CN117769427A - 作为冠状病毒和其他病毒的抗病毒剂的修饰核苷和核苷酸类似物 - Google Patents

作为冠状病毒和其他病毒的抗病毒剂的修饰核苷和核苷酸类似物 Download PDF

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Abstract

用于预防、治疗或治愈人类受试者或其他动物宿主中冠状病毒感染的化合物、组合物和方法。在一个实施方案中，该化合物可用于治疗严重急性呼吸综合征病毒感染，如人类冠状病毒229E、SARS、MERS、SARS‑CoV‑1(OC43)和SARS‑CoV‑2。在另一个实施方案中，该方法用于治疗被黄病毒、小RNA病毒、披膜病毒或布尼亚病毒感染的患者。

Description

作为冠状病毒和其他病毒的抗病毒剂的修饰核苷和核苷酸类 似物
技术领域
本公开涉及用于治疗或预防冠状病毒感染的化合物、方法和组合物。更具体地，本公开描述了某些核苷和核苷酸类似物、其药学上可接受的盐或其他衍生物，以及其在冠状病毒，尤其是SARS-CoV-2的治疗中的用途。
背景技术
冠状病毒是属于冠状病毒科冠状病毒亚科的一种病毒，并且是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称的核衣壳的包膜病毒。
冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的上呼吸道和胃肠道，而多种已知的毒株也会感染人类。冠状病毒被认为导致了成人和儿童的所有普通感冒中的很大比例。
冠状病毒主要在冬季和早春季节导致人类感冒。冠状病毒也可导致肺炎(直接病毒性肺炎或继发性细菌性肺炎)、支气管炎(直接病毒性支气管炎或继发性细菌性支气管炎)和严重急性呼吸综合征(SARS)。
冠状病毒还会导致农场动物和家养宠物的一系列疾病，其中一些疾病可能很严重，并对农业产业构成威胁。在鸡中，传染性支气管炎病毒(IBV)，即一种冠状病毒，不仅靶向呼吸道，而且靶向泌尿生殖道。该病毒可以传播到鸡的不同器官。
农场动物的经济上重要的冠状病毒包括猪冠状病毒(传染性胃肠炎冠状病毒，TGE)和牛冠状病毒，这两种病毒都会导致幼小动物腹泻。猫冠状病毒：两种形式，猫肠道冠状病毒是一种临床意义不大的病原体，但该病毒的自发突变可导致猫传染性腹膜炎(FIP)，这是一种与高死亡率相关的疾病。有两种类型的犬冠状病毒(CCoV)，一种会导致轻度胃肠疾病，另一种被发现会导致呼吸系统疾病。小鼠肝炎病毒(MHV)是一种冠状病毒，可导致高死亡率的流行性鼠疾病，尤其是在实验室小鼠群体中。
MHV的一些毒株在已被用作多发性硬化症的小鼠模型的小鼠中引起进行性脱髓鞘性脑炎。
最近，冠状病毒疫情对美国和世界的健康和经济造成了双重威胁。COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的。这种疾病的常见症状包括发烧(88％)、干咳(68％)、呼吸急促(19％)和嗅觉丧失(15％至30％)。并发症可能包括肺炎、病毒性败血症、急性呼吸窘迫综合征、腹泻、肾脏疾病、心脏问题和脑炎。截至2020年6月，全球感染总人数超过400万，至少102,753人死亡，根据约翰霍普金斯大学冠状病毒资源中心的数据，美国近200万人冠状病毒检测呈阳性，超过10万人死于该疾病。200多个国家记录了这种疾病的局部传播。风险因素包括旅行和病毒暴露，预防由社交距离和隔离辅助。
目前对这些感染的治疗主要是支持性的，尽量减少症状，而不是治疗潜在的病毒感染。例如，可以用止痛剂治疗患者以减轻疼痛，并且可以治疗肠病毒心脏炎患者的并发症，例如心律失常、心包积液和心力衰竭。
提供新的抗病毒剂、包含这些药剂的组合物以及使用这些药剂治疗冠状病毒的治疗方法将是有利的。本公开提供了这样的药剂、组合物和方法。
发明内容
本公开涉及用于治疗或预防宿主中冠状病毒和/或其他病毒感染的化合物、方法和组合物。该方法包括施用治疗或预防有效量的至少一种本文所述的化合物以治疗或预防冠状病毒或其他病毒感染，或施用足以降低所述病毒生物活性的量，所述病毒包括但不限于SARS-CoV-2、MERS、SARS和OC-43。在其他实施方案中，本文所述的化合物可用于治疗或预防黄病毒(Flaviviruses)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、披膜病毒科(Togavirodae)和布尼亚病毒科病毒(Bunyaviridae)感染。
在一个实施方案中，公开了使用有效的、选择性抗病毒剂靶向冠状病毒和其他病毒感染，从而帮助消除和/或治疗被这些病毒感染的患者的感染的方法。
在该实施方案的一个方面，所用的化合物包括一种或多种本文所述的特异性核苷抑制剂。
在另一个实施方案中，公开了包含一种或多种本文所述化合物的药物组合物，其在一个实施方案中包含胞苷和尿苷类似物的组合，其与药学上可接受的载体或赋形剂结合。这些组合物可用于治疗感染冠状病毒或其他病毒感染的宿主，预防这些感染之一，和/或降低这些病毒之一的生物活性。所述组合物可以包含一种或多种本文所述化合物，任选地与其他抗病毒化合物或生物药剂的组合，包括抗SARS-CoV2化合物和生物药剂、融合抑制剂、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、抗病毒核苷，如瑞德西韦、GS-441524、N4-羟基胞苷和美国专利号9,809,616中公开的其它化合物及其前药、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、JAK抑制剂、血管紧张素转化酶2(ACE2)抑制剂、SARS-CoV特异性人单克隆抗体，包括CR3022、NS5A抑制剂，例如达卡他韦，和不同或未知机制的药物。
在另一个实施方案中，本公开涉及制备本文所述特定核苷化合物的方法。
在一些实施方案中，本文所述的化合物在一个或多个位置被氘代。当化合物是核苷时，氘代可以存在于化合物的糖部分、化合物的碱基部分和/或化合物的前药部分的一个或多个位置，任意位置。
在一些实施方案中，制备酯前药以允许更多的药物在口服给药时到达血浆，而不是作为三磷酸被截留在肠道中。
在另一个实施方案中，制备酯前药以提高药物的口服生物利用度。
参考以下详细描述，将更好地理解本公开。
附图说明
图1显示了COVID-19病毒nsp12-nsp7-nsp8复合物的结构，包括COVID-19病毒nsp12的结构域组织。
图2是N-末端NiRAN结构域和RdRp的β发夹结构的示意图。RdRp结构域和NiRAN结构域的手掌和手指亚结构域中的相互作用残基通过标记来识别。
图3是显示三磷酸抑制剂如何干扰RNA合成的一个实施方案的示意图。
图4是显示当以剂量依赖性方式将瑞德西韦或本文所述的特异性核苷酸抑制剂(1、10、100、250或500μM)加入到包含RdRp复合物和核苷酸三磷酸的混合物中，并且加入水(对照)、瑞德西韦或抑制剂化合物之一时，聚合酶抑制程度的照片。
具体实施方式
本文描述的化合物在基于细胞的测定中显示出对冠状病毒科的抑制活性。因此，该化合物可用于治疗或预防宿主中的冠状病毒科感染，或降低病毒的生物活性。宿主可以是感染了冠状病毒科病毒的哺乳动物，特别是人。这些化合物也有效对抗黄病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科和布尼亚病毒科病毒。该方法包括施用有效量的一种或多种本文所述的化合物。
还公开了药物制剂，其包含一种或多种本文所述的化合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中，制剂包括至少一种本文所述的化合物和至少一种其他治疗剂。
参考以下定义将更好地理解本公开：
I.定义
术语“独立地”在本文中用于表示独立应用的变量因应用情况而独立变化。因此，在诸如其中R”“独立地为碳或氮”的R”XYR”的化合物中，两个R”可以都是碳，两个R”可以都是氮，或者一个R”可以是碳，另一个R”可以是氮。
如本文所用，术语“对映异构体纯的”是指包含至少约95％，优选约97％、98％、99％或100％的该化合物的单一对映异构体的化合物组合物。
如本文所用，术语“基本上不含”或“基本上不存在”是指包含至少85％至90％重量，优选95％至98％重量，甚至更优选地，99％至100％重量的该化合物的指定对映异构体的化合物组合物。在一个优选的实施方案中，本文所述的化合物基本上不含对映异构体。
类似地，术语“分离的”是指这样的化合物组合物，其包含至少85％至90％重量，优选95％至98％重量，甚至更优选地，99％至100％重量的化合物，其余包含其他化学物质或对映异构体。
除非另有说明，否则本文所用的术语“烷基”是指饱和的直链、支链或环状伯、仲或叔烃，包括取代和未取代的烷基。烷基可以任选地被不另外干扰反应或者提供该方法的改进的任意部分取代，包括但不限于卤素、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、酰氨基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亚胺、磺酰基、硫烷基、亚磺酰基、氨磺酰基、酯、羧酸、酰胺、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯，其是未受保护的或视需要受到保护的，如本领域技术人员已知的，例如如Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991所教导的，在此通过引用并入。具体包括CF3和CH2CF3。
在本文中，每当使用术语C(烷基范围)时，该术语独立地包括该类的每个成员，如同具体地、单独地列出一样。术语“烷基”包括C1-22烷基部分，术语“低级烷基”包括C1-6烷基部分。本领域普通技术人员应理解，相关的烷基基团通过用后缀“-基(-yl)”代替后缀“-烷烃(-ane)”来命名。
