CN117860892A - Il-16阳性神经元在调节恐惧消退记忆中的作用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了IL‑16阳性神经元在调节恐惧消退记忆中的应用，并基于此公开了一种促进恐惧消退记忆治疗PTSD的药物，该药物是利用腺相关病毒载体构建的特异性靶向并激活IL‑16阳性神经元的基因治疗药物。本发明成功地构建了IL‑16特异性的AAV表达载体，实现了IL‑16阳性神经元的特异性表达，进一步地，将病毒载体转化应用于神经系统，通过化学遗传技术和光遗传技术激活IL‑16阳性神经元，降低模型小鼠的僵直比，从而促进恐惧消退记忆。本发明证实了IL‑16阳性神经元是治疗PTSD的潜在作用靶点，在开发相关治疗药物方面具有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药学领域，涉及一种与恐惧消退记忆相关的作用靶点，尤其是白细胞介素16(IL-16)阳性神经元与恐惧消退记忆相关的作用靶点，本发明还涉及针对该作用靶点开发的相关药物及其应用。
背景技术
创伤后应激障碍(Posttraumatic Stress Disorder，PTSD)是由于遭受非同寻常的威胁性或灾难性心理创伤而诱发的长期持续的精神障碍，对患者的心理、生理和社会功能造成严重的负面影响。PTSD在普通人群中的患病率从6.4％到7.8％不等，在经历过重大公共创伤事件的人群中明显更高。目前，对于PTSD没有很好的药物治疗手段，暴露疗法是治疗PTSD的一线临床疗法，该疗法是在没有威胁的情境中让PTSD患者反复接受创伤性的恐惧刺激，产生一种新的恐惧消退记忆来抑制引起PTSD的恐惧记忆。现阶段PTSD治疗的重点和难点在于：相比固有的恐惧记忆，新形成的消退记忆非常脆弱，特别容易遗忘或失效，导致固有的恐惧记忆重现或自发恢复。在接受该疗法的患者当中，约有30％～50％的患者再次经历恐惧的复发和重现。出现这种状况的主要原因之一是，恐惧消退记忆的脑机制还不完善，与恐惧消退记忆相关的分子特异性的神经元亚群有哪些还不清楚。
光遗传和化学遗传技术作为新型神经调控技术目前已经在神经系统疾病的药物开发、功能基因组学等领域中得到了广泛的应用，它们能够精确地调控模式动物特异性神经元且避免对动物造成不可逆的损伤。近期，借助光遗传技术发现光激活岛叶皮层向中央杏仁核的投射神经元可以促进恐惧记忆的形成，而光激活岛叶皮层向伏隔核的投射神经元可以促进恐惧消退记忆的形成。此外，化学遗传技术激活恐惧消退相关痕迹细胞能够减少模式小鼠在恐惧消退期间的僵直行为，促进恐惧消退记忆的形成。这些结果表明，同一脑区可以依赖于不同分子类群神经元调控正负性情感。然而，这些分子类群有哪些种类还是未知的。
基于当前对治疗PTSD的迫切需求，急需找到在恐惧消退记忆中高度特异的神经元亚群及治疗靶点。本申请人通过单细胞转录组技术，在恐惧消退记忆模型小鼠中鉴定出一小群特异性激活的神经元，即白介素16(Interleukin 16,IL-16)阳性神经元，这一研究结果表明IL-16阳性神经元亚群极有可能是与恐惧消退记忆相关的特异性神经元亚群。早期研究中，IL-16主要是作为炎症因子在免疫系统中发挥作用。而在1999年，发现IL-16的N端区域有两个额外的PDZ域，是一种神经元变体。先前的研究表明，IL-16的mRNA主要定位于小脑和海马的神经元，能够与多种神经元离子通道的胞质结构域发生物理作用；IL-16可以与转染细胞的NMDA受体亚单位2A(NR2A)发生免疫共沉淀，可能参与了神经递质受体的靶向和聚集。此外，IL-16处理培养的小鼠小脑颗粒细胞导致立即早期基因c-fos的诱导，表明IL-16能够在神经元中启动信号级联。因此，IL-16在神经系统中可能具有双重功能，既作为caspase-3诱导后分泌的信号分子，又作为锚定膜上离子通道的胞质支架蛋白。然而，IL-16阳性神经元在恐惧消退记忆中的作用，目前尚未发现相关研究。
目前针对IL-16的研究技术主要集中于荧光原位杂交技术、免疫荧光、蛋白印迹技术和酶联免疫吸附测定等分子生物学技术，仅能从RNA或蛋白水平获取IL-16的信息，难以获取IL-16阳性神经元的形态学信息、其在大脑中的投射、以及或通过遗传学方式调控IL-16阳性神经元来研究其对恐惧消退记忆的影响。
基因治疗是一种通过操纵目的基因来实现疾病治疗的技术，主要包括基因替代、基因激活、基因抑制和基因编辑等策略。腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)由于其较低的免疫原性和位点特异性整合能力在基因治疗领域的发展势头日益强劲，目前在遗传性耳聋、视网膜病变及血友病等疾病治疗方面已经取得了一定的进展。采用基因调控的方式研究IL-16阳性神经元在恐惧消退中作用，将为恐惧消退记忆提供精确治疗靶点，同时也为PTSD的基因治疗药物提供修饰位点，具有广阔的应用前景。
发明内容
为了能更好地解析IL-16阳性神经元的在大脑中的形态学特征及其在恐惧消退记忆中发挥的功能，申请人利用IL-16基因启动子来构建IL-16神经元特异性的腺相关病毒载体，进一步特异性地标记IL-16阳性神经元亚群，解析IL-16神经元在大脑中的投射，并通过经典的神经生物学操控技术来调控IL-16阳性神经元亚群并明确其对恐惧消退记忆的作用。本发明最终将为治疗或缓解PTSD提供新的药物或治疗靶点。
