和制备成本高等缺点。此外，由于患者T细胞培养过程时为了防止免疫排斥，需要专人专机培养，使CAR-T细胞的生成难以规模化。本发明公布的工程化外泌体经雾化吸入等方式进入体内后，可以直接靶向T细胞并将CARmRNA递送至T细胞内，进而直接生成CAR-T细胞。这种方法可以大幅降低CAR-T细胞的制备周期和成本。同时，这种外泌体可以大规模生产并长期保存，解决了CAR-T细胞规模化生成困难的缺点。本发明显示该工程化外泌体能快速生成CAR-T细胞，且生成的CAR-T细胞具有良好的肿瘤杀伤效果，因此有望有望推动CAR-T细胞在肿瘤治疗中的应用。

附图说明

图1用于CAR-T生成的工程化外泌体的分子结构设计；

图2为工程化外泌体的粒径分析结果图；

图3工程化外泌体的CAR mRNA装载能力评估；

图4工程化外泌体对T细胞靶向能力评估，使用DiO对外泌体染色后，通过共聚焦显微镜观察外泌体在T细胞中的聚集程度；

图5工程化外泌体生成CAR-T细胞能力评估，将工程化外泌体转入T细胞后，通过共聚焦显微镜观察GFP标记的CAR蛋白在T细胞中的表达情况；

图6工程化外泌体生成的CAR-T的抗肿瘤能力评估，E：T radio是指将效应细胞(CAR-T)与靶细胞(PC-9细胞)以不同的比例共孵育，然后评估CAR-T细胞对PC-9细胞的特异性裂解能力。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1质粒的构建

本发明提供的靶向和激活T细胞的scFv，由信号肽、CD3 scFv、CD28scFv、连接肽、LAMP2B串联形成，结构如图1(上)所示；本发明提供的RNA结合肽，由信号肽、CD63、L7Ae串联形成，结构如图1(下)所示；其中，CD3 scFv和CD28 scFv串联的基因序列来自本实验室构建的单克隆抗体序列，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合T细胞的表达，基因序列信息如序列表SEQ ID NO.1所示。CD63和L7Ae的基因序列同样来自本实验室构建的单克隆抗体序列，并将其进行密码子优化，基因序列信息如序列表SEQ IDNO.2所示。设计好序列以后，委托上海捷瑞生物公司合成。

在完成CD3/CD28 scFv和CD63/L7Ae的基因序列合成后，分别亚克隆至含有pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO的质粒中和pCDH-CMV-MCS-EF1-NEO，从而获得目的基因。

实施例2工程化外泌体的制备

为了制备可以靶向并激活T细胞的基因工程化外泌体，首先对HEK 293T细胞进行慢病毒质粒转染，这些质粒携带着目标蛋白的编码信息。同时，将携带CAR蛋白编码的mRNA质粒与之一同转染到293T细胞中。接着，在不含外泌体的FBS培养基中培养经过基因稳定表达改造的HEK 293T细胞，并采用差速超速离心法从培养基中分离外泌体。

本研究中，外泌体的分离和纯化过程如下所述：

1.在去除外泌体的FBS培养基中，扩增已稳定表达目标基因的HEK 293T细胞。

2.用3200g的离心速度旋转5分钟，以去除较大的颗粒，然后收集上层清液。

3.继续用20000g的离心速度旋转25分钟，再次收集上层清液。

4.将上述清液在100000g的离心速度下旋转35分钟，丢弃上层清液，保留沉淀物。

5.使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)重新悬浮沉淀物，并在4℃下保存。

6.利用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒对膜蛋白含量进行定量，并将样品分装，用于后续的实验研究。

实施例3基因工程化外泌体中CAR mRNA装载情况的评估

为了评价工程化外泌体内CAR mRNA的含量，我们从这些外泌体中提取总RNA，采用TRIzol试剂(由Invitrogen公司，美国生产)。提取的RNA通过NanoDrop光谱光度计进行量化。随后，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将相同量的RNA逆转录为cDNA。通过Bio-Rad公司的CFX96实时PCR系统，结合Applied Biosystems公司的SYBR绿色母液和针对CAR的特异性引物，对cDNA进行实时定量PCR(RT-qPCR)。实验中以U6作为内参标准。

