CN117813424A - 用于分析生物样品的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在表面上生成cDNA文库以并且分析来自支持物的表面上的多个细胞的核酸分子的方法和系统。在一些实施方案中，本发明包括用于分析同一平坦表面的独立区域上的多个单个细胞的转录组的方法。
Description
交叉引用
本申请要求2021年6月11日提交的美国临时申请号63/209,544的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地且单独地指示以引用的方式并入。就以引用的方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
背景技术
生物样品分析是现代医学的基石之一。虽然最近在特定脱氧核酸(DNA)分子的分析方面取得了进展，但对从特定细胞或组织样品生成的核酸分子(例如，DNA、核糖核酸(RNA))的分析仍然是行业需要克服的障碍。例如，基于样品中经测序的核酸的序列和丰度来分析细胞中的基因表达谱(例如，转录组)仍然是低效且劳动密集型的。当前可用的测序技术具有弊端。例如，对RNA样品进行测序需要在测序之前首先将RNA转化为双链cDNA形式的样品制备方法。因此，为了测序而制备包含RNA的生物样品常常是劳动密集型的。此外，当前的测序技术在将起源单链RNA分子转化为双链cDNA之后保留其链特异性信息方面不是最佳的。保留链特异性信息对于确定基因表达水平的注解可能非常重要。
细胞分析领域将受到多重单细胞分析方法的可用性的推动，尤其是RNA-seq方法，RNA-seq方法提供了细胞基因表达的灵敏且便利的测量。
发明内容
本发明涉及用于在表面上生成cDNA文库的方法和系统。在一些实施方案中，本发明涉及用于分析来自固体支持物的表面上的多个细胞的核酸分子(诸如信使RNA)的方法和系统。在一些实施方案中，本发明涉及用于从来自布置在固体支持物的表面上的多个细胞的核酸分子合成cDNA的方法。在一些实施方案中，本发明方法涉及确定布置在固体支持物的表面上的细胞的转录组。在一些实施方案中，此类方法可以包括：(a)提供固体支持物，其中固体支持物在表面上包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；(b)使表面的独立区域与不同细胞的一个或多个核酸分子接触，以在每个独立区域中产生一个或多个被捕获的核酸分子，其中不同独立区域中的被捕获的核酸分子来自不同细胞；以及(c)从被捕获的核酸分子或其衍生物合成cDNA分子，其中每个cDNA分子与固体支持物的表面偶联，并且其中与不同独立区域偶联的cDNA分子来自不同细胞。在一些实施方案中，与表面偶联的cDNA分子包括共价键合至表面的cDNA分子。在一些实施方案中，此类方法还包括扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物的多个扩增子集，其中每个扩增子集来自不同细胞。在一些实施方案中，多个细胞的转录组通过对扩增子的cDNA分子进行测序来确定。在一些实施方案中，固体支持物的表面的独立区域由包封多个细胞中的每个细胞的水凝胶室确定。在一些实施方案中，接触步骤包括用释放一个或多个核酸分子的裂解剂处理细胞。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，表面包含扩散性改性剂，其减少或阻止一个或多个核酸扩散远离细胞。在一些实施方案中，扩散性改性剂包括凝胶屏障。在一些实施方案中，改变扩散性的凝胶屏障包括水凝胶室。在一些实施方案中，固体支持物的表面包含布置在其上的细胞。在一些实施方案中，固体支持物的表面包含扩散性改性剂。在上述实施方案的变型中，固体支持物的表面是平坦表面。在一些实施方案中，本发明系统和方法采用光学系统以便收集来自平坦表面上的经标记的细胞和/或分子的光学信号。
本文提供的方面是一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中cDNA分子与固体支持物偶联；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’区处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集，其中cDNA分子或其衍生物集与固体支持物偶联。在一些实施方案中，合成包括进行逆转录和一个或多个第二链合成反应。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集与多个表面引物探针偶联。在一些实施方案中，衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集包含衔接子。在一些实施方案中，该方法包括在使固体支持物与一个或多个核酸分子接触之后，使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸(template switch extension)、随机引物法(random priming)或两者。在一些实施方案中，在将衔接子插入在cDNA分子的3’区处之前，该方法包括扩增cDNA分子或其衍生物。在一些实施方案中，在将衔接子插入在cDNA分子的3’区之前，该方法包含溶液中的引物序列。在一些实施方案中，使用溶液中的引物序列扩增cDNA分子。在一些实施方案中，在将衔接子插入在cDNA分子的3’区处之前，该方法包括片段化cDNA分子或其衍生物。在一些实施方案中，将衔接子插入在cDNA分子的3’区处包括单链连接。在一些实施方案中，将衔接子插入在cDNA分子的3’区处包括标签化。在一些实施方案中，将衔接子插入在cDNA分子的3’区处包括双链连接。在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，在扩增cDNA分子之前，使多个表面引物探针进行使封闭剂经历解封闭多个表面引物探针的至少子集的反应，以允许延伸反应。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。在一些实施方案中，该方法包括切割或线性化cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。在一些实施方案中，该方法包括封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与包含与DNA分子集的子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。在一些实施方案中，该方法包括对固体支持物上的cDNA分子或其衍生物的子集进行原位测序。在一些实施方案中，该方法包括将cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，DNA是经片段化的单链DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA。在一些实施方案中，RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，RNA分子包括mRNA。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸(randomer)、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以包括孔、珠子、凝胶基体或流体通道。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针附接至固体支持物的平坦表面。在一些实施方案中，流体通道包括流动池。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，扩增包括固体支持的扩增。在一些实施方案中，固体支持的扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。在一些实施方案中，该方法发生在凝胶基体中，其中凝胶基体与固体支持物相邻。
本文提供的方面是一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获物探针；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子；首先扩增cDNA分子或其衍生物以生成经扩增的cDNA群体；将衔接子插入在经扩增的cDNA分子或其衍生物的3’区处，从而生成带标签的经扩增的cDNA群体；以及对带标签的经扩增的cDNA群体进行固体支持的扩增以生成cDNA分子或其衍生物集。在一些实施方案中，合成包括对被捕获的RNA模板进行逆转录。在一些实施方案中，固体支持物包含多个表面引物探针。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物、经扩增的cDNA群体、带标签的经扩增的cDNA群体、cDNA分子或其衍生物集或其任何组合与多个表面引物探针偶联。在一些实施方案中，衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集包含衔接子。在一些实施方案中，该方法包括使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些实施方案中，合成包括进行包括cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括随机引物法。在一些实施方案中，该方法包括片段化经扩增的cDNA分子。在一些实施方案中，衔接子的插入包括单链连接。在一些实施方案中，衔接子的插入包括标签化。在一些实施方案中，衔接子的插入包括双链连接。在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，该方法包括使封闭剂经历解封闭多个表面引物探针的至少一个子集的反应，以允许延伸反应。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。在一些实施方案中，该方法包括切割或线性化cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。在一些实施方案中，该方法包括封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与包含与DNA分子集的子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。在一些实施方案中，该方法包括对固体支持物上的cDNA分子或其衍生物的至少子集进行原位测序。在一些实施方案中，该方法包括将cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，DNA是经片段化的单链DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA。在一些实施方案中，RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，RNA分子包括mRNA。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物包括孔、珠子、凝胶基体或流体通道。在一些实施方案中，流体通道是流动池。在一些实施方案中，固体支持物不是珠子。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，首先扩增包括固体支持的扩增。在一些实施方案中，首先扩增包含溶液中的引物序列。在一些实施方案中，固体支持的扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。在一些实施方案中，该方法发生在凝胶基体中，其中凝胶基体与固体支持物相邻。
本文提供的方面是一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中合成包括进行逆转录；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集。在一些实施方案中，合成包括进行包括cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应通过包含模板转换部分的多个表面引物探针的子集介导。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物、cDNA分子或其衍生物集或两者与多个表面引物探针偶联。在一些实施方案中，衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集包含衔接子。在一些实施方案中，该方法包括使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些实施方案中，该方法包括扩增cDNA分子或其衍生物。在一些实施方案中，扩增包含溶液中的引物序列。在一些实施方案中，衔接子的插入包括片段化cDNA分子。在一些实施方案中，衔接子的插入包括单链连接。在一些实施方案中，衔接子的插入包括标签化。在一些实施方案中，衔接子的插入包括连接。在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，该方法包括使封闭剂经历解封闭多个表面引物探针的至少子集的反应，以允许延伸反应。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。在一些实施方案中，该方法包括切割或线性化cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。在一些实施方案中，该方法包括封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与包含与DNA分子集的子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。在一些实施方案中，该方法包括对固体支持物上的cDNA分子或其衍生物的至少子集进行原位测序。在一些实施方案中，该方法包括将cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，DNA是经片段化的单链DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA。在一些实施方案中，RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，RNA分子包括mRNA。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物包括孔、珠子、凝胶基体或流体通道。在一些实施方案中，流体通道是流动池。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，扩增包括固体支持的扩增。在一些实施方案中，固体支持的扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。在一些实施方案中，该方法发生在凝胶基体中或与凝胶基体相邻，其中凝胶基体与固体支持物相邻。
本文提供的方面是一种固体支持物，其包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置为与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物包括孔、珠子、凝胶基体或流体通道。在一些实施方案中，流体通道是流动池。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，DNA是片段化的。在一些实施方案中，DNA是单链DNA。在一些实施方案中，RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，RNA分子包括mRNA。在一些实施方案中，固体支持物包含凝胶基体，其中凝胶基体与固体支持物相邻。
本文提供的方面是一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中合成包括进行逆转录，并且其中cDNA分子与固体支持物偶联；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集，其中cDNA分子或其衍生物集与固体支持物偶联。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集与多个表面引物探针偶联。在一些实施方案中，衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集包含衔接子。在一些实施方案中，该方法包括使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些实施方案中，合成包括进行包括cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括随机引物法。在一些实施方案中，该方法包括扩增cDNA分子或其衍生物。在一些实施方案中，扩增包含溶液中的引物序列。在一些实施方案中，衔接子的插入包括片段化cDNA分子。在一些实施方案中，衔接子的插入包括单链连接。在一些实施方案中，衔接子的插入包括标签化。在一些实施方案中，衔接子的插入包括连接。在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，该方法包括使封闭剂经历解封闭多个表面引物探针的至少子集的反应，以允许延伸反应。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。在一些实施方案中，该方法包括切割或线性化cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。在一些实施方案中，该方法包括封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与包含与DNA分子集的子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。在一些实施方案中，封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端包括使DNA分子或其衍生物集的子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。在一些实施方案中，该方法包括对固体支持物上的cDNA分子或其衍生物的至少子集进行原位测序。在一些实施方案中，该方法包括将cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，DNA是经片段化的单链DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA。在一些实施方案中，RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，RNA分子包括mRNA。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物包括孔、珠子、凝胶基体或流体通道。在一些实施方案中，流体通道是流动池。在一些实施方案中，固体支持物不是珠子。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，扩增包括固体支持的扩增。在一些实施方案中，固体支持的扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。在一些实施方案中，该方法发生在凝胶基体中，其中凝胶基体与固体支持物相邻。
本文提供的方面包括一种用于从来自多个细胞的一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，固体支持物包括表面，表面包含附接至其的一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针并且包含布置在其上的多个细胞；使表面的独立区域与多个细胞中的不同细胞的一个或多个核酸分子接触，以在每个独立区域中产生一个或多个被捕获的核酸分子，其中不同独立区域中的核酸分子来自多个细胞中的不同细胞；以及从被捕获的核酸分子或其衍生物合成cDNA分子，其中每个cDNA分子与多个表面引物探针中的表面引物探针偶联，并且与不同独立区域偶联的cDNA来自多个细胞中的不同细胞。在一些实施方案中，接触包括用裂解试剂处理多个细胞中的不同细胞，以从多个细胞中的不同细胞释放一个或多个核酸分子。在一些实施方案中，该方法还包括扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物的多个扩增子集。在一些实施方案中，多个细胞的转录组通过对扩增子的cDNA分子进行测序来确定。在一些实施方案中，附接至表面的cDNA分子包含编码表面上的位置的空间条形码，并且还包括在测序之前将cDNA分子从表面上洗脱下来。在一些实施方案中，接触一个或多个核酸分子是在降低一个或多个核酸分子的扩散性的扩散性改性剂的存在下进行的。在一些实施方案中，表面包括封装布置在其上的细胞的凝胶层，或者其中布置在表面上的每个细胞被独立凝胶体封装。在一些实施方案中，布置在表面上的每个细胞被水凝胶室包封。在一些实施方案中，水凝胶室包括内部区域，并且其中接触还包括在预先确定的温度下温育被释放的一个或多个核酸分子，使得被捕获的一个或多个核酸分子被释放并且在内部区域内被捕获探针重新捕获。在一些实施方案中，选择水凝胶室的内部区域，使得经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离为至少0.25μm。在一些实施方案中，选择水凝胶室的内部区域，使得经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离为至少1μm。在一些实施方案中，选择水凝胶室的内部区域，使得经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离为至少2μm。在一些实施方案中，经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离的范围为0.5μm至5μm。
本文所提供的方面包括一种水凝胶室，其布置在表面上，其中水凝胶室包括内部区域，内部区域包括来自单个细胞的核酸分子的基本上均匀的分布。在一些实施方案中，核酸分子是mRNA分子。在一些实施方案中，基本上均匀的分布是核酸分子之间的预期最近邻距离为1μm或更大的泊松分布。在一些实施方案中，核酸分子的均匀的分布基本上是泊松分布。
本文提供的方面包括一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物的方法，该方法包括：提供固体支持物，固体支持物包括表面，其中表面未被分区，并且其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；在固体支持物上生成离散区域，其中离散区域包含独特于离散区域的一个或多个细胞；从一个或多个细胞提取一个或多个核糖核酸(“RNA”)分子，其中一个或多个RNA分子被位于离散区域中的一个或多个核酸分子捕获探针捕获，从而生成独特于离散区域的一个或多个被捕获的RNA分子；从一个或多个被捕获的RNA分子或其衍生物合成cDNA分子，其中cDNA分子与位于离散区域中的多个表面引物探针中的表面引物探针偶联；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’区处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集，其中cDNA分子或其衍生物集与固体支持物偶联。在一些实施方案中，离散区域被聚合物基体围绕。在一些实施方案中，每个离散区域包含单个细胞。在一些实施方案中，该方法发生在聚合物基体内。在一些实施方案中，聚合物基体形成水凝胶。在一些实施方案中，聚合物基体由一种或多种聚合物前体形成。在一些实施方案中，聚合物基体包括大小设定为允许试剂扩散通过聚合物基体的孔隙，其中RNA分子不可以扩散通过聚合物基体的孔隙。在一些实施方案中，固体支持物包括一个或多个离散区域，并且其中一个或多个离散区域不与另一离散区域流体连通。在一些实施方案中，固体支持物不是珠子。在一些实施方案中，未被分区的表面包括平坦表面，其中平坦表面上的每个点或定位与平坦表面上的每个其他点或定位流体连通。
附图说明
本专利申请含有至少一幅以彩色绘制的附图。在提出请求并支付必要费用后，专利局将提供具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请的副本。
图1A示出根据一些实施方案的用于生成转录组的当前技术的图。
图1B示出根据一些实施方案的用于生成转录组的当前技术的工作流程。
图2A示出用于从被捕获的mRNA原位获得改进的转录组并且从被捕获的mRNA直接生成可测序文库的工作流程。使用第一和第二引物(诸如，P5和P7引物)的表面涂层来直接在表面上生成文库。扩增步骤可以潜在地使用桥式扩增进行，但也可以通过溶液中的引物进行。因此生成的表面簇可以直接原位测序，或者可以将文库从表面上洗脱下来以便单独测序。
图2B示出通过本发明的一个实施方案解决的问题，该实施方案涉及分析由平坦表面上的相邻细胞释放的核酸分子。
图2C示出一个实施方案，其使用扩散性改性剂解决图2B的问题。
图2D示出一个实施方案，其中扩散性改性剂是封装布置在平坦表面上的细胞的凝胶层。
图2E-图2F示出一个实施方案，其中扩散性改性剂是包封单个细胞的水凝胶室。
图2G示出一个实施方案，其中扩散性改性剂是除在细胞周围的腔或孔之外的水凝胶层。
图2H示出与被捕获的核酸分子在释放被捕获的核酸分子的细胞附近的分布相关的问题。
图2I示出本发明的一个实施方案，该实施方案通过使用水凝胶室和用于使细胞核酸分子不稳定并将其重新捕获以产生被捕获的分子在水凝胶室的内部表面上的均匀的分布的方法来解决图2H的分布问题。
图3示出在通过利用本文所述的方法和系统获得转录组的工作流程中按需使用3’-磷酸核苷酸来封闭和解封闭引物。此使用与图2A所示的使用类似。然而，最初表面P5和P7引物探针是封闭的(显示为P5*和P7*)。当要将它们用于扩增或文库构建时，则可以使用化学或酶促过程将它们解封闭。这减少了不需要的表面杂交和背景。
图4示出使用互补序列以通过与引物杂交来保持引物不可用。引物可以通过去杂交和洗掉互补序列而被激活或变得可用。与图3类似，代替封闭表面P5和P7引物探针，P5和P7引物探针可以与表面上的互补P5’和P7’探针杂交，以便减少不需要的杂交。P5和P7引物探针在表面激活之前可以是未杂交的。
图5示出使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT，上图)或互补寡核苷酸(下图)来减少由于二级结构造成的核酸降解。TdT酶可以封闭cDNA簇的3’末端，使得如果此末端折叠回到cDNA分子上(更具体地，在Poly-T捕获探针上)并形成二级结构，则它不可能被延伸并在测序期间产生噪声信号，导致降低测序信号的质量。此步骤可以在聚集和切割或线性化步骤之后进行。替代地，可以使用互补的寡核苷酸代替TdT(下图)以防止自身折叠。
图6示出在片段化之前对mRNA进行原位扩增，以改进用于在脱流动池(off-flowcell)工作流程(上图)和在流动池(on-flow cell)工作流程(下图)中获得单个细胞转录组并增加其质量的工作流程。
