CN117797263A - 一种药物组合物、药物和用途 - Google Patents

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CN117797263A CN202311656654.5A CN202311656654A CN117797263A CN 117797263 A CN117797263 A CN 117797263A CN 202311656654 A CN202311656654 A CN 202311656654A CN 117797263 A CN117797263 A CN 117797263A
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马静云
高龙
赵晓亚
梁爽爽
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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种药物组合物，包括：溶瘤病毒和STING激动剂，其中，所述溶瘤病毒为SVA病毒。该药物组合物将STING激动剂和SVA协同使用激活I型IFN通路，作为桥梁介导固有免疫进一步激活抗瘤的获得性免疫，并通过SVA逆转STING的双向效应，发挥机体系统性的抗瘤免疫效应，进而提升肿瘤治疗效果；同时，SVA联合STING激动剂使用组出现了增效减毒的协同效应，在肿瘤中联合使用组增强了病毒在瘤内的持续复制提高了病毒的增殖滴度，而在心、肝、脾、肺、肾等重要脏器以及机体循环系统中反而抑制了病毒复制沉积，显示了该疗法具有良好的安全性和有效性。同时，本发明还提供了基于该组合物的药物和用途。

Description

一种药物组合物、药物和用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种药物组合物、药物和用途。
背景技术
肿瘤疾病是世界上除心血管疾病以为的第二大致死性疾病，据世界卫生组织国际癌症研究机构(IACR)2020年全球癌症负担数据可知，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中死亡病例996万例。预计2040年全球新发癌症病例将达到3000万例，肿瘤疾病已经成为最重要的公共卫生事件之一。
以皮肤黑色素瘤为例，皮肤黑色素瘤起源于皮肤基底层的黑色素细胞，是高度侵袭性的皮肤癌类型，其发病率不断增加，晚期或转移性黑色素瘤患者的预后差。并且黑色素瘤的死亡率极高，约75％的皮肤癌死亡由恶性黑色素瘤引起。晚期无法切除或转移性黑色素瘤的治疗难度大、方式复杂，由于存在多基因通路突变，黑色素瘤的可塑性和异质性极强，其对于常规化疗反应差，主要依靠靶向治疗及免疫治疗。
溶瘤病毒属于肿瘤免疫疗法的一种是治疗肿瘤的新策略之一。能够特异的在肿瘤细胞内增殖不杀伤正常细胞，通过诱导肿瘤细胞凋亡、裂解发挥直接杀伤肿瘤细胞的作用。由于肿瘤细胞表面MHC分子表达量下调以及TME的抑炎微环境限制了肿瘤适应性免疫的作用，溶瘤病毒还能通过裂解肿瘤细胞释放瘤内抗原破坏肿瘤冷免疫微环境促进机体免疫机能发挥效应。因此，现多使用溶瘤病毒疗法与其他免疫疗法或传统放化疗以及分子靶向药进行联合用药增强其抗瘤效应。
溶瘤病毒并非一种病毒，而是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，世界上最早出现溶瘤病毒的报道，是由于当时发现一名子宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后，肿瘤随之消退。
现在已有许多不同类型病毒被用于溶瘤病毒的开发，如腺病毒(AdV)、单纯疱疹病毒(HSV)、牛痘病毒(VV)、呼肠孤病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒(MeV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、柯萨奇病毒(CV)、犬传染性肝炎(CAV)、伪狂犬病病毒(PRV)等；
关于溶瘤病毒和其他药物的协同使用可见如下现有技术：
现有技术1：CN201780062582.8公开了药物递送组合物及其用途，其进一步公开了所述药物递送组合物包含生物材料和先天免疫应答的激活剂；
其进一步公开了所述组合物包含水凝胶和干扰素基因(STING)激动剂的刺激因子；
其进一步公开了还包含溶瘤病毒、放射性同位素、化疗剂或其组合。
其进一步公开了溶瘤病毒包括但不限于单纯疱疹病毒(例如，HSV1716、OncoVexGM-CSF)；腺病毒(例如，H101、Onyx-15)；脊髓灰质炎病毒(例如，PV1(RIPO))；呼肠孤病毒(例如，reolysin)；塞内卡病毒(例如，NTX-010、SVV-001)；Rigvir病毒；马拉巴病毒；麻疹；新城疫病毒；牛痘或ECHO病毒；
在该方案中，其说明书明确记载：免疫治疗剂的定位递送可以通过将药物的作用集中在所需要之处来提高有效性；其说明，其有效性的发挥离不开水凝胶，当缺失了水凝胶后，其有效性将会明显降低。
同时其说明书记载，其STING激动剂为2′3′-cGAMP)；STING-RR＝
2′3′-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)；这两种激动剂都是一代STING激动剂；在本发明的深入研究中发现，一代STING激动剂无法和SVA病毒产生强烈的内协同；
