CN117769563A - 用于神经退行性病变的新的治疗肽 - Google Patents

Abstract

本文描述了新的、线粒体编码的开放阅读框，所述开放阅读框引起名为SHMOOSE的新线粒体肽的产生。SHMOOSE是58个氨基酸的肽，并且在其开放阅读框内包括全基因组显著的小核苷酸多态性(SNP)，显著增加阿尔茨海默病、大脑结构、大脑基因表达和认知的风险。SHMOOSE提高了神经元型细胞的存活，并保护其免受β淀粉样蛋白毒性的影响。代谢组学研究揭示了所述肽在能量优化中的作用，在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中，其功能障碍和失调会导致大脑的生理学上显著的区域中的细胞死亡。描述了用于治疗和诊断的方法和组合物，包括肽类似物和衍生物。

Description

用于神经退行性病变的新的治疗肽

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的拨款号AG055369、AG062693、AG061834和AG068405的政府资助下进行的。政府对本发明拥有一定权利。

对相关申请的交叉引用

本申请包括根据35U.S.C.§119(e)对2021年6月3日提交的美国临时专利申请第63/196,480号的优先权的要求，该申请的全部内容通过引用结合到本文中。

对序列表的引用

2022年6月3日提交的序列表是名为“SequenceListing-065715-000102WO00_ST25”的文本文件，创建于2022年6月3日，并且大小为39992字节，通过引用结合到本文中。

技术领域

本文描述了与用于治疗代谢相关疾病及组合(例如神经退行性疾病)的线粒体肽相关的组合物和方法。

背景技术

最近的组学揭示了神经生物学和阿尔茨海默病(AD)中的新的功能基因组元件，但有两个成分尚待严格检查：微蛋白(microprotein)和线粒体DNA变异。微蛋白是由小开放阅读框(sORF)编码的生物活性肽。由于计算能力和生化限制，这些肽已经被遗漏了几十年。然而今天，高分辨率基因组学和蛋白质组学已经揭示了数千种未表征的微蛋白。

微蛋白代表了理解神经生物学的巨大机会。在过去的二十年里，已对数种线粒体编码的微蛋白进行了研究。一种这样的微蛋白是人体肽(humanin；从阿尔茨海默病(AD)患者的枕叶中克隆出来的24个氨基酸的肽)。自其发现以来，已发现人体肽通过其三聚体受体信号传导和β淀粉样蛋白毒性保护来减轻部分AD病理。最近，据报道，认知年龄和人体循环水平与人体肽sORF 9中的单核苷酸多态性(SNP)有关，表明其他线粒体SNP可能会影响未表征的微蛋白。

线粒体衍生肽(MDP)是由mtDNA小开放阅读框(ORF)编码的一类肽。16569bp的线粒体基因组编码参与氧化磷酸化的13种大蛋白：ATP6、ATP8、CO1、CO2、CO3、CYB、ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6；并将线粒体基因组重新注释为包含9个至40个氨基酸之间的sORF，揭示了数百个推定的MDP sORF。线粒体是产生能量和调节细胞死亡的关键因素。线粒体通过在核基因组中编码的、或者作为线粒体代谢的次级产物的逆行信号通信回细胞。

最近，由线粒体基因组编码的线粒体衍生肽已被鉴定为这些调节过程中的重要参与者。线粒体衍生的逆行信号肽被认为有助于鉴定具有治疗和诊断作用的基因和肽，以治疗人类疾病。

发明内容

以下实施方式及其方面是结合组合物和方法的描述和说明，所述实施方式及其方面旨在示例性的和说明性的，不限制范围。

本文公开了包括线粒体肽的组合物，所述线粒体肽具有氨基酸序列MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)、或者其片段、其类似物或其衍生物。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以包括氨基酸序列MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以包括SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：97-SEQ ID NO：107中的任一者的氨基酸序列。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以包括PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以包括与MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQID NO：93)或PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF(SEQ ID NO：3)具有约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的氨基酸序列。在各种实施方式中，所述线粒体肽的长度可以是19-70个氨基酸。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以具有翻译后修饰或人工修饰。例如，人工修饰可以包括聚乙二醇化、脂肪酸缀合、多肽延伸、IgG-Fc、CPT、HSA、ELP、转铁蛋白或白蛋白修饰。在各种实施方式中，所述组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂或药学上可接受的载体。

本文公开了治疗疾病和/或病症的方法。在各种实施方式中，所述方法可包括向需要所述疾病和/或病症的治疗的受试者施用一定量(a quantity of)的线粒体肽，其中，所述线粒体肽具有氨基酸序列MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)、或者其片段、其类似物或其衍生物。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以是SEQ ID NO：93的氨基酸序列的片段。在各种实施方式中，所述片段可以包括氨基酸序列PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF(SEQ ID NO：3)。在各种实施方式中，所述线粒体肽的长度可以是19-70个氨基酸。例如，该疾病和/或病症可以包括神经退行性疾病和/或病症(任选地为阿尔茨海默病，或以高于参比值的β淀粉样蛋白水平为特征)。在各种实施方式中，所述线粒体肽增加受试者脑脊液中的tau水平。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以降低受试者大脑中的β淀粉样蛋白水平或β淀粉样蛋白斑块。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以减轻或抑制受试者的内侧颞叶皮质组织的体积的降低。在各种实施方式中，所述受试者可以是在SNP位置具有“A”等位基因的单核苷酸多态性(SNP)rs2853499的携带者。例如，所述神经退行性疾病和/或病症可以是帕金森病。在各种实施方式中，所述线粒体肽可以减轻或抑制受试者的上顶叶皮质组织的体积的降低。在各种实施方式中，相对于健康的正常受试者，所述受试者可以表达在生物样品中测定的高的量的MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)。

本文描述了检测一种或多种生物标记的方法。在各种实施方式中，所述方法可以包括检测从期望确定一种或多种生物标记的受试者获得的生物样品中的一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平；以及检测所述一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平。在各种实施方式中，所述一种或多种生物标记可以包括具有以下序列的肽：MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)、MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPNFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：94)，或单核苷酸多态性(SNP)rs2853499。例如，检测存在、不存在或表达水平包括免疫测定。在各种实施方式中，一种或多种生物标记可以包括单核苷酸多态性(SNP)rs2853499，其中“A”等位基因位于SNP位置。在各种实施方式中，所述方法可进一步包括：当检测到具有SEQ ID NO：94的肽的存在时，诊断受试者具有疾病和/或病症、或具有增加的患有疾病和/或病症的可能性；或与健康对照相比，当检测到具有SEQ ID NO：93的肽的低表达水平时，诊断受试者具有疾病和/或病症、或具有增加的患有疾病和/或病症的可能性；或当检测到单核苷酸多态性(SNP)rs2853499(其中“A”等位基因位于SNP位置)时，诊断受试者具有疾病和/或病症。例如，所述疾病和/或病症是神经退行性疾病和/或病症。在各种实施方式中，所述神经退行性疾病和/或病症可以选自于由阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆症及其组合所组成的组。

本文描述了在有需要的受试者中检测线粒体衍生肽的基因型的方法。在各种实施方式中，所述方法可以包括对从受试者获得的生物样品进行测定以检测单核苷酸多态性(SNP)处的基因型。例如，SNP是rs2853499。在各种实施方式中，所述方法可以进一步包括检测受试者中的SNP处的A等位基因。例如，受试者具有阿尔茨海默病或具有发展出阿尔茨海默病的风险因素。在各种实施方式中，在具有阿尔茨海默病或具有发展出阿尔茨海默病的风险因素的受试者中，所述检测能够检测到SNP处的A等位基因的计数高于对照受试者。在各种实施方式中，所述方法可进一步包括向受试者给予阿尔茨海默病治疗。在各种实施方式中，所述受试者期望关于神经退行性疾病或紊乱(任选阿尔茨海默病)的确定。

结合附图，本发明的其他特征和优点由以下的详细描述将变得显而易见，附图通过示例的方式示出了本发明的实施方式的各种特征。

附图说明

图1A-图1F描述了线粒体rs2853499改变SHMOOSE的氨基酸序列，并与AD和神经成像模态相关。翻译示意图示出线粒体DNA变体如何能用于揭示新的微蛋白。(A)与阿尔茨海默病相关的线粒体单核苷酸多态性(“SNP”)的视觉表现。SNP使得名为“SHMOOSE”的肽的氨基酸序列发生突变，产生“SHMOOSE SNP”。等同于MiWAS的GWAS曼哈顿图(Manhattan plot)，被称为太阳图(Solar Plot)。延伸到外部蓝色之外的SNP是统计学上显著的，排列经验p值为0.05。最显著的mtSNP是rs2853498和rs2853499一一两者都是单倍群U决定的，后者导致SHMOOSE的错义改变。(B)SHMOOSE SNP在4个队列(ADNI、ROSMAP、LOAD、ADC1/2)中的优势比。这些队列由患有和不患有阿尔茨海默病(AD)的人组成。具有SHMOOSE SNP的那些人患AD的几率高出30％。ADNI、ROSMAP、LOAD和ADC/1/2中的rs2853499的Meta分析森林图(Meta-analysis forest plot)。条棒代表95％的置信区间。(C)具有相同SHMOOSE SNP的人具有更快的海马体萎缩。这对AD和一般性神经退行性病变两者都非常重要。UK Biobank中的基于神经成像的PheWAS说明SHMOOSE.D47N和年龄对海马旁回的显著影响。在图12中注意到对EC和PCC的其他显著作用。(D)SHMOOSE SNP将58个氨基酸的SHMOOSE肽的第47个氨基酸从天冬氨酸(D)改变为天冬酰胺(N)。也就是说，rs2853499改变了SHMOOSE的第47个氨基酸。RosettaTTFold的SHMOOSE和SHMOOSE.D47N的计算模拟模型。(E)当SHMOOSE在大脑颞叶皮质的表达较高时，线粒体的表达也较高。GO细胞项(GO cellular terms)富集在人类颞叶皮质中与SHMOOSE共表达的基因(n＝69)。(F)SHMOOSE在神经元细胞的细胞核和线粒体中被检测到。含有mtDNA的细胞与不含mtDNA细胞(即rho-0细胞)中的～6kDa SHMOOSE的蛋白质印迹检测。层粘连蛋白B1是核标记；GRSF1亚型是线粒体标记；GAPDH是胞质标记。

图2A-图2C描述生物组织中SHMOOSE的量化水平的新的测定或测试。通过使用针对SHMOOSE的第32-58位氨基酸的抗体开发了酶联免疫吸附夹心测定(ELISA)。人脑脊液(CSF)中的SHMOOSE水平与年龄、tau和脑白质微结构相关。(A)阿尔茨海默病大脑的颞叶皮质中SHMOOSE的RNA水平较高。SHMOOSE RNA在AD病例的颞叶皮质中的表达。对所有经归一化的线粒体基因计数进行负二项式回归后，显著性表示为pAdj＜0.05。(B)脑脊液中SHMOOSE的实际肽水平与年龄、tau和磷酸化tau相关。tau和磷酸化的tau是阿尔茨海默病相关的生物标记。人CSF SHMOOSE水平(pg/mL)与年龄相关。回归模型包括生物性别作为协变量；p值<0.001。SHMOOSE与CSF总tau(pg/mL)相关。回归模型包括生物性别和年龄作为协变量；p值<0.05。SHMOOSE与第181位残基处的CSF磷酸化tau相关(p tau 181；pg/mL)。回归模型包括生物性别和年龄作为协变量；p值<0.05。(C)扣带回皮质(参与许多神经退行性疾病的大脑区域)中SHMOOSE的实际肽水平与较差的大脑白质有关。在72名非痴呆老年人中，较高的CSFSHMOOSE与双侧上放射冠和胼胝体的主体中较低的DTI FA显著相关。回归模型包括年龄、报告的性别和临床痴呆评分。彩色体素(voxels)表明体素方法(voxelwise)多重比较的校正后，FSL无阈值聚类增强(FSLThreshold-Free Cluster Enhancement)导出的p值<0.05。以放射方向呈现(L＝R)。

图3A-图3C描述了SHMOOSE与人、细胞和小鼠中的差别化的线粒体和核糖体基因表达相关。实线框代表线粒体项，而虚线框代表核糖体项。(A)描述了具有SHMOOSE SNP(与阿尔茨海默病相关的相同SNP)的那些人，其也与差别化的线粒体基因表达和核糖体基因表达相关。主成分分析(PCA)，颜色编码14个SHMOOSE.D47N携带者或55个SHMOOSE参比等位基因携带者。虚线表示PC2的中值。在14个SHMOOSE.D47N携带者中，11个低于PC2中值(p值<0.05；广义线性模型)。PCA图右侧为SHMOOSE.D47N携带者富集的GO细胞区室项。(B)描述了SHMOOSE的突变体形式(SHMOOSE.D47N)引起神经元细胞的线粒体内膜基因表达以及核糖体基因表达的改变。经10μM SHMOOSE或SHMOOSE.D47N处理的神经细胞24小时后的体外基因表达特征的PCA。PCA图右侧为经SHMOOSE.D47N处理的神经细胞富集的GO细胞区室项。(C)描述了当将SHMOOSE注射到小鼠中时，核糖体的基因表达和线粒体的基因表达也发生了改变。对小鼠进行14天SHMOOSE处理后，由SHMOOSE富集的针对肝组织的相应的PCA图和GO细胞区室项丰富。

图4A-图4F描述了SHMOOSE对线粒体能量学的影响。SHMOOSE是生物活性微蛋白，定位至线粒体并提高代谢活性和氧化消耗率。(A)当给予至细胞时，SHMOOSE前往线粒体。经SHMOOSE处理的分化的SH-SY5Y细胞(1μM)在15分钟后定位至线粒体。印迹的顶部代表5秒的暴露。印迹的第二部分代表30秒的暴露。在经SHMOOSE处理的条件下，还鉴定出约12kDa的SHMOOSE二聚体(其在线粒体部分中最显著)。层粘连蛋白、GRSF1和GAPDH分别代表细胞核、线粒体和胞质部分。(B)当给予至细胞时，SHMOOSE以剂量反应方式提高代谢活性。SHMOOSE和突变体SHMOOSE.D47N之间在这种大量代谢活动上没有差异。同样，这是与阿尔茨海默病相关的SHMOOSE版本。示出1μM的SHMOOSE(浅蓝色)和SHMOOSE.D47N(深蓝色)两者的MTT测定结果都对1μM和10μM下的细胞代谢活性有影响。对于独立t检验，显著性定义为p值<0.05。(C)SHMOOSE(但不是突变体SHMOOSE.D47N)提高了基础细胞氧气消耗率。归一化至基线第三次测量，SHMOOSE和SHMOOSE.D47N对线粒体闲置产能(spare capacity)的影响。使用独立t检验确定统计学显著性。(D)SHMOOSE和突变体SHMOOSE.D47N增强线粒体处理压力的能力。SHMOOSE和SHMOOSE.D47N对基础OCR的影响。对于独立t检验，显著性定义为p值<0.05。(E)在具有家族性阿尔茨海默病突变的神经元中SHMOOSE表达最高。神经元中的SHMOOSE表达来源于具有FAD APP突变、FAD PSEN突变和FAD APP加上PSEN突变的iPSC。SHMOOSE表达在后一种细胞类型中最高。对所有经归一化的线粒体基因计数进行负二项式回归后，显著性定义为pAdj<0.05。(F)SHMOOSE(但不是突变体SHMOOSE.D47N)保护神经元细胞免受β淀粉样蛋白的影响。经SHMOOSE处理的神经细胞保护免受β淀粉样蛋白42诱导的毒性的影响。对于独立t检验，显著性定义为p值<0.05。