具体的RNA提取步骤包括：

1.在RNase-free EP管中离心收集外泌体，并用TRIzol试剂裂解。

2.向每500μl TRIzol加入100μl氯仿，剧烈振荡后室温静置2-3分钟直至分层，然后在4℃、12000rpm/min下离心15分钟。

3.将上层水相转移到新的RNase-free EP管中，加入每500μl TRIzol的250μl异丙醇，轻轻振荡后室温静置15分钟(或可选-20℃过夜)，随后在4℃、10000rpm/min下离心10分钟。

4.去掉上清，加入等体积的75％乙醇(用RNase-free水配制)，轻轻振荡后在4℃、10000rpm/min下离心10分钟。

5.去除乙醇，吸干残余液体，室温风干，根据沉淀量加入DEPC水溶解RNA，用Nanodrop检测RNA浓度和纯度。

逆转录PCR的操作步骤如下：

1.使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，将总RNA逆转录为cDNA。

2.将总RNA 1μg、Oligo(dT)1μl和补足至10.5μl的DEPC水混合，振荡后在PCR仪中65℃处理5分钟，之后冰上放置2分钟。

3.每孔加入如下试剂：5×Reaction Buffer 4μl、RevertAid^TMM-MuLV ReverseTranscriptase 1μl、10mM dNTP 1μl、RiboLock^TMRNase抑制剂0.5μl、DEPC水3μl，振荡均匀后于PCR仪中42℃反应60分钟合成cDNA，70℃反应5分钟终止反应，-20℃保存cDNA。

RT-qPCR的操作步骤如下：

1.将逆转录后的cDNA稀释10倍，作为qPCR模板。

2.配置10μl反应体系：2×SYBR Green Mix 5μl、5μM Primers Mix 0.4μl、稀释的cDNA模板1μl、DEPC水3.6μl。

3.实时PCR仪器程序设置：50℃预处理2分钟；95℃预处理2分钟；接着95℃15秒，60℃60秒，共40个循环；默认溶解曲线程序。

4.根据RT-qPCR反应的扩增曲线获取Ct值，利用相对定量法计算基因相对表达水平，以内参Ct为基准。

如图2所示，结果表明外泌体中成功装载了目标的CARmRNA。

实施例4工程化外泌体对T细胞靶向能力的增强评估

本实施例旨在通过定量的实验方法评估工程化外泌体对T细胞的靶向能力。实验的核心步骤包括使用DIO染料对外泌体进行标记，然后将这些染色的外泌体与T细胞共孵育，最终通过流式细胞术测定T细胞的平均荧光强度。

具体操作流程如下：

1.外泌体染色：

-使用0.5μM的DIO染料溶液染色外泌体。

-将外泌体与DIO染料混合，于室温下反应30分钟以完成染色过程。

-通过100,000g的超速离心10分钟移除多余的染料。

2.与T细胞共孵育：

-在96孔培养板中种植密度为1×10^6cells/ml的T细胞。

-向每孔中加入预先染色的外泌体，使最终体积达到500μl。

-在37℃、5％CO2的条件下将外泌体与T细胞共孵育4小时，以允许外泌体与T细胞的充分结合。

3.流式细胞术分析：

-共孵育结束后，轻柔离心(500g,5分钟)收集T细胞，并用PBS洗涤两次以去除未结合的外泌体。

-采用流式细胞术对处理后的T细胞进行分析，特别关注细胞的平均荧光强度。

-记录并比较处理组(Free Exo，无靶向性)和对照组(工程化外泌体，有靶向性)的荧光强度数据，评估外泌体的靶向能力。

通过比较处理组和对照组T细胞的平均荧光强度，本实施例可有效评估工程化外泌体对T细胞的靶向能力。荧光强度的显著提升将指示外泌体与T细胞的成功结合，从而验证工程化外泌体在免疫治疗领域的应用潜力。如图3所示，结果表明工程化外泌体对T细胞具有更好的靶向性。

实施例5工程化外泌体生成CAR-T细胞能力评估

本实施例的主要目的是评估工程化外泌体转染T细胞以生成CAR-T细胞的能力。实验中设置了对照组(Free Exo，未包裹任何mRNA的外泌体)和实验组(工程化外泌体，包裹编码嵌合抗原受体(CAR)mRNA)。这些外泌体分别以不同浓度处理T细胞，并在处理24小时后，通过流式细胞术检测T细胞表面CAR蛋白的表达。检测过程中使用的特异性抗体是针对CAR蛋白的protein L。