为实现上述目的，申请人首先将IL-16特异性启动子插入腺相关病毒(AAV)载体，将构建的重组病毒经过包装后获得了rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA和rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA两个重组病毒，这两个包含IL-16启动子的重组病毒能够特异性地标记IL-16阳性神经元。其中，所述的rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒能够特异性的感染IL-16阳性神经元，用于解析IL-16阳性神经元解剖学形态和在大脑中的投射环路特征；所述的rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA可以与包含DIO元件的功能病毒结合，用于标记或调控IL-16阳性神经元，研究IL-16阳性神经元的投射或其在恐惧消退记忆中的功能。
为了能够实现IL-16细胞类型特异性的功能标记或操作，本发明构建的rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA病毒与含DIO元件的病毒联合使用组成Cre-LoxP重组酶系统。Cre-LoxP重组酶系统的基本原理如下：Cre(Cyclization Recombination Enzyme)是一种重组酶，它的C-末端结构域包含催化活性位点，能够催化DNA分子中特定位点之间的重组。当引入的两对lox位点为LoxP和Lox2272时，称之为DIO序列策略。此时，在IL-16启动子的作用下，Cre重组酶能识别特异的lox位点，使LoxP和Lox2272位点间发生基因重组，使DIO病毒中的目的基因稳定的表达在IL-16特异性的细胞中，从而在IL-16特异性的细胞中灵活地引入各种功能元件以对IL-16细胞的功能调控，从而实现IL-16细胞在恐惧消退中的作用研究。
接着，将rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒通过脑立体注射的方式分别注射入小鼠的IL和海马脑区，观察病毒的表达情况，结果发现，重组病毒在IL脑区和海马脑区都有高表达，然后采用IL-16抗体、NeuN抗体和S100β抗体对脑片进行免疫荧光标记，结果发现重组病毒感染的细胞与IL-16抗体和NeuN抗体有很高的共标率。该结果表明，以IL-16启动子构建的重组病毒能够高度特异性的感染IL-16阳性神经元细胞。
将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA、rAAV-DIO-EGFP-T2A-TVA和rAAV-DIO-oRVG辅助病毒与RV-EnvA-Δdg-mRuby3组合，能够实现IL脑区IL-16神经元的逆向跨单突触投射，便于研究IL-16阳性神经元的上游脑区；而将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与rAAV-CAG-DIO-mWGA-mCherry组合，能够实现IL脑区IL-16阳性神经元的顺向跨单级突触投射，便于研究IL-16阳性神经元的下游脑区。
将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq(or hM4Di)-mcherry结合可通过化学遗传学的方式激活或者抑制IL-16阳性神经元，将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与DIO-ChR2或者DIO-NpHR3.0结合可通过光遗传学的方式激活或者抑制IL-16阳性神经元，实验发现，激活IL-16神经元可促进恐惧记忆的消退，而抑制IL-16神经元会抑制恐惧记忆的消退。
总结起来，本发明首先通过单细胞转录组技术发现IL-16神经元亚群可能是影响恐惧消退记忆的神经元亚群，在此基础上，构建IL-16启动子的基因序列并成功地构建了IL-16特异性的AAV表达载体，实现了IL-16阳性神经元的特异性表达；进一步地，将病毒载体转化应用于神经系统，通过化学遗传技术和光遗传技术激活IL-16阳性神经元，降低模型小鼠的僵直比，从而促进恐惧消退记忆。本发明的意义在于，提供的一种IL-16启动子序列及其AAV病毒载体系统，并且在恐惧消退记忆行为学中具有实际操作的可行性，同时证实了IL-16阳性神经元是治疗PTSD的潜在作用靶点，该靶点在开发相关治疗药物方面具有广阔应用前景。
在本发明中，所述用于激活IL-16阳性神经元的药剂包括但不限于利用腺相关病毒载体构建的基因治疗剂，将能够激活IL-16的化学药物采用包括脂质体在内的药剂学方法使其靶向IL-16阳性神经元，或者采用免疫学方法制备能特异性促进神经元IL-16表达的蛋白或抗体，这些化学药剂和生物药剂同样也包含在本发明的保护范围之内。
附图说明
图1为pAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA的质粒元件构成(A)及图谱(B)。
图2Cre-loxP系统原理示意图。
图3为pAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA的质粒元件构成(A)及图谱(B)。