图5A-图5E描述了SHMOOSE的各种特征。SHMOOSE结合线粒体内膜蛋白mitofilin。(A)SHMOOSE是由98种蛋白质组成的结合复合体的部分。这些蛋白质中的一种被称为mitofilin，其存在于线粒体内膜中。使用定制SHMOOSE多克隆抗体进行免疫沉淀的掺入SHMOOSE的神经细胞裂解物的示意的蛋白质组学分析。(B)SHMOOSE与mitofilin在神经元细胞中免疫共沉淀。通过用SHMOOSE抗体或mitofilin抗体进行免疫沉淀，对SHMOOSE/mitofilin相互作用进行相互的蛋白质印迹验证。(C)合成SHMOOSE结合细胞外的mitofilin。相互的斑点杂交显示出重组mitofilin和SHMOOSE相互作用。(D)当细胞中的mitofilin水平降低时，SHMOOSE对代谢活性的影响降低。MTT测定示出，当用siRNA敲低mitofilin时，SHMOOSE对神经细胞代谢活性没有影响。Y轴被归一化以控制基线吸光度值。使用独立t检验确定统计学显著性，p值<0.05。(E)SHMOOSE结合mitofilin的N末端的计算模拟。SHMOOSE(黄色)和mitofilin(棕色)相互作用的HDOCK预测。mitofilin的预测的相互作用残基出现在其C末端。

图6A描述了2周后肝转录组将经SHMOOSE处理的小鼠与对照区分开，图6B描述了2周后SHMOOSE降低小鼠中的肝酶AST和ALT，图6C描述了2周后SHMOOSE减轻喂食高脂肪饮食的小鼠的体重增加，图6D描述了2周后下丘脑转录组将经SHMOOSE处理的小鼠与对照区分开，图6E描述了SHMOOSE处理后的下丘脑转录组表明有效的核糖体和线粒体基因表达改变，以及图6F描述了如通过cFOS所测定的，SHMOOSE激活下丘脑神经元。

图7描述了SHMOOSE对线粒体超氧化物的影响。SHMOOSE减少线粒体超氧化物。IMMTsiRNA减少线粒体超氧化物，并且SHMOOSE之后没有作用。当细胞中的mitofilin水平降低时，SHMOOSE降低活性氧的作用减弱。

图8A描述了使用邻近线粒体标记策略在HEK293细胞线粒体中检测到SHMOOSE。将肽序列DNSYPLVLGPK(SEQ ID NO：96)在图8A中示出。图8B描述了SHMOOSE存在于线粒体内膜中。

图9A描述了当将SHMOOSE给予神经元细胞时，它前往线粒体并结合线粒体超复合体，最主要地结合至ATP5。图9B描述了当使用免疫沉淀将SHMOOSE吸取出细胞时，ATP5粘附至它。SHMOOSE结合ATP5。图9C描述了SHMOOSE与ATP5亚基B和亚基O在细胞外结合。图9D是以下的视觉表示：在ATP5中结合的SHMOOOSE蛋白，ATP5O和ATP5B结合，但ATP5A1不结合。

图10描述了通过MTT测量的类似物筛选测定。顶部：每个条棒代表SHMOOSE的片段(长度为25个氨基酸)。底部：每个条棒代表SHMOOSE的拟磷酸(phosphomimetic)片段(长度为25个氨基酸)。细胞模型为SHSY5Y。发明人制备了103种类似物/衍生物(见表1)。

图11描述了具有增强活性的SHMOOSE的示例性类似物。图11示出具有如下序列的SHMOOSE肽的示例性类似物，该序列具有14个氨基酸：PCLTTWLSQLLKDN(SEQ ID NO：95)。根据SEQ ID NO：95的序列，表征了该类似物的3个不同的分析窗口：PCLTTWLSQLL(SEQ ID NO：108)、CLTTWLSQLLK(SEQ ID NO：109)和LTTWLSQLLKD(SEQ ID NO：110)，各自具有11个氨基酸。疏水面由来自SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：109的序列的氨基酸CWLLLL(SEQ ID NO：111)形成。疏水面由来自SEQ ID NO：110的序列的氨基酸WLLLL(SEQ ID NO：112)形成。

图12描述了UK Biobank中基于神经成像的PheWAS，其说明了SHMOOSE.D47N和年龄分别对神经成像标记的显著影响。SHMOOSE.D47与数个旁边缘区域(paralimbic regions)(包括海马旁回、内嗅皮质(EC)、前扣带皮质(ACC)、后扣带皮质(PCC)和颞极(TPO))中的皮质厚度、体积、软脑膜表面积、WM表面Jacobian和GM/WM对比度显著相关(按聚类方式，RFT校正p值<0.05)。颜色代表p值。

图13描述了SHMOOSE mtSNP与更快的认知能力下降相关。具有SHMOOSE mtSNP(A等位基因)的个体被预测具有加速的认知能力下降。模型示出根据混合效应增长模型估计的影响。红色轨迹代表SHMOOSE.D47N携带者。从65岁的年龄开始估计影响。

图14描述了SHMOOSE ELISA的标准曲线。标准曲线的范围为100pg/mL-250000pg/mL。

图15描述了用tau作为介导物的p Tau 181对SHMOOSE的影响。间接影响(ACME)并非显著(-0.15)低于间接影响和直接影响的组合(ADE)(15.83；p值<0.01)。p tau 181对总体的影响显著(6.025；p值<0.01)，而控制p tau 181时，总tau对SHMOOSE的影响不显著(-2.56)。

图16描述了被编码以代表8个APOE4携带者的主成分分析(PCA)颜色。虚线代表PC2的中值。尽管不是统计学上显著的，但8个APOE4携带者中的5个低于PC2中值。

图17A-图17C描述了皮质、下丘脑和海马体的PCA和GO本体富集(GO OntologyEnrichment)。(A)在皮质中，PCA将经SHMOOSE处理的小鼠与具有针对CNS特异性而富集的细胞成分项的媒介物(vehicle)充分分离开。(B)在下丘脑中，PCA将经SHMOOSE处理的小鼠与具有针对CNS特异性而富集的细胞成分项的媒介物充分分离开。(C)在海马体中，PCA没有将经SHMOOSE处理的小鼠充分分离开，并且没有富集项。

图18A-图18D描述了SHMOOSE对经注射的小鼠的影响。(A)两周后，与高脂肪饮食的经对照处理小鼠相比，经SHMOOSE处理的小鼠的AST水平较低(p值<0.1)。(B)同样，在经SHMOOSE处理的小鼠中，ALT水平较低(p值<0.2)。(C)与对照相比，SHMOOSE减轻了体重增加。(D)SHMOOSE并没有改变食物的摄取。

图19A-图19D描述了每个队列的线粒体-DNA主成分分析。(A)ADNI队列中的mtPCA。SHMOOSE A等位基因携带者聚类在一起。(B)RUSH ROSMAP mtPCA。SHMOOSE A等位基因携带者也似乎聚类在一起。(C)LOAD队列中的mtPCA。SHMOOSE A等位基因携带者在三个不同的簇中。(D)ADC1/2队列中的mtPCA。SHMOOSE A等位基因携带者在三个不同的簇中。

图20A-图20I描述了在UKB中，SHMOOSE.D47N在语言中枢(颞上回和额下回)、背外侧和内侧前额叶皮质、中枢运动系统和枕视觉皮质中的影响。(A-I)白质表面积、软脑膜表面积、表面jacobian、灰质/白质对比度、皮质厚度、皮质体积、沟深度、平均曲率和高斯曲率按顺序建模。灰度表明p值。效果以宽松、未校正的p值<0.05示出。

图21A-图21I描述了在ADNI中，SHMOOSE.D47N边缘区域(如内侧颞叶皮质和后扣带皮质)在未校正的p值<0.05的宽松阈值下的影响。(A-I)白质表面积、软脑膜表面积、表面jacobian、灰质/白质对比度、皮质厚度、皮质体积、沟深度、平均曲率和高斯曲率按顺序建模。灰度表明p值。效果以宽松、未校正的p值<0.05示出。

具体实施方式

本文引用的所有参考文献通过引用的方式以其整体并入，如同完全阐述一样。除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3^rded.，Revised，J.Wiley&Sons(New York，NY 2006)；以及Sambrook和Russel，MolecularCloning：A Laboratory Manual 4^th ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(ColdSpring Harbor，NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。

本领域技术人员将认识到与本文描述的那些相似或等同的许多方法和材料可以用于本发明的实践。事实上，本发明决不限于所描述的方法和材料。

本文中使用的“施用(administering和/或administer)”是指将药物组合物递送给患者的任何途径。递送途径可包括非侵入性经口(通过口腔)、局部(皮肤)、透粘膜(鼻腔、颊/舌下、阴道、眼部和直肠)和吸入途径，以及胃肠外途径和本领域已知的其他方法。胃肠外是指通常与注射相关的递送途径，包括眶内、输注、动脉内、颈动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、包膜下、皮下、透粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可以处于用于输注或注射的溶液或悬液的形式，或者作为冻干粉。

当与提及的数字指示结合使用时，本文中使用的术语“约”是指提及的数字指示加上或减去该提及的数字指示的5％，除非本文另有特别规定。例如，表述“约50％”涵盖了45％到55％的范围。如果权利要求中有特别规定，在各种实施方式中，当与引用的数字指示结合使用时，术语“约”可意味着引用的数字指示加上或减去该引用的数字指示的4％、3％、2％、1％、0.5％或0.25％。

当在本文中提及本发明的SHMOOSE肽而使用时，“类似物”是指SHMOOSE的肽片段。在各种实施方式中，与参比肽相比，类似物具有大约相同或增加的活性。在各种实施方式中，增加的活性是活性增加至少5％。在各种实施方式中，增加的活性是活性增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、175％或200％。

本文中使用的“衍生物”是指基于参比肽设计的肽。在各种实施方式中，衍生物肽能够具有与参比肽大约相同或增加的功能活性。在各种实施方式中，增加的活性是活性增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、175％或200％。在各种实施方式中，衍生物包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在各种实施方式中，衍生物肽包含多达15个氨基酸取代、缺失或添加。在各种实施方式中，衍生物肽包含多达10个氨基酸取代、缺失或添加。在各种实施方式中，衍生物肽包含至多5个氨基酸取代、缺失或添加。在各种实施方式中，衍生物肽包含至多3个氨基酸取代、缺失或添加。在各种实施方式中，衍生物不包括天然存在的氨基酸取代、缺失或添加。在各种实施方式中，衍生物不是D47N变体。

当在本文中提及本发明的SHMOOSE肽而使用时，“变体”和“突变体”是指与“野生型”SHMOOSE肽相比具有一个或多个天然存在的氨基酸取代、缺失或添加的肽。例如，变体“D47N”是在大约25％的欧洲人中发现的SHMOOSE肽的版本，并且这种突变体/变体使AD的风险增加30％。

本文中使用的“调节(modulation或modulates或modulating)”是指反应的上调(即激活或刺激)、下调(即抑制或阻抑)、或两者结合或分开。

本文中使用的“药学上可接受的载体”是指可用于本发明的常规药学上可接受的载体。

本文中使用的“促进(promote和/或promoting)”是指细胞或生物体的特定行为的增强。

本文中使用的“受试者”包括所有动物，包括哺乳动物和其他动物，包括但不限于伴侣动物、农场动物和动物园动物。术语“动物”可包括任何活的多细胞脊椎生物体，包括例如以下的类别：哺乳动物、鸟类、猿猴、狗、猫、马、牛、啮齿动物等。同样，术语“哺乳动物”包括人类和非人类哺乳动物。在各种实施方式中，受试者是人。

本文中使用的“治疗有效量”是指在接受治疗的受试者中足以达到期望效果的特定组合物或组合物中的活性剂的量。治疗有效量可根据多种因素而变化，包括但不限于受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性、期望的临床影响)和施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量。

本文中使用的“治疗(treat、treating和treatment)”指的是治疗性处理和预防性或防御性措施，其目的是预防或减缓(减轻)目标病症、疾病或紊乱(统称为“病痛”)，即使治疗最终不成功。需要治疗的那些可包括已经患有这种病痛的那些，以及易于患有所述病痛或待预防这种病痛的那些。

本文描述了使用新的线粒体肽进行治疗的方法和组合物。通过全基因组扫描进行鉴定，与新的线粒体肽相关的线粒体单核苷酸多态性(SNP)突变与神经退行有关。

SHMOOSE(Small Human Mitochondrial Open reading frame Over the SErine-tRNA)是新发现的与神经退行性疾病有关的肽。因此，人工SHMOOSE肽类似物能够用于预防和治疗这些病症。本发明包括SHMOOSE的肽类似物家族(新发现的线粒体衍生肽)的物质组成。本发明还包括用于检测人类组织和循环中的SHMOOSE肽水平的抗体和测定。

SHMOOSE由小的线粒体DNA开放阅读框(ORF)编码。在神经元细胞和CSF中检测到SHMOOSE。具体而言，使用质谱法和针对SHMOOSE参比序列设计的抗体来检测神经元细胞的细胞核和线粒体中的SHMOOSE。SHMOOSE是58个氨基酸的肽，具有MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)的序列，所述序列包含固有的无序区域。线粒体衍生肽(MDP)是逆行线粒体信号传导和线粒体基因表达的关键因素。与人类核基因组相比，线粒体具有约16570bp的中等大小的环状基因组，所述基因组表面上只包括13个蛋白质编码基因，所述基因都是电子传递链系统的结构组件。

线粒体DNA(mtDNA)的复制和转录开始由核编码的蛋白质调节，并被认为转录为单一多顺反子前体，通过切割战略性定位的22个tRNA(tRNA标点模型)被加工成单个基因，产生两个rRNA和13个mRNA。

人类线粒体在附近的重链(主链和副链)中具有两个启动子，并且在轻链中有一个，从而产生三种不同的单一多顺反子转录本。重的主链启动子负责全部的线粒体RNA(mtRNA)转录本的80％。尽管整个基因被认为是作为单个转录本转录的，但单个rRNA、tRNA和mRNA转录本的丰度差异很大，并且rRNA是最丰富的。这种加工结构表明线粒体中的一类尚未探索的转录后加工。

重要的是，从线粒体中鉴定出的许多mRNA种类是离散的较小长度的种类，不会映射到传统的线粒体蛋白质编码基因。例如，从16S rRNA中观察到多个这样的mRNA。RNA末端的平行分析(PARE)揭示出对于线粒体已经发现大量预期和未预期的切割位点。大多数tRNA和mRNA在5′端具有不同的显性切割位点，但基因内切割位点在rRNA中尤其丰富。值得注意的是，小肽的新兴领域有令人信服的证据表明，长度为11-32个氨基酸的生物活性肽由来自多顺反子mRNA的小开放阅读框(sORF)编码。

线粒体被认为通过核线粒体DNA转移或线粒体起源的核插入(NUMT)过程将其基因组转移到宿主细胞核，留下染色体“二重身(doppelganger)”。NUMT来自mtDNA的所有部分，有不同大小，与原始序列具有不同程度的同源性。整个mtDNA可见于核基因组中，尽管在大多数情况下具有大量的序列退化。大多数NUMT是<500bp的小插入，并且只有12.85％是>1500bp。同一性百分比与大小呈负相关，并且NUMT和mtDNA之间的平均百分比为79.2％，同一性范围为63.5％至100％。

本文描述的是线粒体肽。在一个实施方式中，线粒体肽包括具有氨基酸序列MPPCLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQID NO：93)的肽、其类似物或其衍生物。