如本文所用，“桥连烷基(bridged alkyl)”是指双环或三环烷烃，例如，2:1:1双环己烷。
如本文所用，“螺烷基(spiro alkyl)”是指连接在单个(季)碳原子上的两个环。
术语“烯基”是指不饱和的烃基，为直链或支链，只要它含有一个或多个双键即可。本文公开的烯基基团可以任选地被对反应过程无不利影响的任意部分取代，包括但不限于对烷基部分上的取代基所描述的那些。烯基基团的非限制性实例包括乙烯、甲基乙烯、异亚丙基、1,2-乙烷-二基、1,1-乙烷-二基、1,3-丙烷-二基、1,2-丙烷-二基、1,3-丁烷-二基和1,4-丁烷-二基。
术语“炔基”是指不饱和的无环烃基，为直链或支链，只要它含有一个或多个三键即可。炔基基团可以任选地被对反应过程无不利影响的任意部分取代，包括但不限于上述对烷基部分描述的那些。合适的炔基基团的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、羟丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基和己炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-1-基。
术语“烷基氨基”或“芳基氨基”分别指具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
如本文所用，术语“脂肪醇”是指在链中具有4至26个碳，优选在链中具有8至26个碳，最优选在链中具有10至22个碳的直链伯醇。精确的链长随来源而变化。代表性的脂肪醇包括月桂基、硬脂基和油烯基醇。它们是无色油状液体(对于较小的碳数)或蜡状固体，但是不纯的样品可能会显示黄色。脂肪醇通常具有偶数个碳原子，并且在末端碳上连接有一个醇基(-OH)。有些是不饱和的，有些是支链的。它们在工业中被广泛使用。与脂肪酸一样，它们通常用分子中的碳原子数来表示，例如“C12醇”，即具有12个碳的醇，例如十二烷醇。
除非另外定义，否则本文所用的术语“受保护的”是指加到氧、氮或磷原子以防止其进一步反应或用于其它目的的基团。多种氧和氮保护基团是有机合成领域技术人员已知的，描述于例如Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis，同上。
单独或组合使用的术语“芳基”是指含有一个、两个或三个环的碳环芳族体系，其中这些环可以以悬垂方式连接在一起或者可以稠合。芳基的非限制性实例包括苯基、联苯基或萘基，或从芳环除去氢后保留的其它芳族基团。术语芳基包括取代和未取代的部分。芳基基团可以任选地被对过程无不利影响的任意部分取代，包括但不限于上述对烷基部分所描述的那些。取代的芳基的非限制性实例包括杂芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-杂芳基氨基-N-烷基氨基、杂芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、单芳基酰氨磺酰基、芳基亚磺酰氨基、二芳基酰氨磺酰基、单芳基酰氨基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基硫基、杂芳基亚磺酰基、杂芳基磺酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳烷酰基、杂芳烷酰基、羟基芳烷基、羟基杂芳烷基、卤代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基(arylkoxy)、芳氧基烷基、饱和杂环基、部分饱和的杂环基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳氧基烷基、芳烷基、杂芳基烷基、芳基烯基和杂芳基烯基、芳烷氧羰基(carboaralkoxy)。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”是指具有芳基取代基的烷基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指具有烷基取代基的芳基。
本文所用的术语“卤素”包括氯、溴、碘和氟。
术语“酰基”是指一种羧酸酯，其中酯基团的非羰基部分选自由以下组成的组：直链、支链或环状烷基或低级烷基，烷氧基烷基(包括但不限于甲氧基甲基)，芳烷基(包括但不限于苄基)，芳氧基烷基(如苯氧基甲基)，芳基(包括但不限于苯基)，其任选地被以下取代：卤素(F、Cl、Br或I)，烷基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)或烷氧基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)，磺酸酯(如烷基或芳烷基磺酰基，包括但不限于甲磺酰基)，单、二或三磷酸酯，三苯甲基或单甲氧基三苯甲基，取代的苄基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基基团最佳地包含苯基基团。术语“低级酰基”是指这样一种酰基基团，其中非羰基部分是低级烷基。
术语“烷氧基”和“烷氧基烷基”包括具有烷基部分的直链或支链含氧基团，例如甲氧基。术语“烷氧基烷基”还包括具有一个或多个与烷基连接的烷氧基的烷基，即，形成单烷氧基烷基和二烷氧基烷基。“烷氧基”基团可以进一步被一个或多个卤原子取代，例如氟、氯或溴，以提供“卤代烷氧基”基团。这些基团的实例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基和氟丙氧基。
术语“烷基氨基”表示分别含有一个或两个与氨基连接的烷基的“单烷基氨基”和“二烷基氨基”。术语芳基氨基表示分别含有一个或两个与氨基基团连接的芳基基团的“单芳基氨基”和“二芳基氨基”。术语“芳烷基氨基”包括与氨基基团连接的芳烷基基团。术语芳烷基氨基表示分别含有一个或两个与氨基连接的芳烷基的“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”。术语芳烷基氨基还表示含有与氨基基团连接的一个芳烷基基团和一个烷基基团的“单芳烷基单烷基氨基”。
如本文所用的术语“杂原子”是指氧、硫、氮和磷。
如本文所用的术语“杂芳基”或“杂芳族”是指芳环中包含至少一个硫、氧、氮或磷的芳族化合物。
术语“杂环”、“杂环基”和环杂烷基是指非芳族环状基团，其中在环中存在至少一个杂原子，例如氧、硫、氮或磷。
杂芳基和杂环基团的非限制性实例包括呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基(cinnolinyl)、酞嗪基、黄嘌呤基(xanthinyl)、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪和蝶啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1,2,3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、氧氮杂环丙烷(oxazirane)、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞苷基(5-azacytidinyl)、5-氮杂尿嘧啶基(5-azauracilyl)、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤(vinypurine)、N6-炔嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N5-烷基嘧啶、N5-苄基嘧啶、N5-卤代嘧啶、N5-乙烯基嘧啶、N5-炔嘧啶、N5-酰基嘧啶、N5-羟烷基嘌呤和N6-硫代烷基嘌呤和异噁唑基。杂芳族基团可以任选地被取代，如以上对于芳基所述。杂环或杂芳族基团可任选地被一个或多个选自卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰氨基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的取代基取代。杂芳族化合物可根据需要部分或完全氢化。作为非限制性实例，可以使用二氢吡啶代替吡啶。可以根据需要或期望保护杂环或杂芳基上的官能氧和氮基团。合适的保护基团是本领域技术人员熟知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、酰基如乙酰基和丙酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基。杂环或杂芳族基团可以被对反应无不利影响的任意部分取代，包括但不限于上述对于芳基所描述的那些。
如本文所用的术语“宿主”是指病毒可以在其中复制的单细胞或多细胞生物体，包括但不限于细胞系和动物，并且优选是人。或者，宿主可以携带病毒基因组的一部分，其复制或功能可以被本文所述的化合物改变。术语宿主特别是指感染的细胞，用全部或部分病毒基因组转染的细胞，和动物，特别是灵长类动物(包括但不限于黑猩猩)和人类。在本文所述的大多数动物应用中，宿主是人类。然而，在某些适应症中，清楚地考虑兽医应用(例如用于治疗黑猩猩)。
术语核苷还包括核糖核苷，代表性的核糖核苷公开在例如Journal of MedicinalChemistry,43(23),4516-4525(2000),Antimicrobial Agents和Chemotherapy,45(5),1539-1546(2001)和PCT WO 2000069876中。
