CN117815431A - 生物粘合剂及其制备、使用方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种适用于体内和/或水下医疗用途的新型生物粘合剂。该生物粘合剂包括与用于赋予耐水性的疏水片段和/或与用于增强对生物组织的粘附力的酚部分缀合的基础聚合物。该生物粘合剂具有低毒性，并与生物组织高度相容。

Description

生物粘合剂及其制备、使用方法

技术领域

本发明涉及用于医疗应用的粘合剂领域。

背景技术

目前，具有高粘附强度、易用性和生物相容性的生物粘合剂可以在许多临床应用中替代缝合线或吻合器。例如，在涉及植入移植物与组织的粘合、伤口闭合、止血以及在某个部位延长给药持续时间的医疗程序中可以使用生物粘合剂(Chen等人，Zhang等人)。市售的生物粘合剂可分为天然材料衍生的生物粘合剂，如基于凝血机理的纤维蛋白胶(例如)，和合成材料衍生的生物粘合剂，如聚氰基丙烯酸酯(例如)(Li等人，Duan等人，Mehdizadeh等人)。尽管已证明了/>作为止血辅助手段更有效、更安全(Li等人)，但其局限性和潜在风险不容忽视。例如，来源于人血浆，可能导致经血液传播的交叉感染(Li等人，Hino等人，Horowitz等人)。

合成聚合物衍生的生物粘合剂通常因其具有良好的力学强度而与组织具有高粘附力。然而，它们一旦脱离就会对组织造成严重损伤。此外，合成聚合物衍生的生物粘合剂的降解产物可能会导致慢性炎症(Ma等人，Ge等人)。许多合成聚合物衍生的生物粘合剂是非生物可降解的，生物相容性相对较差(Farrar等人，Cedano等人)。对于硬组织，例如具有湿润和平滑表面的软骨，液体形式的合成聚合物衍生的生物粘合剂难以对此类组织进行局部治疗。因此，具有高粘附强度的可扩散的液体形式的聚合物基生物粘合剂在用于硬组织手术时不易使用并可能存在生物安全风险。

除了生物相容性差之外，许多商业化的生物粘合剂在潮湿条件下的粘附力也很差(Ge等人，Yuk等人)，这些生物粘合剂在潮湿环境中容易溶胀，导致材料水合，机械强度降低，破坏粘合剂内聚力，会可能导致胶水脱离，甚至在临床使用中导致手术失败。因此，需要开发一种生物相容性好的生物粘合剂，在其暴露于水和高湿度条件下也可保持较高的粘附强度。

发明内容

生物粘合剂遇水后粘附强度较差，通常是由粘合剂发生水合引起的。本文提供了一种具有增强疏水性的生物粘合剂，其在潮湿条件下具有较好的粘附强度和生物相容性。在一些实例中，生物粘合剂可以含有疏水片段，该疏水片段可赋予生物粘合剂耐水性并且是生物相容的。在一些实例中，疏水片段共价结合至阳离子聚合物。在一些实例中，疏水片段共价结合至阴离子聚合物。在某些方面，生物粘合剂含有酚部分(phenolic moieties)，例如儿茶酚基团。酚部分例如儿茶酚基团可提高生物粘合剂的粘附性。在一些实例中，酚部分例如儿茶酚基团共价结合至阴离子聚合物。在一些实例中，酚部分例如儿茶酚基团共价结合至阳离子聚合物。在一些实例中，疏水片段共价结合至阳离子聚合物，酚部分共价结合至阴离子聚合物。在一些实例中，疏水片段共价结合至阴离子聚合物，酚部分共价结合至阳离子聚合物。

本发明的生物粘合剂可用于医疗，包括水相环境的医疗应用。不受理论限制，本发明的生物粘合剂的作用机制被认为是基于带正电荷的聚合物和带负电荷的聚合物(例如带负电荷的多糖)之间的静电相互作用。在一些实例中，本发明的生物粘合剂可以包含用于增强耐水性的胆固醇酯基团和用于更稳定地粘附到周围组织的儿茶酚基团，通过聚阴离子和聚阳离子之间的静电相互作用提供内聚力。

本文所公开的生物粘合剂可相对快速地制备出，例如在几秒钟内，这使得生物粘合剂便于医疗应用。体外力学测量证明，与市售纤维蛋白密封剂相比，本文所公开的新型生物粘合剂表现出更优的水下粘附性能。大鼠乳房切除模型和大鼠软骨移植物植入模型的动物实验证明了本发明的生物粘合剂用于各种医疗应用的潜力，包括封闭手术切口、减少血清肿的形成和增强组织工程移植物粘附性。

因此，本发明的一些实例涉及一种生物粘合剂，该生物粘合剂包含阳离子聚合物和阴离子聚合物，其中阳离子聚合物或阴离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物或阴离子聚合物是由至少一个疏水片段官能化该阳离子聚合物或阴离子聚合物而形成的。在一些方面，本发明的一些实例涉及一种生物粘合剂，该生物粘合剂包含阴离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物。在一些方面，本发明的一些实例涉及一种生物粘合剂，该生物粘合剂包含阳离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物。在本发明中，阳离子聚合物是指包含伯胺和/或仲胺和/或叔胺和/或季铵部分的任何可带正电荷的聚合物。可以用于本发明的阳离子聚合物的实例包括但不限于聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)、聚酰胺环氧氯丙烷(PAE)，及其组合。在本发明中，阴离子聚合物可以是带负电荷的多糖。在一些实例中，带负电荷的多糖包括但不限于硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，及上述材料的组合。在本发明中，疏水片段是可以赋予生物粘合剂耐水性的缀合至阳离子或阴离子聚合物的基团或片段，其实例包括但不限于脂质(例如胆固醇)、硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐或季铵盐部分，或其组合。通过改变阳离子或阴离子聚合物上疏水片段的接枝量可以调整生物粘合剂的耐水性。在一些方面，所述生物粘合剂中不含疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物含有至少一个酚部分。含有至少一个酚部分的阴离子聚合物或阳离子聚合物是使阴离子聚合物或阳离子聚合物与至少一个酚部分缀合而形成的。在本发明中，酚部分是指包含儿茶酚(或邻苯二酚)基团的部分。在一些实例中，所述酚部分和/或儿茶酚(或邻苯二酚)基团上可任选地具有其他取代基。可用于本发明的酚部分可包含儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺或表儿茶素基团。在一些实例中，可用于本发明的酚部分的实例包括但不限于儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺或表儿茶素基团。在一些实例中，酚部分可以是儿茶酚基团或者包含儿茶酚基团。通过改变缀合至阴离子或阳离子聚合物的酚部分的量可以调整生物粘合剂的粘附性。

在一些方面，基于生物粘合剂的总重量，生物粘合剂可以包含15wt％至60wt％的阳离子聚合物。生物粘合剂包含的阳离子聚合物的量可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60wt％或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。在一些方面，基于生物粘合剂的总重量，生物粘合剂可以包含40wt％至85wt％的阴离子聚合物。生物粘合剂包含的阴离子聚合物的量可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85wt％或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。

在一些方面，阳离子或阴离子聚合物含有的疏水片段与阳离子或阴离子聚合物的比率可以是4个疏水片段比阳离子或阴离子聚合物的1个亚基(4:1)至1个疏水片段比阳离子或阴离子聚合物的15个亚基(1:15)。在一些实例中，阳离子或阴离子聚合物含有的疏水片段与阳离子或阴离子聚合物的比率可以是4:1、3:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。例如，在一些实例中，平均1个胆固醇基团对应聚乙烯亚胺的2个乙烯亚胺亚基(1:2)。在一些方面，阴离子或阳离子聚合物含有的酚部分与该阴离子或阳离子聚合物的比率可以是4个酚部分比阴离子或阳离子聚合物的1个亚基(4:1)至1个酚部分比阴离子或阳离子聚合物的15个亚基(1:15)。在一些实例中，阴离子或阳离子聚合物含有的酚部分与该阴离子或阳离子聚合物的比率可以是4:1、3:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15或介于其中任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。例如，在一些实例中，平均为1个儿茶素基团对应2个包含D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)对的硫酸软骨素(1:2)。

本发明的一些方面涉及用于粘附生物组织的医用粘合剂试剂盒，其包括本文所公开的生物粘合剂。本发明的一些方面涉及一种粘附生物组织的方法，其包括将本文所公开的生物粘合剂应用于生物组织，并将生物组织粘附到另一生物组织和/或相同生物组织的另一部分，例如周围组织。

本发明的一些方面涉及一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阴离子聚合物与阳离子聚合物接触以形成生物粘合剂，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。在一些实例中，通过用至少一个疏水片段官能化阴离子聚合物或阳离子聚合物得到含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物。在一些实例中，本发明涉及一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阴离子聚合物与含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物接触以形成生物粘合剂。在一些实例中，本发明涉及一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阳离子聚合物与含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物接触以形成生物粘合剂。在一些实例中，本发明涉及一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阴离子聚合物与阳离子聚合物接触以形成生物粘合剂，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段，另一个含有至少一个酚部分。在一些实例中，本发明涉及一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物与含有至少一个酚部分的阴离子聚合物接触以形成生物粘合剂。在一些实例中，本发明涉及一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物与含有至少一个酚部分的阳离子聚合物接触以形成生物粘合剂。在一些实例中，生物粘合剂是在溶液中形成的。在一些实例中，生物粘合剂的组分以能够储存的干燥形式组合，直到引入液体以形成生物粘合剂。在一些方面，阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚酰胺环氧氯丙烷，或其组合。在一些方面，疏水片段选自或包含胆固醇、硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐或季铵盐部分，或其组合。在一些方面，阴离子聚合物是一种带负电荷的多糖，可选自硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，及其组合。在一些方面，酚部分是包含儿茶酚(或邻苯二酚)基团的部分。在一些方面，酚部分包含儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团，或其组合。在一些方面，酚部分选自儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团，或其组合。在一些实例中，生物粘合剂是本文公开的可用材料或方法所能制备的生物粘合剂中的任何一种。