具体实验操作包括：

1.外泌体准备与T细胞感染：

-制备两组外泌体：一组为未包裹任何mRNA的Free Exo，另一组为包裹有编码CARmRNA的工程化外泌体。

-将这两组外泌体分别以不同的浓度与培养的T细胞进行共孵育，确保T细胞充分暴露于外泌体。

-在37℃、5％CO2的条件下，将外泌体与T细胞共孵育24小时，以允许外泌体中的mRNA转染至T细胞。

2.流式细胞术检测：

-感染24小时后，用流式细胞术收集和分析T细胞。

-使用特异性抗体protein L对T细胞表面的CAR蛋白进行标记。

-测定并记录两组T细胞(对照组和实验组)中CAR蛋白的表达水平。

通过对比对照组和实验组T细胞的CAR蛋白表达水平，本实施例可以有效评估工程化外泌体转染T细胞生成CAR-T细胞的能力。CAR蛋白表达的增加将直接证明工程化外泌体的转染效率，从而表明其在CAR-T细胞疗法制备中的应用潜力。如图4所示，结果表明工程化外泌体能有效生成CAR-T细胞。

实施例6评估CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力

为了对比工程化外泌体制备的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，我们使用了CytoTox非放射性细胞毒性检测方法来测定CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵育后上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放水平。这种检测是基于比色分析的，用于量化LDH的浓度，这是一种在细胞破裂时释放的稳定胞质酶。LDH在上清中的浓度越高，表明细胞裂解越多。在此实验中，我们选择PC-9细胞作为目标被杀伤细胞。实验的具体步骤如下：

1.对照设置：设置多个对照实验，包括效应细胞和靶细胞自发LDH释放的校正、靶细胞最大LDH释放量的确定、裂解液体积变化的校正、培养基背景校正以及LDH阳性对照。

2.实验操作：在96孔板中加入固定数目的肿瘤细胞，随后添加不同数量的效应细胞或外泌体，保证每孔总体积至少为100μl。接着，进行250g离心4分钟，以确保效应细胞与靶细胞的充分接触。

3.培养与收集：将培养系统孵育4-8小时，在收集前的45分钟向靶细胞最大LDH释放对照孔添加裂解液。4小时后，以250g离心4分钟，然后从每个孔中提取50μl上清至新的96孔板。

4.比色分析：向每个孔加入50μl已配制好的底物，用锡箔纸遮光并在室温下孵育30分钟，随后加入50μl终止液。

5.读数与计算：在492nm波长下测定吸光度，计算细胞毒性比例，即(实验组LDH释放量-效应细胞自发LDH释放-靶细胞自发LDH释放)/(靶细胞最大LDH释放-靶细胞自发LDH释放)×100％。

实验结果显示，利用工程化外泌体制备的CAR-T细胞对PC-9细胞展现出显著的细胞裂解作用(参见图5)。

上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种能够直接快速生成CAR-T细胞的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体表面同时表达能够识别并激活T细胞的双特异性单链可变片段CD3/CD28 scFv和能与mRNA结合的RNA结合肽L7Ae/CD63；所述编码CD3/CD28 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述编码RNA结合肽L7Ae/CD63的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种慢病毒表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的核苷酸序列SEQ IDNO.1和/或核苷酸序列SEQ ID NO：2。

3.权利要求1所述工程化外泌体在制备嵌合抗原受体修饰的T细胞中的应用。

4.一种制备嵌合抗原受体修饰T细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)将编码识别T细胞的CD3/CD28 scFv和编码RNA结合肽L7Ae/CD63的核苷酸序列重组到慢病毒表达载体中，获得慢病毒表达质粒；

(3)将表达质粒转染至293T细胞，构建293T稳转株；经过离心获得表达识别T细胞的CD3/CD28 scFv和RNA结合肽L7Ae/CD63的工程化外泌体；

(4)使用步骤(3)得到的工程化外泌体在体外感染T淋巴细胞，在体外获得嵌合抗原受体修饰的T细胞；

或，将工程化外泌体导入人体内部，在体内获得嵌合抗原受体修饰的T细胞。

5.权利要求4所述方法得到的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。