图7示出使用外切核酸酶来消化表面或溶液中未使用和未附接的引物。例如，可以消化未捕获任何RNA分子的未附接的捕获探针(例如，具有Poly-T的探针)。
图8A示出用于模板转换的引物的使用。代替对寡核苷酸使用游离的溶液中的模板转换，可以将表面引物用于模板转换。这种改进可以增加模板转换过程的效率，并且避免在模板转换过程期间形成多联体，因此增加整个工作流程的mRNA捕获效率。
图8B示出一个实施方案，其中条形码和捕获探针被分组在不同表面引物上。
图9示出组合使用图2(在表面上的文库构建)、图3(对表面引物进行3’封闭以便避免不需要的杂交和延伸)、图5(使用TdT以便封闭cDNA的3’末端)和图7(使用外切核酸酶处理以去除不需要的捕获探针)中描述的改进以改进当前可用的测序技术。
图10示出根据一些实施方案，布置在流体装置中的通道的一部分的示意图。
图11A示出根据一些实施方案，如本文所提供的系统的一部分，其包括能量源。
图11B示出根据一些实施方案，在如本文所提供的系统的一部分中在生物组分周围形成的聚合物基体。
图11C示出根据一些实施方案，在如本文所提供的系统中在生物组分周围形成聚合物基体的方法。
图12是描绘形成聚合物基体的实施方案的流程图。
图13A示出根据一些实施方案，在流体装置中包括捕获元件的通道的一部分。
图13B示出根据一些实施方案，在流体装置中与包括通道的系统的一部分的表面上的捕获元件偶联的生物组分。
图13C示出根据一些实施方案，在包括流体装置的通道的一部分的系统中布置在生物组分周围的聚合物基体。
图14是描绘在偶联至表面的生物组分周围形成聚合物基体的实施方案的流程图。
图15A示出包括有包括可密封开孔的流体装置的系统的另一实施方案的一部分。
图15B示出根据一些实施方案，在包括流体装置的系统的一部分中捕集生物组分的方法。
图16A示出根据一些实施方案，包括流体装置的系统的一部分的示意图的俯视图。
图16B示出根据一些实施方案，包括流体装置的一部分的系统的示意图的俯视图，包括聚合物基体。
图17示出根据一些实施方案，包括流体装置的系统的一部分的示意图的俯视图，包括多种不同试剂。
图18A示出根据一些实施方案，空间能量调制元件和圆柱形聚合物基体的一部分。
图18B示出根据一些实施方案，空间能量调制元件和空心圆柱体形状的聚合物基体的一部分。
图19示出根据一些实施方案，封装一个或多个生物组分的聚合物基体区室的显微照片。
图20A示出根据一些实施方案，在多步骤聚合物基体形成过程中形成的敞开区室。
图20B示出根据一些实施方案，在多步骤聚合物基体形成过程中形成的闭合区室。
图21A是根据一些实施方案，涂覆有排斥元件的流体装置的表面的一部分的示意图。
图21B示出根据一些实施方案，使用排斥元件在表面上捕获的生物组分的显微照片。
图21C示出根据一些实施方案，使用排斥元件在表面上捕获的生物组分的更高放大倍数的显微照片。
图22A和图22B示出用于合成与本发明一起使用的水凝胶室的系统。
本公开的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下对说明性实施方案阐述的具体实施方式，将会获得对本公开的特征和优点的更好的理解。
具体实施方式
概述
本文提供了用于生成测序就绪(sequencing-ready)核酸分子(例如，DNA分子集)的系统和方法，其包括官能化的固体支持物。本文所述的系统和方法提供了核酸分子集，核酸分子可以在生成它们的固体支持物上进行原位测序，或者可以从固体支持物上洗脱下来以进行异地测序，其中系统和方法改进了当前可用的测序技术(图1A和图1B)，重点是第二链合成。在一些实施方案中，系统和方法可以对核酸分子的第一链核酸、第二链核酸或第一链和第二链核酸两者进行测序。在一些实施方案中，该方法包括从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集，其通过以下进行：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中合成包括进行逆转录和一个或多个第二链合成反应，其中cDNA分子与固体支持物偶联；以及将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’区处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集，其中cDNA分子或其衍生物集与固体支持物偶联。在一些实施方案中，该方法包括使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。
在一些实施方案中，该方法包括将衔接子插入在经扩增的cDNA分子或其衍生物的3’区处，从而生成带标签的经扩增的cDNA群体；以及对带标签的经扩增的cDNA群体进行固体支持的扩增以生成cDNA分子或其衍生物集。在一些情况下，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些方面中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些情况下，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，该方法包括封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。在一些实施方案中，本文描述了一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中合成包括进行逆转录；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集。
在一些实施方案中，本文描述了一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中合成包括进行逆转录；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集。
在一些实施方案中，本文描述一种系统，其包括固体支持物，固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分。在一些实施方案中，本文描述一种利用用于从一个或多个核酸分子制备互补脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的系统的方法，该方法包括：提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中合成包括进行逆转录，并且其中cDNA分子与固体支持物偶联；将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物集，其中cDNA分子或其衍生物集与固体支持物偶联。在一些实施方案中，利用系统的方法包括使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。在一些情况下，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些实施方案中，该方法包括扩增cDNA分子或其衍生物。在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。
在一些实施方案中，本文所述的系统或方法包括使用与本文所述的流体装置中的单独组分的至少一部分相邻或围绕本文所述的流体装置中的单独组分的至少一部分形成的聚合物基体(例如，水凝胶基体)。水凝胶基体可以在系统检测组分之后选择性地生成以围绕组分，或者水凝胶基体可以根据流体装置中预先限定的图案来生成。水凝胶基体可以允许试剂和较小的实体通过，同时使生物样品的单个组分保持在适当的位置。因为一个或多个单个组分可以定位在流体装置内(例如，被封装)，并且定位的组分可以在分析期间和/或分析之间中暴露于一种或多种试剂和/或洗涤溶液，所以可以在区室内进行多项测定(例如，同时、基本上同时、连续等)。可以在流体装置的不同定位中进行不同的测定，例如，以测试不同处理条件的影响。另外，因为组分通常不混合和合并，所以可以防止组分的浓度低(例如，由于稀释)。例如，当分析基因组物质时，由于每个区室中遗传物质的保存，可以避免扩增步骤。通过在区室内有两种或更多种组分，也可以研究组分之间的相互作用。聚合物基体可以“根据需要”降解，从而实现受控的定位和释放机制。本文所提供的解决方案可以保留组分的空间信息并生成细胞、蛋白质组、转录组或基因组水平的数据。由于保留了空间信息，数据可以与表型数据相关联(例如，有联系)。此外，本文所提供的解决方案可以保留组分的空间信息以及联系细胞、蛋白质组、转录组或基因组水平上的数据(例如，表型数据)。
在一些实施方案中，本发明涉及在表面的独立区域中合成表面附接的cDNA分子集。此类表面附接的cDNA分子来源于被捕获的核酸，使得不同独立区域中的cDNA分子基本上来自不同细胞。每当将细胞随机(例如以泊松分布)布置在表面上时，例如在测量单细胞转录组中，用于最小化被捕获的分子的重叠与用于最大化通量的细胞浓度(或密度)之间存在权衡。即，表面上的细胞密度越高意味着从相邻细胞捕获的核酸重叠的可能性越大，而密度越低意味着测量的转录组越少。根据本发明的方面，这种权衡可以通过提供扩散性改性剂来影响；即，减少或阻止从细胞释放的核酸分子的扩散的剂，从而促进被更接近起源细胞的捕获探针捕获(与不存在扩散性改性剂的情况相比)。扩散性改性剂可以是包含细胞的反应混合物或介质的成分，诸如可溶性聚合物，如琼脂糖、聚(乙二醇)(PEG)、葡聚糖、聚(乙烯)醇、聚(乙酸乙烯酯)、聚酰胺、多糖、聚赖氨酸、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚(丙烯酸)等。在一些实施方案中，扩散性改性剂可以是黏度改性剂，诸如甘油、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素等。在一些实施方案中，扩散性改性剂可以是围绕表面上的一些或全部细胞的凝胶屏障，诸如表面上的凝胶层。在其他实施方案中，扩散性改性剂可以是封装或包封单独细胞的不连续凝胶屏障的集合。在一些实施方案中，此类不连续凝胶屏障包含各自封装单个细胞的凝胶材料的单个团块或主体，或者此类不连续凝胶屏障可以是凝胶室或笼的集合，凝胶室或笼包括包封单个细胞的聚合物基体壁，但其可以或可以不与细胞接触。在一些实施方案中，此类凝胶室是水凝胶室(如本文进一步描述)。在一些实施方案中，通过在包含细胞的反应混合物中提供扩散性改性剂来促进核酸分子与表面的独立区域的接触。在其他实施方案中，通过为多个细胞中的每个细胞提供水凝胶室来促进这种接触。
上文实施方案的方面在图2B-图2H中示出。上文实施方案所解决的问题在图2B中示出。在上图中，细胞(252)和细胞(253)布置在表面(250)上，它们之间具有距离D1(256)。表面(250)包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针。例如，此类捕获探针可以被设计为捕获polyA mRNA，并且此类表面引物探针可以包含常规引物，例如用于被捕获和逆转录的mRNA的表面扩增的P5和P7引物(或其互补序列)。在一些实施方案中，两个捕获探针和表面引物探针集均共价附接至表面(250)并且以预先确定的密度均匀地涂覆表面(250)。在裂解(258)并释放细胞核酸分子(诸如信使RNA(mRNA))之后，被释放的核酸分子的一部分接触表面(250)并且被捕获探针捕获。捕获率取决于细胞核酸分子的浓度，裂解后的浓度由它们从它们的起源细胞的扩散决定。因此，对于裂解后的给定时间，捕获的最大可能性最接近起源细胞，此后随着距起源细胞的径向距离增加，这种可能性单调下降。图2B中的彼此距离不同的两对细胞说明了这种现象。分别来自裂解的细胞(252)和(253)的被捕获的核酸分子((254)和(255))的密度分布以灰度拓扑地显示，最高密度最暗，并且最低密度最亮。在裂解后的给定时间，来自特定细胞的核酸分子主要被相邻于裂解的细胞的捕获探针捕获。对于此时相距D1的细胞，被捕获的分子没有重叠(或重叠最小)(256)。如下图所示，对于相隔距离D2的彼此较近的细胞，被捕获的核酸分子有显著的重叠(264)。根据本发明的一些实施方案，表面上布置的细胞的密度与例如单细胞转录组测量的数量之间的权衡可以通过在扩散性改性剂的存在下进行裂解步骤来改进，这使核酸分子的扩散速率降低。
如上文所提及，多种试剂可用于降低核酸分子的扩散性，使得(如图2C所示)以相同距离的D1和D2的细胞对((266)和(267)；(268)和(269))不产生重叠的被捕获的核酸分子(265)，因为被释放的核酸分子的扩散速率已经降低。这样允许更大密度的细胞被布置在表面(250)上，以便对被释放的细胞分子(诸如细胞核酸分子)进行分析。
图2D示出采用包含扩散性改性剂的凝胶层(272)的实施方案，凝胶层(272)围绕布置在表面(270)上的细胞。测定试剂，诸如裂解试剂、聚合酶、核苷三磷酸、引物等，可以通过使它们以液体层(277)的方式在凝胶层(272)上流过(273)并使它们扩散至布置在表面(270)上的细胞(例如(274)和(275))来递送至细胞。凝胶层(272)可以通过以包含一种或多种聚合物前体的反应混合物的形式将细胞布置在表面(270)上来形成。在布置后，凝胶层(272)可以通过使用常规技术使一种或多种聚合物前体光聚合来形成，如下文进一步描述。可以选择聚合物前体和反应条件，使得测定试剂可以容易地扩散通过凝胶层(272)，而同时感兴趣的细胞核酸(例如，包含多于200-300个核苷酸的mRNA)具有降低的扩散性。递送裂解试剂(278)后，将细胞温育一段时间以允许(i)裂解试剂到达细胞，(ii)发生细胞裂解，(iii)释放细胞核酸分子，以及(iv)被释放的核酸分子从起源细胞扩散出去并且/或者被捕获探针捕获。如分别通过来自细胞(274)和(275)的被捕获的核酸分子(280)和(282)的分布所示，凝胶层(272)确保来自不同细胞的被捕获的核酸分子的较大部分(平均)在表面的独立区域(270)中。在一些实施方案中，凝胶层(272)是通过使聚合物前体光交联形成的水凝胶层。
图2E-2G示出包含扩散性改性剂的水凝胶室。如图2E所示，细胞和聚合物前体被加载到表面(2902)上，该表面可以是流体装置的通道的一部分(下文更全面地描述)。细胞(例如，2901)布置在表面(2902)上，并且细胞的位置通过检测器(2904)来确定，控制系统使用检测器(2904)来生成用于使空间能量调制元件(2906)产生光束的指令，以在单个细胞周围的通道(2900)中合成(2908)水凝胶室，如例如通过水凝胶室(2912、2913和2914)所示。放大图(2910)示出固体外观结构(2912、2913和2914)具有内部(2911)和具有预先确定的厚度(2916)的壁(2921)。同样，水凝胶室具有预先确定的形状(例如，具有直径(2917)的圆形)并且包封预先确定的区域。在附图中，为了方便起见，室被示出为孤立地放置，而不与相邻室连接，并且被示出为具有圆柱形或类环形的形状；然而，空间能量调制元件可以合成不同形状和大小的室，就像可用于特定应用那样。在一些实施方案中，表面(2902)可以是流体装置中的流动池和/或通道的一部分，并且水凝胶室可以在表面(2902)与平行的第二表面(图2E中未示出)之间合成。如本文所用，“通道”意指能够容纳流体(其可以是静态或流动的)并且具有至少一个在其上可以进行细胞测定(诸如，转录组测量)的表面的容器。在一些实施方案中，通道可以具有第一表面和/或第二表面，在表面上可以合成室并且/或者在表面上可以附接细胞或测定组分。此外，在一些实施方案中，细胞或测定组分可以通过聚合物基体壁上的捕获元件来附接或捕获。如本文所用，“第一表面”的属性(例如，作为包含捕获元件的表面)也可以适用于第二表面，或者视情况而定，也可以适用于聚合物基体壁(其全部都可以是水凝胶室的内表面)。如本文所用，“通道”包括固体支持物，固体支持物包括表面，特别是平坦表面。在一些实施方案中，通道可以包括第一表面和第二表面，它们例如可以是彼此平行的。在一些实施方案中，通道还可以限制穿过其的流体从入口向出口的流动。在其他实施方案中，通道可以包含非流动性体积的流体，该流体可以通过开口或入口去除、替代或添加；即，在一些实施方案中，本发明通道可以是孔或孔状结构。第一表面与第二表面之间的垂直距离可以在10μm至500μm的范围内或可以在50μm至250μm的范围内。在一些实施方案中，第一表面与第二表面之间的垂直距离可以在待分析的细胞的平均大小的两倍至待分析的细胞的平均大小的五倍的范围内。
在一些实施方案中，在表面上合成的每个水凝胶室可以具有相同的形状和面积，例如内部区域的范围为0.001至0.1mm2或范围为0.001至1.0mm2的类环形。在一些实施方案中，对于所测定的每种不同类型的细胞，每个合成的水凝胶室都具有相同的形状和面积。在测定哺乳动物细胞的一些实施方案中，在单个细胞周围合成的水凝胶室的数量可以大于100；或大于1000；或大于10,000；或者数量可以在100至100,000的范围内；或者在1000至100,000的范围内；或者在1000至106的范围内。
在合成了水凝胶室后，用裂解试剂处理(2913)细胞，使得细胞核酸(例如mRNA)被释放到水凝胶室(例如2924)的内部，在其中一部分被捕获探针捕获。在一些实施方案中，捕获后，可以使水凝胶室解聚(2925)，之后引入延伸和/或扩增试剂(例如聚合酶、dNTP、引物等)，以用于cDNA合成和/或扩增。
图2G示出扩散性改性剂的实施方案，除腔或孔(2980)围绕布置在表面(2984)上的细胞(2982)之外，扩散性改性剂还包括如上的凝胶层(2981)。因此，例如，如果细胞(2982)随机布置在表面(2984)上，则通过例如通过光聚合而超出自每个细胞给定半径使聚合物前体选择性地聚合来在它们周围形成随机孔阵列。与固体凝胶层的情况一样，用于测定的试剂可以通过使它们流过凝胶层以便它们可以进入孔中来递送至细胞。
如图2H所示，在用裂解试剂处理表面(2930)上的细胞(2932)之后，当细胞核酸分子(诸如mRNA)扩散离开它们的起源细胞(2932)时，此类分子被相邻的捕获探针捕获。(带有虚线轮廓的较浅色细胞(例如，2933)表示裂解的细胞。)此外，最初被捕获的分子将解离，扩散一段距离并被重新捕获，之后重复该过程。在一些实施方案中，被捕获的mRNA被转化为cDNA，其继而被表面扩增(例如通过桥式PCR)以形成cDNA的簇或克隆群，例如使用常规合成测序技术对它们进行测序。为了使用此类方法成功测序，每个簇的克隆cDNA的数量必须足够大以产生可检测的信号，并且簇的间距必须足够大以避免簇之间的重叠，这会降低由于重叠的区域中不同cDNA所致的信号。关于后一个参数，对于常规的合成测序技术，用于表面扩增的随机分布的cDNA的预期最近邻距离可能在0.25至5.0μm之间或在1.0至5.0μm之间。在一些实施方案中，用于表面扩增(诸如桥式扩增)的随机分布的cDNA的预期最近邻距离可能为0.5μm或更大，或预期最近邻距离为1.0μm或更大，预期最近邻距离为2.0μm或更大。在一些实施方案中，表面上随机分布的cDNA(或被捕获的mRNA)基本上呈泊松分布来分布。返回到图2H，当细胞核酸分子在表面(2930)上展开时，可以定性地绘制与起源细胞相邻的在所需范围内具有被捕获mRNA的区域，如下图所示。在裂解时(2934)，由于浓度较高，与细胞相邻的被捕获的mRNA的预期最近邻距离对于可接受的簇的形成来说太低。随着mRNA扩散的进展以及最初被捕获的mRNA去杂交并被重新捕获(2936)，在与起源细胞相邻的区域中预期最近邻距离增加。此过程持续进行(2938)直到达到平衡。在合成了防止mRNA分子扩散通过其聚合物基体壁的水凝胶室的一些实施方案中，可以选择水凝胶室的大小(以及因此选择其内部区域)，使得在水凝胶室内，被捕获的mRNA的分布达到平衡随机分布，其中被捕获的RNA(或cDNA)的预期最近邻距离达到在所需范围内的一个值。因此，如图2I中所示，细胞(例如2944)布置在表面(2946)上，并且合成了水凝胶室(2948)，之后裂解细胞(2944)以释放mRNA(例如)，其被表面(2946)上的捕获探针捕获。被捕获的mRNA达到平衡分布后，合成了预期最近邻距离在所需范围内的cDNA。例如，如果细胞(2944)是具有约2x105个mRNA分子的哺乳动物细胞，mRNA分子被完全释放到水凝胶室(2948)中，则当水凝胶室(2948)的内部区域(2950)为约2.8x 105μm2(例如，半径为300μm的圆的面积)时，被捕获的mRNA的预期最近邻距离为约1μm，例如Pielou,Introduction to Mathematical Ecology(Wiley-Interscience,1969)。在一些实施方案中，可以通过控制水凝胶室的聚合物基体壁的渗透性(或孔隙率)来控制保留在水凝胶室内部的mRNA的数量。例如，可以选择聚合物基基体孔隙率，使得该数量的保留的mRNA的分子量可以高于预先确定的大小。在一些实施方案中，细胞核酸在水凝胶室的内表面中接近平衡分布的速率可以通过引入使双链体形成不稳定的剂(例如，热、低盐缓冲液、离液剂等)来增加。
在一些实施方案中，上文方法可以通过以下步骤实现：(a)提供固体支持物，固体支持物包括表面，表面包含附接至其的一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针并且包含布置在其上的多个细胞；(b)在扩散性改性剂的存在下，使表面的独立区域与不同细胞的一个或多个核酸分子接触，以在每个独立区域中产生一个或多个被捕获的核酸分子，其中不同独立区域中的核酸分子来自不同细胞；以及(c)从被捕获的核酸分子或其衍生物合成cDNA分子，其中每个cDNA分子与固体支持物的表面偶联，并且与不同独立区域偶联的cDNA来自不同细胞。在一些实施方案中，通过使用被捕获的细胞核酸分子作为模板在聚合酶反应(诸如，逆转录酶延伸反应)中延伸捕获探针来将cDNA与表面“偶联”。在一些实施方案中，接触包括使用裂解试剂处理所述细胞，以从所述细胞释放一个或多个核酸分子，例如mRNA。在一些实施方案中，上文方法还包括扩增cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物的多个扩增子集。在一些实施方案中，多个细胞的转录组通过对扩增子的cDNA分子进行测序来确定。在一些实施方案中，附接至表面的cDNA分子包含编码表面上的位置的空间条形码，并且该方法还包括在测序之前从表面洗脱cDNA分子。在一些实施方案中，表面包含一个或多个凝胶层，诸如一个或多个水凝胶层，其封装布置在其上的细胞。在一些实施方案中，单个水凝胶层封装布置在表面上的基本上所有细胞。在一些实施方案中，布置在表面上的细胞被独立凝胶层或凝胶体封装。
在一些实施方案中，扩散性改性剂构成包封布置在表面上的细胞的水凝胶室。在一些实施方案中，布置在表面上的每个细胞被独立水凝胶室包封。在一些实施方案中，选择水凝胶室的聚合物基体壁的孔隙率，使得有效防止分子量在预先确定的大小范围内的细胞核酸分子扩散通过此类聚合物基体壁。在mRNA被捕获的一些实施方案中，此类大小范围包括大于100个核糖核苷酸、大于200个核糖核苷酸、大于300个核糖核苷酸、大于400个核糖核苷酸或大于500个核糖核苷酸的mRNA分子。在一些实施方案中，在裂解细胞后，将水凝胶室在升高的温度下温育一段时间以使被释放的细胞核酸分子与其捕获探针之间形成的双链体去稳定，使得被释放的细胞核酸分子随机分布在水凝胶室内部的表面的捕获探针之间。此类升高的温度可以在25℃至95℃的范围内，或者此类升高的温度可以比室温高10℃至60℃。在一些实施方案中，此类时间间隔可以在30秒至20分钟、30秒至5分钟或30秒至2分钟的范围内。在一些实施方案中，在裂解细胞后，使用双链体去稳定试剂(诸如低盐缓冲液)处理水凝胶室一定时间间隔，以使被释放的细胞核酸分子与捕获探针之间形成的双链体去稳定。在该时间间隔后，将此类低盐缓冲液替代成形成稳定双链体的缓冲液。在一些实施方案中，选择所述水凝胶室的内部区域，使得偶联的cDNA分子(从其生成簇)的预期最近邻距离大于1μm，或在0.25μm至5μm的范围内，或在1μm至3μm的范围内。
在一些实施方案中，本发明包括物质组合物，其构成布置在表面上的水凝胶室，其中水凝胶室包括内部区域，内部区域包括来自单个细胞的核酸分子的随机分布。在一些实施方案中，核酸分子的随机分布是均匀的分布，因为给定数量的核酸分子附接在内部区域的给定子区域内的概率仅取决于子区域的大小。在一些实施方案中，此类均匀的分布基本上是泊松分布。如本文所用的“基本上是泊松分布”意指通过泊松过程生成实际分布的概率大于50％、大于70％或大于90％。在一些实施方案中，均匀分布的核酸分子是mRNA。在一些实施方案中，均匀分布的核酸分子是cDNA。在一些实施方案中，mRNA分子或cDNA分子的此类均匀的分布的mRNA或cDNA之间的预期最近邻距离为1μm或更大。
在一些实施方案中，在本发明中使用的水凝胶室可以通过以下步骤合成：(a)提供流体装置，其包括(i)一个或多个通道，其各自包括第一表面，(ii)空间能量调制元件，其与每个第一表面光学连通，以及(iii)检测器，其基于来自细胞的一个或多个光信号识别每个通道中细胞的位置；(b)将每个通道加载细胞和一种或多种聚合物前体，使得细胞布置在第一表面上；以及(c)在每个通道中合成一个或多个室，通过使用空间能量调制元件将光投射到每个通道中，使得经投射的光使一种或多种聚合物前体发生交联以形成室的聚合物基体壁，使每个室包封一个或多个细胞，其中每个通道中合成的室的位置通过检测器所鉴定的由此包封的细胞的位置来确定。在一些实施方案中，该方法还包括(i)将通道加载裂解试剂，使得细胞的信使RNA被释放并且被水凝胶室内部中的捕获探针捕获；(ii)将通道加载逆转录试剂，以复制被捕获的信使RNA，产生互补的DNA；以及(iii)对互补的DNA进行测序。
在一些实施方案中，水凝胶室的聚合物基体壁对于分子量小于3x106道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3x106道尔顿的分子是不可渗透的。在一些实施方案中，水凝胶室的聚合物基体壁对于分子量小于3x105道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3x105道尔顿的分子是不可渗透的。在一些实施方案中，水凝胶室的聚合物基体壁对于分子量小于3x104道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3x104道尔顿的分子是不可渗透的。在一些实施方案中，水凝胶室的聚合物基体壁对于分子量小于3x103道尔顿的分子是可渗透的，并且对于分子量大于3x103道尔顿的分子是不可渗透的。
生成带标签的核酸分子集以便测序
