CN117858939A - 清除锰的乳杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物学领域。本申请提供具有锰转运蛋白MntH1的灭活的调控序列的新型乳杆菌以及包含所述细菌的组合物。此类细菌可用于制造食物产品或其他工业应用。此外，本发明提供一种改善乳杆菌的锰清除活性的方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物学领域，并且涉及具有锰摄取活性的细菌。所述细菌可用于控制产品中不想要的微生物的腐败或污染。本发明还涉及使用此类细菌的发酵的食物产品和其制剂。
背景技术
食品工业中的一个主要问题是非所需微生物引起的腐败。酵母和霉菌在引起食物腐败方面高度有效，并且是大多数食品制造商所面临的问题。由于酵母和霉菌引起的腐败在食物产品表面上清晰可见为霉菌块或变色，因此允许其在食用前被处理掉。酵母倾向于以浮游形式在食物和饮料基质内生长。它们倾向于发酵糖并在厌氧条件下生长良好。相比之下，霉菌倾向于以由细胞组成的可见菌丝体的形状在产品表面上生长。
乳制品(包括流体奶、干酪和培养产品)的过早微生物腐败是导致乳制食品废物的主要原因。微生物污染可在整个生产和加工连续体中的各个点发生，并且包括生物体，诸如革兰氏阴性细菌(例如假单胞菌属(Pseudomonas))、革兰氏阳性细菌(例如类芽孢杆菌属(Paenibacillus))和宽范围的真菌生物体。
除了腐败之外，食品中的食物污染也是该行业持续面临的挑战。例如，李斯特菌属(listeria)污染涉及一些乳制品和即食(RTE)食品，并且可能导致严重的疾患，包括严重的败血症、脑膜炎或脑炎，有时导致终身伤害，甚至死亡。在乳制品中，乳热处理并不始终足以保证不存在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。已知在巴氏灭菌后或后加工步骤期间缺乏卫生或卫生设备也会导致污染。在食品工业中一直需要控制李斯特菌生长。
已报道锰耗尽是乳酸菌(LAB)延迟乳制品中腐败污染物生长的机制(Siedler等“竞争排斥是乳杆菌对抗发酵乳产品中真菌腐败的主要生物保护机制(Competitiveexclusion is a major bioprotective mechanism of lactobacilli against fungalspoilage in fermented milk products).”Appl Environ Microbiol 86(2020):e02312-19.和van Gijtenbeek,Lieke A.等“鼠李糖乳酪杆菌通过锰限制阻碍李斯特菌属种在农家干酪中的生长(Lacticaseibacillus rhamnosus impedes growth of Listeria spp.incottage cheese through manganese limitation).”Foods 10.6(2021):1353)。锰(Mn)是必需的痕量元素，是所有生命界中的关键辅因子，使其对细菌、酵母和霉菌的生长很重要。此外，低锰浓度可充当李斯特菌生长的限制因素。
WO2019/202003公开了通过使用具有锰摄取活性的细菌进行真菌抑制。LAB中两种主要的锰摄取系统是NRAMP型转运蛋白MntH和ABC转运蛋白SitABC。ABC转运蛋白主要在中性pH值下具有活性，而质子驱动的同向转运蛋白MntH是酸性条件下的主要转运系统。特别地，MntH的高表达显著促进锰摄取，这限制了锰对其他微生物生长的可用性(Siedler等，2000)。
出于经济和环境原因，一直需要有效控制微生物腐败或污染的改善的策略。
发明内容
本申请涉及通过锰耗尽来抑制微生物生长。本发明人首次发现，当锰转运蛋白MntH1转录的阻遏物机制被破坏时，乳杆菌属(Lactobacillus)菌株能够在环境中存在较高锰浓度的情况下清除锰。
基于此，现在有可能提供锰摄取能力得到改善的菌株。这使得它们尤其可用于具有较高锰水平的产品中的应用，因为所述菌株的摄取能力得到改善。
如下面将详细描述的，锰转运调控物MntR(也被称为“MntR蛋白质”或简称为“MntR”)充当mntH1转录的阻遏物。根据本申请的细菌的特征在于灭活的MntR蛋白质和/或用于MntR的对应结合位点。这可以通过直接筛选具有此类特征的细菌，或者通过使野生型母菌株中的相关基因突变并从中选择具有更高锰清除活性的突变体来提供。
在第一方面，本申请提供一种改善乳杆菌属菌株的锰清除活性的方法，其包括：
-提供一种或多种表达锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株作为母菌株，
-从所述母菌株获得一个或多个突变体，其中将锰转运调控物MntR或其在mntH1基因上游的结合位点灭活，以及
-从所获得的突变体中选择一种或多种锰清除活性与所述母菌株相比更高的子代乳杆菌属菌株
选择步骤可在合适的培养基中以预定的锰浓度(诸如0.135mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L或1.0mg/L)进行。
优选地，乳杆菌属菌株属于唾液乳杆菌(L.salivarius)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)、开菲尔乳杆菌(L.kefiri)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、玉米乳杆菌(L.zeae)、泡菜乳杆菌(L.kimchicus)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、干酪乳杆菌(L.casei)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)和发酵乳杆菌(L.fermentum)的种。最优选地，乳杆菌属菌株属于弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。
在又一方面，本申请提供包含锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属种，其特征在于所述菌株包含灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点。
优选地，乳杆菌属菌株属于唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、消化乳杆菌、玉米乳杆菌、泡菜乳杆菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。最优选地，乳杆菌属菌株属于弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。
在另一方面，本申请提供一种减少产品、优选食品或饲料产品中游离锰的方法，其包括以下步骤：
-选择一种或多种清除锰的乳杆菌属菌株，其包含锰转运蛋白MntH1和灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，
-将所述一种或多种乳杆菌属菌株优选作为直投式(DVS)培养组合物添加到所述产品中，从而减少游离锰。
乳杆菌属的锰清除活性可导致不想要的微生物(诸如酵母、霉菌和/或其他细菌，诸如李斯特菌)的生长的抑制或延迟。
还优选将产品中的锰降低至低于0.01ppm、优选低于约0.008ppm且更优选低于0.006ppm的浓度。
本申请另外提供一种或多种具有改善的锰清除活性的乳杆菌属菌株的组合物，其可呈冷冻、干燥或冷冻干燥的形式，例如作为优选具有至少106菌落形成单位/g(cfu/g)(诸如至少107、至少108、至少109或至少1010cfu/g)的浓度的直投式(DVS)培养物。所述组合物可进一步包含另外的细菌，诸如乳酸菌，包括嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
在又一方面，本申请提供一种或多种具有改善的锰清除活性的乳杆菌属菌株用于抑制或延迟食品或饲料产品中的真菌或李斯特菌生长的用途。优选地，该用途在葡萄糖存在下进行。本发明人已惊讶地发现，锰摄取可在此类条件下增加。
葡萄糖可能已存在于所应用的产品中。或者，其可通过直接添加或以间接方式(例如通过添加至少一种能够释放葡萄糖作为代谢物的乳酸菌菌株)来补充。在优选的实施方案中，该用途在至少0.2g/L葡萄糖(诸如至少0.5g/L葡萄糖，诸如至少1.0g/L葡萄糖，诸如至少2.0g/L葡萄糖，诸如至少3.0g/L葡萄糖，诸如至少4.0g/L葡萄糖，诸如至少5.0g/L葡萄糖)存在下进行。
本发明还提供包含本文所述的一种或多种清除锰的乳杆菌属菌株的产品，诸如食物产品、饲料产品、化妆品、保健产品或药物产品。此类产品可以是发酵的食物产品、乳制品、乳品类似物产品、肉类产品、肉类似物产品或植物产品等。
在整个本公开中，基因名称用斜体字母表示，并且与基因相关的蛋白质用第一个字母大写的非斜体字母表示。
附图说明
图1描绘了对于副干酪乳杆菌母菌株(黑色圆圈)和其mntR缺失突变体LpMntR(灰色菱形)，在乳(图1A)和补充有0.5％葡萄糖的乳(图1B)中在37℃孵育24小时后，在补充有所指示的锰浓度的乳中测量的pH。显示了三个生物学独立实验的单个值和平均值。
图2描绘了对于副干酪乳杆菌母菌株(黑色圆圈)和其mntR缺失突变体LpMntR(灰色菱形)，在乳(图2A)和补充有0.5％葡萄糖的乳(图2B)中在37℃孵育24小时后，在补充有所指示的锰浓度的乳中测量的红色荧光。显示了三个生物学独立实验的单个值和平均值。
图3描绘了酵母抑制测定的结果。在补充有所指示的锰浓度而不添加葡萄糖(图3A)或添加葡萄糖(图3B)的乳中生长24小时后，以生物重复进行生物测定，并将约20 CFU的汉逊德巴利酵母(D.hansenii)引入到样品中。在17℃孵育5天后，将1000倍稀释物点样在选择性YGC板上。在室温下孵育两天后拍摄照片。显示了每种菌株的两个生物独立实验的结果。
图4描绘了补充有所指示的锰浓度的乳中，在乳中在37℃孵育21小时期间，CHCC15860(图4A)和LrMntR(图4B)的酸化。
