CN117771215A - 一种靶向治疗骨质疏松症的药物递送系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料及生物医药领域，具体提供一种基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统及其制备方法与应用，所述药物递送系统通过将DSPE‑PEG2000‑DGlu6功能化修饰的磷脂包覆在具药物(千层纸素A)涂层的无定形碳酸钙纳米核心上获得。本发明所述药物递送系统中的酸性多肽与骨具有很强的结合能力，增强了药物递送系统的靶向性，本发明通过PVP分子把脂溶性药物稳定吸附于无定形碳酸钙表面，提高了对酸性微环境响应性的敏感性。本发明所述药物递送系统可以在酸性病理微环境下可控释放负载的药物，进而有效抑制破骨细胞的分化与成熟，实现治疗骨质疏松症的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料和生物医药领域，具体涉及一种基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统及其制备方法与应用。
背景技术
骨质疏松症是一种常见的全身系统性的骨骼疾病，多发生于老年人群，尤其是绝经后的女性，主要表现为骨量减少、骨微结构受损和骨脆性增加。骨质疏松症是骨折的危险因素之一，可能给中老年人群带来相当大的精神和身体痛苦。据估计，全世界患有骨质疏松症的人数超过2亿，相关的医疗和社会经济影响将进一步增加。因此，骨质疏松症是一个与公共卫生和财政负担有关的重要课题。
骨质疏松症的主要生理病理特征是破骨细胞介导的骨分解代谢超过成骨细胞的骨形成作用。因此，临床上预防和治疗骨质疏松症的药物主要促进成骨细胞活性或抑制破骨细胞功能，如选择性雌激素受体调节剂、雌激素类、双膦酸盐类等。然而，这些药物长期使用会产生严重的副作用，限制药物的可用性与疗效。例如，双磷酸盐会引起罕见的非典型股骨骨折和颌骨坏死。雌激素治疗会引发一些乳腺癌和血管事件。有报道称降钙素可诱发血管症状和胃肠道症，甲状旁腺激素可引起危及生命的高钙血。因此，探索新型药物来预防或治疗骨质疏松症是很有必要的。
在亚洲国家，人们也使用传统的中医药来强化骨骼和治疗其他相关的肌肉骨骼疾病。近年来，科研人员一直在努力从中医中寻找治疗骨质疏松症的突破口。黄芩是临床应用最广泛的中药之一，已被证明具有广泛的药理活性，主要用于杀菌、解热镇痛和抗癌。最近的研究发现，黄芩具有良好的抗骨质疏松的活性，可以明显防止失重引起的骨质疏松，提高骨矿物质密度和骨的微结构。
千层纸素A(OroxylinA，ORO)是黄芩中提取的最具生物活性的成分之一，OroxylinA能以时间和浓度依赖的方式减弱RANKL诱导的破骨细胞的形成，并在分子水平上抑制NFATc1活性和细胞内活性氧(ROS)水平。我们曾证实了OroxylinA减少破骨细胞生成和骨吸收，同时增加血管生成和骨生成,在骨质疏松治疗以及骨折愈合方面具有巨大的潜力。然而，由于OroxylinA水溶性差、缺乏靶向性不能在骨质疏松微环境中有效积累，降低了药物的生物利用度。在骨质疏松微环境中，破骨细胞是高度活跃的，大量成熟的破骨细胞分泌的氢离子(H+)累积在溶骨工作区，导致破骨细胞和骨的界面出现酸性的细胞外微环境(pH值～4.5±0.3)。活跃的破骨细胞周围独特的酸性微环境为骨靶向药物的响应性释放提供了机会。此外，最近还有研究指出酸中和可以抑制破骨细胞活性并缓解骨质疏松症，因此如果将抑制破骨细胞的药物OroxylinA结合酸中和化合物响应骨质疏松微环境，有望协同抑制破骨细胞的活性增强骨质疏松的治疗效果。最后，黄酮类亲脂性药物往往被负载于具有骨靶向脂质体的磷脂双分子层内而缺乏pH响应的敏感性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统及其制备方法与应用，所述药物递送系统通过将DSPE-PEG2000-DGlu6功能化修饰的磷脂包覆在具药物(千层纸素A)涂层的无定形碳酸钙纳米核心上获得。本发明所述药物递送系统中的酸性多肽与骨具有很强的结合能力，增强了药物递送系统的靶向性，本发明通过PVP分子把脂溶性药物稳定吸附于无定形碳酸钙表面，提高了对酸性微环境响应性的敏感性。本发明所述药物递送系统可以在酸性病理微环境下可控释放负载的药物，进而有效抑制破骨细胞的分化与成熟，实现治疗骨质疏松症的目的。