在一个实施方式中，线粒体肽的长度为19-70个氨基酸。在特定实施方式中，线粒体肽的长度为58个氨基酸。在各种实施方式中，SHMOOSE类似物的长度为25个氨基酸或约25个氨基酸。在各种实施方式中，SHMOOSE类似物的长度为20-30个氨基酸；或长度为18-20个、20-22个、22-24个、24-26个、26-28个、28-30个或30-32个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体肽包括合成氨基酸。在一个实施方式中，线粒体肽与MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLVLGPKNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)具有小于约25％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多的百分比的同一性。

在各种实施方式中，提供了具有表1中的序列的肽。在各种实施方式中，提供了与表1中的任何肽具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的肽。在一些实施方式中，提供了与表1中的SEQ ID NO：3(PCITTWLSQLLKDNSYPIVLGPKNF)的肽具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的肽。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法确立百分比同一性，包括确立参比氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的比较窗口，以确立百分比同一性的程度。

在其他实施方式中，线粒体肽具有翻译后修饰或其他类型的修饰，例如人工修饰。在各种实施方式中，这包括例如：聚乙二醇化、脂肪酸缀合脂质化、重复多肽延伸、IgG-Fc、CPT、HSA、ELP、转铁蛋白或白蛋白修饰等。在各种实施方式中，与未修饰的肽相比，这些修饰可以提高肽的稳定性、减少酶降解、增加肽的半衰期或增加细胞通透性。本文描述的是肽。在各种实施方式中，肽的长度为19-70个氨基酸。在各种实施方式中，肽是重组肽，或在实验室中合成。在各种实施方式中，位置1处的肽(即，第一N末端氨基酸)是X1，位置2是(X2)，以此类推(X3、X4、X5、X6等)，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6等选自于由天然或合成氨基酸所组成的组。在其他实施方式中，线粒体肽具有翻译后修饰或其他类型的修饰，例如人工修饰。在各种实施方式中，这包括例如：聚乙二醇化、脂肪酸缀合脂质化、重复多肽延伸、IgG-Fc、CPT、HSA、ELP、转铁蛋白或白蛋白修饰等。例如，修饰可以包括在其类似物或衍生物中相应的X1、X2、X3、X4、X5、X6等位置的甲酰化、磷酸化、乙酰化。在各种实施方式中，肽与MPP CLT TWLSQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)具有小于约25％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多百分比的同一性。

在各种实施方式中，所述肽具有表1中的SEQ ID NO：3(PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF)的肽的至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在各种实施方式中，所述肽与MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLVLGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)的一部分具有75％、80％、85％或更多的百分比同一性，包括例如：MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGPKNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)的三个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、二十个或更多个、二十五个或更多个氨基酸，其中所述部分起始于X1、X2、X3、X4等。在一些实施方式中，所述肽与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107的肽具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，其中所述部分起始于X1、X2、X3、X4等。

在各种实施方式中，所述肽是表1的那些肽中的任何一种。

本文描述了使用线粒体肽来增加有需要的受试者中的细胞的代谢活化的方法，包括向需要治疗的受试者施用一定量的线粒体肽。在一个实施方式中，线粒体肽具有MPP CLTTWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ IDNO：93)的序列，或长度为19-70个氨基酸的其类似物或其衍生物。在一个实施方式中，线粒体肽的长度为58个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体衍生肽的长度为25个氨基酸或长度为约25个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体衍生肽是表1的那些肽中的任何一种。在一个实施方式中，线粒体衍生肽是表1的SEQ ID NO：3的肽。

在各种实施方式中，需要增加细胞代谢活化的受试者包括那些患有神经退行性疾病的受试者。在各种实施方式中，需要增加细胞代谢活化的受试者包括那些患有神经退行性疾病的风险增加的受试者。在各种实施方式中，需要增加细胞代谢活化的受试者包括那些被怀疑患有或表现出患有神经退行性疾病的一种或多种症状的受试者。神经退行性疾病包括ALS、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)、共济失调和麻痹(如脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA))和本领域认可的所有其他神经退行性疾病。在各种实施方式中，上述疾病包括显性突变和散发形式，例如散发性ALS、阿尔茨海默病和帕金森病。在各种实施方式中，所述疾病或病症是阿尔茨海默病(AD)。在各种实施方式中，所述疾病或病症是痴呆症。在各种实施方式中，AD是迟发性阿尔茨海默病(LOAD)。

本文描述了使用线粒体肽治疗疾病和/或病症的方法，包括向需要治疗的受试者施用一定量的线粒体肽。在一个实施方式中，线粒体肽是MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLVLGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)的序列、或长度为19-70个氨基酸的其类似物或其衍生物。在一个实施方式中，线粒体肽的长度为58个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体衍生肽的长度为25个氨基酸或长度为约25个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体衍生肽是表1的那些肽中的任何一种。在一个实施方式中，线粒体衍生肽是表1的SEQ ID NO：3的肽。在各种实施方式中，线粒体衍生肽是具有SEQ ID NO：3、SEQID NO：1、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：100、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107的肽。在各种实施方式中，所述方法进一步包括在施用肽之前选择需要治疗的受试者。例如，选择可以基于如本文进一步描述的SNP的存在或不存在或线粒体肽的表达水平。在一个实施方式中，所施用的线粒体肽的量是线粒体肽的治疗有效量。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。

在各种实施方式中，适合用所述线粒体肽或所述类似物组合物治疗的疾病和/或病症包括神经退行性疾病。神经退行性疾病包括ALS、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)、共济失调和麻痹(如脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA))和本领域认可的所有其他神经退行性疾病。在各种实施方式中，上述疾病包括显性突变和散发形式，例如散发性ALS、阿尔茨海默病和帕金森病。在各种实施方式中，所述疾病或病症是阿尔茨海默病(AD)。在各种实施方式中，所述疾病或病症是痴呆症。在各种实施方式中，AD是迟发性阿尔茨海默病(LOAD)。

在各种实施方式中，线粒体肽增加CSF中的tau。在各种实施方式中，线粒体肽减少认知能力下降和/或降低认知能力下降的速率。在各种实施方式中，线粒体肽减少颞叶皮质组织或上顶叶皮质组织中的疾病的迹象。在各种实施方式中，线粒体肽通过例如优化细胞中的燃料(fuel)利用来增加能量代谢。在各种实施方式中，受试者是SNP 12372(rs2853499)的携带者。

在各种实施方式中，受试者不表达肽MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNFGATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)。在各种实施方式中，相对于健康的正常受试者，受试者表达低量的肽MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATPNKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)。在其他实施方式中，受试者具有低SHMOOSE活性的代谢特征。在其他实施方式中，受试者具有高或异常的SHMOOSE活性的代谢特征。在各种实施方式中，对受试者施用SHMOOSE的衍生物和/或显性阴性类似物。

在各种实施方式中，根据本发明的组合物可以配制用于通过任何施用途径递送。“施用途径”可指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、鼻腔、口服、透粘膜、经皮或胃肠外。“经皮”施用可使用外用乳膏或软膏或通过经皮贴剂完成。“胃肠外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、包膜下、皮下、透粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可以处于用于输注或注射的溶液或悬液的形式，或者作为冻干粉。通过肠内途径，药物组合物可以处于如下的形式：片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆、悬液、溶液、粉末剂、颗粒剂、乳液、允许控释的聚合物囊泡或微球或纳米球或脂质囊泡。通过胃肠外途径，组合物可以处于用于输注或注射的溶液或悬液的形式。通过局部给药途径，基于本发明的化合物的药物组合物可被配制用于治疗皮肤和粘膜，并且处于软膏剂、乳膏剂、乳剂、油膏剂、粉末剂、浸渍垫剂、溶液、凝胶剂、气雾剂、洗剂或悬液的形式。它们还可以处于允许控释的微球、或纳米球、或脂质囊泡、或聚合物囊泡、或聚合物贴片和水凝胶的形式。根据临床适应症，这些局部途径组合物可以是无水形式或水性形式。通过眼部途径，它们可以处于滴眼液的形式。

在各种实施方式中，肽或组合物通过脑室内注射施用。

根据本发明的组合物还能够包含任何药学上可接受的载体。本文中使用的“药学上可接受的载体”是指参与到携带或转运感兴趣的化合物从一个组织、器官或机体的一部分到另一组织、器官或机体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。在一些实施方式中，药学上可接受的载体还用作肽的稳定剂或防腐剂，和/或减少肽的降解。因此，包含肽和载体的组合物将比包含无载体的肽的组合物具有更长的“保质期”。在各种实施方式中，载体可以是液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，或其组合。载体的每种成分都必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分兼容。它还必须适用于与其可能接触的任何组织或器官接触，意味着它不能具有毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或超过其治疗益处的任何其他并发症的风险。

根据本发明的组合物也能够被封装、压片或制备成用于口服施用的乳液或糖浆。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或促进组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、酒精和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可以包括单独或与蜡一起的缓释材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

药物制剂是按照传统的药学技术制备的，涉及研磨、混合、造粒和必要时压片为片剂形式，或研磨、混合和填充为硬明胶胶囊形式。当使用液体载体时，制剂将处于糖浆、酏剂、乳液或者水性或非水性悬液的形式。这种液体制剂可以直接口服施用或填充到软明胶胶囊中。

根据本发明的组合物可以以治疗有效量递送。确切的治疗有效量是在给定受试者的治疗效果方面将产生最有效结果的组合物的量。该量将根据多种因素变化，包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)，药学上可接受的载体的性质或配方中的载体，以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验来确定治疗有效量，例如，通过监测受试者对施用化合物的反应并相应地调整剂量。更多指导请参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro ed.20th edition，Williams&Wilkins PA，美国)(2000)。

本文描述了诊断个体的疾病和/或病症的方法。在各种实施方式中，所述方法包括选择受试者，检测一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平，以及基于所述一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平诊断受试者的疾病和/或病症。在各种实施方式中，生物标记包括线粒体肽。在各种实施方式中，生物标记包括MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLVLGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)。例如，相对于健康正常受试者，如果表达低、高或异常量的肽MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNFGATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)，则受试者可被诊断。在各种实施方式中，生物标记的存在、不存在或表达水平的检测包括对一种或多种生物标记的抗体检测，包括使用例如：单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、其他免疫原性检测和质谱检测方法。

在另一个实施方式中，生物标记包括单核苷酸多态性(SNP)。在各种实施方式中，SNP是12372(rs2853499)。本领域技术人员知道能够检测SNP的方法。

在各种实施方式中，适合用所述线粒体肽或类似物组合物治疗的疾病和/或病症包括神经退行性疾病。神经退行性疾病包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)、共济失调和麻痹(如脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA))和本领域认可的所有其他神经退行性疾病。在各种实施方式中，上述疾病包括显性突变和散发形式，例如散发性ALS、阿尔茨海默病和帕金森病。在具体实施方式中，适合用线粒体肽或类似物组合物治疗的疾病和/或病症是阿尔茨海默病。

本文描述了检测一种或多种生物标记的方法。在各种实施方式中，所述方法包括在从需要确定一种或多种生物标记的受试者获得的生物样品中，检测一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平；以及检测所述一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平。在各种实施方式中，一种或多种生物标记包括序列为MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)、MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPNFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：94)的肽、或单核苷酸多态性(SNP)rs2853499。例如，检测存在、不存在或表达水平包括免疫测定。在各种实施方式中，一种或多种生物标记包括单核苷酸多态性(SNP)rs2853499，其中“A”等位基因位于SNP位置。在各种实施方式中，所述方法进一步包括：当检测到具有SEQ ID NO：94的肽的存在时，诊断受试者患有疾病和/或病症、或具有增加的患有疾病和/或病症的可能性；或与健康对照相比，当检测到具有SEQ ID NO：93的肽的低表达水平时，诊断受试者患有疾病和/或病症、或具有增加的患有疾病和/或病症可能性；或当检测到单核苷酸多态性(SNP)rs2853499(其中“A”等位基因位于SNP位置)时，诊断受试者患有疾病和/或病症。例如，所述疾病和/或病症是神经退行性疾病和/或病症。在各种实施方式中，所述神经退行性疾病和/或病症选自于由阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆症及其组合所组成的组。

本文描述了在有需要的受试者中检测线粒体衍生肽的基因型的方法。在各种实施方式中，所述方法包括对从受试者获得的生物样品进行测定以检测单核苷酸多态性(SNP)处的基因型。例如，SNP是rs2853499。在各种实施方式中，所述方法进一步包括检测受试者中的SNP处的A等位基因。例如，受试者具有阿尔茨海默病或具有发展出阿尔茨海默病的风险因素。在各种实施方式中，在具有阿尔茨海默病或具有发展出阿尔茨海默病的风险因素的受试者中，所述检测在SNP处检测出A等位基因的计数高于对照受试者。在各种实施方式中，所述方法进一步包括向受试者给予阿尔茨海默病治疗。在各种实施方式中，所述受试者期望确定神经退行性疾病或紊乱(任选为阿尔茨海默病)。

本发明进一步提供了使用线粒体肽增强疾病和/或病症治疗的功效的方法，包括以下步骤：选择需要治疗的受试者，以及将一定量的线粒体肽给予至接受疾病和/或病症的治疗的受试者，其中所述线粒体肽增强所述疾病和/或病症的功效，从而增强所述治疗的功效。在一个实施方式中，线粒体肽与能够治疗炎性疾病和/或病症的组合物同时施用。在一个实施方式中，在施用能够治疗疾病和/或病症的组合物之前或之后顺序施用线粒体肽。在一个实施方式中，受试者是人。例如，本发明的线粒体肽和类似物组合物可以与用于神经退行性疾病的治疗的其他治疗剂共同施用。共同施用以是同时的，例如，在单个药物组合物或分开的组合物中。本发明的组合物也可以与其他治疗剂分开施用，例如，以独立的给药方案。

在各种实施方式中，本发明进一步提供了药物组合物。在一个实施方式中，所述药物组合物包括线粒体肽和药学上可接受的载体。在一个实施方式中，所述线粒体肽的序列是MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPYHPR(SEQ ID NO：93)。在各种实施方式中，所述肽与MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGPKNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)的一部分具有75％、80％、85％或更多百分比同一性，所述部分包括例如，MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGPKNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)的三个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、二十个或更多个、二十五个或更多个氨基酸，其中所述部分开始于X1、X2、X3、X4等。在各种实施方式中，所述肽与表1的那些肽中的一个或多个具有75％、80％、85％或更多的百分比同一性。在各种实施方式中，所述肽与表1的SEQID NO：3具有75％、80％、85％或更多的百分比同一性。在一些实施方式中，所述肽与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107的肽具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。

在一些实施方式中，生物活性线粒体肽小至6-9个氨基酸，以及一些的长度为19-70个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体肽的长度为58个氨基酸。在一个实施方式中，线粒体肽的长度为25个氨基酸，或长度为约25个氨基酸。在一个实施方式中，药物组合物中的线粒体肽包括治疗有效量的线粒体肽。在一个实施方式中，药物组合物包括一种或多种线粒体肽和药学上可接受的载体。

在各种实施方式中，本发明进一步提供了制造线粒体肽的方法。在一个实施方式中，所述制造方法包括以下步骤：提供编码线粒体肽的一种或多种多核苷酸，在宿主细胞中表达所述一种或多种多核苷酸，以及从宿主细胞中提取线粒体肽。在一个实施方式中，制造方法包括以下步骤：在宿主细胞中表达一种或多种多核苷酸，以及从宿主细胞中提取线粒体肽。在一个实施方式中，一种或多种多核苷酸是编码如下的序列：MPP CLT TWL SQL LKDNSY PLV LGP KNF GATP NKS NNHAHY YNHPNP DFP NSPHPY HPR(SEQ ID NO：93)，或与MPPCLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQID NO：93)具有超过约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多百分比同一性的线粒体肽。在各种实施方式中，所述肽与MPP CLTTWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ IDNO：93)的一部分具有75％、80％、85％或更高百分比同一性，所述部分包括例如MPP CLTTWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKS NNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ IDNO：93)的三个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、二十个或更多个、二十五个或更多个氨基酸，其中所述部分开始于X1、X2、X3、X4等。