术语“肽”是指含有2至100个氨基酸的天然或合成化合物，这些氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连接。
在整个说明书中使用术语“药学上可接受的盐或前药”来描述化合物的任意药学上可接受的形式(例如酯)，在向患者施用后，其提供该化合物。药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机碱和无机酸或有机碱和有机酸的盐。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁以及制药领域熟知的许多其它酸的盐。
药学上可接受的前药是指在宿主中被代谢(例如被水解或氧化)以形成本文所述的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的功能部分上具有生物学上不稳定的保护基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。本文所述的化合物的前药形式可以具有抗病毒活性，可以被代谢形成表现出这种活性的化合物，或二者兼具。
II.活性化合物
本文所述的核苷化合物具有下列结构式之一。在一个实施方案中，化合物是式(A)或式(A1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
Y和R独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤素、任选取代的O-连接的氨基酸、取代或未取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的C2-6烯基、取代或未取代的C2-6炔基、取代或未取代的C3-6环烷基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、OR'、SR'，其中每个R’独立地是-C(O)-C1-12烷基、-C(O)-C2-12烯基、-C(O)-C2-12炔基、-C(O)-C3-6环烷基、-C(O)O-C1-12烷基、-C(O)O-C2-12烯基、-C(O)O-C2-12炔基、-C(O)O-C3-6环烷基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基和C3-6环烷基，其中该基团可以被一个或多个选自由卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基和氰基组成的组的取代基取代，
R1是和R1A独立地是H、CH3、CH2F、CHF2或CF3，其中，当R1是Me时，它所连接的碳可以全部或部分是R或S或其任何混合物，或者R1和R1A可以结合形成C3-7环烷基环；
R2是H、CN、N3、F、CH2-卤素、CH2-N3、O-CH2-P-(OH)3、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基或取代或未取代的C2-8炔基；
当R5是O时，R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的C2-8炔基或N3，和
当R5是Se、CH2、CHF、CF2、-C(CH3)-、-C(环丙基)-、C＝CF2或C＝CH2时，R3选自由H、F、N3、取代或未取代的(C1-8)烷基、取代或未取代的(C2-8)烯基、取代或未取代的(C2-8)炔基、O-(C1-8)烷基和N3组成的组，
R5是O、CH2、Se、CHF、CF2、-C(CH3)-、-C(环丙基)-、C＝CF2或C＝CH2，
R8和R8’独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤素、任选取代的O-连接的氨基酸、取代或未取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的C2-6烯基、取代或未取代的C2-6炔基、取代或未取代的C3-6环烷基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、OR'、SR'，其中每个R’独立地是-C(O)-C1-12烷基、-C(O)-C2-12烯基、-C(O)-C2-12炔基、-C(O)-C3-6环烷基、-C(O)O-C1-12烷基、-C(O)O-C2-12烯基、-C(O)O-C2-12炔基、-C(O)O-C3-6环烷基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基，其中该基团可以被一个或多个选自由卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基、氰基组成的组的取代基取代，
R4是OH、任选取代的O-连接的氨基酸、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、-O-C(O)O-C3-6环烷基、OC1-6烷基、OC1-6卤代烷基、OC1-6烷氧基、OC2-6烯基、OC2-6炔基、OC3-6环烷基、O-P(O)R6R7或单-、二-、或三磷酸酯，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或其任何混合物，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基(如苯基和吡啶基)组成的组，其中芳基和杂芳基任选被0-3个独立选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
其中R16独立地是H、取代或未取代的C1-20烷基，衍生自被C1-6烷基、C1-6烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
(b)D-或L-氨基酸的酯R17和R18独立地是H、C1-20烷基，衍生自任选被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
在一个实施方案中，碱基选自由以下组成的组：
在另一个实施方案中，碱基是：
X1是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-(C3-7)环烷基、C-(C1-6)卤代烷基、C-(C1-6)羟烷基、C-OR22、C-N(R22)2、C-卤素、C-CN或N，
X1’是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-卤素、C-CN或N
R9和X2独立地是H、OH、NH2、卤素(即F、Cl、Br或I)、SH、NHOH、O(C1-10)烷基、O(C2-10)烯基、O(C2-10)炔基、O(C3-7)环烷基、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、-O-C(O)O-C3-6环烷基、S(C1-10)烷基、S(C2-10)烯烃、S(C2-10)炔、S(C3-7)环烷基、任选不饱和的NH(C1-10)烷基、任选不饱和的N((C1-10)烷基)2、NH(C3-7)环烷基、任选不饱和的NH(CO)(C1-20)烷基、任选不饱和的NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、任选不饱和的NHO(CO)(C1-20)烷基、或任选不饱和的NHO(CO)NH(C1-20)烷基、(C1-3)烷基，
R9’是OH、NH2、SH、NHOH、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、或-O-C(O)O-C3-6环烷基，
R10是H或F，
X2’是N或CH，和
W是O或S。
在一个实施方案中，R5是O。
在另一个实施方案中，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R3是H。
在另一个实施方案中，R3是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R2是CN或H。
在另一个实施方案中，R1是和R1A是H。
在另一个实施方案中，R8和R8’是OH。
在另一个实施方案中，R4是OH或O-P(O)R6R7。
在另一个实施方案中，碱基是
在该实施方案的一个方面，R9是OH、NH2或NHOH。
在另一个实施方案中，碱基是
在该实施方案的一个方面，X2是NH2、OH或SH。
这些子特征可以以任何组合存在于本文所述的任何化合物中。
在另一个实施方案中，化合物是式(B)或式(B1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、Y、R、R1、R1A、R2、R3、R5和R8’如式A中所定义，
A是O或S，和
D选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基(如苯基和吡啶基)组成的组，其中芳基和杂芳基任选被0-3个独立选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
(b)D-或L-氨基酸的酯R17和R18独立地是H、C1-20烷基，衍生自任选被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；和
(c)其中R30选自由取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、取代或未取代的(C2-10)烯、取代或未取代的(C2-10)炔、C1-4(烷基)芳基、芳基、杂芳基和C1-6卤代烷基组成的组。
在一个实施方案中，R5是O。
