CN117815258A - 三叶青多糖在制备防治jak-stat通路相关疾病药物中的应用 - Google Patents
三叶青多糖在制备防治jak-stat通路相关疾病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，公开了三叶青多糖在制备防治JAK‑STAT通路相关疾病药物中的应用。本发明首次发现三叶青多糖能够多领域多靶点防治包括银屑病、特应性皮炎、免疫介导的癌症、细胞因子释放综合征等在内的JAK‑STAT通路相关疾病，不仅拓宽了三叶青多糖的应用范围，也为治疗JAK‑STAT通路相关疾病提供了新途径；此外，本发明首次发现三叶青多糖能够在体内和体外抑制JAK‑STAT信号通路的表达水平，有望为其相关疾病的治疗及其病理机制的研究提供新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及三叶青多糖在制备防治JAK-STAT通路相关疾病药物中的应用。
背景技术
JAK-STAT是由细胞因子调节的主要信号通路，对于启动先天免疫、协调适应性免疫机制以及最终限制炎症和免疫应答至关重要。JAK是免疫应答过程中最重要的细胞因子激活转录因子之一，该家族主要由四个成员组成：JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2。而细胞质中的STAT家族是JAK的下游靶标，由七个成员组成，即 STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5A，STAT5B和 STAT6。研究结果证实，JAK-STAT通路与许多自身免疫性疾病如银屑病、类风湿性关节炎，免疫介导的癌症，炎症性疾病如细胞因子释放综合征（cytokine syndrome, CRS）的病理机制密切相关。研究表明，重症 COVID-19患者体内TNF-α、IFN-γ等细胞因子水平急剧升高，因此可通过抑制TNF-α、IFN-γ等炎性细胞因子过表达，调控JAK/STAT1信号通路则可有效预防细胞因子风暴的发生，从而防治重症COVID-19。当前研究JAK/STAT信号通路和疾病形成的潜在机制的需求不断增加，因此，JAK和STATs等蛋白质可能是治疗这些疾病的最有效靶标。
当前临床针对JAK-STAT通路相关疾病的治疗药物以调控机体致炎-抗炎平衡为主，如采用受体激动剂/抑制剂、细胞因子中和抗体等。与该途径相关的抑制剂虽具有给药简单、反应快、半衰期短等优点，如JAK2抑制剂（Federatinib）和STAT1抑制剂（Fludarabine）也成为新的临床应用药物，最初用于器官移植排斥，但后来也用于其它免疫炎性适应症，例如炎症性肠病、免疫性血小板减少症等。但由于JAK-STAT通路在疾病发展中的生理、发病机制、长期疗效和安全性尚不完全清楚，且可能具有促进肿瘤发展，产生脱靶效应等弊端，多种药物仍停留在临床试验阶段；传统的激素疗法存在肺功能障碍、肌肉无力、中枢神经系统机能紊乱等诸多不良反应。因此，尚无确切的靶向调控JAK-STAT通路的特效药物来治疗与JAK-STAT通路密切相关的疾病。
有研究证实，抑制JAK-STAT信号通路被认为可以调控多条与炎症、自身免疫性疾病、增殖性疾病、免疫介导的癌症相关疾病的信号通路达到治疗目的。中药具有双向免疫调节和多靶点治疗的优势来调控JAK/STAT通路达到疾病的治疗效果。三叶青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg，TH）具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒作用，是民间流传的抗病毒肺炎药物。三叶青多糖（Tetrastigma hemsleyanumpolysaccharides，THP）是三叶青的主要生理活性成分，可显著抑制IFN-γ、TNF-α和IL-6的过表达，发挥解热、抗炎作用。同时，也证实了THP可以通过弱激活TLR4/NF-κB信号通路，避免因TLR4/NF-κB信号通路强激活而导致TNF-α、IL-6等细胞因子的大量释放，调节机体免疫功能，避免过度炎症反应。但THP针对JAK-STAT通路治疗疾病的相关研究尚无报道，其具体机制及针对靶点有待进一步验证。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了三叶青多糖在制备防治JAK-STAT通路相关疾病药物中的应用。本发明首次发现三叶青多糖能够多领域多靶点防治包括银屑病、特应性皮炎、免疫介导的癌症、细胞因子释放综合征等在内的JAK-STAT通路相关疾病，不仅拓宽了三叶青多糖的应用范围，也为治疗JAK-STAT通路相关疾病提供了新途径；此外，本发明首次发现三叶青多糖能够在体内和体外抑制JAK-STAT信号通路的表达水平，有望为其相关疾病的治疗及其病理机制的研究提供新的途径。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了三叶青多糖在制备防治JAK-STAT通路相关疾病药物中的应用。
作为优选，所述JAK-STAT信号通路涉及JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3中的一种或多种。
作为优选，所述JAK-STAT通路相关疾病包括银屑病、特应性皮炎、免疫介导的癌症、细胞因子释放综合征（CRS）。进一步地，所述细胞因子释放综合征包括急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。
本发明通过体内试验结果发现：三叶青多糖能够缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损，减轻银屑病皮损程度（PASI）评分，抑制角质形成细胞异常增殖；进一步检测发现，三叶青多糖通过调控JAK-STAT3通路的激活减弱皮损处炎症浸润程度，下调银屑病小鼠体内IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的过表达，从而发挥防止银屑病的作用。
本发明通过体内试验结果发现：三叶青多糖能够影响JAK-STAT通路的激活。进一步检测发现，三叶青多糖能够降低ALI/ARDS肺组织中JAK2、STAT1、STAT2的磷酸化，降低ALI/ARDS肺组织中JAK2、STAT1、STAT2 mRNA的表达。因此，三叶青多糖能够通过抑制JAK-STAT通路的激活，发挥防治ALI/ARDS的作用。
本发明通过体内和体外试验结果发现：三叶青多糖能够明显抑制肺组织中被激发的JAK-STAT信号通路；并且，在体外对A549细胞的实验表明，三叶青多糖能够在蛋白和RNA水平上显著下调因TNF-α/IFN-γ协同作用而激活的JAK-STAT通路。提示三叶青多糖可能是通过JAK-STAT信号通路，来应对TNF-α/IFN-γ联合刺激后的细胞因子风暴而产生抗炎作用，最终发挥修复肺部屏障的作用。
第二方面，本发明提供了三叶青多糖作为JAK-STAT通路抑制剂的应用。
作为优选，所述JAK-STAT通路涉及JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3中的一种或多种。
作为优选，所述JAK-STAT通路为肺组织、皮肤组织中的JAK-STAT通路。