在各种实施方式中，肽与表1的SEQ ID NO：3具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在各种实施方式中，所述肽与表1的SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在各种实施方式中，所述肽与表1的SEQ ID NO：15具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在各种实施方式中，所述肽与表1的SEQ ID NO：2具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在各种实施方式中，所述肽与表1的SEQID NO：4具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在另一个实施方式中，制造方法包括使用液相合成或固相合成进行肽合成的步骤。在一个实施方式中，固相合成是Fmoc或BOC合成。

表1.SHMOOSE类似物/衍生物及其效率，通过MTT测定，作为与SHMOOSE相比的百分比(SHMOOSE活性为100％)。

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实施例

本文描述的是所要求保护的发明的非限制性实例。

实施例1.SHMOOSE(Small Human Mitochondrial Open reading frame Over theSErine-tRNA)肽

SHMOOSE是新发现的序列为MPP CLT TWL SQL LKD NSY PLV LGP KNF GATP NKSNNH AHY YNH PNP DFP NSP HPY HPR(SEQ ID NO：93)的肽，其功能障碍的突变和调节异常与神经退行性疾病有关。因此，人工SHMOOSE肽类似物可用于预防和治疗这些病症。本文描述了SHMOOSE在神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病(AD))中的作用，SHMOOSE的肽类似物(包括它们在能量代谢中的作用)。

实施例2.SHMOOSE的性质

将SHMOOSE在使用线粒体全基因组关联研究发现的开放阅读框中编码。研究与SNP关联，该SNP改变SHMOOSE序列，并增加阿尔茨海默病病理和认知的风险。这种多态性在欧洲血统的人中非常普遍。

更具体地说，SHMOOSE的过表达增加神经元型细胞的存活。有趣的是，鉴别了导致SHMOOSE在神经元型细胞中的作用减弱的SNP。与野生型G核苷酸SHMOOSE相比，具有A核苷酸的SHMOOSE 12372SNP(rs2853499)与认知评分的增加的下降相关。

实施例3.SHMOOSE在细胞代谢中的作用

不受任何假设的约束，SHMOOSE优化燃料利用并定位在线粒体和细胞核中。基于这个作用，SHMOOSE在细胞功能中的作用能够通过开发有效的SHMOOSE类似物来利用，包括用于在细胞模型和动物模型中治疗神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和帕金森病)的目的。

实施例4.SHMOOSE表达，初步细胞生物学研究

为了解释SHMOOSE的作用，初步研究证实，SHMOOSE可被表达和合成以用于向细胞施用，包括突变体D47N亚型。在向细胞施用后，观察到SHMOOSE在β淀粉样蛋白毒性测定中提高了神经元细胞的活力。相比之下，突变体D47N SHMOOSE不能提高神经元细胞的活力。

进一步探索SHMOOSE在表观神经元细胞活力中的潜在作用，并鉴于线粒体在细胞代谢中的作用，能量图测定揭示SHMOOSE优化细胞中的燃料利用。通过观察到SHMOOSE定位于线粒体，证实了这种燃料利用的功能性观察。初步结构分析表明，SHMOOSE具有7个高置信度磷酸化位点。

实施例5.SHMOOSE的功能障碍和失调在神经退行中表现出广泛的影响

为了进一步研究SHMOOSE在疾病病理学(包括神经退行性疾病)中的作用，进一步的研究证实，SHMOOSE基因型预测阿尔茨海默病(AD)表型并与核基因型相互作用，SHMOOSE中的A SNP 12372(rs2853499)预测AD、认知、大脑结构和大脑基因表达。

有趣的是，上述相互作用进一步表明，SHMOOSE mtSNP预测海马(与AD相关的重要大脑区域)变薄。有趣的是，SHMOOSE mtSNP还与更大的颞极体积(AD中常见的特征)有关。SHMOOSE表达在AD中较高，并且对于SHMOOSE mtSNP携带者而言在AD中尤其更高。这些结果强烈表明SHMOOSE在神经元功能中具有更广泛的作用，伴随着SHMOOSE的功能障碍和失调导致神经退行。

SHMOOSE基因型与颞叶皮质基因表达的显著差异相关，证实SHMOOSE功能障碍的更广泛影响。这些结果表明，SHMOOSE mtSNP携带者具有差异表达的基因，所述基因与细胞核中的RNA加工、线粒体中的代谢加工和额外的细胞外活性有关。

实施例6.代谢组学和神经退行

为了阐明SHMOOSE在体内稳态和能量加工中的明显作用与导致神经退行的功能障碍的SHMOOSE之间的关系，对细胞生物学和疾病状态进行了额外研究。

发明人观察到SHMOOSE在神经元中表达。具体来说，在细胞核和线粒体中发现内源性SHMOOSE。针对SHMOOSE肽的定制抗体(第32-58位氨基酸)表明，SHMOOSE(包括人工SHMOOSE肽)可以在细胞内内化并前往线粒体和细胞核。

将线粒体中的定位和能量加工的功能观察联系起来，SHMOOSE可以通过提高线粒体衍生的能量产生能力来保护免受Aβ的毒性。SHMOOSE保护免受神经元中的Aβ毒性。SNP12372(rs2853499)导致D47N突变体不会保护神经元免受Aβ毒性的影响。这些结果通过如下的观察得到了证实：SHMOOSE增加神经元中MTT信号。MTT是捕获NAD(P)H通量的读数，代表新陈代谢。SHMOOSE(包括人工SHMOOSE肽)增强线粒体功能和神经元的闲置产能。

SHMOOSE的基因富集分析。SHMOOSE改变与脂质合成和线粒体功能相关的基因表达；突变体SHMOOSE扩增识别标志(signature)；其与人类关联数据相匹配。SHMOOSE开启和关闭与RNA加工和脂质代谢相关的基因。它对线粒体基因表达也有深远的影响。D47N放大了这些影响，因为这些细胞产生野生型的、天然SHMOOSE。

实施例7.动物研究

SHMOOSE减轻小鼠的体重增加；改善肝脏酶。发明人对小鼠饲喂高脂肪饮食2周，并且发现：IP注射SHMOOSE的小鼠体重没有增加那么多；SHMOOSE进入血流并具有强的半衰期；SHMOOSE降低AST和ALT(这些酶参与肝脏代谢)。较低的水平表明保护免受高脂肪饮食的影响。

实施例8.SHMOOSE类似物

发明人制备了103个类似物(表1)。参考图10，在顶部的图中，每个条棒代表SHMOOSE肽的25个氨基酸的片段。本发明人发现，如通过MTT测定的，两种肽具有比SHMOOSE更大的活性。在图10中，底部的图示出这些类似物的假磷酸化关闭了活性。图11示出具有序列PCLTTWLSQLLKDN(SEQ ID NO：95)的SHMOOSE肽的示例性类似物。该类似物的序列长度为14个氨基酸，并表征了该类似物的3个不同的分析窗口，每个窗口具有11个氨基酸。

实施例9.SHMOOSE的结构特征

同源性研究表明SHMOOSE的前15个氨基酸残基与线粒体定位和核输出相关的蛋白质序列有关。该N末端区域在哺乳动物中更高度保守，包括在小鼠中具有保守性的26个氨基酸。

相比之下，多达30个氨基酸的C末端区域与易于识别的哺乳动物肽或蛋白质几乎没有或没有同源性。这反映了多细胞生物体中的线粒体的细菌起源。

人脑中的SHMOOSE共表达识别标志与核和线粒体核糖体组织相关的基因一起示出。

SHMOOSE ORF中的A SNP(rs2853499)与神经退行有关。Rs2853499预测阿尔茨海默病；它还预测人类大脑颞叶皮质的解剖结构(UK Biobank；n＝20000)。

转录组识别标志分析鉴定了SHMOOSE mtSNP携带者、认知正常个体(n＝78)中差异表达的基因，这示出SHMOOSE不仅与线粒体基因共表达，而且还区分核糖体生物发生基因的表达。

研究了SHMOOSE的药代动力学，其中在25周龄的C57/BI6小鼠中腹膜内注射2.5mgSHMOOSE/kg。

进一步的研究包括通过APEX融合的、FLAG融合的和内源性的CoIP进行结合伴侣测定；进行稳定细胞系RNA测序；进行体内肝和脑RNA测序2小时、14天和28天；以及在人体组织中进行ELISA靶向定量。

进一步设想的是，在一些实施方式中，SHMOOSE或其片段或其SNP变体通过侧脑室内注射而施用。由于SHMOOSE减轻饲喂高脂肪饮食的小鼠的体重增加并进入循环系统，因此SHMOOSE的外周效应可能是通过神经生物学机制介导的。考虑到SHMOOSE与神经退行和肽的“可成药性”的组合效应，还设想的是SHMOOSE可以充当痴呆症的治疗靶点。因此，在一些实施方式中，设想通过施用靶向或特异性结合(或阻断)SHMOOSE的试剂(例如针对SHMOOSE的抗体或其片段)来治疗或降低痴呆症的严重程度的方法。这可以在AD的三重转基因小鼠模型(3×Tg-AD)中进行测试，该模型表达Aβ斑块和负载tau的神经原纤维缠结，以及突触和行为缺陷。

实施例10.线粒体rs2853499出现在先前未注释的微蛋白中并与AD和神经成像表型相关

首先，发明人测试了sORF中的线粒体SNP与AD相关的假设。此前，据报道，在ADNI1队列中(n＝～300)，线粒体单倍群U与AD相关。从那时起，ADNI以多个新阶段扩大了其队列规模，发明人将其纳入线粒体广泛关联研究(MiWAS)。通过评估ADNI 1、GO 2和3(n＝～800)，本发明人确认了与AD相关的单倍群U SNP(即，碱基对位置11467、12308和12372)(图1A)。这三个单倍群SNP不会改变mt-ND4和mt-ND5蛋白的氨基酸序列。然而，碱基对位置12372(rs2853499)处的mtSNP确实改变了由sORF、SHMOOSE(Small Human MitochondrialORF Over SErine tRNA)编码的微蛋白的氨基酸序列。具体地，rs2853499(此后称为SHMOOSE.D47N)将第47个氨基酸从谷氨酰胺改变为天冬氨酸(图1D)。在ADNI中，SHMOOSE.D47N携带者呈现出1.56的优势比(病例频率：22.9％；对照频率：15.7％；95％CI：1.06-2.30；排列86经验p值<0.03)。

此外，本发明人检验了SHMOOSE.D47N在三个额外队列中的影响：宗教秩序研究(ROS)和记忆与衰老项目(MAP)、迟发性阿尔茨海默病(LOAD)和NIA阿尔茨海默病中心(ADC1和ADC2)。SHMOOSE.D47N携带者在ROSMAP、LOAD和ADC1/2中分别呈现1.55(病例频率：25.3％；对照频率：17.6)、1.04(病例频率：24.7％；对照频率：23.0％)和1.13(病例频率：24.0％；对照频率：23.3％)的优势比。发明人分析了这些队列并考虑了队列特异性等位基因频率差异。尽管发明人在ADNI和ROSMAP中没有观察到SHMOOSE.D47N携带者的显著的线粒体遗传异质性，但发明人确实在LOAD和ADC1/2中观察到了SHMOOSE.D47N携带者的线粒体遗传异质性，发明人在统计模型中对此进行了校正(图19)。总之，随机效应meta分析估计SHMOOSE.D47N的优势比为1.30(95％CI：1.06-1.59；p值<0.005；图1B)。另请参见表2。

表2.针对AD跨队列的SHMOOSE mtSNP效应

此外，发明人在健康与退休研究(HRS)中估计了SHMOOSE.D47N对认知能力下降的影响，这是针对50岁或以上(n＝～15000)的美国成年人的基于人群的研究16，注意到替代等位基因携带者随着时间推移的认知能力下降更快(图13)。由于具有SHMOOSE mtSNP(A等位基因)的个体被预测具有加速的认知能力下降，这些个体可被鉴定为认知能力下降的早期治疗对象。

由于GWAS/MiWAS容易产生虚假的关联，发明人进行了全表型组关联研究(PheWAS)，所述研究包括针对约18300名欧洲祖先个体的大样本的约4000种神经成像模式。PheWAS的显著优势是SHMOOSE.D47N跨相关神经生物学表型的复制，由于其强大的能力，它具有针对性和统计稳健性。在PheWAS中，SHMOOSE.D47N(频率：25.5％)与数个旁边缘区域(包括海马旁回、内嗅皮质(EC)、前扣带皮质(ACC)、后扣带皮质(PCC)以及颞极(TPO))中的皮质厚度、体积、软脑膜表面积、WM表面Jacobian和GM/WM对比度显著相关(按聚类方式，RFT校正的p值<0.05；图12)。随着年龄的增长，SHMOOSE.D47N携带者表现出海马旁回(图1C)、EC和PCC的加速变薄。也就是说，SHMOOSE.D47N的跨年龄轨迹在年轻和老年时表现出相反的影响。例如，SHMOOSE参比等位基因与中年(45岁-65岁)和/或低龄老年(65岁-75岁)时较小的大脑结构测量相关，而替代等位基因(即，SHMOOSE.D47N)与老年(>75岁)时的结构损失相关。除了在旁边缘区域的主要结果外，在未校正p值<0.05的宽松阈值下，发明人还观察到在语言中枢(颞上回和额下回)、背外侧和内侧前额叶皮质、中央运动系统和枕视觉皮质中的SHMOOSE.D47N影响的分布趋势(图20)。另外，发明人在ADNIPheWAS中观察到类似的趋势，其是在用于ADNI排列MiWAS的相同样品上进行的。正如本发明人在UK Biobank中观察到的，SHMOOSE.D47N在未校正p值<0.05的宽松阈值下与边缘区域(如内侧颞叶皮质和后扣带皮质)显著相关(图21)。

由于rs2853499与神经成像结果和AD相关，并且所述变体使SHMOOSE氨基酸序列突变(图1D)，发明人试图检测内源性SHMOOSE。因此，本发明人首先评估了针对69例非痴呆性死后大脑颞叶皮质的SHMOOSE RNA计数和核编码基因计数之间的131种相关性。这些分析揭示了与SHMOOSE共表达的线粒体细胞区室(图1E)。事实上，使用针对SHMOOSE的C末端的定制抗体，发明人通过蛋白质印迹从神经元线粒体和细胞核组分中检测到预测的～6kDa分子量的SHMOOSE(图1F)。然而，在rho-0细胞(即，没有mtDNA的细胞)中，发明人没有检测到SHMOOSE，进一步证实SHMOOSE来源于线粒体DNA。

