CN117813085A - 伊贝扎波尔司他用于促进微生物组健康的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用伊贝扎波尔司他来增加肠道微生物组的健康的方法。本发明提供了同时治疗艰难梭菌感染且同时降低艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发的方法。本发明还提供了通过增加肠道中的放线菌门和/或厚壁菌门的数量来增加肠道微生物组的健康的方法。

Description

伊贝扎波尔司他用于促进微生物组健康的用途

本文所提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入，其程度就如同明确且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入。

本发明涉及使用伊贝扎波尔司他(ibezapolstat)来增加肠道微生物组的健康的方法。本发明提供了同时治疗艰难梭菌(Clostridioides difficile(C.difficile)，以前称为艰难梭菌(Clostridium difficile))感染(CDI)，同时降低艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发的方法。本发明还提供了通过增加肠道中的放线菌门(Actinobacteria)和/或厚壁菌门(Firmicutes)的数量来增加肠道微生物组的健康的方法。

背景技术

身体的粘膜表面含有复杂而专门的微生物群落，通常被称为微生物组或微生物群。(穆什BH(Mullish BH)等人前线胃肠病学(Frontline Gastroenterology)2021；12:118–127)。据估计，人胃肠道的微生物群或微生物组由至多100万亿个微生物组成，其中大多数存在于大肠中。(卡里曼都(Kachrimanidou),微生物(Microorganisms)2020,8,200)。虽然胃肠道微生物组是多样的，但在健康成人中，其主要由两个主要门的细菌组成，厚壁菌门(革兰氏阳性(Gram-positive)孢子形成生物体)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(革兰氏阴性(Gram-negative)非孢子形成生物体)。这两个门通常包括大约90％的微生物组。(穆什BH等人前线胃肠病学2021；12:118–127)。

除了厚壁菌门和拟杆菌门外，肠道微生物组还由放线菌门、梭杆菌门(Fusobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和变形菌门(Proteobacteria)组成。(穆什)。变形菌门由革兰氏阴性兼性厌氧菌组成，并且虽然变形菌门的一些成员是健康肠道的一部分，但此门也包括常见的革兰氏阴性致病菌，如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)和大肠杆菌(Escherichia coli)。(穆什)。并且越来越多量的数据表明变形菌门可能是疾病的微生物特征。(里扎蒂,L.R.(Rizzatti,L.R.)等人,“变形菌门：人疾病中的常见因素(Proteobacteria:A Common Factor in Human Diseases)”,国际生物医学研究(BioMed Research International),第2017卷,文章ID 9351507,第7页,2017。https://doi.org/10.1155/2017/9351507)。放线菌门在儿童中占很大比例，并且总体比例通常随着年龄的增长而下降(被厚壁菌门和放线菌门取代)。出生时，如大肠杆菌、葡萄球菌(Staphylococcus)和链球菌(Streptococcus)等兼性厌氧物种会在婴儿肠道定植，并且在出生后的前几天产生厌氧环境，使拟杆菌属(Bacteroides)(拟杆菌门)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)(放线菌门)等严格厌氧菌能够茁壮成长。(米勒(Mueller)等人,分子医学趋势(Trends in Molecular Medicine),2015年2月,第21卷,第2期)。在婴儿出生的第一年，并且通过婴儿暴露在环境和母乳或配方奶粉中，肠道微生物组进化为成熟的生物群落，接近成人肠道微生物组。(让济(Jangi)和拉蒙特(Lamont),JPGN,第51卷,第1期,2010年7月)。

肠道微生物组是复杂的，并且与宿主有着互惠互利的关系。通过这种关系，微生物组为宿主提供了许多好处，包含塑造肠道和全身免疫系统，维持健康的肠道上皮，从食物中获取能量和抵御病原体。(穆什)。当微生物组的组成从其正常多样性改变时，这些有益的生理功能就会被破坏。这就是所谓的生态失调。(穆什)。当肠道微生物组处于生态失调状态时，微生物组的有益微生物(共生体)较少，并且潜在有害微生物(致病共生菌)较多。(穆什)。

除了以上段落中描述的益处外，肠道细菌还通过两组酶的活性代谢缀合的胆汁酸。

第一组，胆汁盐水解酶(BSH)去除缀合的牛磺酸或甘氨酸以产生未缀合的胆汁酸。一旦未缀合，初级胆汁酸可以通过7α-脱羟基通路进一步代谢以产生次级胆汁酸。已有报道称，缀合的和非缀合的初级胆汁酸牛磺胆酸盐(TCA)和胆酸盐(CA)分别促进艰难梭菌孢子萌发，而次级胆汁酸，如石胆酸盐(LCA)和脱氧胆酸盐(DCA)通常抑制艰难梭菌的营养生长。(钱(Qian)等人,美国生理学胃肠和肝脏生理学杂志(Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol)319:G227–G237,2020)。

艰难梭菌感染(CDI)是美国医疗保健相关感染的最常见原因。(马吉尔SS(MagillSS)等人美国医院医疗保健相关感染流行率的变化(Changes in prevalence of healthcare-associated infections in U.S.hospitals).新英格兰医学杂志(N Engl J Med)2018；379:1732–44)。艰难梭菌有时可能是健康肠道微生物组的正常组分，但当微生物组失衡时，艰难梭菌会茁壮成长并导致疾病(称为CDI)。艰难梭菌定殖后，生物体产生并释放主要毒力因子，即两种大型梭菌毒素A(TcdA)和B(TcdB)。(卡里曼都,微生物2020,8,200；doi:10.3390/microorganisms8020200)。TcdA和TcdB是与人肠上皮细胞结合的外毒素，并且负责炎症、液体和粘液分泌，以及对肠粘膜的损伤。艰难梭菌引起广泛的临床症状，范围从轻度腹泻到严重危及生命的结肠穿孔和中毒性巨结肠。CDI易于破坏宿主微生物组，通常是由先前使用高风险抗生素引起的。(戴维斯ML(Davis ML)等人医疗保健相关的艰难梭菌感染的简单预测指标的多中心推导和验证(Multicentre derivation and validation of asimple predictive index for healthcare-associated C.difficile infection).临床微生物感染(Clin Microbiol Infect)2018；24:1190–4)。例如，通过使用广谱抗生素的治疗，拟杆菌门可以几乎完全消失，厚壁菌门减少，并且变形菌门过度生长；这些变化使艰难梭菌孢子发芽，并且菌落可以生长并致病。(穆什)。一旦艰难梭菌被激活，其两种毒素就会在结肠中产生，从而导致疾病。(布里顿RA(Britton RA)等人,肠道微生物群在艰难梭菌定植抗性中的作用(Role of the intestinal microbiota in resistance tocolonization by C.difficile).胃肠病学(Gastroenterology)2014；146:1547–53)。

大约60％至70％的健康新生儿和婴儿被艰难梭菌定植。(让济2010)。然而，由于尚未完全了解的原因，与易患严重腹泻和结肠炎的年龄较大的儿童和成人相比，这些定植的婴儿没有表现出这种厌氧菌释放的强效外毒素的不良影响。所述生物体是在婴儿期获得的，就像在成人中一样，是由于托儿所或家庭环境中的环境污染。婴儿肠道经常被艰难梭菌的产毒菌株定植，其菌落计数与在患有假膜性结肠炎的成人中所见的一样高(这是CDI的严重表现)。(让济2010)。婴儿无症状定植的一个可能的原因可能是其它共生菌群的存在和竞争，如双歧杆菌属(放线菌门中)和乳杆菌属(Lactobacillus)(厚壁菌门中)。(让济2010)。事实上，正如让济报道的那样，双歧杆菌属和乳杆菌属都能够抑制特定艰难梭菌菌株的生长。