图5描绘了酵母抑制测定的结果。使所指示的菌株在补充有所指示的锰浓度的乳中生长24小时后，进行生物测定。为此，将约20CFU的汉逊德巴利酵母引入到样品中。在17℃孵育4天后，将100倍稀释物点样在选择性YGC板上。在室温下孵育两天后拍摄照片。没有酵母生长指示抑制，而酵母生长指示在给定条件下没有被生物保护性菌株抑制。
具体实施方式
锰转运蛋白
已知用于锰的转运系统并且例如描述于Kehres等，“细菌中锰转运、生物化学和发病机制的新兴主题.”FEMS microbiology reviews 27.2-3(2003):263-290中。细菌Mn2+转运蛋白包括ABC转运蛋白(例如SitABCD和YfeABCD)或质子依赖性Nramp相关转运蛋白。
ABC转运蛋白主要在较高的pH值下具有活性，而质子驱动的转运蛋白在酸性条件下更具活性。因此，质子驱动的转运蛋白特别可用作发酵食品或饲料产品中的锰清除剂。
MntH属于在由转运分类数据库(Transport Classification Database)给出的转运蛋白分类系统中指定为TC#2.A.55的金属离子(Mn2+-铁)转运蛋白(Nramp)家族(M.Saier；U of CA,San Diego,Saier MH,Reddy VS,Tamang DG,Vastermark A.(2014))。TC系统是用于转运蛋白质的分类系统，其类似于用于酶分类的酶委员会(Enzyme Commission,EC)系统。转运蛋白分类(TC)系统是由国际生物化学和分子生物学联盟(International Unionof Biochemistry and Molecular Biology)批准的转运蛋白质分类命名系统。TCDB可在http://www.tcdb.org免费访问，该网站提供了几种不同的用于访问数据的方法，包括逐步访问分级分类、按序列或TC编号直接搜索和全文搜索。不同的MntH同源物转运蛋白已由Groot等“植物乳杆菌中推定锰转运系统的基于基因组的计算机检测和其遗传分析(Genome-based in silico detection of putative manganese transport systems inLactobacillus plantarum and their genetic analysis).”Microbiology 151.4(2005):1229-1238描述。本发明特别涉及表达锰转运蛋白MntH1和其转录调控物的细菌。
锰转运蛋白调控物MntR
锰转运调控物MntR是可被Mn2+活化以阻抑锰转运蛋白转录的金属蛋白质转录调控物。MntR通过协调输入蛋白和输出蛋白(取决于生物体)的转录来控制细胞内Mn2+水平。MntR形成同型二聚体，所述同型二聚体通过每个亚基结合一个Mn2+离子，经历构象变化，这增加了对其DNA结合位点的亲和力。
关于Mn2+代谢的功能和调控的最初研究集中在作为模式生物体的大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。随后在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中以及在某种程度上在链球菌(streptococci)和乳球菌(lactococci)中进行了研究，例如，如Que等2000(“枯草芽孢杆菌中的锰稳态由与白喉毒素阻遏物蛋白质家族相关的双功能调控物MntR调控(Manganese homeostasis in Bacillus subtilis is regulated by MntR,abifunctional regulator related to the diphtheria toxin repressor family ofproteins).”Molecular microbiology 35.6(2000):1454-1468)中所述。
在枯草芽孢杆菌中，已显示需要严格调控来正确平衡Mn的细胞内浓度，Mn是一种必需但有毒的痕量元素。观察到枯草芽孢杆菌mntR缺失突变体组成型表达MntH和MntABC两者，这导致Mn2+中毒(Huang等“枯草芽孢杆菌MntR协调锰摄取和外排系统的转录调控(Bacillus subtilis MntR coordinates the transcriptional regulation ofmanganese uptake and efflux systems).”Molecular microbiology 103.2(2017):253-268)。
尽管这种金属离子在这些细菌的整体生理学中很重要，但尚未在乳酸菌(诸如乳杆菌)中研究Mn2+摄取调控(Bosma,Elleke F.等“锰在细菌中的调控和独特生理作用(Regulation and distinct physiological roles of manganese in bacteria)”FEMSMicrobiology Reviews(2021))。
本发明人发现，乳杆菌中MntR的灭活增加锰清除活性，但不会导致细胞死亡。因此，此类细菌可因其改善的锰清除能力而被有利地利用。这是令人惊讶的，因为已知Mn2+的过量积累可主要通过蛋白质的误金属化(mismetallation)而容易地导致细胞毒性，如在枯草芽孢杆菌的情况下所示。
有用的乳杆菌可通过直接筛选缺乏功能性阻遏机制的野生型细菌，或者通过使野生型母菌株中的相关基因突变并从中选择具有更高锰清除活性的突变体来提供。可例如突变mntR基因、其调控序列或用于MntR的结合位点，例如通过取代、截短、缺失、点突变和/或敲除。
清除锰的乳杆菌
根据本发明的一种或多种乳杆菌属菌株表达锰转运蛋白二价金属阳离子转运蛋白MntH1，所述蛋白质属于TC#2.A.55.2.6家族。MntH1是本领域已知的被鉴别为对于锰清除活性来说重要的锰转运蛋白(Siedler等，2020)。
本申请另外提供SEQ ID NO:1-15的示例性MntH1序列。优选地，一种或多种乳杆菌属菌株表达如SEQ ID NO:1-15中所示的MntH1转运蛋白或其同源序列。
发现MntH1在副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中高度表达，但在其他乳杆菌属种中也是可能的。确定给定的乳杆菌属是否表达MntH1转运蛋白在本领域技术人员能力范围内。例如，这可以使用已知方法(例如如出版物Siedler等2020中所述)来确定。
优选地，乳杆菌属菌株属于唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、消化乳杆菌、玉米乳杆菌、泡菜乳杆菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。最优选地，乳杆菌属菌株属于弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。
在优选的实施方案中，乳杆菌属菌株包含与SEQ ID NO:1-15中任一个的序列，优选与SEQ ID NO:1或2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
出于本发明的目的，两个多肽序列之间的“序列同一性”程度是使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等2000，Trends Genet.16:276-277)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定的。可使用如Madeira,Fábio等“2019年的EMBL-EBI搜索和序列分析工具API(The EMBL-EBI search and sequence analysis toolsAPIs in 2019).”Nucleic acids research 47.W1(2019):W636-W641中所述的EMBOSSNeedle比对。所用的任选参数是10的缺口开放罚分(gap open penalty)、0.5的缺口延伸罚分(gap extension penalty)和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵(substitution matrix)。使用标记为“最长同一性(longest identity)”(使用nobrief选项获得)的Needle输出作为同一性百分比，并计算如下：
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
表1显示编码MntH1的示例性序列和它们与SEQ ID NO:1的序列同一性。
表1MntH1序列
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灭活的MntR和MntR结合位点
本申请的乳杆菌属菌株的特征在于灭活的MntR或位于mntH1基因上游的灭活的MntR结合位点，这意味着缺乏对mntH1转录的阻遏。可使用本领域技术人员已知的方法，例如通过取代、截短、缺失、点突变和/或敲除来进行MntR或其结合位点的灭活。
当被Mn2+活化时，MntR充当阻遏物并结合到用于mntH1的启动子区域附近的操纵子位点(也被称为“用于MntR的结合位点”或简称为“结合位点”)，从而阻遏mntH的转录。结合位点可位于启动子元件和起始密码子之间。结合位点在乳杆菌中高度保守，并且具有列为SEQ ID NO:16的序列基序，所述序列基序具有DDDKWWRSKNNNCHWAMMA的多核苷酸序列(其中M表示A或C；R表示A或G；W表示A或T；S表示C或G；K表示G或T；H表示A、C或T；D表示A、G或T；N表示A、C、G或T)。基于表2中所示的在多个细菌种中鉴别为SEQ ID NO:17-30(RegPresice,Novichkov等“RegPrecise 3.0——用于基因组规模探索细菌转录调控的资源(RegPrecise3.0–a resource for genome-scale exploration of transcriptional regulation inbacteria).”BMC genomics 14.1(2013):1-12)的TF结合位点数据制备序列基序。
表2MntR结合位点序列和序列基序
序列基序可被描述为表3中所示的位置特异性概率矩阵。