一代激动剂是一种环状DNA分子，完全是通过cGAS感受器的作用原理进行研发。化学本质是一种环状核苷酸。在验证过程中发现，类cGAS感受器激活的药物无法和SVA病毒产生协同性。
本申请人于2023年提出一项新的专利申请CN116059260A，公开了SVA病毒在制备肿瘤防治药物中的应用及抗肿瘤组合物，该方案公开了两方面内容，第一方面公开了SVA病毒在制备抑制肿瘤细胞P13K信号通路的药物中的应用，第二方面公开了采用SVA病毒和CDK4/6抑制剂组成抗肿瘤组合物。
其抗肿瘤的机理在于利用天然SVA病毒具有抑制P13K信号通路的特性，当其与CDK4/6抑制剂联合使用时，可提高CDK4/6抑制剂针对Ishikawa肿瘤细胞的杀伤效应。
SVA(塞内卡病毒)是2002年新发的一种小核糖核酸病毒，其具体序列可见GenBank:KT321458.1，该病毒可选择性引起肿瘤细胞裂解杀伤而不损害正常组织细胞且相比于其他溶瘤病毒，SVA具备体积小、复制迅速、可穿透实体瘤的血管系统等多种优越特性。有临床前研究显示，SVA可有效杀死多实体瘤细胞，而且SVA不感染人类，这使该病毒具有了作为病毒治疗药物的安全性。本实验室独立分离发现的该毒株具有激活肿瘤细胞系I型IFN通路的独特作用。但在溶瘤病毒应用领域，病毒使用的安全性和有效性是一个关键问题。前期研究发现，溶瘤病毒在体内多器官有扩散沉积现象，虽然不会造成严重的病理反应但也具有一定的安全隐患。同时在肿瘤微环境中病毒会被快速耗竭，复制滴度也相对偏低，极大的影响了溶瘤病毒对肿瘤的治疗效果并增加了治疗成本。
所以，本案解决的技术问题是：如何解决STING激动剂单药使用无法有效激活机体抑瘤免疫效应以及SVA溶瘤病毒在体内其他脏器沉积而在瘤内快速耗竭的相关问题，如何实现SVA病毒协同STING激动剂发挥增效减毒的核心作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药物组合物，该药物组合物将二代STING激动剂和SVA协同使用激活I型IFN通路，作为桥梁介导固有免疫进一步激活抗瘤的获得性免疫，并通过SVA逆转STING的双向效应，发挥机体系统性的抗瘤免疫效应，进而提升肿瘤治疗效果；同时，SVA联合二代STING激动剂使用组出现了增效减毒的协同效应在肿瘤中联合使用组增强了病毒在瘤内的持续复制提高了病毒的增殖滴度，而在心、肝、脾、肺、肾等重要脏器以及机体循环系统中反而抑制了病毒复制沉积，显示了该疗法具有良好的安全性和有效性。
同时，本发明还提供了基于该组合物的药物和用途。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种药物组合物，包括溶瘤病毒和二代STING激动剂，其中，所述溶瘤病毒为SVA病毒。
在上述的药物组合物中，由溶瘤病毒和二代STING激动剂组成。
在上述的药物组合物中，所述药物组合物以SVA病毒和二代STING激动剂的混合物的形式存在，或，所述药物组合物以SVA病毒和二代STING激动剂单独保存的形式存在。
在上述的药物组合物中，所述SVA病毒和二代STING激动剂的用量的体积比为1:1；其中，SVA病毒的浓度为108/mL，二代STING激动剂的浓度为750μg/100μL。
在上述的药物组合物中，所述二代STING激动剂为MSA-2、ADU-S100、SR-717、E7766、MK1454、TAK-676中的一种或多种。
同时，本发明还公开了一种药物，含有如上任一所述的药物组合物。
在上述的药物中，还含有药学上可接受的载体；所述药物组合物中的SVA病毒和二代STING激动剂以混合物的形式存在于载体内或载体表面；或，所述药物组合物中的SVA病毒和二代STING激动剂各自独立的存在于两份独立的载体中。
在上述的药物中，所述药物的剂型为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或滴剂。
同时，本发明还公开了采用如上任一所述的药物组合物制备抗肿瘤药物的用途。
在上述的用途中，所述抗肿瘤药物的作用对象为人和/或动物；
和/或，所述抗肿瘤药物作用的肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、膀胱癌、口腔鳞状细胞癌中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次发现了天然SVA病毒具有联合STING激动剂协同强激活肿瘤细胞I型干扰素的释放，同时激活以CD8+T细胞和细胞为核心的系统性抗瘤免疫反应，提升了在肿瘤治疗上的有益效果，显示了在肿瘤治疗领域良好的应用前景。而且，在小鼠安全性实验中，SVA联合STING激动剂使用组出现了增效减毒的协同效应在肿瘤中联合使用组增强了病毒在瘤内的持续复制提高了病毒的增殖滴度，而在心、肝、脾、肺、肾等重要脏器以及机体循环系统中反而抑制了病毒复制沉积，显示了该疗法具有良好的安全性和有效性。
附图说明
图1A为实施例一中，关于SVA病毒的不同实验组的细胞实验的IFN-β蛋白表达量图；
图1B为实施例一中，关于PRV病毒的不同实验组的细胞实验的IFN-β蛋白表达量图；
图1C为实施例一中，关于CAV病毒的不同实验组的细胞实验的IFN-β蛋白表达量图；
图1D为实施例一中，关于CAV病毒的不同实验组的细胞实验的CCL-5蛋白表达量图；