第三方面，本发明提供了三叶青多糖在抑制体外细胞中JAK-STAT通路激活中的应用。
作为优选，所述体外细胞为体外肺组织、体外皮肤组织中的细胞。其中，体外肺组织细胞优选为肺泡上皮细胞。
作为优选，所述三叶青多糖的制备方法包括：三叶青药材粉碎、乙醇浸提、热水浸提、乙醇沉淀、透析、阴离子交换色谱纯化、分子筛（凝胶）色谱纯化、冷冻干燥。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1）本发明首次发现三叶青多糖能够多领域多靶点防治包括银屑病、特应性皮炎、免疫介导的癌症、细胞因子释放综合征等在内的JAK-STAT通路相关疾病，不仅拓宽了三叶青多糖的应用范围，也为治疗JAK-STAT通路相关疾病提供了新途径。
（2）本发明首次发现三叶青多糖能够在体内和体外抑制JAK-STAT信号通路的表达水平，有望为其相关疾病的治疗及其病理机制的研究提供新的途径。
附图说明
图1是三叶青精制多糖分子重复结构单元的推测结构；
图2是雾化吸入THP对ALI肺组织损伤的干预作用；A：肺组织的形态学变化和W/D对ALI小鼠的影响，B：对肺组织病理变化的影响（10×），C：对肺组织MPO表达水平的影响（20×），D：对肺组织CD42表达的影响（10×），E：对肺组织F4/80表达的影响（20×）；## P<0.01，### P<0.001，vs. Control group；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. Model group；
图3是雾化吸入THP对ALI小鼠血及BALF中炎性细胞水平的干预作用；：血中WBC数量，B：血中PLT数量，C：血中淋巴细胞数量，D：血中中性粒细胞数量，E：BALF中WBC数量，F：BALF中PLT数量，G：BALF中淋巴细胞数量，H：BALF中中性粒细胞数量；## P<0.01，### P<0.001，vs. Control group；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. Model group；
图4是雾化吸入THP对ALI小鼠血及BALF中细胞因子水平的干预作用；A：血中IL-6水平，B：血中MCP-1水平，C：血中IFN-γ水平，D：血中TNF-α水平，E：BALF中IL-6水平，F：BALF中MCP-1水平，G：BALF中IFN-γ水平，H：BALF中TNF-α水平；# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001，vs. Control group；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. Model group；
图5是雾化吸入THP对ARDS小鼠存活率及肺组织损伤的干预作用；A：雾化吸入THP对ARDS小鼠存活率影响，B：对肺组织W/D的影响，C：对肺组织病理变化的影响（20×），D：对肺组织MPO表达水平的影响（20×），E：CD42对肺组织表达的影响（20×），F：F4/80对肺组织表达的影响（×20）；## P<0.01，### P<0.001，vs. Control group；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. Model group；
图6是雾化吸入THP对ARDS小鼠血及BALF中炎性细胞水平的干预作用；A：血中IL-6水平，B：血中MCP-1水平，C：血中IFN-γ水平，D：血中TNF-α水平，E：BALF中IL-6水平，F：BALF中MCP-1水平，G：BALF中IFN-γ水平，H：BALF中TNF-α水平；# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001，vs. Control group；* P<0.05，*** P<0.001 vs. Model group；
图7是雾化吸入THP对ARDS小鼠血及BALF中细胞因子水平的干预作用；A：血中IL-6水平，B：血中MCP-1水平，C：血中IFN-γ水平，D：血中TNF-α水平，E：BALF中IL-6水平，F：BALF中MCP-1水平，G：BALF中IFN-γ水平，H：BALF中TNF-α水平；### P<0.001，vs. Controlgroup；** P<0.01，*** P<0.001 vs. Model group；
图8是雾化吸入THP对ALI/ARDS小鼠中JAK-STAT通路激活的影响；A：雾化吸入THP对ALI小鼠肺组织中JAK2、STAT1、STAT2 mRNA水平影响；B：雾化吸入THP对ARDS小鼠肺组织中JAK2、STAT1、STAT2 mRNA水平影响；C：雾化吸入THP对ALI/ARDS小鼠肺组织中p-JAK2、p-STAT1、p-STAT2 表达水平影响（20×）；### P<0.001，vs. Control group；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 vs. Model group；
图9是IFN-γ与TNF-α协同诱导A549细胞的炎症损伤；A：A549细胞在增加IFN-γ和/或TNF-α浓度处理24h、48h、72h后的相对活力；B：TNF-α/IFN-γ处理的A549细胞上清中IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平；C：TNF-α/IFN-γ-处理的A549细胞的凋亡率；# P<0.05,## P<0.01,### P<0.001, vs. Control group.* P<0.05,*** P<0.001 vs. Model group；
图10是THP抑制TNF-α/IFN-γ-处理的A549细胞的炎症损伤水平；A：TNF-α/IFN-γ-处理的A549细胞在THP治疗后的凋亡率；B：检测TNF-α/IFN-γ处理过的A549细胞上清液经THP治疗后的IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平；C：分析TNF-α/IFN-γ-处理的A549细胞中THP治疗后的IL-6、TNF-α和IFN-γ mRNA水平；### P<0.001, vs. Control group.* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001 vs. Model group；
图11是TNF-α/IFN-γ刺激A549细胞JAK-STAT信号通路的RNA-Seq分析；A：正常组（CON）与模型组（MOD）之间DEG基因表达统计维恩图（a）、火山图（b）；B：KEGG分析的主要类别术语；C：CON组与MOD组差异表达基因的层次聚类分析；D：MOD与CON之间JAK-STAT信号通路相关基因表达差异直方图；# P<0.05,## P<0.01,### P<0.001, vs. CON group；