表3用于序列基序的位置特异性概率矩阵
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结合位点的灭活可使用本领域技术人员已知的方法进行，以使其无功能。这优选通过截短、完全或部分缺失和/或敲除来进行。
如本文所用，“灭活”在本发明的精神内是指在足够的锰存在下，MntR不能结合到位于mntH1的启动子区域附近的操纵子位点(“结合位点”)。这可能是例如由于缺乏功能性MntR或MntR的功能性结合位点。可根据本领域已知的方法(诸如可用于研究DNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动测定(EMSA))来确定“灭活”。该技术基于以下事实：DNA-蛋白质复合物在天然聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中比未结合的DNA迁移得慢，导致标记的DNA条带的迁移“移位”。为此，可按照制造商的方案使用Thermo Scientific LightShift化学发光EMSA试剂盒。为了确定给定的MntR是否能够结合到操纵子位点，可用含有操纵子位点的经扩增DNA和含有MntR蛋白质的溶液进行测试，锰浓度范围为0mg/L到20mg/L。作为参考对照条件，应使用含有SEQ ID NO:20的DNA序列和具有SEQ ID NO:31的MntR。与参考条件相比，在0.135mg/L或更高的锰浓度下结合能力的降低被认为是灭活。
确定MntR蛋白质无活性的另一种方式是分析mntR基因序列以观察其是否包含可引起蛋白质灭活的修饰，例如基于折叠预测。
MntR是DtxR的同源物，DtxR是控制白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)中的铁转运功能的经充分表征的二价金属离子依赖性阻遏物。在结构上，MntR在隔开的两个结合位点(标记为A和C)处与Mn2+形成双核复合物。(Kliegman,Joseph I.等“枯草芽孢杆菌锰转运调控物金属选择性活化的结构基础(Structural basis for the metal-selectiveactivation of the manganese transport regulator of Bacillus subtilis).”Biochemistry 45.11(2006):3493-3505；McGuire等“A和C位点在MntR的锰特异性活化中的作用(Roles of the A and C sites in the manganese-specific activation ofMntR).”Biochemistry 52.4(2013):701-713)。MntR和相关蛋白质的结构已由Chen等，2017(“金属调节物MntR在控制细菌抗氧化应激方面的过氧化氢传感机制的分子见解(Molecular insights into hydrogen peroxide-sensing mechanism of themetalloregulator MNTR in controlling bacterial resistance to oxidativestresss).”Journal of Biological Chemistry292.13(2017):5519-5531)研究。
突变可以是出现提前终止密码子，或例如引起移码的插入、缺失、突变等。在优选的实施方案中，突变发生在存在于N末端DNA结合结构域、C末端二聚化结构域或位于两者之间的金属结合位点上的MntR中的半胱氨酸残基上。
还应当理解，如果给定菌株诸如由于缺乏mntR基因而不表达MntR，则其包含灭活的MntR。这是如本申请中例示的突变体的情况。
锰清除活性的改善
基于发现，本发明人提供改善乳杆菌属菌株的锰清除活性的策略。如本文所定义，术语“锰清除活性”或“锰摄取活性”是指当在允许细菌输入游离锰的条件下培养时细菌输入游离锰的能力。“改善的锰清除活性”可通过在0.135mg/L或更高的锰浓度下摄取锰的能力来观察。这可以确定如下：使待分析的菌株在巴氏灭菌的牛乳中在37℃生长24小时(牛乳将含有固有的锰，所述锰通常为约0.06mg/L，但可根据乳而变化)。然后，将两个重复的发酵乳(150μL)转移到96微量滴定板，并向一半样品中添加锰到最终浓度为6mg/L，且向另一半样品中添加锰到最终浓度为0.135mg/L(应考虑乳中已存在的锰来确定所述浓度)。然后，将每克产品50-100CFU的汉逊德巴利酵母(例如CHCC16374)接种到有锰和无锰的发酵乳中，以确定锰是否耗尽。在17℃孵育4天后，将稀释行的样品点样在选择性YGC琼脂板上以分析酵母生长。酵母生长可通过光学检查来计数。如果观察到0.135mg/L和6mg/L之间的差异，则显示出改善的锰清除。
在进行突变的情况下，可通过获得MntR蛋白质或对应的结合位点被灭活的突变体并从与母菌株相比锰清除活性增加的突变体子代菌株中选择来实现增加。在优选的实施方案中，在具有0.135mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L或1.0mg/L的锰浓度的乳中，与母菌株相比，子代乳杆菌属菌株具有更高的锰清除活性。
本发明的方法包括以下步骤：
-提供一种或多种表达锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株作为母菌株，
-从所述母菌株获得一个或多个突变体，其中将锰转运蛋白调控物MntR或其在mntH1上游的结合位点灭活，以及
-从所获得的突变体中选择一种或多种与所述母菌株相比具有增加的更高锰清除活性的子代乳杆菌属菌株。
术语“表达MntH1蛋白质”是指当细胞处于存活状态时表达所述蛋白质的能力。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
-提供一种或多种表达锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株作为母菌株，
-优选通过取代、截短、缺失、点突变和/或敲除，使所述母菌株中一个或多个编码MntR或调控编码MntR的基因表达的基因突变，或使mntH1上游的MntR的结合位点突变，以从所述母菌株获得一个或多个突变体，其中将锰转运蛋白调控物MntR或其在mntH1上游的结合位点灭活，以及
-从所获得的突变体中选择一种或多种与所述母菌株相比具有更高的锰清除活性的子代乳杆菌属菌株，
在相同条件下，优选在具有预定锰浓度(诸如0.135mg/L或更高的锰浓度)的合适培养基中，对母菌株和子代菌株进行比较。锰浓度可根据母菌株的锰清除能力以及食物产品的类型和子代菌株预期所用的食物产品中待清除的锰的量来预先确定。
在另一实施方案中，本方法包括：
-提供一种或多种表达锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株作为母菌株，
-通过全部或部分缺失所述母菌株中一个或多个编码MntR蛋白质和/或调控编码MntR蛋白质的基因表达的基因，使所述一或多个基因突变；
-从所述母菌株获得一个或多个突变体，其中将MntR或其在mntH1上游的结合位点灭活，以及
-从所获得的突变体中选择一种或多种与所述母菌株相比具有更高的锰清除活性的子代乳杆菌属菌株。
锰清除活性可通过其抑制酵母汉逊德巴利酵母的能力来评估。在优选的实施方案中，在相同条件下，优选在0.135mg/L或更高的锰浓度下，所选子代菌株展现出比母菌株更高的对汉逊德巴利酵母的抑制活性。
本发明的另一方面提供包含通过本文所公开的本发明方法获得的一种或多种子代菌株的组合物。
MntR序列
根据本发明的合适的母菌株包含作为mntH1基因的转录因子的锰转运调控物MntR。应当理解，母菌株的MntR蛋白质是“功能活性的”。MntR已由例如Chen等2017在分子水平上进行详细研究。
表4显示编码MntR的示例性序列和它们与SEQ ID NO:31的序列同一性。
表4MntR序列
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由于转录因子MntR在乳杆菌中普遍存在，因此通常预期转录因子将在细菌中存在并具有功能活性，即充当mntH1基因的阻遏物。作为阻遏物，它将结合到mntH1基因上游的对应结合位点以防止转录。术语“上游”是指从特定参考点朝向多核苷酸的5’端的位置。本领域技术人员理解，结合位点可操作地连接到mntH1基因，并且其间的距离可根据细菌而变化。例如，结合位点和起始密码子可相隔小于500个碱基对，诸如相隔小于400个碱基对，诸如相隔小于300个碱基对。
例如，母菌株的MntR蛋白质可与SEQ ID NO:31-44中的任一序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％序列同一性。
优选地，母菌株的MntR蛋白质可与SEQ ID NO:31中的任一序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％或100％序列同一性。
从母菌株获得突变体
从作为母菌株的包含锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属中，可能获得一种或多种其中MntR无活性的突变体。这可能是由于缺乏功能性MntR或MntR的功能性结合位点。
在本上下文中，术语“突变体”应理解为借助于例如遗传改造、辐射和/或化学处理从本发明菌株或母菌株得到的菌株或可得到的菌株。突变体可通过使本发明菌株经受任何常用的诱变处理(包括用诸如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)的化学诱变剂、UV光处理)而获得的菌株，或自发地发生的突变体。突变体可能已经受若干诱变处理(单次处理应理解为一个诱变步骤、之后是筛选/选择步骤)，但目前优选地，实施不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与母菌株相比，细菌基因组中小于5％或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸已与另一核苷酸交换，或缺失。