本发明的一些方面涉及生物粘合剂的使用方法。例如，通过使两个表面彼此和生物粘合剂接触来粘附这两个表面。表面可以来自同一物体，也可以来自不同的物体。一个或两个表面都可以是生物材料的表面。在一些实例中，两个表面是伤口的两个表面、皮肤的两个表面、器官的两个表面、有机体的两个表面、医疗器械的两个平面，或者两个不同物体(例如有机体和医疗器械)的表面。在一些实例中，一个或两个表面都是硬组织，例如软骨、骨骼、外壳、爪、牙齿和/或指/趾甲。在一些实例中，当表面与生物粘合剂接触时，一个或两个表面都是湿的或在水下。在一些实例中，一个或两个表面是硬组织，并且在该表面与生物粘合剂接触时是湿的或在水下。一个或两个表面都可以是非生物材料的表面。在一些实例中，一个或两个表面都是医疗器械的表面。在一些实例中，该方法中使用的生物粘合剂是本文所公开的可用材料或方法所能制备的生物粘合剂中的任何一种。

还公开了本发明的以下方面1至37。方面1是一种生物粘合剂，其包含阴离子聚合物和阳离子聚合物，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。方面2是一种生物粘合剂，其包含阴离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物。方面3是一种生物粘合剂，其包含阳离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物。方面4是方面1至3中任一方面所述的生物粘合剂，其中阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚酰胺环氧氯丙烷，或其组合。方面5是方面1至4中任一方面所述的生物粘合剂，其中阴离子聚合物包括带负电荷的多糖。方面6是方面5所述的生物粘合剂，其中带负电荷的多糖包括硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，或其组合。方面7是方面1至6中任一方面所述的生物粘合剂，其中疏水片段包含胆固醇、硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐或季铵盐部分，或其组合。方面8是方面1至7中任一方面所述的生物粘合剂，其中疏水片段包含胆固醇部分或是胆固醇部分。方面9是方面1至8中任一方面所述的生物粘合剂，其中不含疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物含有至少一个酚部分。方面10是方面9所述的生物粘合剂，其中酚部分包含或选自儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团，或其组合。方面11是方面9或10所述的生物粘合剂，其包含含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物和含有至少一个酚部分的阴离子聚合物。方面12是方面9或10所述的生物粘合剂，其包含含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物和含有至少一个酚部分的阳离子聚合物。方面13是方面1至12中任一方面所述的生物粘合剂，其中基于生物粘合剂的总重量，生物粘合剂包含15至60wt％的阳离子聚合物。方面14是方面1至13中任一方面所述的生物粘合剂，其中基于生物粘合剂的总重量，生物粘合剂包含40至85wt％的阴离子聚合物。方面15是一种用于粘附生物组织的医用粘合剂试剂盒，其包含方面1至14中任一方面所述的生物粘合剂。方面16是一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阴离子聚合物与阳离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。方面17是一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阴离子聚合物与含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂。方面18是一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使阳离子聚合物与含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂。方面19是方面16所述的方法，其中不含疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物含有至少一个酚部分。方面20是方面17所述的方法，其中阴离子聚合物含有至少一个酚部分。方面21是方面18所述的方法，其中阳离子聚合物含有至少一个酚部分。方面22是一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物与含有至少一个酚部分的阴离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂。方面23是一种制备生物粘合剂的方法，该方法包括使含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物与含有至少一个酚部分的阳离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂。方面24是方面16至23中任一方面所述的方法，其中将阳离子聚合物与阴离子聚合物混合形成溶液。方面25是方面24所述的方法，其中阳离子聚合物和/或阴离子聚合物在混合时被包含在溶液中。方面26是方面25所述的方法，其中包含在溶液中的阳离子聚合物和/或阴离子聚合物至少部分地溶解在包含该阳离子聚合物和/或该阴离子聚合物的溶液中。方面27是方面16至26中任一方面所述的方法，其中阳离子聚合物包含或者选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚酰胺环氧氯丙烷，或其组合。方面28是方面16至27中任一方面所述的方法，其中阴离子聚合物是带负电荷的多糖。方面29是方面28所述的方法，其中带负电荷的多糖包含或选自硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，或其组合。方面30是方面16至29中任一方面所述的方法，其中疏水片段包含或者选自胆固醇、硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐或季铵盐部分，或其组合。方面31是方面19至30中任一方面所述的方法，其中酚部分包含或者选自儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团，或其组合。方面32是由方面16至31中任一方面所述的方法制备得到的生物粘合剂。方面33是一种粘附两个表面的方法，该方法包括使方面1至14和32中任一方面所述的生物粘合剂与第一表面接触以形成生物粘合剂涂层表面，并使生物粘合剂涂层表面与第二表面接触，其中，使生物粘合剂涂层表面与第二表面接触将第一表面和第二表面粘附在一起。方面34是方面33所述的方法，其中第一表面和/或第二表面是生物材料的表面。方面35是方面33至34中任一方面所述的方法，其中第一表面和/或第二表面是软骨、骨骼、外壳、爪、牙齿或指/趾甲的表面。方面36是方面33至35中任一方面所述的方法，其中第一表面在与生物粘合剂接触时是湿的，和/或第二表面在与生物粘合剂涂层表面接触时是湿的。方面37是方面33至36中任一方面所述的方法，其中所述方法还包括使粘附的第一和第二表面与水接触。

在本申请通篇中，术语“约”用于表示一个值包括测量或定量方法的固有误差变化。

词语“一个(种)”在与术语“包含”结合使用时可以表示“一个(种)”，但也可以表示“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)以上”。

术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括式的或开放性的，不排除其他未陈述的元素或方法步骤。

用于其用途的组合物和方法可以“包含”本说明书通篇中公开的任何成分或步骤，“基本上由本说明书通篇中公开的任何成分或步骤组成”或“由本说明书通篇中公开的任何成分或步骤组成”。“基本上由所公开的任何成分或步骤组成”的组合物和方法将权利要求的范围限定为指定的材料或步骤，其对所要求保护的发明的基本和新颖特征没有实质影响。

短语“药学上可接受的”包括施用于人体时不产生过敏或类似不良反应的组合物。通常，将这样的组合物制备为外用组合物、液体溶液或悬浮液，也可以制备成在使用前在液体中形成溶液或悬浮液的形式。给药途径可以随着待治疗的疾病的位置和性质而发生变化，包括例如外用、吸入、皮内、透皮、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射，以及口服给药。

短语“疏水”包括HLB值为0至小于10的分子，其中HLB值定义为HLB＝20*Mh/M，其中Mh是分子亲水部分的分子质量，M是整个分子的分子质量。

本文中出现的术语“片段”、“基团”和“部分”可以互换使用，是指化合物失去一个原子或一个原子团后剩余的部分。

术语“任选地”表示随后描述的事件或状况可能发生也可能不发生，且该描述同时包括该事件或状况发生和不发生的情况。例如，“任选地含有至少一个酚部分”表示不含酚部分或者含有至少一个酚部分，且该描述同时包括不含酚部分以及含有至少一个酚部分的情况。

预期本说明书中讨论的任何实施方案都可以针对本发明涉及的任何方法或组合物实现，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。

以下详细描述可以明显显示本发明的其他目的、特征和优点。然而，应当理解的是，详细描述和具体实施例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据此详细描述，本领域技术人员均可轻易作出本发明精神和范围内的各种变化和修改。

附图说明

以下附图是本说明书的一部分，并用于进一步演示本发明的某些方面。参考一幅或多幅附图，结合本文所示具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A-1C：图1A是描述聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI-Chol)的合成的图。图1B是聚乙烯亚胺(PEI)和PEI-Chol的¹H NMR谱图。图1C是PEI、胆固醇(Chol)和PEI-Chol的FTIR谱图。

图2A-2C：图2A是描述儿茶素修饰的硫酸软骨素(CSCC)的合成的图。图2B是硫酸软骨素(CS)、儿茶素(CC)和CSCC的紫外可见光谱。图2C是CS、儿茶素和CSCC的FTIR光谱。

图3A-3C：图3A是CSCC、CS、PEI、CC和PEI-Chol的不同组合的照片。图3B是CSCC、CS、PEI、CC和PEI-Chol的不同组合后形成产物的总结表。图3C展示了在涂覆和不涂覆CSCC、PEI-Chol和PcC的云母片上滴加水和二碘甲烷后测得的接触角图片。

图4A-4D：图4A是PEI-Chol(0.5mg/mL)的动态光散射(DLS)结果图。图4B是CSCC(0.5mg/mL)的DLS结果图。图4C是PcC的DLS结果图。图4D是不同含量CSCC下PEI-Chol/CSCC混合物的Zeta电位图。

图5A-5B：图5A是说明CSCC、PEI-Chol和PcC的C、N、O和S含量的表。图5B是CSCC、PEI-Chol和PcC的X射线光电子能谱(XPS)谱图。

图6A-6F：不同浓度的PEI-Chol在第1天(图6A)、第4天(图6B)和第7天(图6C)的细胞毒性。不同浓度的CSCC在第1天(图6D)、第4天(图6E)和第7天(图6F)的细胞毒性。

图7A-7B：图7A是软骨片粘结dLhCG移植物的搭接剪切强度测量示意图。图7B显示了以TISSEEL作为对照组，在不同条件处理的软骨片上使用PcC生物粘合剂的搭接剪切强度结果。