在另一个实施方案中，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R3是H。
在另一个实施方案中，R3是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R2是CN或H。
在另一个实施方案中，R8’是OH。
在另一个实施方案中，Y是H。
在另一个实施方案中，R1和R1A是H。
在另一个实施方案中，A是H。
这些子特征可以以任何组合存在于本文所述的任何化合物中。
在另一个实施方案中，化合物是式(C)或式(C1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R、R1、R1A、R2、R3、R5、R8、R8’和Y如式A中所定义，
X是OH、NH2、SH、NHOH、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、或-O-C(O)O-C3-6环烷基，
Z是H或F，和
W是O或S。
在一个实施方案中，R5是O。
在另一个实施方案中，R2是N3或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R3是H。
在另一个实施方案中，R3是N3或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R2是CN或H。
在一个实施方案中，R8和R8’是OH。
在一个实施方案中，Y是H。
在一个实施方案中，R是H。
在一个实施方案中，Z是H。
在一个实施方案中，X是OH、NH2或NHOH。
在一个实施方案中，W是O。
在一个实施方案中，R1和R1A是H。
在一个实施方案中，R4是OH或O-P(O)R6R7。
这些子特征可以以任何组合存在于本文所述的任何化合物中。
在另一个实施方案中，化合物是式(D)或式(D1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中R、R1、R1A、R2、R3、R5、R8’和Y如式A中所定义，A和D如式C中所定义。
在一个实施方案中，R5是O。
在另一个实施方案中，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R3是H。
在另一个实施方案中，R3是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R2是CN或H。
在另一个实施方案中，R8’是OH。
在另一个实施方案中，Y是H。
在另一个实施方案中，R是H。
在另一个实施方案中，Z是H。
在另一个实施方案中，X是OH、NH2或NHOH。
在另一个实施方案中，W是O。
在另一个实施方案中，R1和R1A是H。
在另一个实施方案中，R4是OH或O-P(O)R6R7。
这些子特征可以以任何组合存在于本文所述的任何化合物中。
在另一个实施方案中，化合物是式(E)或式(E1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、R1、R1A、R2、R3和R4如式A中所定义，
R30是O或CH2，
当R30是O或CH2时，R31是O或S，
R32和R33独立地是H、F、C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。在一个实施方案中，R30是O。
在另一个实施方案中，R31是O。
在另一个实施方案中，R32和R33独立地是H或F。
在另一个实施方案中，R2是N3或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R3是N3或取代或未取代的C2-8炔基。
在另一个实施方案中，R2是CN。
在另一个实施方案中，R1和R1A是H。
在另一个实施方案中，R4是OH或O-P(O)R6R7。
在另一个实施方案中，碱基是在另一个实施方案中，X1是N。
这些子特征可以以任何组合存在于本文所述的任何化合物中。
在另一个实施方案中，化合物是式(F)或式(F1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、R1、R1A、R2、R3和R4如式A中所定义，
R34是O或CH2，和
R35和R36独立地是H、F或CH3。
在一个实施方案中，R35和R36是H。
在一个实施方案中，R34是CH2。
在一个实施方案中，R4是OH或O-P(O)R6R7。
在一个实施方案中，R3是H。
在一个实施方案中，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
在一个实施方案中，R2是CN或N3。
在一个实施方案中，R3是取代或未取代的C2-8炔基。
在一个实施方案中，R1和R1A是H。
这些子特征可以以任何组合存在于本文所述的任何化合物中。
在另一个实施方案中，化合物具有下式之一：
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施方案中，化合物具有下式之一：
在另一个实施方案中，化合物具有下式之一：
在任何这些实施方案中，化合物可以以β-D或β-L构型存在。
III立体异构现象和多晶型现象
本文所述的化合物可具有不对称中心，可以以外消旋体、外消旋混合物、单独的非对映异构体或对映异构体存在，所有异构形式均包括在本公开中。具有手性中心的本文所述化合物可以以光学活性和外消旋形式存在和分离。一些化合物可以表现出多晶型。本公开包括具有本文所述的有用性质的本文所述化合物的外消旋、光学活性、多晶型或立体异构形式或其混合物。光学活性形式可以通过例如以下方式来制备：通过重结晶技术拆分外消旋形式、通过从光学活性起始材料合成、通过手性合成或通过使用手性固定相的色谱分离或通过酶促拆分。可以纯化相应的化合物，然后衍生该化合物以形成本文所述的化合物，或纯化化合物本身。
光学活性形式的化合物可以使用本领域已知的任意方法制备，包括但不限于通过重结晶技术拆分外消旋形式、通过从光学活性起始材料合成、通过手性合成或通过使用手性固定相的色谱分离。
获得光学活性材料的方法的实例至少包括下列方法。
i)晶体物理分离法：手动分离各个对映异构体的宏观晶体的技术。如果存在单独的对映异构体的晶体，即原料是团聚体(conglomerate)且所述晶体是视觉上可区分的，则可采用该技术；
ii)同时结晶法：从外消旋体的溶液中分别结晶出各个对映异构体的技术，可能只有当外消旋体是固态的团聚体时才可行；
iii)酶促拆分法：借助对映异构体与酶反应的不同速率，部分或完全分离外消旋体的技术；
iv)酶促不对称合成法：至少一个合成步骤采用酶促反应以获得所需对映异构体的对映异构体纯的或富集的合成前体的合成技术；
v)化学不对称合成法：在产物中产生不对称(即手性)的条件下从非手性前体合成所需对映异构体的合成技术，其可使用手性催化剂或手性助剂来完成；
vi)非对映异构体分离法：使外消旋化合物与对映异构体纯试剂(手性助剂)反应，将各个对映异构体转化为非对映异构体的技术。然后所得非对映异构体借助其现在更明显的结构差异，通过色谱法或结晶法分离，随后除去手性助剂，获得所需的对映异构体；
vii)一级和二级不对称转化法：该技术通过平衡来自外消旋体的非对映异构体，使其在来自所需对映异构体的非对映异构体的溶液中占优势，或者来自所需对映异构体的非对映异构体的优先结晶作用破坏了这种平衡，致使所有材料最终几乎都被转化为来自所需对映异构体的结晶型非对映异构体。然后从所述非对映异构体中释放出所需对映异构体；
viii)动力学拆分法：该技术是指借助对映异构体与手性、非消旋试剂或催化剂在动力学条件下的不同反应速率，实现对外消旋体的部分或完全拆分(或者对部分拆分的化合物进一步拆分)；
ix)从非外消旋前体进行对映异构体专一性合成：从非手性原料获得所需对映异构体且在合成过程中没有或仅最小量地破坏立体化学完整性的合成技术；
x)手性液相色谱法：借助于外消旋体的对映异构体与固定相的相互作用不同而在液体流动相中分离出外消旋体的对映异构体的技术(包括但不限于通过手性HPLC)。所述固定相可由手性材料制得，或者所述流动相可包含引起不同相互作用的另外的手性材料；
xi)手性气相色谱法：通过使外消旋体挥发，并借助于对映异构体在气态流动相中与含有固定的非外消旋手性吸附相的柱子的不同相互作用而分离出对映异构体的技术；
xii)用手性溶剂萃取：借助一种对映异构体优先溶解于特定手性溶剂中而分离出对映异构体的技术；
xiii)跨手性膜转运法：使外消旋体与薄膜屏障接触的技术。该屏障通常分离出两种可混溶液体，其中一种含有外消旋体，驱动力如浓度差或压力差导致优先跨膜屏障转运。该膜的非外消旋手性性质仅允许外消旋体中的一种对映异构体通过，从而实现了分离。
在一个实施方案中使用手性色谱法，包括但不限于模拟移动床色谱法。各种手性固定相可商购获得。
IV.盐或前药制剂
在化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸盐或碱盐的情况下，将化合物作为药学上可接受的盐施用可能是合适的。药学上可接受的盐的实例是与酸形成的有机酸加成盐，其形成生理学上可接受的阴离子，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。还可以形成合适的无机盐，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。对于某些透皮应用，可优选使用本文所述化合物的脂肪酸盐。脂肪酸盐可以帮助渗透角质层。合适的盐的实例包括化合物与硬脂酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、辛酸和癸酸的盐。