本文描述了用于生成带标签的核酸以便测序的方法。在一些实施方案中，带标签的核酸由捕获在固体支持物上的一个或多个核酸分子合成。固体支持物的非限制性示例包括凝胶基体或流体通道。在一些实施方案中，流体通道是流动池。在一些实施方案中，固体支持物不是珠子。在一些实施方案中，固体支持物与凝胶基体(诸如，水凝胶)接触或被其封装。在一些实施方案中，固体支持物是凝胶基体。在一些实施方案中，固体支持物是封装凝胶基体。在一些实施方案中，被捕获的核酸分子是RNA。在一些实施方案中，将被捕获的核酸分子(例如，mRNA)从固体支持物上洗掉或降解。在一些实施方案中，第一链核酸是带标签的并且由被捕获的核酸合成，而第二链带标签的核酸在被捕获的核酸分子从固体支持物上洗掉或降解后由第一链核酸合成。在一些实施方案中，该方法包括从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集。在一些实施方案中，使一个或多个核酸分子与包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针的固体支持物接触。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子被捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含cDNA分子的第一链核酸由被捕获的核酸分子或其衍生物合成，其中合成包括进行逆转录，并且其中cDNA分子与固体支持物偶联。在一些实施方案中，cDNA是带标签的(例如，使用条形码，诸如独特分子索引或UMI)。在一些实施方案中，cDNA用包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含UMI序列的标签加标签。在一些实施方案中，可以将衔接子插入或添加在cDNA分子或其衍生物的3’末端处。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物可以被进一步扩增或测序。在一些实施方案中，插入在cDNA分子的3’末端处的衔接子可以充当测序的起始。在一些实施方案中，该方法包括合成cDNA分子或其衍生物的一条或多条第二链。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。在一些实施方案中，其中一个或多个第二链合成反应包括随机引物法。在一些实施方案中，该方法包括通过单链连接来合成cDNA文库。在一些实施方案中，cDNA文库合成包括标签化。在一些实施方案中，cDNA文库合成包括片段化，之后进行衔接子连接。在一些实施方案中，cDNA可以被切割或线性化。在一些实施方案中，cDNA在扩增后被切割或线性化。在一些实施方案中，cDNA通过固体支持的扩增来合成。在一些实施方案中，固体支持的扩增是桥式扩增。
在一些实施方案中，与固体支持物接触并且充当cDNA合成模板的一个或多个核酸可以是DNA或RNA。在一些情况下，DNA是单链的。在一些实施方案中，DNA是基因组DNA。在一些实施方案中，DNA是无细胞DNA。在一些实施方案中，RNA是ncRNA、nmRNA、sRNA、smnRNA、tRNA、sRNA、mRNA、pcRNA、rRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、SSU rRNA、LSU rRNA、NoRC RNA、pRNA、6S RNA、SsrS RNA、aRNA、asRNA、asmiRNA、cis-NAT、crRNA、tracrRNA、CRISPR RNA、DD RNA、diRNA、dsRNA、endo-siRNA、exRNA、gRNA、hc-siRNA、hcsiRNA、hnRNA、RNAi、lincRNA、lncRNA、miRNA、mrpRNA、nat-siRNA、natsiRNA、OxyS RNA、piRNA、qiRNA、rasiRNA、RNase MRP、RNaseP、scaRNA、scnRNA、scRNA、scRNA、SgrS RNA、shRNA、siRNA、SL RNA、SmY RNA、snoRNA、snRNA、snRNP、SRP RNA、ssRNA、stRNA、tasiRNA、tmRNA、uRNA、vRNA、vtRNA、Xist RNA、Y RNA、NATs、pre-mRNA、circRNA、msRNA或cfRNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。在一些实施方案中，RNA是微RNA(miRNA)。
探针失活
在一些实施方案中，该方法包括可以使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活。在一些实施方案中，可以使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活(图7)。在一些实施方案中，可以在与一个或多个核酸分子接触之前使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活。在一些实施方案中，可以在与一个或多个核酸分子接触之后使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活。在一些实施方案中，可以通过用核酸酶处理核酸分子捕获探针来使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活。在一些实施方案中，可以在与一个或多个核酸分子接触之前使一个或多个引物探针的至少一个子集失活。在一些实施方案中，可以在与一个或多个核酸分子接触之后使一个或多个引物探针的至少一个子集失活。在一些实施方案中，可以通过用核酸酶处理引物探针使一个或多个引物探针的至少一个子集失活。在一些情况下，核酸酶可以是内切核酸酶。在一些方面中，核酸酶是外切核酸酶。用于使一个或多个核酸分子捕获探针失活的核酸酶的非限制性示例包括S1核酸酶、P1核酸酶、粗糙脉孢菌(N.crassa)核酸酶、菌丝体、分生孢子、BAL 31核酸酶、玉米黑粉菌(U.Maydis)核酸酶、核酸酶Bh1、曲霉(Aspergillus)核酸酶、绒泡菌(Physarum)核酸酶、SP核酸酶、绿豆核酸酶、小麦叶绿体核酸酶、核酸酶I、豌豆种子核酸酶、烟草核酸酶I、苜蓿幼苗核酸酶、SK核酸酶、母鸡肝核酸酶、大鼠肝细胞核核酸酶或小鼠线粒体核酸酶。
在一些实施方案中，可以通过不为核酸酶的部分使一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针失活(图5)。在一些实施方案中，可以通过包含TdT酶的部分使一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针失活。在一些实施方案中，可以通过与互补的寡核苷酸杂交使一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针失活。在一些实施方案中，可以通过将一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针与至少部分互补的寡核苷酸杂交并且将可逆终止子核苷酸与聚合酶掺入使一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针失活。在一些实施方案中，可以通过与将磷酸酯附接至寡核苷酸的3’末端的部分接触使一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针失活。在一些实施方案中，可以通过与包含阳离子-中性二嵌段多肽共聚物的部分接触使一个或多个核酸分子捕获探针或引物探针失活。在一些实施方案中，使探针失活减少了探针的自身折叠。在一些实施方案中，使探针失活降低了背景信号，该背景信号与不与一个或多个核酸分子或由一个或多个核酸分子合成的cDNA接触的探针相关联。
在溶液中生成cDNA
在一些实施方案中，本文描述用于在溶液中合成cDNA或对其进行测序的方法。在一些实施方案中，合成了cDNA分子或其衍生物，同时一个或多个核酸分子附接至固体支持物(例如，通过与一个或多个核酸分子捕获探针接触来附接)。在一些实施方案中，合成了第一链cDNA，同时一个或多个核酸分子附接至固体支持物。在一些实施方案中，合成了第二链cDNA，同时一个或多个核酸分子附接至固体支持物。在一些实施方案中，在测序之前经由与溶液中的引物接触来将合成的cDNA(第一链和第二链)从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，cDNA分子在从固体支持物上洗脱下来之前与凝胶基体(例如水凝胶)接触或被其封装。在一些实施方案中，cDNA分子在从固体支持物上洗脱下来之后与凝胶基体(例如水凝胶)接触或被其封装。在一些实施方案中，cDNA分子在从固体支持物上洗脱下来之后悬浮于水性缓冲液中。
在一些实施方案中，一个或多个核酸与核酸分子捕获探针接触并被其捕获。当与核酸分子捕获探针接触时，可以合成第一链带标签的cDNA序列。在一些实施方案中，将被捕获的核酸分子(例如，mRNA)从固体支持物上洗掉或降解。在一些实施方案中，可以在合成第二链带标签的cDNA序列之前将第一链从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，可以在对cDNA进行测序之前，将第一链和第二链从固体支持物上洗脱下来。
在一些实施方案中，合成了cDNA分子或其衍生物，同时一个或多个核酸分子未附接至固体支持物。在一些实施方案中，合成了cDNA分子或其衍生物，同时一个或多个核酸分子被封装在凝胶基体诸如本文所述的水凝胶中。在一些实施方案中，在将一个或多个核酸分子从固体支持物上洗脱下来之后，合成了cDNA分子或其衍生物。在一些实施方案中，在将一个或多个核酸分子从固体支持物上洗脱下来之后，合成了第一链cDNA。在一些实施方案中，在将一个或多种核酸分子从固体支持物上洗脱下来之后，合成了第二链cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过与溶液中的引物序列接触来合成。在一些实施方案中，经由使用溶液中的引物序列合成的cDNA是经片段化的。在一些实施方案中，经由使用溶液中的引物序列合成的cDNA包含标签化。
封闭引物探针
在一些实施方案中，本文描述用于通过使表面引物探针与本文所述的封闭部分接触来封闭表面引物探针的方法。在一些实施方案中，可以通过与包含与表面引物探针互补的核酸序列的寡核苷酸接触和杂交来封闭表面引物探针。在一些实施方案中，可以通过与包含一个或多个3’磷酸核苷酸的封闭剂接触来封闭表面引物探针。图3示出了在获得本文所述转录组的工作流程中按需要使用3’-磷酸核苷酸来封闭和解封闭表面引物的非限制性示例。此使用与图2所示的使用类似。然而，最初表面P5和P7引物探针是封闭的(显示为P5*和P7*)。当要将它们用于扩增或文库构建时，则可以使用化学或酶促过程将它们解封闭。这减少了不需要的表面杂交和背景信号。图4示出了封闭和解封闭表面引物的另一个示例，其中包含表面引物的互补序列的寡核苷酸可以通过与表面引物杂交来保持表面引物不可用。表面引物可以通过去杂交和洗掉互补序列来激活或变得可用。与图3类似，代替封闭表面P5和P7引物探针，P5和P7引物探针可以与表面上的互补P5’和P7’探针杂交，以便减少不需要的杂交。P5和P7引物探针在表面激活之前可以是未杂交的。
在一些实施方案中，该方法包括从一个或多个核酸分子制备cDNA分子或其衍生物集。在一些实施方案中，该方法包括使本文所述的固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子。在一些实施方案中，第一链cDNA分子由被捕获的核酸分子合成。在一些情况下，第二链cDNA分子由第一链合成。在一些实施方案中，将衔接子插入在cDNA分子(第一链或第二链)或其衍生物的3’末端处。在一些实施方案中，使cDNA分子与多个表面引物探针的至少一个子集接触，以便起始对cDNA分子进行测序的测序反应。在一些方面中，在扩增之前，将cDNA分子或其衍生物与固体支持物偶联。在一些方面中，在扩增之前，将cDNA分子或其衍生物从固体支持物上洗脱下来。在一些实施方案中，表面引物探针包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，在扩增cDNA分子之前，去除封闭剂以解封闭多个表面引物探针，从而允许延伸反应。
在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，封闭剂包含寡核苷酸，其包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。在一些实施方案中，通过用TdT处理多个表面引物探针来封闭多个表面引物探针。在一些实施方案中，封闭多个表面引物探针的子集的3’末端包括使多个表面引物探针与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。
生成核酸的带标签的第二链以便测序
本文描述用于生成核酸的第二链(例如，cDNA分子的第二链)以便测序的方法。图2示出用于从被捕获的mRNA和核酸的带标签的第二链(例如，cDNA分子的第二链)原位获得改进的转录组并且从它们直接生成可测序的文库的非限制性示例。可以使用P5和P7引物探针的表面涂覆来直接在固体支持物表面上生成文库。扩增可以使用桥式扩增来进行，但也可以通过溶液中的引物来进行。桥式扩增可以包括使用涂覆在固体支持物的表面上的引物探针进行的扩增。引物探针可以通过柔性接头附接在5’末端。扩增结束时，每个克隆簇包含cDNA的单个成员或一个或多个核酸分子的几个拷贝。在一些实施方案中，通过溶液中的引物进行的扩增可以包括使用乳液PCR。在一个实施方案中，PCR引物之一可以拴系至固体支持物的表面(5’-附接)，而另一引物可以在溶液中。在一些情况下，固体支持物包含多于一个引物，其中引物可以靶向核酸分子或cDNA分子中的一个或多个或与其杂交。
生成的表面簇可以直接原位测序，或者可以将文库从表面洗脱以单独测序。在一些实施方案中，该方法包括从一个或多个核酸分子制备cDNA分子或其衍生物集。在一些情况下，该方法包括提供固体支持物，其包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针。在一些情况下，该方法包括使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子。在一些实施方案中，cDNA分子由被捕获的核酸分子合成，其中当cDNA或一个或多个核酸分子附接至固体支持物时，可以发生cDNA的合成。在一些实施方案中，当将cDNA或一个或多个核酸分子从固体支持物上洗脱下来时，可以发生cDNA的合成。在一些实施方案中，可以将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’区处。在一些实施方案中，当cDNA分子或其衍生物集与固体支持物偶联时，发生cDNA的扩增。
在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物集与多个表面引物探针偶联。在一些实施方案中，插入在cDNA分子的3’区处的衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针可以通过本文所述的任何一种部分失活或封闭。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针可以通过本文所述的任何一种核酸酶失活。在一些实施方案中，核酸酶是外切核酸酶。图7示出使用外切核酸酶来消化表面上或溶液中的未使用和未附接的引物。例如，可以消化未捕获任何RNA分子的未附接的捕获探针(例如，Poly-T)。
在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸、随机引物法或两者。在一些实施方案中，当cDNA附接至固体支持物时，发生cDNA分子或其衍生物的扩增。在一些实施方案中，当将cDNA从固体支持物上洗脱下来时，发生cDNA分子或其衍生物的扩增。在一些实施方案中，cDNA分子的扩增包括使cDNA分子与溶液中的引物序列接触。在一些实施方案中，cDNA包含片段化。在一些实施方案中，插入至cDNA中的衔接子包含用于标签化的序列。在一些实施方案中，通过单链连接将衔接子插入至cDNA中。在一些实施方案中，通过双链连接将衔接子插入至cDNA中。
在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，该方法包括使封闭剂经历解封闭多个表面引物探针的至少子集的反应，以允许延伸反应。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。图3示出了在获得本文所述转录组的工作流程中按需要使用3’-磷酸核苷酸来封闭和解封闭表面引物的非限制性示例。此使用与图2所示的使用类似。然而，最初表面P5和P7引物探针是封闭的(显示为P5*和P7*)。当要将它们用于扩增或文库构建时，则可以使用化学或酶促过程将它们解封闭。这减少了不需要的表面杂交和背景。图4示出了封闭和解封闭表面引物的另一个示例，其中包含表面引物的互补序列的寡核苷酸可以通过与表面引物杂交来保持表面引物不可用。表面引物可以通过去杂交和洗掉互补序列来激活或变得可用。与图3类似，代替封闭表面P5和P7引物探针，P5和P7引物探针可以与表面上的互补P5’和P7’探针杂交，以便减少不需要的杂交。P5和P7引物探针在表面激活之前可以是未杂交的。
在一些实施方案中，该方法包括通过使DNA分子或其衍生物集的子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触来封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。在其他情况下，该方法包括通过使DNA分子或其衍生物集的子集与包含与DNA分子集的子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触来封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。图5示出使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT，上图)或互补寡核苷酸(下图)来减少由于二级结构造成的核酸降解。TdT酶可以封闭cDNA簇的3’末端，使得如果此末端折叠回到cDNA分子上(更具体地说，在Poly-T捕获探针上)并形成二级结构，则它不可能被延伸并在测序期间产生噪声信号，导致降低测序信号的质量。此步骤可以在聚集和切割或线性化步骤之后进行。替代地，可以使用互补的寡核苷酸代替TdT以防止自身折叠。在一些实施方案中，该方法包括通过使DNA分子或其衍生物集的子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触来封闭DNA分子或其衍生物集的子集的3’末端。
在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些方面中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，当一个或多个核酸分子或cDNA分子附接至固体支持物时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当将一个或多个核酸分子或cDNA分子从固体支持物上洗脱下来时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当一个或多个核酸分子或cDNA分子与本文所述的凝胶基体接触或被其封装时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当将一个或多个核酸分子或cDNA分子从固体支持物上洗脱下来并使其与凝胶基体接触或被凝胶基体封装时，发生cDNA的合成或扩增。
模板转换寡核苷酸
本文描述用于通过利用模板转换寡核苷酸合成cDNA的方法。图8A示出使用模板转换引物的示例。代替对寡核苷酸使用游离的溶液中的模板转换，可以将表面引物用作模板转换引物。这种改进可以增加模板转换过程的效率，并且避免在模板转换期间形成多联体，因此增加整个工作流程的mRNA捕获效率。在一些实施方案中，该方法包括从一个或多个核酸分子制备cDNA分子或其衍生物集。在一些实施方案中，该方法包括提供固体支持物，其包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分(例如，模板转换引物)。在一些实施方案中，该方法包括使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子以及从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子。在一些实施方案中，可以将衔接子插入在cDNA分子或其衍生物的3’末端处。在一些实施方案中，可以扩增cDNA分子或衍生物以便测序。
在一些实施方案中，该方法包括合成，合成包括进行包括cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。在一些实施方案中，一个或多个第二链合成反应通过包含模板转换部分的多个表面引物探针的子集介导。在一些实施方案中，第二链通过模板转换延伸来合成。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物与多个表面引物探针或模板转换部分偶联。在一些实施方案中，插入在cDNA的3’区处的衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针或表面引物探针可以通过本文所述的任何一种部分失活或封闭。
在一些实施方案中，当一个或多个核酸分子或cDNA分子附接至固体支持物时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当将一个或多个核酸分子或cDNA分子从固体支持物上洗脱下来时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当使一个或多个核酸分子或cDNA分子与本文所述的溶液中的引物序列接触时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当一个或多个核酸分子或cDNA分子与本文所述的凝胶基体接触或被其封装时，发生cDNA的合成或扩增。在一些实施方案中，当将一个或多个核酸分子或cDNA分子从固体支持物上洗脱下来并使其与凝胶基体接触或被凝胶基体封装时，发生cDNA的合成或扩增。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以用于获得转录组测序。在一些实施方案中，可以使用包含随机寡核苷酸的引物探针来扩展第一链合成。除了其他衔接子和引物结合位点(诸如转座体衔接子序列或模板转换(TS)引物)之外，随机寡核苷酸还可以包括样品条形码和独特分子标识符的相同组合。可以进行模板转换和第二链合成以进行oligo-dT引发的cDNA合成。然后可以对所得双链cDNA进行标签化。
图8B示出一个实施方案，在其中捕获序列和条形码序列(其可以包含或可以不包含UMI)与独立表面引物一起分组或位于其上。这样得到较短的表面引物，这从合成的角度来看是有利的，而且还因为它产生的表面标签化(如果使用)的问题更少所以是有利的。此外，所述系统是模块化的，所以可以使用多个不同的捕获探针，而无需改变系统其余部分的设计。例如，用于mRNA捕获的polyDT寡核苷酸，以及捕获特定核酸序列(诸如互补寡核苷酸条形码)的柄序列。
在一个实施方案中，固体支持物(850)具有表面(852)，其包含：(i)捕获元件或探针(851)，其包括表面引物(854)(其可以是例如P7引物)和捕获探针(856)；以及(ii)寡核苷酸序列(861)，其包含表面引物(862)(其可以是例如P5表面引物)、引物结合位点(R1)的互补序列(R1’)(864)(其可以在测序步骤中使用，例如以识别条形码或UMI)、条形码序列(866)、UMI(868)和引物结合位点R2的互补序列(R2’)(870)(其可在测序步骤中使用，例如以识别靶模板)。还显示被捕获序列(863)，其包含捕获探针(856)的互补序列(860)(其可以是例如mRNA的polyA区，或另一细胞核酸分子的所谓“柄”序列或人工序列(诸如抗体标记))和被复制以形成cDNA的一部分的模板区(858)。在逆转录、标签化(或类似程序)和变性(871)后，产生初步的cDNA(873)。在替代实施方案中，如果不使用标签化，则可以经由模板转换来附接R2(872)。在杂交条件下并且在聚合酶和dNTP的存在下，R2(872)与其互补序列R2’(870)退火并被延伸(875)，复制表面引物(861)。这产生(877)最终的cDNA产物(878)，其包含引物结合位点R2(884)、UMI(888)、条形码(886)、引物结合位点R1(885)和引物结合位点P5(881)。此最终的cDNA产物可以例如被表面扩增以形成用于测序的簇，或者它可以被复制并且洗脱出拷贝以便外部测序。
在一些实施方案中，上文用于合成经条形码化的cDNA的方法可以通过以下步骤实现：(a)提供固体支持物，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中至少一个表面引物探针包含条形码序列；(b)使固体支持物与所述一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；(c)从被捕获的核酸分子或衍生物合成初始cDNA分子，其中cDNA分子与所述固体支持物偶联；(d)将衔接子连接至cDNA分子的游离末端，其中衔接子包含与包含条形码序列的表面引物探针的3’末端互补的3’区段；提供其中衔接子的3’区段与表面引物的3’末端退火并且延伸的条件，从而产生包含条形码序列的第二cDNA分子。在一些实施方案中，衔接子通过标签化连接至初始cDNA。在一些实施方案中，第二cDNA分子被表面扩增以形成簇。
加标签前扩增核酸分子
本文描述了用于在加标签或片段化之前扩增核酸分子的方法。图6示出在片段化之前对cDNA进行扩增以改进在脱流动池工作流程(上图)和在流动池上的工作流程(下图)中获得单个细胞转录组并增加其质量的工作流程的非限制性示例。在一些实施方案中，该方法包括通过提供固体支持物从一个或多个核酸分子制备cDNA分子或其衍生物集，其中固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针。在一些方面中，该方法包括使固体支持物与一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子。在一些情况下，该方法包括从被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子并对cDNA分子或其衍生物进行扩增以生成经扩增的cDNA群体。如前所述，可以将衔接子插入在经扩增的cDNA分子或其衍生物的3’区处，以便生成带标签的经扩增的cDNA群体。在一些实施方案中，该方法包括对带标签的经扩增的cDNA群体进行固体支持的扩增以生成cDNA分子或其衍生物集。在一些实施方案中，该方法包括在将cDNA分子或其衍生物从固体支持物上洗脱下来之后进行扩增。在一些实施方案中，cDNA分子或其衍生物、经扩增的cDNA群体、带标签的经扩增的cDNA群体、cDNA分子或其衍生物集或其任何组合与多个表面引物探针偶联。
在一些实施方案中，衔接子包含被配置成允许在cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。在一些实施方案中，该方法包括使固体支持物与被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，核酸分子捕获探针或表面引物探针中的一个或多个可以通过本文所述的任何一种部分失活或封闭。
采用聚合物基体的实施方案
本公开提供用于区室化或隔离一个或多个生物组分的系统。系统可以包括含有或包含一个或多个生物组分的流体装置。流体装置可以含有或包含一种或多种聚合物前体。在一些情况下，流体装置可以包括第一表面，其被配置成偶联或接收一个或多个生物组分中的至少一个以形成偶联的生物组分。系统还可以包括至少一个能量源，其中能量源与流体装置连通。在各种实施方案中，至少一个能量源可以在一个或多个生物组分的至少一部分上或相邻于一个或多个生物组分的至少一部分形成聚合物基体。