图4为重组病毒rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA进行脑立体定位注射后在IL脑区和海马脑区细胞感染图示。
图5为重组病毒rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA感染的细胞与IL-16、NeuN(神经元标志物)和S100β(星形胶质细胞标志物)抗体的共标示意图。
图6为重组病毒rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与AAV辅助病毒及RV改造病毒共同使用标记IL脑区后，研究IL-16的跨单级突触逆向投射寻找其上游脑区的结果示意图。其中，图6A为rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与辅助病毒和改造的RV病毒共同起作用表达于IL脑区的结果图示，图6B-F为IL脑区的IL-16神经元的跨单级逆向投射脑区结果图示。
图7为重组病毒rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与rAAV-CGA-DIO-mWGA-mCherry共同使用注射于IL脑区后，IL-16阳性神经元的顺向跨单级投射的下游脑区的结果示意图。其中，图B是图A中RE脑区的局部放大展示，图D是图C中BLA脑区的局部放大展示，图F是图E中小脑脑区被感染细胞的局部放大展示。
图8为重组病毒rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq-mcherry和DIO-hM4Di-mcherry共同使用标记IL脑区后，研究IL-16在恐惧消退记忆中作用的结果展示。其中，图8A为化学遗传激活病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq-mcherry)激活IL-16神经元后，小鼠恐惧消退记忆行为结果展示，图8B为化学遗传抑制病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1a-DIO-hM4Di-mcherry)抑制IL-16神经元后，小鼠恐惧消退记忆行为结果展示。图示中RC：Retention Control，在本发明中指进行了恐惧训练而未进行恐惧消退训练的分组；EXT：Extinction，即恐惧消退训练实验组。CS：conditionedstimulus，本发明中指声音刺激，pre-CS指出现声音刺激之前，第一次声音刺激为CS-1，第二次声音刺激为CS-2，以此类推。
图9为重组病毒rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与DIO-ChR2-EYFP和DIO-NpHR3.0-mcherry共同使用标记IL脑区后，研究IL-16在恐惧消退记忆中作用的结果展示。其中，图9A为光遗传激活病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-hSyn-DIO-ChR2-EYFP)激活IL-16神经元后，小鼠恐惧消退记忆行为结果展示，图9B为光遗传抑制病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-hSyn1-DIO-NpHR3.0-mcherry)抑制IL-16神经元后，小鼠恐惧消退记忆行为结果展示。图示中RC：Retention Control，在本发明中指仅进行了恐惧训练而未进行恐惧消退训练；EXT：Extinction，即恐惧消退训练。CS：conditioned stimulus，本发明中即指声音刺激，pre-CS指出现声音刺激之前，第一次声音刺激为CS-1，第二次声音刺激为CS-2，以此类推。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，需要指出的是，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何未背离本发明精神实质与原理下所作出的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
申请人前期通过单细胞转录组技术获取恐惧消退小鼠IL脑区的基因型并通过聚类分析，发现一个与恐惧消退记忆高度相关的神经元亚群，即白介素16(Interleukin 16,IL-16)阳性神经元，这一研究结果表明IL-16阳性神经元亚群极有可能是与恐惧消退记忆相关的特异性神经元亚群。
在本发明中，为了能更好地解析IL-16阳性神经元的在大脑中的形态学特征及其在恐惧消退记忆中的功能，申请人利用IL-16基因启动子来构建IL-16神经元特异性的腺相关病毒载体，进一步特异性地标记IL-16阳性神经元亚群，从而解析IL-16神经元亚群在大脑中投射，并通过经典的神经生物学操控技术来调控IL-16阳性神经元亚群明确其对恐惧消退记忆的作用。
材料：
HEK293细胞：购买自尚恩生物，细胞货号SNL-014。
AAV-MCS质粒：购买自Addgene，质粒编号#46954，用于构建pAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA和pAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA的载体。
