CN117881782A - 调节tjp1表达以治疗肝病 - Google Patents
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Abstract
公开了治疗受试者的肝病的方法，包括向受试者施用Tjp1抑制剂。Tjp1抑制剂可以是靶向Tjp1的siRNA或shRNA。还公开了试剂盒和编码Tjp1抑制剂的核酸。
Description
对相关申的交叉引用
本申请要求享有2021年9月16日提交的第10202110245U号新加坡专利申请和2021年12月1日提交的第10202113389U号新加坡专利申请的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文，用于所有目的。
技术领域
本发明大体上涉及分子生物学。特别是，本发明涉及通过靶向Tjp1治疗肝病的方法。
背景技术
肝病每年影响着全球许多患者。例如，肝癌是全球和亚太地区第三大最常见的癌症死因。肝病会对肝造成不同程度的损害。一些肝病导致肝纤维化，其中过量结缔组织堆积在肝内。其他肝病导致肝硬化，这是一种更严重的肝纤维化形式，会导致肝结构变形。这些病症通常与胆汁流动扰乱有关，胆汁流动扰乱导致例如但不限于胆汁淤积等肝病。目前，药物治疗、手术治疗或经动脉治疗等不同疗法可以用于肝病。尽管这些不同的治疗选项取得了进展，但成功治疗肝病仍是一项尚未解决的临床挑战。允许肝细胞存活或置换肝的治疗方法会具有巨大的经济和社会影响。鉴于上述问题，有必要提供替代方法来治疗受试者的肝病。
概述
在一个方面，提供了治疗受试者的肝病的方法，其中该方法包括向受试者施用药学有效量的Tjp1抑制剂。
在另一方面，提供了使受试者的胆管系统再生的方法，其中该方法包括向受试者施用药学有效量的Tjp1抑制剂。
在另一方面，提供了编码Tjp1抑制剂的核酸，其中该核酸与选自以下的序列具有至少60％或至少80％的同一性：
5’-CGTGGATTGAACTTACTAAAT-3’(SEQ ID NO:4)、5’-ATTTAGTAAGTTCAATCCACG-3’(SEQ ID NO:91)、5’-CCGCGAAGTTATGAGCAAGTT-3’(SEQ ID NO:5)、5’-AACTTGCTCATAACTTCGCGG-3’(SEQ ID NO:92)、5’-CGGCCATTTGAACGCAAATTT-3’(SEQ ID NO:6)、5’-AAATTTGCGTTCAAATGGCCG-3’(SEQ ID NO:93)、5’-GCAATGGTTAACGGAGTTTCA-3’(SEQID NO:104)、5’-AATGGTTAACGGAGTTTCAAT-3’(SEQ ID NO:105)、5’-AAGGAAATTTCACAAGATAGT-3’(SEQ ID NO:106)、5’-TACAAGTGATGACCTTGATTT-3’(SEQ IDNO:107)、5’-ACTGATCAAGAACTAGATGAA-3’(SEQ ID NO:108)、5’-AAGAACTAGATGAAACTCTTA-3’(SEQ ID NO:109)、5’-CCCACCTTTAGATAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:110)、5’-CAGCACGATTTCTGTTTAGAT-3’(SEQ ID NO:111)、5’-AGCACGATTTCTGTTTAGATA-3’(SEQ IDNO:112)以及5’-TAGATAATACACCACTACATT-3’(SEQ ID NO:113)。
在另一方面，提供了编码Tjp1抑制剂的核酸，其中该核酸与选自以下的序列具有至少60％的同一性：
I)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:4的3’端与SEQID NO:91的5’端，并且其中SEQ ID NO:91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；
II)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:5的3’端与SEQID NO:92的5’端，并且其中SEQ ID NO:92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；以及
III)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。
在另一方面，提供了编码Tjp抑制剂的核酸，其中该核酸与选自以下的序列具有至少60％的同一性： 以及/>
在另一方面，提供了编码Tjp抑制剂的核酸，其中该核酸与选自以下的序列具有至少60％的同一性：5’-UGAAACUCCGUUAACCAUUGC-3’(SEQ IDNO:94)、5’-AUUGAAACUCCGUUAACCAUU-3’(SEQ ID NO:95)、5’-ACUAUCUUGUGAAAUUUCCUU-3’(SEQ ID NO:96)、5’-AAAUCAAGGUCAUCACUUGUA-3’(SEQ ID NO:97)、5’-UUCAUCUAGUUCUUGAUCAGU-3’(SEQID NO:98)、5’-UAAGAGUUUCAUCUAGUUCUU-3’(SEQ ID NO:99)、5’-UUCUCUUUAUCUAAAGGUGGG-3’(SEQ ID NO:100)、5’-AUCUAAACAGAAAUCGUGCUG-3’(SEQ ID NO:101)、5’-UAUCUAAACAGAAAUCGUGCU-3’(SEQ ID NO:102)以及5’-AAUGUAGUGGUGUAUUAUCUA-3’(SEQ IDNO:103)。
还在另一方面，提供了编码Tjp抑制剂的核酸，其中该核酸包含选自以下的序列：5’-UGAAACUCCGUUAACCAUUGC-3’(SEQ ID NO:94),5’-AUUGAAACUCCGUUAACCAUU-3’(SEQ IDNO:95)、5’-ACUAUCUUGUGAAAUUUCCUU-3’(SEQ ID NO:96)、5’-AAAUCAAGGUCAUCACUUGUA-3’(SEQ ID NO:97)、5’-UUCAUCUAGUUCUUGAUCAGU-3’(SEQ ID NO:98)、5’-UAAGAGUUUCAUCUAGUUCUU-3’(SEQ ID NO:99)、5’-UUCUCUUUAUCUAAAGGUGGG-3’(SEQ ID NO:100)、5’-AUCUAAACAGAAAUCGUGCUG-3’(SEQ ID NO:101)、5’-UAUCUAAACAGAAAUCGUGCU-3’(SEQ ID NO:102)以及5’-AAUGUAGUGGUGUAUUAUCUA-3’(SEQ ID NO:103)。
另一方面，提供了包含本文定义的Tjp1抑制剂和/或本文定义的核酸的试剂盒。
附图简要说明
参考详细描述，本发明在结合非限制性实例和附图来考虑时会得到更好的理解：
图1显示的一系列实验数据比较了Tjp1条件敲除(cKO)小鼠和对照小鼠肝解剖和功能的影响。图1A是Tjp1(ZO-1)(左)和Tjp2(ZO-2)(左二)、苏木精和伊红(H&E)以及天狼星红(Sirius red)染色的一系列免疫荧光显微(IF)照片。Tjp1 cKO小鼠肝的肝细胞和胆管细胞缺乏Tjp1。在免疫荧光显微镜照片中，细胞核标记有DAPI(左三)，合并图像(右)代表Tjp1(ZO-1)、Tjp2(ZO-2)和DAPI图像的叠加图像。H&E和天狼星红染色分别未显示肝组织学或纤维化的明显变化。图1B显示了4个代表对照小鼠和Tjp1 cKO小鼠肝与体重的比率以及血浆胆汁酸(BA)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平的图形。对照小鼠和Tjp1cKO小鼠的肝与体重的比率以及血浆胆汁酸(BA)、ALT和AST水平相当。图1C显示了Tjp1和Tjp2的免疫荧光染色照片。图1D显示了对照小鼠和Tjp1 cKO小鼠肝细胞中密封蛋白-1(Cldn1)、密封蛋白-2(Cldn2)、密封蛋白-3(Cldn3)、闭合蛋白、扣带蛋白(Cgn)、E-钙黏着蛋白和黏着斑蛋白的蛋白质印迹分析图像。还提供了显示相对蛋白表达的各自图形。图1E显示了Cldn1、Cldn2、Cldn3和扣带蛋白(Cgn)以及癌胚抗原相关细胞黏附分子(Ceacam(癌胚抗原相关细胞粘附分子))的免疫荧光显微照片。图1C-1E显示了在小鼠肝中Tjp1的条件缺失不改变紧密连接成分的表达和定位。蛋白质印迹分析。图1F显示了对照小鼠和Tjp1 cKO小鼠肝组织的电子显微(EM)图像。该图像显示了胆小管和微绒毛附近典型的电子致密紧密连接斑(黑框)。如通过EM所评估，Tjp1的条件缺失对紧密连接形态没有明显影响。图1G是显示对照小鼠、Tjp cKO小鼠和LPS处理的小鼠中4kDa FITC葡聚糖水平的图表。将4kDa FITC葡聚糖注射到尾静脉并评估其向胆汁的转移。Tjp1的缺失不影响胆汁-血液屏障。LPS处理的小鼠用作阳性对照，其中LPS注射损害了胆汁-血液屏障，导致可检测到的FITC葡聚糖泄漏。图1表明，在小鼠肝中Tjp1的条件缺失对肝组织和功能没有明显影响。
图2所示的一系列实验数据表明了对照小鼠和Tjp1条件敲除(cKO)小鼠中硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝损伤的影响。图2A显示了TAA处理的Tjp1 cKO小鼠和野生型(WT)对照小鼠的肝图像。TAA处理的Tjp1 cKO小鼠肝的大体解剖结构保持不变，而WT小鼠的肝则出现了一些损伤迹象，如白色虚线圈出的区域所示。图2B是显示TAA注射后Tjp1 cKO小鼠和对照小鼠存活率的线图。长期接受TAA处理的Tjp1 cKO小鼠的死亡率并没有像在对照中观察的那样增加。图2C是显示Tjp1 cKO小鼠和对照小鼠在TAA处理后6、24和48小时ALT和AST水平的图形。与对照相比，TAA处理的Tjp1 cKO小鼠的血浆ALT和AST水平有所下降，这表明Tjp1的肝缺失减轻肝损伤。图2D是对照和Tjp1cKO肝H&E染色图像汇编。附图中提供了坏死的量化。与对照组相比，Tjp1cKO肝中TAA诱导的肝坏死受到显著抑制。白色箭头表示肝组织中的坏死区域。图2E显示了Tjp1 cKO小鼠和用TAA处理的对照小鼠的H&E染色图像以及血浆ALT和AST水平的图。。如通过生物化学和H&E染色所评估，Tjp1缺失会防止慢性肝损伤。与相应的对照相比，在TAA处理18天的Tjp1 cKO小鼠中，血浆ALT和AST水平以及肝组织学受到的影响显著较小。图2F显示了天狼星红染色的图像和显示对天狼星红阳性面积百分比进行量化的图形。与对照相比，在Tjp1 cKO肝中，施用TAA 18天后，肝纤维化有所减少。图2G所示的一系列柱状图显示了长期TAA处理的Tjp1 cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中通过qRT-PCR监测的纤维化标志物的表达水平。纤维化标志物是αSMA、CK19、胶原蛋白1a1、骨桥蛋白、TIMP1、TGFβ、CTGF、PDGFRβ和PDGFβ，与相应的对照相比，所有标志物在长期TAA处理的Tjp1cKO小鼠肝中的表达水平都较低。图2H显示了CK19染色图像和CK19阳性面积百分比的图形。与相应的对照相比，Tjp1 cKO小鼠肝中长期TAA诱导的CK19染色较低。图2I显示了胱天蛋白酶3染色图像和胱天蛋白酶3阳性面积百分比的图形。阳性胱天蛋白酶3染色代表存在细胞凋亡。与相应的对照相比，长期TAA暴露导致Tjp1 cKO肝中的胱天蛋白酶3阳性细胞较少，表明细胞死亡较少。因此，图2说明，Tjp1失活保护小鼠免受TAA诱导的急性和慢性肝损伤。