药学上可接受的盐可以使用本领域熟知的标准方法获得，例如通过使足够碱性的化合物如胺与合适的酸(提供生理学上可接受的阴离子)反应。在化合物包括多个胺基的那些情况下，可以与任意数量的胺基形成盐。还可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙)盐。
前药是一种药理学物质，其以无活性(或显著较低的活性)形式施用，并随后在体内代谢为活性代谢物。以较低剂量使更多药物到达所需靶标通常是使用前药背后的基本原理并且这通常归因于更好的吸收、分布、代谢和/或排泄(ADME)性质。前药通常设计成用于改善口服生物利用度，因为胃肠道吸收不良通常是限制因素。另外，使用前药策略可以增加药物对其预期靶标的选择性，从而降低脱靶效应的可能性。
V.治疗方法
在一个实施方案中，本文所述的化合物可用于预防、治疗或治愈冠状病毒感染，具体包括SARS-CoV2感染，如SARS-CoV-2、MERS、SARS和OC-43。在其他实施方案中，本文所述的化合物可用于预防、治疗或治愈黄病毒、小RNA病毒科、披膜病毒科和布尼亚病毒科感染。
所述方法包括施用治疗或预防有效量的至少一种如本文所述的化合物，以治疗、治愈或预防由冠状病毒感染或由黄病毒、小RNA病毒、披膜病毒和布尼亚病毒或其它RNA病毒引起的感染引起的感染，或施用足以降低所述病毒生物活性的量。
在另一个实施方案中，本文所述的化合物可用于抑制细胞中冠状病毒、黄病毒、小RNA病毒、披膜病毒或布尼亚病毒蛋白酶，或与另一种RNA病毒相关的蛋白酶。该方法包括将细胞与有效量的本文所述化合物接触，
宿主，包括但不限于被冠状病毒、黄病毒、小RNA病毒、披膜病毒或布尼亚病毒或其它RNA病毒或其基因片段感染的人，可以通过向患者施用在药学上可接受的载体或稀释剂的存在下的有效量的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐来治疗。活性物质可以通过任意合适的途径施用，例如以液体或固体形式口服、胃肠外、静脉内、皮内、透皮、皮下或局部施用。
冠状病毒属中有多个物种，包括但不限于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)和SARS-Cov2。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以改善和/或治疗MERS-CoV感染、SARS-CoV感染或SARS-Cov2感染。可将有效量的本文所述化合物向感染这些病毒的受试者施用，和/或通过将感染这些病毒的细胞与有效量的本文所述化合物接触。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以抑制这些病毒的复制。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善这些感染的一种或多种症状。症状包括但不限于极度疲劳、不适、头痛、高烧(例如>100.4°F.)、嗜睡、意识模糊、皮疹、食欲不振、肌痛、寒战、腹泻、干咳、流鼻涕、喉咙痛、气短、呼吸问题、血氧水平逐渐下降(例如缺氧)和肺炎。
本文公开的一些实施方案涉及治疗和/或改善由披膜病毒科病毒引起的感染的方法，该方法可以包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物，或包含本文所述化合物的药物组合物。本文所述的一些实施方案涉及在制备用于改善和/或治疗由披膜病毒科病毒引起的感染的药物中使用本文所述的一种或多种化合物，其可以包括向受试者施用有效量的本文所述的一种或多种化合物。
本文公开的一些实施方案涉及改善和/或治疗由披膜病毒科病毒引起的感染的方法，所述方法可包括将被病毒感染的细胞与有效量的一种或多种本文所述化合物或包含一种或多种本文所述化合物的药物组合物接触。本文所述的其它实施方案涉及在制备用于改善和/或治疗由披膜病毒科病毒引起的感染的药物中使用本文所述的一种或多种化合物，其可以包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。
在一些实施方案中，披膜病毒科病毒可以是甲病毒。甲病毒中的一种是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善和/或治疗VEEV感染。在其它实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可被制成用于改善和/或治疗由VEEV引起的感染的药物，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。在其它实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可用于改善和/或治疗由VEEV引起的感染，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。在一些实施方案中，VEEV可以是流行亚型。在一些实施方案中，VEEV可以是本地亚型。如本文所述，委内瑞拉马脑炎病毒复合物包括多个亚型，这些亚型通过抗原变异型进一步划分。在一些实施方案中，本文所述的化合物可有效对抗VEEV的一种以上亚型，例如2、3、4、5或6种亚型。在一些实施方案中，化合物可用于治疗、改善和/或预防VEEV亚型I。在一些实施方案中，本文所述的化合物可有效对抗一种以上的VEEV抗原变异型。在一些实施方案中，化合物可以改善VEEV感染的一种或多种症状。感染VEEV的受试者表现出的症状的实例包括流感样症状，例如高烧、头痛、肌痛、疲劳、呕吐、恶心、腹泻和咽炎。患有脑炎的受试者表现出以下一种或多种症状：嗜睡、惊厥、意识模糊、畏光、昏迷以及脑、肺和/或胃肠道出血。在一些实施方案中，受试者可以是人。在其他实施例中，受试者可以是马。
基孔肯雅病毒(CHIKV)是另一种甲病毒。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善和/或治疗CHIKV感染。在其它实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可被制成用于改善和/或治疗由CHIKV引起的感染的药物，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。在其它实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可用于改善和/或治疗由CHIKV引起的感染，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。在一些实施方案中，通过向感染CHIKV的受试者施用有效量的化合物和/或通过将CHIKV感染的细胞与有效量的本文所述化合物接触，可以改善CHIKV感染的一种或多种症状。CHIKV感染的临床症状包括发热、皮疹(如瘀点和/或斑丘疹)、肌肉疼痛、关节痛、疲劳、头痛、恶心、呕吐、结膜炎、味觉丧失、畏光、失眠、关节痛和关节炎。
其他种类的甲病毒包括巴尔马森林病毒、马雅罗病毒(MAYV)、阿良良病毒、罗斯河病毒(RRV)、塞姆利基森林病毒、辛德比斯病毒(SINV)、乌纳病毒、东部马脑炎病毒(EEE)和西部马脑脊髓炎病毒(WEE)。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可用于改善和/或治疗由甲病毒引起的感染，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的一种或多种所述化合物接触和/或向受试者(例如，感染病毒的受试者)施用有效量的一种或多种所述化合物，其中甲病毒可选自巴尔马森林病毒、马雅罗病毒(MAYV)、阿良良病毒、罗斯河病毒(RRV)、塞姆利基森林病毒、辛德比斯病毒(SINV)、乌纳病毒、东部马脑炎病毒(EEE)和西部马脑脊髓炎病毒(WEE)。
冠状病毒科病毒的另一个属是风疹病毒(Rubivirus)。本文公开的一些实施方案涉及改善和/或治疗由风疹病毒引起的感染的方法，所述方法可包括将被病毒感染的细胞与有效量的一种或多种本文所述化合物或包含一种或多种本文所述化合物的药物组合物接触。本文所述的其它实施方案涉及在制备用于改善和/或治疗由风疹病毒引起的感染的药物中使用本文所述的一种或多种化合物，其可以包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。本文所述的其它实施方案涉及本文所述的一种或多种化合物，其可用于通过将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触来改善和/或治疗由风疹病毒引起的感染。
本文公开的一些实施方案涉及治疗和/或改善由布尼亚病毒科病毒引起的感染的方法，该方法可以包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物，或包含本文所述化合物的药物组合物。本文公开的其他实施方案涉及治疗和/或改善由布尼亚病毒科病毒引起的感染的方法，该方法可以包括向被鉴定为患有病毒感染的受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物，或包含本文所述化合物的药物组合物。
本文公开的一些实施方案涉及改善和/或治疗由布尼亚病毒科病毒引起的感染的方法，所述方法可包括将被病毒感染的细胞与有效量的一种或多种本文所述化合物或包含一种或多种本文所述化合物的药物组合物接触。本文所述的其它实施方案涉及在制备用于改善和/或治疗由布尼亚病毒科病毒引起的感染的药物中使用本文所述的一种或多种化合物，其可以包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。本文所述的其它实施方案涉及本文所述的一种或多种化合物，其可用于通过将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触来改善和/或治疗由布尼亚病毒科病毒引起的感染。