优选在存在于MntR中的半胱氨酸残基上引入突变。还可在N末端DNA结合结构域、C末端二聚化结构域或位于两者之间的金属结合位点上进行突变。
可通过各种手段进行MntR的灭活。可通过引入到mntR基因中的合适修饰使蛋白质灭活，所述修饰包括但不限于例如引起移码的插入、终止密码子、缺失或取代。在本申请的范围内，突变还将包括控制MntR表达的调控序列中的突变。此类突变将导致MntR表达的降低或缺失。例如，在mntR基因中引入终止密码子或移码插入可产生非功能基因，该非功能基因将例如不表达MntR蛋白质或表达部分长度的无活性MntR蛋白质。
特别地，可使用DNA重组技术。引入突变的其他常规方法是通过将合适的DNA片段同源重组到基因序列中(例如，通过使用可公开获得的pGhost载体或通过其他克隆载体)。所引入的片段可含有例如无义(终止)密码子、移码突变、缺失、突变或插入。在一些实施方案中，突变包括N末端缺失或C末端缺失。选择适当的策略来例如引入mntR基因的合适修饰以使MntR蛋白质灭活是技术人员的常规工作。或者，可随机诱变(例如通过UV辐射)并选择使MntR蛋白质或相关序列灭活的突变。遗传修饰技术以及非遗传修饰技术两者均可用于本申请中。遗传修饰技术提供直接的修饰，而如果区域规则或市场需求需要，则优选非遗传修饰策略。
具有灭活的MntR的乳酸杆菌
本申请进一步包括通过当前所公开的方法获得或可获得的乳杆菌。还可能通过从野生型菌株中选择那些具有灭活的MntR的菌株来提供此类菌株。
在优选的实施方案中，MntR蛋白质被灭活，例如由于移码或编码该蛋白质的终止密码子序列。有用的菌株属于唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、消化乳杆菌、玉米乳杆菌、嗜泡菜乳杆菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。更优选地，乳杆菌属菌株属于弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌的种。
因此，本申请提供属于以下种的乳杆菌属菌株：唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、消化乳杆菌、玉米乳杆菌、泡菜乳杆菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活MntR结合位点。MntH1优选是与SEQ ID NO:1-15中的任一序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在优选的实施方案中，本申请提供副干酪乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQID NO:1或2中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选干酪乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:3中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选鼠李糖乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的MntR的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:4中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选植物乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:5中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选唾液乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:6中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选发酵乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:7中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选清酒乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:8中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选罗伊氏乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:9中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选短乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:10中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选开菲尔乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:11中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选消化乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:12中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选弯曲乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:13中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选玉米乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:14中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
在另一优选的实施方案中，本申请提供乳杆菌属菌株，优选泡菜乳杆菌，其包含锰转运蛋白MntH1、灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，其中MntH1优选是与SEQ ID NO:15中的任一序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
鉴于许多乳杆菌属种是具有公认安全(GRAS)状态的经充分表征的食品级乳酸菌(LAB)，本文所提供的菌株可有利地用作食品工业中的起子培养物。本申请提供包含本文所公开的可用作起子培养物的乳杆菌属菌株的组合物。在后一种情况下，组合物可另外包含用于发酵食物产品的其他起子细菌。本领域技术人员能够基于食物产品的类型来选择合适的起子细菌。本发明可用于制备食物产品，包括发酵的食物产品，诸如乳制品(包括干酪)、肉类产品或发酵的乳品似物或肉类似物产品和其他基于植物的食物产品。
锰摄取活性可使用本领域已知的常规方法测量，参见例如Kehres等“鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的NRAMP蛋白质是参与对活性氧的反应的选择性锰转运蛋白质(The NRAMPproteins of Salmonella typhimurium and Escherichia coli are selectivemanganese transporters involved in the response to reactive oxygen).”Molecular microbiology 36.5(2000):1085-1100。或者，锰清除活性可经由描述为以下测定的酵母抑制测定来确定：使待分析的菌株在巴氏灭菌的牛乳中在37℃生长24小时。然后，将两个重复的发酵乳(150μL)转移到96微量滴定板，并向一半样品中添加锰到最终浓度为6mg/L。然后，将每克产品50-100CFU的汉逊德巴利酵母(例如CHCC16374)接种到添加锰和不添加锰的发酵乳中，以确定锰是否耗尽。在17℃孵育4天后，将稀释行的样品点样在选择性YGC琼脂板上以分析酵母生长。酵母生长可通过光学检查来计数。如果观察到添加锰或不添加锰之间的差异，则显示出来自测试菌株的锰清除。
组合物
在一个方面，本申请提供包含本发明的乳杆菌的组合物，优选直投式组合物。有利地，所述细菌可作为冷冻或冷冻干燥培养物供应给所述工业，以用于批量起子繁殖，或作为预定用于直接接种到发酵器皿或桶中的所谓的“直投式”(DVS)培养物供应给所述工业，以用于生产发酵产品，诸如发酵的乳制品，如干酪。起子培养物组合物优选呈冷冻、干燥或冷冻干燥形式，例如作为直投式(DVS)培养物。优选地，组合物具有至少106菌落形成单位/g(cfu/g)(诸如至少107、至少108、至少109或至少1010cfu/g)的浓度。
然而，组合物还可以是在将冷冻、干燥或冷冻干燥的细胞浓缩物悬浮在诸如水或PBS缓冲液的液体介质中后获得的液体。当本发明的组合物是悬浮液时，活细胞的浓度在104至1012CFU(菌落形成单位)/ml组合物的范围内，包括至少104CFU/ml组合物，诸如至少105CFU/ml，例如至少106CFU/ml，诸如至少106CFU/ml，例如至少108CFU/ml，诸如至少109CFU/ml，例如至少1010CFU/ml，诸如至少1011CFU/ml。