在一些情况下，可以将样品引入至或提供至系统。在某些情况下，样品可以包含一个或多个生物组分。系统可以用于将一个或多个生物组分彼此分开。在各种情况下，生物组分可以被物理分开。在一些情况下，生物组分可以彼此流体连通。在某些情况下，生物组分可以彼此化学连通。系统可以用于单细胞分析。在一些实施方案中，系统可以用于在基因组水平上的单细胞分析。例如，系统可以用于基因组测序。又如，系统可以用于脱氧核糖核酸(DNA)测序。系统可以用于无细胞DNA的DNA测序、全基因组测序、全外显子组测序、靶向测序或16S测序。系统可以用于研究附接至感兴趣的生物分子上的DNA标签。生物分子可以包括蛋白质、代谢物等。在一些情况下，DNA可以是核DNA或线粒体DNA。系统可以用于在转录组水平上的单细胞或大量分析。例如，系统可以用于核糖核酸(RNA)测序。例如，系统可以用于3’或5’基因表达分析、细胞的免疫组库研究或全长mRNA分析。在一些实施方案中，系统可以用于在蛋白质组水平上的单细胞分析。系统可以用于生物组分的功能测定。系统可以用于研究生物组分的表面蛋白、分泌蛋白或代谢物。在一些情况下，系统可以用于研究生物组分中的表观基因组学、DNA甲基化或染色质可及性。系统可以用于其他合适的测定、实验和过程。
在某些实施方案中，系统可以用于在间接细胞间相互作用水平上的单细胞分析。例如，可以使用如本文所提供的系统分析从第一细胞产生的一个或多个分子对第二细胞的影响。在各种实施方案中，系统可以用于分析直接细胞间相互作用。例如，两个或更多个细胞(例如，第一细胞和第二细胞)可以物理接触，并且可以使用如本文所公开的系统分析第一细胞对第二细胞的影响(或反之亦然)。在一些实施方案中，系统可以用于在生物组分中的药物应答分析。在某些实施方案中，系统可以用于分析生物组分对各种生理条件(例如，各种培养基、温度、机械刺激等)的应答。
在一些情况下，样品包括生物样品。生物样品可以包含生物组分。在一些实施方案中，生物样品可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、1,000、10,000、105、106、107、108、109、1010、1020个或更多个生物组分。生物样品可以包含本文所提及的任何两个数字之间的任何数量的生物组分。在一些实施方案中，生物样品可以包含多于1020个生物组分。生物组分可以包括细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括真核细胞、原核细胞、真菌细胞、原生动物、藻类细胞、植物细胞、动物细胞(例如，人类细胞)或任何其他合适的细胞。生物组分可以包括细胞、病毒、细菌、核酸(例如，DNA或RNA)、蛋白质或其组合。组合可以包含DNA-蛋白质复合物、RNA-蛋白质复合物或其组合。在某些实施方案中，核酸可以包含DNA。DNA的长度可以是至少10个碱基对(bp)。在一些实施方案中，DNA的长度为至少10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp或长于800bp。
在某些实施方案中，可以将一种或多种聚合物前体添加至生物样品中或与生物样品一起被包含。可以将一种或多种生物样品和一种或多种聚合物前体引入至系统中(例如，系统的流体装置中)。可以将一种或多种生物样品和一种或多种聚合物前体以任何顺序(例如，并行、顺序等)引入至流体装置中。例如，可以在聚合物前体之前引入生物样品，可以在生物样品之前引入聚合物前体，可以同时(或基本上同时)或以任何其他合适的方式或顺序引入生物样品和聚合物前体。在一些实施方案中，聚合物前体可以包含一种或多种水凝胶前体。一种或多种聚合物前体可以单独储存和/或引入至系统中。在一些情况下，一种或多种聚合物前体可以在引入至系统之前与一个或多个生物组分混合。在各种情况下，一种或多种聚合物前体可以在引入至系统之后与一个或多个生物组分混合。
系统可以包括流体装置。在一些实施方案中，流体装置可以包括一种或多种聚合物前体。换言之，一种或多种聚合物前体可以布置在流体装置的至少一部分内(例如，流体装置的通道的至少一部分内)。在一些实施方案中，流体装置可以包括一个或多个通道或室。在一些实施方案中，流体装置可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、1,000、10,000个通道或室，或者本文所提及的任何两个数字之间的任何数量的通道或室。在一些实施方案中，流体装置包括超过10,000个通道或室。如本文所述，流体装置可以包括一个或多个通道。流体装置还可以或替代地包括一个或多个室。除非另外指示，否则术语通道和室在本文的公开内容中可以互换使用。例如，流体装置的通道或室可以包括第一表面、第二表面或更多表面。
流体装置的通道或室可以接收或被配置成接收生物样品。图10示出通道100的一部分的示意图，该通道100可以布置在如本文所提供的系统的流体装置的至少一部分中。流体装置可以包括通道100。通道100可以包括第一表面101。此外，通道100可以包括第二表面102。在一些实施方案中，第一表面101和第二表面102彼此相对地布置、放置或定位(例如，如图10所描绘)。在一些实施方案中，第一表面101可以是下表面。在某些实施方案中，第二表面102可以是上表面。术语“下”和“上”并非旨在进行限制并且在本文中为了参考附图时方便而使用。通道100可以接收生物样品，其包含一个或多个生物组分50、51。通道100可以接收一种或多种聚合物前体。如图10所示，生物组分50、51可以包括细胞。然而，如本文所讨论，生物组分可以包括组织、蛋白质、核酸等。在一些实施方案中，第一表面101、第二表面102或两个表面可以偶联或接收或者被配置成偶联或接收一个或多个生物组分50、51中的至少一个。在一些情况下，第一表面101可以偶联或接收或者被配置成偶联或接收生物组分(例如，生物组分50、51)。在某些情况下，第二表面102可以偶联或接收或者被配置成偶联或接收生物组分(例如，生物组分50、51)。
在某些情况下，通道可以具有矩形、圆形、半圆形、卵形横截面或其他合适形状的横截面。因此，通道可以具有单个内表面。在一些情况下，通道可以具有三角形、正方形、矩形、多边形或其他横截面。因此，通道可以具有三个或更多个内表面。一个或多个内表面可以偶联或接收或者被配置成偶联或接收一个或多个生物组分。
在一些情况下，第一表面101、第二表面102或两个表面101和102可以例如用涂层(例如，表面涂层)官能化。在一些实施方案中，表面涂层可以是表面聚合物。表面涂层的一些非限制性示例可以包括捕获试剂(例如，吡啶甲醛(PCA))、捕获一个或多个部分(例如，化学部分)的官能团、丙烯酰胺、琼脂糖、生物素、链霉亲和素、strep-tagII、接头、包含醛的官能团、磷酸酯、硅酸酯、酯、酸、酰胺、炔烃、叠氮化物、醛二硫戊环或其组合。在各种实施方案中，表面涂层可以包含捕获一个或多个部分的官能团。例如，丙烯酰胺、琼脂糖等可以包含此类官能团。在某些实施方案中，表面聚合物可以包含聚乙二醇(PEG)、硫醇、烯烃、炔烃、叠氮化物或其组合。在各种实施方案中，表面聚合物可以包含硅烷聚合物。在一些实施方案中，表面聚合物可以用寡核苷酸、抗体、细胞因子、趋化因子、蛋白质、抗体衍生物、抗体片段、碳水化合物、毒素或适体中的至少一种官能化。
在一些情况下，第一表面101、第二表面102或两个表面101和102可以包含一个或多个条形码(例如，核酸条形码)。在一些实施方案中，第一表面101、第二表面102或两个表面101和102可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、1,000、10,000、50,000、100,000、250,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、15,000,000个条形码或者本文所提及的任何两个数字之间的任何数目的条形码。条形码可以覆盖约500nm2至约500nm2的面积。在一些实施方案中，第一表面101、第二表面102或两个表面101和102可以包括总数至多约10,000,000个条形码。条形码可以彼此不同(例如，每个条形码可以是独特的)。在某些实施方案中，条形码的第一部分或子集可以不同于条形码的第二部分或子集。可以有2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100、1,000、10,000个条形码部分或子集，或本文所提及的任何两个数字之间的任何数量的条形码部分或子集。在一些情况下，条形码(或条形码的一部分/子集)可以与条形码在表面上的定位(通道表面上的定位坐标(例如，x坐标、y坐标))相关联。条形码可以附接或偶联至捕获的生物组分。在一些实施方案中，条形码可以是将生物组分与其他生物组分区分开(例如，鉴定第一生物组分相对于第二生物组分)的独特标识符。在一些实施方案中，条形码可以包含捕获生物组分或在扩增使用的核酸序列(例如，共同序列)。在一些实施方案中，条形码可以包含独特标识符，独特标识符包含独特核酸序列(例如，DNA序列、RNA序列等)、蛋白质标签、抗体或适体。在一些实施方案中，条形码可以包含荧光分子。在一些实施方案中，捕获的生物组分的定位可以与独特标识符相关联，以例如保留生物组分的空间信息。
在一些实施方案中，流体装置可以是流动池。例如，流体装置可以用于测序(例如，DNA或RNA测序)。在一些实施方案中，流体装置可以是微流体装置。在某些实施方案中，流体装置可以是纳米流体装置。
本文所公开的系统可以包括一个或多个能量源。能量源可以与流体装置连通。在一些情况下，能量源可以用于在流体装置中(例如，在流体装置的通道或室的表面上或相邻于流体装置的通道或室的表面)形成一个或多个聚合物基体。在一些实施方案中，能量源可以包括光生成装置、热生成装置、电化学反应生成装置、电极或微波装置。聚合物基体可以在流体装置的通道中形成。能量源可以将能量引导或传递至流体装置中的预先确定的位置。能量可以引起或激活一种或多种聚合物前体，以在预先确定的位置中形成聚合物基体(例如，聚合)。
在一些实施方案中，聚合物基体可以包含水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶可以是足够多孔的，或具有合适大小的孔隙，以允许试剂(例如，酶、化合物、小分子、抗体等)移动或转移通过聚合物基体，而水凝胶可以不允许生物组分(例如，DNA、RNA、蛋白质、细胞等)移动或转移通过聚合物基体。在一些实施方案中，孔隙的直径可以为5nm至100nm。在一些实施方案中，孔隙的直径可以为5nm至10nm、10nm至20nm、20nm至30nm、30nm至40nm、50nm至60nm、60nm至70nm、70nm至80nm、80nm至90nm、90nm至100nm。在一些实施方案中，孔隙的直径可以大于100nm。在一些实施方案中，孔隙的直径可以小于5nm。试剂可以包括大小小于50个碱基对(bp)的酶或引物。引物可以包含单链DNA(ssDNA)。在一些实施方案中，引物的大小可以为5bp至50bp。在一些实施方案中，引物的大小可以为5bp至10bp、10bp至20bp、20bp至30bp、30bp至40bp或40bp至50bp。在一些实施方案中，引物的大小可以超过50bp。在某些情况下，引物的大小可以小于5bp。试剂可以包括溶菌酶、蛋白酶K、六聚体(例如，随机六聚体)、聚合酶、转座酶、连接酶、催化酶、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶、核糖核酸酶抑制剂、DNA寡聚物、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂、洗涤剂、盐、二价阳离子或任何其他合适的试剂。
图11A示出如本文所提供的系统的一部分，其包括能量源1103。图11A的实施方案可以包括在一些方面中类似于图10的部件的部件。例如，图11A的实施方案包括可以类似于图10的通道100的通道1100。应当理解，所示的实施方案可以具有类似的特征。因此，相似的特征用相似的附图标号表示，其中前导数字递增至“2”。因此，上文阐述的关于相似鉴定的特征的相关公开内容可以在下文中不再重复。此外，本文所提供的系统的具体特征以及图11A中所示的相关部件可能未通过附图中的附图标号示出或标识或者在随后的书面描述中具体讨论。然而，此类特征可以明确地与其他实施方案中描绘的和/或关于此类实施方案描述的特征相同或基本上相同。因此，此类特征的相关描述等同地适用于图11A的系统和相关部件的特征。关于图10所示的系统和部件描述的特征的任何合适的组合及其变型可以与图11A的系统和部件一起使用，反之亦然。此公开模式同样适用于随后的附图中描绘的和下文中描述的其他实施方案。
继续参考图11A，系统的通道1100可以包括第一表面1101和第二表面1102。在一些实施方案中，能量源1103可以包括一个或多个能量发射部分(例如，能量发射部分1105)。在一些实施方案中，能量源1103可以包括一个或多个非发射部分(例如，非发射部分1104)。非发射部分1104可以不发射或者被配置成不发射能量。在一些实施方案中，发射部分1105可以呈电磁波(例如，微波、光、热等)的形式向流体装置的至少一部分发射能量。在某些实施方案中，发射部分1105可以向流体装置发射能量。在一些实施方案中，流体通道可以联接至可移动载物台上。在其他实施方案中，可以将光投射至流体通道的至少一部分或其上，以生成一个或多个聚合物基体。可以将光引导至流体通道的各种部分。在一些实施方案中，发射部分1105可以联接至物镜(例如，显微镜物镜或透镜)，其中物镜可以移动至流体装置的不同部分。物镜可以提供允许光在流体装置上形成图案的形状(例如，虚拟或物理掩模)，以便形成与图案相似或互补的聚合物基体。在各种实施方案中，流体装置中的或与生物样品混合的一种或多种聚合物前体可以吸收发射的能量1106。在一些实施方案中，发射的能量1106可以或足以从一种或多种聚合物前体形成聚合物基体。例如，流体装置的通道1100内的一种或多种聚合物前体的一部分可以通过发射的能量激活，并且可以引发聚合反应以形成聚合物基体。
在一些实施方案中，能量源可以将能量发射至流体通道的较大部分或流体通道的几乎整个表面。物理掩模可以用于阻挡发射至流体通道的一个或多个部分的能量。能量源(例如，光源)可以经由物镜(例如，显微镜物镜或透镜)联接至流体装置。能量源可被引导至流体通道的一部分(例如，经由可移动物镜)。在一些情况下，光源、物镜和/或流体通道是可移动的以允许将能量发射至流体通道，以便在流体装置的表面的至少一部分上生成图案。聚合物基体可以与能量发射的图案相似或互补地形成。
聚合物前体可以包含激活分子，其可以吸收发射的能量1106以在流体装置中引发一种或多种聚合物前体的聚合。激活分子的非限制性示例可以包括光催化剂、光激活剂、光酸发生剂或光碱发生剂。在一些实施方案中，第一聚合物基体1108和/或第二聚合物基体1109可以在生物组分50上或相邻于生物组分50形成。在某些实施方案中，第一聚合物基体1108和第二聚合物基体1109可以形成分析室或区室1120，其在流体装置中将生物组分50与其他生物组分(例如，生物组分51、52或53)分开(例如，以物理方式分开)。换言之，聚合物基体可以区室化通道(例如，通道1100)。在各种实施方案中，聚合物基体可以部分地包围生物组分。例如，包围生物组分的聚合物结构可以形成闭合结构(例如，中空圆柱体形聚合物结构)或部分敞开结构(例如，新月形聚合物结构)。在一些实施方案中，可以相邻于生物组分形成两个或更多个聚合物基体，形成将生物组分与其他生物组分分开的区室。在某些实施方案中，聚合物基体可以包括或形成壁(例如，聚合物基体壁)。
继续参考图11A，聚合物基体1108、1109或聚合物基体1108、1109的至少一部分可以联接至第一表面1101、第二表面1102或两个表面1101和1102。在某些实施方案中，聚合物基体或聚合物基体的至少一部分可以适当地联接至第三表面、第四表面、第五表面等。在各种实施方案中，聚合物基体1108、1109可以从第一表面1101向第二表面1102延伸(例如，穿过通道200的内腔或室的腔的至少一部分)，使得聚合物基体围绕或基本上围绕生物组分50。在一些实施方案中，在物理上非常接近的两个或更多个生物组分(例如，图11C的生物组分50、51)可以被分开(例如，通过搅拌或摇动流体装置)。流体装置可以通过物理移动、使用声脉冲、改变通道中的流动或任何其他合适的搅拌方法来搅拌或摇动。然后可以形成围绕(或部分围绕)分开的生物组分的聚合物基体。图11B示出在与生物组分51分开之后围绕生物组分50形成的聚合物基体1108、1109。图11C示出根据各种实施方案的分离非常接近的两个生物组分50、51的过程。也就是说，通过搅拌或摇动流体装置，可以分开生物组分50、51。在一些实施方案中，生物组分的分开通过流体压力、流量脉动、介电泳、光热流或其某种组合来实现。在一些情况下，生物组分的分开通过声振动来实现。图11C还示出在分开生物组分50、51之后围绕生物组分50形成以生成区室1122的聚合物基体。
继续参考图11A，在一些情况下，能量源1103可以或被配置成形成或产生一个或多个发射部分1105和一个或多个非发射部分204。本文所公开的系统还可以包括空间能量调制元件，以将能量从能量源引导至流体装置的一个或多个靶向部分。例如，空间能量调制元件可以被配置成选择性地引导来自能量源的能量以在生物组分的至少一部分上或相邻于生物组分形成聚合物基体。空间能量调制元件可以被配置成通过例如抑制或防止能量被引导至除流体装置的一个或多个靶向部分之外的一个或多个部分来选择性地引导能量。在一些实施方案中，空间能量调制元件可以包括物理掩模。在一些情况下，空间能量调制元件可以包括虚拟掩模。在某些情况下，空间能量调制元件可以被配置成控制一个或多个电极，一个或多个电极可以选择性地向流体装置的一个或多个靶向部分提供能量。电极概念还可以用于提供空间调制能量以形成水凝胶结构。在一些实现方式中，一个或多个电极可以被安置在流体通道中的预先确定的定位处，因此允许在那些定位中形成水凝胶。在替代实现方式中，电极可以是阵列的形式。阵列的元件可以根据需要打开或关闭，以产生所需的能量空间图案，形成所需的水凝胶形状。例如，一个或多个电极(例如，电极阵列)可以布置在流体装置的一个或多个部分内。又例如，一个或多个电极(例如，电极阵列)可以与流体装置的一个或多个部分连通(例如，电连通)。
在一些实施方案中，掩模可以防止或被配置成防止能量源1103的能量发射表面1110的一个或多个部分发射能量(例如，非发射部分1104)。在一些实施方案中，掩模可以是虚拟掩模(例如，计算机代码或数字系统)。在某些实施方案中，掩模可以防止能量发射至生物组分所存在的定位。这可以允许或容许形成相邻于生物组分、在生物组分上或封装生物组分的聚合物基体(例如，以将细胞、蛋白质、DNA分子、RNA分子或其他靶分子保留在流体通道上的定位处)。在其他实施方案中，掩模可以促进聚合，使得聚合物基体在生物组分上。在各种实施方案中，掩模可以是物理掩模(例如，不透明物质、热屏蔽件或电磁屏蔽件)。在一些实施方案中，可以使用检测或鉴定生物组分的定位的检测器或与其组合来生成掩模(例如，虚拟掩模或物理掩模)。在一些实施方案中，检测器包括相机。在一些实施方案中，检测器包括光检测器、电导率检测器、超声检测器、超声传感器、压电传感器、其组合或另一合适的检测装置。
在一些实施方案中，第一表面1101或第二表面1102可以包括检测器，其检测或被配置成检测一个或多个生物组分在流体装置中(例如，在通道1100中)的一个或多个定位。在某些实施方案中，能量源1103可以包括检测器、联接至检测器或与检测器连通，检测器检测或被配置成检测生物组分在流体装置中的定位。在各种实施方案中，可以使用从流体装置的至少一部分获得的图像来生成掩模。掩模可以允许或容许能量源1103在一个或多个生物组分在第一表面1101上或相邻于第一表面1101存在的一个或多个定位或位置中或向它们发射能量。掩模可以抑制或防止能量源1103在一个或多个生物组分在第一表面1101上或相邻于第一表面1101存在的一个或多个定位或位置中发射能量或向该一个或多个定位或位置发射能量。在一些实施方案中，图像可以从相机(例如，数码相机、荧光成像相机等)获得。在一些实施方案中，相机可以联接至、连接至能量源1103或与能量源1103连通。例如，相机(未示出)可以与能量源1103电连通。在一些实施方案中，能量源1103可以包括相机。在各种实施方案中，能量源203可以包括显微镜(例如，荧光显微镜、共焦显微镜、无透镜成像系统、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)等)。显微镜可以用于检测一个或多个生物组分的一个或多个位置(例如，与检测器组合)。
图18A显示掩模的示例，其包括能量掩蔽区域1810和能量透明区域1815。来自能量源的能量可以被能量掩蔽区域1810阻挡，以防止能量在流体装置的一部分(例如，部分1820)中形成任何聚合物基体。能量透明区域1815可以允许能量与流体装置连通以形成聚合物基体1825。图18B示出掩模的另一示例，其中能量透明区域1835为空心圆柱体形状(例如，环形)。被掩蔽区域1830掩蔽的能量可以防止与流体装置的一部分(例如，部分1840)的能量连通。能量透明区域1835可以将能量递送至流体装置以形成聚合物基体1845。聚合物基体1845可以是中空圆柱体形状。
图19示出使用聚合物基体封装和/或定位的生物组分(即，指示为白色斑点)的示例。在一些情况下，生物组分1901可以定位在聚合物基体区室1902的中空区域内。在一些其他情况下，聚合物基体1903可以在生物组分1904上形成。在一些替代情况下，聚合物基体1905可以定位多于一个生物组分。生物区室聚合物基体1906可封装一个或多个生物组分。
图12是根据本公开的一些实施方案，在一个或多个生物组分上或相邻于一个或多个生物组分形成聚合物基体的流程图。过程1200可以手动地或自动地(例如，通过适当编程的计算机系统)进行。在步骤1210中，可以将生物样品沉积、引入或提供至流体装置的至少一部分中。在一些实施方案中，然后可以形成或生成掩模以使朝向生物组分的能量源的一个或多个部分不发射(步骤1220)。在步骤1230中，能量源可以向流体装置的至少一部分施加或提供能量。在一些实施方案中，能量源可以激活或引发聚合物前体，使得聚合物前体形成聚合物基体(例如，经由能量源提供的能量)。在一些实施方案中，可以在步骤1210之后和步骤1220之前进行对流体装置的成像以确定或鉴定生物组分的定位以生成掩模。在一些实施方案中，掩模是虚拟掩模。在一些实施方案中，聚合物基体可以形成部分或完全围绕生物组分的区室。
在某些情况下，可以操纵能量源使得在不同步骤中形成聚合物基体。例如，能量源可以引发多种聚合物前体，使得聚合物前体形成敞开的区室(例如，新月形或半圆柱体聚合物基体)。敞开区室可以用于将生物组分(例如，细胞)或样品的一部分捕获和/或容纳至流体装置的一部分。可以调整能量源或流体装置的取向，并且可以形成聚合物基体的附加部分。此附加部分可以用于与预成形的半圆柱体聚合物基体结合形成一个或多个区室。在其他实施方案中，聚合物基体区室可以在至少2、3、4、5或更多个基体形成步骤中形成。
图20A和图20B显示多步骤聚合物基体区室生成的示例。图20A示出多步骤生成的第一步，其中可以生成敞开的区室(例如，由聚合物基体制成的敞开的区室2001)以捕获和/或容纳生物组分(例如，生物组分2002)。包含生物组分2002的样品可以在流体装置(例如，流体装置2000的一部分)内具有流动方向2003。敞开的区室2001可以通过使用本文所述的能量源和能量调制单元生成聚合物基体来形成。敞开的区室可以与流体装置中的样品流动方向2003的一部分相交。聚合物基体敞开区室2001可以倾斜或垂直于流体装置中样品的流动方向2003。图11B示出多步骤生成的第二步骤，其中通过相邻于生物组分(例如，生物组分2012)、在生物组分(例如，生物组分2012)周围或在生物组分(例如，生物组分2012)上形成聚合物基体来密封或闭合敞开区室(例如，敞开区室2001)。在一些情况下，在第二步中，生物组分可以完全或基本上完全被聚合物基体封装(例如，以形成闭合的区室2011)。在一些情况下，可以相邻于生物组分、在生物组分周围或在生物组分上形成的聚合物基体将生物组分定位于流体装置2000上的定位。可以从定位的生物组分提取出基因组和/或蛋白质组物质。聚合物基体可以进一步定位提取的物质。然后流体装置可以提供可以对提取的物质进行测序的表面。在一些实施方案中，提取的物质可以被洗脱并转移至另一装置或表面以用于测序。在其他实施方案中，测序可以通过短读长测序、纳米孔测序、合成测序、原位杂交测序、使用显微镜的任何光学读出或任何其他合适的测序方法来进行。
流体装置的一个或多个表面可以包括光学(例如，荧光)、机械、电或生化传感元件或传感器。传感元件可以包括荧光标签、酶、引物、寡核苷酸或传感器分子(例如，生化传感器分子)。传感元件可以用于检测和/或测量pH、氧气浓度、CO2浓度或任何其他合适的变量。传感元件可以局部地检测和/或测量参数。例如，传感元件可以检测和/或测量围绕生物组分的区室(例如，聚合物基体外壳圆柱体)内的pH、氧气浓度或CO2浓度。
具有捕获元件的系统
本公开还提供系统，其包括用于固定和/或区室化一个或多个生物组分的一个或多个捕获元件(例如，本文所述的核酸捕获探针)。系统可以包括流体装置。流体装置可以包括或含有一个或多个生物组分。此外，流体装置可以包括或含有一种或多种聚合物前体。在一些实施方案中，流体装置可以包括第一表面(例如，在流体装置的通道和/或室中)。流体装置可以包括一个或多个捕获元件。捕获元件可以将一个或多个生物组分中的至少一个固定在第一表面(或任何合适的表面)上或相邻于第一表面(或任何合适的表面)的定位处，或可以被配置成将一个或多个生物组分中的至少一个固定在第一表面(或任何合适的表面)上或相邻于第一表面(或任何合适的表面)的定位处。生物组分与捕获元件的固定或偶联可以形成固定的生物组分。系统还可以包括与流体装置连通的至少一个能量源。在某些实施方案中，至少一个能量源可以向流体装置的至少一部分提供或供应能量或被配置成向流体装置的至少一部分提供或供应能量。因此，能量源可以激活或导致一种或多种聚合物前体(例如，布置在流体装置中)在固定的生物组分上或相邻于固定的生物组分形成至少一个聚合物基体。在各种实施方案中，流体装置还可以包括平台或载物台以保持流体装置。在一些实施方案中，系统还可以包括测序装置(例如，下一代测序装置)以获得测序数据。在流体装置中形成的聚合物基体可以用于捕获和定位生物组分。可以使用流体装置提取基因组和/或蛋白质组物质。然后流体装置可以提供可以对提取的物质进行测序的表面。在一些实施方案中，提取的物质可以被洗脱并转移至另一装置或表面以用于测序。在其他实施方案中，测序可以通过短读长测序、纳米孔测序、合成测序、原位杂交测序或使用显微镜的任何光学读出来进行。
为了固定生物组分，流体装置可以包括一个或多个捕获部位。捕获部位可以包括捕获元件。在一些实施方案中，一个或多个捕获元件或部位可以包括图案或以图案布置。流体装置可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、1,000、10,000、105、106、107、108、109、1010、1020个捕获元件，或本文所提及的任何两个数字之间的任何数量的捕获元件。在一些实施方案中，流体装置可以包括多于1020个捕获元件。
流体装置可以包括通道。流体装置可以包括室。图13A示出流体装置中的通道1300的至少一部分的示例。一个或多个捕获元件1311可以布置或定位在流体装置的第一表面1301上。在一些情况下，第二表面1302可以包括一个或多个捕获元件。捕获元件可以布置在两个表面或任何其他合适的表面上。捕获元件可以包含官能团或至少部分地由官能团形成。官能团的一些非限制性示例包括捕获试剂(例如，吡啶甲醛(PCA))、生物素、链霉亲和素、strep-tag II、接头或可以与分子反应的官能团(例如，醛、磷酸酯、硅酸酯、酯、酸、酰胺、炔烃、叠氮化物或醛二硫戊环)。官能团可以特异性地偶联至肽的N末端或C末端。官能团可以特异性地偶联至氨基酸侧链。官能团可以偶联至氨基酸侧链(例如，谷氨酸或天冬氨酸的酸、半胱氨酸的硫醇、赖氨酸的胺或者谷氨酰胺或天冬酰胺的酰胺)。官能团可以特异性地偶联至特定物种上的反应性基团，诸如细胞上的膜结合分子(例如，真核细胞的糖蛋白或原核生物的原生质上的菌毛)。在一些示例中，捕获元件可以包含纤连蛋白。在另一个示例中，捕获元件可以包含RGD肽。在一些情况下，捕获元件可以包含抗体。在一些示例中，官能基序可以可逆地偶联和切割(例如，通过使用酶)。图13B示出与捕获元件1311接触或偶联的生物组分51的示例。在一些情况下，排斥表面涂层(例如，PEG)可以用于防止聚合物基体覆盖或捕集生物组分。