图12是THP通过降低JAK-STAT信号通路，减轻TNF-α/IFN-γ-处理的A549细胞的炎症损伤；A：THP治疗后TNF-α/IFN-γ-处理的A549细胞中JAK2、STAT1和STAT2的mRNA水平；B：THP治疗后TNF-α/IFN-γ刺激的A549细胞的JAK2、STAT1、STAT2的磷酸化水平和GAPDH的蛋白水平；C：Fed（a）/Flu（b）/THP对A549细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ浓度的影响；D：Fed（a）/Flu（b）/THP对A549细胞JAK-STAT通路相关mRNA水平的影响；E：A549细胞中的p-JAK2（红色）和p-STAT1（绿色）细胞代表性免疫荧光图像（放大×200，比例尺：50 mm）；# P<0.05,## P<0.01,### P<0.001, vs. Control group.* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001 vs. Model group；
图13是THP对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样品皮损的干预作用；A：THP对咪喹莫特诱导的小鼠皮肤表征的变化；B：THP治疗后脾脏病理变化；C：脾脏的代表性图像；D：THP治疗后小鼠脾指数的变化；E：动物实验设计：所有小鼠第0天剃毛，第1天到第6天除正常组外所有小鼠每日接受咪喹莫特药物造模，THP组小鼠从第2天到第6天每日接受THP给药治疗，同时，DXMS组每天给予20 mg的复方醋酸地塞米松乳膏；F：每日背部皮损处PASI评分；G：每日小鼠的体重测量；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，vs. Control group；# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001 vs. Model group；
图14是THP治疗对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠血及皮肤组织炎症反应的干预作用；A：皮肤组织IL-1βmRNA的表达水平；B：皮肤组织IL-22 mRNA的表达水平；C皮肤组织TNF-αmRNA的表达水平；D：皮肤组织IL-6 mRNA的表达水平；E：血清炎性细胞因子IFN-γ的含量变化；F：血清炎性细胞因子TNF-α的含量变化；P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，vs. Controlgroup；# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001 vs. Model group；
图15是THP通过调控JAK-STAT3信号通路，减轻咪喹莫特诱导的的小鼠银屑病样的炎症炎症；A：皮肤组织中STAT3表达水平的代表性免疫荧光图像；B：STAT3荧光强度分析；C：皮肤组织中P-STAT3表达水平的代表性免疫荧光图像；D：P-STAT3荧光强度分析；E：皮肤组织中STAT3/P-STAT3、JAK2/P-JAK2、JAK1/P-JAK1蛋白的表达水平；F：皮肤组织中STAT3、JAK1、JAK2 mRNA的相关表达。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。
除非另有描述，本发明的实施将采用细胞生物学、分子生物学、基因工程技术等常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。
总实施例
三叶青多糖在制备防治JAK-STAT通路相关疾病药物中的应用。作为优选，所述JAK-STAT信号通路涉及JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3中的一种或多种。作为优选，所述JAK-STAT通路相关疾病包括银屑病、特应性皮炎、免疫介导的癌症、细胞因子释放综合征。进一步地，所述细胞因子释放综合征包括急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。
三叶青多糖作为JAK-STAT通路抑制剂的应用。作为优选，所述JAK-STAT通路涉及JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3中的一种或多种。作为优选，所述JAK-STAT通路为肺组织、皮肤组织中的JAK-STAT通路。
三叶青多糖在抑制体外细胞中JAK-STAT通路激活中的应用。作为优选，所述体外细胞为体外肺组织、体外皮肤组织中的细胞。其中，体外肺组织细胞优选为肺泡上皮细胞。
三叶青多糖的制备方法包括：三叶青药材粉碎、乙醇浸提、热水浸提、乙醇沉淀、透析、阴离子交换色谱纯化、分子筛（凝胶）色谱纯化、冷冻干燥。
实施例1：三叶青精制多糖的制备
1.1实验试剂和仪器
化学试剂：95％乙醇、浓硫酸（98％）、苯酚、咔唑、四硼酸钠、刚果红、氢氧化钠，均为分析纯。DEAE-52纤维素（上海碧云天生物技术有限公司）、Superdex 200葡琼糖凝胶（北京韦氏博慧色谱科技有限公司）。
试剂盒：Brandford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天P0006）。
实验仪器：恒流蠕动泵（兰格恒流泵有限公司），1.5×30 cm玻璃层析柱、2.6×50cm玻璃层析柱（上海联塔仪器有限公司），HC-0210-10中压层析柱（北京瑞达恒辉科技发展有限公司），BS-100N自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司），旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），LDZ5-2型低速平衡离心机（北京京立离心机有限公司）、SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、Freezone 4.5L冻干机（美国Labconco公司）、3000 kD透析袋（上海碧云天生物技术有限公司），U3000高效液相色谱系统（配备OHpak SB-805 HQ，SB-804 HQ，SB-803 HQ凝胶柱）（美国Thermo Fisher公司），Optilab T-rEX示差折光检测器（美国Wyatt公司），DAWN HELEOS II多角度激光光散射检测器（美国Wyatt公司），ICS 5000+高效液相色谱系统（配备DionexTMCarboPacTMPA-20阴离子交换柱）（美国ThermoFisher公司），安捷伦7890A-5977B气相色谱系统（配备安捷伦BPX70色谱柱）（美国AgilentTechnologies公司），各型移液器（德国Eppendorf公司）。
实验器械：水浴锅、圆底烧瓶、布氏漏斗、滤纸、玻璃棒、烧杯。
1.2实验方法
1.2.1提取三叶青粗多糖
取烘干的三叶青叶片和茎干，粉碎，称取100 g，以95%（v/v）乙醇水溶液（温度为80℃）提取2次，抽滤，滤渣于室温下置通风处晾干，然后用热水（温度为95℃）提取滤渣2次，4000 rpm离心5 min，取上清液抽滤、减压旋蒸浓缩（温度为70℃）。冷却后，加95%（v/v）乙醇水溶液至终浓度80%（v/v），4℃过夜，离心，取沉淀冷冻干燥得到三叶青粗多糖。
1.2.2纯化三叶青粗多糖制备三叶青精制多糖
1.2.2.1透析
取粗多糖溶解于纯水中，纯水透析72 h（截留孔径3000 kD），取出透析袋内液体保存在4℃。
1.2.2.2阴离子交换色谱柱纯化