图3所示的一系列实验数据说明了对照小鼠和Tjp1条件敲除(cKO)小鼠中3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢三甲吡啶(DDC)饮食诱导的肝损伤的影响。图3A显示了喂食DDC的Tjp1 cKO小鼠和野生型(WT)对照小鼠的肝图像。与喂食DDC 7天的小鼠的对照肝扩大相比，Tjp1 cKO肝表现出正常的尺寸和颜色。图3B所示的线图显示了对Tjp1 cKO小鼠和对照小鼠在具有和不具有DDC饮食诱导损伤的情况下肝和脾重量与体重的量化。在对照小鼠中，DDC饮食诱导肝和脾与体重的比率增加。在Tjp1 cKO动物中，这种肝和脾与体重比率的增加受到抑制或消除。图3C是对照肝和Tjp1 cKO肝的H&E染色图汇编。喂食DDC饮食28天后，在对照小鼠的肝中观察到大量导管反应，而在Tjp1 cKO小鼠中则没有观察到。图3D是显示Tjp1cKO小鼠和对照小鼠在具有和不具有DDC饮食的情况下BA、血浆碱性磷酸酶(AP)、ALT、AST和胆红素水平的图形。Tjp1cKO小鼠的BA、AP、ALT、AST和胆红素水平在具有DDC饮食的情况下保持不变，这表明Tjp1的失活保护肝免受DDC饮食诱导的肝损伤。图3E显示了天狼星红染色的图像和显示对天狼星红阳性面积百分比进行量化的图形。在Tjp1 cKO肝中，与对照相比，天狼星红染色所评估的DDC饮食诱导的肝纤维化有所减少。图3F显示了CK19染色图像和CK19阳性面积百分比的图形。通过胆管细胞标志物CK19染色监测的DDC饮食诱导的导管反应在Tjp1 cKO肝中受到抑制。图3G所示的一系列柱状图显示了在具有或不具有DDC饮食的情况下，Tjp1 cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中通过qRT-PCR监测的纤维化标志物的表达水平。纤维化标志物是αSMA、CK19、上皮细胞黏附分子(EpCam)、胶原蛋白1、TIMP1、TGFβ1、CTGF、PDGFRβ和PDGFβ，与相应的对照相比，所有标志物在喂食DDC的Tjp1 cKO小鼠肝中的表达水平都较低。图3H显示了喂食标准饲料、DDC饮食7天和28天的对照小鼠和Tjp1cKO小鼠肝细胞中αSMA、Smad2、磷酸化SMAD2(pSMAD2)的蛋白质印迹分析图像。GAPDH作为参考对照。图3I显示了从喂食DDC的Tjp1 cKO小鼠和对照小鼠获得的肝样品中αSMA(左)、DAPI(中)和合并(右)的免疫荧光染色照片。图3I显示了从喂食DDC的Tjp1 cKO小鼠和对照小鼠获得的肝样品的层粘连蛋白1-2和胶原蛋白1染色的免疫组织化学图像。图3K所示的一系列柱状图显示了在具有或不具有DDC饮食的情况下，Tjp1 cKO和野生型(WT)对照小鼠肝中通过qRT-PCR监测的巨噬细胞标志物CD11b和F4/80以及关键炎性细胞因子TNFα、白细胞介素6(IL-6)和骨桥蛋白的表达水平。与相应的对照相比，喂食DDC的Tjp1 cKO小鼠肝中巨噬细胞标志物和炎性细胞因子的表达水平较低。图3表明，Tjp1的失活保护小鼠免受DDC饮食诱导的肝损伤。
图4所示的一系列实验数据显示了对照小鼠和Tjp1条件敲除(cKO)小鼠中胆管结扎(BDL)诱导的肝损伤的影响。图4A显示了量化对照小鼠和Tjp1 cKO小鼠中假或BDL处理组肝中Tjp1和Tjp2 mRNA表达水平的柱状图。图4B显示了对照小鼠和Tjp1 cKO小鼠假或BDL处理组肝的免疫组织化学图像。还呈现了显示坏死面积百分比、肝与体重的比率以及ALT和AST的血浆水平的图形。在Tjp1 cKO动物中，通过肝坏死所评估的BDL诱导的肝损伤、肝与体重的比率以及血浆ALT和AST有所减少。图4C显示了天狼星红染色的图像和显示对天狼星红阳性面积百分比进行量化的图形。与对照组比，天狼星红染色所评估的BDL诱导的肝纤维化在Tjp1 cKO肝中有所减少。图4D显示了在具有或不具有BDL的情况下，Tjp1 cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中炎性标志物(胶原蛋白1A、EPCAM、αSMA、MMP9、Timp-1、CTGF和TGFβ)的mRNA表达水平的柱状图。蛋白质印迹中还显示了TIMP的蛋白表达，其中柱状图中显示了相对表达。与相应的对照相比，BDL Tjp1 cKO小鼠肝中炎性标志物的表达水平较低。图4E显示了CK19染色图像、CK19阳性面积百分比的图形以及对CK19 mRNA表达进行量化的另一张图形。通过胆管细胞标志物CK19染色监测的BDL诱导的导管反应在Tjp1 cKO肝中受到抑制。图4F展示了BDL后Tjp1 cKO小鼠中F4/80和CD11b阳性巨噬细胞和中性粒细胞的一系列染色图像和量化，以说明肝免疫细胞浸润减少。另一系列柱状图和蛋白质印迹图像说明了BDL后Tjp1 cKO小鼠中炎性细胞因子(CCL21、C反应蛋白、内皮联蛋白、ICAM-1、IGFBP-1、MMP9、髓过氧化物酶、骨桥蛋白、TNFα、IL-6和IL-11b)的表达水平减少。图4G所示的图形呈现了肝和血浆胆汁酸(BA)、血浆AP和胆红素的表达水平，这表明BDL后Tjp1 cKO小鼠胆汁淤积减少、肝功能改善。图4H显示了BDL后对照小鼠和Tjp1 cKO小鼠中总胆汁和胆汁酸的图形。BDL后Tjp1 cKO小鼠胆汁中胆汁酸浓度较低，这可有助于减轻肝损伤。图4I所示的一系列柱状图展示了参与胆汁酸合成的基因(Cyp7a1、Cyp7b1、Cyp8b1、Cyp27a1、FXR和SHP-1)和胆汁酸转运的基因(NTCP、Oatp1、Oatp2、ABCB11、ABCB4、ABCC2、ABCC3和ABCC4)的表达水平。图4J显示了在具有和不具有BDL的情况下，Tjp1 cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中Cyp3a11、Sult2a1、Ugt1a1、CAR和PXR的mRNA表达水平的柱状图。图4K显示了Ki67和切割的胱天蛋白酶3染色的图像，以及Ki67和切割的胱天蛋白酶3阳性细胞数量的图形。BDL后，Tjp1 cKO小鼠肝中肝细胞增殖增加(通过Ki67染色和量化显示)和细胞凋亡减少(通过胱天蛋白酶3染色和量化显示)，可有助于减少肝损伤。图4表明，Tjp1的失活保护小鼠免受胆管结扎(BDL)诱导的肝损伤。
图5所示的一系列实验数据显示了Yap cKO小鼠条件敲除(cKO)小鼠肝中Tjp1失活的影响。图5A显示了对照和Tjp1基因缺失Yap cKO小鼠肝的免疫组织化学图像。还呈现了显示坏死面积百分比、肝和脾与体重的比率以及血浆胆汁酸和胆红素的图形。在Yap cKO背景下肝特异性Tjp1缺失改善Yap cKO小鼠的肝表型。图5B显示了天狼星红染色的图像和显示对天狼星红阳性面积百分比进行量化的图形。还评估了血浆ALT和AST的表达水平。Tjp1失活肝中血浆ALT和AST减少表明肝损伤的愈合得到改善，天狼星红水平减少表明肝纤维化受到抑制。图5C显示了在具有或不具有Tjp1失活的情况下，Yap cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中纤维化标志物(αSMA、CK19、胶原蛋白1、TIMP1、TGFβ、CTGF、EpCam、PDGFRβ和PDGFβ)的mRNA表达水平的柱状图。图5D是蛋白质印迹图像，显示了在具有或不具有Tjp1失活的情况下，Yap cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中纤维化标志物(αSMA、层粘连蛋白1-2和骨桥蛋白)的蛋白表达水平。GAPDH作为参考对照。图5E显示了在具有或不具有Tjp1失活的情况下，Yap cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中纤维化标志物(αSMA、胶原蛋白1和层粘连蛋白1-2)的免疫组织化学染色图像。图5F是一系列柱状图，说明在具有或不具有Tjp1失活的情况下，Yap cKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中炎性细胞因子(F4/80、CD11b、骨桥蛋白、TNFα、IL-6和IL-1b)的表达水平减少。图5G显示了在具有或不具有Tjp1失活的情况下，YapcKO小鼠和对照野生型(WT)小鼠肝中胆管标志物CK19免疫组织化学染色的图像。在Yap cKO肝中缺失的胆管树在Tjp1 Yap cKO肝中得到了恢复。图5H所示的图形显示了肝和脾与体重的比率，以及血清胆汁酸(BA)、血浆AP ALT、AST和胆红素的水平。Tjp1失活延长进一步使肝和脾与体重的比率正常化，并进一步改善肝功能，如通过血清胆汁酸水平所评估。图5显示，Tjp1的失活改善了Yap cKO小鼠的肝表型。
图6A显示了3个示例性短发夹分子序列。短发夹分子中靶向Tjp1的序列用粗体表示，其余序列是转录shRNA中形成短发夹所必需的。这些短发夹分子是根据转录shRNA在组织培养细胞中沉默Tjp1表达的能力而选择的。短发夹分子被并入肝细胞特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子下游的AAV8载体中，以形成编码Tjp1shRNA的不同AAV8 TBG-shTjp1载体，以便在肝肝细胞中进行选择性表达。图6B显示了小鼠肝样品中Tjp1的免疫荧光染色照片，该小鼠注射了编码Tjp1 shRNAs的不同AAV8 TBG-shTjp1载体。编码乱序(AAV-Scr)的DNA用作阴性对照。包含编码Tjp1 shRNA#21(AAV-Tjp1#21)、Tjp1 shRNA#22(AAV-Tjp1#22)和Tjp1 shRNA#13(AAV-Tjp1#13)的DNA的AAV载体显示Tjp1表达减少。图6C显示了肝样品的天狼星红染色图像和血浆AST和ALT水平的图形。如天狼星红染色所示，在Tjp1f/f Alb-CreERT2小鼠中他莫昔芬诱导型Tjp1缺失(例如Tjp1 icKOHC)和注射AAV-Tjp1#21能够改善肝纤维化。两组小鼠的血浆AST和ALT水平也都有所减少，因此这表明肝损伤可以受到抑制。他莫昔芬诱导的Tjp1缺失和AAV-Tjp1#21介导的Tjp1沉默都特异性地发生在肝细胞中。图6表明，Tjp1失活或沉默改善了Mdr2小鼠模型的肝损伤。
图7显示了肝和肝样品的天狼星红染色的图像。根据小鼠12个月大(P360)时的肝，评估了致癌作用。在ABCB4-/-小鼠的肝上可以看到肿瘤，但在ABCB4-/-Tjp1 cKO小鼠的肝上看不到肿瘤。通过天狼星红染色，评估小鼠6个月大(P180)时肝组织的肝纤维化，由此，在ABCB4-/-Tjp1 cKO小鼠肝中观察到天狼星红染色减少，表明Tjp1失活抑制了肝纤维化。图7表明，在Mdr2(Abcb4)KO小鼠模型中，Tjp1的失活抑制了肝癌发生。