抗微生物疗法是CDI治疗的标志，尽管治疗选择有限。历史上，甲硝唑(vancomycin)被广泛用于CDI的治疗，但由于与万古霉素(vancomycin)相比失败率高得令人无法接受，死亡率和累积毒性更高，因此不再推荐使用甲硝唑。(麦克唐纳LC(McDonaldLC)等人,成人和儿童艰难梭菌感染的临床实践指南：美国传染病学会(IDSA)和美国医疗保健流行病学学会(SHEA)2017年更新(Clinical practice guidelines for C.difficileinfection in adults and children:2017update by the Infectious DiseasesSociety of America(IDSA)and Society for Healthcare Epidemiology of America(SHEA)).临床感染疾病(Clin Infect Dis)2018；66:987–94；以及史蒂文斯VW(StevensVW)等人万古霉素和甲硝唑预防患有艰难梭菌感染的患者的复发和死亡的比较有效性(Comparative effectiveness of vancomycin and metronidazole for the preventionof recurrence and death in patients with C.difficile infection).JAMA内科医学(JAMA Intern Med)2017；177:546–53)。

目前，因为其能够杀死艰难梭菌并解决临床症状的能力，万古霉素或非达霉素(fidaxomicin)是CDI的推荐抗生素。(冈萨雷斯-卢娜AJ(Gonzales-Luna AJ)等人,难治性艰难梭菌感染的系统生物学评估，包含粪便微生物群移植的多次失败(Systems biologyevaluation of refractory Clostridioides difficile infection includingmultiple failures of fecal microbiota transplantation),厌氧菌(Anaerobe),https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2021.102387)。虽然万古霉素是IDSA治疗指南推荐的，但其与CDI的高复发率有关，并且最近由于宿主微生物群的严重破坏而显示出耐药性增加。(艾萨克S(Isaac S)等人,口服万古霉素对人肠道微生物群的短期和长期影响(Short-and long-term effects of oral vancomycin on the human intestinalmicrobiota).抗菌剂与化疗杂志(J Antimicrob Chemother)2017；72:128–36；以及彭Z(Peng Z)等人,艰难梭菌抗微生物耐药性更新：耐药性机制和抗微生物药敏测试(Updateon antimicrobial resistance in C.difficile:resistance mechanisms andantimicrobial susceptibility testing).(临床微生物学杂志(J Clin Microbiol))2017；55:1998–2008)。用万古霉素治疗导致厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门的微生物组多样性降低，具有典型的变形菌门过度生长。(加里(Garey)2020)。变形菌门过度生长与多药耐药(MDR)革兰氏阴性生物体系统感染风险显著增加有关。万古霉素与CDI复发率高有关——约20-25％的患者在停止治疗后复发感染。(冈萨雷斯-卢娜)。

非达霉素的活性谱比万古霉素窄，并且在治疗过程中引起的生态失调更少。与万古霉素不同，非达霉素与艰难梭菌孢子结合，阻止营养细胞生长，由此导致复发率比其它治疗低大约50％。(冈萨雷斯-卢娜)。虽然非达霉素的复发率较低，但有报道称，耐药性通过rpoB基因中的突变表现出来。(加里(Garey)2020)。无论选择的疗法如何，CDI的复发率都会随着CDI的每次后续经历而增加，通常需要延长抗生素疗程来控制疾病。

此外，有报道称，广谱抗生素治疗会导致次级胆汁酸的损失。(钱)。另外，有报道称，遭受艰难梭菌反复感染的患者具有较高的初级胆汁酸，而健康受试者具有较高的次级胆汁酸。(钱)。这些结果表明，产生更多次级胆汁酸的治疗可能对预防复发性CDI有效。

因此，迫切需要具有针对艰难梭菌的不同作用机制的新疗法。事实上，CDC将艰难梭菌列为需要新型抗生素的“紧急”优先病原体类别。特别是，需要一种CDI治疗，所述治疗为微生物组提供了抵抗复发的环境，而无需任何进一步的治疗。还需要促进微生物组健康的CDI治疗。

发明内容

本发明提供了一种同时治疗艰难梭菌感染并降低受试者的艰难梭菌感染的可能性或预防所述复发的方法，所述方法包括向遭受艰难梭菌感染的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中所述有效量的伊贝扎波尔司他的施用同时治疗所述艰难梭菌感染并降低90天内艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发。可以继续施用伊贝扎波尔司他，直到所述艰难梭菌感染的临床治愈实现或当实现所述艰难梭菌感染的临床治愈时终止。所述有效量的伊贝扎波尔司他的施用可以降低艰难梭菌感染的可能性或预防其在30天内复发。

本发明还提供了一种促进遭受艰难梭菌感染的受试者体内的放线菌门的生长的方法，所述方法包括施用有效量的伊贝扎波尔司他以治疗或预防所述艰难梭菌感染，其中所述受试者的肠道微生物组中的放线菌门的量增加或者放线菌门与变形菌门相比的比例增加。可以继续施用伊贝扎波尔司他，直到所述艰难梭菌感染的临床治愈实现或当实现所述艰难梭菌感染的临床治愈时终止。

本发明进一步提供了一种改善肠道微生物组的健康的方法，所述方法包括向遭受艰难梭菌感染的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中与所述伊贝扎波尔司他的施用之前所述受试者的肠道微生物组相比，所述受试者的肠道微生物组中的细菌门的比例被调节到更健康的平衡。

本发明进一步提供了一种增加肠道微生物组中的放线菌门的量的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中与所述伊贝扎波尔司他的施用之前所述肠道微生物组中的放线菌门的量相比，所述肠道微生物组中的放线菌门的量更高。

本发明进一步提供了一种改善肠道微生物组的健康的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中与所述伊贝扎波尔司他的施用之前所述受试者的肠道微生物组相比，所述受试者的肠道微生物组中的细菌门的比例被调节到更健康的平衡。

附图说明

图1示出了如使用香农指数(Shannon's index)确定的，在施用伊贝扎波尔司他(ACX362E)后，微生物组中的物种的α多样性没有显著降低。相反，施用125mg的万古霉素后，细菌物种的多样性降低。被标记为安慰剂的受试者是那些具有健康肠道、未施用伊贝扎波尔司他或万古霉素的受试者。每个方框表示一位给予了10天研究期药物或安慰剂的患者，研究时段为13天

图2示出了施用300mg和450mg伊贝扎波尔司他以及125mg万古霉素对微生物组特征的影响。数据通过PCoA布雷柯蒂斯图(PCoA Bray Curtis Plots)提供。从图中可以看出，与万古霉素相比，在给药10天后，鉴定出不同的伊贝扎波尔司他微生物组特征。

图3示出了在施用125mg万古霉素、300mg伊贝扎波尔司他和450mg伊贝扎波尔司他后，按细菌门的微生物组的组成。被标记为安慰剂的受试者是那些具有健康肠道、未施用伊贝扎波尔司他或万古霉素的受试者。每个方框表示一位给予了10天研究期药物或安慰剂的患者，研究时段为13天

图4A和4B示出了在给予伊贝扎波尔司他和万古霉素的受试者中，从第0天到第10天微生物组变化的线性效应大小算法(LEfSe)总结。阴影表示与基线相比，第10天的细菌丰度增加或减少。

图5A和5B示出了与伊贝扎波尔司他和万古霉素的施用相关的初级胆汁酸和次级胆汁酸的变化，图5B示出了以初级胆汁酸与次级胆汁酸的比率为形式的数据。

图6示出了通过香农熵(Shannon's Entropy)(6A)或辛普森(Simpson's Index)指数(6B)测量的治疗组α多样性随时间的汇总估计，以及在基线(6C)或至少5天的疗法后测量的β多样性(6D)。

图7示出了初级(7A)和次级(7B)的总体变化，以及初级:次级胆汁酸的比率(7C)随时间的变化。值表示平均值±标准误差。

图8示出了IBZ和VAN治疗的受试者在基线、疗法中点和疗法结束时的胆汁酸浓度。

图9示出了伊贝扎波尔司他试验结果，示出了伊贝扎波尔司他的施用后的临床治愈和持续的临床治愈。

图10示出了伊贝扎波尔司他对GI感染的PK特性。如图所示，伊贝扎波尔司他对GI感染具有理想的PK特性。

图11示出了用伊贝扎波尔司他处理的样品，所述样品在CCFA板上铺板之前用牛磺胆酸盐进行了48小时的富集步骤。

图12A和12B示出了通过香农多样性指数(Shannon Diversity Index)(12A)或通过反向辛普森指数(Inverse Simpson Index)(12B)测量的伊贝扎波尔司他的施用后α多样性随时间的汇总估计。如图所示，对于伊贝扎波尔司他，α多样性改善。