图1E为实施例一中，关于PRV病毒的不同实验组的细胞实验的CCL-5蛋白表达量图；
图1F为实施例一中，关于CAV病毒的不同实验组的细胞实验的CCL-5蛋白表达量图；
图1G为实施例二中，不同实验组在Ishikawa细胞系上IFN-β蛋白表达量(图右)、CCL-5蛋白表达量(图左)图；
图1H为实施例二中，不同实验组在MC 38细胞系上IFN-β蛋白表达量(图右)、CCL-5蛋白表达量(图左)图；
图1I为实施例二中，不同实验组在EMT 6细胞系上IFN-β蛋白表达量(图右)、CCL-5蛋白表达量(图左)图；
图1J为实施例二中，不同实验组在PAN 02细胞系上IFN-β蛋白表达量(图右)、CCL-5蛋白表达量(图左)图；
图1K为实施例二中，不同实验组在CT 26细胞系上IFN-β蛋白表达量(图右)、CCL-5蛋白表达量(图左)图；
图1L为实施例二中，不同实验组在B16细胞系上IFN-β蛋白表达量(图右)、CCL-5蛋白表达量(图左)图；
图2A为实施例二中，不同实验组在Ishikawa细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2B为实施例二中，不同实验组在EMT 6细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2C为实施例二中，不同实验组在CT 26细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2D为实施例二中，不同实验组在MC 38细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2E为实施例二中，不同实验组在PAN 02细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2F为实施例二中，不同实验组在B16细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2G为实施例二中，不同实验组在BHK细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图2H为实施例二中，不同实验组在ST细胞系上在强上调IFNβ时，VP1蛋白的表达量图；
图3A为实施例三中，B16-F10细胞系中RIG表达量和时间的关系图；
图3B为实施例三中，B16-F10细胞系中MDA5表达量和时间的关系图；
图3C为实施例三中，B16-F10细胞系中TBK1表达量和时间的关系图；
图3D为实施例三中，B16-F10细胞系中IRF7表达量和时间的关系图；
图3E为实施例三中，B16-F10细胞系中IFNβ表达量和时间的关系图；
图3F为实施例三中，B16-F10细胞系中CXCL 10表达量和时间的关系图；
图3G为实施例三中，Pan02细胞系中RIG表达量和时间的关系图；
图3H为实施例三中，Pan02细胞系中MDA5表达量和时间的关系图；
图3I为实施例三中，Pan02细胞系中TBK1表达量和时间的关系图；
图3J为实施例三中，Pan02细胞系中IRF7表达量和时间的关系图；
图3K为实施例三中，Pan02细胞系中IFNβ表达量和时间的关系图；
图3L为实施例三中，Pan02细胞系中CXCL 10表达量和时间的关系图；
图4A为实施例四中，不同实验组的MC38细胞系作用于小鼠后，不同时间的肿瘤体积趋势图；
图4B为实施例四中，不同实验组的MC38细胞系作用于小鼠后，不同时间的小鼠体重趋势图；
图4C为实施例四中，不同实验组的PAN02细胞系作用于小鼠后，不同时间的肿瘤体积趋势图；
图4D是图4C的数据放大图；
图4E为实施例四中，不同实验组的PAN02细胞系作用于小鼠后，不同时间的小鼠体重趋势图；
图4F是为实施例四中，实验结束时不同实验组的肿瘤的重量柱状图；
图4G为实施例四中，PAN02细胞系作用于小鼠后，不同实验组在不同时间的肿瘤的状态图；
图4H为实施例四中，B16-F10细胞系作用于小鼠后，不同时间的小鼠体重趋势图；
图4I是不同实验组最后的肿瘤的重量柱状图；
图4J为实施例四中，B16-F10细胞系作用于小鼠后，不同实验组在不同时间的肿瘤的状态图；
图4K为实施例四中，B16-F10细胞系作用于小鼠后，STING激动剂组1、协同组1以及SVA组在不同时间的肿瘤体积变化图；
图4L为实施例四中，B16-F10细胞系作用于小鼠后，STING激动剂组2、协同组2以及SVA组不同时间的肿瘤体积变化图；
图4M为实施例四中，B16-F10细胞系作用于小鼠后，STING激动剂组3、协同组3以及SVA组不同时间的肿瘤体积变化图；
图4N是B16-F10细胞系作用于小鼠后，对照组、STING激动剂组3、SVA组、协同组3的小鼠的肿瘤体内呈像图；
图5A为实施例五中，PAN 02细胞系作用于小鼠后，不同实验组在不同组织上的病毒复制量柱状图；
图5B为实施例五中，B 16细胞系作用于小鼠后，不同实验组在不同组织上的病毒复制量柱状图；
图6A为实施例六中，不同实验组的脾脏组织的CD86+DC细胞数量百分比图表；
图6B为实施例六中，不同实验组的脾脏组织的M1细胞数量百分比图表；
图6C为实施例六中，不同实验组的脾脏组织的MHCII+CD11C+DC细胞数量百分比图表；
图6D为实施例六中，不同实验组的脾脏组织的MHCII+CD11C+DC细胞数量百分比图表；分别为NC组、MSA-2以250、500、750μg的量加入的实验组、SVA组(100ul)、SVA+不同用量的MSA-2的协同组，协同组中SVA用量为(50ul)；