本发明的组合物可另外包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、营养素、填充剂、调味剂或它们的混合物。组合物可以呈冷冻或冷冻干燥的形式。组合物优选包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养物中的一种或多种，更优选冷冻保护剂、冻干保护剂和/或抗氧化剂，且最优选冷冻保护剂或冻干保护剂，或两者。诸如冷冻保护剂和冻干保护剂的保护剂的使用是本领域技术人员已知的。合适的冷冻保护剂或冻干保护剂包括单糖、二糖、三糖和多糖(诸如葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精、淀粉和阿拉伯胶(gum arabic,acacia)等)、多元醇(诸如赤藓醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、苏糖醇、木糖醇等)、氨基酸(诸如脯氨酸、谷氨酸)、复合物质(诸如脱脂乳、蛋白胨、明胶、酵母提取物)和无机化合物(诸如三聚磷酸钠)。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸和其盐、没食子酸盐、半胱氨酸、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖。合适的营养素包括糖、氨基酸、脂肪酸、矿物质、痕量元素、维生素(诸如B族维生素、维生素C)。组合物可任选地包含另外的物质，包括填充剂(诸如乳糖、麦芽糖糊精)和/或调味剂。
在制备此类组合物时，优选不包括过多的锰，因为当随后应用于食物产品中时，细菌可能变得在抑制或延迟李斯特菌生长方面不太有效，如WO2021/078764中所述。优选地，组合物包含至多600ppm的锰，并且其中乳酸菌菌落形成单位/g的浓度为至少106菌落形成单位/g(cfu/g)，诸如至少107、至少108、至少109或至少1010cfu/g。在优选实施方案中，此类产品包含10-600ppm的锰、30-600ppm的锰、35-600ppm的锰、40-600ppm的锰、45-600ppm的锰、50-600ppm的锰、60-550ppm的锰、100-500ppm的锰、150-450ppm的锰、190-400ppm的锰、200-350ppm的锰、250-300ppm的锰。
用途
在又一方面，清除锰的乳杆菌属菌株或包含所述菌株的组合物可用于减少游离锰和/或抑制或延迟真菌(酵母和/霉菌)或李斯特菌生长。
由于已知锰是真菌生长的重要生长限制因素，因此可能使用本文所公开的细菌来降低产品中游离锰的水平。游离锰浓度优选降低至低于约0.01ppm，诸如低于约0.008ppm，低于约0.006ppm或低于约0.003ppm。通过此类用途，可获得不想要的酵母和/或霉菌几乎不能在其中繁殖的产品。设想此类腐败预防策略甚至适用于食物产品以外的产品，并延伸到通常易于受到微生物污染的其他产品，诸如饲料产品、化妆品、生物产品、健康护理产品、药物产品等。
此外，已知李斯特菌生长也可因锰耗尽而被抑制或延迟(van Gijtenbeek等，2021)。因此，使用本发明的乳杆菌，可通过在食物产品的保存期期间控制李斯特菌的生长来确保食物安全。
根据本申请的“游离锰”或有时“锰”是指存在于产品中(即形成产品的一部分，诸如在产品内或在产品的表面上)的可被真菌(包括酵母和霉菌)或其他细菌摄取的锰。例如，游离锰是指存在于产品基质中的锰。
优选地，该用途在葡萄糖存在下在所施用的产品中进行。本发明人已惊讶地发现，锰清除活性在葡萄糖存在下增加。在优选的实施方案中，该用途在产品中存在至少0.2g/L葡萄糖(诸如至少0.5g/L葡萄糖，诸如至少1.0g/L葡萄糖，诸如至少2.0g/L葡萄糖，诸如至少3.0g/L葡萄糖，诸如至少4.0g/L葡萄糖，诸如至少5.0g/L葡萄糖)的情况下进行。
一般来说，抑制意指细胞或微生物的功能和活性的降低(无论是部分还是全部)。如本文所用，与微生物有关的术语“抑制(to inhibit)”和“抑制(inhibiting)”意指给定微生物的生长、数量或浓度相同或减少。这可以通过微生物学领域中已知的任何方法来测量。可通过将具有减少的游离锰的产品中或该产品上的生长、数量或浓度与对照进行比较来观察抑制。对照可以是相同的产品，但不含减少的游离锰。术语“延迟”一般意指停止、推迟、阻碍或引起某事比正常情况更慢地发生的行为。如本文所用，“延迟微生物的生长”是指推迟所述微生物的生长的行为。这以可通过比较两种产品中微生物生长到给定水平所需的时间来观察，所述产品中的一种具有减少的锰而另一种没有(但其他方面相同)。在一些实施方案中，“延迟生长”是指延迟7天或更长时间。
可用本领域技术人员已知的各种方法测量真菌或李斯特菌生长。例如，真菌生长可通过菌落的密度或大小、细胞数量、菌丝团变化、孢子产生、菌丝生长、菌落形成单位(CFU)等来测量，这取决于真菌类型和应用所述方法的产品。还可通过测量营养素或代谢物浓度的变化(诸如二氧化碳释放和氧气摄取)来观察真菌生长。还可使用本领域已知的常规计数方法来确定李斯特菌生长。可应用美国FDA的细菌学分析手册(BacteriologicalAnalytical Manual,BAM)中的标准方案(Hitchins等，“BAM：单核细胞增生李斯特菌的检测和计数(BAM:Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes).”细菌学分析手册(2016))或由欧洲和国际标准方法(European and International Standard method)ENISO 11290-1:2017公布的方案(ISO,PNEN.“11290–1:2017.食物链的微生物学—用于单核细胞增生李斯特菌和李斯特菌属种的检测和计数的水平方法(Microbiology of the foodchain—Horizontal method for the detection and enumeration of Listeriamonocytogenes and of Listeria spp.)”)。还可使用其他方法，诸如Law等“深入了解食品中单核细胞增生李斯特菌的分离、计数和分子检测(An insight into the isolation,enumeration,and molecular detection of Listeria monocytogenes in food).”Frontiers in microbiology 6(2015):1227中所述。
此外，本申请提供本文所述的一种或多种清除锰的乳杆菌属菌株或组合物用于制备发酵食物产品的用途。此类食物产品优选是发酵的乳品或乳品类似物产品，包括酸乳、干酪和对应的类似物产品。
除了乳之外，“乳制品”还包括来源于乳的产品，诸如奶油、冰淇淋、黄油、干酪和酸乳，以及次级产品，诸如抗乳血清和酪蛋白，以及含有乳或乳组分作为主要成分的任何制备食品，诸如配方乳。在一个优选的实施方案中，乳制品是发酵乳制品。“乳”通常被理解为通过给任何哺乳动物(诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶而获得的乳分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。
乳品或肉类似物产品是指所制备的乳品类或肉类产品，它们是用作乳品或肉类产品的烹饪替代物的产品，其中一种或多种动物组分已用其他成分替代并且所得食物类似于原始产品。“乳品类似物产品”包括衍生自基于植物的乳(诸如豆乳)的产品。出于本申请的目的，术语“乳”应理解为包括由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液，例如豆乳。
减少游离锰的方法
在又一方面，本申请提供减少产品(诸如包括发酵的食物产品在内的食物产品)中游离锰的方法，所述方法包括以下步骤：
-选择一种或多种包含锰转运蛋白MntH1的清除锰的乳杆菌属菌株，其特征在于所述菌株包含灭活的MntR和/或mntH1上游的MntR的灭活的结合位点，
-将所述一种或多种乳杆菌属菌株优选作为直投式(DVS)培养组合物添加到所述产品中。
当应用于食物产品时，所述方法可进一步包括将所述食物产品发酵到目标pH值的步骤。锰清除活性可导致不想要的微生物(诸如酵母、霉菌和/或李斯特菌)的生长的抑制或延迟。
优选将产品中的锰减少至低于约0.01ppm、优选低于约0.008ppm、或低于约0.006ppm、优选低于约0.005ppm、低于约0.004ppm、低于约0.003ppm、低于约0.002ppm或低于约0.001ppm的浓度。
在一个优选的实施方案中，本申请涉及抑制或延迟食物产品中真菌生长的方法，其包括降低食物产品的食品基质中的游离锰浓度。如本文所用，术语“食品基质”是指食物的组成和结构。其基于营养素包含在连续介质中的概念。
术语“减少(reduce)”或“减少(reducing)”通常意指在给定背景下降低物质的量。如本文所用，术语“减少游离锰(to reduce free manganese)”或“减少游离锰(reducingfree manganese)”意指减少存在于产品中的可被真菌(包括酵母和霉菌)摄取的锰的量。
例如，这可以通过去除存在于产品中或将成为产品一部分的材料中的锰来进行。例如，这可以通过使原材料经受离子交换色谱以去除锰从而降低最终产品中的浓度来进行。
一旦接触，真菌就会迅速定殖，增加种群，并从其紧邻环境中摄取营养。在一些实施方案中，考虑到真菌可以首先在表面上与产品接触，在本发明的精神内，减少步骤在产品的部分上进行，例如在产品的外部部分(诸如涂层或外层)中进行。在此类情况下，减少步骤仍然会导致产品中浓度的总体降低。
如本文所用，锰浓度或锰水平以基于重量/重量计算的百万分率(“ppm”)表示。将产品中的游离锰减少到低于某一值的浓度意味着减少产品或其部分中的游离锰，使得按重量计整个产品中游离锰的浓度降低。确定痕量元素(诸如锰)的方法是本领域已知的并且描述于例如Nielsen,S.Suzanne编辑，食品分析(Food analysis).第86卷，Gaithersburg,MD:Aspen Publishers,1998中。
如本文所用，术语“约”指示略微在所引用值的值之外，即加或减0.1％至10％。因此，略微在所引用范围的浓度之外也被本发明的范围所涵盖。
测量低浓度锰的方法为本领域技术人员所熟知。此类方法包括原子吸收光谱、原子发射光谱、质谱、中子活化分析和x射线荧光测定(参见例如Williams等“锰的毒理学概况(Toxicological profile for manganese).”(2012))。