图8A-8B：图8A是乳房切割手术过程的一系列图像。图8B是在第1天、第4天和第7天分别收集到的血清肿体积的平均值与总体积值。

图9是H&E和Masson三色染色组织病理学染色图。

图10A-10D：图10A是大鼠关节软骨的图像。图10B展示了软骨上直径为2mm的圆柱形孔。图10C是移植到软骨关节中的dLhCG在第1天的图像。图10D是移植到软骨关节中的PcC/dLhCG在术后第1天的图像。

图11是dLhCG和PcC/dLhCG在术后第1天的Col-II、CD3和CD68的IHC染色图像。

发明详述

本文公开了一种适用于体内和/或水下医疗用途的新型生物粘合剂。该生物粘合剂显示出增强的体内和水下粘附性能，具有良好的粘附强度和生物相容性。下面的实验结果证明了该生物粘合剂能够闭合手术切口并减少血清肿的形成。结果还证明了该生物粘合剂可以在体内用于硬组织表面上和潮湿环境中。生物粘合剂在水中浸泡后仍能保持较高的粘附强度，证明了其作为体内使用的组织粘合剂在不同手术条件下的有效性。

A.成分

在一些实例中，本发明的生物粘合剂可以包含阴离子聚合物和阳离子聚合物，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。在一些方面，含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物是通过用至少一个疏水片段官能化阴离子聚合物或阳离子聚合物而形成的。在一些实例中，本发明的生物粘合剂可以包含阴离子聚合物；和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物。在一些实例中，本发明的生物粘合剂可以包含阳离子聚合物；和含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物。在一些方面，不含疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物含有至少一个酚部分。在一些方面，含有至少一个酚部分的阴离子聚合物或阳离子聚合物是由阴离子聚合物或阳离子聚合物与至少一个酚部分缀合而形成的。在一些实例中，本发明的生物粘合剂可以包含含有至少一个酚部分的阴离子聚合物；和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物。在一些实例中，本发明的生物粘合剂可以包含含有至少一个酚部分的阳离子聚合物；和含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物。

本发明的阳离子聚合物可以是任何阳离子聚合物。在一些实例中，阳离子聚合物是药学上可接受的聚合物。在一些实例中，阳离子聚合物是生物可降解、可吸收和/或可再吸收的阳离子聚合物。在一些实例中，阳离子聚合物是生物聚合物和/或合成聚合物。在一些实例中，阳离子聚合物包括一种或多种阳离子聚合物。在一些实例中，阳离子聚合物是包含伯胺和/或仲胺和/或叔胺和/或季胺部分的任何可带正电荷的聚合物。在一些实例中，可用于本发明的阳离子聚合物的实例包括但不限于聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚酰胺环氧氯丙烷，或其组合。

本发明的阴离子聚合物可以是任何阴离子聚合物。在一些实例中，阴离子聚合物是药学上可接受的聚合物。在一些实例中，阴离子聚合物是生物可降解、可吸收和/或可再吸收的阴离子聚合物。在一些实例中，阴离子聚合物是天然聚合物和/或合成聚合物。在一些实例中，阴离子聚合物包括一种或多种阴离子聚合物。在一些实例中，可用于本发明的阴离子聚合物的非限制性实例包括带负电荷的多糖。在一些实例中，可用于本发明的带负电荷的多糖的实例包括但不限于硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，或其组合。

许多目前可用的医用级粘合剂的湿粘附强度低是由其高度水合引起的。本申请发明人发现加入疏水片段可以增强生物粘合剂的疏水性。疏水片段可以有助于赋予生物粘合剂耐水性。在一些方面，疏水片段缀合至阳离子聚合物。在一些方面，疏水片段缀合至阴离子聚合物。在一些实例中，疏水片段缀合的聚合物是生物可降解的、可吸收的和/或可再吸收的。在一些实例中，疏水片段缀合的聚合物是天然聚合物和/或合成聚合物。在一些实例中，疏水片段缀合的聚合物包含一个或多个疏水片段和/或一个或多个聚合物。疏水片段的实例包括但不限于硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐、季铵盐、脂质部分等，或其组合。在一些实例中，脂质可以是胆固醇。胆固醇是人体内存在的一种脂质分子，广泛分布于细胞膜中(Farzaneh等人，Gruber等人)，因其能够提高生物粘合剂的耐水性而被用于本文的实验中。在一些实例中，疏水片段是胆固醇基、胆固醇基羰基或油酸酯基。缀合至聚合物的疏水片段的量可以改变，以调整生物粘合剂的耐水性。

酚部分可以有助于改善粘附性质。在本发明中，酚部分是指包含儿茶酚(或邻苯二酚)基团的部分。在一些实例中，所述酚部分和/或所述儿茶酚(或邻苯二酚)基团上任选地还包含其他取代基。在一些方面，阴离子聚合物含有至少一个酚部分。在一些方面，阳离子聚合物含有至少一个酚部分。在一些方面，含有至少一个酚部分的阴离子聚合物是使至少一个酚部分缀合至阴离子聚合物而形成的。在一些方面，含有至少一个酚部分的阳离子聚合物是使至少一个酚部分缀合至阳离子聚合物而形成的。在一些实例中，含有酚部分的聚合物是生物可降解的、可吸收的和/或可再吸收的。在一些实例中，含有酚部分的聚合物是生物聚合物和/或合成聚合物。在一些实例中，含有酚部分的聚合物包含一个或多个酚部分和/或一个或多个聚合物。可用于本发明的酚部分包含或选自儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团或其组合。在一些实例中，酚部分是儿茶酚基团或者包含儿茶酚基团。儿茶酚基团在碱性环境下可以发生聚合或氧化。在一些实例中，酚部分来自于可以提供儿茶酚基团的任何化合物，例如儿茶素。儿茶素主要来源于植物，作为抗氧化剂被广泛研究，并提供儿茶酚基团(He等人，Pheomphun等人)。可以改变缀合至聚合物的酚部分的量以调整生物粘合剂的粘附性。

在一些方面，基于生物粘合剂的总重量，生物粘合剂可包含15wt％至60wt％的阳离子聚合物(例如，含有疏水片段的阳离子聚合物，或含有酚部分的阳离子聚合物)。生物粘合剂包含的阳离子聚合物的量可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60wt％或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。

在一些方面，基于生物粘合剂的总重量，生物粘合剂可包含40wt％至85wt％的阴离子聚合物(例如，含有酚部分的阴离子聚合物，或含有疏水片段的阴离子聚合物)。生物粘合剂包含的阴离子聚合物的量可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85wt％或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。

在一些方面，聚合物含有的疏水片段与聚合物的比率可以是4个疏水片段比聚合物的1个亚基(4:1)至1个疏水片段比聚合物的15个亚基(1:15)。在一些实例中，聚合物含有的疏水片段与聚合物的比率可以是4:1、3:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。

在一些方面，聚合物含有的酚部分与聚合物的比率可以是4个酚部分比聚合物的1个亚基(4:1)至1个酚部分比聚合物的15个亚基(1:15)。在一些实例中，聚合物含有的酚部分与聚合物的比率可以是4:1、3:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15或介于上述任意两个值之间的值，或其中可衍生的任何范围。

本文所用的阴离子聚合物的重均分子量(Mw)不受特别的限制。在本文所公开的生物粘合剂中可以使用重均分子量为100至1,000,000g/mol或更大的阴离子聚合物。本文所用阴离子聚合物的Mw可以为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、51000、52000、53000、54000、55000、56000、57000、58000、59000、60000、61000、62000、63000、64000、65000、66000、67000、68000、69000、70000、71000、72000、73000、74000、75000、76000、77000、78000、79000、80000、81000、82000、83000、84000、85000、86000、87000、88000、89000、90000、91000、92000、93000、94000、95000、96000、97000、98000、99000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000、700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000、800000、810000、820000、830000、840000、850000、860000、870000、880000、890000、900000、910000、920000、930000、940000、950000、960000、970000、980000、990000、1000000g/mol，或其任意两个值之间的任何值或其中可衍生的任何范围。本文所用的阴离子聚合物的Mw可以为15000道尔顿(Da)至60000Da或更大的值。在一些实例中，本文所用的阴离子聚合物的Mw为大于15000Da、20000Da、25000Da、30000Da，35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da或60000Da，或其任意两个值之间的任何值，或其中可衍生的任何范围。在一些实例中，本文所用的阴离子聚合物是硫酸软骨素，其分子量为大于25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da或60000Da，或介于其任意两个值之间的任何值或其中可衍生的任何范围。

本文所用的阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺的重均分子量(Mw)不受特别的限制。在本文公开的生物粘合剂中可以使用重均分子量范围为100至1,000,000g/mol的阳离子聚合物。本文公开的阳离子聚合物的Mw可以是：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、51000、52000、53000、54000、55000、56000、57000、58000、59000、60000、61000、62000、63000、64000、65000、66000、67000、68000、69000、70000、71000、72000、73000、74000、75000、76000、77000、78000、79000、80000、81000、82000、83000、84000、85000、86000、87000、88000、89000、90000、91000、92000、93000、94000、95000、96000、97000、98000、99000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000、700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000、800000、810000、820000、830000、840000、850000、860000、870000、880000、890000、900000、910000、920000、930000、940000、950000、960000、970000、980000、990000、1000000g/mol，或其任意两个值之间的任何值或其中可衍生的任何范围。本文所用的阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺的Mw可以为15000Da至60000Da或更大的值。在一些实例中，本文所用的阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺的Mw为大于15000Da、20000Da、25000Da、30000Da，35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da或60000Da，或其中任意两个值之间的任何值或其中可衍生的任何范围。在一些实例中，本文所用的阳离子聚合物是聚乙烯亚胺，其分子量为大于25000Da、30000Da、35000Da、40000Da、45000Da、50000Da、55000Da或60000Da，或介于其任意两个值之间的任何值或其中可衍生的任何范围。