辅助质粒pAAV-helper：购买自Addgene，质粒编号#11286，包含腺病毒的VA、E2A和E4基因，辅助rAAV的包装。
包装质粒pAAV-RC2：购买自Addgene，质粒编号#104963，包含Rep和Cap基因，决定rAAV的血清型和组织嗜性。
rAAV-DIO-EGFP-T2A-TVA：购买自布林凯斯(深圳)生物科技有限公司，产品编号BC-0041；rAAV-DIO-oRVG：购买自布林凯斯(深圳)生物科技有限公司，产品编号BC-0040；RV-EnvA-Δdg-mRuby3：购买自上海泰儿图生物科技有限公司，产品编号R002。rAAV-DIO-EGFP-T2A-TVA、rAAV-DIO-oRVG和RV-EnvA-Δdg-mRuby3等病毒与rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA病毒联用，用于特异性IL-16阳性神经元的逆向跨单级突触研究，其原理来自于：EdwardCallaway等研究者对RV病毒进行了改造，首先他们敲除了RV病毒的表面囊膜蛋白基因，并用荧光蛋白基因取代了表面囊膜蛋白基因，这样改造后的RV病毒不再具备跨突触的能力，毒性大大降低，并且可以在神经元中表达荧光蛋白，用荧光标记被感染的神经元，从而使被标记的神经元可视化。进一步地，他们将这类基因改造的RV病毒的表面囊膜蛋白替换为禽类白血病病毒的囊膜蛋白EnvA，这类囊膜蛋白在哺乳动物中没有受体，因此这类RV-EnvA病毒不能单独感染小鼠的神经元。为了使RV-EnvA病毒能够感染小鼠的神经元并重新获得跨突触能力，研究者利用腺相关病毒AAV作为辅助病毒，用以表达EnvA的受体肿瘤病毒A(tumor virus A,TVA)和RV-EnvA病毒跨突触所需的RV囊膜蛋白(rabies glycoprotein,RG)。这样将AAV病毒和RV-EnvA病毒同时注射到小鼠同一个脑区时，被AAV感染的神经元会表达TVA，这样这些神经元就有可能被RV-EnvA感染，RV-EnvA借助AAV表达的RG，可以组装成完整的RV病毒粒子，并跨一级感染上一级神经元，由于上一级神经元并没有被AAV感染，此时的RV病毒由于缺乏其自身囊膜蛋白的基因而不能表达RG，而停止在一级输入神经元，从而实现了标记特定神经元的上一级神经元的目的。本发明中利用在特定类型IL-16阳性神经元中表达Cre重组酶(通过rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA病毒实现)结合Cre依赖的AAV辅助病毒(rAAV-DIO-EGFP-T2A-TVA和rAAV-DIO-oRVG)，再结合改造的RV-EnvA病毒，就可以标记小鼠特定脑区中IL-16阳性神经元的上一级神经元。
rAAV-CAG-DIO-mWGA-mCherry：购买自布林凯斯(深圳)生物科技有限公司，产品编号BC-1227。rAAV-CAG-DIO-mWGA-mCherry和rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA联用，用于特异性IL-16阳性神经元的顺向跨单级突触研究，其原理源于2022年加州大学旧金山分校研究者在Nature Neuroscience杂志(IF＝24.884)上发表的文章。他们首先利用基因工程改造麦胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)并筛选到一个特定的融合蛋白产物mWGA-mCherry(mWmC)，并通过腺相关病毒载体(AAV)感染特定靶点细胞类型后，可实现顺行单突触的示踪。
rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq-mcherry：购买自上海泰儿图生物科技有限公司，产品编号S0145-9-H50。rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq-mcherry与rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA联用，将hM3Dq表达于IL-16阳性神经元上，当hM3Dq与接触到腹腔注射的氯氮平一氧化氮(Clozapine N-oxide，CNO)时，与Gq蛋白耦合，向下作用于“磷脂酶C(PLC)-肌醇三磷酸(IP3)-胞内钙离子(Ca2+)”这一信号通路，从而激活IL-16神经元。
rAAV-Ef1a-DIO-hM4Di-mcherry：购买自上海泰儿图生物科技有限公司，产品编号S0144。rAAV-Ef1a-DIO-hM4Di-mcherry与rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA联用，将hM4Di表达于IL-16阳性神经元上，当hM4Di与接触到腹腔注射CNO时，与Gi耦合，可以激活G蛋白内向整流钾离子通道，从而抑制IL-16阳性神经元的放电活动。
rAAV-hSyn-DIO-ChR2-EYFP：购买自上海泰儿图生物科技有限公司，产品编号S0829。rAAV-hSyn-DIO-ChR2-EYFP与rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA联用，将光感基因ChR2转入到神经系统中IL-16阳性神经元中进行阳离子通道的表达。ChR2在470nm光照的刺激下会对阳离子通道产生选择性，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到选择性地兴奋IL-16神经元的目的。