总之，发明人在其sORF中鉴定出与AD和大脑结构相关的遗传变体后，靶向并检测到了新的微蛋白SHMOOSE。

实施例11.脑脊液中的SHMOOSE水-平与年龄、tau和脑白质微观结构相关

开发了新的测定或测试来量化生物组织中的SHMOOSE的水平。特别地，通过使用针对SHMOOSE的第32-58位氨基酸的抗体开发了酶联免疫吸附夹心测定(ELISA)。CSF中的SHMOOSE水平与年龄、tau和脑白质微观结构相关。在AD大脑的颞叶皮质中，SHMOOSE RNA比对照高约15％(AD n＝82；对照n＝78；图2A)。也就是说，阿尔茨海默病大脑的颞叶皮质中的SHMOOSE的RNA水平较高。但为了直接评估微蛋白水平，本发明人开发了灵敏度范围为100pg/mL-250000pg/mL的SHMOOSE酶联免疫吸附测定(ELISA)(图14)。在来自南加州大学(USC)AD研究中心的非痴呆个体的79个脑脊液样本(CSF)中，发明人分析了年龄、CSF β淀粉样蛋白、CSF总tau、残基编号181处的CSF磷酸化tau(p taul81)和白质微观结构(通过扩散张量成像分数各向异性测定)对SHMOOSE水平的影响。CSF SHMOOSE水平与年龄、CSF总tau和CSF p tau 181呈正且显著的相关(图2B)。因此，脑脊液中的SHMOOSE的实际肽水平与年龄、tau和磷酸化tau相关。为了确定p tau 181对SHMOOSE水平的影响是否通过总tau介导，本发明人进行了介导分析，其中总tau被认为是介导物。这种介导的间接影响被认为在统计学上并不显著，并且当控制总tau时，p tau 181对SHMOOSE的直接影响略有减弱(p值＝0.060)。ptau 181对SHMOOSE的直接和间接影响在一起是显著的(p值<0.01)。因此，p tau 181看起来特异性地驱动与SHMOOSE的关系，并且不是由总tau介导(图15)。另外，发明人没有观察到β淀粉样蛋白42的CSF水平和SHMOOSE之间的显著相关性。最后，即使在控制年龄、生物性别和认知状态(CDR测试分数)之后，发明人发现具有较高CSF SHMOOSE水平的个体在胼胝体和双侧上放射冠中也具有较低的DTI分数各向异性FA(图2C)。

实施例12.SHMOOSE与线粒体和核糖体基因表达改变相关

鉴于发明人观察到SHMOOSE基因型的神经成像模式差异，发明人进一步假设大脑基因表达将因SHMOOSE基因型(即，SHMOOSE.D47N)而不同。因此，发明人分析了源自69例死后大脑颞叶皮质的RNA-Seq数据(Mayo Clinic；n＝14个替代等位基因且n＝55个参比等位基因)。发明人观察到在p调整值为0.05下，SHMOOSE.D47N与大脑颞叶皮质中的2122个差异表达基因相关。也就是说，在Mayo Clinic颞叶皮质RNA-Seq中的SHMOOSE基因型之间观察到基因表达差异。非常显著地，源自基因计数矩阵的主要成分揭示了SHMOOSE参比等位基因表达的聚类，而SHMOOSE.D47N携带者的识别标志则进一步偏离了参比等位基因簇。通过基于第二主成分的中值对样品进行分类，SHMOOSE.D47N携带者表现出显著的全局基因表达偏差(p值<0.05；图3A)。考虑到死后大脑基因表达受到数个因素(即环境等)的影响，本发明人认为SHMOOSE.D47N的显著影响极其值得注意。作为对比，本发明人注意到APOE4携带者的类似的趋势，其中APOE4携带者趋于远离人群标准，尽管该趋势在统计学上并不显著(图16)。SHMOOSE.D47N携带者的这些统计学差异表达基因富集了核糖体和线粒体的GO细胞区室项。

接下来，为了确定SHMOOSE.D47N对基因表达的影响是否可以在体外重现，发明人在向神经细胞施用SHMOOSE或SHMOOSE.D47N 24小时后施行差异化的转录组学。经SHMOOSE.D47N处理的细胞在0.2的p调节值下诱导1400个基因的差异化表达。也就是说，在用SHMOOSE或SHMOOSE.D47N处理的细胞之间观察到基因表达差异。事实上，这些重要的基因富集了线粒体和核糖体细胞区室，就像通过69例死后人类大脑中观察到的SHMOOSE基因型那样。“线粒体内膜”是最富集的GO细胞区室项(图3B)。

本发明人还将SHMOOSE腹膜内注射(IP)至饲喂高脂肪饮食(即，轻度代谢紊乱)的12周龄C57BL/6J小鼠。在两周的研究结束时，发明人收集了大脑和肝脏用于RNA-Seq。正如本发明人对于SHMOOSE.D47N携带者和在体外实验中所观察到的，在0.05的p调节值下，367个差异化表达的基因在肝脏中富集线粒体和核糖体项(图3C)。也就是说，在SHMOOSE的IP注射后观察到肝脏表达差异。在SHMOOSE的IP注射后也观察到大脑下丘脑表达差异。此外，在SHMOOSE的IP注射后观察到皮质表达差异。然而，尽管本发明人在小鼠皮质和下丘脑中观察到如PCA所示的全局基因表达改变，但最富集的项包括中枢神经系统相关项，而不是核糖体或线粒体特异性(图17)。此外，在SHMOOSE的IP注射后，观察到大脑海马体的表达差异。本发明人也没有在海马体中观察到强健的基因表达差异(图15)。与经对照处理的小鼠相比，用SHMOOSE处理的小鼠没有表现出毒性影响、也没有表现出行为改变，并且示出减弱的体重增加以及肝酶AST和ALT升高(食物摄入没有改变)(图18)。

实施例13.SHMOOSE修饰细胞代谢活性并保护其免受β淀粉样蛋白毒性

由于SHMOOSE与差异化的线粒体基因表达相关(图4A-图4C)，发明人假设SHMOOSE将在体外诱导代谢改变。事实上，当SHMOOSE被外源性施用至细胞时，肽主要定位至线粒体(图4A)。在从1μM到10μM的剂量依赖性反应中，SHMOOSE和SHMOOSE.D47N分别增加了10％和20％的神经细胞代谢活性(图4B)。因此，当被给予至细胞时，SHMOOSE以剂量反应的方式增强代谢活性。在线粒体应激期间，在施用寡霉素和FCCP后，允许最大质子流通过线粒体内膜，SHMOOSE和SHMOOSE.D47N都增强了线粒体的闲置产能(图4C)，表明两种形式的SHMOOSE对线粒体生物学的整体影响。然而，与SHMOOSE.D47N相比，野生型SHMOOSE显著增加了约20％的基础耗氧率(图4D)。

此外，在来源于具有APP和PSEN1突变(两种家族性AD突变)两者的iPSC的神经元中，SHMOOSE RNA表达比源自仅具有一个突变的神经元高出三倍，表明SHMOOSE在β淀粉样蛋白生物学中的作用(图4E)。同样，在用低聚化的β淀粉样蛋白应激的神经元细胞中，SHMOOSE施用保护免于细胞死亡，但SHMOOSE.D47N不会类似地保护细胞(图4F)。

实施例14.SHMOOSE与线粒体内膜mitofilin相互作用用

本发明人通过进行免疫共沉淀测定来寻找SHMOOSE蛋白相互作用伴侣。最终，发明人将mitofilin鉴定为与SHMOOSE相互作用的蛋白质伴侣。基于掺入SHMOOSE的神经元裂解物的蛋白质组学分析，后随着基于SHMOOSE抗体的免疫沉淀，靶向mitofilin。这些裂解物的基于质谱法的分析表明SHMOOSE结合了98种蛋白质；然而，在通过p值和倍数变化进行的索引和蛋白质定量过滤的过程中，本发明人认为mitofilin是首选的SHMOOSE结合蛋白候选物(图5A)。事实上，在向神经细胞施用SHMOOSE后，发明人通过相互免疫沉淀和随后的蛋白质印迹验证了SHMOOSE-mitofilin相互作用(图5B)。此外，本发明人在重组SHMOOSE和mitofilin之间进行了相互的基于斑点的免疫印迹(reciprocal dot-basedimmunoblots)，证实了mitofilin与SHMOOSE和SHMOOSE.D47N之间的结合(图5C)。此外，在使用siRNA敲低mitofilin后，如通过MTT测定所测量的，本发明人观察到SHMOOSE对神经细胞代谢活性无影响(图5D)。发明人使用HDOCK(基于模板和无模板对接的混合算法)对SHMOOSE和mitofilin之间的生物物理相互作用进行建模(图5E)，注意到预测的SHMOOSE和mitofilin之间的相互作用集中在mitofilin的C末端(残基332-413)。

讨论

本发明人最初靶向SHMOOSE，因为SHMOOSE sORF中的线粒体SNP与大型流行病学队列中的脑基因表达、神经成像模式和AD相关。在四个队列中，具有SHMOOSE.D47N的个体表现出AD的风险增加(OR：1.30；图1B)。在基于神经成像的PheWAS中，SHMOOSE.D47N携带者随着年龄变化在内侧颞叶区域(如海马旁回、内嗅皮质、前扣带回皮质和顶叶扣带回皮质)具有更大的萎缩。已知内侧颞叶皮质和顶叶扣带回皮质在阿尔茨海默病(AD)中很脆弱，并且病理性萎缩可能在临床症状前数年出现。发明人还在ADNI中检查了脑神经成像，并在边缘区域中观察到了类似的影响，但没有结果通过多次校正，并且发明人缺乏UK Biobank(n＝～18300)提供的影响力。此外，SHMOOSE.D47N的跨年龄轨迹在年轻和老年时表现出相反的影响。SHMOOSE参比等位基因与中年(45-65岁)和低龄老年(65-75岁)时较小的大脑结构测量相关，而替代等位基因与老年(>75岁)时的结构损失相关。对于经常与年龄敏感的认知功能和神经退行性病变(例如，脑源性神经营养因子)相关的数种其他基因，已经观察到年轻和老年样本中的这种相反的遗传效应。

考虑到该SHMOOSE SNP与神经生物学表型(即，AD和神经成像模式)之间的遗传关联，本发明人通过开发针对SHMOOSE的第32-58位氨基酸残基的多克隆抗体来对SHMOOSE进行生物化学靶向。同样，本发明人通过蛋白质印迹在神经元线粒体和细胞核中检测到预测的～6kDa的SHMOOSE，而本发明人在缺乏线粒体DNA的细胞中没有观察到SHMOOSE检测。此外，发明人发现CSF SHMOOSE与年龄、tau和脑白质呈正相关。由于较高水平的CSF tau先前预测了AD，SHMOOSE和tau之间的相关性表明SHMOOSE可能参与AD的进行性病因，并且可以为生物标记。此外，本发明人观察到，在非痴呆的老年人中，较高的CSF SHMOOSE水平与DTI FA相关。多种因素可能导致较低的DTI FA，但它可能反映较低水平的髓鞘形成，并且通常与疾病状态有关。髓磷脂的维持和修复需要代谢，并且当存在能量不足时特别容易受到损伤，这提供了线粒体肽和白质微观结构之间的可能联系。较高的CSF SHMOOSE和较低的区域DTIFA之间的关系可能表明大脑中的代谢或其他应激源的不完全补偿。

本发明人进一步评估了人群队列中的SHMOOSE SNP(即，SHMOOSE.D47N)以推断生物学机制。非常显著地，单独的SHMOOSE.D47N SNP使人脑转录组分化，因为具有SHMOOSE.D47N的死后大脑通过PCA的基因表达识别标志偏离了SHMOOSE参比等位基因簇。考虑到环境、寿命等对人脑转录组学的影响，这是出乎意料的。同样，在体外，SHMOOSE和SHMOOSE.D47N的基因表达差异富集了线粒体内膜和核糖体区室。此外，在涉及SHMOOSE的IP注射的体内研究中，发明人还观察到大脑以外的肝脏中的核糖体和线粒体内膜基因表达变化，表明SHMOOSE能够作用于非神经系统。用SHMOOSE处理的这些小鼠在高脂饮食期间经历减弱的体重增加，任意地伴随肝酶ALT和AST的轻度降低。

在所有的转录组学研究中，发明人观察到线粒体内膜富集的共同主题，发明人认为这是值得注意的，因为SHMOOSE在多个模型中结合线粒体内膜mitofilin。mitofilin是MICOS复合体的组成部分，该复合体调节线粒体嵴连接和内膜组织。另外，发明人观察到核糖体项的转录富集，其可通过SHMOOSE-mitofilin相互作用来解释，因为通路共用蛋白质-蛋白质相互作用(Pathway Commons Protein-Protein Interactions)数据集显示出近1800种与mitofilin的相互作用蛋白，其中的137种是核糖体蛋白。

尽管过去的MiWAS研究已经检查了mtSNPs对神经退行性病变的影响，但很少有跟进实验。MiWAS的一个功能限制是隔离个体mtSNP的影响，因为这些SNP限定了更广泛的单倍群。作为结果，发明人不能排除SHMOOSE.D47N单倍群(即，单倍群U)内的其他SNP具有独立于SHMOOSE的影响(例如对tRNA的影响)。然而，该SNP的唯一错义效应是针对SHMOOSE微蛋白，并且发明人使用这一多表型策略来鉴定用于实验验证的微蛋白候选物(即，SHMOOSE)。

发明人的数据具有数种含义。首先，区分于SHMOOSE，发明人示出线粒体DNA变体能够与数种可有助于功能解释(即，疾病分类、结构解剖和基因表达)的神经生物学表型相关。也就是说，发明人示出了由SNP引起的SHMOOSE的自然发生版本，所述版本与人类的大脑解剖结构、大脑基因表达和AD有关。其次，发明人揭示了线粒体DNA变体能够被映射到编码生物功能微蛋白的sORF。随着具有遗传数据的大的人类队列继续添加全基因组测序数据，可以预见的是，这种精细的mtDNA分辨率将产生额外的微蛋白。此外，随着蛋白质组学技术的进步，还可以设想检测到更多的线粒体编码的微蛋白。第三，SHMOOSE的CSF水平、CSF AD相关的生物标记(如，tau)和脑白质之间的相关性表明SHMOOSE具有作为生物标记的潜力。最后，SHMOOSE看起来是影响线粒体生物学的另一种微蛋白，因为最近的微蛋白发现(如，mitoregulin、BRAWNIN、MIEF-MP1)也对线粒体生物学产生了深远影响。

方法

线粒体广泛关联研究(MiWAS)和mtSNP AD关联分析

测试了ADNI1、ADNI GO、ADNI2和ADNI3中的线粒体遗传变体可能对AD的影响。发明人对先前针对ADNI1报道的MiWAS结果进行了跟进。在发明人的分析中，来自ADNI1、ADNIGO、ADNI2和ADNI3的线粒体基因型和诊断都被合并用于分析。ADNI1样本使用Illumina610-Quad BeadChip进行基因分型，而ADNI GO/2样本使用不含mtSNPs的IlluminaHumanOmniExpress BeadChip进行基因分型。然而，对ADNI1/GO/2样本进行了全基因组测序，并且包括线粒体基因型。这些全线粒体基因型经过具有严格的质量控制的处理，并且以变体调用格式提供。使用Illumina Infinium Global Screening Array v2(GSA2)对ADNI3样本进行基因分型。使用PLINK(v1.9)将线粒体全基因组测序数据转换为合适的格式，并以PLINK bed/bam/bim格式与ADNI1和ADNI3合并。合并遗传数据后，在MiWAS期间，对于总共448例临床可能病例和290例对照而言保留138个mtSNP。MiWAS排列模型包括ADNI指出的欧洲血统个体5％的次要等位基因频率阈值，剩下29个mtSNP符合排列条件。本发明人通过对mtSNP进行主成分分析来进一步评估线粒体遗传混合的程度。这些主成分是通过mtSNP矩阵的奇异值分解而生成的，输出以最小量的值接近矩阵的特征向量(R中的prcomp函数)，如其他地方所示。线粒体遗传混合程度较低，并且对排列方式而言是理想的。经验p值低于0.05的任何mtSNP都被认为是统计学上显著的。对最显著的mtSNP进行了共957次排列，所述mtSNP发生在SHMOOSE sORF中并成为微蛋白候选物。另外，本发明人使用逻辑回归，估计了SHMOOSE mtSNP在Rush阿尔茨海默病中心(RADC)中的影响，所述中心包括宗教秩序研究(ROS)和记忆与衰老项目(MAP)、迟发性阿尔茨海默病(NIA-LOAD)和NIA阿尔茨海默病中心(ADC1和ADC2)队列。使用全基因组测序对ROSMAP样本进行基因分型，并以VCF格式向合格用户提供线粒体基因变体。使用Illumina 610-Quad BeadChip对LOAD样品进行基因分型，并使用Ilumina Human660W-Quad BeadChip对ADC1和ADC2样品进行基因组分型。ROSMAP(n＝281例和n＝233对照)、LOAD(n＝993例和374n＝883对照)和ADC1/2(n＝2261例和n＝654对照)中的线粒体遗传混合也通过实施线粒体主成分分析来评估(图13)；发明人在LOAD和ADC1/2中观察到SHMOOSE替代等位基因携带者的线粒体遗传异质性，并因此将前三个线粒体主成分包括在逻辑回归模型中，以年龄和生物性别作为额外的协变量。对于meta分析，将年龄和生物性别纳入ADNI模型中。在ROSMAP、LOAD和ADC1/2中估计SHMOOSE mtSNP的影响后，使用metafor R包的随机效应模型方法进行meta分析。