硫酸软骨素(CS)或其他糖胺聚糖(GAG)来源于软骨，在本文中被用作生物相容性阴离子聚合物材料的非限制性实例(Zhu等人2019，Tao等人)。CS是一种带负电荷的多糖，可以通过静电相互作用与带正电荷的材料结合(Jin等人)。作为本发明酚部分的一个非限制性实例，儿茶酚类物质可与聚合物(例如阴离子聚合物)组分缀合，在碱性环境下可发生聚合或氧化。作为本发明阳离子聚合物的一个非限制性实例，支化聚乙烯亚胺(PEI)已在基因疗法、抗菌和生物粘合剂应用中进行了广泛研究(Wang等人，Ren等人，Cui等人)。在本文的实验中使用了PEI。本文公开了一种新型生物粘合剂，本文称为PcC，其适用于但不限于水相环境和医疗用途。

B.结构

本发明的生物粘合剂可以被构造或配制成多种不同形式。非限制性实例包括粉末、溶液(例如，水溶液、水醇溶液)、乳剂(例如，油包水、水包油包水、水包油、水包硅酮、硅酮包水、油包水包油、硅酮包水包油乳剂)、乳膏、无水碱(anhydrous bases)、凝胶(例如，水凝胶)等。其他对于本领域技术人员而言显而易见的组分存在形式变化，也是适合在本发明中使用的。在一些实例中，将用于制造生物粘合剂的成分分开储存或至少部分地分开储存，并在即将应用于待粘附物体之前或应用期间将这些成分合并以制备成生物粘合剂。在一些实例中，至少将部分成分分开储存，直至在应用于待粘附物体之前10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒，或其间的任何时间点。在一些实例中，至少将部分成分分开储存，其中至少一种成分在与其他成分混合或应用于待粘附物体之前储存在溶液中或以干态储存。在一些实例中，在即将应用于待粘附物体之前或应用期间，成分与水水合以形成生物粘合剂。在一些实例中，在应用于待粘附物体之前10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒，或其间的任何时间点，使成分水合。

本发明的生物粘合剂可以包括所有类型的溶媒和载体，或者可以不包括溶媒或载体。溶媒或载体可以是药学上可接受的。溶媒或载体的非限制性实例包括水、甘油、醇、油、含硅化合物、硅酮化合物等。其他对于本领域技术人员而言是显而易见的可选择的合适的溶媒，也适合在本发明中使用。在某些方面，聚合物的种类、成分和浓度与组合可以按以下原则选择，即组合具有化学兼容性且不会形成可沉淀的络合物。

C.另外的成分

除了发明人所公开的成分组合之外，本发明的生物粘合剂还可以包括另外的成分。这些另外的成分的非限制性实例可以包括但不限于药物活性成分、增稠剂、防腐剂、染料和色素成分等。

本发明的生物粘合剂还可以包括本说明书通篇描述的另外的成分的以任何数量加入的组合(例如，色素成分、防腐剂或另外的药物活性成分)。生物粘合剂内任何成分的浓度都可能改变。在非限制性实施方案中，生物粘合剂中可以包含的本说明书和权利要求书中提及的至少一种另外的成分(以其最终形式)的含量可以为0至45wt％。例如，生物粘合剂中可以包含的本说明书和权利要求书中提及的至少一种另外的成分(以其最终形式)的含量基于生物粘合剂的总重量可以为至少约0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0200％、0.0250％、0.0275％、0.0300％、0.0325％、0.0350％、0.0375％、0.0400％、0.0425％、0.0450％、0.0475％、0.0500％、0.0525％、0.0550％、0.0575％、0.0600％、0.0625％、0.0650％、0.0675％、0.0700％、0.0725％、0.0750％、0.0775％、0.0800％、0.0825％、0.0850％、0.0875％、0.0900％、0.0925％、0.0950％、0.0975％、0.1000％、0.1250％、0.1500％、0.1750％、0.2000％、0.2250％、0.2500％、0.2750％、0.3000％、0.3250％、0.3500％、0.3750％、0.4000％、0.4250％、0.4500％、0.4750％、0.5000％、0.5250％、0.0550％、0.5750％、0.6000％、0.6250％、0.6500％、0.6750％、0.7000％、0.7250％、0.7500％、0.7750％、0.8000％、0.8250％、0.8500％、0.8750％、0.9000％、0.9250％、0.9500％、0.9750％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％，或其中任意两个值之间的任何值或其中可衍生的任何含量范围。在一个非限制性方面，可以通过生物粘合剂的总体积计算百分比。本领域的技术人员可以理解，浓度可以通过给定组合中成分的添加、替换和/或减去而改变。

药物活性成分的非限制性实例可以包括但不限于镇痛药、麻醉药、抗组胺药、α肾上腺素能受体激动剂、抗炎药(包括非甾体抗炎药)、抗生素、抗真菌药、抗病毒药、抗微生物药、抗癌活性剂、抗肿瘤药、止痒药、抗皮脂溢药、生物活性蛋白和肽、烧伤治疗剂、烧灼剂、酶、止血药、类固醇(包括激素和皮质类固醇)、血管收缩剂、伤口治疗剂、伤口愈合剂等。

镇痛药的非限制性实例包括能够减轻疼痛的物质。镇痛药可包括但不限于利多卡因、冬青油、萜烯类药物(例如愈创木酚)、双氯芬酸、酮洛芬、辣椒素、发红药、非甾体抗炎药、吗啡、氢吗啡酮、其他阿片类药物(例如曲马多、哌替啶、可待因、哌腈米特、左美沙酮、芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼和舒芬太尼)。

增稠剂(thickening agents)的非限制性实例可包括但不限于增稠剂(thickener)或胶凝剂，包括其他可增加粘度的物质。增稠剂包括能够增加组合物粘度而不会改变组合物内活性成分实质性功效的那些物质。增稠剂还可以提高组合物的稳定性。在本发明的某些方面中，增稠剂包括氢化聚异丁烯、三羟基硬脂、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/乙烯基吡咯烷酮共聚物或它们的混合物。另外的增稠剂的非限制性实例包括羧酸聚合物、交联聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖和树胶。羧酸聚合物的实例包括含有一个或多个衍生自丙烯酸、取代丙烯酸以及这些丙烯酸和取代丙烯酸的盐和酯的单体的交联剂，其中交联剂包含两个或更多个碳碳双键，并且衍生自多元醇。市售羧酸聚合物的实例包括卡波姆，是丙烯酸键合丙烯基蔗糖或季戊四醇烯丙醚交联的丙烯酸均聚物。交联聚丙烯酸酯聚合物的非限制性实例包括阳离子型和非离子型聚合物。聚丙烯酰胺聚合物(包括非离子型聚丙烯酰胺聚合物，包括取代的支化或非支化聚合物)的非限制性实例包括聚丙烯酰胺、异构烷烃和laureth-7(聚氧乙烯月桂醚)、丙烯酰胺和取代的丙烯酰胺与丙烯酸和取代的丙烯酸的多嵌段共聚物。多糖的非限制性实例包括纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、乙酸丙酸羧酸纤维素、羟乙基纤维素，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、纤维素硫酸钠，及其混合物。另一实例为烷基取代的纤维素，其中纤维素聚合物的羟基被羟烷基化(优选羟乙基化或羟丙基化)以形成羟烷基化纤维素，然后用C10-C30直链或支链烷基通过醚键进一步修饰该羟烷基化纤维素。通常，这些聚合物是C10-C30直链或支链醇与羟烷基纤维素形成的醚。其他可用的多糖包括小核菌聚糖，其主链由β-D-(1→3)-吡喃葡萄糖基单元组成，每三个单元含有一个(1→6)键连接的β-D-吡喃葡萄糖基葡萄糖。树胶的非限制性实例包括阿拉伯胶、琼脂、褐藻胶、海藻酸、海藻酸铵、支链淀粉、海藻酸钙、卡拉胶钙、肉碱、卡拉胶、糊精、明胶、结冷胶、瓜尔胶、瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵、锂蒙脱石、透明质酸、水合二氧化硅、羟丙基壳聚糖、羟丙基瓜尔胶、刺梧桐胶、海带、槐豆胶、纳豆胶、海藻酸钾、卡拉胶钾、海藻酸丙二醇酯、小核菌胶、羧甲基葡聚糖钠、卡拉胶钠、黄蓍胶、黄原胶，及其混合物。

防腐剂的非限制性实例包括抗微生物剂、抗真菌剂、抗病毒药、抗微生物药、抗氧化剂、螯合剂、对羟基苯甲酸酯、酚类、酸和醇。

染料和色素成分的非限制性实例包括Blue 1、Blue 1Lake、Red 40、二氧化钛、D&CBlue No.4、D&C Green No.5、D&C Orange No.4、D&C RedNo.17、D&C Red No.33、D&CViolet No.2、D&C Yellow No.10、D&CYellow No.11等。

D.制备

本文公开的生物粘合剂可以相对快速地制备得到，例如在几秒钟内，从而使生物粘合剂便于医疗应用。在一些实例中，将用于制造生物粘合剂的成分彼此分开或至少部分地分开储存并在即将应用于待粘附物体之前或在应用期间将这些成分合并以制备生物粘合剂。在一些实例中，至少将部分成分分开储存，直至在应用于待粘附物体之前10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒，或其间的任何时间点。在一些实例中，至少将部分成分分开储存，并且其中至少一种成分在与其他成分混合或应用于待粘附物体之前储存在溶液中或以干态形式储存。在一些实例中，在即将应用于待粘附物体之前或在应用期间，成分与水水合以形成生物粘合剂。在一些实例中，在应用于待粘附物体之前10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒或两者之间的任何时间点，使成分水合。