使用DEAE-52纤维素作为阴离子交换色谱柱填料。使用恒流泵确定流速。去离子水过柱3~5个柱床体积以达到平衡状态（线性流速1.5 cm/min）。取适量透析后的粗多糖的去离子水溶液上样（线性流速0.25 cm/min），以去离子水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脱（线性流速1 cm/min），采用自动部分收集器收集洗脱组分于试管中。采用硫酸-苯酚法检测洗脱组分。取0.4 mol/L NaCl洗脱组分，减压旋蒸浓缩（温度为60℃），透析脱盐（截留孔径3000 kD），冷冻干燥，得到初步纯化的三叶青多糖。
1.2.2.3分子筛（凝胶）色谱柱纯化
使用Superdex 200凝胶作为分子筛（凝胶）色谱柱填料。使用恒流泵确定流速。去离子水过柱3~5个柱床体积以达到平衡状态（线性流速0.3 cm/min）。取初步纯化多糖的去离子水溶液（浓度7.5 mg/mL，线性流速0.3 cm/min）上样，为取得良好的分离效果，每次上样体积为柱床体积的5~10%。用去离子水洗脱（线性流速0.3 cm/min），用自动部分收集器收集组分于试管中。采用硫酸-苯酚法检测洗脱组分。取洗脱组分冷冻干燥，得到三叶青精制多糖。
1.2.3三叶青精制多糖分子量、分子半径和分子构象测定
采用体积排阻色谱联用多角度激光光散射检测和示差折光检测方法（SEC-MALLS-RI），检测三叶青精制多糖的绝对分子量和在水相溶液中的分子构象。三叶青精制多糖溶于0.1 M NaNO3（含0.02% NaN3），浓度1 mg/mL，进样100 μL至液相色谱系统，以0.1 M NaNO3（含0.02% NaN3）作为洗脱液，以0.4 mL/min流速洗脱，通过多角度激光光散射检测器和示差折光检测器记录检测信号，测得三叶青精制多糖的分子量分布范围、重均分子量（Mw）和均方根分子半径（Root mean square radius），利用分子量分布范围和均方根分子半径的双对数作图，根据拟合线斜率推断分子构象。
1.2.4三叶青精制多糖的单糖组成测定
利用高效阴离子交换色谱（HPAEC）测定多糖的单糖组成。5 mg三叶青精制多糖用1mL三氟乙酸（浓度2 M）在121 °C水解2小时。挥干后，用甲醇清洗，在氮气氛围中干燥。复溶于1 mL纯水，取5 μL进样。使用纯水、氢氧化钠溶液、醋酸钠溶液按不同配比组成流动相，以0.5 mL/min梯度洗脱。利用不同浓度的单糖标准品，以相同的操作方法生成标准曲线。将样本峰的保留时间与单糖标准品对比，定量测定三叶青精制多糖的单糖组成。
1.2.5三叶青精制多糖糖链的重复单元结构测定
利用多糖甲基化分析、核磁共振谱等手段，推测多糖糖链的重复单元结构。
1.3实验结果
1.3.1提取三叶青粗多糖
提取到外观黄色的片状多糖，产率12.47%（三叶青粗多糖/三叶青粉，干重比）。
1.3.2纯化三叶青粗多糖制备三叶青精制多糖
初步纯化的三叶青多糖产率20.31%（初步纯化的三叶青多糖/三叶青粗多糖，干重比），外观呈淡黄色絮状，三叶青精制多糖产率67.04%（三叶青精制多糖/初步纯化的三叶青多糖，干重比），外观呈白色絮状。
1.3.3三叶青精制多糖化学成分鉴定
采用硫酸-苯酚法测得三叶青精制多糖中的糖含量为83.5%；采用硫酸-咔唑法测得三叶青精制多糖中的糖醛酸含量为24.73%；采用考马斯亮蓝法测得三叶青精制多糖中的蛋白质含量低于检出限。
1.3.4三叶青精制多糖的分子量、分子半径和分子构象测定
测得三叶青精制多糖的重均分子量（Mw）为3.225×105g/mol，均方根分子半径约在10~100 nm之间，在水相溶液中的分子构象可能是随机线圈。
1.3.5三叶青精制多糖的单糖组成
三叶青精制多糖的单糖组成为鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖和葡萄糖醛酸，摩尔比为2.95: 11.89: 35.77: 1.53: 20.90: 26.95。半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸占主要部分。
1.3.6三叶青精制多糖的重复单元结构测定
推测多糖糖链的重复单元结构如图1所示。
实施例2：三叶青多糖缓解急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的药效试验
2.1实验材料
2.1.1 实验动物及药品
BALB/c雄性小鼠96只，体重20±2 g，购于浙江中医药大学动物实验中心，动物实验经浙江中医药大学批准（伦理批准号:IACUC-20220530-10。实验动物分笼饲养，每3天更换一次垫料，适应性饲养2天，实验期间自由饮水和进食。饲养环境温度为20±2℃，相对湿度为60%，每天12小时光照和12小时黑夜循环。
将小鼠根据组别随机分组：对照组、模型组、DEX组、THP-L组、THP-M组、THP-H组，每组8只。THP，即由实施例1从三叶青中提取的多糖。
2.1.2实验试剂和仪器
化学试剂：DEX（地塞米松，Shyuanye，B25793），LPS（脂多糖，Sigma，L2880）。
试剂盒：BDTMCBA 小鼠炎症检测试剂盒（BD Biosciences，552364），总 RNA 提取试剂盒（Vazyme，R223-01），HiScript II QRT SuperMix for qPCR试剂盒（Vazyme，R223-01），ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒（Vazyme，Q331-03），Diaminobenzidine （DAB，Beyotime，P0202），MPO抗体（Abcam，ab208670），CD42抗体（Abcam，ab183345），F4/80抗体（Invitrogen，MF48000），p-JAK2抗体（Abcam，ab32101），p-STAT1抗体（Santa CruzBiotechnology，sc-8394），p-STAT2抗体（Cell Signaling Technology，88410）。
实验仪器：FA2204电子天平（上海力辰邦西仪器科技有限公司），Allegra64R台式高速冷冻离心机（Beckman库尔特商贸中国有限公司），7500型PCR仪（美国Bio-Rad公司），Q5000型超微量紫外可见分光光度计（美国Quawell公司），5427R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），Accuri™ C6流式细胞仪（美国BD公司），Direct-Q8超纯水一体机（美国Millipore公司），移液器（德国Eppendorf公司），XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。
实验器械：弯头镊，手术剪，止血钳，烧杯，量筒，EP管，离心管，1 mL注射器。 2.1.3药品配置
2.1.3.1三叶青多糖悬液制备
用电子天平称量2.5、3.75、5 mg三叶青多糖粉末倒入10 mL离心管中，加入无菌生理盐水，超声溶解，配制成终浓度为0.25、0.375、0.5 mg/mL工作液，每次使用前涡旋混匀，THP雾化溶液现配现用。
2.1.3.2 LPS溶液配制
用电子天平称量10、40 mg LPS粉末，倒入2 mL离心管中，加入无菌生理盐水，超声溶解，配制成终浓度为0.5、2 mg/mL工作液，LPS溶液现配现用。