图13A-13D示出了比较以下的图表：门平均比例丰度与抗生素疗法天数(13A)；纲平均比例丰度与抗生素疗法天数(13B)；目平均比例丰度与抗生素疗法天数(13C)；以及科平均比例丰度与抗生素疗法天数(13D)。如图所示，在伊贝扎波尔司他疗法中观察到厚壁菌门的比例增加，其中最常见的厚壁菌门的增加的分类群是梭菌目(Clostridiales)。

图14A示出了伊贝扎波尔司他对初级胆汁酸影响随时间变化的汇总。图14B示出了伊贝扎波尔司他对次级胆汁酸影响随时间变化的汇总。图14C示出了次级胆汁酸与初级胆汁酸的比率。值表示平均值±标准误差。

图15A是示出按门的分类群的相对丰度的受试者特异性变化的图表。所述图表示出了一位接受了为期10天的伊贝扎波尔司他疗程，并且随访至第40天的患者。图15B是示出按纲的分类群的相对丰度的受试者特异性变化的图表。所述图表示出了一位接受了为期10天的伊贝扎波尔司他疗程，并且随访至第40天的患者。图15C是示出按目的分类群的相对丰度的受试者特异性变化的图表。所述图表示出了一位接受了为期10天的伊贝扎波尔司他疗程，并且随访至第40天的患者。图15D是示出按科的分类群的相对丰度的受试者特异性变化的图表。所述图表示出了一位接受了为期10天的伊贝扎波尔司他疗程，并且随访至第40天的患者。

具体实施方式

本文描述了使用伊贝扎波尔司他来增加肠道微生物组的健康的方法。本发明提供了治疗艰难梭菌感染的方法，同时降低艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发。本发明还提供了通过增加肠道中放线菌门的数量和/或增加放线菌门相对于微生物组中的其它细菌门的比例来增加肠道微生物组的健康的方法。

“艰难梭菌感染”或“CDI”是指艰难梭菌对宿主动物,例如哺乳动物的入侵。例如，感染可以包含通常存在于哺乳动物体内或身体上的艰难梭菌的过度生长，或通常不存在于哺乳动物体内或身体上艰难梭菌的生长。更一般地，艰难梭菌感染可以是艰难梭菌或艰难梭菌释放的毒素的存在对宿主动物造成损害的任何情况。当动物体内或身体上存在过量的艰难梭菌时，或者当艰难梭菌毒素的存在正在损害动物的肠道细胞或其它组织时，动物就“遭受”艰难梭菌感染。在一个实施例中，艰难梭菌的特定属或种的数量比健康微生物组中发现的数量高至少2、4、6或8个对数。可替代地，艰难梭菌可能与健康的微生物组相同，但正在产生毒素。艰难梭菌感染的存在可以通过粪便中存在毒素来表征，通常通过测试产生毒素B的基因，使用PCR方法或使用能够检测毒素蛋白的ELISA测定。

“有效量”意指足以产生有益或期望的临床或生化结果的量。有效量可以施用一次或多次。出于本发明的目的，有效量是当施用于感染或潜在感染部位时将治疗或预防艰难梭菌感染，同时增加微生物组中放线菌门和/或厚壁菌门的量和/或比例的伊贝扎波尔司他的量。

“施用”意指给予动物(例如，哺乳动物)一种或多种单位剂量的伊贝扎波尔司他的方法(如局部、口服、静脉内、腹膜内或肌内施用)。施用方法可以根据各种因素而变化，例如药物组合物的成分、潜在或实际感染的部位以及实际微生物感染的严重程度。

“抑制”意指将艰难梭菌细菌的细胞生长率降低至少80％。在某些实施例中，生长可被抑制90％、95％、或甚至99％或更多。抑制程度可以通过例如体外生长测定，例如通过标准液体培养技术来确定。优选在适当的MIC(最小抑制浓度)下抑制集落形成，例如，<100μg/ml，更优选地<10μg/ml。

“治疗”意指用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益的或所期望的临床结果包含但不限于症状的减轻、疾病程度的减轻、疾病的状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减缓、以及缓和(不论是部分还是总体)，不论这些结果是可检测的还是不可检测的。“治疗”是指治疗和预防或预防性措施。需要治疗的患者包含已经患有病症的患者以及需要预防病症和/或预防复发的患者。“缓解”疾病意指与未经治疗的情况相比，疾病状态的程度和/或不期望的临床表现减轻和/或进展的时间进程减慢或延长。

“微生物组”意指特定环境中的微生物(包含身体或身体的一部分)。优选地，微生物组位于肠道中。

“健康微生物组”可以从生态稳定性(即在压力下抵抗群落结构变化或在压力相关变化后迅速恢复到基线的能力)、理想化(可能与健康相关)的组成或期望的功能特征(包含对宿主的代谢和营养供应)来描述。健康的成人微生物组也可以以厚壁菌门或拟杆菌门的大多数细菌物种和放线菌门和变形菌门的少数细菌物种为特征。健康的新生儿微生物组可以以拟杆菌门和放线菌门中的大多数细菌物种为特征。

“改善肠道微生物组的健康”意指微生物组的组成由放线菌门、厚壁菌门或拟杆菌门的大多数细菌物种和少数变形菌门组成。可替代地，改善肠道微生物组的健康可以意指增加放线菌门中细菌物种的比例，如健康新生儿肠道微生物组中存在的细菌物种。受试者可以遭受艰难梭菌感染或未遭受艰难梭菌感染。

“降低艰难梭菌感染的可能性”意指预防性治疗或治疗，与未接受伊贝扎波尔司他的受试者或患者群体相比，通过施用伊贝扎波尔司他，受试者和患者群体感染艰难梭菌的几率或比率降低(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。

“临床治愈”意指初始感染已经清除。优选地在受试者已接受治疗过程后的诊断后约10-12天进行测量。

“持续的临床治愈”意指受试者已经临床治愈，并且感染没有复发。其在诊断后第30-90天测量。

“复发”意指受试者已临床治愈，并且在30-90天的时间内再次发生感染。

健康肠道的微生物组由称为门的主要细菌群体组成。厚壁菌门(革兰氏阳性孢子形成生物体)和拟杆菌门(革兰氏阴性非孢子形成生物体)是最常见的，并且通常共同占健康成人肠道微生物组的90％以上。成人肠道微生物组还含有放线菌门、梭杆菌门、疣微菌门和变形菌门。放线菌门在儿童中占很大比例，并且总体比例通常随着年龄的增长而下降(被厚壁菌门和放线菌门取代)。变形菌门(革兰氏阴性兼性厌氧菌)通常占健康微生物组的2-5％。当微生物组的组成从其正常多样性改变时，正常生理功能就会被破坏，称为生态失调。遭受艰难梭菌感染的患者处于生态失调状态。与艰难梭菌感染受试者相关的生态失调包含变形菌门比例增加(通常被称为“开花”)和厚壁菌门和拟杆菌门的数量减少

伊贝扎波尔司他是2-((3,4-二氯苄基)氨基)-7-(2-吗啉乙基)-1,7-二氢-6H-嘌呤-6-酮。1,7-二氢-6H-嘌呤-6-酮化合物的合成方法以及其在抑制细菌生长中的用途公开于美国专利第6,926,763号和第8,796,292号中，所述美国专利通过引用并入本文。伊贝扎波尔司他是DNA聚合酶IIIC抑制剂。其具有抗革兰氏阳性谱的抗菌活性，可用于治疗艰难梭菌感染。伊贝扎波尔司他的作用机制靶向低G+C(G和C DNA碱基比A和T碱基少)含量的革兰氏阳性细菌(主要是包含艰难梭菌在内的厚壁菌门)。DNA聚合酶IIIC酶对低G+C含量革兰氏阳性细菌的复制是必需的，并且因此对如艰难梭菌等厚壁菌门是选择性的，但对如放线菌门或拟杆菌门等其它宿主微生物群没有活性。