在一些实例中，可通过混合阴离子聚合物和阳离子聚合物来形成生物粘合剂，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。在一些实例中，含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物是用至少一个疏水片段官能化阴离子聚合物或阳离子聚合物而形成的。在一些实例中，可通过混合阴离子聚合物和阳离子聚合物来形成生物粘合剂，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段，另一个含有至少一个酚部分。例如，在一些实例中，可通过混合含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物和含有至少一个酚部分的阴离子聚合物来形成生物粘合剂。在一些实例中，可通过混合含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物和含有至少一个酚部分的阳离子聚合物来形成生物粘合剂。生物粘合剂可以基于阴离子聚合物和阳离子聚合物之间的静电相互作用(例如经由静电相互作用交联)和聚合物表面上暴露的一个或多个疏水片段来制备。然而，任选地含有至少一个酚部分的阴离子聚合物或阳离子聚合物(例如，含有至少一个酚部分的阴离子聚合物)和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物或阴离子聚合物(例如，含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物)的混合物可能仍可溶于水，这表明疏水片段可以在交联后被暴露出来，并有助于生物粘合剂的形成。在一些实例中，生物粘合剂形成凝胶。此外，在一些实例中，酚部分(例如，酚部分上的羟基)可以在阳离子聚合物引入的环境下发生氧化或聚合。氧化或聚合可以有助于生物粘合剂的粘附性能。

阴离子聚合物和阳离子聚合物，例如，任选地含有至少一个酚部分的阴离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物，或含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物和任选地含有至少一个酚部分的阳离子聚合物，可以以5:1至1:5范围内的任何质量比，例如5:1、4:1、3:1、2:1、3:2、1:1、2:3、1:2、1:3、1:4、1:5的质量比或其间的任何比例或范围混合。

生物粘合剂可以很容易地制备得到，其中阴离子聚合物和阳离子聚合物形成生物粘合剂的交联反应可以在1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒内或者在其间的任何时间或其范围内完成，例如通过搅拌可在5秒内完成。

在一些实例中，含有疏水片段的阳离子聚合物可以通过伯胺、仲胺和/或叔胺与包含疏水片段的酰氯基团之间的反应来形成。在一个非限制性实例中，疏水片段(例如胆固醇氯甲酸酯)可与含胺的阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺)反应。在一些实例中，反应可以在三乙胺(TEA)的存在下进行。在一些实例中，阳离子聚合物和/或疏水片段可以溶解在二氯甲烷(DCM)中。在一些实例中，反应可以在-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50℃的温度或其间的任何温度下或其范围内进行1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时或23小时或1天、2天、3天或4天或其间的任何时间或其范围。可以通过蒸馏、透析和/或洗涤等方式对产物进行纯化。在一些实例中，可以对产物进行干燥。

在一些实例中，含有疏水片段的阴离子聚合物可以通过将疏水片段接枝至阴离子聚合物来形成。在一个非限制性实例中，疏水片段(例如胆固醇)可通过偶联法(例如N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)偶联法)接枝至阴离子聚合物(例如带负电荷的多糖，例如海藻酸钠)，从而得到含有疏水片段的阴离子聚合物(例如含有胆固醇部分的海藻酸钠)。在一些实例中，以DCC为偶联剂，以4-(N,N’-二甲基氨基)吡啶(DMAP)为催化剂，在室温下使海藻酸钠与胆固醇反应24小时，得到含有至少一个胆固醇部分的海藻酸钠(Yang等人)。

在一个非限制性实例中，疏水片段(例如油酸)可与阴离子聚合物(例如带负电荷的多糖，例如透明质酸)发生酯化反应，从而得到含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物(例如含有油酸酯部分的透明质酸)。在一些实例中，使透明质酸与苯甲酸油酸酸酐(BOAn)在碱(例如三乙胺)和有机催化剂(例如DMAP)的存在下在有机溶剂(例如二氧六环或叔丁醇)和水的混合物(例如以1:1的比例)中发生酯化反应，得到含有油酸酯基团的透明质酸(等人)。

在一些实例中，含有至少一个酚部分的阴离子聚合物可以通过在阴离子聚合物上诱导的自由基与至少一个酚部分(例如含有儿茶酚基团的酚部分)反应形成。在一个非限制性实例中，通过氧化还原对(例如过氧化氢和抗坏血酸)的诱导，可以在阴离子聚合物上形成自由基。酚部分，例如儿茶素，可以与阴离子聚合物上的诱导自由基反应。在一些实例中，反应可以在水或热水等溶剂的存在下进行。在一些实例中，自由基诱导可进行30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟、140分钟、150分钟、160分钟、170分钟或3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时或更长时间，或其间的任何时间或其范围。在一些实例中，自由基诱导可在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃或其间的任何温度下或其范围内发生。在一些实例中，反应可以在-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50℃或其间的任何温度下或其范围内进行5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时或23小时或1天、2天、3天或4天或两者之间的任何时间或其范围。可以通过蒸馏、透析和/或洗涤等方式对产物进行纯化。在一些实例中，可以对产物进行干燥。

在一些实例中，含有至少一个酚部分的阳离子聚合物可以通过醛交联法(例如使用戊二醛)来形成。在一些实例中，使酚部分(例如多巴胺)在醛溶液(例如戊二醛的水溶液)中在室温、氮气保护下反应过夜，然后加入阳离子聚合物(例如壳聚糖(CS))溶液(例如CS的HOAc水溶液)反应，得到含有至少一个酚部分的阳离子聚合物(例如含有至少一个多巴胺部分的CS)(Shi等人)。

在一些实例中，含有至少一个酚部分的阳离子聚合物可以通过迈克尔加成法来合成。在一些实例中，使多巴胺在碱性有氧条件下形成聚多巴胺，然后与阳离子聚合物(例如壳聚糖(CS))溶液反应24小时，得到含有至少一个酚部分的阳离子聚合物(例如含有至少一个多巴胺部分的CS)(Hu等人)。

E.用途

本文公开的生物粘合剂可用于粘附两个或更多个表面。表面可以来自同一物体，也可以来自不同的物体，例如生物表面。在一些实例中，这两个表面是同一伤口的两个表面、同一皮肤的两个表面、同一器官的两个表面或同一有机体的两个表面。在一些实例中，一个或两个表面都是硬组织，例如软骨、骨骼、外壳、爪、牙齿和/或指/趾甲。在一些实例中，一个或两个表面在与生物粘合剂接触时该表面是湿的或是在水相中。在一些实例中，一个或两个表面都是硬组织，并且在与生物粘合剂接触时该表面是湿的或是在水相中。一个或两个表面都可以是非生物材料的表面。在一些实例中，一个或两个表面都是医疗器械的表面。在一些实例中，一个表面是生物材料的表面，而另一个表面是非生物材料(例如医疗器械)的表面。在一些实例中，这两个表面来自两个不同的物体。在一些实例中，该方法中使用的生物粘合剂是本文所公开的生物粘合剂中的任何一种。

在一些方面，生物粘合剂可以在应用于表面之前的10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒或其间的任何时间点或其范围内制备。在一些方面，生物粘合剂在应用于表面之前数小时、数天、数月或数年制备，例如干生物粘合剂。

在某些方面，生物粘合剂可快速固化或凝固。在一些实例中，生物粘合剂可在应用于表面之后的10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟或55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒或其间的任何时间点或其范围内固化和/或凝固。

在一些方面，生物粘合剂可以用于人、其他哺乳动物、其他动物或植物。在一些方面，生物粘合剂在手术期间和/或手术后用于修复角膜。

F.试剂盒

本文公开的生物粘合剂可以包含在粘合剂试剂盒中。用于制备本文所公开的生物粘合剂的成分可以包含在粘合剂试剂盒中。粘合剂试剂盒可用于实施本文所公开的任何方法或程序。试剂盒的成分和/或生物粘合剂可以包含在本文公开的任何成分和/或生物粘合剂类型里。在一些实例中，粘合剂试剂盒是医用粘合剂试剂盒。在一些实例中，医用粘合剂试剂盒可用于粘附生物材料和/或将生物材料与非生物材料粘附在一起。在一些实例中，医用粘合剂试剂盒可用于外科手术中或用作医疗急救试剂盒的一部分。在一些实例中，粘合剂试剂盒可用于制备本文所公开的生物粘合剂。

实施例

下列实施例仅用于举例说明本发明的某些方面和实施方案，并不以任何方式限制本发明。本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对所公开的具体实施方案进行各种更改，而仍能获得相似或类似的结果。

实施例1

采用自由基诱导机制制备了带负电荷的儿茶素修饰的CS(CSCC)。通过一级、二级和/或三级PEI上氨基与胆固醇酰氯之间的反应，制备了带正电荷的胆固醇氯甲酸酯修饰的支化PEI(PEI-Chol)。对其化学结构和细胞毒性进行了表征。

制备CSCC。通过采用自由基诱导机制制备CSCC(图2A)(Spizzirri等人)。在圆底烧瓶中将0.5g CS溶解于10mL去离子(DI)水中(5wt％)。添加氧化还原反应对——H₂O₂(4mL)和抗坏血酸(0.19g)，然后在室温(RT)下搅拌混合物2h以生成自由基。将0.4g儿茶素(CC)溶解在25mL热去离子水中(60℃)，并添加到反应混合物中。然后将反应混合物冷却至室温，并在室温下保持48小时。收集产物，在透析袋(MWCO：2000Da)中用去离子水透析2天，冻干(FreezeZone，Labconco)，并保存在4℃下，以备进一步使用。

制备PEI-Chol。通过一级、二级或三级PEI上的氨基与酰氯形式的胆固醇之间的反应来制备PEI-Chol(图1A)。首先，将1.85g支化PEI(Mw＝25000Da)溶解于20mL二氯甲烷(DCM)中，并与186μL三乙胺(TEA)一起添加到在冰浴中的双颈烧瓶中。然后将0.2g胆固醇氯甲酸酯(Chol)溶解在5mL DCM中，并经由滴液漏斗逐滴添加到混合物中。将混合物在0℃下搅拌过夜，然后通过减压蒸馏除去DCM。用乙醚洗涤产物以除去未反应的Chol和TEA，并在室温下真空纯化。