rAAV-hSyn-DIO-NpHR3.0-mcherry：购买自上海泰儿图生物科技有限公司，产品编号S0652-8。rAAV-hSyn-DIO-NpHR3.0-mcherry与rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA联用，将光感基因NpHR3.0转入到神经系统中IL-16阳性神经元中进行阴离子通道的表达。ChR2在570nm光照的刺激下会对阴离子通道产生选择性，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到选择性地抑制IL-16神经元的目的。
其它未予说明的材料，均为本领域常规材料。
实施例1：IL-16神经元特异性腺相关病毒载体的构建
1.IL-16特异性启动子的构建
利用UCSC数据库：http://genome.ucsc.edu/分析IL-16启动子的序列。首先搜索IL-16基因，点击进入基因的详细信息，找到Genomic Sequence，设置启动子的长度为，提交序列信息，使用Vistabrowser2对获取的启动子序列进行评估。IL-16基因座上游的2.0kb推定启动子区域的基因组保守序列，获得IL-16启动子基因序列SEQ ID NO.1。
2.pAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA质粒构建
为了能实现IL-16特异性细胞的可视化，选择增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因，与IL-16启动子序列SEQ ID NO.1连接。为了提高EGFP基因转录后的稳定性，在EGFP基因(NZ_CP084280.1)的3’端增加了WPRE转录后调控元件以及polyA序列。然后，通过融合克隆方案将IL-16启动子生成到AAV-MCS(多克隆位点)表达载体的MluI-BamHI限制酶位点。在将EGFP插入BamHI-EcoRI的位点，构建pAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA质粒(如图1所示)，并通过测序验证。
3.rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒的制备
将获得的质粒进行rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒的包装和纯化。其基本步骤如下：为了提高rAAV感染活体的效率和便于rAAV的制备，选取常用的2型rAAV。首先将HEK293细胞铺到10cm细胞皿中培养至80％密度，将包装rAAV所需的三个质粒(辅助质粒pAAV-helper、包装质粒pAAV-RC2、核心质粒pAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA)以摩尔比(1:1:1)共同转染HEK293细胞。转染72h后，用细胞刮将产毒的贴壁细胞刮下后离心，收集离心后的细胞沉淀。然后，将细胞沉淀裂解液用核酸酶处理，病毒上清液中的rAAV用PEG/NaCl沉淀浓缩。将含有rAAV的裂解液上清用碘克沙醇密度梯度超速离心分离纯化，最后将纯化得到的rAAV分装后，在-80度冰箱冻存。利用实时荧光定量qPCR测病毒滴度，其中IL-16的引物序列为F1:ggccgcacgcgtgtgtctagaactagtagcttcacggctttca；R1:gcccttgctcaccatggtggcgtcgacgcaacagtggcagcag，测得的病毒滴度为5.43×1012vg/ml。
4.pAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA质粒构建及rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA重组病毒的制备
为了能够实现IL-16细胞类型特异性功能操作，选择Cre-LoxP重组酶系统进行标记。首先，构建pAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA质粒并包装成重组病毒，再与含DIO元件的病毒联用进行标记。Cre-loxP系统原理如图2所示，如果两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转(Inversion)。DIO策略则是通过引入两对不相容的反向Lox位点LoxP和Lox2272，经过两组Lox位点的两轮重组可达到一种稳定状态。在这种策略下，任一对Lox位点间的序列会在Cre的作用下发生可逆的快速翻转，之后Cre重组酶马上不可逆地切割翻转后的同向Lox位点，只留下翻转后的基因和单独的LoxP、Lox2272位点，防止基因的再次翻转。这种巧妙的设计可以在病毒载体中构建DIO目的基因，在双病毒系统中，含有特异性启动子的Cre病毒感染特异性的阳性细胞后，含有DIO的病毒可以让Cre阳性的细胞表达目的基因。
pAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA质粒构建和重组病毒的包装：通过融合克隆方案将IL-16启动子生成到AAV-MCS(多克隆位点)表达载体的MluI-BamHI限制酶位点。再将Cre重组酶(NC_005856.1)插入BamHI-EcoRI的位点，构建pAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA质粒(如图3所示)，并通过测序验证。利用HEK293细胞包装病毒、浓缩、纯化后收集病毒，将病毒包装成rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA(详细步骤同3)。利用实时荧光定量qPCR测病毒滴度，其中Cre的引物序列为：F2：gctgctgccactgttgcgctagcgccatgtccaatttactga；R2：caacgttttcttttcggatccgccgcataaccagtg，测得的病毒滴度为5.93×1012vg/ml。
实施例2：IL-16神经元特异性腺相关病毒载体的特异性和在大脑中的投射
1.rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA脑立体定位注射IL脑区和海马结果示例
将rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒通过脑立体注射的方式分别注射入小鼠的IL、海马脑区，病毒滴度为5.43×1012vg/ml。其中，IL脑区的注射位点为bregma 1.4mm，中缝靠外侧0.3mm,颅骨以下2.8mm，注射体积分别为50nL；海马脑区的注射位点为bregma-1.70mm，中缝靠外侧1.0mm,颅骨以下2.0mm，注射体积为200nL，注射速度均为30nl/min。注射完成后，停针10min，使病毒在脑组织中被充分吸收。待病毒表达3周后，麻醉小鼠，进行心脏灌流，取出鼠脑，将鼠脑置于多聚甲醛中固定24h，然后置于30％的蔗糖溶液中直到脑组织沉底。沉糖完成后的脑组织在冰冻切片机上进行冠状面切片，切片厚度为40μm。然后将获取的脑片在玻片扫描显微镜下进行扫描成像，观察rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA病毒的表达情况，如图4所示，图4A和B为脑立体定位注射IL脑区的结果展示，其中图4A是感染IL脑区的冠状面切片的整体展示，图4B是图4A中IL脑区中感染的细胞的局部放大展示，绿色为rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA病毒感染的细胞，蓝色为DAPI染色的细胞核，用于便于脑区分割；图4C-E是脑立体定位注射海马脑区后所感染细胞的图示，其中图4C为脑立体定位注射海马脑区所感染的所有细胞的冠状面切片展示，图4C和4D为被病毒感染的海马脑区细胞的局部放大展示。
以上结果表明，重组病毒rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA能够在脑立体定位注射的IL脑区和海马脑区进行高亮度表达。
2.rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒感染IL脑区后与IL-16抗体、NeuN抗体和S100β共标结果示例
为了验证rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA病毒感染的细胞类型和细胞特异性，采用将rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒对小鼠IL脑区进行脑立体定位注射，注射位点和流程同上述1，表达21天后，灌流、取脑、冰冻切片(40μm)。收集包含IL脑区的冠状切片，然后采用IL-16抗体、NeuN抗体(神经元标志物)和S100β抗体(星形胶质细胞标志物)对脑片进行免疫荧光标记。免疫标记完成的脑片在黏附载玻片上进行贴片，玻片扫描显微镜成像。统计病毒感染的细胞与各种抗体标记的细胞个数并采用GraphPad 9.0软件计算共标率，从而验证rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒的特异性。如图5所示，rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA重组病毒感染的细胞与IL-16抗体标记的细胞共标率为(96.06±2.31)％，即病毒所感染的细胞为IL-16阳性细胞，表明了本发明构建的IL-16启动子的有效性和特异性；与神经元标志物NeuN的细胞共标率为(94.64±1.26)％，表明病毒所感染的IL-16阳性细胞类型为神经元；而与星形胶质细胞标志物S100β几乎没有共标的细胞，表明IL-16阳性细胞不属于星形胶质细胞类型。
以上结果表明，以IL-16启动子构建的重组病毒rAAV-IL-16-EGFP-WPRE-pA能够高度特异性的感染IL-16阳性细胞且该阳性细胞是高度神经元特异性的。
3.rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA重组病毒与RV病毒组合标记IL脑区追踪其上游脑区的结果示例