2.1.3.3 DEX溶液配制
用电子天平称量2 mg DEX加入10 mL离心管中，加入无菌生理盐水，超声溶解，配制成终浓度为0.2 mg/mL工作液，每次使用前涡旋混匀，DEX溶液现配现用。
2.2实验方法
2.2.1动物分组及模型建立
将小鼠根据组别随机分组，每组8只。
采用气管内灌注LPS （5 mg/kg）建立ALI模型。对照组和模型组分别雾化无菌生理盐水（NS），在LPS刺激前30 min雾化DEX （2 mg/kg）和THP（2.5、3.75、5 mg/kg）组小鼠，每组每天雾化用药1次，连续3 d，造模后24 h处死。
采用LPS（20 mg/kg）腹腔注射建立ARDS模型。对照组和LPS组分别雾化NS，对照组、模型组、DEX（2 mg/kg）和THP（2.5、3.75、5 mg/kg）组小鼠每天雾化1次，连续3 d。DEX组和THP组在末次雾化吸入结束后30 min给予LPS处理，12 h后处死。
2.2.2实验过程
每天观察记录小鼠活动、进食、精神状态、体重状态和死亡等情况；小鼠处死后进行眼眶取血、小鼠肺泡灌洗液提取（BALF）、肺组织拍照、肺组织干湿重比测定、肺组织冻存、肺组织浸泡于10%福尔马林固定。血浆及BALF处理：4℃下12000 rpm离心10 min，取上清，用于细胞因子水平测定；血浆及BALF细胞沉淀用于血细胞分类计数。
2.2.3血浆及BALF细胞因子水平测定
取新1.5 mL离心管，每个管子里加入10 μL细胞因子混合液+10μL细胞上清样本/倍比稀释的标准溶液+10 μL的PE染料，离心混匀。避光室温孵育2 h，每个样本加入100 μL的water buffer，混匀，通过流式细胞仪上样检测。
2.2.4肺组织W/D测定
取同一叶肺组织，进行湿重测定并记录，将湿重测定的肺组织放于离心管中，60℃烘箱放置72 h烘干，后进行干重测定并记录。按照以下公式计算重症肺炎小鼠肺湿干重比（W/D）。
肺湿干重比（W/D）=肺组织湿重（mg）/肺组织干重（mg）×100%。
2.2.5肺组织HE染色
固定组织切片脱水，石蜡包埋。HE染色：先将样品水化，然后用苏木精与伊红染色，最后再对样品脱水，后封片镜检。
2.2.6肺组织免疫组化测定MPO、CD42、F4/80、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT2水平
将切片脱蜡水化，用柠檬酸缓冲液或EDTA进行抗原修复，用3%H2O2进行封闭消除非特异性干扰，在4℃下分别用MPO、CD42、F4/80、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT2孵育肺组织切片，37℃水浴用二抗结合抗体孵育30 min，切片在显微镜下观察标本并拍照。
2.2.7 JAK-STAT通路相关mRNA测定
通过液氮对肺组织进行研磨，加入RNA提取裂解液充分裂解，水相分离，RNA沉淀洗涤和再溶解进行肺组织Total RNA提取，采用超微量紫外可见分光光度计检测RNA浓度。后配置基因组DNA去除体系：RNase-free ddH2O（to 16 μL）、4×gDNA wiper Mix（4 μL）、模板RNA（1 μg），用移液器轻轻吹打混匀，于PCR仪内42℃孵育2 min。加入4 μL的5 × HiScriptII qRT SuperMix II，使逆转录反应体系为20 μL，用移液器轻轻吹打混匀。50℃孵育15min 进行逆转录反应，随后85℃孵育5 s使反转录酶失活。根据qRT-PCR反应体系：2×MagicSYBR Mixture 10 μL，PCR上下游引物各0.4 μL，ROX 0.2 μL，RNAase-free ddH2O 8μL，样本cDNA 1 μL，共20 μL。反应条件为95℃（30s）预变性；循环条件为95℃（5 s）变性，60℃（30 s）退火/延伸，共40个循环；融解曲线分析为95℃（15 s），60℃（1 min），95℃（15 s），50℃（30 s）进行测定。
2.2.8 数据统计
计量资料均用均数±标准差（mean±SD），各组间差异比较用方差分析检验，两两比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），以p<0.05判断统计学意义，“#”表示与正常对照组相比p<0.05，“##”表示与正常对照组相比p<0.01，“###”表示与正常对照组相比p<0.001，“*”表示与模型组相比p<0.05；“**”表示与模型组相比p<0.01；“***”表示与模型组相比p<0.001；用Graphpad Prism9.0进行统计。
2.3 实验结果
2.3.1 三叶青多糖对LPS诱导的ALI小鼠肺组织的影响
研究结果如图2所示：在ALI小鼠中，正常组肺脏色泽正常，质地柔软，无水肿或出血等病理特征。而模型组肺脏肿胀明显，表面呈深红色并伴有明显出血和坏死，可见大量暗红色瘀斑，肺组织水肿程度也显著升高。经THP雾化吸入治疗的小鼠肺脏色泽接近对照组，表面出血及坏死减少，肺组织水肿程度明显下降，肺脏损伤较模型组明显减少。使用免疫组化法分析F4/80表达来测定肺组织中巨噬细胞水平，通过分析CD42水平来评估免疫血栓情况。与对照组相比，模型组肺组织中MPO水平升高，巨噬细胞增多，CD42表达增加，肺组织中免疫血栓明显增多。而经过THP不同给药方式处理后均不同程度降低了MPO水平，减少了巨噬细胞数量，减少了免疫血栓的形成。
2.3.2 三叶青多糖对ALI小鼠血及BALF中炎性细胞的影响
研究结果如图3所示：与对照组相比，LPS诱导可使小鼠血（A-D）及BALF（E-H）中WBC、PLT、中性粒细胞数、淋巴细胞数量增加，THP雾化给药可不同程度降低ALI小鼠BALF和血中的WBC、PLT、中性粒细胞数、淋巴细胞数。
2.3.3 三叶青多糖对ALI小鼠血及BALF中细胞因子的影响
研究结果如图4所示：与对照组相比，LPS诱导可使小鼠血（A-D）中IL-6、MCP-1、TNF-α水平升高，THP雾化给药可不同程度降低ALI小鼠血中的IL-6、MCP-1、TNF-α水平。LPS诱导可使小鼠BALF（E-H）中IL-6、MCP-1、IFN-γ、TNF-α水平升高，而THP雾化给药可不同程度降低ALI小鼠BALF中IL-6、MCP-1、IFN-γ、TNF-α水平。
2.3.4 三叶青多糖对LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的影响
研究结果如图5所示：腹腔注射LPS后72 h内，正常组雾化吸入生理盐水不影响小鼠的存活，在LPS组小鼠存活率显著下降，与模型组相比，不同浓度的THP组中小鼠72 h的存活率有不同程度的提高。与对照组相比，LPS组ARDS小鼠肺组织病理损伤明显，肺组织中MPO水平升高，巨噬细胞增多，CD42表达增加，肺组织中免疫血栓增多。经过DEX组和不同浓度THP组雾化吸入给药均可改善肺组织损伤程度，降低MPO水平，减少巨噬细胞生成和免疫血栓的形成。
2.3.5 三叶青多糖对ARDS小鼠血及BALF中炎性细胞的影响
研究结果如图6所示：与对照组相比，LPS诱导可使小鼠血（A-D）及BALF（E-H）中WBC、PLT、中性粒细胞数、淋巴细胞数量增加，THP雾化给药可显著降低ARDS小鼠血中的WBC、PLT、中性粒细胞数、淋巴细胞数，BALF中WBC、PLT、中性粒细胞数、淋巴细胞数也有所下降。