表征CSCC和PEI-Chol的化学结构。通过核磁共振氢谱(¹H NMR)(Bruker 600MHz“ASCEND AVANCE III HD”核磁共振系统)以氧化氘(D2O)为溶剂，以及傅里叶变换红外光谱(FTIR)(Perkin-Elmer Spectrum100)，对CSCC和PEI-Chol的化学结构进行了表征。如PEI-Chol的¹H NMR谱图(图1B)所示，出现在3.5ppm、3.1ppm和0.5至1.5ppm左右的峰属于胆固醇，证实了PEI与胆固醇成功缀合。在FTIR谱图上，与PEI相比，PEI-Chol在2900cm^-1左右出现更明显的C-H拉伸振动，进一步证实了胆固醇成功地接枝到PEI上(图1C)。

如CSCC的UV-vis谱图(图2B)中所示，在290nm左右观察到一个明显的峰。该峰对应于儿茶素的苯环，证实了儿茶素的成功接枝。CSCC的FTIR谱图上在1736cm^-1左右出现的峰表示C＝C拉伸振动，也证实了CSCC的成功合成(图2C)。

体外细胞毒性。在体内应用期间，CSCC或PEI-Chol可能会从PcC生物粘合剂中释放出来。因此，使用CCK-8试剂进行体外细胞毒性试验，以检测粘合剂应用在体内环境时的各成分PEI-Chol或CSCC安全使用浓度(图6A至图6F)。使用细胞增殖试剂CCK-8检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，Beyotime)评价CSCC和PEI-Chol对细胞的体外细胞毒性。首先，将L929细胞(ATCC)在96孔板(2500个细胞/孔)中用含或不含CSCC或PEI-Chol的DMEM培养基进行培养。采用了不同浓度的CSCC(4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL)和不同浓度的PEI-Chol(1.5625μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)。混合物在37℃的CO₂培养箱中培养。在第1天、第4天和第7天将CCK-8试剂以1:10的体积比添加到每个孔中。然后将混合物与细胞一起在37℃的CO₂培养箱中培养4小时。根据制造商的方案，在酶标仪上测量并计算培养混合物的吸光度。

根据结果(参见图6A至图6F)，PEI-Chol水溶液在浓度大于25μg/mL时对L929显示出明显的细胞毒性。浓度降至12.5μg/mL后，PEI-Chol的细胞毒性得到了高度缓解。然而，从第1天到第7天，细胞存活率从81.5±10.0％下降到61.6±16.6％。对于浓度小于6.25μg/mL的PEI-Chol水溶液，未检测到细胞毒性。此外，以6.25μg/mL、3.125μg/mL和1.5625μg/mLPEI-Chol作为添加剂的细胞增殖或代谢培养在第4天得到促进(6.25μg/mL、3.125μg/mL和1.5625μg/mL组分别为218.8±21.6％、250.3±3 7.0％和185.0±32.9％)，但在第7天回复到约110％。因此，浓度小于6.25μg/mL的PEI-Chol对细胞是安全的。对于CSCC，4mg/mL CSCC水溶液对L929具有细胞毒性，而浓度小于2mg/mL的CSCC水溶液对细胞是安全的。此外，测定浓度为2mg/mL和1mg/mL的CSCC促进细胞增殖或代谢。

实施例2

制备并表征了PcC生物粘合剂。

制备PcC生物粘合剂。将CSCC水溶液(100mg/mL)与PEI-Chol水溶液(100mg/mL)以1:1的体积比混合，以获得生物粘合剂(PcC)。PcC的颜色为橙色。粘合剂水凝胶易于制备，通过搅拌在5秒内完成交联反应。

实施例3

表征了生物粘合剂的粘附性能和作用机理。

搭接剪切强度试验。进行搭接剪切强度试验以测量PcC生物粘合剂在软骨上的粘附强度(图7A)。简而言之，从市售的猪骨中收集软骨片，并将其切成片，每片大约2×5×30(mm)。将40μL CSCC(100mg/mL)与40μL PEI-Chol(100mg/mL)混合以制备生物粘合剂PcC，然后用PcC生物粘合剂将两片软骨粘在一起，搭接面积为5mm×5mm。使用吹风机干燥5min，然后在37℃水浴中孵育1h(PcC-W)，在37℃的水中浸泡1小时(PcC-I)，以及在室温环境中孵育1小时(PcC-A)。

制备了脱细胞活透明软骨移植物(dLhCG)。从新鲜猪软骨中收集猪软骨细胞，并将其包封在具有明胶微球的海藻酸盐水凝胶中。在三维水凝胶中培养的软骨细胞的生长和增殖过程中分泌细胞外基质(ECM)。使用柠檬酸钠溶液去除海藻酸盐水凝胶以收集LhCG(Nie,X.等人)。然后，通过物理、化学和酶促方法进行脱细胞化，以产生dLhCG。采用体外软骨片力学模型(图7A)来测试生物粘合剂作为移植物涂层时的力学性能。使用生物打孔器在市售猪软骨的较厚的位置打一个孔，然后将涂覆PcC的脱细胞活透明软骨移植物(dLhCG)放入该孔中。将软骨粘在另一块软骨片上，然后在37℃下孵育1h(PcC/dLhCG-W)。使用拉伸试验机(Instron 5942)固定样品，并以2mm/min的速度拉伸。使用/>(一种市售的纤维蛋白基生物粘合剂，购买自上海莱士血液制品股份有限公司)的粘附强度作为对照。

如图7B所示，在室温环境中孵育的PcC(PcC-A)的粘附强度为66.3±4.6kPa。对于在37℃水浴中孵育的PcC(PcC-W)，检测到粘附强度为56.7±7.4kPa。在37℃水浴中浸泡后(PcC-I)，PcC粘附强度保持在38.9±1.6kPa。在室温环境中孵育的(-A)显示粘附强度为22.3±16.0kPa。对于在37℃水浴中孵育的/>(-W)，平均粘附强度为28.1±16.8kPa。在37℃水浴中浸泡后(/>-I)，粘附强度下降至1.9±0.8kPa，表明在水性环境中/>的粘合性能很差。

如图7B所示，在37℃水浴中孵育后，PcC涂层dLhCG(PcC/dLhCG-W)为58.6±12.5kPa，而涂层dLhCG(/>/dLhCG-W)显示出较低的强度，为12.9±9.4kPa。

搭接剪切强度实验证明了PcC生物粘合剂比市售纤维蛋白胶具有更好的粘附强度。PcC生物粘合剂在潮湿的组织表面或水浸泡的环境中仍能保持其粘合性。

PcC生物粘合剂的作用机理。为了研究PcC生物粘合剂的作用机理，制备了100mg/mL PEI、PEI-Chol水溶液和100mg/mL CS、CC和CSCC水溶液，并制备了不同组合的混合物。如图3A和图3B所示，当PEI-Chol与CSCC或CS混合时生成水凝胶，而当PEI-Chol与CC混合时没有形成水凝胶。可以认为PcC是由PEI-Chol(带正电荷)和CSCC(带负电荷)之间的静电相互作用形成的。Zeta电位测量(图4D)表明，Zeta电位为-50.4mV的黄色CSCC与Zeta电位为63.2mV的白色PEI-Chol相互作用，经由静电相互作用交联生成橙红色的PcC生物粘合剂。然而，PEI与CSCC或CS的混合物仍可溶于水，表明疏水性Chol组分在交联后被暴露出来，有助于水凝胶的形成。PcC的橙红色或砖红色来自于CC，其在PEI或PEI-Chol引入的碱性环境下发生氧化或聚合。

接触角测量。在接触角分析仪(Kruss DSA25)上用5μL的水或二碘甲烷滴测量水和二碘甲烷在CSCC、PEI-Chol和PcC上的接触角。在测量前，将CSCC、PEI-Chol和PcC涂覆在云母上，并在60℃的烘箱中干燥。作为对照，还测试了水和二碘甲烷在云母上的接触角。接触角测量可以用作表面自由能的指标。根据水接触角的结果(图3C)，与CSCC(15.77°±5.67°)和PEI-Chol(26.08°±5.98°)相比，PcC显示出更疏水的表面，水接触角为50.28°±6.72°，进一步证实了疏水性的Chol组分在CSCC和PEI-Chol静电相互作用交联后被暴露出来，并促成PcC生物粘合剂的形成。

动态光散射(DLS)。将CSCC和PEI-Chol(浓度均为0.5mg/mL)以不同的体积比(CSCC:PEI-Chol＝0:1、1:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.5:1、3:1、1:0)混合在一起，制成PcC悬浮液。用DLS(Zetasizer Nano-S Malvern)测量PEI-Chol、CSCC和PcC悬浮液(CSCC:PEI-Chol＝1:1)的粒径以及PcC悬浮液的Zeta电位。为了进一步研究CSCC和PEI-Chol之间的静电相互作用，进行了DLS测量以检测Zeta电位。通过以不同体积比组合等浓度的CSCC和PEI-Chol制备稀PcC悬浮液(图4D)。观察到当CSCC体积比增加时，Zeta电位从63.2mV下降至-50.4mV，并且当CSCC:PEI-Chol(v/v)达到约2.2:1时，PcC悬浮液变为电中性。根据DLS结果，PEI-Chol的平均粒径约为105.2nm(图4A)，CSCC的粒径约为219.8nm(图4B)。对于PcC，检测到一些沉淀，如DLS结果所示(图4C)。说明在非常稀的浓度下，PEI-Chol和CSCC混合时发生了交联沉淀。