在一个实施方案中，所述方法用于抑制诸如以下的酵母的生长：念珠菌属(Candida)种、迈耶氏酵母属(Meyerozyma)种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)种、毕赤酵母属(Pichia)种、耐碱酵母属(Galactomyces)种、丝孢酵母属(Trichosporon)种、锁掷酵母属(Sporidiobolus)种、有孢圆酵母属(Torulaspora)种、隐球菌属(Cryptococcus)种、酵母属(Sacharomyces)种、耶氏酵母属(Yarrowia)种、德巴利酵母属(Debaryomyces)种和红酵母属(Rhodoturola)种。优选地，真菌是选自由以下组成的组的酵母：有孢圆酵母属种、隐球菌属种、酵母属种、耶氏酵母属种、德巴利酵母属种、念珠菌属的种和红酵母属种。更优选地，真菌是选自由以下组成的组的酵母：德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、长莓隐球菌(Cryptococcus fragicola)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、汉逊德巴利酵母和粘质红酵母(Rhodoturola mucilaginosa)。
在一个实施方案中，所述方法用于抑制霉菌的生长。优选地，真菌是选自由以下组成的组的霉菌：曲霉属(Aspergillus)种、枝孢霉属(Cladosporium)种、亚隔孢壳属(Didymella)种或青霉属(Penicillium)种。更优选地，真菌是选自由以下组成的组的霉菌：短密青霉(Penicillium brevicompactum)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、离生青霉(Penicillium solitum)、肉色青霉(Penicillium carneum)、酒青霉(Penicilliumpaneum)和罗克福尔青霉(Penicillium roqueforti)。
在一个实施方案中，所述方法用于抑制李斯特菌属的生长。截至2019年，已知李斯特菌属包含20个种：水生李斯特菌(L.aquatica)、布氏李斯特菌(L.booriae)、科氏李斯特菌(L.cornellensis)、哥斯达黎加李斯特菌(L.costaricensis)、山李斯特菌(L.goaensis)、菲氏李斯特菌(L.fleischmannii)、佛氏李斯特菌(L.floridensis)、大岛李斯特菌(L.grandensis)、格氏李斯特菌(L.grayi)、无害李斯特菌(L.innocua)、伊氏利斯特菌(L.ivanovii)、玛氏李斯特菌(L.marthii)、单核细胞增生李斯特菌、纽约李斯特菌(L.newyorkensis)、沙燕氏李斯特菌(L.riparia)、罗氏李斯特菌(L.rocourtiae)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、泰国李斯特菌(L.thailandensis)、玟氏李斯特菌(L.weihenstephanensis)和威氏李斯特菌(L.welshimeri)。两个众所周知的种是单核细胞增生李斯特菌或无害李斯特菌。已发现无害李斯特菌和李氏李斯特菌(L.listeria)在乳品环境中表现相似。无害李斯特菌通常被认为是非致病性的，并且在反映和预测对单核细胞增生李斯特菌的抑制的初步研究中用作替代物。此外，已报道了无害李斯特菌菌血症的致命病例(Perrin等，Journal of Clinical Microbiology 41.11(2003):5308-5309)。优选地，所述方法用于抑制单核细胞增生李斯特菌的生长。
当测量游离锰时，此类游离锰不包括在细胞内发现的锰。相反，游离锰是指在细胞外，即在产品的无细胞部分中发现的锰，因为它们可被其他微生物如酵母、霉菌或其他细菌摄取。因此，在此类情况下，应仅考虑细胞外锰来测量游离锰的浓度。这可以例如通过离心去除细胞(诸如起子培养物)并获得无细胞上清液，之后测量无细胞上清液中的锰来进行。
如本文所用，术语“细菌菌株”或“菌株”在微生物学领域具有其共同含义并且是指细菌的遗传变体。
当应用本发明方法时，本领域技术人员可首先确定待处理产品中存在的锰水平，然后相应地确定待施用的乳杆菌的量。食物产品的锰浓度已得到充分研究，并且可在诸如丹麦食物成分数据库(Danish Food Composition Databank)和加拿大营养档案(CanadianNutrient Files)的国家食物组成数据库中找到。通常，对于乳，锰以至少0.03ppm的浓度存在，使得乳制品易受真菌或李斯特菌污染。已报道，牛乳中的锰水平在0.04至0.1ppm范围，且山羊或绵羊乳中的锰水平最高达0.18ppm(Muehlhoff等，人类营养中的乳和乳制品(Milkand dairy products in human nutrition).联合国粮食及农业组织(Food andAgriculture Organization of the United Nations,FAO),2013)。对于发酵的乳制品如干酪，锰水平通常由于来自乳的浓缩过程而增加，通常最高达10倍或更高。已报道各种类型的干酪的不同水平，例如里科塔干酪(ricotta cheese)为约0.06ppm，奶油干酪为0.11ppm，布里干酪(brie)为0.34ppm，马苏里拉干酪(mozzarella)为0.3ppm，农家干酪(cottagecheese)为0.7ppm，高德干酪(gouda)为0.68ppm，且切达干酪(cheddar cheese)为0.74ppm(Smit,L.E.等，南非干酪的营养含量(The nutritional content of South Africancheeses).ARC-Animal Improvement Institute,1998；Gebhardt,Susan等，“美国农业部国家标准参考营养数据库(USDA national nutrient database for standard reference)，发布12.”United States Department of Agriculture,Agricultural ResearchService,1998)。在植物材料中发现更高的锰水平。
可根据如由欧洲标准化委员会(European Committee for Standardization)出版的欧洲标准EN13805:2014中的“食品-痕量元素的确定-加压溶出(Foodstuffs-Determination of trace elements-Pressure digestion)”中所述的标准程序、或如由国际标准化组织(International Organization for Standardization)出版的ISO 11885:2007中的“水质-通过电感耦合等离子体光发射光谱确定所选元素(Water quality-Determination of selected elements by inductively coupled plasma opticalemission spectrometry)(ICP-OES)”中所述的标准程序测量锰浓度。
产品
本发明还提供包含本文所述的一种或多种清除锰的乳杆菌属菌株或组合物的产品。在一些实施方案中，产品是食物产品、饲料产品、化妆品、健康护理产品或药物产品。“食品”和“食物产品”具有这些术语的共同含义。“食物产品”和“饲料产品”是指任何适合被人或动物食用的产品。此类产品可以是新鲜或易腐烂的食物产品以及储存或加工的食物产品。食物产品包括但不限于水果和蔬菜，包括衍生产品、谷物和谷物衍生产品、乳制品、肉类、家禽和海产食品。更优选地，食物产品是肉类产品或乳制品，诸如酸乳、特沃劳格奶酪(tvarog)、酸奶油、干酪等。食物产品通常具有约3.5到约6.5(诸如约4到约6，诸如约4.5到约5.5，诸如约5)的pH值。
易于真菌或李斯特菌腐败的主要食物类别是具有中到高的水活度的乳制品，诸如酸乳、奶油、黄油、干酪等。然而，还设想本发明适于具有较低水活度的食物产品，诸如加工肉类、谷物、坚果、香料、乳粉、干肉和发酵肉。
值得注意的是，锰可天然存在于许多食物来源中，包括叶菜、坚果、谷物和动物产品。常见食品中锰浓度的典型范围是例如谷物产品中的0.4-40ppm，肉类、家禽、鱼和蛋中的0.1-4ppm，蔬菜产品中的0.4-7ppm。乳中锰的浓度根据产生锰的动物、饲料以及季节而变化。通常，锰以至少0.03ppm的浓度存在于乳制品中，例如对于脱脂乳为0.08ppm，并且对于全脂乳为0.1ppm或更高。根据本发明人的当前发现，减少此类产品或由其制备的产品中的锰量将使它们更耐腐败。
本发明特别可用于抑制或延迟乳制品中的真菌生长。在此类产品中，酵母和霉菌的污染很常见，并且限制了此类产品的保存期。
制备乳品或乳品类似物产品的方法
本文所公开的方法特别可用于抑制或延迟发酵的乳品或乳品类似物产品中的酵母、霉菌和/或李斯特菌生长。
表述“发酵的乳制品”意指其中制备涉及用乳酸菌发酵乳基料的产品。如本文所用的“发酵乳制品”包括但不限于诸如嗜热产品(例如酸乳)和嗜温产品(诸如酸奶油)的产品。
在优选的实施方案中，发酵食物产品选自由以下组成的组：夸克(quark)、奶油干酪、清爽干酪、希腊酸乳、斯凯尔(skyr)、拉布尼(labneh)、酪乳、酸奶油、酸乳、培养乳、开菲尔(kefir)、拉西(lassi)、爱兰(ayran)、特瓦罗格(twarog)、杜赫(twarog)、斯美塔那(doogh)、优格(yakult)和达希(dahi)。
在另一优选的实施方案中，发酵食物产品是干酪，包括大陆型干酪、新鲜干酪、软干酪、切达干酪、马斯卡泊尼乳酪(mascarpone)、帕斯特费拉特干酪(pasta filata)、马苏里拉干酪、波萝伏洛干酪(provolone)、白卤干酪、比萨干酪(pizza cheese)、羊乳酪、布里干酪、卡门贝干酪(camembert)、农家干酪、埃丹干酪(Edam)、高德干酪、太尔西特干酪(Tilsiter)、哈瓦蒂干酪(Havarti)或埃曼塔尔干酪(Emmental)、瑞士干酪(Swiss cheese)和玛斯登干酪(Maasdamer)。
锰转运蛋白不存在于德氏乳杆菌保加利亚亚种中并且在嗜热链球菌中仅展示出低表达，这两种菌株见于酸乳起子培养物中，使得它们对于真菌腐败特别敏感。因此，优选包括一种或多种本发明的乳杆菌属菌株来清除存在于酸乳中的游离锰。