神经成像表现型广泛关联研究(PheWAS)

这项工作是使用ADNI和UK Biobank资源(ukbiobank.ac.uk)按照批准的25641项目进行的。发明人使用了2018年8月发布的22392名参与者的大脑MRI成像(UK Biobankdata-field：110)(biobank.ctsu.ox.ac.uk/crystal/label.cgi？id＝110)。在UK Biobank大脑成像文档(biobank.ctsu.ox.ac.uk/crystal/refer.cgi？id＝1977)和协议表格(biobank.ctsu.ox.ac.uk/crystal/refer.cgi？id＝2367)中描述了MRI采集的细节。此研究弃去1002名MRI扫描未通过手动质量评估的参与者，45名因数据撤回或图像处理失败的参与者，以及3055名没有英国白人血统和/或未通过遗传数据的样本质量控制的参与者(biobank.ctsu.ox.ac.uk/crystal/label.cgi？id＝100313)，得到18330名年龄范围在45岁-81岁(平均年龄＝63.27+7.45岁)之间的个体、8729名男性(47.62％)和4680名SHMOOSEmtSNP携带者(25.53％)的样本。使用FreeSurfer软件包v6.0(surfer.nmr.mgh.harvard.edu)处理所有MR图像以提取全脑形态学测量值。FreeSurfer的工作流程包括：体积T1加权图像的运动校正和平均、非脑组织的去除、自动的Talairach变换、脑体积分割、强度归一化、灰质(GM)和白质(WM)之间的边界镶嵌、自动拓扑校正，以及遵循强度梯度的表面变形，以将GM/WM和GM/脑脊液边界最佳地放置在其中强度的最大变化定义了向其他组织类别的过渡的位置处。每个半球的GM和WM表面由163842个顶点组成，这些顶点排列为327680个三角形。一旦表面模型完成，就会执行许多可变形的程序来进行进一步的数据处理和分析，包括：表面膨胀、使用个体皮质折叠模式配准到球形图集以匹配受试者的皮质几何形状，以及最终创建各种基于表面的大脑形态学衡量指标。MRI处理的所有程序均在LONI管道系统(pipeline.loni.usc.edu)上实施，以用于高性能并行计算。此研究包括9项顶点方向的大脑形态学测量：皮质厚度、体积、WM表面积、软脑膜表面积、脑沟深度、WM表面Jacobian、GM/WM对比度、平均曲率和高斯曲率。有关这些基于表面的衡量指标的详细信息在surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/可获得。简而言之，将皮质厚度值计算为每个顶点处的灰质和白质表面之间的最短距离。通过将GM和WM表面之间的每个斜截三棱锥划分为三个四面体来计算顶点体积。通过将每个三角形面积的三分之一分配给每个顶点来估计针对软脑膜和WM表面的顶点表面积测量。脑沟深度传达了关于表面上特定顶点从存在于脑回和脑沟之间的假想的中表面移动多远的信息。它给出了线性距离和位移的指示：脑褶有多深和有多高。表面Jacobian测量了表面被扭曲多少以配准到球形图集。GM/WM对比度表示白质和灰质之间的逐顶点的百分比对比度，其中将WM在白色表面下1mm处采样，并将GM在皮质中的厚度的30％处采样。平均曲率是顶点处的两个主曲率的平均值。高斯曲率是顶点处的两个主曲率的乘积。在统计分析之前，使用全宽半最大值为20mm的高斯核函数在镶嵌表面上对这些基于表面的数据进行平滑处理，以提高信噪比并减少错误配准的影响。所有的UK Biobank参与者均使用Affymetrix UK BiLEVE Axiom阵列进行基因分型(针对最初的约50000名参与者)，并且Affymetrix UK Biobank Axiom阵列(针对剩余的约450000名参与者)使用Affymetrix UK Biobank Axiom阵列进行基因分型。使用PLINK2.0软件从基因分型阵列中提取SHMOOSE基因型。为捕获种群结构，UKB团队从高质量的基因分型数据集53计算了前40个主成分(PC)。此外，为了捕获隐藏在线粒体基因组中的群体结构，发明人还使用线粒体主成分分析计算了线粒体PC。为了测试SHMOOSE mtSNP对与年龄相关的大脑结构差异的影响，发明人通过用如下的模型在给定的形态学测量值Y_i的每个皮质表面顶点i处实施线性混合效应回归，评估了SHMOOSE mtSNP基因型与年龄之间的相互作用：

Y_i＝intercept+β1G+β₂Age+β₃Age×G+ei

其中，G是SHMOOSE mtSNP基因型，Age是扫描仪中的个体的年龄，e是残差，intercept和β项是固定效应。将性别、颅内容积(ICV)、细胞核和线粒体PC作为混杂变量添加到模型。使用适于神经成像数据的空间平滑度的随机场理论(RFT)方法，将所有顶点处的统计结果都针对跨大脑表面的家庭错误率(FWER)进行了校正。所有基于表面的分析都使用Neuroimaging PheWAS系统进行，该系统是用于大数据、全脑成像关联研究的云计算平台。

认知能力下降分析

在HRS中，发明人通过实施混合效应回归方法评估了SHMOOSE基因型对衰老过程中纵向认知能力下降的影响。HRS使用HumanOmni2.5阵列直接对256个线粒体SNP进行基因分型。使用PLINK2.0提取SHMOOSE基因型。经验证的HRS认知得分代表情景记忆学习、情景记忆检索、语义流畅性和定向。混合效应模型包括欧洲祖先个体的生物性别、线性和二次年龄、线粒体遗传祖先和SHMOOSE基因型的固定效应项。除了衰老过程中认知评分变化率的个体间差异(即每两年随访一次)之外，在65岁时的个体差异之间还包含受试者特定的随机效应。使用R中的lme4包进行分析。共对8072名个体以45465个总数据点进行单独评估。

SHMOOSE蛋白结构预测

将RoseTTAFold用于预测SHMOOSE的微蛋白结构。完整的算法细节已在其他地方全面详细说明。与Alphafold2相比，RoseTTAFold对于复杂蛋白质实现了类似程度的准确度。对野生型版本的SHMOOSE和SHMOOSE.D47N进行建模，并将输出文件472下载为PDB格式。

共表达分析

发明人利用了Mayo生成的转录组数据(Synapse ID：syn5550404)。SHMOOSE转录本计数矩阵从提供的bam文件创建。这通过构建GTF格式的sORF数据库并实施R中的GenomicAlignments包的汇总重叠函数(summarizeOverlaps function)来完成。然后，使用归一化计数来建立SHMOOSE计数和所有核编码基因计数之间的相关性，并使用0.05的错误发现率(FDR)校正多个假设。使用clusterProfiler包的enrichGo函数来测试与SHMOOSE表达统计学上相关的基因的富集，所述函数在FDR控制后返回基因本体(GO)类别的富集。从enrichGo函数输出的数据用于使用R中的ggplot2来生成图示。

细胞

研究中使用的SH-SY5Y细胞购自ATCC(CRL-2266)。细胞在具有10％FBS的DMEM/F12中于37℃和5％CO₂下生长，并根据汇和度每4-7天分裂一次。此外，如前所述，对于rho 0细胞，通过添加5μg/mL溴化乙锭、50μg/mL尿苷和1mM丙酮酸盐约两个月来耗竭SH-SY5Y细胞的线粒体DNA。如前所述，对于所有实验，通过在具有1％FBS的DMEM/F12中加入10μM视黄酸来使细胞分化，并且培养基每48小时更换一次，总共更换两次。如有指示，用化学合成的SHMOOSE对细胞进行处理，所述SHMOOSE由GenScript通过固相肽合成方法制备。

用三氟乙酸(TFA)裂解来自树脂的合成的肽。肽合成后，除去残留的TFA，并且重组SHMOOSE的pH为中性。

亚细胞分级分离

从经培养的SH-SY5Y细胞中制备细胞质、细胞核和线粒体级分。为了提取细胞核，将细胞在冰冷的DPBS中洗涤，并在含有10mM HEPES pH 7.6、3mM MgCl₂、10mM KCl、5％(v/v)甘油、1％Triton-X100和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的分级分离缓冲液中重悬15分钟，然后在4℃下以250×g离心5分钟。将所得上清液在4℃下以18000×g进一步离心10分钟，以获得相对纯的细胞质级分。在18000×g离心前，将原始沉淀在10mM HEPES pH 7.6、1.5mM MgCl₂、10mM KCl和蛋白酶/磷酸酶抑制剂中洗涤，并在250×g和4℃下离心。然后将洗涤后的沉淀重悬于含有20mMHEPES pH 7.6、1.5mM MgCl₂、420mM NaCl、25％(v/v)甘油、0.2mM EDTA和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的核提取缓冲液中，然后在冰上以30％的振幅进行3次5秒的超声处理(间隔10秒)。将经超声处理的沉淀在4℃下以18000×g离心10分钟，以获得相对纯的核裂解物。为了提取线粒体，将细胞在冰冷的DPBS中洗涤，并在含有10mM NaCl、1.5mM MgCl₂和10mM Tris-HCl pH 7.5的2mL低渗缓冲液中重悬7.5分钟。低渗孵育后，将细胞转移到玻璃匀浆器中，并通过用杵直接向下按压20次均质，使细胞裂开，同时保持线粒体的完整性516。然后将线粒体均质缓冲液(MHB)添加到2mL经均质的样品中，以实现1×浓缩(210mM甘露醇、70mM蔗糖、20mM HEPES和2mM EGTA)。然后将匀浆转移到干净的5mL试管，并在4℃下以17000×g离心15分钟。将所得沉淀在MHB缓冲液中洗涤并再离心两次，然后将线粒体沉淀重悬在RIPA裂解缓冲液中，并且最后的离心步骤为4℃下以14000×g离心10分钟以获得相对纯的线粒体裂解物。对于外源性SHMOOSE施用，将1μM的SHMOOSE施用至细胞30分钟，在冷的PBS中洗涤两次，并分级分离。将5mg-15mg的蛋白质在NuPAGE样品缓冲液中还原，并在NuPAGE4％-12％Bis-Tris凝胶上跑胶。将蛋白质转移到PVDF膜，用TBS 0.1％吐温中的5％BSA封闭，并在4℃下与各自的抗体以1：1000稀释度孵育过夜。第二天，将膜用0.1％TBST洗涤，并用针对各自来源的一抗种类的与HRP缀合的二抗以1：30000孵育，然后使用ECl试剂激发5分钟。

SHMOOSE抗体的产生和ELISA的开发

兔抗SHMOOSE血清由Yenzyme抗体(San Francisco，CA)生产。根据制造商的方案，使用带有UltraLink Support(Thermo Scientific)的CarboxyLink Immobilization试剂盒从兔抗SHMOOSE血清中纯化SHOOSE亲和抗体。简言之，将抗血清施加于合成的SHMOOSE肽固定柱上，并通过280nm的UV吸光度对洗脱的级分进行定量。通过内部的ELISA测量SHOOSE的循环水平。在测定前，用90％乙腈和10％1N HCl提取CSF。为了测量内源性SHMOOSE水平，使用合成的SHMOOSE肽作为标准品，其范围为100pg/mL至20000pg/mL。简言之，用抗SHMOOSE多克隆抗体包被96孔微量滴定板3小时，然后用SuperBlock缓冲液(Thermo Scientific)封闭所述板。接下来，将标准品、对照或提取的样品和预先滴定的检测抗体加入适当的孔中并孵育过夜。随后洗涤3次，向孔中加入链霉亲和素-HRP缀合物并孵育30分钟。四次洗涤后，加入超灵敏TMB(Thermo Scientific)并孵育10分钟-20分钟。通过加入2N硫酸终止反应，并在450nm处在酶标仪上测量吸光度。SHOOSE-ELISA的批内和批间变异系数(CV)分别小于10％。

CSF SHMOOSE水平与CSF tau、CSF p tau 181和大脑DTI之间的相关性

发明人考虑了通过南加州大学阿尔茨海默病研究中心(ADRC)招募的79名受试者的数据，这些受试者具有可得的扩散MRI(dMRI)扫描和SHMOOSE的CSF测量。其中，1个没有能用的dMRI扫描，而6个因质量评估鉴别的预处理失败而被排除(参见扩散MRI预处理)。最终样本包括72名非痴呆老年人(平均65.7岁；47岁-82岁)，他们具有扩散MRI扫描，该扫描通过了SHMOOSE的所有质量检查和可用的CSF测量。受试者的临床痴呆评分(CDR)的得分为0(56名受试者)或0.5(16名受试人)。受试者种族/族裔自我报告为：白人(53)、亚洲人(12)、美洲印第安人或阿拉斯加原住民(3)、多于一个种族(4)、未报告种族(1)；西班牙裔/拉丁裔(任何种族)(10)、非西班牙牙裔/非拉丁裔(任何种族)(62)。MR图像是在南加州大学阿尔茨海默病研究中心(ADRC)的3Tesla Siemens Prisma扫描仪上采集的。采集解剖矢状T1加权磁化制备的快速采集梯度回波(MPRAGE)扫描参数(TR 2300ms；TE 2.95ms；1.2×1.0×1.0mm³体素大小)。发明人还获得了64向(b＝1000s/mm²)的扩散MRI扫描(TR 7100ms；TE 71.0ms；2.5×2.5×2.5mm³体素大小)。所有扫描都进行了视觉的质量评估。对于每个受试者，使用带有Rician滤波器的局部主成分分析(LPCA)工具用MATLAB版本R2014b软件(MathWorks，Natick，MA)对扩散图像进行去噪，并进行强度偏差校正。DWI的失真校正包括使用MRtrix3的Gibbs ringing的校正，以及使用FSL实用程序中的eddy_correct工具的涡电流校正(FSL5.0.9；(fmrib.ox.ac.uk/fsl))。发明人使用MRtrix3进行偏置场校正。使用FSL和ANTS软件校正平面回波成像(EPI)敏感伪影，以将平均b0图与受试者特定的T1加权MPRAGE结构扫描对齐。每一步都进行了视觉质量检查。分数各向异性(FA)图(指示体素内的扩散限制)是使用FSL软件创建的。FA是微观结构完整性的度量标准，显示出增强检测AD特异性缺陷的能力，较低的FA值通常代表AD中白质微观结构的完整性较差。使用基于FSL的工具、基于区域的空间统计(TBSS)，对DWI FA数据进行体素统计分析。TBSS将非线性配准应用于使所有FA图带入标准模板空间。创建平均FA骨架，然后将阈值设定为0.2，从而得到4D骨架化FA图像，用于下文详述的体素统计分析。我们使用一般线性模型(GLM)和FSL的无阈值聚类增强(TFCE)选项来评估SHMOOSE和平均FA骨架内的体素白质FA之间的关系，对CDR评分、年龄和报告的性别进行协变。对于该分析，SHMOOSE值<100被编码为50(5名受试者)。对于CSF tau和p tau 181，以生物性别和年龄为协变量、且SHMOOSE CSF水平为因变量进行线性回归分析。另外，我们认为对p tau 181的影响是通过总tau水平介导的。因此，我们使用了R中的mediation包，并模拟了p tau 181、年龄和生物性别对介导物(即，tau)的影响；模拟tau、ptau 181、生物性别和年龄对SHMOOSE的影响；并使用这些模型来确定使用介导函数的间接(ACME)和直接(ADE)影响。