与目前推荐的治疗艰难梭菌感染的万古霉素的施用相比，伊贝扎波尔司他的施用会导致明显不同的微生物组特征。例如，与万古霉素治疗的受试者中的更大数量和比例的不期望的变形菌门相比，在伊贝扎波尔司他治疗的受试者中发现了更大比例的期望的放线菌门和厚壁菌门。变形菌门过度生长与MDR革兰氏阴性生物体系统感染风险显著增加有关。因此，与万古霉素相比，伊贝扎波尔司他不仅不会伤害期望的放线菌门和厚壁菌门的群体，而且伊贝扎波尔司他意外地增加了微生物组中存在的放线菌门和厚壁菌门的数量和/或比例。参见图3和4。通过促进如放线菌门和厚壁菌门等健康细菌的生长并且不导致变形菌门的增加，伊贝扎波尔司他还提供了预防艰难梭菌感染的复发或降低所述复发的可能性的微生物组。

伊贝扎波尔司他可以被调配为药物组合物，用于以适合体内或体外施用的生物相容形式施用于人或动物受试者。因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含与赋形剂混合的本发明的化合物。

本发明提供了通过向遭受艰难梭菌感染的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他来同时治疗艰难梭菌感染并降低受试者的艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发的方法。有效量的伊贝扎波尔司他的施用同时治疗艰难梭菌感染并在30-90天内降低艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发。优选地，可以继续伊贝扎波尔司他的施用，直到艰难梭菌感染在临床上治愈。优选地，一旦实现临床治愈，就可以终止伊贝扎波尔司他的施用。

本发明进一步提供了促进遭受艰难梭菌感染的受试者体内的放线菌门的生长的方法，所述方法包括施用有效量的伊贝扎波尔司他以治疗或预防艰难梭菌感染。受试者的肠道微生物组中的放线菌门的数量增加或放线菌门的比例增加。继续伊贝扎波尔司他的施用，直到实现艰难梭菌感染的临床治愈。优选地，当实现艰难梭菌的临床治愈时，终止伊贝扎波尔司他的施用。伊贝扎波尔司他的施用后放线菌门的百分比可以增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

本发明进一步提供了一种改善肠道微生物组的健康的方法，所述方法包括向遭受艰难梭菌感染的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他。与伊贝扎波尔司他的施用之前受试者的肠道微生物组相比，受试者的肠道微生物组中的细菌门的比例被调节到更健康的平衡。例如，放线菌门的百分比可以增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。

本发明还提供了一种增加肠道微生物组中的放线菌门的量的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中与所述伊贝扎波尔司他的施用之前所述肠道微生物组中的放线菌门的量相比，所述肠道微生物组中的放线菌门的量更高。受试者不需要遭受艰难梭菌感染。本发明还提供了一种改善肠道微生物组的健康的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中与所述伊贝扎波尔司他的施用之前人的肠道微生物组相比，所述受试者的肠道微生物组中的细菌门的比例被调节到更健康的平衡。受试者不需要遭受艰难梭菌感染。

如图1所示，施用伊贝扎波尔司他后，微生物组中细菌物种的多样性没有显著降低。相反，施用万古霉素后细菌物种的多样性降低。被标记为安慰剂的受试者是那些具有健康肠道、未施用伊贝扎波尔司他或万古霉素的受试者。与安慰剂相比，伊贝扎波尔司他的施用并没有显著降低微生物组的多样性。较低的细菌多样性是不期望的，因为其可以预测艰难梭菌感染随时间的推移而复发。如图2所示，在10天的过程中，施用300mg和450mg伊贝扎波尔司他产生的微生物组特征与125mg万古霉素产生的微生物组特征不同。

如图3所示，施用万古霉素后，变形菌门增加，这会降低微生物组的健康和平衡并增加艰难梭菌感染的复发的机会。相比之下，与其它细菌门相比，施用300mg的伊贝扎波尔司他引起微生物组中的放线菌门的增加。与其它细菌门相比，施用450mg的伊贝扎波尔司他也引起放线菌门的增加。两种剂量的伊贝扎波尔司他的施用均未引起万古霉素施用后所见的变形菌门的增加。

出生后，儿童通过接触各种细菌，立即开始发展其肠道微生物组。在早期婴儿期期间，如大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌等兼性厌氧物种会在婴儿肠道定植，并且在出生后的前几天产生厌氧环境，使拟杆菌属(拟杆菌门)和双歧杆菌属(放线菌门)等严格厌氧菌能够茁壮成长。此外，大约60％至70％的健康新生儿和婴儿被艰难梭菌定植——频率与定植计数通常与遭受CDI的有症状的成人一样高。这些婴儿通常不会因这种定植而经历任何症状。本发明的方法产生了与健康早期婴儿肠道微生物组非常相似的肠道微生物组，具有大量放线菌门。双歧杆菌属是放线菌门中的一组细菌，可抑制艰难梭菌菌株的生长。因此，根据本发明的方法产生肠道微生物组，所述肠道微生物组将预防CDI的复发或降低所述复发的可能性。

伊贝扎波尔司他满足理想抗艰难梭菌抗生素的三个关键标准：伊贝扎波尔司他以最小的全身吸收达到高结肠浓度；其对艰难梭菌具有强大的活性，而与口服万古霉素相比，其对肠道微生物组的破坏最小；并且其显示出对肠道胆汁酸代谢的潜在有益作用。

根据本发明的方法，如本领域技术人员将理解的，根据所选择的施用途径，可以以多种形式向受试者或患者施用伊贝扎波尔司他。对于人或动物用途，通过口服、经颊、直肠和阴道途径，或通过局部施用来施用伊贝扎波尔司他，并且相应地调配药物组合物。优选地，以口服剂型施用伊贝扎波尔司他。无限制地，对于口服施用，组合物可以是例如片剂、胶囊、颗粒、液体溶液和悬浮液的形式。组合物也可以通过栓剂或灌肠施用。

如上所述，伊贝扎波尔司他可以单独或与药学上可接受的赋形剂组合施用于动物，优选地人，其比例由化合物的溶解度和化学性质、选择的施用途径和标准药物实践确定。伊贝扎波尔司他可以施用于成人或儿童。本发明的化合物和/或包括本发明的化合物的组合物的剂量可以根据许多因素而变化，如施用方式；受体的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；治疗频率和同时治疗的类型(如果有的话)；以及待治疗的动物体内的化合物的清除率。本领域技术人员可以基于以上因素来确定合适的剂量。本发明的化合物可以以合适的剂量初始施用，所述剂量可以根据临床应答按照需要进行调节。通常，本发明的化合物可以在含有约0.1至10％w/v化合物的生理缓冲水溶液中提供，或者以固体剂型(如片剂或胶囊)提供。一般剂量范围是每天约0.01mg/kg至约1g/kg体重。伊贝扎波尔司他的口服剂量可以包含每天约10mg至1000mg，优选地每天100mg至900mg，并且更优选地每天约150、300、600或900mg的量。

实例

上述描述和实例仅仅是为了说明本发明而提出，并且不意味着限制。由于结合本发明的精神和实质的所描述的实施例的修改可以由本领域的技术人员进行，因此本发明应被广泛地解释为包含权利要求以及其等效物范围内的所有变化。

实例1：

I期健康志愿者研究的微生物组研究：

背景：健康肠道的微生物组由称为门的两个主要细菌群体组成。厚壁菌门(革兰氏阳性孢子形成生物体)和拟杆菌门(革兰氏阴性非孢子形成生物体)是最常见的。第三个门——变形菌门(革兰氏阴性兼性厌氧菌)以低丰度存在，但通常占健康微生物组的2-5％。第四个门——放线菌门在儿童中占很大比例，并且通常随着年龄的增长，总体比例会下降(被厚壁菌门和放线菌门取代)。遭受艰难梭菌感染的患者处于生态失调状态，并且通常具有增加的变形菌门比例，例如变形菌门过多或“变形菌门开花”，并且厚壁菌门和拟杆菌门数量减少。