本文公开的一些实施方案涉及抑制布尼亚病毒科病毒复制的方法，所述方法可包括将被病毒感染的细胞与有效量的一种或多种本文所述化合物或包含一种或多种本文所述化合物的药物组合物接触。本文所述的其它实施方案涉及在制备用于抑制布尼亚病毒科病毒复制的药物中使用本文所述的一种或多种化合物，其可以包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。本文所述的其它实施方案涉及本文所述的化合物，其可用于通过将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触来抑制布尼亚病毒科病毒复制。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以抑制布尼亚病毒科病毒的RNA依赖性RNA聚合酶，从而抑制RNA的复制。在一些实施方案中，通过将感染了布尼亚病毒科病毒的细胞与本文所述的化合物接触，可以抑制布尼亚病毒的聚合酶。
在一些实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以是布尼亚病毒(Bunyavirus)。在其他实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以是汉坦病毒(Hantavirus)。在其他实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以是内罗病毒(Nairovirus)。在其他实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以是白蛉病毒(Phlebovirus)。在一些实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以是正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)。在其他实施方案中，布尼亚病毒科病毒可以是番茄斑萎病毒(Tospovirus)。
白蛉病毒属的一种是裂谷热病毒。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善和/或治疗裂谷热病毒感染。在其它实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可被制成用于改善和/或治疗由裂谷热病毒引起的感染的药物，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。在其它实施方案中，本文所述的一种或多种化合物可用于改善和/或治疗由裂谷热病毒引起的感染，其可包括将感染病毒的细胞与有效量的所述化合物接触。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以抑制裂谷热病毒的复制，其中所述化合物被施用于感染裂谷热病毒的受试者和/或其中所述化合物接触感染裂谷热的细胞。
在一些实施方案中，本文所述的化合物可以改善、治疗和/或抑制一种或多种眼部型、脑膜脑炎型或出血热型裂谷热病毒的复制。在一些实施方案中，可以改善裂谷热病毒感染的一种或多种症状。裂谷热病毒感染的症状实例包括头痛、肌肉疼痛、关节痛、颈部僵硬、对光敏感、食欲不振、呕吐、肌痛、发热、疲劳、背痛、头晕、体重减轻、眼部形成症状(例如，视网膜损伤、视力模糊、视力下降和/或永久性失明)、脑膜脑炎形成的症状(例如，剧烈头痛、丧失记忆、幻觉、意识模糊、定向障碍、眩晕、抽搐、嗜睡和昏迷)和出血热形成的症状(例如，黄疸、吐血、便血、紫癜性皮疹、瘀斑、鼻子和/或牙龈出血、月经过多和静脉穿刺部位出血)。
白蛉病毒属的另一种是血小板减少综合征病毒。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善、治疗和/或抑制血小板减少综合征病毒的复制。在一些实施方案中，化合物可以改善和/或治疗伴有血小板减少综合征(SFTS)的严重发热。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善SFTS的一种或多种症状。临床症状包括：发热、呕吐、腹泻、多器官衰竭、血小板减少、白细胞减少和肝酶水平升高。
克里米亚-刚果出血热病毒(CCHF)是内罗病毒属的一种。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善、治疗和/或抑制克里米亚-刚果出血热病毒的复制。感染CCHF的受试者具有一种或多种以下症状：流感样症状(如高烧、头痛、肌痛、疲劳、呕吐、恶心、腹泻和/或咽炎)、出血、情绪不稳定、激动、精神混乱、咽喉瘀斑、流鼻血、血尿、呕吐、黑便、肝脏肿胀和/或疼痛、弥散性血管内凝血、急性肾衰竭、休克和急性呼吸窘迫综合征。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善CCHF的一种或多种症状。
加利福尼亚脑炎病毒是布尼亚病毒科的另一种病毒，是正布尼亚病毒属的一员。加利福尼亚脑炎病毒感染的症状包括但不限于发热、寒战、恶心、呕吐、头痛、腹痛、嗜睡、局灶性神经病学发现、局灶性运动异常、瘫痪、嗜睡、精神警觉性和定向力缺乏以及癫痫发作。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善、治疗和/或抑制加利福尼亚脑炎病毒的复制。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善加利福尼亚脑炎病毒感染的一种或多种症状。
汉坦病毒属内的病毒可引起汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)(由诸如汉坦河病毒、多布拉瓦-贝尔格莱德病毒、萨雷马病毒、首尔病毒和普马拉病毒等病毒引起)和汉坦病毒肺综合征(HPS)。可导致HPS的病毒包括但不限于，黑河沟病毒病毒(BCCV)、纽约病毒(NYV)、辛诺伯病毒(SNV)。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善和/或治疗HFRS或HPS。HFRS的临床症状包括脸颊和/或鼻子发红、发热、发冷、手心出汗、腹泻、不适、头痛、恶心、腹部和背部疼痛、呼吸问题、胃肠道问题、心动过速、低氧血症、肾衰竭、蛋白尿和多尿。HPS的临床症状包括流感样症状(例如，咳嗽、肌痛、头痛、嗜睡和气短，可恶化为急性呼吸衰竭)。在一些实施方案中，本文描述的化合物可以改善HFRS或HPS的一种或多种症状。
用于确定治疗和/或改善冠状病毒科、披膜病毒科、肝炎病毒科和/或布尼亚病毒科病毒感染的方法的有效性的各种指标是本领域技术人员已知的。合适指标的实例包括但不限于病毒载量的减少、病毒复制的减少、血清转化时间的减少(患者血清中检测不到病毒)、临床结果中发病率或死亡率的减少和/或疾病反应的其他指标。进一步的指标包括一个或多个总体生活质量健康指标，如减少的病程、减少的疾病严重程度、减少的恢复正常健康和正常活动的时间，以及减少的缓解一种或多种症状的时间。在一些实施方案中，与未经治疗的受试者相比，本文所述的化合物可导致一种或多种上述指标的减少、缓解或阳性指示。
VI.联合或替代疗法
在一个实施方案中，本文所述的化合物可以与至少一种其它活性药物一起使用，所述活性药物可以是抗病毒剂。在该实施方案的一个方面，所述至少一种其它活性药物选自由以下组成的组：融合抑制剂、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、抗病毒核苷，如瑞德西韦、GS-441524、N4-羟基胞苷和美国专利号9,809,616中公开的其它化合物及其前药、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、JAK抑制剂、血管紧张素转化酶2(ACE2)抑制剂、SARS-CoV特异性人单克隆抗体(包括CR3022、NS5A抑制剂，例如达卡他韦)以及不同或未知机制的药物。
乌米非诺韦(Umifenovir，也称为阿比朵尔)是一种代表性的融合抑制剂。
代表性的进入抑制剂包括卡莫司他、木犀草素、MDL28170、SSAA09E2、SSAA09E1(作为组织蛋白酶L抑制剂)、SSAA09E3和四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(TGG)。这些化合物中的某些化合物的化学式如下：
其他进入抑制剂包括以下：
瑞德西韦、索非布韦、利巴韦林、IDX-184和GS-441524具有下式：
此外，可以施用抑制细胞因子风暴的化合物、解决血凝块的抗凝剂和/或血小板聚集抑制剂、螯合由病毒如COVID-19从血红蛋白释放的铁离子的化合物、细胞色素P-450(CYP450)抑制剂和/或NOX抑制剂。