本发明的目的可以具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面，提供一种基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统(OAPLG)，所述药物递送系统由磷脂包覆具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心颗粒组成，同时磷脂外表面用DSPE-PEG2000-DGlu6进行功能化修饰获得。
进一步地，所述无定形碳酸钙纳米颗粒的粒径为50～80nm。
进一步地，所述药物为脂溶性药物千层纸素A。
进一步地，所述DSPE-PEG2000-DGlu6通过将多肽DCys-DGlu6接枝到DSPE-PEG2000-MAL上的方式获得。
进一步地，所述pH响应性脂溶性药物递送系统通过PVP将药物千层纸素A稳定吸附在无定形碳酸钙纳米颗粒后，与磷脂和DSPE-PEG2000-DGlu6共孵育的方式获得。
本发明第二方面，提供一种本发明所述的基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：CaCl2溶于少量蒸馏水后，加入无水乙醇混匀，用封口膜封口并留几个小孔，将其与固体(NH4)2CO3一起放入干燥器中，恒温进行气体扩散反应24h后，将产物离心，用无水乙醇重悬漂洗，经TEM表征获得50～80nm的无定形碳酸钙纳米颗粒；
步骤2：将脂溶性药物千层纸素A溶于乙醇溶液后加入含有PVP分子的无定形碳酸钙乙醇溶液中，室温搅拌4h后，将产物离心，用无水乙醇重悬漂洗，获得具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心；
步骤3：利用Fmoc固相合成法将多肽DCys-DGlu6接枝到DSPE-PEG2000-Mal上，获得DSPE-PEG2000-DGlu6；
步骤4：将具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心的乙醇溶液与DOPA(二油酰磷脂酸钠盐)氯仿溶液混合，水浴超声，得到DOPA包覆的纳米颗粒，并将其重新悬浮在含有胆固醇、DPPC(二棕榈酰基卵磷脂)和DSPE-PEG2000-DGlu6的氯仿溶液中，搅拌过夜后，除去氯仿，然后在超声波作用下与PBS水合，收集和纯化获得所述的pH响应性脂溶性药物递送系统(OAPLG)。
进一步地，步骤1中所述的CaCl2与(NH4)2CO3的投料比为1:15(m/m,g)。
进一步地，步骤2中所述的千层纸素A的乙醇溶液与含有PVP的CaCO3乙醇溶液的体积比为1:2(v/v,mL)。
进一步地，步骤2中所述的千层纸素A的乙醇溶液的浓度为0.09mol/L。
进一步地，步骤2中所述的含有PVP的CaCO3乙醇溶液中PVP的浓度为10mg/mL；CaCO3的浓度为3mg/mL。
进一步地，步骤3中所述的DCys-DGlu6与DSPE-PEG2000-Mal的投料比为4:1(mol/mol)。
进一步地，步骤4中所述的无定形碳酸钙纳米核心与DOPA的投料比为10:1(m/m,mg)。
进一步地，步骤4中所述的无定形碳酸钙纳米核心与胆固醇、DPPC和DSPE-PEG2000-DGlu6的投料比为10:1:2:4(m/m,mg)。
更具体的，本发明所述的基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：200mgCaCl2于200ml的圆底烧瓶，加300μl蒸馏水完全溶解后，再加入100mL无水乙醇，超声分散，用封口膜封紧瓶口，并用注射针头扎多个小孔，将圆底烧瓶与两个装有3g固体(NH4)2CO3的玻璃瓶一起放入干燥器中，在37℃下进行气体扩散反应24h后，将产物离心(8000转/分，10min)，无水乙醇漂洗3次，然后再分散在无水乙醇中，获得50～80nm的无定形碳酸钙纳米颗粒；
步骤2：将千层纸素A的乙醇溶液(0.09M，1ml)加入含有PVP分子(20mg)的CaCO3乙醇溶液(6mg，2mL)中，在25℃下搅拌4h后，用乙醇离心法(8000rpm,10min)洗涤3次，获得具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心；