图8A显示了在肝中表达Tjp1短发夹分子的AAV8(2x107)的免疫荧光染色照片。用免疫荧光显微术监测注射了携带乱序(Scr)对照短发夹分子(AAV8 Scr)(上排)或Tjp1短发夹分子(AAV8 Tjp1)(下排)的AAV8的小鼠肝中Tjp1的表达。Tjp2的表达不受短发夹分子的影响。图形显示了从不同组的肝获得的相对Tjp1 mRNA表达和定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。显示了编码shRNA#21(SEQ ID NO:2)的DNA的数据，其他短发夹分子也获得了类似的结果。图8B显示了注射了AAV8 Scr的对照小鼠或Yap cKO小鼠或AAV8 shTjp1小鼠的血液生物化学水平图形。图形显示，与AAV8 Scr小鼠相比，AAV8 shTjp1小鼠的血浆胆汁酸(BA)血浆、碱性磷酸酶(AP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和胆红素水平均有所下降，表明注射了AAV8 shTjp1的小鼠的不同参数均得到改善。图8C是天狼星红和Ck19染色组织的照片，分别用于监测纤维化和胆管系统。AAV8短发夹分子抑制Yap cKO小鼠的纤维化并诱导胆管系统的重整。图形显示了天狼星红和Ck19表达的水平。图8D是天狼星红染色的照片和显示注射了AAV8 Scr或AAV8 shTjp1载体的Mdr2/Abcb4 KO小鼠中AST和ALT血浆水平的图形。图8说明了AAV8介导的肝特异性启动子表达的Tjp1短发夹分子的递送效果，并证明在Yap cKO和Mdr2/Abcb4 KO小鼠模型中，由肝特异性启动子表达Tjp1短发夹分子的AAV8具有肝保护作用。
发明详述
肝是负责包括氨基酸、碳水化合物和脂质代谢、解毒以及胆汁分泌在内的生理功能的代谢枢纽。消化和代谢平衡需要代谢物的肝内循环。胆汁酸(BA)合成发生在肝细胞中，衬有胆管细胞的胆管进行从肝的排出。肝细胞和胆管细胞依靠紧密连接(TJ)建立将胆汁与血液循环分离的血液-胆汁屏障(BBB)。还认为，TJ通过将不同的蛋白质分离到顶端膜和基底外侧膜来强化细胞极性。特异性转运体的极性分布有助于BBB，因为它对定向收集血液中的BA、肝细胞将BA释放到胆汁中或胆管中的胆汁浓度至关重要。
上述任何一种肝功能失调都可能导致多种不同的肝病。肝疾病是全球疾病和死亡的主要原因。肝病最终会导致肝衰竭，肝衰竭是危及生命的疾病状况。尽管可用不同的药物和治疗方法来治疗肝病，但疗效仍然不容乐观。例如，熊去氧胆酸(UDCA)自2016年以来一直是称为原发性胆汁性胆管炎(PBC)的肝病的公认疗法。然而，疗效仍有待商榷，因为它并没有提供对存活率或肝组织学的任何改善。目前，对患有肝病和肝损伤患者的有效医学治疗仍未得到满足。有鉴于此，有必要提供替代方法来治疗受试者的肝病并使受试者的胆管系统再生。
本公开的发明人发现了治疗受试者的肝病的替代方法。因此，在一个方面，本发明提供了治疗受试者的肝病的方法，包括向受试者施用(药学有效量的)Tjp1抑制剂。Tjp1抑制剂的施用抑制Tjp1的表达。在一些实例中，受试者患有肝病或患有肝损伤。在不拘泥于理论的情况下，Tjp1抑制剂减少巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞的募集，还减少炎性细胞因子和趋化因子的水平(图2-4)。这降低了肝病或肝损伤后的炎性反应，并允许肝中发生胆管系统的再生过程(图5)。
本文所用的术语Tjp1(紧密连接蛋白1)和ZO-1(紧密连接-1)互换使用。术语"Tjp1"和"ZO-1"是指与紧密连接相关的肌动蛋白结合支架蛋白，紧密连接对胆汁-血液屏障和人类患者至关重要。Tjp1的示例性核酸序列包括但不限于SEQ ID NO:7、8、10、11、114或115。Tjp1的示例性氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NOs:9或12。
在一个实例中，本文所述的Tjp1抑制剂可抑制Tjp1表达。术语"抑制"在本文中通常用于表示与未处理的受试者或对照相比量降低。然而，为了避免疑问，"抑制"是指Tjp1水平的降低足以使患有肝病的患者得到任何改善。在一个实例中，抑制是指与未治疗的受试者相比，Tjp1表达降低至少10％，或与未治疗的受试者相比Tjp1表达降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或高达并包括100％，或与未治疗的受试者相比，Tjp1表达降低10-100％。本文所用术语"对照"是指在统计学上与被测试的一组群体类似的群体，对其不进行任何改变。本文所用对照的非限制性实例是野生型小鼠(即无Tjp1敲除的小鼠)。
应当理解的是，本领域已知的能够减少或灭活Tjp1表达或活性的任何方法都适用于本文所述的方法。本领域技术人员应当认识到，本文所包括的Tjp1抑制剂类型的列表并非穷举。Tjp1抑制剂类型的实例包括但不限于小分子、抗体、多肽、核酸，例如但不限于DNA、互补DNA、siRNA或shRNA，以及能够抑制Tjp1表达、功能或活性的任何其他生物或化学实体。在一个实例中，Tjp1抑制剂包括但不限于核酸、小分子、抗体、多肽等。本领域技术人员还应当认识到，在一些实例中，可用作Tjp1抑制剂的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在一些实例中，抗体包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在一些实例中，抗体是人类抗体。
正如本领域技术人员应当认识到的那样，可以设计诸如短发夹分子、载体、DNA插入物、shRNA等核酸序列来靶向Tjp1。在一个实例中，用作Tjp1抑制剂的核酸包括但不限于短发夹分子、shRNA、siRNA、反义寡核苷酸(AON)、间隙体(gapmer)、短发夹反义寡核苷酸(shAON)等。本文所用的术语"短发夹分子"是指具有发夹状结构的5'和3'尾的人工核酸序列。短发夹分子可以是DNA序列、RNA序列或其组合。短发夹分子通常包含与靶基因序列或其一部分相同或互补的序列。在一个实例中，短发夹分子可以是插入载体(例如质粒载体或病毒载体)的DNA序列，由此在细胞中产生短发夹RNA。本领域的技术人员应当认识到，短发夹分子会被细胞内的细胞机制转录并加工成可以与靶标的mRNA(例如，可翻译成Tjp1蛋白的mRNA)中的区域结合的分子。这会导致靶mRNA降解，并阻止Tjp1蛋白的产生，从而经由RNA干扰沉默靶基因表达。在另一个实例中，核酸进一步转录成短发夹RNA(shRNA)，并受到加工，从而其与编码Tjp1的mRNA或其同源物结合。在另一个实例中，当核酸用作Tjp1抑制剂时，核酸可以转录成shRNA，该shRNA经加工与编码Tjp1的mRNA结合或相互作用，并与编码Tjp1的mRNA形成shRNA-mRNA复合体。在一个实例中，当用作Tjp1抑制剂的核酸转录成shRNA并经过加工与编码Tjp1的mRNA结合或相互作用并形成核酸-mRNA复合体时，shRNA-mRNA复合体中的mRNA被切割和/或不翻译。
本文所用术语"同源物"是指不同分类群的基因(或结构)之间存在共同的祖先。换句话说，同源是指源自共同的祖先并且最终具有相同或相似的功能(即生物学上等同)的生物结构或序列之间的关系。就序列同源性而言，DNA或蛋白质序列是根据共同祖先来定义的。通常用"序列同源性"来代替术语"序列相似性"，或反之亦然。在一个实例中，这类序列相似性可以包括序列与靶标结合并调节靶标功能的能力，例如但不限于使用短发夹分子、shRNA、siRNA、反义寡核苷酸(AON)、间隙体或短发夹反义寡核苷酸(shAON)结合Tjp1 mRNA并调节其功能。因此，"同源物"是指在物种之间不发生变化或仅表现出极小变化的高度保守序列(保守序列)。
Tjp1抑制剂可以是与Tjp1编码序列完全或部分相同或互补的核酸序列。Tjp1抑制剂也可以是能够抑制Tjp1的核酸序列。在一个实例中，Tjp1抑制剂是与能够抑制Tjp1的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的核酸。在一个实例中，Tjp抑制剂是包含部分Tjp1序列的核酸序列，所述部分Tjp1序列是但不限于5’-CGTGGATTGAACTTACTAAAT-3’(SEQ ID NO:4)、5’-ATTTAGTAAGTTCAATCCACG-3’(SEQ ID NO:91)、5’-CCGCGAAGTTATGAGCAAGTT-3’(SEQ ID NO:5)、5’AACTTGCTCATAACTTCGCGG-3’(SEQ ID NO:92)、5’-CGGCCATTTGAACGCAAATTT-3’(SEQID NO:6)、5’-AAATTTGCGTTCAAATGGCCG-3’(SEQ ID NO:93)、5’-GCAATGGTTAACGGAGTTTCA-3’(SEQ ID NO:104)、5’-AATGGTTAACGGAGTTTCAAT-3’(SEQ ID NO:105)、5’-AAGGAAATTTCACAAGATAGT-3’(SEQ ID NO:106)、5’-TACAAGTGATGACCTTGATTT-3’(SEQ IDNO:107)、5’-ACTGATCAAGAACTAGATGAA-3’(SEQ ID NO:108)、5’-AAGAACTAGATGAAACTCTTA-3’(SEQ ID NO:109)、5’-CCCACCTTTAGATAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:110)、5’-CAGCACGATTTCTGTTTAGAT-3’(SEQ ID NO:111)、5’-AGCACGATTTCTGTTTAGATA-3’(SEQ IDNO:112)或5’-TAGATAATACACCACTACATT-3’(SEQ ID NO:113)。在另一个实例中，Tjp1抑制剂是与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的核酸序列：5’-CGTGGATTGAACTTACTAAAT-3’(SEQ ID NO:4)、5’-ATTTAGTAAGTTCAATCCACG-3’(SEQ ID NO:91)、5’-CCGCGAAGTTATGAGCAAGTT-3’(SEQ ID NO:5)、5’AACTTGCTCATAACTTCGCGG-3’(SEQID NO:92)、5’-CGGCCATTTGAACGCAAATTT-3’(SEQ ID NO:6)、5’-AAATTTGCGTTCAAATGGCCG-3’(SEQ ID NO:93)、5’-GCAATGGTTAACGGAGTTTCA-3’(SEQ ID NO:104)、5’-AATGGTTAACGGAGTTTCAAT-3’(SEQ ID NO:105)、5’-AAGGAAATTTCACAAGATAGT-3’(SEQ IDNO:106)、5’-TACAAGTGATGACCTTGATTT-3’(SEQ ID NO:107)、5’-ACTGATCAAGAACTAGATGAA-3’(SEQ ID NO:108)、5’-AAGAACTAGATGAAACTCTTA-3’(SEQ ID NO:109)、5’-CCCACCTTTAGATAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:110)、5’-CAGCACGATTTCTGTTTAGAT-3’(SEQ IDNO:111)、5’-AGCACGATTTCTGTTTAGATA-3’(SEQ ID NO:112)或5’-TAGATAATACACCACTACATT-3’(SEQ ID NO:113)。