图6E为实施例六中，不同实验组的脾脏组织的NK1.1+GZMB+NK细胞数量百分比图表；
图7A为实施例六中，总CD8+T细胞在各实验组所占比例；
图7B为实施例六中，激活型CD8+T细胞在各实验组所占比例；
图7C为实施例六中，总CD4+T细胞与总CD8+T细胞在各实验组的比值；
图7D为实施例六中，总CD8+T细胞在治疗后9h与7天时在各实验组所占比例随时间变化情况；
图7E为实施例六中，激活型CD8+T细胞在各实验组所占总CD8+T细胞的比例；
图7F为总CD4+T细胞与总CD8+T细胞在各实验组的比值在治疗后9h与7天时在各实验组变化情况
图7G为实施例六中，γδT细胞在各实验组所占比例
图7H为实施例六中，γδT细胞在治疗后9h与7天时在各实验组所占比例随时间变化情况
图8A为对比例一中，一代STING激动剂结合SVA协同作用时对A72细胞中IFNβ表达的影响；
图8B为对比例一中，一代STING激动剂结合SVA协同作用时对4T1细胞中IFNβ表达的影响；
图9为对比例2中，不同实验组中肿瘤体积变化趋势图；
图10为二代STING激动剂和STING结合的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：SVA、PRV、CAV联合STING激动剂在A72细胞系中对I型IFN表达的影响检测
材料：A72细胞系(ATCC)，实验室独立分离保存SVA病毒(GenBank:KT321458.1)，CAV病毒(犬腺状病毒，NCBI:AC_000020.1)，PRV病毒(伪狂犬病病毒，NCBI:OL639029.1)，MSA-2(MCE，二代STING激动剂)，TRIzol Reagent(Takara)，All-in-One First-StrandSynthesis Master Mix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，2×SYBR Green qPCR Premix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，Anti-mouse-IFN-β(Sangon Biotech)，Anti-mouse-CCL5(Sangon Biotech)；
SVA病毒可通过人工合成的方式获得：具体包括如下步骤：
步骤1：病毒核酸获得：根据病毒全基因组序列进行人工合成，获得病毒全基因组序列质粒。
步骤2：转染拯救：使用Lipo3000将病毒核酸转染BHK细胞系，48h后冻融三次回收病毒液，盲传五代后即可获得病毒粒子。
本实施例的具体实验方法为：
方法：取对数生长期的A72细胞，消化计数后铺于12孔板中，于37℃的CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后进行SVA病毒(MOI＝1，SVA病毒和细胞个数比例为1:1)联合MSA-2(10～50μmol/孔)的处理。将混有不同剂量的MSA-2以及SVA的培养基接种于培养板中，每组3个重复，对照组为完全培养基，后置于37℃的CO2培养箱中培养不同时间后收样,提取核酸并进行反转录,然后采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix进行荧光定量RT-PCR检测IFN-β蛋白以及CCL5蛋白的基因表达情况，以此评估I型IFN反应是否被激活,以及SVA的复制是否受到影响。
参考图1A，M10是指单用MSA-2，浓度10μmol/孔，以此类推，M30是指单用MSA-2，浓度30μmol/孔；SM10是指SVA(MOI＝1)和MSA-2(10μmol/孔)联用；
通过图1A可见，IFN-β蛋白在MSA-2单用时，表达增加不超过2；FN-β蛋白在单用SVA时，表达增加大约为20；当SVA和MSA-2联用时，IFN-β蛋白表达增加最大超过30；这说明当SVA和MSA-2联用时，可上调胞内IFNβ的表达；
对应的图1B和图1C(图1B和图1C中，PM10代表PRV(MOI＝1)和MSA-2(10μmol/孔)联用；CM10代表CAV(MOI＝1)和MSA-2(10μmol/孔)联用，其余数字以此类推)中，这种表达上调仅为个位数；并且在图1B中，单用PRV和联用方式没有实质性区别；在图1C中，单用PRV比联用方式也无实质性差异，甚至比CM10和CM50的表达量要高；
通过图1D可见，单用MSA-2与NC例无差别；SM10、SM30和SVA单用模式无明显差异，但是SM50相比SVA单用模式增效为7左右；这说明，CCL5(趋化因子，一种细胞因子，由多种免疫细胞产生)的表达在SVA和MSA-2的联用中表现出协同性；
在图1E和图1F中，PRV、CAV和MSA-2的联用中并未表现出任何协同性。在绝大部分案例中还表现出减弱趋势。
结果：如图1A至图1F可知，只有实验室保存的SVA能够协同STING激动剂上调胞内IFNβ的表达，CAV、PRV均不能发挥协同STING激动剂上调IFNβ的作用。
实施例二
SVA协同STING激动剂在多种肿瘤细胞中对I型IFN以及自身复制影响检测