步骤3：将DCys-DGlu6和DSPE-PEG2000-Mal(4:1，mol/mol)溶解于ACN/H2O(2:1，v/v)溶液，搅拌条件下，加入0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)和6M盐酸胍溶液(pH＝7.0)，冲氮气置换氧气，在室温下氮气氛围下反应2h。将反应液转移至透析袋(MWCO：1000Da)中，在纯水中透析，以除去未反应的DCys-DGlu6多肽。将透析袋中反应产物进行冷冻干燥，获得PEG接枝的骨靶向多肽DSPE-PEG2000-DGlu6；
步骤4：将具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心(20mg，5mL)的乙醇溶液与DOPA氯仿溶液(2mg，1mL)混合，水浴超声20min。然后，通过离心法纯化得到的DOPA包覆的纳米颗粒，并将其重新悬浮在含有胆固醇(2mg)、DPPC(4mg)和DSPE-PEG2000-DGlu6(8mg)的氯仿溶液(6mL)中。这些纳米粒子在室温下搅拌一夜后，用旋转蒸发器除去氯仿，然后在超声波作用下与PBS(2mL)水合。随后，通过离心法(8000转/分，10min)收集和纯化这些聚乙二醇化的纳米颗粒获得所述的pH响应性脂溶性药物递送系统。
本发明第三方面，提供一种前述的基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统在制备治疗或预防骨质疏松症相关药物中的应用。
本发明还提供一种前述的基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统的制备方法在制备治疗或预防骨质疏松症相关药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下效果：
其一，本发明通过气体扩散法获得的无定形碳酸钙，呈弱碱性，对水敏感，遇水会发生晶型的改变，快速释放附着的药物，同时也会释放大量无细胞毒性的钙，有利于骨质疏松症的修复，另外，选用50～80nm粒径的无定型碳酸钙，更利于药物系统通过血液循环到达骨质表面。
其二，通过分子生物学和动物体内实验结果显示，本发明的酸性多肽与骨具有很强的结合能力。并且区别于传统的脂溶性药物装载于磷脂双分子层内部，本发明通过PVP分子把脂溶性药物稳定吸附于无定形碳酸钙表面，提高了对酸性微环境响应性的敏感性。实验结果显示，本发明的药物装载设计可以在酸性环境触发下短时间内快速释放药物，提高药物的局部浓度，有利于提高药物疗效。
其三，通过体内和体外实验的验证，本发明的pH响应性脂溶性药物递送系统可以在酸性病理微环境下可控释放负载的药物，进而有效抑制破骨细胞的分化与成熟，实现治疗骨质疏松症的目的。我们在构建的雌性C57BL/6小鼠去卵巢骨质疏松症模型中发现，采用本发明药物递送系统相比纯药物组，骨小梁修复显著。组织学以及血清学指标实验都证明了相同的结果。通过PVP将千层纸素A稳定的吸附在无定形碳酸钙表面，外覆的磷脂层用骨靶向多肽DSPE-PEG2000-DGlu6进行修饰,然后通过血液循环富集到骨基质表面，在溶骨性微环境的低pH值时，碳酸钙中和酸性并释放千层纸素A进而抑制破骨细胞的形成与分化，也可以补充流失的钙，联合治疗产生更强的骨质疏松治疗作用。
附图说明
图1.ACC(左图)、OCA(中图)、OAPLG(右图)的透射电镜图。
图2.pH响应性脂溶性药物递送系统OAPLG的代表性透射电镜放大图。
图3.OAPLG在不同pH缓冲液中与骨片孵育随时间的荧光信号。
图4.OAPLG在不同pH缓冲液中响应性药物释放。
图5.OAPLG在体外骨片上富集的情况。
图6.OAPLG在小鼠体内股骨胫骨处富集的情况。
图7.OAPLG以及不同的对照组样品注射到骨质疏松症模型小鼠体内后治疗骨质疏松症情况的CT重建图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1药物递送系统OAPLG的制备
步骤1：200mgCaCl2于200ml的圆底烧瓶，加300μl蒸馏水完全溶解后，再加入100mL无水乙醇，超声分散。用封口膜封紧瓶口，并用注射针头扎多个小孔。将圆底烧瓶与两个装有3g固体(NH4)2CO3的玻璃瓶一起放入干燥器中，在37℃下进行气体扩散反应24h后，将产物离心(8000转/分，10min)，无水乙醇漂洗3次，然后再分散在无水乙醇中，获得50～80nm的无定形碳酸钙纳米颗粒；