在另一个实例中，Tjp1抑制剂是不限于以下的核酸：i)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:4的3’端与SEQ ID NO:91的5’端，并且其中SEQ ID NO:91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:5的3’端与SEQ ID NO:92的5’端，并且其中SEQID NO:92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；或iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQ ID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。在另一个实例中，Tjp1抑制剂是与i)、ii)或iii)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的核酸：i)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:4的3’端与SEQID NO:91的5’端，并且其中SEQ ID NO:91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:5的3’端与SEQ ID NO:92的5’端，并且其中SEQ ID NO:92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；或iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQ ID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。在另一个实例中，SEQ ID NOs 4、5或6的5’端侧翼是包含3-8个核苷酸、4-6个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的核苷酸序列；4-15个核苷酸、8-13个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的核苷酸序列分别连接SEQ ID NO:4、5或6的3’端与SEQ ID NO:91、92或93的5’端；并且SEQ ID NO:91、92或93的3’端侧翼是包含3-8个核苷酸、4-6个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的核苷酸序列。还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是不限于i)、ii)或iii)的核酸：i)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含4个核苷酸的核苷酸序列，其中6个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:4的3’端与SEQ ID NO:91的5’端，并且其中SEQ ID NO:91的3’端侧翼是包含6个核苷酸的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含4个核苷酸的核苷酸序列，其中6个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:5的3’端与SEQ ID NO:92的5’端，并且其中SEQ ID NO:92的3’端侧翼是包含6个核苷酸的核苷酸序列；或iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含4个核苷酸的核苷酸序列，其中6个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含6个核苷酸的核苷酸序列。
还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是不限于 或/> 的核酸。可以看出，SEQ ID NOs:1-3中的粗体残基与SEQID NOs:4-6和91-93中的序列相同。SEQ ID NOs:4-6对应于Tjp1编码序列，SEQ ID NOs:91-93对应于互补序列，其中互补序列负责与Tjp1mRNA结合，从而抑制Tjp1。SEQ ID NOs:1-3的剩余序列是在短发夹分子中形成短发夹所需的，并且可以是能够形成短发夹分子的任何序列。还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸：/> 或/> 还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是短发夹分子，所述短发夹分子包含为下述序列但不限于下述序列的序列：/> 或/> 还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的短发夹分子：/> 或/>
还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是siRNA，所述siRNA包含为下述序列但不限于下述序列的序列：5’-UGAAACUCCGUUAACCAUUGC-3’(SEQ ID NO:94)、5’-AUUGAAACUCCGUUAACCAUU-3’(SEQ ID NO:95)、5’-ACUAUCUUGUGAAAUUUCCUU-3’(SEQ ID NO:96)、5’-AAAUCAAGGUCAUCACUUGUA-3’(SEQ ID NO:97)、5’-UUCAUCUAGUUCUUGAUCAGU-3’(SEQID NO:98)、5’-UAAGAGUUUCAUCUAGUUCUU-3’(SEQ ID NO:99)、5’-UUCUCUUUAUCUAAAGGUGGG-3’(SEQ ID NO:100)、5’-AUCUAAACAGAAAUCGUGCUG-3’(SEQ ID NO:101)、5’-UAUCUAAACAGAAAUCGUGCU-3’(SEQ ID NO:102)或5’-AAUGUAGUGGUGUAUUAUCUA-3’(SEQ IDNO:103)。还在另一个实例中，Tjp1抑制剂是与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸：5’-UGAAACUCCGUUAACCAUUGC-3’(SEQ ID NO:94),5’-AUUGAAACUCCGUUAACCAUU-3’(SEQ ID NO:95)、5’-ACUAUCUUGUGAAAUUUCCUU-3’(SEQ ID NO:96)、5’-AAAUCAAGGUCAUCACUUGUA-3’(SEQ ID NO:97)、5’-UUCAUCUAGUUCUUGAUCAGU-3’(SEQ ID NO:98)、5’-UAAGAGUUUCAUCUAGUUCUU-3’(SEQID NO:99)、5’-UUCUCUUUAUCUAAAGGUGGG-3’(SEQ ID NO:100)、5’-AUCUAAACAGAAAUCGUGCUG-3’(SEQ ID NO:101)、5’-UAUCUAAACAGAAAUCGUGCU-3’(SEQ IDNO:102)或5’-AAUGUAGUGGUGUAUUAUCUA-3’(SEQ ID NO:103)。
本发明还提供了编码Tjp1抑制剂的核酸，其中该核酸与能够抑制Tjp1的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在另一个实例中，核酸包含部分Tjp1序列，所述部分Tjp1序列是，但不限于：5’-CGTGGATTGAACTTACTAAAT-3’(SEQ ID NO:4)、5’-ATTTAGTAAGTTCAATCCACG-3’(SEQ ID NO:91)、5’CCGCGAAGTTATGAGCAAGTT-3’(SEQ ID NO:5)、5’-AACTTGCTCATAACTTCGCGG-3’(SEQID NO:92)、5’-CGGCCATTTGAACGCAAATTT-3’(SEQ ID NO:6)、5’-AAATTTGCGTTCAAATGGCCG-3’(SEQ ID NO:93)、5’-GCAATGGTTAACGGAGTTTCA-3’(SEQ ID NO:104)、5’-AATGGTTAACGGAGTTTCAAT-3’(SEQ ID NO:105)、5’-AAGGAAATTTCACAAGATAGT-3’(SEQ IDNO:106)、5’-TACAAGTGATGACCTTGATTT-3’(SEQ ID NO:107)、5’-ACTGATCAAGAACTAGATGAA-3’(SEQ ID NO:108)、5’-AAGAACTAGATGAAACTCTTA-3’(SEQ ID NO:109)、5’-CCCACCTTTAGATAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:110)、5’-CAGCACGATTTCTGTTTAGAT-3’(SEQ IDNO:111)、5’-AGCACGATTTCTGTTTAGATA-3’(SEQ ID NO:112)或5’-TAGATAATACACCACTACATT-3’(SEQ ID NO:113)。
在另一个实例中，该核酸与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性：5’-CGTGGATTGAACTTACTAAAT-3’(SEQ ID NO:4)、5’-ATTTAGTAAGTTCAATCCACG-3’(SEQ ID NO:91)、5’-CCGCGAAGTTATGAGCAAGTT-3’(SEQ ID NO:5)、5’-AACTTGCTCATAACTTCGCGG-3’(SEQID NO:92)、5’-CGGCCATTTGAACGCAAATTT-3’(SEQ ID NO:6)、5’-AAATTTGCGTTCAAATGGCCG-3’(SEQ ID NO:93)、5’-GCAATGGTTAACGGAGTTTCA-3’(SEQ ID NO:104)、5’-AATGGTTAACGGAGTTTCAAT-3’(SEQ ID NO:105)、5’-AAGGAAATTTCACAAGATAGT-3’(SEQ IDNO:106)、5’-TACAAGTGATGACCTTGATTT-3’(SEQ ID NO:107)、5’-ACTGATCAAGAACTAGATGAA-3’(SEQ ID NO:108)、5’-AAGAACTAGATGAAACTCTTA-3’(SEQ ID NO:109)、5’-CCCACCTTTAGATAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO:110)、5’-CAGCACGATTTCTGTTTAGAT-3’(SEQ IDNO:111)、5’-AGCACGATTTCTGTTTAGATA-3’(SEQ ID NO:112)或5’-TAGATAATACACCACTACATT-3’(SEQ ID NO:113)。