材料：Ishikawa、MC38、EMT6、Pan02、CT26、B16-F10细胞系(ATCC)，实验室独立分离保存SVA病毒(GenBank:KT321458.1)，MSA-2(MCE)，TRIzol Reagent(Takara)，All-in-OneFirst-Strand Synthesis Master Mix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，2×SYBR GreenqPCR Premix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，Anti-mouse-IFN-β(Sangon Biotech)，Anti-mouse-CCL5(Sangon Biotech)
方法：取对数生长期的Ishikawa、MC38、EMT6、Pan02、CT26、B16-F10、4T1、MB49细胞，消化计数后铺于12孔板中，于37℃的CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后进行SVA联合MSA-2的处理。将混有不同剂量的MSA-2以及SVA的培养基接种于培养板中，每组3个重复，对照组为完全培养基，后置于37℃的CO2培养箱中培养不同时间后收样,提取核酸并进行反转录,然后采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix进行荧光定量RT-PCR检测IFN-β蛋白、CCL5蛋白以及病毒VP1的基因表达情况，以此评估I型IFN反应是否被激活,以及SVA的复制是否受到影响。
图1G至图1L、图2A至图2H中，横坐标中MSA-2(μM)以及数字代表每孔中加入MSA-2的量；横坐标中SVA栏中“+”代表在孔中有加入SVA(MOI＝1)，“-”代表在孔中没有加SVA；
结果：从图1G至图1L中可知，SVA联合STING激动剂在黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤细胞系上均能广泛发挥一种协同激活IFNβ和CCL5的刺激效应。
从图2A至图2H中可知，SVA联合STING激动剂在黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤细胞系上在强上调IFNβ时并没有受到干扰素抗病毒的影响，该病毒所表达的VP1蛋白并未表现出降低，说明没有降低病毒复制增殖的滴度。在部分肿瘤细胞中有反向促进病毒增殖的趋势。在非肿瘤细胞系ST的联合使用组中，SVA的复制受到了抑制。该实验体现了SVA与STING激动剂联合使用组具有增效减毒的潜在优势。
实施例三
SVA协同STING激动剂在多种肿瘤细胞中通过以RIG-MDA5-TBK1-IRF7通路为核心上调I型IFN
材料：Pan02、B16-F10细胞系(ATCC)，实验室独立分离保存SVA病毒(GenBank:KT321458.1)，MSA-2(MCE)，TRIzol Reagent(Takara)，All-in-One First-StrandSynthesis Master Mix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，2×SYBR Green qPCR Premix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，抗体Anti-mouse-IFN-β、Anti-mouse-RIG、Anti-mouse-MDA5、Anti-mouse-TBK1、Anti-mouse-IRF、Anti-mouse-CXCL10(Sangon Biotech)。
方法：取对数生长期的Pan02、B16-F10细胞，消化计数后铺于12孔板中，于37℃的CO2培养箱中培养24h，待细胞(图3A至图3F为B16-F10细胞系，图3G至图3L为Pan02细胞系)贴壁后进行SVA联合MSA-2的处理。将混有不同剂量的MSA-2以及SVA的培养基接种于培养板中，每组3个重复，对照组为完全培养基，后置于37℃的CO2为5％的培养箱中培养不同时间后收样,提取核酸并进行反转录,然后采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix进行荧光定量RT-PCR检测上述6个基因表达情况，以此评估I型IFN反应通路相关基因是否被激活。
图3A至图3F为B16-F10细胞系中，SVA和/或SMA-2在实验中相关抗体(抗体Anti-mouse-IFN-β、Anti-mouse-RIG、Anti-mouse-MDA5、Anti-mouse-TBK1、Anti-mouse-IRF、Anti-mouse-CXCL10(Sangon Biotech))的表达；
图3G至图3L为Pan02细胞系中，SVA和/或SMA-2在实验中相关抗体(抗体Anti-mouse-IFN-β、Anti-mouse-RIG、Anti-mouse-MDA5、Anti-mouse-TBK1、Anti-mouse-IRF、Anti-mouse-CXCL10(Sangon Biotech))的表达；
图3A至图3L中，图标中50μM代表每孔中加入MSA-2的量；SVA的加入量为MOI＝1；
结果：从2图中可知，以黑色素瘤和胰腺癌为模型，SVA联合STING激动剂协同上调了IFNβ上游RIG-MDA5-TBK1-IRF7通路各个关键节点的基因表达量。
实施例四：SVA协同STING激动剂在多种荷瘤小鼠模型中抑瘤效应检测