步骤2：将千层纸素A的乙醇溶液(0.09M，1ml)加入含有PVP分子(20mg)的CaCO3乙醇溶液(6mg，2mL)中，在25℃下搅拌4h后，用乙醇离心法(8000rpm,10min)洗涤3次，获得具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心；
步骤3：将DCys-DGlu6和DSPE-PEG2000-Mal(4:1，mol/mol)溶解于ACN/H2O(2:1，v/v)溶液，搅拌条件下，加入0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)和6M盐酸胍溶液(pH＝7.0)，冲氮气置换氧气，在室温下氮气氛围下反应2h。将反应液转移至透析袋(MWCO：1000Da)中，在纯水中透析，以除去未反应的DCys-DGlu6多肽。将透析袋中反应产物进行冷冻干燥，获得PEG接枝的骨靶向多肽DSPE-PEG2000-DGlu6；
步骤4：将具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心(20mg，5mL)的乙醇溶液与DOPA氯仿溶液(2mg，1mL)混合，水浴超声20min。然后，通过离心法纯化得到的DOPA包覆的纳米颗粒，并将其重新悬浮在含有胆固醇(2mg)、DPPC(4mg)和DSPE-PEG2000(8mg)的氯仿溶液(6mL)中。这些纳米粒子在室温下搅拌一夜后，用旋转蒸发器除去氯仿，然后在超声波作用下与PBS(2mL)水合。随后，通过离心法(8000转/分，10min)收集和纯化这些聚乙二醇化的纳米颗粒获得所述的pH响应性脂溶性药物递送系统。
按照上述方法合成无定形碳酸钙(ACC)、药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心(OCA)、OAPLG后载体浓度稀释至合适浓度，采用透射电子显微镜进行形态学观察(如图1和图2)，确定载体的大小和药物的负载，并确定骨靶向多肽的成功修饰。
实施例2OAPLG的pH响应性
为了研究OAPLG在骨表面上的pH响应行为，我们利用牛骨切片和完全培养基来高度模拟生理环境，将DiD标记的OAPLG与牛骨切片在完全培养基中进行共孵育，通过观察荧光信号来反映OAPLG在骨表面的行为。如图3，7d后，OAPLG仍稳定分布在骨切片上，然而将培养基pH降低至约4.5后，OAPLG的荧光信号在几分钟内迅速消失，这表明OAPLG具有良好的pH响应性。随后通过监测不同pH值的缓冲液中ORO的释放情况，研究OAPLG的pH响应性药物释放行为。如图4，在pH为4.5(模拟活性OCs局部细胞外微环境pH值)的条件下，6小时后，OAPLG释放出约82.3％的ORO，而在pH 7.4的生理模拟状态下只释放出低于约30.0％的ORO。接着，我们在不同pH值的缓冲溶液中监测了OAPLG的粒径变化，发现孵育相同时间，粒径随pH值的降低逐渐变大。综上这些结果表明OAPLG具有良好的pH响应性。
实施例3OAPLG的骨靶向性
为了研究骨基质与骨靶向递送系统在体外的骨矿物质结合能力，根据之前的报道进行了骨切片吸附实验。简单地说，将DID标记的OAPL和OAPLG(1mg/mL)加入置有骨切片的96孔板中，然后将孔板在室温下温和振荡1小时，以使DID标记的未经DSPE-PEG2000-DGlu6修饰的磷脂包覆的具药物的无定形碳酸钙核心(OAPL)和OAPLG吸附在骨切片上。通过测定吸附前的初始储备液与吸附后上清液的荧光强度差来确定DID标记的OAPL和OAPLG的吸附量，结果如图5所示，具多肽修饰的载体与骨片共孵育后，荧光强度相比无多肽修饰的载体差异显著，说明多肽修饰后的载体OAPLG具有良好的骨靶向性。随后，我们还以DiD为探针，研究了OAPLG在正常小鼠体内的骨靶向性。如图6，结果表明给药4h后，OAPLG组骨内的荧光强度明显高于OAPL组，直到8h,OAPL组才有较弱的荧光强度。这些结果表明，DGlu6修饰有利于OAPLG定向积累到骨组织，有利于骨质疏松症的治疗。体外和体内实验结果均证实OAPLG能够靶向骨组织并在骨部位蓄积，提示OAPLG具有骨靶向递送的潜力。
实施例4OAPLG体内骨质疏松症逆转作用