在另一个实例中，编码Tjp1抑制剂的核酸是，但不限于：i)SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:4的3’端与SEQ ID NO:91的5’端，并且其中SEQ IDNO:91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:5的3’端与SEQ ID NO:92的5’端，并且其中SEQ ID NO:92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；或iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQ ID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。在另一个实例中，编码Tjp1抑制剂的核酸与i)、ii)或iii)具有但不限于至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性：i)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ IDNO:4的3’端与SEQ ID NO:91的5’端，并且其中SEQ ID NO:91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:5的3’端与SEQ ID NO:92的5’端，并且其中SEQ ID NO:92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；或iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQ ID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。在另一个实例中，SEQ ID NOs 4、5或6的5’端侧翼是包含3-8个核苷酸、4-6个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的核苷酸序列；4-15个核苷酸、8-13个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的核苷酸序列分别连接SEQ IDNO:4、5或6的3’端与SEQ ID NO:91、92或93的5’端；并且SEQ ID NO:91、92或93的3’端侧翼是包含3-8个核苷酸、4-6个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的核苷酸序列。还在另一个实例中，编码Tjp1抑制剂的核酸是但不限于：i)SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:91的组合，其中SEQ ID NO:4的5’端侧翼是包含4个核苷酸的核苷酸序列，其中6个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:4的3’端与SEQ ID NO:91的5’端，并且其中SEQ ID NO:91的3’端侧翼是包含6个核苷酸的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:92的组合，其中SEQ ID NO:5的5’端侧翼是包含4个核苷酸的核苷酸序列，其中6个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ IDNO:5的3’端与SEQ ID NO:92的5’端，并且其中SEQ ID NO:92的3’端侧翼是包含6个核苷酸的核苷酸序列；或iii)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:93的组合，其中SEQ ID NO:6的5’端侧翼是包含4个核苷酸的核苷酸序列，其中6个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO:6的3’端与SEQ ID NO:93的5’端，并且其中SEQ ID NO:93的3’端侧翼是包含6个核苷酸的核苷酸序列。
还在另一个实例中，该核酸包含为下述序列但不限于下述序列的序列： />或/> 还在另一个实例中，该核酸包含与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：/> 或/>
编码Tjp1抑制剂的核酸也可以是siRNA。在一个实例中，编码Tjp1抑制剂的核酸包含为下述序列但不限于下述序列的序列：5’-UGAAACUCCGUUAACCAUUGC-3’(SEQ ID NO:94)、5’-AUUGAAACUCCGUUAACCAUU-3’(SEQ ID NO:95)、5’-ACUAUCUUGUGAAAUUUCCUU-3’(SEQ IDNO:96)、5’-AAAUCAAGGUCAUCACUUGUA-3’(SEQ ID NO:97)、5’-UUCAUCUAGUUCUUGAUCAGU-3’(SEQ ID NO:98)、5’-UAAGAGUUUCAUCUAGUUCUU-3’(SEQ ID NO:99)、5’-UUCUCUUUAUCUAAAGGUGGG-3’(SEQ ID NO:100)、5’-AUCUAAACAGAAAUCGUGCUG-3’(SEQ IDNO:101)、5’-UAUCUAAACAGAAAUCGUGCU-3’(SEQ ID NO:102)和5’-AAUGUAGUGGUGUAUUAUCUA-3’(SEQ ID NO:103)。
在一个实例中，编码Tjp1抑制剂的核酸与为下述序列但不限于下述序列的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：5’-UGAAACUCCGUUAACCAUUGC-3’(SEQ ID NO:94)、5’-AUUGAAACUCCGUUAACCAUU-3’(SEQ ID NO:95)、5’-ACUAUCUUGUGAAAUUUCCUU-3’(SEQ ID NO:96)、5’-AAAUCAAGGUCAUCACUUGUA-3’(SEQ ID NO:97)、5’-UUCAUCUAGUUCUUGAUCAGU-3’(SEQ ID NO:98)、5’-UAAGAGUUUCAUCUAGUUCUU-3’(SEQID NO:99)、5’-UUCUCUUUAUCUAAAGGUGGG-3’(SEQ ID NO:100)、5’-AUCUAAACAGAAAUCGUGCUG-3’(SEQ ID NO:101)、5’-UAUCUAAACAGAAAUCGUGCU-3’(SEQ IDNO:102)和5’-AAUGUAGUGGUGUAUUAUCUA-3’(SEQ ID NO:103)。
本文公开的一些核酸序列是DNA序列(例如SEQ ID NOs:1-6、91-93或104-113中的任意一个，或其组合)。在一个实例中，SEQ ID NOs:1-6、91-93或104-113中任一个所公开的核酸序列中只有一个可以插入单个载体中。在另一个实例中，SEQ ID NOs:1-6、91-93或104-113中任一个所公开的核酸序列中有一个以上可以插入单个载体中，从而单个载体会表达一个以上短发夹分子。在不希望受理论约束的情况下，多个短发夹分子的组合可以增加短发夹分子对Tjp1表达或活性的抑制作用。
本文公开的其他核酸序列是RNA序列，例如siRNA序列(例如SEQ ID NOs:94-103中的任一个或其组合)。在不希望受理论约束的情况下，siRNAs的组合可以增加siRNAs对Tjp1表达或活性的抑制作用。
可以使用本领域已知的任何递送系统施用Tjp1抑制剂。Tjp1抑制剂的递送方法包括但不限于使用病毒介导的递送系统的递送方法。本领域技术人员应当认识到，本文列出的经由病毒介导的递送系统施用Tjp1抑制剂的病毒列表并非穷举。此类病毒的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等。在一个实例中，其中当Tjp1抑制剂的递送系统是病毒介导的递送系统时，病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等。在一个实例中，其中当Tjp1抑制剂的递送系统是病毒介导的递送系统时，病毒是腺相关病毒(AAV)。可以用于递送Tjp1抑制剂的腺相关病毒有多种血清型。在一个实例中，用于递送Tjp1抑制剂的腺相关病毒包括但不限于AAV血清型1、AAV血清型2、AAV血清型3、AAV血清型4、AAV血清型5、AAV血清型6、AAV血清型7、AAV血清型8、AAV血清型9、AAV血清型10、AAV血清型11等。在一个实例中，用于递送Tjp1抑制剂的腺相关病毒是AAV血清型8。
在一个实例中，其中当Tjp1抑制剂的递送系统是病毒介导的递送系统时，Tjp1抑制剂包含约1x107-1x1016AAV，或约1x107-1x109AAV、约1x109-1x1011AAV、约1x1011-1x1013AAV、约1x1013-1x1015AAV、约1x1014-1x1016AAV，或约1x107AAV、约2x107AAV、约3x107AAV、约4x107AAV、约5x107AAV、约6x107AAV、约7x107AAV、约8x107AAV、约9x107AAV、约1x108AAV、约2x108AAV、约3x108AAV、约4x108AAV、约5x108AAV、约6x108AAV、约7x108AAV、约8x108AAV、约9x108AAV、约1x109AAV、约2x109AAV、约3x109AAV、约4x109AAV、约5x109AAV、约6x109AAV、约7x109AAV、约8x109AAV、约9x109AAV、约1x1010AAV、约2x1010AAV、约3x1010AAV、约4x1010AAV、约5x1010AAV、约6x1010AAV、约7x1010AAV、约8x1010AAV、约9x1010AAV、约1x1011AAV、约2x1011AAV、约3x1011AAV、约4x1011AAV、约5x1011AAV、约6x1011AAV、约7x1011AAV、约8x1011AAV、约9x1011AAV、约1x1012AAV、约2x1012AAV、约3x1012AAV、约4x1012AAV、约5x1012AAV、约6x1012AAV、约7x1012AAV、约8x1012AAV、约9x1012AAV、约1x1013AAV、约2x1013AAV、约3x1013AAV、约4x1013AAV、约5x1013AAV、约6x1013AAV、约7x1013AAV、约8x1013AAV、约9x1013AAV、约1x1014AAV、约2x1014AAV、约3x1014AAV、约4x1014AAV、约5x1014AAV、约6x1014AAV、约7x1014AAV、约8x1014AAV、约9x1014AAV、约1x1015AAV、约2x1015AAV、约3x1015AAV、约4x1015AAV、约5x1015AAV、约6x1015AAV、约7x1015AAV、约8x1015AAV、约9x1015AAV或约1x1016AAV。
在另一个实例中，本文所公开的核酸序列(例如SEQ ID NOs:1-6或91-113中的任一个)的全部或片段可以作为单链核酸(例如siRNA、反义寡核苷酸等)单独或以其组合或作为DNA递送。这些核酸可以是DNA(包含胸苷)或RNA(包含尿嘧啶)，甚至含有能与靶标结合的非天然核苷酸。这些核苷酸还可以包含额外的修饰，以增强其稳定性。它们还可以偶联于例如核酸的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合递送系统。
本发明提供了用于治疗的Tjp1抑制剂。在另一个实例中，本发明提供了用于治疗肝病的Tjp1抑制剂。还在另一个实例中，本发明提供了Tjp1抑制剂在制造用于治疗肝病的药物中的用途。本文所用术语"肝病"是指肝结构和/或功能异常。疾病或失调的表述可以互换使用。肝中的任何结构都可能出现异常，包括但不限于肝细胞等细胞、肝中的血管或胆管。这些异常可能自发发生，也可能由非肝细胞诱发，例如但不限于免疫细胞浸润介导的炎症，或由毒素、化学品或药物诱发。肝构成胆管系统的一部分，其中肝、胆管和胆囊共同合作，产生、储存、分泌和运输胆汁。由于胆管系统中器官的密切关系，应当认识到，胆管系统的任何异常都可能导致肝失调。肝病的实例包括但不限于胆汁淤积、肝癌、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、胆汁淤积性肝病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、肝纤维化、肝硬化、胆汁淤积相关进行性胆管损伤、囊性纤维化相关肝病、硫代乙酰胺(TAA)相关肝病、3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢三甲吡啶(DDC)相关肝病、胆管结扎肝损伤、Yes相关蛋白(YAP)相关肝病(Yes-associated Protein(YAP)-related liver disease)、Mdr2相关肝病、与接触影响胆固醇/胆汁酸(BA)生物合成和/或代谢的药物相关的疾病、与影响胆固醇/胆汁酸(BA)生物合成和/或代谢的基因突变相关的疾病或与胆汁血液屏障完整性受损相关的疾病。