材料：MC38、Pan02、B16-F10细胞系(ATCC)，实验室独立分离保存SVA病毒(GenBank:KT321458.1)，MSA-2(MCE)，SPF级C57小鼠(百视通)。
方法：取体重相近的C57BL/6小鼠在day 7，采用皮下注射方式，将MC38、Pan02、B16-F10细胞(106/0.1mL/只)注射至小鼠腋窝中部外侧皮下。每日观察肿瘤长势，大约1周左右成瘤；在接种后7天左右，每两天测定一下肿瘤体积，当肿瘤体积达到100～200mm3之间时，挑选肿瘤大小大致一致的小鼠进行后续实验。
对于MC38组和Pan02组，均分别将荷瘤小鼠分为四组(n＝15)，分别是对照组(DMSO)、SVA组(100μL，108/mL)、STING激动剂组(注射量100μL，内含750μg)和SVA(50μL，108/mL)与STING激动剂(注射量50μL，内含375μg)协同组。进行瘤内注射治疗，隔天治疗，共2次。对小鼠进行体重及肿瘤体积监测，当对照组肿瘤达到最大允许尺寸2000mm3，处死小鼠。并解剖取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，用于实施例四部分的检测。
对于B16-F10组，需要将小鼠分为八组(n＝15)，分别为对照组(DMSO)、SVA组(100μL，108/mL)、STING激动剂组1(注射量100μL，内含250μg)、STING激动剂组2(注射量100μL，内含500μg)、STING激动剂组3(注射量100μL，内含750μg)、协同组1(SVA(50μL，108/mL)+STING激动剂(注射量50μL，内含125μg)、协同组2(SVA(50μL，108/mL)+STING激动剂(注射量50μL，内含250μg)、协同组3(SVA(50μL，108/mL)+STING激动剂(注射量50μL，内含375μg)。进行瘤内注射治疗，隔天治疗，共2次。对小鼠进行体重及肿瘤体积监测，当对照组肿瘤达到最大允许尺寸2000mm3，处死小鼠。并解剖取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，用于实施例四部分的检测。
图4A代表MC38细胞系作用于小鼠后，不同时间时的肿瘤体积；图4B代表MC38细胞系作用于小鼠后，不同时间时的小鼠体重；
图4A见，肿瘤体积采用MSA-2、SVA联合治疗都明显减小；
图4B可见，采用不同的实验组，其体重都是在增加的，说明本发明的治疗方法对于小鼠生长是没有负面影响的。
图4C和图4D都是PAN02细胞系作用于小鼠后，不同时间的肿瘤体积；图4D是图4C的数据放大图；
图4E是PAN02细胞系作用于小鼠后，不同时间的小鼠体重；图4F是实验结束时不同实验组的肿瘤的重量。
图4G为PAN02细胞系作用于小鼠后，不同实验组在不同时间的肿瘤的状态；第一行为对照组(DMSO)，第二行为SVA组，第三行为STING激动剂组，第四行为SVA与STING激动剂协同组；
从图4C至图4G可见，不管是肿瘤体积还是肿瘤重量，采用MSA-2、SVA联合治疗都明显减小；
图4H是B16-F10细胞系作用于小鼠后，不同时间的小鼠重量；图4I是不同实验组最后的肿瘤的重量；图4J为B16-F10细胞系作用于小鼠后，不同实验组在不同时间的肿瘤的状态；第一行为SVA组，第二行为STING激动剂组1，第三行为STING激动剂组2；第四行为STING激动剂组3；第五行为协同组1；第六行为协同组2；第七行为协同组3；
图4K是B16-F10细胞系作用于小鼠后，STING激动剂组1、协同组1以及SVA组在不同时间的肿瘤体积；
图4L是B16-F10细胞系作用于小鼠后，STING激动剂组2、协同组2以及SVA组不同时间的肿瘤体积；
图4M是B16-F10细胞系作用于小鼠后，STING激动剂组3、协同组3以及SVA组不同时间的肿瘤体积；
图4N是B16-F10细胞系作用于小鼠后，对照组、STING激动剂组3、SVA组、协同组3的小鼠的肿瘤体内呈像图；左上为对照组，右上为SVA组，左下为STING激动剂组3，右下为协同组3；
从图4K至图4M可见，不管是肿瘤体积还是肿瘤重量，采用MSA-2、SVA联合治疗都明显减小；
结果：从图A至图4M中可知，以黑色素瘤、结直肠癌、胰腺癌为模型，SVA联合STING激动剂对荷瘤小鼠进行治疗，在联合使用组中均显著抑制了肿瘤的发展，发挥了极佳的协同效应。
实施例五：SVA协同STING激动剂在多种荷瘤小鼠模型肿瘤及各脏器中增殖复制检测
材料：Pan02、B16-F10细胞系(ATCC)，实验室独立分离保存SVA病毒(GenBank:KT321458.1)，MSA-2(MCE)，SPF级C57小鼠(百视通)，TRIzol Reagent(Takara)，All-in-OneFirst-Strand Synthesis Master Mix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，2×SYBR GreenqPCR Premix(广州欣凯莱生物技术有限公司)，Anti-mouse-sva-vp1(Sangon Biotech)