人脑SHMOOSE mtSNP差异表达分析

本发明人利用通过Mayo产生的基因型和转录组数据(Synapse ID：syn5550404)。通过SHMOOSE基因型分析“RNAseq TCX”数据。受试者SHMOOSE基因型从Mayo LOAD GWAS数据中提取，所述数据从HumanHap300-Duo Genotyping BeadChips产生。前面已经描述了处理和各个子队列的完整描述。简言之，使用Mayo MAP-Rseq流程对来自人脑颞叶皮质的基因表达fastq文件进行比对。然后使用多变量线性回归来调整死亡年龄、生物性别和RNA完整性，通过SHMOOSE基因型来检查经归一化的读取计数的差异表达。对Mayo提供的R中的源代码进行了修改，以通过SHMOOSE基因型进行差异表达分析。结果包括至少1个受试者中具有非零原始计数的所有基因，并且每个基因包括代表SHMOOSE mtSNP的效应大小的beta值。使用Benjamin Hochberg进行多重假设校正。使用R中的clusterProfiler软件包将重要基因包括在基因富集分析中。通过使用enrichGo和enrich WP函数，根据超几何模型提取显著富集的途径。针对55个参比等位基因SHMOOSE个体评估了总共14个SHMOOSE mtSNP携带者。这些样本是通过提取死亡时也包含SHMOOSE基因型数据的非痴呆个体来选择的。

经SHMOOSE处理的细胞转录组学

将分化的神经细胞与10μM SHMOOSE或SHMOOSE.D47N孵育24小时，然后快速提取RNA。将细胞用冰冷的DPBS洗涤一次，并立即用TRIzol(Thermo Scientific)裂解，并使用Quick-RNA Miniprep试剂盒(Zymo Research)提取RNA。将高质量RNA用于文库制备(mRNA-Seq Nu Quant)，其捕获多聚腺苷酸化RNA。从此开始，在Illumina NextSeq 550平台上对制备的样品进行75个单端循环的测序。每个样本都实现了近2500万的读取深度。使用FastQC确保高质量的fastq文件，并使用kallisto将其映射到人类参比基因组(GRCh38.p13)。然后使用R中的DESeq2软件包，将经归一化的倍数变化用来估计经SHMOOSE和SHMOOSE.D47N处理的细胞之间的差异基因表达。使用R中的clusterProfiler软件包，对显著不同的基因(FDR<0.2)进行基因富集。

体内SHMOOSE

为了检测用SHMOOSE处理的小鼠的转录组，从Jackson实验室获得12周龄的雄性C57B1/6N小鼠。在开始SHMOOSE的每天IP注射(2.5mg/kg)之前，对小鼠饲喂高脂肪饮食10天(总卡路里的60％)。经IP注射不超过60μL的体积。IP注射两周后，小鼠在禁食过夜后实施安乐死，然后迅速摘除大脑，摘除下丘脑并且正中矢状地对半切开。进一步对半脑进行显微切割，以摘除海马体和皮质。将组织快速冷冻，并通过每10mg组织添加100μL的TRIzol(ThermoScientific)提取RNA。然后将匀浆以16000RCF离心60秒，并使用Quick-RNA Miniprep试剂盒(Zymo Research)进行处理。将高质量RNA用于文库制备(mRNA-Seq Nu Quant)其捕获多聚腺苷酸RNA。从此开始，在Illumina NextSeq 550平台上对制备的样品进行75个单端循环的测序，并使用FastQC确保fastq文件的质量，并使用kallisto将其映射到小鼠参比基因组(GRCm39)。然后，使用R中的DESeq2软件包，将经归一化的倍数变化用来估计经SHMOOSE处理的小鼠的差异基因表达。使用R中的clusterProfiler软件包，对显著不同的基因(FDR<0.2)进行基因富集。

海马测定

将SH-SY5Y细胞以10000个细胞的密度接种到96孔板中。第二天，将细胞进行总共4天的分化。此后，将SHMOOSE或SHMOOSE.D47N孵育24小时，然后使用XF96细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)测量细胞实时耗氧率。用寡霉素和FCCP(羰基氰4-[三氟甲氧基]苯腙)攻击细胞后，计算ATP周转率和最大呼吸能力。此外，使用细胞外酸化率(ECAR)确定糖酵解速率，并相对于以百分比计的基础水平单独地报告。使用Hoechst 33342将所有读数归一化为总DNA含量。

SHMOOSE在iPSC和AD大脑中的差异表达

下载源自具有694个FAD突变的iPSC的神经元的RNA-Seq数据，以测试作为FAD突变函数的SHMOOSE表达(GEO：GSE128343)。使用带有默认参数的STAR将Fastq文件与人类参比基因组(GRCh38.p 13)进行比对。使用BioConductor包将经比对的BAM文件加载到R中。将包含SHMOOSE基因组坐标和其他线粒体基因的定制GTF文件用于差异表达分析。将计数归一化为线粒体读取计数。计数是通过汇总重叠函数使用“并集(union)”模式调用的。通过R中的DESeq2包使用负二项回归进行差异表达分析。本发明人还使用Mayo RNASeq数据(SynapseID：syn5550404)按照相同的处理工作流程评估AD和基因型的SHMOOSE RNA差异。

β淀粉样蛋白毒性测定

将SH-SY5Y细胞分化4天，与10μM SHMOOSE或SHMOOSE.D47N孵育24小时，然后用具有或不具有如前所述制备的寡聚的1μM β淀粉样蛋白42(CPC Scientific)的SHMOOSE或SHMOOSE.D47N再次孵育。将双色荧光细胞活力测定(LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒；Invitrogen(cat.L3224)用来区分人体肽和β淀粉样蛋白42处理后的活细胞和死细胞。活细胞与死细胞的比率可以被量化，因为活细胞保留钙黄绿素AM染料，而具有受损膜的死细胞允许乙锭同源二聚体(ethidium homodimer)染料进入。

SHMOOSE-Mitofilin蛋白相互作用

为了鉴定SHMOOSE相互作用组，进行了多项实验。首先，将1.5nmol的SHMOOSE掺入1mg SH-SY5Y细胞裂解物中，在4℃下持续6小时。使用具有1×Thermo蛋白酶抑制剂混合物和1mM PMSF的Thermo Pierce CoIP裂解缓冲液制备裂解物。简言之，将细胞用冰冷的DPBS洗涤两次，在冰上裂解15分钟，并在4℃下以12000RCF离心10分钟。进行该实验的基本原理是确保不同条件下的蛋白量相同，并避免由对细胞的SHMOOSE处理引起的差异化的蛋白质表达。6小时后，使用与5μg的定制C末端SHMOOSE抗体缀合的Dynabeads A从样品中免疫沉淀SHMOOSE。作为阴性对照，将掺入SHMOOSE的裂解物也使用5μg兔IgG进行免疫沉淀。使用pH2.8的50mM甘氨酸从珠中洗脱蛋白质，并且使用pH 7.5的Tris HCl对洗脱液进行pH中和。然后，使用LC-MS对完整的洗脱液进行处理以进行蛋白质鉴定。将样品与相同体积的消化缓冲液(8M尿素，0.1M Tris-HCl pH 8.5)混合，然后通过在黑暗中在室温下与5mM TCEP和10mM碘乙酰胺序贯孵育20分钟来对每个样品进行还原和烷基化，同时在Eppendorf热混合器中以1200rpm混合。向每个样品添加6μL羧酸盐改性的磁珠(CMMB，并广泛称为SP3)。将乙醇添加至浓度为50％以诱导蛋白质与CMMB结合。将CMMB用80％乙醇洗涤3次，然后用50μL 50mMTEAB重悬。用0.1μg LysC(Promega)和0.8μg胰蛋白酶(Pierce)在37℃下将蛋白质消化过夜。消化后，向每个样品加入1mL的100％乙腈，以将最终的乙腈浓度提高到超过95％，从而诱导肽与CMMB结合。然后，用100％乙腈洗涤CMMB 3次，并用50μL的2％DMSO洗脱肽。将经洗脱的肽样品通过真空离心进行干燥并在5％甲酸中复原，然后进行LC-MS/MS分析。使用增高的乙腈浓度的140分钟梯度，在装有1.9μm C18颗粒的75μm ID、25cm C18柱(Dr.MaischGmbH HPLC)上分离肽样品，并注入Thermo Orbitrap-Fusion Lumos Tribrid质谱仪。使用数据依赖性采集(DDA)模式采集MS/MS谱。使用MaxQuant(1.6.10.43)针对来自EMBL的人类参比蛋白质组(UP000005640_9606HUMAN Homo sapiens，20874个条目)进行MS/MS数据库搜索。用artMS Bioconductor包进行MaxQuant无标记定量数据的统计分析，其使用MSstatsBioconducter包(默认参数)对蛋白质丰度进行相对定量。对于任何给定的比较，在一种条件下缺失但在另一种条件的多于2个的生物重复中发现的蛋白质的丰度是通过从样品中观察到的最低MS1强度推算强度值来估计的，并且p值被随机分配在0.05和0.01之间以用于说明。本发明人基于估算的倍数变化和p值阈值选择靶向mitofilin(IMMT)。

其次，本发明人使用SHMOOSE抗体和mitofilin抗体的一系列相互免疫共沉淀实验，验证了从MS鉴定的mitofilin相互作用。发明人用1μM SHMOOSE处理分化的SH-SY5Y细胞30分钟，并如上所述使用Thermo Pierce CoIP裂解缓冲液裂解细胞。此后，发明人将样品与5μg的SHMOOSE抗体、mitofilin抗体或阴性兔IgG在室温下孵育30分钟。将抗体偶联的Dynabeads A用0.1％TBST洗涤3次，并使用pH 2.8甘氨酸、NuPAGE LDS样品缓冲液和NuPAGE样品还原剂在95℃下洗脱5分钟。然后将洗脱液上样到NuPAGE 4％-12％Bis-Tris凝胶中进行电泳。将迁移的蛋白质转移到PVDF膜，用处于TBS 0.1％吐温中的5％BSA封闭，并与各自的抗体在4℃下以1∶1000的稀释度孵育过夜。第二天，用0.1％TBST洗涤膜，并用针对各自来源的一抗种类的与HRP缀合的二抗以1：30000孵育，然后使用ECl试剂激发5分钟。

第三，发明人通过将140ng的重组mitofilin(OriGene)、SHMOOSE或SHMOOSE.D47N固定在硝酸纤维素膜上，对SHMOOSE、SHMOOSE.D47N和mitofilin进行了相互斑点印迹。蛋白质干燥后，在室温下用SuperBlock(PBS)封闭缓冲液(Thermo)封闭膜30分钟。然后，在封闭缓冲液中，在室温下，将SHMMOOSE或mitofilin以1μg/mL的浓度流过封闭的膜30分钟。用0.1％的TBSBT洗涤膜三次，每次5分钟，然后在封闭缓冲液中于室温下用0.5μg/mL的各自的抗体孵育30分钟。用0.1％TSBT洗涤膜三次，每次五分钟，并与针对一抗来源种类的二抗以1：30000一起孵育。用0.1％TBST洗涤膜三次，每次5分钟，然后使用ECl试剂激发1分钟。

MTT测定

将MTT测定用于测量mitofilin敲低的影响。当以10000个细胞的密度784接种到96孔板中时，使用RNAiMAX(Invitrogen)和40nM mitofilin siRNA(Horizon，SMARTpool)反向转染SH-SY5Y细胞。第二天，将细胞分化总共4天，并用另外的40nM mitofilin siRNA转染。两天后，用添加的40nM mitofilin siRNA替换分化培养基。MTT测定前24小时，用10μMSHMOOSE或溶剂对照处理细胞。处理4小时后，将MTT(Sigma-Aldrich)试剂(5mg/mL)加入至每个孔，并在使用SpectrMax M3酶标仪读取吸光度值之前裂解。

SHMOOSE-Mitofilin对接模型

如其他地方所述，为了对IMMT-SHMOOSE相互作用进行建模，发明人使用了HDOCK(基于模板的建模和自始(ab initio)自由对接的混合算法)。Mitofilin被认为是“受体”，而SHMOOSE被认为是“配体”

以上描述的各种方法和技术提供了多种方式以实施本发明。当然，应该理解的是，不一定所有描述的目标或优点都可以根据本文中描述的任何具体实施方式来实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式执行，而不必实现如本文可能教导或表明的其它目标或优点。本文提到了各种有利的和不利的替代方式。应该理解的是，一些优选的实施方式特别地包含一个、另一个或数个有利的特征，而其他优选的实施方式特别地排除一个、另一个或数个不利的特征，而其他优选的实施方式特别地通过包括一个、另一个或数个有利的特征来减轻目前的不利的特征。

此外，熟练的技术人员将从不同的实施方式中认识到各种特征的适用性。类似的，以上讨论的各种要素、特征和步骤，以及每个这样的要素、特征或步骤的其他已知等同物，可以由本领域的普通技术人员混合和匹配以执行根据本文所述的原则的方法。在不同的实施方式中，各种要素、特征和步骤中的一些将被特别地包括并且其他被特别地排除。

虽然本发明已经在某些实施方式和实施例的上下文中被公开，但本领域的技术人员将理解，本发明的实施方式超越了具体公开的实施方式，延伸到其他替代的实施方式和/或用途以及其修改和等同物。

在本发明的实施方式中已经公开了许多变形和替代要素。再进一步的变形和替代要素将对本领域的技术人员是明显的。在这些变形中，不受限制地为与诱导的线粒体肽、其类似物和衍生物有关的组合物和方法，与上述组合物的使用有关的方法和组合物，技术和组合物和在其中使用的方案的用途，以及通过本发明的教导创造的产品的具体用途。本发明的各种实施方式可以特别地包括或排除这些变形或要素中的任何。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表示成分的量、性质比如浓度、反应条件等的数应该被理解为在一些例子中被术语“约”所修改。因此，在一些实施方式中，在所撰写的说明书和所附的权利要求书中记载的数字参数是可以根据寻求通过具体的实施方式获得的期望的性质而变化的近似值。在一些实施方式中，数字参数应该根据报告的有效数字的数并且通过应用普通的舍入技术被解释。尽管阐明本发明的一些实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体的实施例中阐明的数值是尽可能精确地报告的。在本发明的一些实施方式中出现的数值可以含有某些误差，这些误差是由它们各自的测试测量中发现的标准偏差必然地造成的。

在一些实施方式中，在描述本发明的特定实施方式的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”以及类似的引用可以被解释为涵盖单数和复数两者。本文对值的范围的列举仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有指示，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独列举一样。本文描述的所有方法都能够以任何合适的顺序执行，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。关于本文中的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对以其它方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的要素。

在本文公开的本发明的替代的要素或实施方式的分组不应该被解释为限制。每个组成员都可以被单独地或与该组的其他成员或在本文中发现的其他要素任意组合地被提及和要求保护。组的一个或多个成员可以因为方便和/或可专利性的原因被包括入组中，或从组中被删除。当发生任何这样的包含或删除时，本说明书在此被视为含有经修改的组，从而满足在所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面描述。