代表性的NOX抑制剂公开在PCT/US2018/067674中，包括AEBSF、Apocyanin、DPI、GK-136901、ML171、白花丹素、S17834、VAS2870、VAS3947、GKT-831、GKT771、GTL003或其酰氨基噻二唑衍生物，如AU2015365465、EP20140198597中所述；以及WO2015/59659，CN104147001和CN20131179455中所述的五味子乙素，美国公开号2015045387、GB20110016017和WO201200725中所述的二芳族和三芳族化合物，JP 2015227329、JP20140097875和JP 20150093939中所述的甲氧基黄酮衍生物，美国公开号2015368301、TN2015000295、美国公开号201514689803、美国公开号201462013916、PCT WO 201450063和EP20130150187中所述的肽，例如NOX2ds-tat和PR-39，美国公开号2014194422、美国专利号9428478、美国公开号201214123877、美国公开号201161496161和PCT WO 2012US41988中描述的哌嗪衍生物，KR101280198、KR20110025151和KR20090082518中公开的吡唑衍生物，HK1171748、PCT WO201054329和EP 20090171466中公开的吡唑啉二酮衍生物，KR20130010109、KR20130002317、EP20100153927、PCT WO201150667、EP20100153929和PCTWO2011IB50668中公开的吡唑并哌啶衍生物，KR20170026643、HK1158948、HK1141734、HK1159096、HK1159092、EP20080164857、PCT WO200954156、PCT WO200954150、EP20080164853、PCT WO200853390、美国公开号20070896284、EP20070109555、PCT WO200954148、EP20080164847、PCT WO200954155和EP20080164849中描述的吡唑并吡啶衍生物，EP2886120、美国公开号2014018384、美国公开号20100407925、EP20110836947、GB20110004600和PCT WO 201250586中公开的喹唑啉和喹啉衍生物，美国公开号2010120749、美国专利号8,288,432、美国公开号20080532567、EP20070109561、美国公开号20070908414和PCT WO 200853704中公开的四氢吲哚衍生物，美国公开号2016083351、美国公开号201414888390、美国公开号201361818726和PCT WO 201436402中公开的四氢异喹啉衍生物，TW201325588和TW20110147671中描述的东莨菪素，以及TW201713650和PCT WO201554662中公开的2,5-二取代的苯并噁唑和苯并噻唑衍生物。代表性的NOX抑制剂还包括PCT WO2011062864中公开的那些抑制剂。
示例性的Nox抑制剂还包括2-苯基苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(4-甲氧基苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(2,4-二甲基苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(4-氟苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(2,4-二甲基苯基)-5-氟苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、5-氟-2-(4-氟苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(2-氯-6-甲基苯基)-5-氟苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、5-氟-2-苯基苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-氟苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸甲酯、4-(5-氟-3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸甲酯、4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸乙酯、4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸叔丁酯、2-甲氧基-4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸甲酯、3-氯-4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸甲酯、4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲腈、2-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸甲酯、2-(4-乙酰基苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(4-硝基苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(4-羟基苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、6-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)烟酸甲酯、6-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)烟腈、2-(4-(羟甲基)苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-苄基苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、N-甲基-4-(3-氧代苯并[d]异噻唑-2(3H)-基)苯甲酰胺、2-(4-羟基苯基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(2,4-二甲基苯基)-1-甲基-1H-吲唑-3(2H)-酮、2-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吲唑-3(2H)-酮、2-(2,4-二甲基苯基)-1H-吲唑-3(2H)-酮、1-甲基-2-苯基-1H-吲唑-3(2H)-酮、2-(1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(5-(乙硫基)-1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(5-(甲硫基)-1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、5-氟-2-(1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(5-(叔丁基)-1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(5-(4-溴苯基)-1,3,4-噻二唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮2-(4-甲基噻唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(4,5-二甲基噻唑-2-基)苯并[d]异噻唑-3(2H)-酮、2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-4,5-二氟苯并[d][1,2]硒唑-3(2H)-酮、2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-氟苯并[d][1,2]硒唑-3(2H)-酮、2-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)-5-氟苯并[d][1,2]硒唑-3(2H)-2-(4-(1,3-二氧戊环-2-基)苯基)苯并[d][1,2]硒唑-3(2H)-酮、2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-6,7-二甲氧基苯并[d][1,2]硒唑-3(2H)-酮、4-(3-氧代苯并[d][1,2]硒唑-2(3H)-基)苯甲酸甲酯、4-(3-氧代异噻唑并[5,4-b]吡啶-2(3H)-基)苯甲酸甲酯和4-(3-氧代异噻唑-2(3H)-基)苯甲酸乙酯及其药学上可接受的盐和前药。
其他代表性的NOX抑制剂包括：
其中
Z选自由以下组成的组：C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烷基芳基、芳烷基、羟基、硝基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、甲酰基、肼基、卤素(F，Cl，Br或1)、OR'、NHR'、SR'、S(O)R’、S(O)2R’、S(O)2NHR’、S(O)2N(R’)R’、SF5、COOR'、COR'、OCOR'、NHCOR'、N(COR')COR'、SCOR'、OCOOR'和NHCOOR’，其中每个R’独立地是H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基或芳烷基，其中所述基团可以被一个或多个如上文所定义的取代基取代，
并且n是0-4的整数，
或其药学上可接受的盐或前药。
这些化合物的具体实例包括
其氘代类似物或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施方案中，NOX抑制剂是依布硒啉、新蝶呤、APBA、Diapocynin或其氘代类似物，或其药学上可接受的盐或前药。
在另一个实施方案中，NOX化合物是PCT WO 2010/035221中公开的那些化合物。