在各种情况下，捕获元件可以包括物理捕集器、流体动力学捕集器、几何捕集器、孔、电化学捕集器(例如，捕集电荷分子)、链霉亲和素、抗体、适体、亲和结合(例如，可以结合细胞的表面蛋白的肽)、一种或多种磁性物质(例如，磁性盘、磁性阵列或磁性颗粒)、介电泳捕集器(例如，电极阵列)或其组合。捕集器可以包含聚合物基体或水凝胶。聚合物基体或水凝胶捕集器可以根据需要，使用能量源和/或类似于本文所提及的聚合物基体区室的降解来构建或解构。例如，捕获元件可以包括孔。孔的直径可以为1μm至50μm。在一些实施方案中，孔的直径可以为1μm至20μm、20μm至30μm、30μm至40μm或40μm至50μm。孔的直径可以超过50μm。孔的直径可以小于1μm。在一些实施方案中，孔的深度可以为0.1μm至100μm。在某些实施方案中，孔的深度可以超过100μm。孔的深度可以小于0.1μm。孔的深度可以为0.1μm至0.5μm、0.1μm至1μm、0.1μm至5μm、0.1μm至10μm、0.1μm至20μm、0.1μm至30μm、0.1μm至50μm、0.1μm至100μm、0.5μm至1μm、0.5μm至5μm、0.5μm至10μm、0.5μm至20μm、0.5μm至30μm、0.5μm至50μm、0.5μm至100μm、1μm至5μm、1μm至10μm、1μm至20μm、1μm至30μm、1μm至50μm、1μm至100μm、5μm至10μm、5μm至20μm、5μm至30μm、5μm至50μm、5μm至100μm、10μm至20μm、10μm至30μm、10μm至50μm、10μm至100μm、20μm至30μm、20μm至50μm、20μm至100μm、30μm至50μm、30μm至100μm或50μm至100μm。孔的深度可以为约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约20μm、约30μm、约50μm或约100μm。孔的深度可以为至少0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm或50μm。孔的深度可以为至多0.5μm、1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、50μm或100μm。
在一些实施方案中，流体装置可以包括排斥表面涂层，其可以用于防止在预先限定的定位处捕获生物组分。图21A示出流体装置的表面2101的一部分，其中表面2101可以包括捕获部位2102和排斥部位2103。表面2101可以使用表面涂层(例如，PEG)官能化以生成排斥部位2103。排斥部位2103可以防止生物组分在排斥部位2103的定位处结合表面2101并且将生物组分驱动至捕获部位2102。在一些情况下，表面2101可以仅包括排斥部位而没有捕获部位。排斥部位最初可以定位生物组分。聚合物基体可以通过将能量源引导至排斥部位来形成，以相邻于可以定位于排斥部位之间的生物组分形成区室。图21B示出流体装置中预先限定的定位中所含的生物组分的示例。图21C示出流体装置中预先限定的定位中所含的生物组分的更高放大倍数的示例。
能量源可以用于在捕获的生物组分的至少一部分上、在捕获的生物组分的至少一部分周围或相邻于捕获的生物组分的至少一部分形成聚合物基体。在一些实施方案中，掩模可以用于允许或容许能量源将能量引导至捕获的生物组分的定位或位置。在某些实施方案中，掩模可以用于抑制或防止能量源将能量引导至捕获的生物组分的定位或位置。掩模可以被配置成将能量引导至预先确定或选定的定位以形成围绕或至少部分地围绕一个或多个生物组分的聚合物基体。掩模可以至少部分地基于捕获部位的图案(例如，流体装置表面上的捕获部位/元件的图案)来生成。在一些实施方案中，掩模可以被配置成防止能量被引导至围绕尚未捕获或偶联生物组分的捕获部位或元件的定位。在某些情况下，为了分析单个细胞，掩模可以被配置成防止能量相邻于已捕获或偶联两个或更多个生物组分的捕获元件的定位被发射。在一些实施方案中，掩模可以被配置成允许或容许能量相邻于已捕获两个或更多个生物组分的捕获元件的定位被发射，例如，以允许分析细胞间相互作用。在某些实施方案中，掩模可以是光刻掩模或另一种合适的掩模，如本文所述。在一些实施方案中，系统还可以包括检测器，例如以检测生物组分的定位，如本文所述。掩模可以至少部分地基于所检测的生物组分的定位来生成。另外，掩模可以选择性地将能量从能量源引导或供应至流体装置，如本文所述。
图13C示出相邻于(例如，围绕)生物组分形成聚合物基体的方法的示例。聚合物基体1308可以相邻于捕获元件1311形成。聚合物基体1308可以被配置成将生物组分51保持在适当的位置或在分析室或区室1320内。区室1320可以至少部分地由聚合物基体1308、第一表面1301和第二表面1302形成，在流体装置内(例如，在生物组分51周围)形成室或至少部分密封的空间。在一些实施方案中，聚合物基体1308可以围绕生物组分51形成区室1320。区室1320可以将生物组分51保持在适当的位置。聚合物基体1308和/或区室420可以抑制或防止与生物组分51缔合的化合物离开区室。在一些实施方案中，与生物组分缔合的化合物可以包括核酸(例如，DNA或RNA)、蛋白质、代谢物、酶、抗体、其组合或任何其他合适的化合物或物质。在一些实施方案中，聚合物基体或水凝胶的表面可以通过将官能团偶联至聚合物基体或水凝胶来官能化。区室内部聚合物基体的官能化表面可以偶联至捕获元件(例如，抗体)以捕获生物组分所分泌的分子(例如，分泌的蛋白质)。然后可以通过传感分子或通过标记方法(例如，通过荧光标记)读出捕获元件或捕获的分子。在一些实施方案中，聚合物基体可以被配置成允许与生物组分缔合的一种或多种化合物通过。在一些实施方案中，聚合物基体可以被配置成允许试剂通过。试剂可以包括例如一种或多种酶、化学品、寡核苷酸(例如，大小小于50个碱基对的一个或多个引物)、溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶、转座酶、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂、细胞培养基、二价阳离子、其组合或任何其他合适的试剂。
在某些实施方案中，流体装置中通道的第一表面、第二表面或两个表面可以被官能化，如本文所述。流体装置的表面(例如，第一表面、第二表面、第三表面等)可以包含被配置成结合至生物组分(例如，被捕获的生物组分)的化合物。在一些实施方案中，流体装置的表面(例如，第一表面、第二表面、第三表面等)可以包含一个或多个条形码。一个或多个表面可以包含寡核苷酸以形成DNA簇以便进行测序。在一些情况下，一个或多个表面可以包括用于直接DNA和/或RNA读出的一个或多个纳米孔读取器。一个或多个表面可以包括捕获单个RNA分子和/或单个DNA分子或容纳DNA/RNA文库的纳米孔。在一些替代情况下，一个或多个表面可以包含用于选择性沉积DNA纳米球的图案化疏水/亲水特征。纳米球可以通过从DNA/RNA分子环化和扩增DNA文库来生成。
流体装置的一个或多个表面可以包括光学(例如，荧光)、机械、电或生化传感元件或传感器。传感元件可以包括荧光标签、酶、引物、寡核苷酸或传感器分子(例如，生化传感器分子)。传感元件可以用于检测和/或测量pH、氧气浓度、CO2浓度或任何其他合适的变量。传感元件可以局部地检测和/或测量参数。例如，传感元件可以检测和/或测量围绕或封装生物组分的区室(例如，聚合物基体外壳圆柱体)内的pH、氧气浓度或CO2浓度。
在一些实施方案中，本文所述的流体装置包含核酸分子捕获探针和多个表面引物探针。在一些实施方案中，核酸分子捕获探针位于如本文所述的一个或多个区室(例如孔、聚合物基体)内。在一些实施方案中，核酸分子捕获探针位于一个或多个区室附近。在一些实施方案中，表面引物探针位于如本文所述的一个或多个区室(例如孔、聚合物基体)内。在一些实施方案中，表面引物探针位于一个或多个区室附近。在一些实施方案中，核酸分子捕获探针和/或表面引物探针包含衔接子序列。在一些实施方案中，核酸分子捕获探针和/或表面引物探针包含扩增引物序列。在一些实施方案中，衔接子包含被配置成允许起始对核酸分子或其衍生物(例如cDNA)的测序反应的序列。在一些实施方案中，微流体装置包括被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针的子集包含未被核酸分子占据的一个或多个核酸分子捕获探针。在一些实施方案中，被配置成使一个或多个核酸分子捕获探针的至少子集失活的部分包含外切核酸酶。在一些实施方案中，核酸分子捕获探针和/或表面引物探针包含模板转换寡核苷酸。在一些实施方案中，微流体装置包括一个或多个区室，以便插入溶液中的引物序列。在一些实施方案中，多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，其封闭多个表面引物探针的至少子集上的延伸反应。在一些实施方案中，封闭剂可以通过解封闭多个表面引物探针的至少子集的反应来去除，以允许延伸反应。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集互补的序列的核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种封闭剂包括包含与多个表面引物探针的至少子集部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸和聚合酶或其任何衍生物。在一些实施方案中，微流体装置包含足以在微流体装置上对核酸分子或其衍生物的至少一个子集进行原位测序的试剂。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。在一些实施方案中，DNA是经片段化的单链DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA。在一些实施方案中，RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。在一些实施方案中，RNA分子包括mRNA。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。在一些实施方案中，被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。在一些实施方案中，微流体装置是孔、珠子或流体通道。在一些实施方案中，流体通道是流动池。在一些实施方案中，微流体装置不是珠子。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。在一些实施方案中，扩增包括固体支持的扩增。在一些实施方案中，固体支持的扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。在一些实施方案中，该方法发生在凝胶基体中，其中凝胶基体与固体支持物相邻。
多层次系统
本文还提供了用于分析生物组分的系统，其至少包括流动通道(例如，第一层或上层)和分析通道(例如，第二层或下层)。系统可以包括流体装置，其包括流动通道、分析通道以及布置在流动通道与分析通道之间的层或壁。系统可以包括与流体装置连通的至少一个能量源，如本文所述。分析通道可相邻于流动通道布置，其中至少一个流动抑制元件可以布置在流动通道内以抑制或停止生物组分在流动通道中的流动。布置在流动通道与分析通道之间的层可以包括在至少一个流动抑制元件处或相邻于至少一个流动抑制元件布置的至少一个可密封开孔。一个或多个生物组分可相邻于可密封开孔被阻挡或捕集。至少一个可密封开孔可以被配置成允许一个或多个生物组分通过。例如，可密封开孔可以被配置成允许一个或多个生物组分从流动通道向分析通道通过。至少一个能量源可以与分析通道连通。此外，至少一个能量源可以在分析通道内形成聚合物基体或被配置成在分析通道内形成聚合物基体。
如本文所述，在一些实施方案中，流体装置可以包括微流体装置或纳米流体装置。在某些实施方案中，流体装置可以用于核酸测序。在一些情况下，流体装置可以包括核酸测序流动池。在其他情况下，测序可以包括短读长测序、纳米孔测序、合成测序、原位杂交测序、通过任何光学读出的收集的测序或任何其他合适的测序方法。
如本文所述，生物组分可以包括细胞、细胞裂解物、核酸、微生物组、蛋白质、细胞混合物、空间连接的生物组分、代谢物、其组合或任何其他合适的生物组分。在一些情况下，细胞混合物可以包含两种或更多种不同的细胞类型。例如，细胞混合物可以包含第一细胞类型和第二细胞类型。在一些情况下，细胞混合物可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种细胞类型。细胞可以是哺乳动物细胞(例如，人类细胞)、真菌细胞、细菌细胞、肿瘤球状体、其组合或任何其他合适的细胞。在一些情况下，生物组分可以包括肿瘤球状体或空间连接的生物组分(或样品)。
在一些情况下，核酸可以包含至少100个碱基或碱基对。在某些实施方案中，核酸包含DNA或RNA。DNA的长度可以为至少100bp。在一些实施方案中，DNA可以包含至少50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1,000bp、10千碱基对(kbp)、100kbp、1兆碱基对(Mbp)、100Mbp、1千兆碱基对(Gbp)、10Gbp、100Gbp或更多碱基对。生物组分可以包含DNA分子，其包含本文所提及的数目之间中的任何数量的碱基对。例如，DNA可以包含50bp至1,000bp、300bp至10kbp或1,000bp至10Gbp。RNA可以是dsRNA。dsRNA可以包含至少50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1,000bp、10kbp或100kbp。生物组分可以包含dsRNA分子，其包含本文所提及的数目之间中的任何数量的碱基对。例如，dsRNA可以包含50bp至1,000bp、300bp至10kbp或1,000bp至100kbp。RNA可以是ssRNA。ssRNA可以包含至少50个核苷酸至100,000nt。ssRNA可以包含50nt至100nt、50nt至1,000nt、50nt至10,000nt、50nt至100,000nt、100nt至1,000nt、100nt至10,000nt、100nt至100,000nt、1,000nt至10,000nt、1,000nt至100,000nt或10,000nt至100,000nt。在一些情况下，ssRNA的长度可以小于50个核苷酸。ssRNA的长度可以超过100,000个核苷酸。
在一些实施方案中，流动通道或其一部分可以与分析通道或其至少一部分平行或基本上平行。在一些实施方案中，流动通道可以可拆卸地联接至分析通道。例如，用户可以从分析通道去除流动通道。因此，流体装置的包括分析通道的部分可以用于进行各种分析或实验。在流体装置的包括流动通道的部分被去除的情况下，流体装置的包括分析通道的部分可以更容易接近例如检测器、相机或用于分析分析通道内的生物组分的其他装置。
在一些情况下，分析通道可以包括用于捕获或捕集生物组分或者通过生物组分产生(例如，在将生物组分引入至流体装置中之前)的分子或化合物的聚合物基体结构。例如，用户可以获得包括聚合物基体结构的分析通道。也就是说，用户可以不形成聚合物基体结构。在各种情况下，分析通道可以被配置成包括用于捕获或捕集生物组分或者通过生物组分产生的分子或化合物的聚合物基体结构。例如，在此类实施方案中，在将生物组分引入至流体装置和分析通道中之后，可以在分析通道中形成一个或多个聚合物基体结构。分析通道可以被配置用于筛选过程、文库制备或其他合适的过程。在一些实施方案中，筛选过程可以用于药物筛选、抗生素筛选、培养条件筛选或CRISPR筛选。在某些情况下，可以将多个样品放置于多个通道中。可以针对其他包含信号的通道中的多种条件来筛选多个样品。
可密封开孔可以被配置成从密封状态转变至敞开状态。例如，可密封开孔可以包含热敏聚合物，其可以例如在接收热之后熔化并使可密封开孔敞开。在一些情况下，生物组分穿过可密封开孔的通行在密封状态下可以被抑制。在某些情况下，生物组分穿过可密封开孔的通行在敞开状态下可以被允许。在一些情况下，可密封开孔可以用琼脂糖凝胶、温度溶解性聚合物、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)聚合物、蜡化合物、藻酸盐或任何其他合适的化合物或物质密封。
图15A和图15B显示被配置成捕集生物组分50的流体装置的一部分。流体装置可以包括流动通道或室1551、分析通道或室1552以及布置在流动通道1551的至少一部分与分析通道1552之间的层或壁1553。层1553可以包括一个或多个可密封开孔或开口1554。另外，一个或多个流动抑制元件1555可以抑制或防止或者可以被配置成抑制或防止生物组分50沿着流动通道1511流动。流动抑制元件1555可以被配置成阻止或捕集相邻于可密封开孔1554的生物组分50。如本文所述，可密封开孔1514可以被配置成从密封状态(例如，闭合状态)或配置转变成敞开状态或配置。图15A示出在密封状态下的可密封开孔1514的示例。图15B显示在敞开状态下的可密封开孔1554的示例。在从密封状态转变至敞开状态之后，可密封开孔1554可以允许或容许生物组分50从流动通道1551的至少一部分向分析通道1552的至少一部分通过。在某些情况下，分析通道1552可以放置或被配置成放置在流动通道1551下方，以允许生物组分50通过所提供的力(例如，经由重力、通过对流动通道中的流加压并在分析通道中生成负压产生的高压脉冲)从流动通道1551转移至分析通道1552。在一些实施方案中，流体装置可被旋转或离心以将一个或多个生物组分从流动通道布置至分析通道。试剂可以被布置或通过分析通道1552的至少一部分，例如以进行本文提供的分析或实验。
如图15A所示，流动抑制元件1555可以布置在流动通道1551的至少一部分内，以抑制或防止生物组分(例如，生物组分50)在流动通道1551中的流动。流动抑制元件1555可以被配置成捕获或捕集流动通道1551的至少一部分中的生物组分50。在一些情况下，流动抑制元件1555可以从流动通道1551的表面(例如，表面1569)延伸。在一些情况下，表面1569可以与相邻于层1553的流动通道表面1561相对布置。
在各种情况下，分析通道1552可以包括与相邻于层1553或作为层1553表面的分析通道表面1563相对布置的表面1559。分析通道1552可以包括一个或多个聚合物基体1556。分析通道1552可以包括一种或多种聚合物前体。例如，一种或多种聚合物前体可以布置在分析通道1552的至少一部分中。可以使用向分析通道1502中的一种或多种聚合物前体提供能量的能量源来形成一个或多个聚合物基体1556。能量源可以与流体装置或分析通道1552光学连通、电化学连通、电磁连通、热连通或微波连通。在一些情况下，能量源可以是光生成装置、热生成装置、电化学生成装置、电极、微波装置或其组合。能量源可以选择性地向分析通道1552提供能量以在预先限定的定位处形成聚合物基体。空间能量调制元件可以用于选择性地向分析通道1552提供能量。
在一些情况下，空间能量调制元件可以包括光刻掩模、DMD系统或其他合适的掩模。一个或多个聚合物基体1556可以在可密封开孔1554转变成敞开状态之前形成(例如，如图15A所示)。例如，聚合物基体可以形成并且与可密封开孔对齐，使得当使可密封开孔1554敞开时，通过抑制元件1555保持的生物组分1550可以被引导(例如，通过重力或通过流体压力落下)至区室1520中。一个或多个聚合物基体1556可以在可密封开孔1554转变成敞开状态之后形成(例如，如图15B所示)。一个或多个聚合物基体1556可以形成分析室或区室1520，如本文所述。
图16A和图16B显示流体装置的俯视图。流动抑制通道1675可以被配置成抑制生物组分20沿着流动通道1651流动。流体(例如，包含生物组分的流体)通过流动通道651和流动抑制通道1651的流动可以导致生物组分20被捕集或阻挡在流动抑制通道1675的开口处，如图16A所描绘。如图所示，流动抑制通道1675的尺寸(例如，宽度)可能太小或太窄以致于不允许或容许生物组分20通过流动抑制通道1675。如图16B所示，聚合物基体1676可以在生物组分20上或相邻于生物组分20(例如，围绕生物组分20)形成。在一些情况下，聚合物基体可以围绕生物组分的至少一部分。图16A和图16B的流体装置可以是单层流体装置。即，聚合物基体可以在流动通道1651中形成。如图所示，流动通道1651的路径可以是迂回的。例如，流动通道1651可以包括一条或多条曲线。在一些实施方案中，流动通道的路径可以是直的、基本上直的、呈锯齿状图案或任何其他合适的形状。
在某些实施方案中，图16A和图16B的流体装置可以包括两个或更多个层。例如，流体装置可以包括流动通道和分析通道(类似于图15A和图15B所示的系统)。此外，可密封开孔可以布置在流动抑制通道的一部分处或相邻于流动抑制通道的一部分。在此类实施方案中，生物组分可以通过可密封开孔转移至分析通道(例如，相邻于流动通道或在流动通道下方布置)中，如本文所述。在一些情况下，分析通道可以接收两个或更多个生物组分。例如，分析通道可以接收2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个生物组分。
图17示出包括或被配置用于多种试剂和/或分析物(R1、R2、R3和R4)的流体装置的示例。流体装置可以包括第一流动通道1751a以接收来自第一样品的一个或多个生物组分。第一流动通道1751a可以允许或容许来自第一样品的一个或多个生物组分流动或通过。此外，第一流动通道1751a可以允许或允许一种或多种聚合物前体流动或通过。流体装置可以包括第二流动通道1751b以接收来自第二样品的一个或多个生物组分。第二流动通道1751b可以允许或容许来自第二样品的一个或多个生物组分流动或通过。此外，第二流动通道1751b可以允许或容许来自第二样品的一个或多个生物组分流动或通过。
第一流动通道1751a和/或第二流动通道1751b可以包括多个抑制元件(例如，抑制元件1755)。生物组分(例如，生物组分50)可以被抑制元件1755捕集或定位。如本文所述，第一流动通道1751a和/或第二流动通道1751b可以包括在一个或多个抑制元件1755处或相邻于一个或多个抑制元件1755布置的一个或多个可密封开孔，其可以被打开(例如，从密封状态转变至敞开状态)以允许生物组分移动至第一分析通道1752a或第二分析通道1752b。第一和第二流动通道1751a和1751b可以布置在第一和第二分析通道1752a和1752b上方(例如，类似于图15A和图15B中所示的流体装置，在上层和下层中)。聚合物基体1756可以围绕生物组分50形成。聚合物基体1756可以部分地围绕生物组分50。聚合物基体1756可以形成区室或分析室1720以将生物组分50定位在分析通道(例如，分析通道1751a和1751b)的至少一部分内。
第一分析通道1752a可以包含与第二分析通道1752b中的一种或多种试剂和/或分析物不同的一种或多种试剂和/或分析物。第一分析通道1752a可以包含与第二分析通道1752b中的一种或多种试剂和/或分析物相同的一种或多种试剂和/或分析物。在一些情况下，流体装置可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、50个或更多个流动通道。在某些情况下，流体装置可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、50个或更多个分析通道。流体装置可以并行分析多个生物组分。多个生物组分可以暴露于一种或多种不同的试剂和/或分析物，如本文所提供。此类配置(例如，如图17所示)可以允许在通过不同试剂和/或分析物提供的各种条件下分析一个或多个样品中的多个生物组分。图17所示的流体装置可以用于筛选过程。筛选过程可以用于药物筛选、抗生素筛选、培养条件筛选或CRISPR筛选。筛选过程可以呈组合方式进行。例如，可以将多个样品加载到多个流动通道中(例如，并行的)，可以针对多个分析通道中的多个条件进行筛选。
第一和/或第二样品可以是同质或异质的。例如，第一样品中的一个或多个生物组分可以相同或不同。第一样品可以与第二样品不同。在一些情况下，可以通过选择性降解聚合物基体来从区室或分析室1720释放生物组分，如本文所述。换言之，聚合物基体可以“根据需要”进行降解(例如，通过用户或如计算机所引导)。在各种实施方案中，可以通过使用定位的刺激来实现降解。在某些实施方案中，降解可以通过使用热、光、电化学反应或其某种组合来实现。释放的生物组分可以使用出口通道(例如，出口通道1781a或1781b)来收集。
如参考图15A和图15B的流体装置所述，层可以布置在流动通道1751a和1751b与分析通道1752a和1752b之间。相邻于层的分析通道表面(例如，类似于图15A所示的表面1561)、与层相对的分析通道表面(例如，类似于图15A所示的表面1559)或两者可以包含一个或多个条形码，如本文所述。
在一些情况下，通道和/或分析可以包括除一个或多个条形码之外或代替一个或多个条形码的分子。例如，一个或多个通道和/或分析通道的任何表面可以包括光学(例如，荧光)、机械、电或生化传感元件或传感器。传感元件可以包括荧光标签、酶、引物、寡核苷酸或传感器分子(例如，生化传感器分子)。传感元件可以用于检测和/或测量pH、氧气浓度、CO2浓度或任何其他合适的变量。传感元件可以局部地检测和/或测量参数。例如，传感元件可以检测和/或测量围绕生物组分的区室(例如，聚合物基体外壳圆柱体)内的pH、氧气浓度或CO2浓度。
水凝胶室
在一些实施方案中，水凝胶室可以用作扩散性改性剂，其限制预先确定的细胞核酸分子可远离裂解的细胞行进的距离。多种可光能合成的凝胶可以结合本发明使用。在一些实施方案中，水凝胶与本发明一起使用，特别是因为它们与活细胞具有相容性并且在配制具有所需性质(包括但不限于孔隙率(其在很大程度上决定了内容物和通过胶(或聚合物基体)壁的物质、可降解性、机械强度、合成的容易性和速度等))的凝胶中用途广泛。
孔隙率。在一些实施方案中，选择水凝胶孔隙率以允许所选试剂通过，同时防止其他试剂通过。在一些实施方案中，选择水凝胶孔隙率以防止生物细胞通过，但允许试剂(包括蛋白质，诸如聚合酶)通过。在一些实施方案中，可渗透聚合物基体壁的试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶、转座酶、连接酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂、细胞培养基或二价阳离子。在一些实施方案中，至少一种聚合基体包括孔隙，其大小设定为允许试剂扩散通过至少一种聚合物基体，但太小以致于不允许用于分析的DNA或RNA横穿孔隙(大小大于100个核苷酸或碱基对，或大于300个核苷酸或碱基对)。在一些实施方案中，交联水凝胶结构的聚合物链形成具有孔隙的水凝胶基体(即，多孔水凝胶基体)。在一些型式中，水凝胶结构中孔隙的大小可以被调控或调谐，并且可以被配制为封装足够大的遗传物质(例如，大于约300个碱基对)，但允许较小的物质(诸如试剂)或大小更小的核酸(例如，小于约50个碱基对)(诸如引物)穿过孔隙，从而进出水凝胶结构。在一些实施方案中，水凝胶可以包含直径足以允许上文列出的试剂扩散通过结构，同时保留长度大于500个核苷酸或碱基对的核酸分子的孔径。在一些实施方案中，孔隙的直径为约10nm至约100nm。在一些实施方案中，水凝胶结构的孔径可以通过常规实验通过改变聚合物前体的浓度与交联剂的浓度的比率、改变pH、盐浓度、温度、光强度等来确定。在一些实施方案中，聚合物基体壁的孔隙的平均直径阻止分子量为25千道尔顿(kDa)或更大、分子量为50kDa或更大、分子量为75kDa或更大、分子量为100kDa或更大或者分子量为150kDa或更大的分子通过。