方法：取体重相近的C57BL/6和Balb/c小鼠，采用皮下注射方式，将Pan02、B16-F10细胞(106/0.1mL/只)注射至小鼠腋窝中部外侧皮下。每日观察肿瘤长势，大约1周左右成瘤；在接种后7天左右，每两天测定一下肿瘤体积，当肿瘤体积达到100～200mm3之间时，挑选肿瘤大小大致一致的小鼠进行后续实验。将荷瘤小鼠分为四个组，分别是对照组(DMSO)、SVA组(100μL，108/mL)、STING激动剂组(注射量100μL，内含750μg)和SVA(50μL，108/mL)与STING激动剂(注射量50μL，内含375μg)协同组。荷瘤后隔天对小鼠进行肿瘤体积和体重测定，待肿瘤体积长至约100mm3时进行瘤内注射治疗，隔天治疗，共2次。当对照组肿瘤达到最大允许尺寸，处死小鼠。解剖取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织进行研磨后用TRIzol提取所述细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA，使用基因特异性引物，用SYBR Green Realtime PCRMaster Mix进行定量RT-PCR。
结果：从图5A和图5B中可知，以黑色素瘤、胰腺癌为模型，SVA联合STING激动剂对荷瘤小鼠进行治疗，在单独使用SVA组中，SVA在治疗7天后出现了向健康组织的趋向尤其是心脏的沉积，虽然机体没有体现出病理变化但是也暗示存在一定的潜在风险。而在肿瘤组织中则基本被耗竭，无法再发挥一个有效溶瘤杀伤效应。在SVA联合STING激动剂的治疗组中，抑制了SVA向健康组织的趋向和沉积，抑制了SVA在机体系统中的迁移增殖。而在肿瘤中促进了病毒长期的增殖、复制，有利于病毒发挥长效的肿瘤杀伤效应。协同使用起到了极佳的增效减毒的抗瘤效果。
实施例六：SVA协同STING激动剂在黑色素瘤小鼠模型中免疫微环境变化检测
材料：苏洁超净工作台(SW-CJ-I-1FD)、细胞恒温培养箱(Thermo scientificHERACELL150i)、低速离心机(TDL-80-2B)、倒置生物学显微镜(BDS200)、流式细胞仪(BDFACSCalibur)PBS磷酸钾缓冲液、生理盐水。流式抗体：CD8-FITC、CD69-PE、NK1.1-APC、CD4-APC、GzmB、CD25-FITC、FOXP3-PE、CD19-PE、CD27、MHC-II-Percp、CD206-PE、CD11c-APC、CD80-PE、CD86-FITC、DyLight 594二抗。淋巴细胞分离液(上海华精)、固定液(BD)、破膜剂(BD)、溶血素(BD)。
方法：将脾脏组织(实施例4的实验对象)剪成小块，加1ml生理盐水轻轻研磨成匀浆液，200目筛网过滤。将过滤的组织研磨液混匀，沿管壁缓缓将组织研磨液叠加于分离液上，切勿冲散液面。组织研磨液与分离液的体积为3比2。将离心管置水平离心机中，2000r/min(≈800g)室温(20～25℃)离心20min。离心分离成功后用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸该层，置于另一离心管中。若初次分离效果不好视情况以2500r/min室温再分离10～20min。加入5倍左右的PBS，充分混匀，1000r/min离心10分钟。离心后倾弃上清液，再用PBS1000r/min离心10分钟洗一次，弃上清，500ul PBS/管重悬细胞。
图6A为不同实验组的脾脏组织的CD86+DC细胞表达量图表；
图6B为不同实验组的脾脏组织的M1细胞表达量图表；
图6C为不同实验组的脾脏组织的MHCII+CD11C+DC细胞表达量图表；
图6D为不同实验组的脾脏组织的MHCII+CD11C+DC细胞表达量图表；分别为NC组、MSA-2以250、500、750μg的量加入的实验组、SVA组(100ul)、SVA+不同用量的MSA-2的协同组，协同组中SVA用量为(50ul)；
图6E为不同实验组的脾脏组织的NK1.1+GZMB+NK细胞表达量图表；
结果：从图6中可知，在SVA联合STING激动剂治疗的小鼠中，固有免疫的DC细胞、M1型巨噬细胞、NK细胞均有一个显著上调。符合目标预期证明联合治疗组协同激活了固有免疫。
图7A为实施例六中，总CD8+T细胞在各实验组所占比例；
图7B为实施例六中，激活型CD8+T细胞在各实验组所占比例；
图7C为实施例六中，总CD4+T细胞与总CD8+T细胞在各实验组的比值；
图7D为实施例六中，总CD8+T细胞在治疗后9h与7天时在各实验组所占比例随时间变化情况；
图7E为实施例六中，激活型CD8+T细胞在各实验组所占总CD8+T细胞的比例图7F为总CD4+T细胞与总CD8+T细胞在各实验组的比值在治疗后9h与7天时在各实验组变化情况；
图7H为γδT细胞在治疗后9h与7天时在各实验组随时间所占比例变化情况；
从图7中可知，在SVA联合STING激动剂治疗的小鼠中，随着固有免疫的激活，DC细胞核巨噬细胞递呈功能的上调，机体获得性免疫出现了进一步的强上调。主要激活了CD8+T细胞和细胞为核心的抗瘤免疫效应实现了对小鼠肿瘤发展的抑制。
对比例一
本对比例主要考察一代STING激动剂是否会和SVA之间产生如上实施例所示的协同性，具体实验过程如下：
一代STING激动剂：c-di-AMP(环状二腺苷酸)；它与跨膜蛋白STING结合，从而激活TBK3-IRF3信号通路，随后触发I型干扰素和TNF的产生。c-di-AMP(环状二腺苷酸)也是一种细菌的第二信使，它调节细胞生长、存活和毒力，主要存在于革兰氏阳性细菌中，并且还调节宿主的免疫反应。
SVA病毒同实施例1；
细胞模型：A72，4T1；
实验方法：