为了研究OAPLG在体内的骨保护作用，我们建立了双侧OVX诱导的骨质疏松小鼠模型。OVX小鼠发生系统性骨质流失后，每周通过尾静脉注射ORO、APLG(DSPE-PEG2000-DGlu6修饰的磷脂包覆的不含药物的无定形碳酸钙核心)、OAPL、OAPLG或生理盐水1次。Micro-CT显示OAPLG治疗后骨小梁体积恢复，如图7所示，证实OAPLG能有效减少小鼠(股骨远端)骨组织的骨量丢失和修复微结构损伤。
Claims (10)
1.一种基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统(OAPLG)，其特征在于，所述药物递送系统由磷脂包覆具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心颗粒组成，同时磷脂外表面用DSPE-PEG2000-DGlu6进行功能化修饰获得。
2.根据权利要求1所述的pH响应性脂溶性药物递送系统，其特征在于，所述无定形碳酸钙纳米颗粒的粒径为50～80nm。
3.根据权利要求1所述的pH响应性脂溶性药物递送系统，其特征在于，所述药物为脂溶性药物千层纸素A。
4.根据权利要求1所述的pH响应性脂溶性药物递送系统，其特征在于，所述DSPE-PEG2000-DGlu6通过将多肽DCys-DGlu6接枝到DSPE-PEG2000-Mal上的方式获得。
5.根据权利要求1所述的pH响应性脂溶性药物递送系统，其特征在于，所述pH响应性脂溶性药物递送系统通过PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)将药物千层纸素A稳定吸附在无定形碳酸钙纳米颗粒后，与磷脂和DSPE-PEG2000-DGlu6共孵育的方式获得。
6.一种制备权利要求1所述的基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统的方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：CaCl2溶于少量蒸馏水后，加入无水乙醇混匀，用封口膜封口并留几个小孔，将其与固体(NH4)2CO3一起放入干燥器中，恒温进行气体扩散反应24h后，将产物离心，用无水乙醇重悬漂洗，获得50～80nm的无定形碳酸钙纳米颗粒；
步骤2：将脂溶性药物千层纸素A溶于乙醇溶液后加入含有PVP分子的无定形碳酸钙乙醇溶液中，室温搅拌4h后，将产物离心，用无水乙醇重悬漂洗，获得具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心；
步骤3：利用Fmoc固相合成法将多肽DCys-DGlu6接枝到DSPE-PEG2000-Mal上，获得DSPE-PEG2000-DGlu6；
步骤4：将具药物涂层的无定形碳酸钙纳米核心的乙醇溶液与DOPA氯仿溶液混合，水浴超声，得到DOPA包覆的纳米颗粒，并将其重新悬浮在含有胆固醇、DPPC和DSPE-PEG2000-DGlu6的氯仿溶液中，搅拌过夜后，除去氯仿，然后在超声波作用下与PBS水合，收集和纯化获得所述的pH响应性脂溶性药物递送系统(OAPLG)。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述的CaCl2与(NH4)2CO3的投料比为1:15(m/m,g)；步骤2中所述的千层纸素A的乙醇溶液与含有PVP的CaCO3乙醇溶液的体积比为1:2(v/v,mL)；所述的千层纸素A的乙醇溶液的浓度为0.09mol/L；所述的含有PVP的CaCO3乙醇溶液中PVP的浓度为10mg/mL；CaCO3的浓度为3mg/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述的DCys-DGlu6与DSPE-PEG2000-Mal的投料比为4:1(mol/mol)。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述的无定形碳酸钙纳米核心与DOPA的投料比为10:1(m/m,mg)；所述的无定形碳酸钙纳米核心与胆固醇、DPPC和DSPE-PEG2000-DGlu6的投料比为10:1:2:4(m/m,mg)。
10.一种权利要求1～5任一所述或权利要求6制备的基于无定形碳酸钙靶向治疗骨质疏松症的pH响应性脂溶性药物递送系统在制备治疗或预防骨质疏松症相关药物中的应用。
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