在一些实施方案中，保留的DNA或RNA的长度可使用常规的合成测序技术进行测序。例如，此类DNA或RNA包含至少50个核苷酸，或在一些实施方案中，至少100个核苷酸。在一些实施方案中，孔隙的平均直径可以为5nm至100nm。在一些实施方案中，孔隙的平均直径可以为5nm至10nm、10nm至20nm、20nm至30nm、30nm至40nm、50nm至60nm、60nm至70nm、70nm至80nm、80nm至90nm、90nm至100nm。在一些实施方案中，孔隙的平均直径可以大于100nm。在一些实施方案中，孔隙的平均直径可以小于5nm。试剂可以包括大小小于50个碱基对(bp)的酶或引物。引物可以包含单链DNA(ssDNA)。在一些实施方案中，引物的大小可以为5bp至50bp。在一些实施方案中，引物的大小可以为5bp至10bp、10bp至20bp、20bp至30bp、30bp至40bp或40bp至50bp。在一些实施方案中，引物的大小可以超过50bp。在某些情况下，引物的大小可以小于5bp。在一些实施方案中，孔隙的直径可以为5nm至100nm。在一些实施方案中，孔隙的直径可以为5nm至10nm、10nm至20nm、20nm至30nm、30nm至40nm、50nm至60nm、60nm至70nm、70nm至80nm、80nm至90nm、90nm至100nm。在一些实施方案中，孔隙的直径可以大于100nm。在一些实施方案中，孔隙的平均直径可以小于5nm。聚合物基体的孔径可以为约5纳米(nm)至约100nm。聚合物基体的孔径可以为约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约110nm、约10nm至约20nm、约10nm至约30nm、约10nm至约40nm、约10nm至约50nm、约10nm至约60nm、约10nm至约70nm、约10nm至约80nm、约10nm至约90nm、约10nm至约100nm、约10nm至约110nm、约20nm至约30nm、约20nm至约40nm、约20nm至约50nm、约20nm至约60nm、约20nm至约70nm、约20nm至约80nm、约20nm至约90nm、约20nm至约100nm、约20nm至约110nm、约30nm至约40nm、约30nm至约50nm、约30nm至约60nm、约30nm至约70nm、约30nm至约80nm、约30nm至约90nm、约30nm至约100nm、约30nm至约110nm、约40nm至约50nm、约40nm至约60nm、约40nm至约70nm、约40nm至约80nm、约40nm至约90nm、约40nm至约100nm、约40nm至约110nm、约50nm至约60nm、约50nm至约70nm、约50nm至约80nm、约50nm至约90nm、约50nm至约100nm、约50nm至约110nm、约60nm至约70nm、约60nm至约80nm、约60nm至约90nm、约60nm至约100nm、约60nm至约110nm、约70nm至约80nm、约70nm至约90nm、约70nm至约100nm、约70nm至约110nm、约80nm至约90nm、约80nm至约100nm、约80nm至约110nm、约90nm至约100nm、约90nm至约110nm或约100nm至约110nm。聚合物基体的孔径可以为约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm或约110nm。聚合物基体的孔径可以为至少约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm或更小。聚合物基体的孔径可以为至多约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约110nm或更大。
孔隙率的调制。聚合物基体中的孔径可以使用化学试剂或通过施加热、电场、光或另一合适的刺激来调节。换言之，聚合物基体可以包括可调谐的性质(例如，孔径)。在一些情况下，聚合物基体可以包括热响应性或温度响应性聚合物。热响应性聚合物(例如，聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAAM))在加热之后或在冷却之后可能与溶液发生相分离(例如，显示下临界溶液温度(LCST)或上临界溶液温度(UCST)的聚合物)。聚合物基体可以包含可在高温下塌陷的聚合物，以例如控制水凝胶或聚合物基体的孔径。可以用于形成具有可调谐的性质的水凝胶/聚合物基体的热响应性聚合物的非限制性示例可以包括聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚(N-乙基噁唑啉)、聚(甲基乙烯基醚)、聚(丙烯酸-丙烯酰胺)共聚物或其组合。温度的变化可以放大或缩小聚合物基体中的平均孔径，以允许选定的分子诸如核酸分子、蛋白质或任何生物分子或小于经调整的孔径的分子从水凝胶室中释放。
水凝胶室的大小和形状。在一些实施方案中，室的聚合物基体壁抑制预先确定的组分的通过，诸如哺乳动物细胞、基因组DNA、较大的多核苷酸(例如大于200个核糖核苷酸、大于300个核糖核苷酸或500个核糖核苷酸的mRNA)等等。在一些实施方案中，聚合物基体壁从第一表面延伸至第二表面(平行于第一表面)以在通道内形成室。在一些实施方案中，室具有聚合物基体壁和内部，其具有内部区域，该内部区域是由室包封的表面的区域。在一些实施方案中，室的内部的大小经过设计以便包封细胞。例如，此类室可以包括圆柱形外壳或多边形外壳，其包括内部空间或内部和聚合物基体壁。在一些实施方案中，此类室具有类环形的横截面。如本文所用，术语“类环形的横截面”意指拓扑上等同于环形的横截面。在一些实施方案中，腔的内部空间或内部的直径的范围为1μm至500μm，并且体积的范围为1皮升至200纳升、100皮升至100纳升或100皮升至10纳升。在一些实施方案中，水凝胶室包封范围为5μm2至1x106μm2或范围为400μm2至7x105μm2的表面积。在一些实施方案中，聚合物基体壁的厚度为至少1μm(微米)。在一些实施方案中，具有类环形横截面的室的高度的值的范围为10μm至500μm或范围为50μm至250μm。在一些实施方案中，具有类环形的横截面的聚合物基体壁的高宽比(即，高度/宽度)为1或更小。在一些实施方案中，选择高宽比和聚合物基体壁厚度以最大化抵抗力(诸如通过通道的试剂流)、洗涤等的室稳定性。在一些实施方案中，至少一个聚合物基体壁是水凝胶壁。在一些实施方案中，至少一个聚合物基体是可降解的。在一些实施方案中，至少一个聚合物基体的降解是“根据需要”的。在一些实施方案中，通道中的室是不连续的。在一些实施方案中，通道中的室可以与相邻的室邻接。在一些实施方案中，室可以彼此共享聚合物基体壁。在一些实施方案中，室可以是合成的，其狭缝或其他孔口足够大以允许某些组分(例如珠子)穿过，但又足够小以防止其他组分(例如细胞通过)。
水凝胶组合物。在一些实施方案中，本发明系统的流体装置的通道包含用于形成室的一种或多种聚合物前体。在一些实施方案中，一种或多种聚合物前体包含水凝胶前体。此类前体可以选自多种化合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N’-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质烷、果胶、卡拉胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙胺、三烯丙胺、二乙烯砜、二甘醇二烯丙基醚、二丙烯酸乙二醇酯、聚二丙烯酸亚甲基二醇酯、聚二丙烯酸乙二醇酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化四丙烯酸季戊四醇酯或其组合或混合物。在一些实施方案中，水凝胶包含可酶促降解的水凝胶、PEG硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N’-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/PPO。在一些实施方案中，以下前体和交联剂可以用于形成具有可降解聚合物基体(水凝胶)壁的室。聚合物前体可以通过使用表1A的任何水凝胶前体和交联剂(分别为第1栏和第3栏)来形成。所得聚合物基体可以用表1A中指示的降解剂(第4栏)降解。
表1A
表1B
水凝胶降解。在一些实施方案中，本发明水凝胶室通常在通道内或“根据需要”在通道内可降解或可解聚。通常可降解的水凝胶室通过用降解剂或等效地暴露于通道内所有室的解聚剂处理来降解。解聚剂可以包括但不限于热、光和/或化学解聚试剂(有时也称为切割试剂或降解试剂)。在一些实施方案中，根据需要的降解可以使用容许光交联和光降解的聚合物前体，例如针对交联和降解使用不同的波长来实现。例如，曙红Y可以用于使用500nm波长在定义的区域处的自由基聚合，之后可以使用380nm的照射来切割交联剂。在其他实施方案中，光笼式水凝胶切割试剂可以包括在聚合物基体壁的形成中。例如，可以使用酸不稳定交联剂(诸如酯等)产生水凝胶，然后可以使用UV光生成局部酸性条件，其进而降解水凝胶。在一些实施方案中，至少一个聚合物基体可以通过以下中的至少一项降解：(i)使至少一个聚合物基体与切割试剂接触；(ii)将至少一个聚合物基体加热至至少90℃；或(iii)将至少一个聚合物基体暴露于切割可光切割交联剂的一定波长的光，可光切割交联剂交联至少一个聚合物基体的聚合物。在一些实施方案中，至少一个聚合物基体包含水凝胶。在一些实施方案中，切割试剂降解水凝胶。在一些实施方案中，切割试剂包括还原剂、氧化剂、酶、基于pH的切割试剂或其组合。在一些实施方案中，切割试剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(3-羟丙基)膦(THP)或其组合。在一些实施方案中，聚合物基体或水凝胶的表面可以通过将官能团偶联至聚合物基体或水凝胶来官能化。官能团的一些非限制性示例可以包括捕获试剂(例如，吡啶甲醛(PCA))、丙烯酰胺、琼脂糖、生物素、链霉亲和素、strep-tag II、接头、包含醛的官能团、磷酸酯、硅酸酯、酯、酸、酰胺、醛二硫戊环、PEG、硫醇、烯烃、炔烃、叠氮化物或其组合。在一些情况下，官能化聚合物基体可以用于捕获在相邻于生物组分(例如，在其周围或在其上)形成的聚合物基体区室内部的生物分子。生物分子可以通过生物组分(例如，来自细胞的分泌组)产生。区室内部的聚合物基体的官能化表面可以用于捕获来自区室外部的试剂或分子。官能化表面可以增加被试剂、分子传感器或任何感兴趣的分子(例如，抗体)覆盖的表面积。
部分降解。在一些实施方案中，现有的聚合物基体壁可以被部分降解，例如以改变孔隙率。在一些实施方案中，聚合物前体可以包含可降解珠子，其在合成时形成聚合物基体壁的一部分并嵌入在其中，之后可以按需或逐渐降解，从而导致孔隙率的增加。
光能合成。在一些实施方案中，在所述流体装置内生成聚合物基体包括将一种或多种聚合物前体暴露于能量源。在一些实施方案中，能量源是光生成装置。在一些实施方案中，光生成装置生成350nm至800nm的光。在一些实施方案中，光生成装置生成350nm至600nm的光。在一些实施方案中，光生成装置生成350nm至450nm的光。在一些实施方案中，光生成装置生成UV光。在一些实施方案中，在所述流体装置内生成聚合物基体使用空间光调制器(SLM)(即，能够在空间上生成所需的光强度图案的空间能量调制元件)进行。在一些实施方案中，SLM是数字微镜装置(DMD)。在一些实施方案中，SLM是使用检流计操纵的激光束。在一些实施方案中，SLM是基于液晶的。
测序、条形码、基因组片段和转录组
寡核苷酸标记、条形码、基因组片段、RNA(包括信使RNA和其他多核苷酸靶标)或核酸分子可以通过本发明方法和系统进行测序。在一些实施方案中，用于此目的的捕获元件或捕获探针包括附接至表面的寡核苷酸，其中此类寡核苷酸包含与待捕获的核酸的序列区段互补的序列区段，其可以是(例如)mRNA或任意序列的polyA区段或与条形码或寡核苷酸标签相邻的“柄”区段。当要进行测序操作时，表面设置有此类捕获元件(诸如寡核苷酸)并且任选地设置有用于被捕获的核酸或其衍生物的表面扩增的表面引物。此类捕获寡核苷酸可以通过本领域已知的许多化学作用附接至第一表面，例如标题为“Strategies forattaching oligonucleotides to solid supports”的Integrated DNA Technologiesbrochure(2014)。测序步骤可以在与裂解的细胞相邻的表面上进行(“原位”测序)，或者模板可以任选地被扩增、从表面释放和洗脱并在外部测序仪器上测序(“外部”测序)。在后一种方法中，捕获元件可以包括提供表面位置信息的空间条形码，并且允许经外部确定的序列与表面上的特定定位(例如各个室的部位)相关联。在一些实施方案中，空间条形码以足够高的密度存在，使得每个室覆盖与一个或多个空间条形码(并且通常是单个空间条形码)独特关联的表面区域。在一些实施方案中，用于测序操作的多核苷酸的制备发生在靶模板(例如寡核苷酸标记、mRNA、基因组片段)被释放并被捕获元件中的互补序列捕获之后。释放步骤取决于靶模板的性质。例如，通过二硫键联附接至抗体的寡核苷酸标记可以通过还原剂(其可以与裂解试剂相同)释放。可以通过用常规裂解试剂处理细胞来释放mRNA。释放基因组片段可能需要裂解和预扩增步骤。裂解条件可能有很大差异，并且可能基于热、洗涤剂、蛋白酶、碱或此类因素的组合的作用。以下参考文献为mRNA和/或基因组DNA的单细胞裂解条件选择裂解试剂或裂解缓冲液提供了指导：Thronhill等人,Prenatal Diagnosis,21:490-497(2001)；Kim等人,Fertility and Sterility,92:814-818(2009)；Spencer等人,ISME Journal,10:427-436(2016)；Tamminen等人,Frontiers Microbiol.Methods,6:article 195(2015)；等等。裂解条件可以包括以下：1)细胞在H2O中，在96℃下持续15min，然后在10℃下持续15min；2)200mM KOH，50mM二硫苏糖醇，加热至65℃持续10min；3)对于4μL基于蛋白酶的裂解缓冲液：1μL 17μM SDS与3μL 125μg/mL蛋白酶K组合，然后在37℃下温育60min，然后在95℃下温育15min(以使蛋白酶K失活)；4)对于10μL基于洗涤剂的裂解缓冲液：2μL H2O，2μL 10mM EDTA，2μL 250mM二硫苏糖醇，2μL 0.5％ N-月桂基肌氨酸盐溶液；5)200mM Tris pH 7.5，20mM EDTA，2％sarcoyl，6％ Ficoll。
在表面上采用空间条形码的实施方案中，可以使用多种方法来生成空间条形码，包括但不限于以下参考文献中描述的方法，这些参考文献以引用的方式并入：Horgan等人,国际专利公开WO2022/013094；Frisen等人,美国专利9593365；Fan等人,美国专利公开US2019/0360121；Chen等人,bioRxiv(https://doi.org/10.1101/2021.01.17.427004)；Cho等人,bioRxiv(https://doi.org/10.1101/2021.01.25.427807)；Quan等人,NatureBiotechnology,29(5):449-453(2011)；Singh-Gasson等人,Nature Biotechnology,17:974-(1999)；等等。
系统和仪器
用于进行实施方案的系统(诸如图2E-2F中所示)采用凝胶屏障作为扩散性改性剂，如图22A中所示。流动池(2200)是流体装置的部件，其在可编程控制下提供一个或多个通道和液体处理部件，以便将珠子和试剂递送至通道。在此图示中，示出了四个通道(2202、2204、2206和2208)，下面示出了通道2(2204)的区段(2210)的放大视图(2212)。在图22A的流动池(2200)的抽象视图中，未示出通道的入口、出口和其他特征部。在通道2(2204)的第一表面(2214)上，多个珠子(例如(2218))各自被水凝胶室(例如(2216))包封。在一些实施方案中，水凝胶室的聚合物基体壁的孔隙率经选择为对珠子是不可渗透的，但对于用于形成空间条形码的试剂是可渗透的。因此，可以通过使试剂流动(2220)通过通道来将试剂引入水凝胶室的内部并且从水凝胶室的内部去除，但珠子保留在内部。通道区段(2210)的下方放大图(2212)示出了用于在通道中珠子的定位处使水凝胶室进行光能合成的光学系统(2221)。本领域普通技术人员将认识到，可以采用具有与图22A和22B的光学系统不同的配置的光学系统来执行这些功能。在一些实施方案中，可以采用一个或多个用于合成水凝胶结构的DMD-物镜子系统以通过同时合成多个结构来提高合成速度。
返回图22A，对于使水凝胶室进行光能合成，光源(2222)生成适当波长的光(例如UV光)的光束(2223)，该光束(2223)穿过适当的光掩模或光束成形或光束指向(Galvo)系统，以便使光束成形，从而在通道中合成所需的结构。在一些实施方案中，采用数字微镜装置(DMD)(2224)，在其他实施方案中，可以采用物理光掩模。室位置、形状和聚合物基体壁厚度至少部分地根据由检测器(2232)收集的图像确定的珠子位置信息来确定。来自DMD(2224)的反射光使用常规光学器件(例如准直光学器件(2228))成形，并且被引导通过物镜系统(2234)进入通道2区段(2210)。物镜(2234)和流动池(2200)在xy方向(2236)上相对于彼此移动，以在任何通道中的任何位置处使室进行光能合成。在一些实施方案中，流动池(2200)移动而光学系统(2221)静止。在一些实施方案中，物镜(2234)还可以将来自光源(2229)的光束(2227)引导到第一表面(2214)上的靶标(诸如细胞)，并且收集来自在第一表面(2214)上进行的测定的光学信号(诸如荧光信号)。替代地，可以用如图22B所示的独立物镜来进行光信号收集。通过检测器(2232)或其在图22B的实施方案中的对应物收集的信息，特别是它们相应通道中的细胞位置，由计算机(2238)和/或辅助控制器用以指导DMD(2224)和控制物镜(2234)和流动池(2200)的相对位置的平移装置，以在适当的定位处合成适当形状和大小的水凝胶室。
图22B示出替代光学系统，其中光学系统的检测部分(2250)独立于光学系统的合成部分(2252)的移动(2268)而移动(2272)。光学系统的检测部分(2250)包括检测器(2256)、物镜(2258)、光源(2260)和互连光学元件，诸如二向色镜(2262)。与图22A的实施方案一样，检测器(2256)在操作上与计算机(2264)和光学系统的合成部分(2252)相关联，以向合成部分(2252)提供珠子位置信息。计算机(2264)和(2238)也在操作上与控制光学系统的物镜的相对位置和流动池的位置的平台和/或电机相关联。在此实施方案中，光学系统的合成部分(2252)位于第一表面(2264)与检测部分(2250)的另一侧。与图22A的实施方案一样，它包括常规部件物镜(2274)、反射镜(2276)、准直光学器件(2280)、DMD(2282)和光源(2278)。
在一些实施方案中，珠子(例如图22A中的(2218))随机布置在第一表面(2214)上。在替代实施方案中，第一表面(2214)可以包括用于捕获珠子的规律间隔的部位或特征部，使得珠子基本上仅布置在第一表面上的此类部位或特征部上。例如，在一些实施方案中，此类部位或特征部可以是点的直线或六边形阵列。
在一些实施方案中，本发明系统包括：(a)通道，其包括第一表面、布置在第一表面上的多个细胞以及一种或多种聚合物前体；(b)空间能量调制元件，其与第一表面光学连通；(c)检测器，其与第一表面光学连通并且与空间能量调制元件可操作地相关联，检测器检测多个细胞中的每个细胞并且确定其在第一表面上的位置；以及(d)多个凝胶室，每个凝胶室包封多个细胞中的单个细胞，其中凝胶室通过使用空间能量调制元件将光投射至通道中，使得经投射的光使一种或多种聚合物前体发生交联以形成室的聚合物基体壁来合成，其中合成的室的位置通过检测器识别的由此包封的细胞的位置来确定。应当理解，如本文所用的术语“检测器”可以包括但不限于：显微镜元件，其收集并任选地放大通道的一部分的图像；和图像分析元件，其包括用于识别细胞、细胞特征部、室和其他物体的软件，以便存储此类信息以及相关联的位置信息。计算机元件使用由检测器生成的此类信息以及用户输入来生成对其他元件(诸如空间能量调制元件)的命令，以执行多种功能，包括但不限于合成室、室的“根据需要”降解、光裂解细胞等等。此类实施方案的配置在上面描述的图22A-22B中示出。在一些实施方案中，流体装置的通道还包括第二表面，其中所述第一表面和第二表面跨通道彼此相对布置，并且其中室的聚合物基体壁从第一表面延伸至第二表面以形成各自都具有内部的室。在一些实施方案中，通道中的室各自包封单个细胞。在一些实施方案中，第一壁和第二壁均由光透射材料(诸如玻璃、塑料等)制成，并且被定位成使得第一表面和第二表面基本上彼此平行。第一表面与第二表面之间的垂直距离可以在10μm至500μm的范围内或在50μm至250μm的范围内。在一些实施方案中，第一表面与第二表面之间的垂直距离可以在待分析的细胞的平均大小的两倍至待分析的细胞的平均大小的五倍的范围内。
在一些实施方案中，第一表面可以包括用于在预先确定的定位处捕获细胞的捕获元件。例如，捕获元件可以包括但不限于对所有细胞或细胞亚群具有特异性的捕获抗体。捕获元件还可包括但不限于非特异性捕获材料，诸如聚赖氨酸、纤连蛋白、经处理的塑料(例如MaxysorbTM塑料、ThermoFisher)等。在一些实施方案中，此类细胞捕获部分(例如，抗体)可以被限制在第一表面上以规则图案排列的点或反应部位；因此，在此类反应部位处捕获的细胞可以以规则图案布置在第一表面上，这对于室合成和/或光学信号检测来说可能比随机布置更有效。有关为表面提供细胞捕获抗体的指南可在以下参考文献中找到：Zhu等人,Analytica Chemica Acta,608:186-196(2008)；Sekine等人,J.Immunol.Methods,313(1-2):96-109(2006)；等等。在一些实施方案中，此类反应部位或点的直径在5-500μm的范围内或在10-1000μm的范围内。在一些实施方案中，此类点或反应部位以直线阵列安置，或以六边形阵列安置。在一些实施方案中，此类点或反应部位的此类阵列的密度的范围为10至2500个部位/mm2、10至1000个部位/mm2、10至500个部位/mm2或10至100个部位/mm2。
使用光能实现聚合的空间能量调制元件可以包括物理光掩模或虚拟光掩模，诸如数字微镜装置(DMD)。以下参考文献以引用的方式并入，提供了在选择和操作实现光聚合凝胶的DMD方面的指导：Chung等人,美国专利10464307；Hribar等人,美国专利10351819；Das等人,美国专利9561622；Huang等人,Biomicrofluidics,5:034109(2011)；等等。
虽然已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅为通过示例的方式提供。本发明并不旨在受本说明书内提供的具体实施例的限制。虽然已经参考上述具体说明描述了本发明，但是对本文中实施方案的描述和说明不意在以限制性意义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到多种变型、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中所述具体的描绘、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种可替选方案可以用于实施本发明。因此，考虑到本发明还应覆盖任何此类可替选方案、修改、变型或等同方案。所附权利要求意在限定本发明的范围并且意在由此覆盖处于这些权利要求的范围内的方法和结构及它们的等同方案。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的刺激、系统和方法的实施方案，并且不意味着以任何方式进行限制。
实施例1
采用本文所述的方法的RNA测序
进行了使用来自RNA转录物的P7或P5衔接文库的实验。RNA转录物由含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒生成。基于pMA-T的质粒含有P5、T7聚合酶启动子、起始密码子、His标签、FLAG标签、GFP序列、TAA终止密码子、T7终止子和P7。RNA转录物可以从启动子序列延伸至T7终止序列。然而，T7终止子不会完全停止转录，因此所得RNA转录物中的一些是His_FLAG_GFP_P7’。用DNA酶处理RNA转录物，以去除DNA，否则其将形成簇。为了检查DNA酶处理的有效性，可以在凝胶上进行反应并进行分析，以证明DNA酶处理对于去除DNA是有效的。
按照模板杂交的标准簇方案，将PhiX DNA文库和DNA酶处理的GFP-P7’RNA转录物杂交至流动池的不同泳道上。例如，泳道1-4可以含有PhiX DNA，而泳道5-8含有GFP RNA。泳道5和6可以含有用DNA酶预处理以去除DNA的RNA。泳道7和8可以是在流动池上用DNA酶预处理并用RNA酶处理的RNA，作为附加的对照。PhiX DNA文库可以经由P5或P7杂交，因为模板中存在这两个序列及其互补序列。相比之下，GFP-P7’RNA模板仅与P7表面引物杂交，因为它们具有互补性并且缺乏P5序列。可以通过使用任何商业逆转录酶(诸如Moloney鼠科动物白血病病毒(MMLV)逆转录酶)来进行第一次延伸。一些泳道可以使用含有转座子序列P5衔接子序列的转座体复合物进行转座。转座事件后留下的DNA序列中的空位可以使用链置换延伸反应来填补。含有GFP_P7’RNA的泳道中需要转座事件以添加P5衔接子，以生成可以形成簇的模板。可以进行等温簇扩增作为标准。
可以对从第一延伸合成的核酸链进行测序以便分析本文所述的生物样品。在一些情况下，可以对从第一次延伸合成的链进行测序以获得转录组数据。在其他情况下，从第一延伸合成的链可以充当第二延伸或第二链合成的模板以生成核酸的第二链。可以对第二链进行测序以获得转录组数据。cDNA分子的第一链、第二链或扩增也可以通过组合的方法获得，其中本文所述的一种或多种方法可以结合使用以获得转录组数据。图9提供此类组合的非限制性示例，其中组合使用图2(在表面上的文库构建)、图3(对表面引物进行3’封闭以便避免不需要的杂交和延伸)、图5(使用TdT以便封闭cDNA的3’末端)和图7(使用外切核酸酶处理以去除不需要的捕获探针)中描述的改进以改进当前可用的测序技术。
实施例2
对获自人的生物样品的RNA测序