2.3.6 三叶青多糖对ARDS小鼠血及BALF中细胞因子的影响
研究结果如图7所示：与对照组相比，LPS诱导可使小鼠血（A-D）中IL-6、MCP-1、IFN-γ、TNF-α水平升高，THP雾化给药可不同程度降低ARDS小鼠血中的IL-6、MCP-1、IFN-γ、TNF-α水平。LPS诱导可使小鼠BALF（E-H）中IL-6、MCP-1、TNF-α水平升高，而THP雾化给药可不同程度降低ARDS鼠BALF中IL-6、MCP-1、TNF-α水平。
2.3.7三叶青多糖对ALI/ARDS小鼠中JAK-STAT通路及其mRNA的影响
研究结果如图8所示：与对照组相比，LPS诱导的ALI小鼠肺组织（A）中JAK2、STAT1、STAT2 mRNA水平和LPS诱导的ARDS小鼠肺组织（B）中JAK2、STAT1、STAT2 mRNA水平均显著升高，THP雾化给药可不同程度降低ALI/ARDS小鼠肺组织中JAK2、STAT1、STAT2 mRNA水平。同时，ALI/ARDS小鼠肺组织中p-JAK2、p-STAT1和p-STAT2 水平均显著升高（C），THP雾化给药可显著降低JAK2、STAT1和STAT2的磷酸化。
实施例3：体外三叶青多糖治疗细胞因子风暴调控JAK-STAT的信号通路研究
3.1实验材料
3.1.1实验细胞及药品配制
人非小细胞肺癌细胞（A549），在37℃、5% CO2的DMEM（Gibco，USA）中培养，添加10%热灭活胎牛血清和1%青霉素和链霉素。
3.1.2实验试剂
化学试剂：MTT（Biofroxx，298-93-1），Fedratinib（MedChemExpress，936091-26-8），Fludarabine（MedChemExpress，21679-14-1），TNF-α（Peprotech，300-01A-50），IFN-γ（Peprotech，300-02-100），DEX（Shyuanye，B25793），抗体JAK2（Cell SignalingTechnology，#3230）、p-JAK2（Abcam，ab32101）、STAT1（Abcam，ab281999）、p-STAT1（SantaCruz Biotechnology，sc-8394）、STAT2（Cell Signaling Technology，#72604）、p-STAT2（Cell Signaling Technology，#88410），GAPDH（Affbiotech，AF7021）。
3.2实验方法
3.2.1 A549细胞活力测定
MTT法测定细胞活力。将细胞接种于96孔板，用TNF-α（0.0005-500 ng/mL）或IFN-γ （0.001-1000 ng/mL）处理24、48、72 h， PBS洗涤细胞，每孔加入MTT （5 mg/mL），再用DMSO溶解甲醛晶体，用分光光度计（Epoch2, American Berten Instrument Co.， Ltd.）在570 nm处测定吸光度。
3.2.2 细胞凋亡测定
将A549细胞（2×105细胞/mL）接种在 6 孔板中。在TNF-α和IFN-γ不存在或不存在的情况下，分别用THP（5、10、20μg/mL）或DEX（3μg/mL）提前刺激细胞2h。Fedratinib（Fed,JAK2抑制剂）组和fludarabine（Flu, STAT1抑制剂）组细胞在细胞因子刺激前3 h分别用Fed（1 μg/mL）或Flu（1 μg/mL）预处理。根据Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（Biosharp，China）说明书进行操作，用流式细胞仪（CytoFLEX，Beckman，USA）检测细胞凋亡情况。
3.2.3 细胞因子水平测定
用THP、抑制剂及TNF-α（100 ng/mL）和IFN-γ（200 ng/mL）处理后培养24小时收集的A549细胞上清样品用BDTMCBA Human Inflammation kit试剂盒处理，然后用Accuri™C6流式细胞仪分析细胞因子水平。
3.2.4 实时定量PCR
根据制造商的说明，使用RNA快速纯化试剂盒（ES Science, RN001）从A549 （n=3）中提取总RNA。使用HiScript II QRT SuperMix反转录成cDNA进行qPCR。采用ChamQ SYBRqPCR Master Mix配制qRT-PCR反应。将PCR反应归一化为GAPDH基因，用2−ΔΔCt方法计算基因相对表达量。
3.2.5全基因组RNA测序
将上述提取的A549细胞总RNA用2100生物分析仪（Agilent Technologies）测定RNA质量，用ND-2000（NanoDrop Technologies）定量。经中国上海美吉生物医药生物技术有限公司（http：//www.majorbio.com/）进行RNA文库构建。然后进行RNA-seq数据的生物信息学和网络分析。
3.2.6 免疫印迹分析
用RIPA裂解缓冲液和苯甲磺酰氟（PMSF）制备蛋白质样品，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。简单地说，根据制造商的说明，在还原条件下，将蛋白质在8–12% Tris-Glycine-SDS上分离。转移到PVDF膜上后，阻断膜与指定的一抗在4°C下孵育过夜，然后在室温下洗涤并用二抗染色2小时。在C-DiGit™Blot Scanner成像系统（Tanon, 5200 MμLti）上使用ECL化学发光衬底检测图像，并使用ImageJ软件进行可视化分析。
3.2.7 免疫荧光染色
A549细胞以5×105/孔的密度接种于放置有14mm细胞爬片的24孔培养板上，然后用THP或抑制剂处理，并用TNF-α（100 ng/mL）和IFN-γ（200 ng/mL）培养24小时。用4%多聚甲醛固定细胞，并用添加0.3% Triton X-100的PBS渗透，5%BSA阻断细胞1小时后，用抗p-JAK2（1：200）和p-STAT1（1：500）或p-STAT2（1：100）在4℃下孵育过夜。二抗孵育1.5 h后DAPI染色5分钟，最后在荧光显微镜下观察细胞。
3.3实验结果
3.3.1 IFN-γ与TNF-α协同作用诱导A549细胞炎症损伤
如图9所示：细胞因子刺激24h、48h、72h后，单独的TNF-α几乎不能对细胞活力造成影响，单独的IFN-γ在较高剂量对细胞活力造成影响，而协同组是在较低剂量造成损伤，且损伤效果较单独组更为明显。此外，IFN-γ和TNF-α的协同刺激会影响细胞因子上清中IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度，引起炎症损伤。同时，协同组（IFN-γ 150 ng/mL + TNF-α 75ng/mL, IFN-γ 200 ng/mL + TNF-α 100 ng/mL）与对照组相比，A549细胞中早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞水平显著升高。因此，我们确定A549细胞的细胞因子风暴模型模拟浓度为IFN-γ（200 ng/mL）/TNF-α（100 ng/mL）。
3.3.2三叶青多糖可减轻IFN-γ/TNF-α诱导的细胞炎症损伤