X射线光电子能谱(XPS)。通过XPS(PHI Model 5802)检测碳(C)、氮(N)、氧(O)和硫(S)，带通能量为40eV。在检测前将PEI-Chol、CSCC和PcC冻干。进行X射线光电子能谱(XPS)分析来研究CSCC、PEI-Chol及其组合PcC的表面组成(图5A和图5B)。可以观察到四个结合能为530.4、399.2、285.6和168.8eV的峰，分别代表了O1s、N 1s、C 1s和S 2p的存在。与PEI-Chol中未检测到硫含量相比，PcC在材料表面显示出0.8％的硫，表明这两种聚电解质的结合。根据上述Zeta电位测量结果，当CSCC:PEI-Chol(v/v)约为2.2:1(这也是每个PcC生物粘合剂中CSCC:PEI-Chol的质量比)时，PcC悬浮液变为电中性。0.8％ S小于以2.2:1的质量比计算的比例，表明更多的Chol组分暴露于PcC生物粘合剂的表面。

PcC的粘附力在很大程度上可以归因于儿茶酚基团，而内聚力可能来自静电相互作用和Chol的疏水性。PEI-Chol在水中以胶束形式存在，亲水性PEI组分暴露在分散相中，疏水性Chol隐藏在胶束内部。然而，在水溶液中与CSCC接触后，PEI-Chol可以通过PEI上的正电荷和CS上的负电荷与CSCC相互作用。因此，PEI-Chol水溶液和CSCC水溶液的平衡可能分别已被打破，导致Chol和CC的暴露。由于Chol的疏水性，PcC可从水分散相中分离出来。同时，由于CC上暴露的儿茶酚基团，PcC水凝胶被赋予了粘附力。

如上述结果证明的，这种新型PcC生物粘合剂可以快速、方便地制备并用于医疗用途。然而，与基于多巴胺的生物粘合剂相比，CC在合成过程中相对更稳定，提高了CSCC合成产物的稳定性。此外，儿茶酚基团仅在添加碱性PEI-Chol后才发生氧化或聚合，表明反应物产物的稳定性更好，可提高储存寿命。此外，PcC生物粘合剂呈橙红色，比多巴胺衍生的生物粘合剂所呈现的黑色在视觉上更令人愉快。

实施例4

测定了PcC生物粘合剂的内部粘附力、密封性和急性毒性。

动物准备和手术程序。为了测试PcC生物粘合剂在体内的内部粘附力、密封性和急性毒性，构建了大鼠血清肿模型和软骨修复模型。对于大鼠乳腺切除模型，将12只体重200-300g的雌性大鼠(SD大鼠)随机分为三组：生理盐水对照组(n＝4)、PcC组(n＝4)、/>密封剂(n＝4)。实验过程简述如下。首先用异氟烷对动物进行麻醉，然后将其置于仰卧位。手术区域进行剃毛处理并用碘伏消毒。使用手术刀和手术剪，从颈部到胸口剪出一个中线切口。提起左腹侧皮瓣，使其与肌肉组织分离，露出胸大肌、腋窝、锁骨和背阔肌的边缘。用剪刀剪去胸大肌和胸小肌。然后用手术刀将提起的皮瓣的内表面刮擦50次，以破坏淋巴管。用300μL生理盐水、300μL />试剂盒或PcC生物粘合剂注射伤口，然后用皮肤钉缝合伤口。每天监测术后动物的伤口开裂、感染和血清肿的形成情况。在术后第1天、第4天和第7天，通过注射器经皮抽吸血清肿液，并测量其体积。在术后第7天，使用二氧化碳对所有动物进行安乐死。随后，收集皮肤和胸壁的全层活体组织，固定并包埋以进行组织学分析。

对于软骨缺损模型，在SD大鼠的关节中创建直径为2mm的圆柱形缺损。为了消除个体差异，分别将PcC涂覆的dLhCG(PcC/dLhCG)和dLhCG植入左腿和右腿的缺损处。每组使用九个重复样本。每天监测术后动物的伤口开裂、感染和肿块的形成情况。术后第1天，用CO₂对大鼠实施安乐死，并收集双膝的软骨关节。组织在固定和脱钙后进行石蜡包埋，对切片进行免疫组织化学(IHC)染色。

体内血清肿预防能力和生物相容性评价。图8A展示了大鼠乳腺切除的过程。术后大鼠没有出现伤口开裂、感染或皮瓣坏死等症状。图8B描绘了血清肿体积平均值和总体积值。在生理盐水对照组中，第1天、第4天和第7天的血清肿体积平均值分别为233.3±84.9μL、192.5±9 5.2μL和46.7±37.7μL。对于PcC组，第1天、第4天和第7天的血清肿体积平均值分别为50±49.6μL、25.0±47.1μL和10±14.1μL。在组中，第1天、第4天和第7天的血清肿体积平均值分别为90±78.7μL、55.0±54.9μL和83.3±33.9μL。这三组的血清肿总体积值分别为472.5±123.0μL、85±52.5μL和228.3±4 9.5μL。PcC组在手术后一周内产生的血清肿总体积值最小。在第7天，血清肿体积几乎为零，而/>组血清肿体积升高。

如图9所示，切除区域的组织学评价显示，在对照生理盐水组中，皮瓣与胸壁完全分离，形成一个死腔。相比之下，在PcC和组中，皮瓣牢固地粘附在胸壁上，没有间隙。

图10A至图10D显示了植入了dLhCG和PcC涂层dLhCG的SD大鼠软骨关节第1天的照片。没有发现肿块、感染或炎症，表明没有超急性排斥反应。

对II型胶原(Col-II)、巨噬细胞(CD68)和T细胞(CD3)进行IHC染色以进行进一步研究。如图11所示，dLhCG和PcC/dLhCG均显示Col-II阳性，表明PcC生物粘合剂的涂层不影响dLhCG的胶原蛋白表型。移植物植入后IHC染色显示轻度免疫和炎症反应。巨噬细胞(CD68)和T细胞(CD3)被染成深褐色，并主要存在于移植物的表面。值得注意的是，CD68在dLhCG的表面和内部都呈现出明显的深色和较大的染色面积，这表明dLhCG的巨噬细胞炎症比PcC/dLhCG严重。同样，与有PcC涂层的dLhCG相比，dLhCG上T细胞(CD3)染色呈更深的褐色，只有少数T细胞(CD3)分布在PcC/dLhCG表面上，内部几乎没有。第1天的IHC染色结果表明，PcC生物粘合剂不会引起免疫排斥反应，表明了PcC生物粘合剂良好的生物相容性。

根据本发明所公开和要求保护的所有产品和方法都可以按照相似的方法进行实验。虽然是通过示例性实施例对本发明的组合物和方法进行了展示，但对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以将变化应用于本文所述的产品和方法以及应用于本文所述方法中的某些步骤或步骤顺序中。更具体地说，可以使用其他某些相关的化学和生理学功能相近的聚合物和试剂取代本文所述的聚合物和试剂，可以获得相同或类似的结果。本领域技术人员所有对于此类类似替代物和其他显而易见的修改均被视为在随附权利要求书定义的本发明的精神、范围和构思内。

参考文献

以下参考文献可补充本文所述内容或其他细节，通过引用的方式纳入本文中。

1.Chen,X.；Yuk,H.；Wu,J.；Nabzdyk,C.S.；Zhao,X.,Instant toughbioadhesivewith triggerable benign detachment.Proceedings of the NationalAcademy ofSciences 2020,117(27),15497-15503.

2.Zhang,L.；Liu,M.；Zhang,Y.；Pei,R.,Recent progress of highlyadhesivehydrogels as wound dressings.Biomacromolecules 2020,21(10),3966-3983.3.Li,J.；Yu,X.；Martinez,E.E.；Zhu,J.；Wang,T.；Shi,S.；Shin,S.R.；Hassan,S.；Guo,C.,Emerging Biopolymer-Based Bioadhesives.MacromolecularBioscience 2022,22(2),2100340.

4.Duan,W.；Bian,X.；Bu,Y.,Applications of bioadhesives:a mini review.

Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 2021,9.

5.Mehdizadeh,M.；Yang,J.,Design strategies and applications of tissuebioadhesives.Macromolecular bioscience 2013,13(3),271-288.

6.Hino,M.；Ishiko,O.；Honda,K.i.；Yamane,T.；Ohta,K.；Takubo,T.；Tatsumi,N.,Transmission of symptomatic parvovirus B19 infection by fibrin sealantusedduring surgery.British journal of haematology 2000,108(1),194-195.7.Horowitz,B.；Busch,M.,Estimating the pathogen safety of manufactured humanplasmaproducts:application to fibrin sealants and to thrombin.Transfusion

2008,48(8),1739-1753.

8.Ma,C.；Sun,J.；Li,B.；Feng,Y.；Sun,Y.；Xiang,L.；Wu,B.；Xiao,L.；Liu,B.；Petrovskii,V.S.,Ultra-strong bio-glue from geneticallyengineeredpolypeptides.Nature communications 2021,12(1),1-14.

9.Ge,L.；Chen,S.,Recent advances in tissue adhesives for clinicalmedicine.

Polymers 2020,12(4),939.

10.Farrar,D.F.,Bone adhesives for trauma surgery:A review ofchallenges anddevelopments.International journal of adhesion and adhesives2012,33,89-97.11.Cedano Serrano,F.；Pinzón,L.；Narváez,D.；Castro Paéz,C.；Moreno-Serrano,C.；Tabima,D.；Salcedo,F.；Briceno,J.；Casas-Rodriguez,J.,Evaluation of awater-resistant and biocompatible adhesive with potential usein bone fractures.

Journal of adhesion science and Technology 2017,31(13),1480-1495.