可以制备具有多个泳道的流动池，其包含能够与包含polyA尾的RNA分子杂交的引物。例如，泳道1可以用仅包含P5和P7寡核苷酸的标准寡核苷酸(寡核苷酸)混合物接枝，而泳道2-8可以用标准混合物(P5和P7寡核苷酸)加上捕获寡核苷酸(即，包含用于结合包含polyA尾的RNA分子的polyT序列的引物)。引物接枝后，流动池可以储存在4℃下直至使用。在此实施例中，可以制备5pM的PhiX对照文库样品并将泳道1和2添加至流动池中以便杂交。对于泳道3-8中的每个泳道，制备400ng RNA样品并将其添加至流动池中以便杂交。泳道3-6可以含有人RNA，诸如获自对象的生物样品。泳道7和8可以含有通用人参考(UHR)RNA。模板杂交后，可以通过流动池施用洗涤缓冲液以去除未杂交的模板。经杂交的模板可以使用AMV-RT(NEB，Ipswich，Mass.)在所有泳道中延伸，从而产生DNA:RNA复合物。
泳道3-8可以与转座体复合物接触，而泳道1和2仅与等体积的洗涤缓冲液接触。制备了两种不同浓度的转座体复合物混合物。泳道3、5和7的混合物可以用1.25μl转座体复合物、100μl缓冲液和400μl水制备。泳道4、6和8的混合物可以用0.625μl转座体复合物、100μl缓冲液和400μl水制备。将95μl转座体复合物混合物添加至流动池的泳道3-8中以便标签化。为了在标签化后去除转座酶，将离液缓冲液添加至流动池的泳道3-8中并温育2分钟。然后将流动池的泳道洗涤两次。洗涤后，将Bst酶用于对经标签化的DNA:RNA复合物进行链置换延伸，以去除转座子的非转移链，并使DNA:RNA复合物的DNA链为全长以便成簇。去除RNA链，然后使用等温扩增生成簇。然后对簇进行测序。
将测序结果与针对通用人参考RNA的标准RNA测序获得的结果进行比较，后者是根据标准测序方法使用标准测序试剂进行的。结果可以显示使用本文提供的方法测序的RNA样品的正态比对分布。结果可以显示较高的重复掩蔽簇，这可能是由于通过标签化方法所分析的RNA样品的3’UTR区中有较多数量的PolyA序列和较多重复。可用的读数可能比标准RNA测序方案低约10％，这可能还是由于可以分析的RNA中有较多重复。核糖体RNA的量可以如预期的那样低，因为mRNA在本文提供的标签化方法中被分离并测序。线粒体RNA在正常限度内。
虽然前述公开内容已经出于清楚和理解的目的进行详细描述，但是本领域技术人员通过阅读本公开可以清楚地看到，可以在不脱离本公开真实范围的情况下对形式和细节进行各种改变。例如，上文所述的所有技术和装置可以呈各种组合的形式使用。本说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文献都出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文献被单独且独立地指示出于所有目的通过引用并入。
术语和定义
“扩增子”意指多核苷酸扩增反应的产物；即，多核苷酸的克隆群体，其可以是单链的或双链的，其从一个或多个起始序列复制。“扩增”意指通过进行扩增反应来产生扩增子。一个或多个起始序列可以是相同序列的一个或多个拷贝，或者它们可以是不同序列的混合物。在一些实施方案中，扩增子通过扩增单个起始序列来形成，使得扩增子是起始序列的克隆群体。扩增子可以通过多种扩增反应产生，这些反应的产物包含一种或多种起始核酸或靶核酸的复制。在一个方面中，产生扩增子的扩增反应是“模板驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对在模板多核苷酸中具有产生反应产物所需的互补序列。在一个方面中，模板驱动的反应是用核酸聚合酶的引物延伸或用核酸连接酶的寡核苷酸连接。此类反应包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增等，其公开于以下参考文献中，这些参考文献以引用的方式并入本文：Mullis等人,美国专利4,683,195、4,965,188、4,683,202、4,800,159(PCR)；Gelfand等人,美国专利5,210,015(使用“taqman”探针的实时PCR)；Wittwer等人,美国专利6,174,670；Kacian等人,美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi,美国专利5,854,033；Aono等人,日本专利公开JP 4-262799(滚环扩增)；等等。关于扩增反应，“反应混合物”意指含有进行反应所需的所有反应物的溶液，其可以包括但不限于在反应期间将pH维持在选定水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。特别令人感兴趣的是固相扩增技术，其中扩增起始序列以产生表面结合的拷贝，诸如桥式扩增等，例如美国专利6090592、6060288、6787308、9057097、9169513、9476080、9476080；Adessi等人,Nucleic Acids Research,28(20):e87(2000)；等等；其以引用的方式并入本文。
“条形码”意指分子标记或标识符。在一些实施方案中，条形码是附接至分析物的分子或者是分析物的区段(例如，在多核苷酸条形码和多核苷酸分析物的情况下)，其可以用于鉴定分析物。在一些实施方案中，条形码(本文中称为“空间条形码”)可以附接至表面以鉴定表面上的定位。在一些实施方案中，相同空间条形码的群体可以布置在表面上的特定区域内。在一些实施方案中，不同的空间条形码与表面上的不同区域之间可以存在一一对应的关系；即，每个不同的区域都有不同且独特的条形码。在一些实施方案中，空间条形码的身份是可确定的，例如，只要空间条形码是多核苷酸，就可以通过测序来确定。在一些实施方案中，空间条形码是寡核苷酸。在一些实施方案中，条形码包含随机序列寡核苷酸。随机序列寡核苷酸通常通过“分合(split and mix)”合成技术来合成，例如，如以下参考文献中所描述的，这些参考文献以引用的方式并入本文：Church,美国专利4942124；Godron等人,国际专利公开WO2020/120442；Seelig等人,美国专利公开2016/0138086；等等。有时，随机寡核苷酸表示为“NNN……N”。在一些实施方案中，术语“条形码”包括复合条形码；即，包含鉴定不同对象的子区段的寡核苷酸区段。例如，复合条形码的第一区段可以识别表面的特定区域，并且复合物条形码的第二区段可以鉴定特定分子(所谓的“独特分子标识符”或UMI)。
“细胞”是指可以通过本发明的方法和系统测定的生物细胞，包括但不限于脊椎动物细胞、非脊椎动物细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、微生物细胞、原生动物细胞、原核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或真菌细胞。在一些实施方案中，通过本发明方法和系统测定哺乳动物细胞。具体地，可以通过本发明方法和系统来分析可以或已经被基因改变以在医学、工业、环境或治疗过程中使用的任何哺乳动物细胞。在一些实施方案中，如本文所用的“细胞”包括经基因修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，“细胞”包括干细胞。在一些实施方案中，“细胞”是指通过CRISPR Cas9技术修饰的细胞。在一些实施方案中，“细胞”是指免疫系统的细胞，包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、天然杀伤细胞、抗原呈递细胞或树突细胞。特别令人感兴趣的是针对治疗应用(诸如癌症疗法)工程化的细胞毒性T淋巴细胞。
“簇”意指通过表面扩增技术(诸如桥式PCR)扩增的单个多核苷酸的扩增子或克隆群体。在一些实施方案中，术语“簇”包括通过滚环扩增产生的扩增子。
“水凝胶”意指包含经交联的亲水性聚合物网络的凝胶，其能够吸收并保留大量水(例如，60％至90％的水，或70％至80％)，而不会由于聚合物链之间的物理或化学键(其可以是共价键、离子键或氢键)的建立而溶解。水凝胶对氧气和营养物质表现出高渗透性，使它们成为细胞封装和培养应用中有吸引力的材料。水凝胶可以包含天然或合成聚合物并且可以是可逆的(即可降解的或可解聚的)或不可逆的。合成水凝胶聚合物可以包括聚乙二醇(PEG)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)和聚(乙烯醇)。天然水凝胶聚合物包括藻酸酯、透明质酸和胶原。以下参考文献描述了水凝胶及其生物医学用途：Drury等人,Biomaterials,24:4337-4351(2003)；Garagorri等人,Acta Biomatter,4(5):1139-1147(2008)；Caliari等人,Nature Methods,13(5):405-414(2016)；Bowman等人,美国专利9631092；Koh等人,Langmuir,18(7):2459-2462(2002)。
术语“根据需要”意指可以针对单独的、离散的、选定的定位(例如，聚合物前体溶液的空间定位；或选定的聚合物基体室)的操作。此类选择可以基于对检测器收集的光信号或数据的手动观察，或者此类选择可以基于对检测器收集的光信号或数据进行操作的计算机算法。对检测器收集的光信号或数据的手动观察可以包括实时检测或在调制单位能量以聚合聚合物前体或降解室之前的某个时间段的检测。例如，室的子集(全部用可光降解的聚合物基体壁形成)可以基于位置信息和来自在室中进行的分析测定的光信号的值进行预选，以用于释放和去除其内容物。预选的室可以通过选择性投射适当波长特征的光束(例如，用空间能量调制元件)以降解预选的室的聚合物基体壁来光降解。在另一示例中，可以实时观察(例如经由荧光显微镜)多个室以便检测感兴趣的分析物，并且在检测感兴趣的分析物之后实时选择多个室中的一个或多个室以用于降解。
“物理光掩模”通常指具有多个开孔或孔穴的物理结构，可以通过它们投射光。物理光掩模可用于通过使聚合物前体溶液聚合并形成对应于光掩模上的图案的三维结构来产生如本文所述的水凝胶基体。物理光掩模可以用特定的布局或几何图案进行图案化。物理光掩模可以黏附至流动池的上表面。
“聚合酶链反应”或“PCR”意指通过DNA互补链的同时引物延伸来对特定DNA序列进行体外扩增的反应。换言之，PCR是一种用于制备侧翼有引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制的反应，此类反应包括以下步骤的一次或多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)将引物与引物结合位点退火，以及(iii)在核苷三磷酸存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，反应在热循环仪中通过针对每个步骤优化的不同温度进行循环。具体的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，例如以下参考文献中所例示的：McPherson等人编辑,PCR:A Practical Approach和PCR2:A PracticalApproach(IRL Press，Oxford，分别为1991年和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可以在>90℃的温度下变性，引物在50-75℃范围内的温度下退火，并且引物在72-78℃范围内的温度下延伸。术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、桥式PCR等。反应体积的范围为几百纳升(例如200nL)至几百微升(例如200μL)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意指在逆转录反应之前进行的PCR，逆转录反应将靶RNA转化为互补的单链DNA，然后将其扩增，例如Tecott等人,美国专利5,168,038，该专利以引用的方式并入本文。“实时PCR”或“定量PCR”意指随着反应进行而监测反应产物(即扩增子)的量的PCR。实时PCR有多种形式，主要区别在于用于监测反应产物的检测化学物质，例如Gelfand等人,美国专利5,210,015(“taqman”)；Wittwer等人,美国专利6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi等人,美国专利5,925,517(分子信标)；这些专利以引用方式并入本文。用于实时PCR的检测化学物质在Mackay等人,Nucleic AcidsResearch,30:1292-1305(2002)中综述，其也以引用方式并入本文。
“聚合物基体”通常指包含至少一种聚合物的相物质(例如连续相物质)。在一些实施方案中，聚合物基体是指至少一种聚合物以及未被聚合物占据的间隙空间。聚合物基体可以由一种或多种类型的聚合物构成。聚合物基体可以包含直链、支链和交联的聚合物单元。聚合物基体还可以包含插入其未被聚合物链占据的间隙空间内的非聚合物物种。插入的物种可以是固体、液体或气体物种。例如，术语“聚合物基体”可以涵盖干燥水凝胶、水合水凝胶和含有玻璃纤维的水凝胶。聚合物基体可以包含聚合物前体，其通常指在激活时可以触发或引发聚合反应的一种或多种分子。聚合物前体可以通过电化学能量、光化学能量、光子、磁能量或任何其他合适的能量来激活。如本文所用，术语“聚合物前体”包括单体(其被聚合以产生聚合物基体)和交联化合物，其可以包括光引发剂、生成聚合物基体(尤其是水凝胶的聚合物基体)所必需或有用的其他化合物等。
“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且各自意指核苷酸单体的线性聚合物。组成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的规则模式特异性结合天然多核苷酸，诸如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型的碱基配对等等。此类单体及其核苷间键联可以是天然存在的或者可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸酯核苷间键联、含有允许附接标记(诸如荧光团)或半抗原的连接基团的碱基等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶促处理，诸如通过聚合酶的延伸、通过连接酶的连接等等时，普通技术人员将理解在这些情况下的寡核苷酸或多核苷酸将不含有核苷间键联的某些类似物，糖部分或任意或某些位置的碱基。多核苷酸的大小范围通常为几个单体单元例如5-40个(当它们通常被称为“寡核苷酸”时)至几千个单体单元。除非另有说明或从上下文中显而易见，否则每当多核苷酸或寡核苷酸由字母序列(大写或小写)表示时，诸如“ATGCCTG”，应理解核苷酸是从左到右按5’→3’顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有说明，否则术语和原子编号约定将遵循Strachan和Read,Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss,New York,1999)中公开的那些。通常，多核苷酸包含通过磷酸二酯键联连接的四种天然核苷(例如，DNA的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或RNA的它们的核糖对应物)；然而，它们还可以包含非天然核苷酸类似物，例如包括经修饰的碱基、糖或核苷间键联。本领域技术人员清楚，当酶具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物活性要求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则针对寡核苷酸或多核苷酸底物选择适当的组成在本领域技术人员的知识范围内，尤其是在论文(诸如Sambrook等人,Molecular Cloning,Second Edition(Cold SpringHarbor Laboratory,New York,1989))及类似参考文献的指导的情况下。
“引物”意指这样的天然或合成寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体后能够充当核酸合成的起始点并沿着模板从其3’末端延伸，使得形成经延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶，诸如DNA或RNA聚合酶来进行。延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常引物通过DNA聚合酶延伸。引物的长度通常在14至40个核苷酸的范围内或在18至36个核苷酸的范围内。将引物用于多种核酸扩增反应，例如，使用单个引物的线性扩增反应或使用两个或更多个引物的聚合酶链反应。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员众所周知的，如通过以下参考文献所证明，该参考文献以引用的方式并入：Dieffenbach编辑,PCR Primer:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press,New York,2003)。
使用绝对或顺序术语，例如“将”、“将不”、“应”、“不应”、“必须”、“不得”、“首先”、“最初”、“接下来”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”并不意味着限制本文公开的本发明实施方案的范围，而仅作为示例。
如本文所用，单数形式“一”、“一个/种”和“所述/该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指出。此外，在术语“包括”、“具有”、“带有”或其变体在具体实施方式和/或权利要求书中使用的程度上，此类术语旨在以与术语“包含”相似的方式是包含性的。
如本文所用，短语“至少一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“和/或”是开放式表达，其在操作中是连接词和转折词。例如，表达“A、B和C中的至少一个(种)”、“A、B或C中的至少一个(种)”、“A、B和C中的一个(种)或多个(种)”、“A、B或C中的一个(种)或多个(种)”和“A、B和/或C”意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起或A、B和C一起。
如本文所用，“或”可以指“和”、“或”或“和/或”并且可以排他地或包含地使用。例如，术语“A或B”可以指“A或B”、“A但没有B”、“B但没有A”以及“A和B”。在一些情况下，上下文可能决定特定的含义。
本文所述的任何系统、方法、软件和平台都是模块化的。因此，诸如“第一”和“第二”的术语不一定暗指优先级、重要性顺序或行为顺序。
当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所提及的数字或数值范围是在实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，并且该数字或数值范围可以从例如所陈述的数字或数值范围的1％至15％变化。在示例中，术语“约”是指所陈述的数字或值的±10％。
术语“增加的”或“增加”在本文通常用于意指统计显著量的增加。在一些方面中，术语“增加的”或“增加”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平、标准或对照相比至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％的增加或至多并包括100％的增加或10-100％之间的任何增加。“增加”的其他示例包括与参考水平相比为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多的增加。
术语“减少的”或“减少”在本文种通常用于意指统计显著量的减少。在一些方面中，“减少的”或“减少”意指与参考水平相比至少10％的减少，例如与参考水平相比至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％的减少或至多并包括100％的减少(例如与参考水平相比的不存在水平或不可检测的水平)或10-100％之间的任何减少。在标志物或症状的上下文中，这些术语意指这种水平的统计显著的降低。降低可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选降低至对于没有给定疾病的个体的正常范围内可接受的水平。
DNA:RNA双链体可以指被捕获的RNA和从被捕获的RNA逆转录互补的DNA(cDNA)时形成的复合物。在一些情况下，DNA:RNA双链体的RNA可以变性或洗掉，并且cDNA可以进行第二链合成反应以生成双链DNA(dsDNA)。
转座子或转座酶可以指具有几乎任意移动定位(易位)能力的小核苷酸序列。
如本文所用的术语“样品”通常指含有生物组分的化学或生物样品。生物组分可以包括细胞、核酸、微生物组、蛋白质、细胞组合、代谢物、其组合或生物样品的任何其他合适的组分。例如，样品可以是包含一个或多个细胞的生物样品。又例如，样品可以是包含一个或多个核酸的生物样品。生物样品可以获自(例如，提取或分离)或包括血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、唾液、黏膜排泄物、痰、粪便和泪液。生物样品可以是流体或组织样品(例如，皮肤样品)。在一些情况下，样品可以来源于匀化的组织样品(例如，脑匀浆、肝匀浆或肾匀浆)。在某些实施方案中，样品可以包括特定类型的细胞(例如，神经元细胞、肌肉细胞、肝细胞或肾细胞)。样品可以包含或获自患病细胞或组织(例如，肿瘤细胞或坏死细胞)。在一些实施方案中，样品可以包含或可以来自疾病相关内含物(例如，斑块、生物膜、肿瘤或非癌性赘生物)。在某些实施方案中，样品可以包括或可获自无细胞体液，诸如全血、唾液或尿液。在各种实施方案中，样品可以包括循环肿瘤细胞。在一些情况下，样品可以包括或可以是环境样品(例如，土壤、废物或环境空气)、工业样品(例如，来自任何工业过程的样品)或食品样品(例如，乳制品、蔬菜产品或肉制品)。可以在加载至微流体装置中之前对样品进行处理。例如，可以处理样品以纯化某种细胞类型或核酸和/或包含试剂。
如本文所用，“标签化”是指通过转座体复合物对DNA的修饰，转座体复合物包含与包含转座子末端序列的衔接子复合的转座酶。标签化导致DNA的同时片段化，并将衔接子连接至双链体片段的两条链的5’末端。在去除转座酶的纯化步骤之后，可以例如通过PCR、连接或任何其他合适的方法将额外的序列添加至经衔接的片段的末端。“转座体”至少包含转座酶和转座酶识别位点。在一些称为“转座体”的此类系统中，转座酶可以与能够催化转座反应的转座子识别位点形成功能复合物。转座酶或整合酶可以结合转座酶识别位点并将转座酶识别位点在有时称为“标签化”的过程中插入至靶核酸中。在一些此类插入事件中，转座酶识别位点的一条链可以转移到靶核酸中。在标准样品制备方法中，每个模板在插入物的任一末端都含有衔接子，并且通常需要许多步骤来修饰DNA或RNA并纯化修饰反应的所需产物。这些步骤在溶液中进行，之后将经衔接的片段添加至流动池中，在流动池中，它们通过引物延伸反应偶联到表面，引物延伸反应将经杂交的片段复制到共价连接到表面的引物末端。
虽然已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅为通过示例的方式提供。本发明并不旨在受本说明书内提供的具体实施例的限制。虽然已经参考上述具体说明描述了本发明，但是对本文中实施方案的描述和说明不意在以限制性意义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到多种变型、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中所述具体的描绘、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种可替选方案可以用于实施本发明。因此，考虑到本发明还应覆盖任何此类可替选方案、修改、变型或等同方案。所附权利要求意在限定本发明的范围并且意在由此覆盖处于这些权利要求的范围内的方法和结构及它们的等同方案。
Claims (173)
1.一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，所述方法包括：
(a)提供固体支持物，其中所述固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；
(b)使所述一个或多个核酸分子捕获探针与所述一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；
(c)从所述被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中所述cDNA分子与所述多个表面引物探针中的表面引物探针偶联；
(d)将衔接子插入在所述cDNA分子或其衍生物的3’区处；以及
(e)扩增所述cDNA分子或其衍生物以生成所述cDNA分子或其衍生物集，其中所述cDNA分子或其衍生物集与所述多个表面引物探针中的表面引物探针偶联。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接子包含被配置成允许在所述cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述cDNA分子或其衍生物集包含所述衔接子。
4.如权利要求1所述的方法，其包括在(b)之后，使所述固体支持物与被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针的所述子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。
6.如权利要求4所述的方法，其中被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少所述子集失活的所述部分包含外切核酸酶。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述合成包括进行包括所述cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。
8.如权利要求1所述的方法，其包括在(d)之前，扩增所述cDNA分子或其衍生物。
9.如权利要求7所述的方法，其中在(d)之前的所述扩增包含溶液中的引物序列。
10.如权利要求1所述的方法，其包括在(d)之前，片段化所述cDNA分子或其衍生物。
11.如权利要求1所述的方法，其中(d)包括单链连接、标签化或双链连接。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，所述封闭剂封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集上的延伸反应。
13.如权利要求12所述的方法，其包括在(e)之前，使所述封闭剂经历解封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集的反应，以允许所述延伸反应。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括包含与所述多个表面引物探针的至少所述子集至少部分互补的序列的核酸分子、可逆终止子核苷酸、聚合酶、其任何衍生物或其任何组合。
16.如权利要求1所述的方法，其包括在(e)之后，切割或线性化所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。