术语“酸乳”具有其通常的含义，并且一般根据本领域众所周知的相关官方法规和标准来定义。用于制作酸乳的起子培养物包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株。技术人员能够选择用于制备预期产品的合适起子培养物。
提供食物基质作为起始材料。为了制成发酵乳制品，食物基质是可任选地基于植物的乳基料。
“乳基料”在本申请中被广泛地用于指基于可用作用于起子培养物的生长和发酵的培养基的乳或乳组分的组合物。
乳基料包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳状产品的溶液/悬浮液，所述乳或乳状产品是诸如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉(reconstituted milk powder)、炼乳(condensed milk)、乳粉(dried milk)。其可由植物材料制备。
取决于消费者的需要，如果含有乳糖，则乳基料还可以是降乳糖的。降乳糖的乳可根据本领域已知的任何方法生产，包括通过乳糖酶将乳糖水解成葡萄糖，或者通过纳滤、电渗析、离子交换色谱和离心。
为了使乳基料发酵，添加起子培养物。如本上下文中使用的术语“起子培养物”是指一种或多种负责酸化乳基料的食品级微生物、特别是乳酸菌的培养物。
考虑到食物产品的性质，诸如水分活性、营养素、天然存在的锰的水平、保存期、储存条件、包装等，技术人员能够调整各种参数，诸如pH、温度、氧、碳水化合物的添加和起子培养物的量以及锰清除细菌，以实现期望的结果。
清除锰的细菌可在发酵之前、发酵开始或发酵期间添加。取决于所选参数，发酵可能需要数小时，诸如至少5小时，诸如至少10小时，诸如至少15小时，诸如至少20小时，诸如至少1天、2天、3天或更长时间。在一些实施方案中，发酵可能需要三、四、五、六个小时或更长时间。
这些条件包括适合特定起子培养物菌株的温度的设定。例如，当起子培养物包含嗜温乳酸菌时，可将温度设定为约30℃，并且如果培养物包含嗜热乳酸菌株，则将温度保持在约35℃到50℃(诸如40℃到45℃)范围内。发酵温度的设定还取决于一种或多种添加到发酵中的酶，这可由本领域普通技术人员容易地确定。在本发明的特定实施方案中，发酵温度为35℃到45℃，优选37℃到43℃，且更优选40℃到43℃。在另一实施方案中，发酵温度为15℃到35℃，优选20℃到35℃，且更优选30℃到35℃。
可使用本领域已知的任何方法终止发酵。一般来说，取决于工艺的各种参数，可通过使乳基料不适合起子培养物的一种或多种菌株生长来终止发酵。例如，当达到目标pH值时，可通过快速冷却发酵产品来进行终止。已知在发酵期间会发生酸化，导致形成由酪蛋白簇和链组成的三维网络。术语“目标pH值”意指发酵步骤结束时的pH值。目标pH值取决于待获得的发酵产品并且可由本领域普通技术人员容易地确定。
在本发明的特定实施方案中，进行发酵直到至少达到5.2的pH值，诸如直到达到5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8或3.7的pH值。优选地，进行发酵直到达到4.0到5.0且更优选4.0到4.6的目标pH值。在优选的实施方案中，进行发酵直到达到低于4.6的目标pH值。
在又一实施方案中，所述方法进一步包括包装食物产品以减少与不想要的微生物(诸如酵母或霉菌)的接触。还优选在低温(低于15℃)下储存产品以帮助延长保存期。
本申请包括通过本文所述的方法获得的食物产品。通过本申请获得的产品优选是在储存至少两天(例如至少3天、至少4天，更优选至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天和至少14天)后游离锰浓度降低至小于0.01ppm的产品，包括发酵的乳品或乳品类似物产品。
***
除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)所用术语“一(a和an)”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文叙述的值的范围仅仅意在作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可按任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则，使用本文所提供的任何和所有实例或示例性用语(例如，“诸如”)仅仅意在用于更好地阐明本发明，而并不对本发明范围构成限制。本说明书中的任何用语都不应当理解为表明是任何非实施本发明必不可少的要求要素。
保藏物和专家解决方案
申请人请求下文所述的保藏微生物的样品只可供专家得到，但须遵守布达佩斯条约缔约国工业产权局(Industrial Property Offices of States Party to theBudapest Treaty)管辖的现有规定，直到授权所述专利的日期为止。
申请人于2012年2月2日将副干酪乳杆菌菌株CHCC14676保藏在布伦瑞克英豪丰大街7B(D-38124)的莱布尼茨研究所-德国微生物和细胞培养物保藏中心(LeibnizInstitute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig)并收到保藏号DSM 25612。
申请人于2015年7月16日将副干酪乳杆菌菌株CHCC15860保藏在布伦瑞克英豪丰大街7B(D-38124)的莱布尼茨研究所-德国微生物和细胞培养物保藏中心并收到保藏号DSM32092。
实施例
实施例1具有灭活的MntR的副干酪乳杆菌
LpMntR的构建
将副干酪乳杆菌菌株CHCC14676(保藏为DSM 25612)用作母菌株。其表达如SEQ IDNO:2中所示的锰转运蛋白MntH1序列，并且具有如SEQ ID NO:31中所示的MntR序列。mntH1上游的MntR的结合位点序列如SEQ ID NO:20中所示。
经由对非复制质粒pCS1966的双交换策略以及用于质粒消除的基于oroP/5-FOA的反选择，从母菌株构建干净的mntR敲除菌株。分别从包括MNTR基因上游1000bp(使用引物对EFB0195+EFB0196)和下游1000bp(使用引物对EFB0197+EFB0198)的基因组DNA扩增侧翼。对所有片段进行凝胶纯化，并用引物对EFB0195+EFB0198进行重叠PCR以融合两个构建体。用引物EFB0122+EFB0123和EFB0124+EFB0125在两个片段中扩增质粒骨架，并进行Gibson组装以融合剩余的三个片段，以形成最终质粒pEBF051，将其转化到乳酸乳杆菌中。然后将所述质粒转化到副干酪乳杆菌中，并在选择性琼脂板上获得整合体。然后培育整合体并将其平铺在反向选择板上，并且通过PCR分析野生型回复体和干净敲除突变体的存在并通过测序确认。
表5用于本实施例中的序列
添加锰的影响
评估向乳中添加锰对LpMntR和母菌株DSM 25612的酸化行为的影响。测量乳中菌株的酸化作为生长的指标。
使两种菌株在96深孔板中在2ml乳(图1A)和补充有0.5％葡萄糖的乳(图1B)中在0至38mg/L范围的不同锰浓度下生长。将板在37℃孵育过夜，并通过pH指示剂的颜色变化来测量pH值，如先前在Poulsen等2019(Poulsen,V.K.,Derkx,P.,Oregaard,G.(2019):“用于质构化乳球菌属菌株的高通量筛选(High-Throughput Screening for TexturingLactococcus Strains)”.FEMS Microbiological Letters)中所述，其中颜色(色调)值根据pH值进行校准。
在添加0.0375-0.6mg/L锰后，在两种菌株之间未检测到生长差异。这表明生长差异不是如实施例2-3中所示的mntH1表达或针对酵母的改善酵母抑制的基础。然而，与LpMntR相比，在更高浓度下，母菌株能够酸化到更低的pH值。
令人惊讶的是，当存在高锰时，LpMntR仍保持酸化。这与枯草芽孢杆菌(Que等，2000)形成对比，其中mntR的缺失导致对升高的锰浓度敏感的菌株。
实施例2 MntH1在DSM 25612和LpMntR中的表达
MntH1是摄取锰的母菌株中重要的锰转运蛋白质。通过基于质粒的与荧光蛋白质融合启动子来分析mntH1基因在副干酪乳杆菌母菌株DSM和其mntR缺失突变体(LpMntR)中的表达强度。
将mntH1启动子克隆在红色荧光蛋白质前面。首先，使用Optimizer(Puigbò等，2007)对mCherry的基因序列(GenBank ID AY678264，(Shaner等，2004))进行关于低GC LAB的密码子优化，其中对于干酪乳杆菌型菌株ATCC334进行了‘引导随机’和‘密码子使用(HEG)’设置。P11启动子是在植物乳杆菌中开发的强组成型合成启动子，并且其序列如最初所述使用(Rud等，2006)。组合的P11启动子和优化的mCherry基因序列作为合成构建体(GenScript,Piscataway,NJ,USA)订购，随后被克隆到宽宿主范围的载体pNZ8148(MoBiTec,Goettingen,Germany)中。使用引物EFB0057+EFB0060从GenScript载体扩增P11-mCherry，同时用引物EFB0061+0062扩增pNZ8148骨架，之后进行Gibson组装。然后，存在于pNZ8148上的nisA启动子被mntH1启动子替换。为此，使用引物EFB0185+EFB0186扩增mntH1启动子，并用引物EFB0180+EFB0181扩增骨架质粒，之后进行Gibson组装，得到质粒pEFB045。
通过电穿孔将该质粒引入母菌株和mntR缺失突变体(LpMntR)两者中。然后，使菌株在2ml深孔板中在2ml乳(图2A)和补充有0.5％葡萄糖的乳(图2B)中在0至38mg/L范围内的不同锰浓度下生长。乳天然含有约0.06mg/L锰。将板在37℃孵育过夜，并将100μL等分试样转移到96低孔板中。在室温下再孵育一天后，在板读数器中以579nm处的激发和616nm处的发射测量荧光。
在母菌株中，观察到添加锰后mntH1表达的降低，当添加超过1.2mg/L锰时其转录被完全阻遏。这显示mntH1的表达在较高锰浓度下完全消除。相比之下，LpMntR中mntH1的表达在所有条件下都始终保持较高。这显示在锰存在下，MntR负责阻遏mntH1基因的表达。