为了研究与恐惧消退记忆相关脑区(IL脑区)中IL-16阳性神经元会接收来自哪些脑区神经元的投射，将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与改造的跨单级突触的逆行示踪病毒狂犬病毒(Rabies virus,RV)结合使用。对于RV跨一级逆行标记技术，需要对实验动物进行两次注射。具体地，先将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与辅助病毒rAAV-DIO-EGFP-T2A-TVA和rAAV-DIO-oRVG以1：2：2的体积比，在小鼠IL脑区(注射位点：bregma 1.4mm，中缝靠外侧0.3mm，颅骨以下2.8mm)进行脑立体定位注射，待病毒表达14天后，在相同的位点注射RV-EnvA-Δdg-mRuby3(病毒滴度为1×109vg/ml)，注射完成后，病毒表达7天左右。病毒表达完成后，对小鼠进行灌流、取脑、切片、DAPI染色、玻扫显微镜观察病毒表达情况及上游脑区示踪情况。如图6所示，rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA能够与辅助病毒和改造的RV病毒共同起作用表达于IL脑区，其上游脑区主要集中于垂直斜角带(Vertical limb of diagonal band nucleus，VDB)，前腹侧丘脑核(Anteroventral nucleus of thalamus，AV)，前内侧丘脑核(Anteromedial nucleus of thalamus，AM)，内背侧丘脑核(Mediodorsal nucleus ofthalamus，MD)和海马CA1区。
以上结果表明，rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA能够与辅助病毒和改造的RV病毒共同起作用表达于IL脑区，并能够实现IL脑区的IL-16神经元的跨单级逆向投射。
4.rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA重组病毒与rAAV-CGA-DIO-mWGA-mCherry组合标记IL脑区追踪其下游投射脑区的结果示例
为了研究与恐惧消退记忆相关脑区(IL脑区)中IL-16阳性神经元会投射向哪些脑区神经元，将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA重组病毒和具有顺行单突触的示踪病毒rAAV-CGA-DIO-mWGA-mCherry组合使用，对小鼠IL脑区进行脑立体定位注射。其中WGA为麦胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)，它的一个特定的融合蛋白产物mWGA-mCherry(mWmC)通过腺相关病毒载体(AAV)感染特定靶点细胞类型(即IL-16)后，可实现顺行单突触的示踪。rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与rAAV-CGA-DIO-mWGA-mCherry的病毒混合比例为1：2，注射位点为bregma 1.4mm，中缝靠外侧0.3mm,颅骨以下2.8mm，病毒表达2～3周后，进行灌流、取脑、切片、DAPI染色、玻扫显微镜观察病毒表达情况及向下游脑区投射情况。如图7所示，IL-16向下游投射的脑区主要集中于内背侧丘脑核(Mediodorsal nucleus of thalamus，MD)，丘脑核(reuniens thalamic nucleus，RE)，基底外侧杏仁核(basolateral amygdaloidnucleus，BLA)和小脑脑区。
结果表明，rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与rAAV-CGA-DIO-mWGA-mCherry能够实现IL脑区的IL-16神经元的跨单级顺向投射。
实施例3：化学遗传调控(激活或抑制)IL脑区中的IL-16阳性神经元对恐惧消退记忆的影响
将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与含有DIO元件化学遗传激活(hM3Dq)或抑制(hM4Di)功能的病毒联用，研究IL脑区中IL-16阳性神经元对恐惧消退记忆的调控作用。在小鼠IL脑区注射混合rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq-mcherry或rAAV-Ef1a-DIO-hM4Di-mcherry病毒，Cre和DIO病毒的体积比为1：2。待病毒表达21天后，对小鼠进行恐惧消退训练。在消退训练前1h，小鼠腹腔注射特定药物氯氮平一氧化氮(Clozapine N-oxide，CNO，3mg/Kg)，用于与hM4Di或者hM3Dq结合靶向操控IL脑区中IL-16神经元。行为学步骤如下：所有的恐惧消退行为学测试都包含两种情境A和B。情境A和B都有两个透明亚克力板组成的条件室，其中情境A室的底部是钢格栅电击板，用于对小鼠进行足底电击，情境B室的底部是塑料非透明的格栅板，用于与情境A进行对照，并最大程度的减少环境的泛化。单个数码相机安装在每个条件室的顶部上，通过一个四轴处理器连接，通过僵直测量程序对小鼠的僵直比进行自动评分。训练第一天，在情境A中进行，采用25％的柠檬水喷雾进行恐惧调节，恐惧条件方案以120s的恐惧前环境适应开始，随后是120s、80dB、16kHz纯声音条件刺激和1s(间隔2min)0.6mA足部刺激(非条件刺激)，该过程循环进行三次。在最后一次条件刺激中没有达到50％僵直行为的动物被排除在外。第二天进行恐惧消退训练，将恐惧训练后的小鼠暴露在情境B中，给予光照和10％的醋酸喷雾。小鼠适应两分钟后，消退训练包括30个非强化的120s声音条件刺激(间隔为5s)。对于消退记忆的回忆测试，所有小鼠返回情境B，经过2分钟的适应，在3次120秒声音条件刺激呈现(120秒部落间间隔)期间评估僵直比(其中第一次呈现声音称为CS-1，第二次呈现声音称为CS-2，第三次呈现声音称为CS-3)，采用FreezeFrame(Colbourn)软件自动评定僵直分数。