取对数生长期的A72、4T1细胞，消化计数后分别铺于12孔板中，于37℃5％的CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后进行SVA病毒(MOI＝1，SVA病毒和细胞个数比例为1:1)联合c-di-AMP(200～800μmol/孔)的处理，最终分别配置为单药浓度为200μM、400μM、800μM及同浓度的协同用药组。进行处理后6小时后进行收样并进行IFN-β基因表达情况的鉴定(用GAPDH或β-actin作为内参基因)
实验结果参考图8A和图8B，SVA和一代STING激动剂并未表现出IFNβ的表达量上调，说明两者并不存在内部协同性。
对比例二
材料：B16-F10，实施例1所示SVA病毒，c-di-AMP(MCE)，MSA-2(MCE)，C57小鼠。
方法：将荷瘤小鼠分为六个组，分别是对照组(DMSO)、SVA组(100μL，108/mL)、MSA-2组(注射量100μL，内含750μg)，SVA(50μL，108/mL)与MSA-2(注射量100μL，内含375μg)协同组，c-di-AMP组(注射量100μL，内含40μg)和SVA(50μL，108/mL)与c-di-AMP(注射量50μL，内含20μg)协同组。荷瘤后隔天对小鼠进行肿瘤体积和体重测定，待肿瘤体积长至约100mm3时进行瘤内注射治疗，隔天治疗，共2次。当对照组肿瘤达到最大允许尺寸，处死小鼠。
结果参考图9；
图9为不同实验组中肿瘤体积变化趋势，可见仅有SVA+MSA-2的实验组表现出协同趋势。SVA+c-di-AMP协同组并未表现出任何协同性。
这也说明，仅有二代STING激动剂才能和SVA产生协同性。
通过上述的实施例和对比例1以及对比例2的对比可以得知：SVA和二代STING激动剂之间具有协同性，和一代STING激动剂之间无协同性。
其机理在于：二代STING激动剂和SVA同时存在时可以激活I型IFN通路，作为桥梁介导固有免疫进一步激活抗瘤的获得性免疫，并通过SVA逆转STING的双向效应，发挥机体系统性的抗瘤免疫效应，进而提升肿瘤治疗效果；
一代STING激动剂是一种环状DNA分子，化学本质是一种环状核苷酸，完全是模拟cGAS感受器及STING信号通路的作用原理进行研发；瘤内注射给药是其常用的方式；
二代STING激动剂根据STING的蛋白构型，直接设计化学小分子激活其作用核心，化学本质是一种小分子化合物，以具有纳摩尔亲和力的非共价二聚体形式与STING结合。
众所周知，STING需要形成二聚体才能发挥相应的生理作用。对于本领域技术人员来说，二代STING激动剂具有非常强的共性，其都能将STING二聚体锁定在闭合构象上；
以MSA-2和SR-717举例，参考图10，图10示出了MSA-2和SR-717两者和STING结合的示意图；
二代STING激动剂与STING的结合模式同天然配体cGAMP非常接近，使得STING二聚体采用相对闭合的构象，而无配体(APO)或双核酸化合物di-GMP则采用开放构象进行结合。
这种闭合构象可能是实现二代STING激动剂和SVA产生协同，激活I型IFN通路的必要条件。
通过以上分析可见一代STING激动剂和二代STING激动剂的作用机理完全不同，得到的结果完全不同，是完全两种不同的用药组合。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，包括溶瘤病毒和二代STING激动剂，其中，所述溶瘤病毒为SVA病毒。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，由溶瘤病毒和二代STING激动剂组成。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以SVA病毒和二代STING激动剂的混合物的形式存在，或，所述药物组合物以SVA病毒和二代STING激动剂单独保存的形式存在。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述SVA病毒和二代STING激动剂的用量的体积比为1:1；其中，SVA病毒的浓度为108/mL，二代STING激动剂的浓度为750μg/100μL。
5.根据权利要求1～4任一所述的药物组合物，其特征在于，所述二代STING激动剂为MSA-2、ADU-S100、SR-717、E7766、MK1454、TAK-676中的一种或多种。
6.一种药物，其特征在于，含有如权利要求1～5任一所述的药物组合物。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，还含有药学上可接受的载体；所述药物组合物中的SVA病毒和二代STING激动剂以混合物的形式存在于载体内或载体表面；或，所述药物组合物中的SVA病毒和二代STING激动剂各自独立的存在于两份独立的载体中。
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或滴剂。
9.采用如权利要求1～4任一所述的药物组合物制备抗肿瘤药物的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物的作用对象为人和/或动物；
和/或，所述抗肿瘤药物作用的肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、膀胱癌、口腔鳞状细胞癌中的一种或多种。
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