本文中所用术语"胆汁淤积"和"胆汁淤积性肝病"是指由于肝细胞分泌受损、胆汁流经肝内或肝外胆管受阻或由于其他肝病或损伤导致肝受损(肝细胞或胆管上皮细胞受损)而导致从肝流向胆囊的胆汁降低。已经证明，许多肝病最终导致胆汁淤积。这导致胆盐潴留在肝中，而在正常情况下，胆盐会分泌到胆汁中。胆汁淤积的实例包括但不限于肝内胆汁淤积、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、妊娠相关肝内胆汁淤积、新生儿胆汁淤积、进行性家族性肝内胆汁淤积3型、胆汁淤积性纤维化或胆道闭锁。肝内胆汁淤积的病因包括免疫介导的疾病状况，例如但不限于原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、妊娠期肝内胆汁淤积、进行性家族性肝内胆汁淤积3型和囊性纤维化相关性肝病、接触影响胆固醇/胆汁酸(BA)生物合成和/或代谢或胆汁血液屏障完整性的药物(类固醇、非类固醇抗炎药、抗生素、抗糖尿病药)和基因突变(包括TJP2失活或Δ4-3-氧甾体5β还原酶缺乏症)。胆汁淤积会引起进行性胆管损伤，导致有毒的疏水胆汁酸进一步潴留。这会对胆管造成持续、广泛的损伤，并最终导致肝损伤。
一些肝疾病会导致炎性过程的激活，例如但不限于免疫细胞浸润、炎性细胞因子和/或趋化因子的表达增加。长期的炎性反应会导致肝纤维化，进而导致肝硬化。肝疾病还会导致肝细胞坏死。抑制Tjp1能够减少这些影响的发作和发展。例如，抑制Tjp1能够减少肝中的TAA诱导的肝坏死水平(图2D)、肝纤维化水平(图2F-2G、3E、4C、5B)以及炎症和免疫细胞浸润水平(图3K、4D)。
如缺乏Tjp1的Mdr2 KO小鼠肝纤维化水平减少(图7)表明，Tjp1抑制还在肝癌中提供保护作用。肝癌可发生在因遗传缺陷、酗酒或慢性感染乙型肝炎和丙型肝炎等疾病感染而受损的肝中。慢性胆汁淤积、肝纤维化和炎症已知也使受试者易患肝癌。在一个实例中，肝癌可以是但不限于肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤或转移性肝癌。
这种伴随的Tjp1失活导致胆管系统再生(图5G)。因此，在另一方面，本发明提供了使受试者的胆管系统再生的方法，其中该方法包括向受试者施用药学有效量的Tjp1抑制剂。本文所用术语"胆管系统"、"胆管"和"胆管树"是指发挥产生、储存、分泌和运输胆汁功能的管道和器官。胆管系统的器官包括但不限于肝、胆管(肝内和/或肝外)和胆囊。胆管系统是肝的一部分，因此任何胆管疾病也都会被认为是肝病。在另一个实例中，本发明提供了用于使胆管系统再生的Tjp1抑制剂。还在另一个实例中，本发明提供了Tjp1抑制剂在制造用于使胆管系统再生的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述Tjp1抑制剂和/或本文所述核酸的试剂盒。在一个实例中，本发明提供了包含本文所述Tjp1抑制剂的药物组合物。还在另一个实例中，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载液(vehicle)或载体。因此，在一个实例中，包含本文所公开的Tjp1抑制剂的药物组合物还可以包含选自但不限于药学上可接受的载体、脂质体载体、赋形剂、佐剂或其组合的化合物。
本申请所用的单数形式"一个/一种(a)"、"一个/一种(an)"和"该/所述(the)"包括复数，除非上下文另有明确规定。例如，术语"遗传标记"包括多种遗传标记，包括其混合物和组合。
本文所用术语"增加"和"降低"是指与整个种群中存在的相同性状或特征相比，所选性状或特征在种群子集中的相对改变。因此，"增加"表示正向变化，而"降低"表示负向变化。本文所用"变化"还表示孤立种群子集的所选性状或特征与整个种群的相同性状或特征相比的差异。然而，该术语并不对所看到的差异进行评估。
本文所用术语"约"，在涉及物质浓度、物质尺寸、时间长度或其他规定值时，是指规定值的+/-5％，或规定值的+/-4％，或规定值的+/-3％，或规定值的+/-2％，或规定值的+/-1％，或规定值的+/-0.5％。
在整个本公开中，可能以范围格式公开了某些实施方案。应当理解的是，以范围格式进行的描述只是为了方便和简洁，不应被理解为对所披露范围的僵化限制。因此，对某一范围的描述应视为已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及单个数值。例如，对1-6等范围的描述应视为已具体公开了该范围内1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围以及各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围有多大，这都适用。
本文说明性地描述的本发明可以在没有本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语"包括/包含(comprising)"、"包括(including)"、"含有(containing)"等应作广义理解，而无限制。此外，本文所用的术语和表述是作为描述而非限制的术语来使用的，在使用这些术语和表达方式时无意排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但应当认识到，在请求保护的发明范围内各种修改是可能的。因此，应当理解的是，尽管已通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可以求助于对此处公开的本发明所体现的发明进行修改和改变，并且这种修改和改变视为落入本发明的范围内。
本文对本发明进行了广义和上位描述。落入上位公开范围内的每一个较窄的种类和亚上位组群也构成本发明的一部分。这包括对本发明的上位描述，其中附带条件或否定性限制删除了上位概念中的任何主题，无论本文是否明确叙述该删除的材料。
其他实施方案落入以下权利要求和非限制性实施例的范围内。此外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员应当认识到，由此也以马库什组的任何个体成员或成员子组的形式描述了本发明。
实验部分
材料和方法
小鼠疾病模型
为了表征Tjp1/ZO-1在肝中的作用，在不同的小鼠模型中以肝特异性方式使Tjp1失活。在肝发育早期，利用白蛋白(Alb)-Cre驱动系在Tjp1条件敲除(cKO)小鼠的肝细胞和胆管细胞中实现Tjp1缺失。Alb-CreERT2或Sox9-CreERT2品系用于实现他莫昔芬诱导型Tjp1条件敲除(Tjp1 icKO)。可以将这种诱导型Tjp1条件敲除系统专门应用于肝细胞或胆管细胞，以获得具有诱导型Tjp1条件敲除肝细胞(Tjp1 icKOHC小鼠)或胆管细胞(Tjp1icKOCC小鼠)的小鼠。
实验检测
建立了不同的检测，包括监测肝功能和组织学的血浆和肝生物化学检测，以及评估组织变化和纤维化的免疫组织化学检测。不同标志物的免疫染色用于评估细胞水平的变化。体内EM和示踪剂渗透性检测用于评估紧密连接屏障。为了评估Tjp1的缺失是否对疾病易感性产生影响，建立了几种肝病模型，包括喂食补充了硫代乙酰胺(TAA)、3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢三甲吡啶(DDC)的饮食、胆管结扎(BDL)或与Mdr2 KO和Yap cKO小鼠等其他肝病模型交叉。
利用肝损伤和肝功能的标准生物化学检测(例如血液AST、ALT和胆红素水平、血液和肝胆汁酸(BA)水平)来评估胆管细胞和/或肝细胞中缺乏Tjp1/ZO-1的影响。组织学、免疫组织化学、免疫荧光显微术和蛋白质印迹分析用于鉴别肝细胞和胆管细胞，评估肝纤维化(天狼星红、胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白)，监测目的肝细胞和胆管细胞标志物的表达水平和定位，以及评估免疫细胞浸润。进行定量RT-PCR以测定肝解毒酶和胆汁酸转运体表达响应Tjp1失活的变化。
小鼠品系、基因分型
在SPF条件下，动物实验获得了相关IACUC的批准(协议号#171211和#201558)。通过使C57BL/6Tac Tjp1F/F小鼠与Alb-Cre小鼠杂交，使Tjp1失活，用于在肝细胞和胆管细胞中进行组成性缺失(Tjp1 cKO)。用于谱系追踪的Alb-Cre和Rosa26:LacZ(Rosa26:Lox-STOP-Lox-LacZ)报道品系(B6；129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J)32均来自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。将小鼠回交至Tjp1F/F背景。对于基因分型，使用引物-1(5’-CTTCTC TGA CCC TAC ACA GCT ACC-3’)(SEQ ID NO:13)和引物-2(5’-ATC GTG TGG GAA AGACAA GC-3’)(SEQ ID NO:14)扩增从尾巴剪切分离的基因组DNA，产生279bp(野生型等位基因)或471bp(条件突变等位基因)的片段。C57BL/6Tac Tjp1F/F同窝出生仔作为对照。使Tjp1F/F和Alb-Cre小鼠与YapF/F小鼠23杂交，以生成Tjp1 Yap条件敲除(cKO)小鼠。使用雄性动物，但雌性小鼠表现出可比较的结果。对于基因分型，使用Yap特异性引物1(5’-CCA TTTGTC CTC ATC TCT TAC TAA C-3’)(SEQ ID NO:15)和引物2(5’-GAT TGG GCA CTG TCA ATTAAT GGG CTT-3’)(SEQ ID NO:16)扩增从尾巴剪切分离的基因组DNA，产生498bps(野生型)或597bps(条件突变等位基因)片段。使Abcb4/Mdr2(FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J)(杰克逊实验室)与Tjp1F/F动物杂家，以使Tjp1缺失。
硫代乙酰胺(TAA)处理
将硫代乙酰胺(TAA)(目录号#163678,Sigma)溶于PBS中，以200mg/kg腹腔内注射到小鼠中。对于急性肝损伤，给小鼠注射TAA，并在6、24和48小时后收集肝样品。对于慢性肝损伤，每两天给小鼠注射一次TAA，每周3次，连续6周。第18次注射后，收集肝样品进行分析。
DDC饮食
给小鼠喂食28天补充了0.1％3,5-二氧基羰基-1,4-二氢碰撞碱(DDC:Cat#D80002,Sigma)的杂食饮食。当用他莫昔芬处理时，在最后一次他莫昔芬剂量一周后，给小鼠提供DDC饮食。
胆管结扎
对8-10周大的小鼠进行麻醉，然后结扎其胆总管。将胆总管结扎的小鼠饲养7天，然后处死，并收集肝样品进行分析。为确保结扎严密，只使用胆囊中胆汁超过100μl的小鼠。
肝屏障功能评估