伊贝扎波尔司他研究：使用I期健康志愿者研究的粪便样品和鸟枪法宏基因组测序表明，与接受万古霉素治疗的受试者相比，在10天内使用伊贝扎波尔司他治疗会引起受试者的微生物组特征显著不同。差异在于，与万古霉素治疗的受试者体内更大比例的变形菌门相比，伊贝扎波尔司他治疗的受试者的放线菌门和厚壁菌门的比例更大。

方法和材料

材料：初级胆汁酸胆酸盐(CA)和鹅脱氧胆酸盐(CDCA)、缀合的初级胆汁酸甘氨胆酸盐(GCA)、牛磺胆酸盐(TCA)、甘氨鹅脱氧胆酸盐(GCDCA)和牛磺鹅脱氧胆酸盐(TCDCA)、次级胆汁酸石胆酸盐(LCA)、脱氧胆酸盐(DCA)、熊脱氧胆酸盐(UDCA)和猪脱氧胆酸盐(HDCA)以及缀合的次级胆汁酸甘氨石胆酸盐(GLCA)、牛磺石胆酸盐(TLCA)、甘氨脱氧胆酸盐(GDCA)和牛磺脱氧胆酸盐(TDCA)购自西格玛公司(Sigma)。

临床试验的描述：纳入了二十二位受试者(女性：33％)，年龄为30±8岁。六位患者被各自给予万古霉素、伊贝扎波尔司他300mg或伊贝扎波尔司他450mg，并且另外四位被给予安慰剂。作为递增剂量伊贝扎波尔司他(每天两次300或450mg)的最近I期健康志愿者研究的一部分，每天收集粪便样品，所述研究具有万古霉素比较组，每天给予四次125mg，以及安慰剂。(加里KW等人一项随机、双盲、安慰剂对照、单次和多次递增剂量的1期研究，旨在确定健康受试者口服伊贝扎波尔司他的安全性、药代动力学以及食物和粪便微生物组影响(Arandomized,double-blind,placebo-controlled,single and multiple ascending dosePhase 1study to determine the safety,pharmacokinetics and food and faecalmicrobiome effects of ibezapolstat administered orally to healthy subjects).抗菌剂与化疗杂志2020；75(12):3635-3643.DOI:10.1093/jac/dkaa364。)获得了机构审查委员会的批准(米德兰机构审查委员会(Midlands Institutional Review Board)IRB#222220170383)，所有志愿者在进行任何研究程序之前签署了知情同意书。在此分析中，在第0天(基线)至第13天和第30天随访(如果可用的话)，从每天两次给予伊贝扎波尔司他300或450mg的受试者、每天四次给予125mg万古霉素或10天给予安慰剂的受试者收集粪便样品。粪便样品立即在-80C下冷冻，然后在干冰上运送到休斯顿大学(University ofHouston)进行分析。

粪便DNA提取和鸟枪法宏基因组测序：使用DNAeasy Power Soil Pro试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，目录号1288-100)在QiaCube自动化DNA提取系统中提取粪便DNA，如前所述。(加里KW等人,抗菌剂与化疗杂志2020；75(12):3635-3643.DOI:10.1093/jac/dkaa364。)鸟枪法宏基因组测序在休斯顿大学测序和基因编辑中心(Sequencing and Gene EditingCore)(美国德克萨斯州休斯顿(Houston,TX USA))使用用于DNA文库制备的Nextera DNAFlex文库制备试剂盒和用于测序的Illumina NextSeq500平台进行。CLC基因组工作台第12版(凯杰公司)用于宏基因组组装和丰度表的创建。

从粪便样品中提取胆汁酸：将粪便样品等分并称重(范围从约10至约150mg)，通过涡流和超声处理将每份等分试样与1ml含有内标(LCA-d5和CA-d5，200μg/L)的100％甲醇充分混合。将混合物在4℃下放置过夜并在10,000g下离心3分钟，将上清液转移到新管中并用纯水稀释10倍。随后，将稀释的上清液应用于预调理的Sep-Pak C18 Classic Cartridge或Waters Corp Oasis HLB 96孔板(美国沃特世公司(Waters,USA))中。用5％甲醇洗涤后，将胆汁酸级分用100％甲醇洗脱。将洗脱液在氮气下干燥，重新悬浮在2ml甲醇/水(1:1，vol/vol)中，并且在-20℃下储存直至进一步分析。

胆汁酸分析：胆汁酸使用靶向液相色谱法质谱法(LC-MS)分析进行定量，所述分析在QTRAP 5500质谱仪(美国马萨诸塞州弗雷明汉的爱博才思公司(Sciex,Framingham,MA,USA))上进行，所述质谱仪改编自先前描述的方法。(谢勒M(Scherer M)等人通过液相色谱法-串联质谱法快速定量血清中的胆汁酸以及其缀合物(Rapid quantification of bileacids and their conjugates in serum by liquid chromatography-tandem massspectrometry).色谱法分析B：技术生物生命科学杂志(J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci)2009；877(30):3920-5.DOI:10.1016/j.jchromb.2009.09.038。)简而言之，相似质量和化学结构的胆汁酸之间的色谱分离在C18柱(美国加利福尼亚州托伦斯的飞诺美公司(Phenomenex,Torrance,CA,USA))上进行，并且使用梯度方法使用两个流动相(溶剂A：甲醇-水(1:1，vol/vol)与10mM乙酸铵和0.1％(wt/vol)氢氧化铵(pH 9)；溶剂B：甲醇与10mM乙酸铵和0.1％(wt/vol)氢氧化铵(pH 9)。根据使用未标记的和稳定同位素标记的胆汁酸标准品生成的标准曲线计算每种类型的胆汁酸的定量。胆汁酸浓度通过对应的样品重量进行归一化。

统计分析

使用R软件生成细菌分类群和α多样性的受试者特异性和汇总变化。建立了线性回归模型，以评估给予万古霉素或伊贝扎波尔司他的受试者在门、纲、目和科水平上随时间的比例分类群差异，相对于总样品中存在的至少百分之五的分类群进行归一化。还建立了线性回归模型，以评估给予万古霉素或伊贝扎波尔司他的受试者的α多样性测量值(香农、辛普森和皮卢(Pielous))随时间的每日变化。线性效应大小算法(LEfSe)算法用于可视化和鉴定基线与第10天样品之间微生物群组成的显著差异。(世嘉N(Segata N)等人宏基因组生物标志物的发现和解释(Metagenomic biomarker discovery and explanati on).基因组生物学(Genome Biol)2011；12(6):R60.DOI:10.1186/gb-2011-12-6-r60。)建立了线性回归模型以评估给予万古霉素或伊贝扎波尔司他的受试者的初级和次级胆汁酸随时间的变化以及初级:次级胆汁酸的比率。所有线性回归模型均使用安慰剂结果作为基线值，并且对受试者的年龄、体重和性别进行控制。使用SAS 9.4版(北卡罗来纳州卡里的塞仕软件研究所(Sas Institute,Cary NC))或用于所有统计分析。为了说明每个目标的多个分析，除非另有说明以限制错误检测率，否则p<0.005的降低的p值被认为是统计上显著。(考斯尔K(Korthauer K)等人控制计算生物学中错误发现方法的实用指南(A practical guide tomethods controlling false discoveries in computational biology).基因组生物学2019；20(1):118.DOI:10.1186/s13059-019-1716-1。)

α和β多样性

α和β多样性：α多样性测试样品中细菌物种的多样性，而β多样性测试样品之间的多样性差异。使用冈萨雷斯-卢娜(难治性艰难梭菌感染的系统生物学评估，包含粪便微生物群移植的多次失败.厌氧菌2021:102387.DOI:10.1016/j.anaerobe.2021.102387)中描述的方法，将来自给予伊贝扎波尔司他的健康受试者的样品的α和β多样性进行了评估，与给予万古霉素的受试者进行了比较。