12.Yuk,H.；Varela,C.E.；Nabzdyk,C.S.；Mao,X.；Padera,R.F.；Roche,E.T.；Zhao,X.,Dry double-sided tape for adhesion of wet tissues and devices.Nature

2019,575(7781),169-174.

13.Farzaneh,H.；Nik,M.E.；Mashreghi,M.；Saberi,Z.；Jaafari,M.R.；Teymouri,M.,A study on the role of cholesterol and phosphatidylcholine invariousfeatures of liposomal doxorubicin:from liposomal preparation totherapy.

International journal of pharmaceutics 2018,551(1-2),300-308.

14.Gruber,A.；Joshi,A.A.；Graff,P.；Cuéllar-Camacho,J.L.；Hedtrich,S.；Klinger,D.,Influence ofNanogel Amphiphilicity on Dermal Delivery:

Balancing Surface Hydrophobicity and NetworkRigidity.Biomacromolecules

2021,23(1),112-127.

15.Zhu,W.；Iqbal,J.；Wang,D.-A.,A DOPA-functionalizedchondroitinsulfatebased adhesive hydrogel as a promising multi-functionalbioadhesive.

Journal of Materials Chemistry B 2019,7(10),1741-1752.

16.Tao,C.；Jin,M.；Yao,H.；Wang,D.-A.,Dopamine basedadhesivenanocoatings on extracellular matrix(ECM)based grafts forenhancedhost–graft interfacing affinity.Nanoscale 2021,13(43),18148-18159.

17.Jin,M.；Shi,J.；Zhu,W.；Yao,H.；Wang,D.-A.,Polysaccharide-basedbiomaterials in tissue engineering:a review.Tissue Engineering Part B:

Reviews 2021,27(6),604-626.

18.Wang,D.-a.；Narang,A.S.；Kotb,M.；Gaber,A.O.；Miller,D.D.；Kim,S.W.；Mahato,R.I.,Novel branched poly(Ethylenimine)-cholesterol water-solublelipopolymers for gene delivery.Biomacromolecules 2002,3(6),1197-1207.19.Ren,J.；Kong,R.；Gao,Y.；Zhang,L.；Zhu,J.,Bioinspired adhesivecoatingsfrom polyethylenimine and tannic acid complexes exhibitingantifogging,self-cleaning,and antibacterial capabilities.Journal of Colloidand InterfaceScience 2021,602,406-414.

20.Cui,Y.；Yin,L.；Sun,X.；Zhang,N.；Gao,N.；Zhu,G.,A UniversalandReversible Wet Adhesive via Straightforward Aqueous Self-AssemblyofPolyethylenimine and Polyoxometalate.ACS Applied Materials&Interfaces

2021,13(39),47155-47162.

21.Yang L,Zhang B,Wen L,et al.Amphiphilic cholesteryl graftedsodiumalginate derivative:Synthesis and self-assembly in aqueous solution[J].

Carbohydrate Polymers,2007,68(2):218-225.

22.O,Vohlídal J,HermannováM,et al.Oleate-modified hyaluronan:

Controlling the number and distribution of side chains by varying thereactionconditions[J].Carbohydrate Polymers,2021,267:118197.

23.Shi Z,Neoh K G,Kang E T,et al.Bacterial adhesion and osteoblastfunction ontitanium with surface-grafted chitosan and immobilized RGD peptide[J].Journalof Biomedical Materials Research Part A:An Official Journal of TheSociety forBiomaterials,The Japanese Society for Biomaterials,and TheAustralianSociety for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials,2008,86(4):865-872.

24.Hu W,Lu S,Ma Y,et al.Poly(dopamine)-inspired surfacefunctionalization ofpolypropylene tissue mesh for prevention of intra-peritoneal adhesionformation[J].Journal of Materials Chemistry B,2017,5(3):575-585.

25.Moulay,S.,Dopa/catechol-tethered polymers:Bioadhesives andbiomimeticadhesive materials.Polymer Reviews 2014,54(3),436-513.

26.Guyot,C.；Cerruti,M.；Lerouge,S.,Injectable,strong andbioadhesivecatecholchitosan hydrogels physically crosslinked using sodiumbicarbonate.

Materials Science and Engineering:C 2021,118,111529.

27.Shi,C.；Chen,X.；Zhang,Z.；Chen,Q.；Shi,D.；Kaneko,D.,Musselinspiredbio-adhesive with multi-interactions for tissue repair.Journal ofBiomaterialsScience,Polymer Edition 2020,31(4),491-503.

28.Zhu,W.；Peck,Y.；Iqbal,J.；Wang,D.-A.,A novel DOPA-albumin basedtissueadhesive for internal medical applications.Biomaterials 2017,147,99-115.29.Fan,C.；Fu,J.；Zhu,W.；Wang,D.-A.,A mussel-inspired double-crosslinkedtissue adhesive intended for internal medical use.Actabiomaterialia 2016,33,51-63.

30.He,J.；Xu,L.；Le Yang,X.W.,Epigallocatechin gallate is the mosteffectivecatechin against antioxidant stress via hydrogen peroxide andradical scavengingactivity.Medical Science Monitor:International MedicalJournal ofExperimental and Clinical Research 2018,24,8198.

31.Pheomphun,P.；Treesubsuntorn,C.；Thiravetyan,P.,Effect ofexogenouscatechin on alleviating O3 stress:the role of catechin-quinone inlipidperoxidation,salicylic acid,chlorophyll content,and antioxidant enzymesofZamioculcas zamiifolia.Ecotoxicology and environmental safety 2019,180,374-383.

32.Spizzirri,U.G.；Parisi,O.I.；Iemma,F.；Cirillo,G.；Puoci,F.；Curcio,M.；Picci,N.,Antioxidant–polysaccharide conjugates for food application by eco-friendlygrafting procedure.Carbohydrate Polymers 2010,79(2),333-340.

33.Nie,X.；Chuah,Y.J.；Zhu,W.；He,P.；Peck,Y.；Wang,D.-A.,Decellularizedtissue engineered hyaline cartilage graft for articularcartilage repair.

Biomaterials 2020,235,119821.

34.Zhu,W.；Yang,J.；Iqbal,J.；Peck,Y.；Fan,C.；Wang,D.-A.,Amusselinspireddouble-crosslinked tissue adhesive on rat mastectomy model:seroma preventionand in vivo biocompatibility.Journal of Surgical Research2017,215,173-182.35.Choi,M.S.；Kim,H.K.；Kim,W.S.；Bae,T.H.；Kim,M.K.,Acomparison oftriamcinolone acetonide and fibrin glue for seroma prevention ina ratmastectomy model.Annals of plastic surgery 2012,69(2),209-212。

Claims (23)

1.一种生物粘合剂，其包含阴离子聚合物和阳离子聚合物，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。

2.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其中所述疏水片段包含胆固醇、硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐或季铵盐部分，或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的生物粘合剂，其中所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚酰胺环氧氯丙烷，或其组合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物粘合剂，其中所述阴离子聚合物包括带负电荷的多糖，优选地，所述带负电荷的多糖选自硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，或其组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物粘合剂，其中不含疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物含有至少一个酚部分。

6.根据权利要求5所述的生物粘合剂，其中所述酚部分包含儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团，或其组合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物粘合剂，其中，基于生物粘合剂的总重量，所述生物粘合剂包含15wt％至60wt％的阳离子聚合物；和/或，其中，基于生物粘合剂的总重量，所述生物粘合剂包含40wt％至85wt％的阴离子聚合物。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的生物粘合剂，其包含阴离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物。

9.根据权利要求8所述的生物粘合剂，其中所述阴离子聚合物含有至少一个酚部分。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的生物粘合剂，其包含阳离子聚合物和含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物。

11.根据权利要求10所述的生物粘合剂，其中所述阳离子聚合物含有至少一个酚部分。

12.一种用于粘附生物组织的医用粘合剂试剂盒，包括权利要求1至11中任一项所述的生物粘合剂。

13.一种制备权利要求1至11中任一项所述的生物粘合剂的方法，所述方法包括使阳离子聚合物与阴离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂，其中阴离子聚合物或阳离子聚合物之一含有至少一个疏水片段。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚酰胺环氧氯丙烷，或其组合。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述阴离子聚合物包括带负电荷的多糖，优选地，所述带负电荷的多糖包含硫酸软骨素、糖胺聚糖、卡拉胶、阿拉伯胶、褐藻胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、海藻酸钠、透明质酸、结冷胶、肝素，或其组合。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述疏水片段包含胆固醇、硬脂酸、油酸、卵磷脂、磺酸盐或季铵盐部分，或其组合。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中不含疏水片段的阴离子聚合物或阳离子聚合物含有至少一个酚部分，优选地，所述酚部分包含儿茶酚、儿茶素、多巴胺、左旋多巴胺、表儿茶素基团，或其组合。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，所述方法包括使含有至少一个疏水片段的阳离子聚合物与任选地含有至少一个酚部分的阴离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂；或者，所述方法包括使含有至少一个疏水片段的阴离子聚合物与任选地含有至少一个酚部分的阳离子聚合物接触以获得所述生物粘合剂。

19.一种粘附两个表面的方法，该方法包括将权利要求1至11中任一项所述的生物粘合剂与第一表面接触以形成生物粘合剂涂层表面，并将生物粘合剂涂层表面与第二表面接触，其中将生物粘合剂涂层表面与第二表面相接触使第一表面和第二表面粘附。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一表面和/或第二表面是生物材料的表面。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述第一表面和/或第二表面是软骨、骨骼、外壳、爪、牙齿或指/趾甲的表面。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中第一表面在与生物粘合剂接触时是湿的，和/或第二表面在与生物粘合剂涂层表面接触时是湿的。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使粘附的第一和第二表面与水接触。