将FITC-Dextran 4kDa(MW 4000,Sigma-Aldrich)溶于PBS(25mg/ml)中。小鼠经尾静脉注射接受100μl的示踪剂溶液，8分钟后处死。从胆囊收集胆汁，并在读板仪(Tecan)中测量FITC荧光。为了破坏肝紧密连接(TJ)，在注射示踪剂前16小时，将LPS(2mg/kg)注射到对照小鼠中。图例给出了分析的每组小鼠的数量，在2-3次不同的独立实验运行中进行样品。
血清和组织生物化学分析
使用试剂盒测定胆红素、血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AP)和天冬氨酸转氨酶(AST)(Teco Diagnostics)或血浆总BA(Diazyme Laboratories)水平。对于肝BA水平，在液氮中研磨100mg肝组织，悬浮于1mL水中，超声处理，离心，并测定上清液中的BA水平。所分析的每组小鼠的数量在各自图例中给出，在2或3次不同的独立实验运行中分析样品。
电子显微术
小鼠肝经下腔静脉灌注2.5％戊二醛固定液，切成小块，并固定24小时。样品用PBS冲洗、后固定(1％四氧化锇，1h)、冲洗、在乙醇中脱水并包埋在树脂中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片进行染色，并用透射EM(JEM-1010)观察。为了进行形态测定分析，测量了紧密连接(TJ)斑的长度和宽度。对于宽度，沿TJ斑在五个不同位置测量两个接壤细胞之间的距离，平均值用作该特定TJ的宽度。对突入小管内的微绒毛进行计数，并归一化为周长单位。为了考虑由于在组织中的定位导致的可能差异，对肝叶边缘和中心的区块(每只动物4个区块)进行切片。由于测量结果也会受到切片平面的影响，因此从不同角度对每个区块进行切片，以归一化这些差异。
组织学
将新鲜切开的肝在4％多聚甲醛中固定过夜，处理，并包埋在石蜡中。5μm切片用H&E或天狼星红染色，并用Zeiss Axio显微镜上的Zeisscam相机成像。分析每组五只小鼠和每只小鼠至少两张切片的图像，并用于量化。
免疫组织化学
以5μm厚度，对石蜡块进行切片。对于免疫组织化学，将载玻片在2100Retriever(Pick Cell Laboratories)中蒸煮20min，以回收抗原。然后用针对切割的胱天蛋白酶3(兔，目录号#9661，Cell Signaling)、层粘连蛋白1-2(兔；目录号#ab11575，Abcam)、胶原蛋白(兔；目录号#NB600-408,NOVUSBiologicals)、F4/80(大鼠；目录号#600-404,NOVUSBiologicals)、CD11b(大鼠；目录号
#ab8878,Abcam)、Ki67(兔；目录号#9129Cell Signaling)、Ck19(大鼠；TromaIII,DSHB,1:20稀释)的一抗和兼容性生物素缀合二抗(Invitrogen)，对载玻片进行染色。
免疫荧光显微术
使石蜡切片脱蜡，通过蒸煮20min(2100Retriever；Pick Cell Laboratories)回收抗原。将冷冻组织包埋在OCT中，并用针对ZO-1(大鼠；目录号#R26.4CDSHB)、密封蛋白-1(兔；目录号#71-7800Invitrogen)、密封蛋白-2(兔；目录号#32-5600Invitrogen)、密封蛋白-3(兔；目录号#34-1700Invitrogen)、扣带蛋白(兔；目录号#36-4401Invitrogen)、CK19(大鼠；目录号#TromaIIIDSHB)、DPPIV(山羊；目录号#AF954 R&D)的一抗和荧光标记的兼容性二抗(Invitrogen,1:200稀释)，对5μm切片进行染色。用DAPI标记细胞核。使用ZeissLSM800共聚焦显微镜获得图像。对每组3只小鼠和每只小鼠至少5个切片进行量化分析。
Edu标记
将5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)溶于DMSO(1mg/10μl)中，并进一步在PBS(1mg/100μl)中稀释。处死小鼠前1小时腹腔内注射该溶液(每克体重1mg)。使用Zeiss LSM800共聚焦显微镜和Zen v3.4(蓝色版)软件从至少3只独立小鼠中采集图像。
LacZ染色
在最后一次注射他莫昔芬七天后切开肝，在最佳切割温度化合物(OCT)中冷冻，切下10μm厚的切片，并封固在载玻片上。在福尔马林中固定10分钟后，按照制造商的方案进行LacZ染色(NovaUltra试剂盒)。用Nuclear Faster Red将切片复染色3-5分钟。对每组3只小鼠和每只小鼠至少5个切片进行分析。
蛋白质印迹
将新鲜肝样品冷冻在液氮中，碾成粉末，并在冰上在裂解缓冲液(50-mM Tris-HCl,pH7.5,100mM NaCl,1mM MgCl2,以及0.5％Triton X-100，补充了蛋白酶抑制剂混合物和每10ml一片PhosSTOP[目录号#04 906 837 01,Roche])中裂解15min。对裂解液进行超声处理，然后在4℃下离心(13,000×g，15min)。收集上清液，等量蛋白质通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分馏并使用针对以下的抗体进行蛋白质印迹：密封蛋白-1(兔；目录号#ab15098,Abcam)、密封蛋白-2(兔；目录号#32-5600Invitrogen)、密封蛋白-3(兔；目录号#34-1700,Invitrogen)、闭合蛋白(兔；目录号#71-1500,Invitrogen)、扣带蛋白(兔；目录号#36-4401Invitrogen)、E-钙黏着蛋白(小鼠；目录号#610181,BD Biosciences)、Smad2(兔；目录号#5339,Cell Signaling)、Phospho-Smad2(兔；目录号#3108,Cell Signaling)、层粘连蛋白1-2(兔；目录号#ab11575,Abcam)、αSMA(兔；目录号#ab5694,Abcam)、Timp-1(兔；目录号#ab211926,Abcam)、ICAM-1(小鼠；目录号#MA5406,ThermoFisher)、骨桥蛋白(小鼠；目录号#MA5-17180)、黏着斑蛋白(小鼠；目录号#V9131,Sigma)或GAPDH(小鼠；目录号#sc-47724,Santa Cruz)。黏着斑蛋白或GAPDH作为加样对照。一抗和二抗分别稀释1:1000和1:3000。使用ImageJ v15.3，对每组至少3只独立小鼠的样品进行分析。
mRNA提取和实时PCR
从全肝提取总信使RNA(mRNA)，并使用QuantStudioTM 3Real-TimePCR System(Applied Biosystems)和特异性引物(SEQ ID NOs:17-90)进行定量反转录聚合酶链反应处理。将mRNA表达水平归一化为GAPDH。从每组至少3只小鼠中分离样品，汇集，并一式三份运行。每个这样的实验独立重复三次，然后合并所有数据，用于分析。
具有编码介导基因沉默的Tjp1 shRNA的DNA的AAV8载体
生成了编码shTjp1 shRNAs的3种不同DNA(5’-CCGGCGTGGATTGAACTTACTAAATCTCGAGATTTAGTAAGTTCAATCCACGTTTTTG-3’(SEQ ID NO:1)、5’-CCGGCCGCGAAGTTATGAGCAAGTTCTCGAGAACTTGCTCATAACTTCGCGGTTTTTG-3’(SEQ ID NO:2)和5’-CCGGCGGCCATTTGAACGCAAATTTCTCGAGAAATTTGCGTTCAAATGGCCGTTTTTG-3’(SEQ ID NO:3)。通过眼眶注射(每只小鼠5x1010至2.5x1010个病毒颗粒)，将编码乱序shRNA或shTjp1 shRNAs之一的DNA注射到2个月大的Mdr2/ABCB4 KO小鼠中。在注射2、4或6个月后处死这些小鼠。收集肝样品，用于分析。介导与靶标Tjp1相互作用的序列以粗体显示。
实验结果
Tjp1不是肝发育所必需的，并且对肝的结构和功能而言也是可有可无的
在肝发育过程中，白蛋白启动子在后来产生胆管细胞和肝细胞的共同前体中被激活，从而在Alb-Cre小鼠的两种细胞类型中导致基因敲入(floxed)或删除。在Tjp1 cKO小鼠中，Tjp1失活，因此不存在于成体器官的肝细胞和胆管细胞中。这并没有在肝功能(图1B)、肝组织学(图1A)、紧密连接标志物表达和定位(图1A、C和E)或紧密连接结构(图1F)或紧密连接功能(通过4kDa FITC-葡聚糖的体内渗透性评估)(图1G)方面导致显性表型。
Tjp1的失活在几种肝病模型中具有保护作用
鉴于Tjp1肝特异性失活后不存在明显的表型，因此在不同的肝病模型中，使用硫代乙酰胺(TAA)、3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢三甲砒啶(DDC)饮食和胆管结扎(BDL)评估了不存在Tjp1的影响。TAA诱导的肝损伤通常用于获得肝纤维化模型。DDC饮食诱导的肝损伤和胆管结扎通常用于获得胆汁淤积性疾病(胆汁淤积)模型。此外，还使用了Yap cKO和Mdr2敲除(KO)小鼠。Yap cKO小鼠在肝发育过程中具有胆管形成缺陷，是胆管疾病的良好模型。因为Mdr3(小鼠Mdr2的人类同源物)存在缺陷，Mdr2 KO小鼠被认为是人类胆汁酸诱导的肝病的良好动物模型。此类胆汁酸诱导的肝病的实例包括但不限于慢性炎性胆汁性肝病、肝纤维化和肝硬化或原发性硬化性胆管炎。
根据在对照野生型小鼠中观察到的血浆和肝生物化学、肝功能、肝组织病理学和肝纤维化，可以观察到TAA(图2)、DDC(图3)饮食喂食和胆管结扎(图4)对肝的有害影响。这些影响在Tjp1 cKO小鼠中得到废除。同样，Yap cKO和Mdr2 KO小鼠也表现出肝病变和受损的迹象。缺失Tjp1后，Yap cKO(图5)和Mdr2 KO(图6)小鼠的损伤程度有所减少。
在Yap cKO小鼠中，Tjp1的伴随失活导致胆管系统再生，如代表胆管增殖的CK19阳性染色所示(图5G)。尽管CK19可以用于证明胆管的存在，但与野生型对照相比K19染色水平的增加会带来不同的解释，因为它代表了胆管失调时或受到肝损伤诱发时反应性胆管的增殖，又称为胆管反应(Ductular reaction)(图3F)。
在DDC饮食诱导的肝损伤、BDL诱导的肝损伤和Yap KO模型中，结扎的Tjp1 cKO肝中巨噬细胞和中性粒细胞的募集以及炎性细胞因子和趋化因子的水平都得到减少(图3K、4F和5F)。如qRT-PCR所评估，在结扎的Tjp1 cKO肝中，几种胆汁酸合成基因(例如Cyp7a1)和转运体(例如Abcb11、Abcb4、Abcc2和Abcc3)基因都得到上调(图4I和4J)。另一方面，与对照肝相比，在假手术Tjp1 cKO肝中，这些转运体基因中有一些的表达较低，表明在Tjp1 cKO肝中损伤在转运体基因上调中的关键作用。Tjp1失活后，在其他肝损伤模型中也观察到BA转运体和解毒酶的类似变化。在BDL模型中，在结扎的Tjp1 cKO肝中，总胆汁酸和个体胆汁酸的浓度都得到减少，表明与结扎对照组相比，肝毒性较低(表1和图4H)。这些发现表明，Tjp1的缺失赋予肝毒性化合物、BDL或基因失活诱导的肝损伤保护作用。
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表1.在Tjp1失活和不失活的情况下，BDL小鼠的胆汁酸浓度(nM)。n.s.表示不显著。
验证Tjp1作为胆汁淤积的治疗靶标