16S核糖体RNA(rRNA)基因测序：如冈萨雷斯-卢娜2021所描述的，进行了16S rRNA测序以表征微生物分类学。使用基于Illumina的测序平台对16S rRNA基因的V3-V4区进行测序，其中每个样品至少有15,000个读段，以评估肠道微生物组群落结构。通过使用NCBIBLAST+软件包v2.8.1 2018搜索NCBI 16S rRNA序列数据库(发布日期：2018年9月1日)，将具有至少97％相似性的质量过滤序列读段聚类为操作分类单元(OTU)，并且在物种水平上为来自每个OTU的代表性序列分配分类身份。微生物多样性指数使用QIIME v1.9.0计算，其中物种丰富度和系统发育距离表示α-多样性，并且布雷-柯蒂斯(Bray-Curtis)和加权Unifrac表示β-多样性。R平台和GraphPad Prism 7.0(加利福尼亚州圣迭戈(San Diego,CA))用于可视化结果。

鸟枪法宏基因组测序：从先前用于16S rRNA测序的粪便样品中提取的DNA是使用基于Illumina的微生物组功能基因的分析平台进行的鸟枪法宏基因组测序。使用HUMAnN2v0.11.2管道.35对鸟枪法宏基因组进行功能基因分析。在预处理步骤中，对测序读数进行质量过滤，并且随后进行筛选并去除污染宿主(人)读段。Trimmomatic v0.38用于过滤和修剪具有默认截止设置的原始序列数据。使用bowtie2算法以配对端模式对照人类基因组数据库搜索读段，并且如果将所述读段映射到数据库，则将其丢弃。为了获得基因家族特征，首先使用bowtie2对照核苷酸数据库(ChocoPhlAn)搜索这些质量控制的宏基因组序列，并且然后使用戴蒙德(diamond)对照蛋白质数据库(UniRef90)搜索这些序列。使用UniRef90对所有已鉴定的基因家族进行注释，并且使用MetaCyc标识符对通路进行注释。α和β的多样性使用基因家族特征产生。

α多样性分析的结果在图1中示出。在图中，最上面一行的图表示接受万古霉素治疗的受试者。第二行的图表示接受300mg伊贝扎波尔司他治疗的受试者。并且第三行的图表示接受450mg伊贝扎波尔司他治疗的受试者。第四行表示接受安慰剂的受试者。如可以从此图中看出的，与万古霉素相比，在治疗过程期间，用伊贝扎波尔司他治疗引起生物群落α多样性的总体变化较小。

β多样性分析的结果在图2中示出。在图中，左图展示了受试者在治疗前的基线多样性。右图示出了接受万古霉素或伊贝扎波尔司他的受试者的β多样性。接受伊贝扎波尔司他治疗的受试者具有保持在同一y轴附近的β多样性，而万古霉素受试者表现出截然不同的β多样性。此研究的结果表明，与万古霉素相比，施用伊贝扎波尔司他后的肠道多样性不同。

微生物组分析

使用冈萨雷斯-卢娜(难治性艰难梭菌感染的系统生物学评估，包含粪便微生物群移植的多次失败.厌氧菌2021:102387.DOI:10.1016/j.anaerobe.2021.102387)和世嘉等人(宏基因组生物标志物的发现和解释.基因组生物学2011；12(6):R60.DOI:10.1186/gb-2011-12-6-r60)中所描述的方法来分析接受伊贝扎波尔司他或万古霉素治疗的健康受试者的微生物组。

使用上述测序，分析了接受伊贝扎波尔司他或万古霉素的受试者的细菌门随时间的变化。此分析的结果在图3中示出。从此分析的结果中可以明显看出，用万古霉素治疗引起变形菌门“开花”(图中以深灰色示出)。从此分析中还可以明显看出，用伊贝扎波尔司他治疗产生了更高比例的放线菌门。

使用线性判别分析效应大小(LEfSe)方法分析了使用伊贝扎波尔司他或万古霉素治疗的健康志愿者的数据，所述方法允许进行高维类别比较，特别关注宏基因组分析。此方法在世嘉等人(宏基因组生物标志物的发现和解释.基因组生物学2011；12(6):R60.DOI:10.1186/gb-2011-12-6-r60)中进行了描述。此分析的结果在图4中示出。所述图描绘了给予伊贝扎波尔司他或万古霉素的受试者从第0天到第10天的微生物组变化。阴影表示与基线相比，第10天的细菌丰度降低或者丰度增加。如LEfSe图中所示，与第10天的万古霉素相比，在治疗的第10天，伊贝扎波尔司他对整体微生物组的变化要小得多。

任何研究组的基线微生物群在基线(第0天样品)处没有差异。基于伊贝扎波尔司他、万古霉素或安慰剂的受试者的个体门和香农指数α多样性随时间的每日变化在图1和3中示出。个体间门差异是明显的。然而，一般来说，在给予万古霉素的受试者中，变形菌门或梭杆菌门的比例增加，而在给予伊贝扎波尔司他的受试者中，放线菌门的比例持续增加。通常，与安慰剂相比，个体受试者接受伊贝扎波尔司他或万古霉素的疗法的α多样性降低。α多样性随时间的变化的统计分析在下表1中示出。使用三个单独的α多样性指数(香农、辛普森和皮卢)，与安慰剂相比，伊贝扎波尔司他450mg和万古霉素显示出α多样性随时间的统计学显著变化。与安慰剂相比，伊贝扎波尔司他300mg没有显示出统计学上的显著变化。治疗组α多样性随时间变化(香农)的汇总测量在图6中示出。β多样性的变化证实了研究组之间的微生物群存在显著差异(图6)。使用主坐标分析，基线样品在所有研究组中都是相似的，而万古霉素治疗的受试者的不同椭圆(代表每个簇的95％置信度)与伊贝扎波尔司他或安慰剂样品的剂量相比有显著差异。通过LEfSe算法生成的基线处与疗法结束时的进化分枝图在图4中示出。万古霉素对微生物组有更广泛的影响，包含除了γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)比例增加外，大多数分类群的比例显著降低。伊贝扎波尔司他显示梭菌目的比例降低并且肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)的某些物种的比例增加。细菌分类群在门、纲、目和科水平上的变化在下表2中示出。

表1.伊贝扎波尔司他与口服万古霉素疗法期间(A)每日α多样性和(B)胆汁酸变化的比较

数字表示研究时间时段期间的平均变化±标准偏差。负(-)数表示(A)多样性或(B)胆汁酸浓度降低。1°：初级；2°：次级；*控制患者年龄、体重和性别的p值与安慰剂

表2.健康受试者给予万古霉素或两种剂量的伊贝扎波尔司他中的一种后分类群的比例变化。浅灰色指示与基线相比，相对比例增加了至少10％/深灰色表示相对比例减少了10％(只有显著性p<0.005的变量着色)。

c：纲；o：目；f：科

胆汁酸分析

为了进一步分析与伊贝扎波尔司他使用相关的胆汁酸变化，基于谢勒M等人(通过液相色谱法-串联质谱法快速定量血清中的胆汁酸以及其缀合物.色谱法分析B：技术生物生命科学杂志2009；877(30):3920-5.DOI:10.1016/j.jchromb.2009.09.038)和钱X(QianX)等人(利地利唑，一种用于治疗艰难梭菌感染的窄谱抗生素，增强了微生物群依赖性胆汁酸的保存(Ridinilazole,a narrow spectrum antibiotic for treatment ofClostridioides difficile infection,enhances preservation of microbiota-dependent bile acids).美国生理学胃肠和肝脏生理学杂志2020；319(2):G227-G237.DOI:10.1152/ajpgi.00046.2020)两者发表的数据，为此研究开发了LC-MS-MS方法。

十七个基线样品可用于胆汁酸分析，17天五个样品和14天10个样品。每种药物和时间时段的胆汁酸浓度在图8中示出。所有研究组的基线样品相似，并且主要包括次级胆汁酸(>95％)。随着暴露于所有研究药物，初级胆汁酸增加，并且次级胆汁酸减少(图7)。使用控制受试者人口统计学的线性回归分析，万古霉素与初级胆汁酸以及初级:次级胆汁酸比率的显著增加有关。尽管用伊贝扎波尔司他450mg的观察到了类似的效果，但这些结果在统计学上不显著(上表1)。