为了确认THP对细胞炎症损伤的改善作用，除上述指标外我们还从RNA水平进行验证。如图10所示：与模型组比较，THP显著降低大鼠早期、晚期细胞凋亡水平，表明THP对IFN-γ/TNF-α联合引起的细胞凋亡损伤有缓解作用。此外，THP给药后，细胞上清中IFN-γ、TNF-α的分泌均明显下调。仅THP-H处理可降低A549细胞中IL-6的浓度。这些结果表明THP减轻了炎症因子的过度分泌，具有显著的治疗效果。与对照组相比，IL-6、IFN-γ和TNF-α mRNA水平显著升高，表明IFN-γ/TNF-α协同作用在RNA水平上带来了显著的炎症损伤。而几乎所有的THP或DEX处理均不同程度地降低了A549细胞中IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA水平，下调了其损伤程度。
3.3.3 三叶青多糖通过IFN-γ/TNF-α激活的JAK /STAT信号通路减轻细胞炎症损伤
为进一步明确THP的作用通路，我们以RNA-seq确定靶点并辅以免疫荧光、免疫印迹等方法进行验证。如图11所示，在经IFN-γ/TNF-α协同诱导后，有2318个差异表达基因（DEGs）产生影响，953个基因表达上调，1365个基因表达下调。对模型组和对照组共调控的DEGs进行KEGG富集分析，前30个KEGG通路包括TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路等。对于JAK/STAT通路相关基因，与对照组相比，模型组共有12个基因上调，1个基因下调。在筛选的12个上调基因中，JAK2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5A和STAT6为代表性基因。
如图12所示，几乎所有治疗组均降低了JAK2、STAT1和STAT2的mRNA水平。与此同时，THP处理抑制IFN-γ/TNF-α刺激的A549细胞中JAK2、STAT1和STAT2的磷酸化水平。为了进一步确定THP是否直接靶向JAK2/STAT抑制细胞因子风暴，我们使用JAK2抑制剂Fed和STAT1抑制剂Flu等JAK-STAT通路抑制剂与THP进行疗效比较。THP/Flu/Fed干预后，细胞上清中IL-6、IFN-γ、TNF-α水平均显著降低，JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、IFN-γ、TNF-α mRNA水平均被显著抑制。免疫荧光结果表明THP处理后，阳性细胞数量减少，p-JAK2/p-STAT1/p-STAT2荧光呈淡绿色和红色，显著弱于模型组。结合流式细胞术、q-PCR和免疫荧光检测结果显示，THP可减轻该过度通路的表达，并可发挥与JAK2或STAT1抑制剂相同的阻断JAK/STAT炎症通路的作用，达到治疗效果。
实施例4：三叶青多糖缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损的药效试验
4.1实验材料
4.1.1 实验动物及药品
C57BL/6J雄性小鼠40只，体重20±2 g，购于浙江中医药大学动物实验中心，动物实验经浙江中医药大学批准（伦理批准号:IACUC-20220530-10。实验动物分笼饲养，每3天更换一次垫料，适应性饲养2天，实验期间自由饮水和进食。饲养环境温度为20±2℃，相对湿度为60%，每天12小时光照和12小时黑夜循环。
将小鼠根据组别随机分组：正常组、模型组、DXMS组、THP组，即由实施例1从三叶青中提取的多糖。
4.1.2实验试剂和仪器
化学试剂：咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限公司，39220601）DXMS（复方醋酸地塞米松乳膏，华润三久医药有限公司，H44024170）。
试剂盒：BDTMCBA 小鼠炎症检测试剂盒（BD Biosciences，552364），总 RNA 提取试剂盒（Vazyme，R223-01），HiScript II QRT SuperMix for qPCR试剂盒（Vazyme，R223-01），ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒（Vazyme，Q331-03），Diaminobenzidine （DAB，Beyotime，P0202），Ki67抗体（Abcam，ab15580），PCNA抗体（Cell signaling technology，#13110)），K17抗体（Cell signaling technology，#4543），p-JAK2抗体（Abcam，ab32101），STAT3抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10253-2-AP），p-STAT3抗体（Abcam，ab267373)。
实验仪器：FA2204电子天平（上海力辰邦西仪器科技有限公司），Allegra64R台式高速冷冻离心机（Beckman库尔特商贸中国有限公司），7500型PCR仪（美国Bio-Rad公司），Q5000型超微量紫外可见分光光度计（美国Quawell公司），5427R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），Accuri™ C6流式细胞仪（美国BD公司），Direct-Q8超纯水一体机（美国Millipore公司），移液枪（德国Eppendorf公司），XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。
实验器械：弯头镊，手术剪，止血钳，烧杯，量筒，EP管，离心管，1 mL注射器。
4.1.3药品配置
4.1.3.1三叶青多糖喷雾制备
用电子天平称20 mg三叶青多糖粉末倒入10 mL离心管中，加入无菌生理盐水，超声溶解，配制成终浓度为2 mg/mL工作液，每次使用前涡旋混匀，装入喷雾瓶内，现配现用。
4.2实验方法
4.2.1动物分组及模型建立
将小鼠根据组别随机分组，每组10只。
将62.5 mg 咪喹莫特乳膏均匀涂抹在小鼠剃毛后的皮肤背侧2 cm×3 cm的面积连续6 d，从造模第1 d起观察小鼠造模部位皮肤变化，出现银屑病样皮损（鳞屑、浸润和红斑等），并随着药物涂抹次数的增加逐渐加重，银屑病皮损面积和疾病严重程度指数（PASI）各项评分与总分均高于正常组（P<0.05），即为造模成功。自造模第2 d起，DXMS组每天给药1次，每次给予20 mg乳膏，而THP组每天给药2次，早晚各1次，每次给予2泵喷雾（使其药物均匀浸润到皮损处）。实验6天后处死，收集样本。
4.2.2银屑病样皮损面积和疾病严重程度评分（PASI）
每日拍照记录，根据评分标准银屑病样皮损面积和疾病严重程度评分（PsoriasisArea and Severity Index Score，PASI评分）进行客观评分系统。对各组小鼠皮损进行鳞屑、浸润及红斑严重程度评分，三者积分之和即为累积得分，取各组每日积分平均值后绘制皮损积分趋势变化图。
4.2.3皮肤组织HE染色
固定组织切片脱水，石蜡包埋。HE染色：先将样品水化，然后用苏木精与伊红染色，最后再对样品脱水，后封片镜检。
4.2.4皮肤组织免疫组化测定Ki67、PCNA水平
将切片脱蜡水化，用柠檬酸缓冲液或EDTA进行抗原修复，用3%H2O2进行封闭消除非特异性干扰，在4℃下分别用Ki67、PCNA孵育皮肤组织切片，37℃水浴用二抗结合抗体孵育30 min，切片在显微镜下观察标本并拍照。