行为学结果表明，通过化学遗传激活病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1a-DIO-hM3Dq-mcherry)激活IL-16神经元后，小鼠在恐惧消退行为中僵直比降低(图8A)，表明激活IL-16神经元促进了恐惧消退记忆；通过化学遗传抑制病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1a-DIO-hM4Di-mcherry)抑制IL-16神经元后，小鼠在恐惧消退行为中僵直比增加(图8B)，表明抑制IL-16神经元抑制了恐惧消退记忆的形成。行为学结果提示：IL脑区中的IL-16阳性神经元可能是治疗PTSD的药物靶点。
实施例4：光遗传调控(激活或抑制)IL脑区中的IL-16阳性神经元对恐惧消退记忆的影响
将rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA与含有DIO元件光遗传激活(ChR2)或抑制(NpHR3.0)的功能病毒联用，研究IL脑区中IL-16阳性神经元对恐惧消退记忆的调控作用。在小鼠IL脑区注射混合rAAV-IL-16-Cre和rAAV-hSyn-DIO-ChR2-EYFP或rAAV-hSyn1-DIO-NpHR3.0-mcherry病毒，待病毒表达14天后，再将光电极植入到病毒注射的相同位点，一周后进行恐惧消退行为学训练。在恐惧消退训练过程中通过蓝光刺激激活或者黄光刺激抑制IL脑区中的IL-16阳性神经元，评估ILIL-16神经元对恐惧消退记忆不同阶段的调控作用。其蓝光刺激的光强为5mW，占空比为10％，每个波形串的输出持续时间为121s，时间间隔为4s，总的输出持续时间为625s。黄光刺激的光强为10mW，占空比为10％，每个波形串的输出持续时间为121s，时间间隔为4s，总的输出持续时间为625s。行为学步骤同实施例3。
行为学结果表明，通过光遗传激活病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-hSyn-DIO-ChR2-EYFP)激活IL-16神经元后，小鼠在恐惧消退行为中僵直比降低(图9A)，进一步地证实了激活IL-16神经元促进了恐惧消退记忆；通过光遗传抑制病毒(rAAV-IL-16-Cre-WPRE-pA和rAAV-hSyn1-DIO-NpHR3.0-mcherry)抑制IL-16神经元后，小鼠在恐惧消退行为中僵直比增加(图9B)，同样进一步地证实抑制IL-16神经元抑制了恐惧消退记忆的形成。以上结果进一步的提示，IL脑区中的IL-16阳性神经元可能是治疗PTSD的药物靶点。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.IL-16阳性神经元在调节恐惧消退记忆中的应用。
2.用于激活IL-16阳性神经元的药剂在制备促进恐惧消退记忆的药物中的应用。
3.用于激活IL-16阳性神经元的药剂在制备治疗PTSD药物中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述药剂是利用腺相关病毒载体构建的特异性靶向IL-16阳性神经元的基因治疗剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因治疗剂中含有序列如SEQ ID NO：1所示的IL-16启动子。
6.一种促进恐惧消退记忆的药物，其特征在于：该药物是利用腺相关病毒载体构建的特异性靶向并激活IL-16阳性神经元的基因治疗药物。
7.一种治疗PTSD的药物，其特征在于：该药物是利用腺相关病毒载体构建的特异性靶向并激活IL-16阳性神经元的基因治疗药物。
8.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于：所述腺相关病毒载体中含有序列如SEQID NO：1所示的IL-16启动子。
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| 位景香;王永堂;鲁秀敏;: "创伤后应激障碍的中医疗法及其机制研究进展", 中国康复理论与实践, vol. 23, no. 01, 31 January 2017 (2017-01-31), pages 54 - 58 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117860892B (zh) | 2024-08-06 |
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