17.如权利要求1所述的方法，在(e)之后，封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与包含与所述DNA分子集的所述子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。
21.如权利要求1所述的方法，其包括在所述固体支持物上对所述cDNA分子或其衍生物的所述至少所述子集进行原位测序。
22.如权利要求1所述的方法，其包括将所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从所述固体支持物上洗脱下来。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述DNA是经片段化的单链DNA。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。
26.如权利要求1所述的方法，其中被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的所述序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与所述一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物是孔、珠子或流体通道。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述流体通道是流动池。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物不是珠子。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增包括固体支持的扩增。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述固体支持的扩增是桥式扩增。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。
34.如权利要求1所述的方法，其中(a)-(e)中的任一项或其任何组合发生在凝胶基体中，其中所述凝胶基体与所述固体支持物相邻。
35.一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，所述方法包括：
(a)提供固体支持物，其中所述固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针；
(b)使所述一个或多个核酸分子捕获探针与所述一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；
(c)从所述被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中所述合成包括进行逆转录；
(d)首先扩增所述cDNA分子或其衍生物以生成经扩增的cDNA群体；
(e)将衔接子插入在所述经扩增的cDNA分子或其衍生物的3’区处，从而生成带标签的经扩增的cDNA群体；以及
(f)对所述带标签的经扩增的cDNA群体进行固相支持的扩增以生成所述cDNA分子或其衍生物集。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述固体支持物包含多个表面引物探针。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述cDNA分子或所述其衍生物、所述经扩增的cDNA群体、所述带标签的经扩增的cDNA群体、所述cDNA分子或其衍生物集或其任何组合与所述多个表面引物探针偶联。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述衔接子包含被配置成允许在所述cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。
39.如权利要求35所述的方法，其中所述cDNA分子或其衍生物集包含所述衔接子。
40.如权利要求35所述的方法，其包括在(b)之后，使所述固体支持物与被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针的所述子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。
42.如权利要求40所述的方法，其中被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少所述子集失活的所述部分包含外切核酸酶。
43.如权利要求35所述的方法，其中所述合成包括进行包括所述cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述一个或多个第二链合成反应包括随机引物法。
46.如权利要求35所述的方法，其包括在(e)之前，片段化所述经扩增的cDNA分子。
47.如权利要求35所述的方法，其中(e)包括单链连接、标签化或双链连接。
48.如权利要求36所述的方法，其中所述多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，所述封闭剂封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集上的延伸反应。
49.如权利要求48所述的方法，其包括在(d)之前，使所述封闭剂经历解封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集的反应，以允许所述延伸反应。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括包含与所述多个表面引物探针的至少所述子集互补的序列的核酸分子。
52.如权利要求35所述的方法，其包括在(f)之后，切割或线性化所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。
53.如权利要求35所述的方法，在(f)之后，封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与包含与所述DNA分子集的所述子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。
57.如权利要求35所述的方法，其包括在所述固体支持物上对所述cDNA分子或其衍生物的所述至少所述子集进行原位测序。
58.如权利要求35所述的方法，其包括将所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从所述固体支持物上洗脱下来。
59.如权利要求35所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述DNA是经片段化的单链DNA。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。
62.如权利要求35所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的序列。
63.如权利要求62所述的方法，其中被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的所述序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与所述一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。
64.如权利要求35所述的方法，其中所述固体支持物是孔、珠子或流体通道。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述流体通道是流动池。
66.如权利要求35所述的方法，其中所述固体支持物不是珠子。
67.如权利要求35所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。
68.如权利要求35所述的方法，其中所述首先扩增包括固体支持的扩增。
69.如权利要求35所述的方法，其中所述首先扩增包含溶液中的引物序列。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述固体支持的扩增是桥式扩增。
71.如权利要求35所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。
72.如权利要求35所述的方法，其中(a)-(f)中的任一项或其任何组合发生在凝胶基体中，其中所述凝胶基体与所述固体支持物相邻。
73.一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，所述方法包括：
(a)提供固体支持物，其中所述固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中所述多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分；
(b)使所述一个或多个核酸分子捕获探针与所述一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；
(c)从所述被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中所述合成包括进行逆转录；
(d)将衔接子插入在所述cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及
(e)扩增所述cDNA分子或其衍生物以生成所述cDNA分子或其衍生物集。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述合成包括进行包括所述cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述一个或多个第二链合成反应通过包含所述模板转换部分的所述多个表面引物探针的所述子集介导。
76.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。
77.如权利要求73所述的方法，其中所述cDNA分子或所述其衍生物、所述cDNA分子或其衍生物集或两者与所述多个表面引物探针偶联。
78.如权利要求73所述的方法，其中所述衔接子包含被配置成允许在所述cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。
79.如权利要求73所述的方法，其中所述cDNA分子或其衍生物集包含所述衔接子。
80.如权利要求73所述的方法，其包括在(b)之后，使所述固体支持物与被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针的所述子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。
82.如权利要求80所述的方法，其中被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少所述子集失活的所述部分包含外切核酸酶。
83.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括在(d)之前，扩增所述cDNA分子或其衍生物。
84.如权利要求73所述的方法，其中在(d)之前的所述扩增包含溶液中的引物序列。
85.如权利要求73所述的方法，其包括在(d)之前，片段化所述cDNA分子。
86.如权利要求73所述的方法，其中(d)包括单链连接、标签化或连接。
87.如权利要求73所述的方法，其中所述多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，所述封闭剂封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集上的延伸反应。
88.如权利要求87所述的方法，其包括在(e)之前，使所述封闭剂经历解封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集的反应，以允许所述延伸反应。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。
90.如权利要求87所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括包含与所述多个表面引物探针的至少所述子集互补的序列的核酸分子。
91.如权利要求73所述的方法，其包括在(e)之后，切割或线性化所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。
92.如权利要求73所述的方法，在(e)之后，封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。
94.如权利要求92所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与包含与所述DNA分子集的所述子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。
95.如权利要求92所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。
96.如权利要求73所述的方法，其包括在所述固体支持物上对所述cDNA分子或其衍生物的所述至少所述子集进行原位测序。
97.如权利要求73所述的方法，其包括将所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从所述固体支持物上洗脱下来。
98.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述DNA是经片段化的单链DNA。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。
101.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的序列。
102.如权利要求101所述的方法，其中被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的所述序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与所述一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。
103.如权利要求73所述的方法，其中所述固体支持物是流体通道。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述流体通道是流动池。
105.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。
106.如权利要求73所述的方法，其中所述扩增包括固体支持的扩增。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述固体支持的扩增是桥式扩增。
108.如权利要求73所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。
109.如权利要求73所述的方法，其中(a)-(f)中的任一项或其任何组合发生在凝胶基体中，其中所述凝胶基体与所述固体支持物相邻。
110.一种固体支持物，其包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针，其中所述多个表面引物探针的至少一个子集包含模板转换部分。
111.如权利要求110所述的固体支持物，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与一个或多个核酸分子偶联的序列。
112.如权利要求111所述的固体支持物，其中被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的所述序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与所述一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。
113.如权利要求110所述的固体支持物，其中所述固体支持物是孔、珠子或流体通道。
114.如权利要求110所述的固体支持物，其中所述流体通道是流动池。
115.如权利要求110所述的固体支持物，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。
116.如权利要求110所述的固体支持物，其中所述一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。
117.如权利要求116所述的固体支持物，其中所述DNA是经片段化的单链DNA。
118.如权利要求117所述的固体支持物，其中所述RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。
119.如权利要求110所述的固体支持物，其中所述固体支持物包含凝胶基体，其中所述凝胶基体与所述固体支持物相邻。
120.一种用于从一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，所述方法包括：
(a)提供固体支持物，其中所述固体支持物包含一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针；
(b)使所述一个或多个核酸分子捕获探针与所述一个或多个核酸分子接触以产生一个或多个被捕获的核酸分子；
(c)从所述被捕获的核酸分子或衍生物合成cDNA分子，其中所述合成包括进行逆转录，并且其中所述cDNA分子与所述多个表面引物探针中的表面引物探针偶联；
(d)将衔接子插入在所述cDNA分子或其衍生物的3’末端处；以及
(e)扩增所述cDNA分子或其衍生物以生成所述cDNA分子或其衍生物集，其中所述cDNA分子或其衍生物集与所述多个表面引物探针中的表面引物探针偶联。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述衔接子包含被配置成允许在所述cDNA分子或其衍生物集的cDNA分子上起始测序反应的序列。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述cDNA分子或其衍生物集包含所述衔接子。
123.如权利要求120所述的方法，其包括在(b)之后，使所述固体支持物与被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少一个子集失活的部分接触。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针的所述子集包含一个或多个不捕获核酸分子的核酸分子捕获探针。
125.如权利要求123所述的方法，其中被配置成使所述一个或多个核酸分子捕获探针的至少所述子集失活的所述部分包含外切核酸酶。
126.如权利要求120所述的方法，其中所述合成包括进行包括所述cDNA分子或其衍生物的一个或多个第二链合成反应。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述一个或多个第二链合成反应包括模板转换延伸。
128.如权利要求126所述的方法，其中所述一个或多个第二链合成反应包括随机引物法。
129.如权利要求120所述的方法，其包括在(d)之前，扩增所述cDNA分子或其衍生物。
130.如权利要求120所述的方法，其中在(d)之前的所述扩增包含溶液中的引物序列。
131.如权利要求120所述的方法，其包括在(d)之前，片段化所述cDNA分子。
132.如权利要求120所述的方法，其中(d)包括单链连接、标签化或连接。
133.如权利要求120所述的方法，其中所述多个表面引物探针的至少一个子集包含封闭剂，所述封闭剂封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集上的延伸反应。
134.如权利要求133所述的方法，其包括在(e)之前，使所述封闭剂经历解封闭所述多个表面引物探针的所述至少所述子集的反应，以允许所述延伸反应。
135.如权利要求133所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括一种或多种3’磷酸核苷酸。
136.如权利要求133所述的方法，其中所述一种或多种封闭剂包括包含与所述多个表面引物探针的至少所述子集互补的序列的核酸分子。
137.如权利要求120所述的方法，其包括在(e)之后，切割或线性化所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集。
138.如权利要求120所述的方法，在(e)之后，封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)接触。
140.如权利要求138所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与包含与所述DNA分子集的所述子集的3’末端互补的序列的寡核苷酸接触。
141.如权利要求138所述的方法，其中所述封闭所述DNA分子或其衍生物集的所述子集的3’末端包括使所述DNA分子或其衍生物集的所述子集与阳离子-中性二嵌段多肽共聚物接触。
142.如权利要求120所述的方法，其包括在所述固体支持物上对所述cDNA分子或其衍生物的所述至少所述子集进行原位测序。
143.如权利要求120所述的方法，其包括将所述cDNA分子或其衍生物集的至少一个子集从所述固体支持物上洗脱下来。
144.如权利要求120所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子包括DNA或核糖核酸(RNA)分子。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述DNA是经片段化的单链DNA。
146.如权利要求144所述的方法，其中所述RNA分子包括信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)。
147.如权利要求120所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的序列。
148.如权利要求147所述的方法，其中被配置成与所述一个或多个核酸分子偶联的所述序列包括poly-T序列、随机寡核苷酸、与所述一个或多个核酸分子的至少一个子集互补的序列或其任何组合。
149.如权利要求120所述的方法，其中所述固体支持物是孔、珠子、凝胶基体或流体通道。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述流体通道是流动池。
151.如权利要求120所述的方法，其中所述固体支持物不是珠子。
152.如权利要求120所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子捕获探针包含一个或多个标签，其中标签包含细胞特异性或空间定位特异性标识符序列并且任选地包含独特分子标识符(UMI)序列。
153.如权利要求120所述的方法，其中所述扩增包括固体支持的扩增。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述固体支持的扩增是桥式扩增。
155.如权利要求120所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子来源于单个细胞或生物组织。
156.如权利要求120所述的方法，其中(a)-(e)中的任一项或其任何组合发生在凝胶基体中，其中所述凝胶基体与所述固体支持物相邻。
157.一种用于从来自多个细胞的一个或多个核酸分子制备互补的脱氧核酸(cDNA)分子或其衍生物集的方法，所述方法包括：
(a)提供固体支持物，所述固体支持物包括表面，所述表面包含附接至其的一个或多个核酸分子捕获探针和多个表面引物探针并且包含布置在其上的多个细胞；
(b)使所述表面的独立区域与不同细胞的所述一个或多个核酸分子接触，以在每个所述独立区域中产生一个或多个被捕获的核酸分子，其中不同独立区域中的核酸分子来自不同细胞；以及
(c)从所述被捕获的核酸分子或其衍生物合成cDNA分子，其中每个所述cDNA分子与所述固体支持物的所述表面偶联，并且与不同独立区域偶联的cDNA来自不同细胞。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述接触包括用裂解试剂处理所述多个细胞中的所述不同细胞，以从所述多个细胞中的所述不同细胞释放所述一个或多个核酸分子。
159.如权利要求157所述的方法，其还包括扩增所述cDNA分子或其衍生物以生成cDNA分子或其衍生物的多个扩增子集。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述多个细胞的转录组通过对所述扩增子的所述cDNA分子进行测序来确定。
161.如权利要求160所述的方法，其中附接至所述表面的所述cDNA分子包含编码所述表面上的位置的空间条形码，并且所述方法还包括在所述测序之前将所述cDNA分子从所述表面上洗脱下来。
162.如权利要求157所述的方法，其中所述接触所述一个或多个核酸分子是在降低所述一个或多个核酸分子的扩散性的扩散性改性剂的存在下进行的。
163.如权利要求162所述的方法，其中所述表面包括封装布置在其上的所述细胞的凝胶层，或者其中布置在所述表面上的每个所述细胞被独立凝胶体封装。
164.如权利要求162所述的方法，其中布置在所述表面上的每个所述细胞被水凝胶室包封。
165.如权利要求164所述的方法，其中所述水凝胶室包括内部区域，并且其中所述接触还包括在预先确定的温度下温育所述被释放的一个或多个核酸分子，使得被捕获的一个或多个核酸分子被释放并且在所述内部区域内被捕获探针重新捕获。
166.如权利要求165所述的方法，其中选择所述水凝胶室的所述内部区域，使得所述经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离为至少0.25μm。
167.如权利要求165所述的方法，其中选择所述水凝胶室的所述内部区域，使得所述经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离为至少1μm。
168.如权利要求165所述的方法，其中选择所述水凝胶室的所述内部区域，使得所述经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离为至少2μm。
169.如权利要求165所述的方法，其中所述经偶联的cDNA分子的预期最近邻距离的范围为0.5μm至5μm。
170.一种水凝胶室，其布置在表面上，其中所述水凝胶室包括内部区域，所述内部区域包括来自单个细胞的核酸分子的均匀的分布。
171.如权利要求170所述的水凝胶室，其中所述核酸分子是mRNA分子。
172.如权利要求170所述的水凝胶室，其中所述均匀的分布是所述核酸分子之间的预期最近邻距离为1μm或更大的泊松分布。
173.如权利要求170所述的水凝胶室，其中所述核酸分子的所述均匀的分布基本上是泊松分布。
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