为了确定使用AAV8载体特异性沉默肝中的Tjp1是否能重现敲除Tjp1的保护作用，在小鼠肝细胞中筛选了几种编码shTJP1 RNA的DNA。用在组织培养细胞中有效沉默Tjp1表达的三种编码shTjp1 RNA的DNA(图6A)来生成包含编码shTjp1 shRNA的DNA的AAV8载体，其中shRNA的表达由肝细胞特异性启动子(例如甲状腺素结合球蛋白(TBG))驱动，以确保Tjp1的肝细胞特异性沉默。然后，在小鼠2个月大时为其注射不同剂量的带有编码shTjp1或乱序shRNA的DNA的AAV8。带有编码shTjp1#21的DNA的AAV8在肝中显示出明显的Tjp1表达沉默(图6B)。当注射到Mdr2 KO小鼠中时，带有编码shTjp1#21的DNA的AAV8能够降低血清AST和ALT水平以及肝纤维化(图6C)。可以通过鉴别更有效的编码Tjp1 shRNA的DNA和/或AAV8载体的剂量给药来改善效率，以分别增强沉默或感染效率。基因沉默或带有肝特异性靶向模块(例如GalNAc)的外显子跳跃反义寡核苷酸的不同化学成分可以作为一种替代方法。
SEQ ID NOs:94-103的siRNAs在注射到结扎的胆管或Yap cKO小鼠模型中时，抑制Tjp1并对胆汁淤积产生有益影响(数据未显示)。
通过血液生物化学和组织学检测评估，肝中Tjp1的失活不会明显影响肝发育，也不会影响肝组织学功能。在细胞水平上，紧密连接和细胞极性的关键标志物的表达和定位均正常。紧密连接尤其是胆汁-血液屏障的结构和功能完整性，也保持完好。根据这些结果，与野生型小鼠的肝相比，Tjp1 cKO小鼠的肝没有表现出任何表型差异。然而，Tjp1 cKO小鼠在接受不同类型的肝损伤方案时被赋予保护作用。与相应的对照组小鼠相比，Tjp1 cKO小鼠表现出更好的血液和肝生物化学和较少的肝纤维化和炎症。这归因于肝细胞缺乏Tjp1。在YapcKO小鼠中，Tjp1的伴随失活挽救了胆管系统的形成。在Mdr2 KO动物中，肝缺失Tjp1抑制肝损伤和纤维化。在肝中敲除Tjp1的有益效果可以使用编码Tjp1 shRNA的DNA的治疗方式来重现，所述DNA由肝特异性启动子表达并通过AAV8载体递送。
Tjp1失活抑制肝细胞癌(HCC)
如上所述，使肝中的Tjp1失活防止不同类型的肝损伤。长期暴露于此类损伤可以导致肝癌。为了评估Tjp1是否在肝癌中有保护作用，使Mdr2/Abcb4KO小鼠内的Tjp1失活。Mdr2/Abcb4 KO是成熟的肝硬化癌症模型，其中动物在12个月大时(P360)会自发患上肝细胞癌(HCC)。来自6个月大(P180)小鼠的肝样品的天狼星红染色证明了Mdr2 KO小鼠肝中的广泛纤维化(图7)。相比之下，在Tjp1 Mdr2 cKO小鼠的肝几乎没有观察到纤维化，与野生型对照组的肝无异(图7)。对P360小鼠和高达到18个月大的小鼠的肝进行了观察，在Tjp1cKOMdr2 KO肝中没有检测到肿瘤。这一结果与对照Mdr2 KO小鼠的肝形成了对比，后者发展出了多发性肝细胞肿瘤。因此，在这种HCC模型中，Tjp1的缺失可能通过减轻肝纤维化和炎症来抑制肝癌发生。
如上所述，在Mdr2 KO小鼠中肝的Tjp1缺失抑制了肝细胞癌的发作。众所周知，Tjp1视为肿瘤阻抑基因。以前已经证明，Tjp1表达降低与肝癌的肿瘤转移有关。然而，Tjp1/ZO-1的表达是在已建立的肿瘤中分析的，而不是在肿瘤发生的早期阶段。因此，在已建立的肿瘤中Tjp1表达都下调可能与肿瘤转移有关，而不是与肿瘤发展本身有关。还表明，在肝癌ZO-1下调，只有在转移时才再次上调。这可能是癌变的结果，与调节癌变过程无关。仅仅显示在癌症中的上调或下调，或与过程相关，并不能证明基因/蛋白质是致癌基因或肿瘤阻抑基因，也不能说明调节其表达影响肿瘤发生。本申请使用了具有健康肝的小鼠，结果表明Tjp1的失活对肝病(包括肝癌)具有保护作用。因此，应当认识到，针对Tjp1的治疗靶标可用于治疗肝病和/或肝癌。
下表2详细列出了本文提到的序列身份编号及其相应的序列。还提供了序列的简要说明。
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Claims (24)
1.一种治疗受试者的肝病的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用药学有效量的Tjp1抑制剂。
2.一种再生受试者的胆管系统的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用药学有效量的Tjp1抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Tjp1抑制剂是核酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸选自由短发夹分子、shRNA、siRNA、反义寡核苷酸(AON)、间隙体和短发夹反义寡核苷酸(shAON)组成的组。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少80％的同一性：
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述核酸包含选自由以下组成的组的序列：
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
i)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：91的组合，其中SEQ ID NO：4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO：4的3’端与SEQ IDNO：91的5’端，并且其中SEQ ID NO：91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：92的组合，其中SEQ ID NO：5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO：5的3’端与SEQ IDNO：92的5’端，并且其中SEQ ID NO：92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；以及
iii)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：93的组合，其中SEQ ID NO：6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO：6的3’端与SEQ IDNO：93的5’端，并且其中SEQ ID NO：93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
和
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少80％的同一性：
和
11.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述核酸是siRNA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述siRNA与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述siRNA包含选自由以下组成的组的序列：
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述肝病选自由以下组成的组：胆汁淤积、肝癌、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、胆汁淤积性肝病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、肝纤维化、肝硬化、胆汁淤积相关进行性胆管损伤、囊性纤维化相关肝病、硫代乙酰胺(TAA)相关肝病、3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢三甲吡啶(DDC)相关肝病、胆管结扎肝损伤、Yes相关蛋白(YAP)相关肝病、Mdr2相关肝病、与暴露于影响胆固醇/胆汁酸(BA)生物合成和/或代谢的药物相关的疾病、与影响胆固醇/胆汁酸(BA)生物合成和/或代谢的基因突变相关的疾病以及与胆汁血液屏障完整性受损相关的疾病。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述胆汁淤积选自由肝内胆汁淤积、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、妊娠相关肝内胆汁淤积、新生儿胆汁淤积、进行性家族性肝内胆汁淤积3型、胆汁淤积性纤维化以及胆道闭锁组成的组。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肝癌选自由肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤和转移性肝癌组成的组。
17.编码Tjp1抑制剂的核酸，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％或至少80％的同一性：
18.根据权利要求17所述的核酸，其中所述核酸包含选自由以下组成的组的序列：
19.编码Tjp抑制剂的核酸，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
iv)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：91的组合，其中SEQ ID NO：4的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO：4的3’端与SEQ IDNO：91的5’端，并且其中SEQ ID NO：91的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；
v)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：92的组合，其中SEQ ID NO：5的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO：5的3’端与SEQ IDNO：92的5’端，并且其中SEQ ID NO：92的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列；以及
vi)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：93的组合，其中SEQ ID NO：6的5’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列，其中1-20个核苷酸的核苷酸序列连接SEQ ID NO：6的3’端与SEQ IDNO：93的5’端，并且其中SEQ ID NO：93的3’端侧翼是包含1-10个核苷酸的核苷酸序列。
20.编码Tjp抑制剂的核酸，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
和
21.根据权利要求20所述的核酸，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少80％的同一性：
和
22.编码Tjp抑制剂的核酸，其中所述核酸与选自由以下组成的组的序列具有至少60％的同一性：
23.编码Tjp抑制剂的核酸，其中所述核酸包含选自由以下组成的组的序列：
24.试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项所定义的Tjp1抑制剂和/或权利要求17-23中任一项所述的核酸。
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