表6用于本实施例中的序列
实施例3 DSM 25612和LpMntR的酵母抑制
将LpMntR的锰清除活性与其母菌株DSM 25612以及添加锰的影响进行比较。已知低锰浓度是酵母生长的主要限制(WO2019/202003)。因此，酵母抑制反映了菌株的锰清除活性。在实验中，预期锰的添加会恢复酵母的生长，并且显示它是酵母生长的限制因素。
使单个乳杆菌属菌株在MRS中生长过夜。使用10μL预培养物接种具有或不具有0.5％葡萄糖的2mL乳(其具有0.06mg/L锰)，两者均补充有0-0.6mg/L范围的锰梯度。将乳在37℃发酵过夜，第二天将150μL发酵乳转移到96孔板中的单个孔中。用约20CFU的汉逊德巴利酵母(Chr.Hansen Culture Collection,CHCC16374)接种所有孔。5天后，将1000倍稀释物点样在选择性YGC板上以分析酵母生长。
图3A描绘了在不添加葡萄糖的情况下在各种锰添加下对酵母的抑制。母菌株仅在锰浓度≤0.08mg/L时才能抑制酵母生长，而LpMntR在添加0.15-0.3mg/L锰时能抑制酵母生长。这证实MntR灭活菌株适用于存在更高锰浓度的更宽应用范围。
图3B描绘了在添加葡萄糖的情况下在各种锰添加下对酵母的抑制。令人惊讶的是，在葡萄糖存在下，MntR灭活菌株展现出更高的锰清除活性，并因此展现出更高的酵母抑制。
实施例4具有灭活的MntR的鼠李糖乳杆菌
LrMntR的构建
将鼠李糖乳杆菌菌株CHCC15860(保藏为DSM 32092)用作母菌株。其表达如SEQ IDNO:4中所示的锰转运蛋白MntH1序列，并且具有如SEQ ID NO:33中所示的MntR序列。mntH1上游的用于MntR的结合位点序列如SEQ ID NO:25中所示。
经由与非复制质粒pCS1966的双交换策略从母菌株构建干净的mntR敲除菌株。分别从包括MNTR基因上游1000bp(使用引物对AMB546+AMB547)和下游1000bp(使用引物对AMB548+AMB549)的基因组DNA扩增侧翼。用引物AMB550+AMB551在一个片段中扩增质粒骨架。对所有三个片段进行凝胶纯化并进行Gibson组装以融合三个片段，以形成最终的质粒pAMB058，将其转化到乳酸乳杆菌中。然后将所述质粒转化到鼠李糖乳杆菌中，并在选择性琼脂板上获得整合体。然后使整合菌株具有感受态并用靶向质粒pAMB060进行转化，所述质粒基于低拷贝复制质粒pIL252。靶向质粒含有从p5启动子表达的MAD7核酸酶，以及由克隆直至TSS位点的p32启动子、gRNA重复和靶向MntR基因的间隔物(ACAGTGTAATCAATCAATGAA)组成的gRNA盒。所述靶向质粒从另一CRISPR-MAD7靶向质粒(pAMB054)分两部分被克隆，其中仅间隔物序列通过作为用于Gibson组装的突出端添加到引物来交换。使用引物对AMB460+AMB556和AMB557+AMB463扩增这两个片段，然后对两者进行凝胶纯化并使用Gibson组装融合，之后将其转化到乳酸乳杆菌中。用靶向质粒pAMB060转化整合菌株导致获得mntR缺失突变体。然后使突变体在非选择性条件下进一步生长过夜，以失去靶向质粒，此产生干净的mntR敲除菌株。
表7用于本实施例中的序列
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添加锰对酸化的影响
评估向乳中添加锰对LrMntR和母菌株CHCC15860的酸化行为的影响。测量并跟踪乳中菌株的酸化曲线作为生长的指标。
使两种菌株在96深孔板中在2ml乳中在0.1至0.6mg/L范围的不同锰浓度下生长。将板在37℃孵育过夜，并通过pH指示剂的颜色变化来测量pH值，如先前在Poulsen等2019(Poulsen,V.K.,Derkx,P.,Oregaard,G.(2019):“用于质构化乳球菌属菌株的高通量筛选(High-Throughput Screening for Texturing Lactococcus Strains)”.FEMSMicrobiological Letters)中所述，其中颜色(色调)值根据pH值进行校准。CHCC15860和LrMntR的酸化分别显示在图4A和图4B中。
在不同锰添加下，在两种菌株之间未检测到生长的显著差异。这表明生长差异不是实施例5中所示的针对酵母的改善抑制的基础。
实施例5 CHCC15860和LrMntR的酵母抑制
使单个乳杆菌属菌株在MRS中生长过夜。使用10μL预培养物接种补充有0-0.6mg/L范围的锰梯度的2mL乳(其具有0.06mg/L锰)。将乳在37℃发酵过夜，第二天将150μL发酵乳转移到96孔板中的单个孔中。用约20CFU的汉逊德巴利酵母(Chr.Hansen CultureCollection,CHCC16374)接种所有孔。4天后，将100倍稀释物点样在选择性YGC板上以分析酵母生长。
图5描绘了在各种锰添加下对酵母的抑制。母菌株仅在锰浓度<0.3mg/L时才能抑制酵母生长，而LrMntR在添加0.4mg/L锰时能抑制酵母生长。
***
前述实施例证实，来自不同乳杆菌种的MntR灭活菌株适用于存在更高锰浓度的更宽应用范围。
PCT/RO/134表
Claims (16)
1.一种改善乳杆菌属(lactobacillus)菌株的锰清除活性的方法，其包括：
-提供一种或多种表达锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株作为母菌株，
-优选通过取代、截短、缺失、点突变和/或敲除，从所述母菌株获得一个或多个突变体，其中所述突变体中锰转运蛋白调控物MntR或其mntH1上游的结合位点是灭活的，以及
-从所获得的突变体中选择一种或多种与所述母菌株相比具有更高的锰清除活性的子代乳杆菌属菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中作为母菌株的乳杆菌属优选唾液乳杆菌(L.salivarius)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)、开菲尔乳杆菌(L.kefiri)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、玉米乳杆菌(L.zeae)或泡菜乳杆菌(L.kimchicus)，并且更优选弯曲乳杆菌(L.curvatus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、干酪乳杆菌(L.casei)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)或发酵乳杆菌(L.fermentum)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MntH1序列是与SEQ ID NO:1-15中的任一序列，优选与SEQ ID NO:1或2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在具有0.135mg/L的锰浓度的乳中，与所述母菌株相比，所述子代乳杆菌属菌株具有更高的锰清除活性。
5.一种包含锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株，其特征在于所述菌株包含灭活的锰转运蛋白调控物MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点。
6.根据权利要求5所述的乳杆菌属菌株，其中所述细菌菌株优选唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌、消化乳杆菌、玉米乳杆菌或泡菜乳杆菌，并且更优选弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌或发酵乳杆菌。
7.根据权利要求5-6所述的乳杆菌属菌株，其中所述MntH1是与SEQ ID NO:1-15中的任一序列，优选与SEQ ID NO:1或2具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或100％序列同一性的多肽。
8.一种组合物，其包含根据权利要求5-7的细菌中的任一种。
9.根据权利要求8所述的组合物，其优选具有至少106菌落形成单位/g(cfu/g)，诸如至少107cfu/g、至少108cfu/g、至少109cfu/g或至少1010cfu/g的浓度的直投式组合物，其中所述组合物被冷冻或冷冻干燥。
10.根据权利要求8-9所述的组合物，其进一步包含能够释放葡萄糖的乳酸菌，优选嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)。
11.一种减少产品、优选食品或饲料产品中游离锰的方法，所述方法包括：
-选择一种或多种包含锰转运蛋白MntH1的乳杆菌属菌株，其特征在于所述菌株包含灭活的MntR和/或mntH1上游的灭活的MntR结合位点，
-将一种或多种所述菌株添加到所述产品中以减少游离锰，所述一种或多种菌株优选作为直投式(DVS)培养组合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述产品是发酵的食物产品，所述方法进一步包括：
-用所述一种或多种菌株发酵所述产品。
13.根据权利要求5-7所述的乳杆菌属菌株或根据权利要求8-10所述的组合物用于减少产品、优选食物产品或发酵的食物产品中的游离锰的用途。
14.根据权利要求5-7所述的乳杆菌属菌株或根据权利要求8-10所述的组合物用于抑制或延迟产品、优选食物产品或发酵的食物产品中的酵母、霉菌或李斯特菌生长的用途。
15.根据权利要求5-7所述的乳杆菌属菌株或根据权利要求8-10所述的组合物用于制备发酵的食物产品的用途。
16.一种生产发酵的乳品或乳品类似物产品的方法，其包括以下步骤
a)将起子培养物和根据权利要求5-7所述的乳杆菌属菌株或根据权利要求8-10所述的组合物添加到乳基中，
b)将所述乳基发酵一段时间直到达到目标pH值，优选pH 4.6。
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