在本文中描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读上述描述后，针对这些优选实施方式的变形将对本领域的普通技术人员变得明显。考虑到技术人员可以视情况而定采用这样的变形，并且本发明可以以除本文特别描述的之外的方式被实践。因此，本发明的许多实施方式包括如适用的法律所允许的所有在此所附的权利要求书中所述主题的修改和等同物。此外，除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则上述要素在其所有可能的变形中的任何组合都被本发明所包括。

更进一步，贯穿本说明书对专利和印刷出版物进行了大量引用。以上引用的参考文献和印刷出版物中的每一个都分别地通过引用以其整体被并入本文中。

如本文所使用，术语“包含(comprising/comprises)”在提及组合物、方法及其相应组分时使用，无论其是否是有用的，所述组合物、方法及其相应组分对实施方式而言是有用的，而对于包含未规定要素而言是开放的。本领域技术人员应理解，一般而言，本文所使用的术语通常预期作为“开放式”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。尽管本文中使用开放式术语“包含”作为诸如包括、含有或具有的术语的同义词来描述和要求保护本发明，但本发明或其实施方式可替代地使用诸如“由……组成”或“基本上由……组成”的替代术语来描述。

除非另有说明，在描述本申请的特定实施方式的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”以及类似的引用可以被解释为涵盖单数和复数两者。本文对值的范围的列举仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有指示，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独列举一样。本文描述的所有方法都能够以任何合适的顺序执行，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。关于本文中的某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本申请，而不对以其它方式要求保护的本申请的范围构成限制。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁语exemp1i gratia，并在本文中用于表示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本申请的实践至关重要的任何未要求保护的要素。

“可选的”或“可选地”意指随后描述的情况可能发生或可能不发生，因此该描述包括情况发生的情形和不发生的情形。

最后，应当理解的是，本文公开的本发明的实施方式是对本发明的原理的说明。可以被采用的其他修改能够在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，能够根据本文的教导使用本发明的替代性构造。因此，本发明的实施方式不限于精确地图示和说明的实施方式。

序列表

<110> 南加利福尼亚大学(UNIVERSITY OF SOUTHERN CALIFORNIA)

<120> 用于神经退行性病变的新的治疗肽

<130> 065715-000102WO00

<150> 63/196,480

<151> 2021-06-03

<160> 112

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Met Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys

20 25

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn

20 25

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr

1 5 10 15

Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe

20 25

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly

20 25

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu

1 5 10 15

Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala

20 25

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 6

Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val

1 5 10 15

Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 7

Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu

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Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 8

Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly

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Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

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<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 9

Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro

1 5 10 15

Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys

1 5 10 15

Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser

20 25

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 11

Gln Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn

1 5 10 15

Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn

20 25

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Leu Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe

1 5 10 15

Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 13

Leu Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly

1 5 10 15

Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 14

Lys Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala

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Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 15

Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr

1 5 10 15

Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 16

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Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

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Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

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Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr

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<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

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Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys

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Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn

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<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 19

Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser

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Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His

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<223> 合成构建体

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Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn

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<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

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<223> 合成构建体

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<223> 合成构建体

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<223> 合成构建体

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Asn Pro Asp Phe Pro Asn Ser Pro His

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<223> 合成构建体

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Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn

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Pro Asp Phe Pro Asn Ser Pro His Pro

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<223> 合成构建体

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Asp Phe Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr

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Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp

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Phe Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His

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<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 33

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

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Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro

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<223> 合成构建体

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Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe Pro

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Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

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<223> 合成构建体

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Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala

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His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asn

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Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His

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Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr

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<223> 合成构建体

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Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr

1 5 10 15

Asn His Pro Asn Pro Asn Phe Pro Asn

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<213> 人工序列

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<400> 39

Phe Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn

1 5 10 15

His Pro Asn Pro Asn Phe Pro Asn Ser

20 25

<210> 40

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 40

Gly Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His

1 5 10 15

Pro Asn Pro Asn Phe Pro Asn Ser Pro

20 25

<210> 41

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 41

Ala Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro

1 5 10 15

Asn Pro Asn Phe Pro Asn Ser Pro His

20 25

<210> 42

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 42

Thr Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn

1 5 10 15

Pro Asn Phe Pro Asn Ser Pro His Pro

20 25

<210> 43

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 43

Pro Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro

1 5 10 15

Asn Phe Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr

20 25

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 44

Asn Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asn

1 5 10 15

Phe Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His

20 25

<210> 45

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 45

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asn Phe

1 5 10 15

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro

20 25

<210> 46

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 46

Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asn Phe Pro

1 5 10 15

Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

20 25

<210> 47

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 47

Met Pro Pro Cys Leu Asp Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys

20 25

<210> 48

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 48

Pro Pro Cys Leu Asp Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp

1 5 10 15

Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn

20 25

<210> 49

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

Pro Cys Leu Asp Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp

1 5 10 15

Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe

20 25

<210> 50

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 50

Cys Leu Asp Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro

1 5 10 15

Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly

20 25

<210> 51

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 51

Leu Asp Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu

1 5 10 15

Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala

20 25

<210> 52

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 52

Asp Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val

1 5 10 15

Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp

20 25

<210> 53

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 53

Asp Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu

1 5 10 15

Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro

20 25

<210> 54

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 54

Trp Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly

1 5 10 15

Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn

20 25

<210> 55

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 55

Leu Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro

1 5 10 15

Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys

20 25

<210> 56

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 56

Asp Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys

1 5 10 15

Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp

20 25

<210> 57

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 57

Gln Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn

1 5 10 15

Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn

20 25

<210> 58

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 58

Leu Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe

1 5 10 15

Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn

20 25

<210> 59

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 59

Leu Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly

1 5 10 15

Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His

20 25

<210> 60

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 60

Lys Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala

1 5 10 15

Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala

20 25

<210> 61

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 61

Asp Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp

1 5 10 15

Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His

20 25

<210> 62

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 62

Asn Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro

1 5 10 15

Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp

20 25

<210> 63

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 63

Asp Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn

1 5 10 15

Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp

20 25

<210> 64

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 64

Asp Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys

1 5 10 15

Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn

20 25

<210> 65

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 65

Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp

1 5 10 15

Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His

20 25

<210> 66

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 66

Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn

1 5 10 15

Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro

20 25

<210> 67

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 67

Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn

1 5 10 15

His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn

20 25

<210> 68

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 68

Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His

1 5 10 15

Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro

20 25

<210> 69

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 69

Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala

1 5 10 15

His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asp

20 25

<210> 70

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 70

Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His

1 5 10 15

Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

20 25

<210> 71

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 71

Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp

1 5 10 15

Asp Asn His Pro Asn Pro Asp Phe Pro

20 25

<210> 72

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 72

Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp

1 5 10 15

Asn His Pro Asn Pro Asp Phe Pro Asn

20 25

<210> 73

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 73

Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn

1 5 10 15

His Pro Asn Pro Asp Phe Pro Asn Asp

20 25

<210> 74

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 74

Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His

1 5 10 15

Pro Asn Pro Asp Phe Pro Asn Asp Pro

20 25

<210> 75

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 75

Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro

1 5 10 15

Asn Pro Asp Phe Pro Asn Asp Pro His

20 25

<210> 76

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 76

Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn

1 5 10 15

Pro Asp Phe Pro Asn Asp Pro His Pro

20 25

<210> 77

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 77

Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro

1 5 10 15

Asp Phe Pro Asn Asp Pro His Pro Asp

20 25

<210> 78

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 78

Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asp

1 5 10 15

Phe Pro Asn Asp Pro His Pro Asp His

20 25

<210> 79

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 79

Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

1 5 10 15

Pro Asn Asp Pro His Pro Asp His Pro

20 25

<210> 80

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 80

Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asp Phe Pro

1 5 10 15

Asn Asp Pro His Pro Asp His Pro Arg

20 25

<210> 81

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 81

Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala

1 5 10 15

His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asn

20 25

<210> 82

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 82

Pro Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His

1 5 10 15

Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asn Phe

20 25

<210> 83

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 83

Lys Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp

1 5 10 15

Asp Asn His Pro Asn Pro Asn Phe Pro

20 25

<210> 84

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 84

Asn Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp

1 5 10 15

Asn His Pro Asn Pro Asn Phe Pro Asn

20 25

<210> 85

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 85

Phe Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn

1 5 10 15

His Pro Asn Pro Asn Phe Pro Asn Asp

20 25

<210> 86

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 86

Gly Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His

1 5 10 15

Pro Asn Pro Asn Phe Pro Asn Asp Pro

20 25

<210> 87

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 87

Ala Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro

1 5 10 15

Asn Pro Asn Phe Pro Asn Asp Pro His

20 25

<210> 88

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 88

Asp Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn

1 5 10 15

Pro Asn Phe Pro Asn Asp Pro His Pro

20 25

<210> 89

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 89

Pro Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro

1 5 10 15

Asn Phe Pro Asn Asp Pro His Pro Asp

20 25

<210> 90

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 90

Asn Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asn

1 5 10 15

Phe Pro Asn Asp Pro His Pro Asp His

20 25

<210> 91

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 91

Lys Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asn Phe

1 5 10 15

Pro Asn Asp Pro His Pro Asp His Pro

20 25

<210> 92

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 92

Asp Asn Asn His Ala His Asp Asp Asn His Pro Asn Pro Asn Phe Pro

1 5 10 15

Asn Asp Pro His Pro Asp His Pro Arg

20 25

<210> 93

<211> 58

<212> PRT

<213> 智人

<400> 93

Met Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 94

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 94

Met Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asn Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 95

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 95

Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 96

Asp Asn Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys

1 5 10

<210> 97

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 97

Met Pro Pro Cys Ile Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 98

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 98

Met Pro Pro Cys Ile Thr Thr Trp Ile Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 99

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 99

Met Pro Pro Cys Ile Thr Thr Trp Ile Ser Gln Ile Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 100

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 100

Met Pro Pro Cys Ile Thr Thr Trp Ile Ser Gln Ile Ile Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 101

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 101

Met Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Ile Ser Gln Ile Ile Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 102

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 102

Met Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Ile Ile Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 103

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 103

Met Pro Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Ile Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 104

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 104

Met Pro Ser Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 105

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 105

Met Pro Ser Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Ser Leu Leu Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 106

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 106

Met Pro Ser Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Ser Leu Leu Ser Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 107

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 107

Met Pro Ser Cys Leu Thr Thr Trp Ile Ser Ser Ile Ile Ser Asp Asn

1 5 10 15

Ser Tyr Pro Leu Val Leu Gly Pro Lys Asn Phe Gly Ala Thr Pro Asn

20 25 30

Lys Ser Asn Asn His Ala His Tyr Tyr Asn His Pro Asn Pro Asp Phe

35 40 45

Pro Asn Ser Pro His Pro Tyr His Pro Arg

50 55

<210> 108

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 108

Pro Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu

1 5 10

<210> 109

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 109

Cys Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys

1 5 10

<210> 110

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 110

Leu Thr Thr Trp Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp

1 5 10

<210> 111

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 111

Cys Trp Leu Leu Leu Leu

1 5

<210> 112

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 112

Trp Leu Leu Leu Leu

1 5

Claims (30)

1.一种组合物，所述组合物包含：

线粒体肽，所述线粒体肽具有氨基酸序列MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)、或其片段、其类似物或其衍生物。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述线粒体肽包含氨基酸序列MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述线粒体肽包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:97-SEQ ID NO:107中任一者的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述线粒体肽包含PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述线粒体肽包含与MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)或PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF(SEQ ID NO：3)具有约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多百分比同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述线粒体肽的长度为19-70个氨基酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述线粒体肽具有翻译后修饰或人工修饰。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述人工修饰包括聚乙二醇化、脂肪酸缀合、多肽延伸、IgG-Fc、CPT、HSA、ELP、转铁蛋白或白蛋白修饰。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂或药学上可接受的载体。

10.一种治疗疾病和/或病症的方法，所述方法包括：

向需要治疗所述疾病和/或病症的受试者施用一定量的线粒体肽，其中，所述线粒体肽具有氨基酸序列MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQID NO：93)、或其片段、其类似物或其衍生物。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述线粒体肽是SEQ ID NO:93的氨基酸序列的片段，其中，所述片段包括氨基酸序列PCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNF(SEQ ID NO：3)。

12.如权利要求10所述的方法，其中，所述线粒体肽的长度为19-70个氨基酸。

13.如权利要求10所述的方法，其中，所述疾病和/或病症包括神经退行性疾病和/或病症，任选阿尔茨海默病，或其特征在于β淀粉样蛋白水平高于参比水平。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述线粒体肽增加所述受试者的脑脊液中的tau水平。

15.如权利要求13所述的方法，其中，所述线粒体肽降低所述受试者大脑中的β淀粉样蛋白水平或β淀粉样蛋白斑块。

16.如权利要求13所述的方法，其中，所述线粒体肽减轻或抑制所述受试者的内侧颞叶皮质组织的体积降低。

17.如权利要求13所述的方法，其中，所述受试者是在SNP位置具有“A”等位基因的单核苷酸多态性(SNP)rs2853499的携带者。

18.如权利要求13所述的方法，其中，所述神经退行性疾病和/或病症是帕金森病。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述线粒体肽减轻或抑制所述受试者的上顶叶皮质组织的体积的降低。

20.如权利要求10所述的方法，其中，相对于健康的正常受试者，所述受试者表达在生物样品中测定的高的量的MPPLCTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：93)。

21.一种检测一种或多种生物标记的方法，所述方法包括：

检测生物样品中的一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平，所述生物样品从期望确定所述一种或多种生物标记的受试者获得；以及

检测所述一种或多种生物标记的存在、不存在或表达水平，

其中，所述一种或多种生物标记包含如下序列的肽或单核苷酸多态性(SNP)rs2853499：MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPDFPNSPHPYHPR(SEQ IDNO：93)、MPPCLTTWLSQLLKDNSYPLVLGPKNFGATPNKSNNHAHYYNHPNPNFPNSPHPYHPR(SEQ ID NO：94)。

22.如权利要求21所述的方法，其中，检测存在、不存在或表达水平包括免疫测定。

23.如权利要求21所述的方法，其中，所述一种或多种生物标记包括单核苷酸多态性(SNP)rs2853499，其中，“A”等位基因位于SNP位置。

24.如权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括：

当检测到具有SEQ ID NO:94的肽的存在时，诊断所述受试者具有疾病和/或病症、或具有增加的患有疾病和/或病症的可能性，或

与健康对照相比，当检测到具有SEQ ID NO:93的肽的低表达水平时，诊断所述受试者具有疾病和/或病症、或具有增加的患有疾病和/或病症的可能性；或

当检测到单核苷酸多态性(SNP)rs2853499时，其中“A”等位基因位于SNP位置，诊断所述受试者具有疾病和/或病症，

其中，所述疾病和/或病症是神经退行性疾病和/或病症。

25.如权利要求24所述的方法，其中，所述神经退行性疾病和/或病症选自于由阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆症及其组合所组成的组。

26.一种在有需要的受试者中检测线粒体衍生肽的基因型的方法，所述方法包括：

对从所述受试者获得的生物样品进行测定以检测单核苷酸多态性(SNP)处的基因型，其中，所述SNP为rs2853499。

27.如权利要求26所述的方法，所述方法进一步包括检测所述受试者中的SNP处的A等位基因，其中，所述受试者具有阿尔茨海默病或具有发展出阿尔茨海默病的风险因素。

28.如权利要求26所述的方法，其中，在具有阿尔茨海默病或具有发展出阿尔茨海默病的风险因素的受试者中，所述检测在SNP处检测出所述A等位基因的计数高于对照受试者。

29.如权利要求27-28中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用阿尔茨海默病治疗。

30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中，所述受试者期望确定神经退行性疾病或紊乱，任选为阿尔茨海默病。