4.2.5皮肤组织免疫荧光测定STAT3、P-STAT3、K17水平
将皮肤组织制备成4μm厚的薄片。脱蜡水化后，切片在0.01M柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）或1X EDTA中加热20 min进行抗原修复。自然冷却15分钟后，用3% H2O2处理10分钟，阻断非特异性蛋白结合。加入一抗（兔抗小鼠K17，稀释度1:200，兔抗小鼠STAT3，稀释度1:100），直至覆盖整个组织，在湿箱中4℃孵育过夜。二抗采用HRP偶联IgG。在200倍放大镜下观察蛋白表达，并使用Image J软件进行密度分析（n = 10个随机选择的场/样本）。
4.2.6 JAK-STAT通路相关蛋白测定
用裂解液提取皮肤组织总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，并对蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），从凝胶润湿到硝化纤维素膜。封膜后（3% BSA）检测一抗（P-STAT3、STAT3、P-JAK2、JAK2、GAPDH）和二抗（兔抗体、小鼠抗体）。用ECL检测蛋白表达，并用Tanon 5200 CL成像分析系统（Tanon,China）进行印迹检测。所有蛋白水平分别用总蛋白和GAPDH归一化，并用Image J软件定量。
4.2.7 JAK-STAT通路相关以及IL-6、TNF-α等炎性细胞因子mRNA测定
通过液氮对皮肤组织进行研磨，加入RNA提取裂解液充分裂解，水相分离，RNA沉淀洗涤和再溶解进行皮肤组织Total RNA提取，采用超微量紫外可见分光光度计检测RNA浓度。后续步骤同“2.2.7”
4.2.8 细胞因子水平测定
用BDTMCBA Human Inflammation kit试剂盒处理收集到的血清样本，然后用Accuri™C6流式细胞仪分析细胞因子水平。
4.2.9 数据统计
计量资料均用均数±标准差（mean±SD），各组间差异比较用方差分析检验，两两比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），以p<0.05判断统计学意义，“*”表示与正常对照组相比p<0.05，“**”表示与正常对照组相比p<0.01，“***”表示与正常对照组相比p<0.001，“#”表示与模型组相比p<0.05；“##”表示与模型组相比p<0.01；“###”表示与模型组相比p<0.001；用Graphpad Prism9.0进行统计。
4.3 实验结果
4.3.1 THP改善咪喹莫特诱导的小鼠牛皮癣样病变
通过局部应用THP喷雾剂，检测THP在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病皮肤炎症中的作用。动物实验设计如图13 E所示。每天测量小鼠的体重变化，在造模2-3天体重明显下降，然后逐渐恢复正常（图13 G）。结果显示，咪喹莫特处理引起小鼠背部银屑病病变（即鳞状斑块和红肿，图13 A），而THP治疗明显抑制病变内的红斑和鳞屑，并使用PASI量化整体疾病严重程度，如图13 F所示。THP可显著降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的PASI，其作用与地塞米松相当。模型组小鼠脾脏异常肿大，给予THP和地塞米松使脾脏大小恢复正常（图13 C），脾脏指数明显下降（图13 D）。此外，THP还能在一定程度上改善脾组织红髓、白髓边界不清等病理改变（图13 B）。
4.3.2 THP改善了咪喹莫特诱导的小鼠牛皮癣样炎症反应
采用RT-PCR和流式细胞术观察THP对促炎细胞因子表达的影响。如图14 A-F所示，IMQ可提高小鼠血清中细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达;同时，经THP处理后，小鼠皮损中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-22 mRNA表达量显著升高，血清中因子TNF-α、IFN-γ表达量降低。促炎因子IL-1β （P<0.05）、TNF-α（P<0.001）、IL-6（P<0.001）、IL-22（P<0.01）在皮损组织中的相对表达量均显著低于模型组。
4.3.3 THP调节银屑病样皮损处JAK/STAT3信号通路
采用免疫荧光、Western Blot和RT-qPCR检测THP对JAK/STAT3信号通路的影响。如图15 A-D所示。免疫荧光结果显示，与正常组比较，模型组大鼠体内STAT3 （P<0.05）和P-STAT3 （P<0.01）的表达均显著升高，THP可显著抑制STAT3和P-STAT3蛋白的过表达（P<0.01）。免疫印迹实验进一步支持上述免疫荧光结果。与模型组比较，THP处理后，STAT3、P-STAT3表达明显降低（图15 E）（P<0.05）。同时，结果显示，与模型组比较，THP治疗组P-JAK2/JAK2和P-JAK1/JAK1比值降低。如图15 F所示，经THP处理后，STAT3和JAK1的mRNA表达显著降低。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、生物材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.三叶青多糖在制备防治JAK-STAT通路相关疾病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述JAK-STAT信号通路涉及JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述JAK-STAT通路相关疾病包括银屑病、特应性皮炎、免疫介导的癌症、细胞因子释放综合征。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述细胞因子释放综合征包括急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。
5.三叶青多糖作为JAK-STAT通路抑制剂的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述JAK-STAT通路涉及JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3中的一种或多种。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述JAK-STAT通路为肺组织、皮肤组织中的JAK-STAT通路。
8.三叶青多糖在抑制体外细胞中JAK-STAT通路激活中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述体外细胞为体外肺组织、体外皮肤组织中的细胞。
10.如权利要求1-7之一所述的应用，其特征在于：所述三叶青多糖的制备方法包括：三叶青药材粉碎、乙醇浸提、热水浸提、乙醇沉淀、透析、阴离子交换色谱纯化、分子筛（凝胶）色谱纯化、冷冻干燥。
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