此分析的结果在图5A和5B中示出。左图示出了在用伊贝扎波尔司他或万古霉素治疗过程期间初级胆汁酸的变化。右图示出了在用伊贝扎波尔司他或万古霉素治疗过程期间次级胆汁酸的变化。从这些结果中可以明显看出，用万古霉素治疗引起初级胆汁酸大幅增加，同时也会引起次级胆汁酸大幅减少。相比之下，伊贝扎波尔司他不会因此初级胆汁酸的量的显著变化，并且不会引起次级胆汁酸的大幅减少。

微生物群与胆汁酸变化的相关性

科分类群与初级和次级胆汁酸浓度之间的相关性在表3中示出。肠杆菌科与初级胆汁酸浓度的相关性最高(r：0.63；p<0.0001)，而疣微菌科与初级胆汁酸浓度呈负相关(r：-0.37；p＝0.0025)。疣微菌科也与次级胆汁酸浓度呈正相关(r＝0.44；p＝0.0002)。假单胞菌科(Pseudomonadaceae)也与次级胆汁酸浓度呈正相关(r＝0.38；p＝0.0017)。

表3.微生物群与胆汁酸的相关性。

此研究中的重要宏基因组发现是使用两种抗生素的梭菌纲持续减少，但随后在伊贝扎波尔司他治疗的受试者中放线菌门纲扩大，在万古霉素治疗的受试者中γ变形菌纲、肠杆菌目和肠杆菌科扩大。在厚壁菌门中，万古霉素也与芽孢杆菌纲分类群比例增加有关。

实例2：

来自伊贝扎波尔司他对CDI的2a期临床试验的微生物组数据

2期临床试验：

2期临床试验旨在评估伊贝扎波尔司他在CDI的治疗中的功效。

此试验的2a期是由来自美国的研究中心的10位受试者组成的开放标签队列。在此队列中，10位通过毒素EIA+诊断为轻度/中度艰难梭菌引起的腹泻患者使用伊贝扎波尔司他450mg口服治疗，每天两次，持续10天。所有患者均进行了28±2天的复发随访。在疗法期间和随访时收集粪便。对患者粪便样品进行艰难梭菌培养和微生物组变化评估。研究证明在第12天100％临床治愈，并且在第38天100％持续的临床治愈。有利的微生物组变化包含在疗法期间放线菌门和厚壁菌门物种的过度生长。这些发现证明了对胆汁酸代谢的有益影响，并且进一步支持微生物组效应可能预测有益的患者结果，包含低复发率。

感染被100％消除，无感染复发(100％)，并且具有可接受的不良事件特征。

方法：

安全性评估

安全性评估包含AE评估、体格检查、生命体征、临床实验室测试(化学、血液学和尿液分析)和心电图。记录所有受试者的安全性终点，包含AE的性质、频率和严重程度。从纳入时间开始，在每次随访时对AE进行评估，并且根据药事管理医学词典(Medical Dictionaryfor Regulatory Activities)(MedDRA 15.0版)进行分类。研究人员在每个部位评估AE严重程度(轻度、中度或重度)和因果关系(与研究药物无关、可能相关或大概相关)。

PK评估

在第1天、第5天和第10天第一次每日施用伊贝扎波尔司他后2小时和4小时抽取血浆水平。在基线处和接受伊贝扎波尔司他的第1-10天每天收集粪便样品。血浆和粪便浓度由阿尔塔科学公司(AltaSciences)(加拿大魁北克省拉瓦尔市(Laval,Quebec,Canada))测定，并且PK分析由学习和认证有限公司(Learn and Confirm Inc.)(加拿大魁北克省蒙特利尔市(Montreal,Quebec,Canada))进行。

微生物学

粪便样品在37℃的选择性环丝氨酸-头孢西丁(cycloserine-cefoxitin)果糖琼脂(CCFA)上，在厌氧条件下培养艰难梭菌48小时。(冈萨雷斯-卢娜)。基于生长和形态确定分离物是艰难梭菌，并且通过艰难梭菌毒素和tpi基因的PCR进行证实。艰难梭菌使用如前所述的基于PCR的核糖体分型方法进行菌株分型。(冈萨雷斯-卢娜AJ,卡尔森TJ(CarlsonTJ),多特森KM(Dotson KM)等人2011年至2018年德克萨斯州艰难梭菌的PCR核糖体分型，包含核糖体分型255的出现(PCR ribotypes of Clostridioides difficile across Texasfrom 2011 to 2018 including emergence of ribotype 255).新兴微生物与感染(EmergMicrobes Infect)2020；9(1):341-7。)在0.1％牛磺胆酸钠脑心输注(BHI)培养基中，通过肉汤微量稀释法测定了伊贝扎波尔司他的最小抑制浓度(MIC)。(贝古姆K(Begum K),贝塞斯E(Basseres E),米兰达J(Miranda J)等人新型四环素类似物甲苯磺酸奥玛环素的体外活性以及其对艰难梭菌的比较(In Vitro Activity of Omadacycline,a NewTetracycline Analog,and Comparators against Clostridioides difficile).抗微生物剂与化疗(Antimicrob Agents Chemother)2020；64(8)。)

微生物组和胆汁酸评估

用于微生物组分析的粪便样品在伊贝扎波尔司他给药期间以及EOT后第2、10、20和28天每天收集。根据说明书，通过Qiagen DNeasy PowerSoil Pro试剂盒(凯杰公司，目录号12888-100)在QIAcube自动化DNA提取系统(凯杰公司)进行粪便DNA提取。通过使用MiSeq系统(美国加利福尼亚圣迭戈的因美纳公司(Illumina,San Diego,CA,USA))对16S rRNA基因的V1-V3区进行测序来进行微生物组表征。(弗多士DW(Fadrosh DW),马B(Ma B),盖杰P(Gajer P)等人Illumina MiSeq平台上多路复用16S rRNA基因测序的改进双索引方法(Animproved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing onthe Illumina MiSeq platform).微生物组(Microbiome)2014；2(1):6；沃克JN(WalkerJN),汉森BM(Hanson BM),平克纳CL(Pinkner CL)等人乳腺植入物和假体周围组织的微生物组在乳腺植入物相关间变性大细胞淋巴瘤中的见解(Insights into the Microbiomeof Breast Implants and Periprosthetic Tissue in Breast Implant-AssociatedAnaplastic Large Cell Lymphoma).科学报告(Sci Rep)2019；9(1):10393。)使用条形码引物扩增每个样品，产生标记在每个单独样品文库上的唯一序列标识符。基因组DNA(gDNA)在PCR前进行归一化，并且PCR产物在汇集前进行归一化。基于Illumina的测序每个样品产生>15,000个读段。胆汁酸使用靶向液相色谱法质谱法(LC-MS)分析进行定量，所述分析在QTRAP 5500质谱仪(美国马萨诸塞州弗雷明汉的爱博才思公司)上进行，所述质谱仪改编自先前描述的方法。(谢勒M,涅乌奇C(Gnewuch C),施米茨G(Schmitz G),利布赫G(LiebischG).通过液相色谱法-串联质谱法快速定量血清中的胆汁酸以及其缀合物色谱法分析B：技术生物生命科学杂志2009；877(30):3920-5。)胆汁酸水平通过对应的粪便样品重量进行归一化。

功效评估

主要功效结果量度是EOT时的临床治愈，其定义为在EOT前24小时时段内腹泻消退，并且在EOT后维持至少48小时。SCC被定义为EOT后28(±2)天内CDI无复发的临床治愈。

统计分析

对接受至少一个剂量的伊贝扎波尔司他的患者进行了意向治疗分析。使用SAS9.4版软件(美国北卡罗来纳州凯里的赛仕软件公司(SAS Institute,Inc Cary,NC,USA))计算功效、安全性/耐受性和PK数据的描述性统计。使用R软件4.1.1版(奥地利维也纳的R核心团队2021(R Core Team 2021,Vienna,Austria))编制微生物组汇总图和数据可视化。(R核心团队(2013).R：一种用于统计计算的语言和环境(R:A language and environmentfor statistical computing).R统计计算基金会(R Foundation for StatisticalComputing),奥地利维也纳。)使用VeganR软件包2.4-2版，使用香农多样性指数和反向辛普森指数评估每个样品的α多样性。使用线性回归模型比较基线处α多样性(香农多样性和反向辛普森指数)和胆汁酸与疗法期间或疗法后的差异。使用线性回归模型计算细菌分类群在10天给药间隔内的比例变化，所述模型适用于在研究时间时段内比例变化至少为百分之一的分类群。p值<0.05被认为是显著的。

2a期临床试验的结果：

2a期数据显示出在用伊贝扎波尔司他治疗的第三天，结肠艰难梭菌已完全根除，并且在疗法期间和疗法后，观察到健康肠道微生物群、放线菌门和厚壁菌门物种过度生长。另外，数据表明，包含梭菌目分类群在内的健康微生物群的比例增加，已知所述微生物群通过7α-脱羟基通路将初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸。(睿顿JM(Ridlon JM),康DJ(Kang DJ),海尔蒙PB(Hylemon PB).人肠道细菌对胆汁盐的生物转化(Bile saltbiotransformations by human intestinal bacteria).脂质研究杂志(J Lipid Res)2006；47(2):241-59)。这些数据显示，在伊贝扎波尔司他疗法期间和之后，次级胆汁酸的浓度增加，这与对艰难梭菌的定殖耐药性相关。另外，初级胆汁酸的减少和次级与初级胆汁酸的比率的有利增加表明，与万古霉素相比，伊贝扎波尔司他可以降低CDI复发的可能性。

患者

纳入了十位年龄为49(±15)岁的患者(50％为女性；100％为白色人种；80％为西班牙裔或拉丁裔)。所有十位患者均接受了伊贝扎波尔司他并完成了研究。疗法开始前24小时内未成形排便的中位次数是4(范围：3-10)。10位患者中有两位在开始使用伊贝扎波尔司他之前接受了<24小时的抗生素(甲硝唑或万古霉素)。在纳入之前或之后没有患者住院。

安全性

AE的汇总在表4中提供。10位患者中有4位报告了七例AE，其中4例发生在一位单独的受试者身上。这些事件都不是严重AE。AE的严重程度是轻度(n＝2)、中度(n＝4)和重度(n＝1；与药物无关的偏头痛)。最常见的AE是头痛(n＝2)或恶心(n＝2)；研究人员认为这两例恶心都与研究药物‘大概相关’。这些AE不需要治疗，并且不需要改变研究药物时间表或停止给药。研究结束时，所有AE均消退。

PK结果

给药后二至四小时的伊贝扎波尔司他血浆水平范围是233至578ng/mL，与给药后2小时的时间时段(范围：234-299ng/mL)相比，给药后4小时的时间时段观察到较高的浓度(范围：373-578ng/mL)。在疗法的第3天，伊贝扎波尔司他粪便浓度平均为416±494μg/g粪便，并且在疗法的第8-10天增加到>1,000μg/g粪便。EOT后两天的平均浓度是535±748μg/g粪便。在第38天收集的4个粪便样品中有三个继续具有可检测到的伊贝扎波尔司他粪便浓度(136±161μg/g粪便)。全粪便和血浆PK数据在图10中示出。伊贝扎波尔司他实现了不超过1ug/mL的粪便浓度和血浆浓度。

微生物学结果

七个基线粪便样品可用于微生物学研究，其中6个(86％)生长出产毒艰难梭菌。来自所有其它采样日的粪便样品(范围7-9个样品/天)没有生长艰难梭菌。已鉴定的核糖体分型包含F078-126(n＝2)、F014-020(n＝2)、F106(n＝1)和FP435(n＝1)。伊贝扎波尔司他MIC是0.25(n＝1)、0.5(n＝3)或1.0(n＝1)ug/mL。

微生物组和胆汁酸结果

在使用反向辛普森和香农指数的基线样品中注意到，α多样性迅速增加(图12)。与基线相比，在伊贝扎波尔司他疗法期间，反向辛普森指数多样性增加了0.14±0.056点(p＝0.017)，并且在EOT后增加了0.22±0.10点(p＝0.0033)。

使用香农多样性指数观察到类似的结果；与基线相比，在伊贝扎波尔司他疗法期间，多样性增加了0.98±0.48点(p＝0.049)，并且在疗法完成后增加了1.7±0.87点(p＝0.043)。伊贝扎波尔司他疗法期间和之后的分类群变化在图13中示出。观察到拟杆菌门的比例减少(-10.0±4.8％；p＝0.043)，最常见的原因是拟杆菌纲分类群(-10.0±4.8％)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae family)分类群(-8.8±4.8％)的比例减少。厚壁菌门的比例增加(+14.7±5.4％；p＝0.009)，最常见的原因是毛螺菌科(+12.7±6.0％)和疣微菌科(+2.8±2.7％)的比例增加。其它厚壁菌门的比例减少，最显著的是芽孢杆菌目(Bacillales)(-4.4±2.3％)和乳杆菌目(-3.7±2.2％)分类群。个别患者的丰度表在图15中示出。

胆汁酸分析的结果在图14中示出。与基线相比，疗法期间粪便中的总初级酸减少了40.1±9.6ng/mg粪便(p＝0.0002)，并且疗法结束后粪便中的总初级酸减少了40.5±14.1ng/mg粪便(p＝0.0066)。与基线相比，总次级胆汁酸在疗法期间增加了65.6±146.7ng/mg粪便(p＝0.66)，并且在疗法结束后增加了97.5±215.4ng/mg粪便(p＝0.65)。

表4.接受伊贝扎波尔司他的CDI患者的不良事件

Claims (10)

1.一种同时治疗艰难梭菌感染并降低受试者的艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发的方法，所述方法包括向遭受艰难梭菌感染的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他，其中所述有效量的伊贝扎波尔司他的所述施用同时治疗所述艰难梭菌感染并在90天内降低艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发。

2.根据权利要求1所述的方法，其中继续伊贝扎波尔司他的所述施用，直到实现所述艰难梭菌感染的临床治愈。

3.根据权利要求1所述的方法，其中当实现所述艰难梭菌感染的临床治愈时，终止伊贝扎波尔司他的所述施用。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效量的伊贝扎波尔司他的所述施用在30天内降低艰难梭菌感染的复发的可能性或预防所述复发。

5.一种促进遭受艰难梭菌感染的受试者体内的放线菌门的生长的方法，所述方法包括施用有效量的伊贝扎波尔司他以治疗或预防所述艰难梭菌感染，

其中所述受试者的肠道微生物组中的放线菌门的量增加，或与变形菌门相比放线菌门的比例增加。

6.根据权利要求5所述的方法，其中继续伊贝扎波尔司他的所述施用，直到实现所述艰难梭菌感染的临床治愈。

7.根据权利要求5所述的方法，其中当实现所述艰难梭菌感染的临床治愈时，终止伊贝扎波尔司他的所述施用。

8.一种改善肠道微生物组的健康的方法，所述方法包括

向遭受艰难梭菌感染的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他

其中与所述伊贝扎波尔司他的所述施用之前所述受试者的肠道微生物组相比，所述受试者的肠道微生物组中的细菌门的比例被调节到更健康的平衡。

9.一种增加肠道微生物组中的放线菌门的量的方法，所述方法包括

向有需要的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他

其中与所述伊贝扎波尔司他的所述施用之前所述肠道微生物组中的放线菌门的量相比，所述肠道微生物组中的放线菌门的量更高。

10.一种改善肠道微生物组的健康的方法，所述方法包括

向有需要的受试者施用有效量的伊贝扎波尔司他

其中与所述伊贝扎波尔司他的所述施用之前所述受试者的肠道微生物组相比，所述受试者的肠道微生物组中的细菌门的比例被调节到更健康的平衡。