在另一个实施方案中，化合物是PCT WO 2013/068972中公开的NOX抑制剂，其选自由以下组成的组：
4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-5-(吡嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(4-氯苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-(吡嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-5-[(l-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(2-氟-5-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-5-[(2-甲氧基吡啶-4-基)甲基]-4-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-甲氧基苯基)-4-甲基-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(5-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-5-[(6-甲氧基吡啶-3-基)甲基]-4-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(5-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(2-氟-5-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-[(1-甲基-1H-吡唑-1-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(5-氯-2-氟苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-甲基-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(吡嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2-氟苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-甲氧基苯基)-4-(3-甲氧基苯基)-5-[(1-甲基-1H-吡唑-1-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-[(1-甲基-1H-吡唑-1-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-5-[(1-甲基-1H-吡唑-1-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-甲氧基苯基)-4-(3-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-[(2-甲氧基吡啶-4-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2-氟-4-甲氧基苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2,6-二氟苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2-氟苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-甲基-5-[(l-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(3-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-5-甲基-4-[3-(甲氨基)苯基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2-氟苯基)-5-(吡啶-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2,5-二氟苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(4-氯苯基)-5-(1,3-噻唑-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲氨基)苯基]-5-[(1-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(3,5-二氯苯基)-5-(吡啶-4-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(3-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲氨基)苯基]-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2,6-二氟苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
4-(2-氟-5-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)-5-(吡嗪-2-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；
2-(2-氯苯基)-4-(2,5-二氟苯基)-5-(吡啶-3-基甲基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮；和
2-(2-氯苯基)-4-[3-(二甲氨基)苯基]-5-[(1-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基]-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6(2H,5H)-二酮。
代表性的CYP450抑制剂包括但不限于：胺碘酮、氨氯地平、芹菜素、阿瑞匹坦、香柠檬素(葡萄柚)、丁丙诺啡、安非他酮、咖啡因、咖啡醇、大麻二酚、塞来昔布、氯霉素、氯苯那敏、氯丙嗪、西咪替丁、西那卡塞、环丙沙星、西酞普兰、克拉霉素、氯马斯汀、氯贝特、氯丙咪嗪、克霉唑、可比司他、可卡因、姜黄素(姜黄)、苯甲嗪、地拉韦定、地昔帕明、双硫仑、地尔硫卓、苯海拉明、二硫代氨基甲酸盐、多潘立酮、多塞平、阿霉素、度洛西汀、紫锥花、恩他卡朋、红霉素、依他普仑、非氨酯、非诺贝特、类黄酮(葡萄柚)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星)、氟西汀、氟伏沙明、氟康唑、氟伐他汀、加巴喷丁、吉非罗齐、孕二烯酮、卤泛群、氟哌啶醇、羟嗪、伊马替尼、吲哚美辛、茚地那韦、干扰素、异烟肼、伊曲康唑、JWH-018、酮康唑、来曲唑、洛伐他汀、左美丙嗪、美金刚胺、哌醋甲酯、甲氧氯普胺、美沙酮、甲巯咪唑、甲氧沙林、美替拉酮、米贝拉地尔、咪康唑、米多君、米非司酮、水飞蓟、吗氯贝胺、莫达非尼、孟鲁司特、吗氯贝胺、柚皮素(葡萄柚)、奈法唑酮、奈非那韦、烟酸、烟酰胺(niacinamide)、尼古丁、烟酰胺(nicotinamide)、尼鲁米特、诺氟沙星、邻甲苯海明、帕罗西汀、奋乃静、毛果芸香碱、胡椒碱、保泰松、丙磺舒、异丙嗪、质子泵抑制剂(例如兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑)、槲皮素、奎尼丁、雷尼替丁、利培酮、利托那韦、沙奎那韦、司来吉兰、舍曲林、杨桃、圣约翰草、硫康唑、磺胺甲噁唑、磺胺苯唑、泰利霉素、替尼泊苷、特比萘芬、噻唑烷二酮类、噻利达嗪、噻氯匹定、噻康唑、噻替派、甲氧苄啶、托吡酯、强内心百乐明、曲吡那敏、缬草、丙戊酸、维拉帕米、伏立康唑、扎鲁司特和珠氯噻醇。
代表性的ACE-2抑制剂包括含巯基的药物，如阿拉普利、卡托普利(capoten)和zefnopril，含二羧酸盐的药物，如依那普利(vasotec)、雷米普利(altace)、喹那普利(accupril)、培哚普利(coversyl)、赖诺普利(listril)、贝那普利(lotensin)、咪达普利(tanatril)、群多普利(mavik)和西拉普利(inhibace)，以及含膦酸盐的药物，如福辛普利(福司坦/莫普利)。
例如，当用于治疗或预防感染时，活性化合物或其前体药物或药学上可接受的盐可以与另一种抗病毒剂组合或交替施用，所述抗病毒剂包括但不限于上式的那些抗病毒剂。通常，在联合疗法中，两种或多种药物的有效剂量一起给药，而在交替疗法中，每种药物的有效剂量依次施用。剂量将取决于药物的吸收、失活和排泄速率，以及本领域技术人员已知的其他因素。应当注意的是，剂量值也将随着要缓解的病况的严重程度而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，具体的剂量方案和时间表应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间进行调整。
与本文所述化合物组合的许多药物公开于Ghosh等人,“Drug Development andMedicinal Chemistry Efforts Toward SARS-Coronavirus and Covid-19Therapeutics,”ChemMedChem 10.1002/cmdc.202000223。
可以与本文公开的化合物联合使用的抗病毒剂的非限制性实例包括下面列出的那些抗病毒剂。
抑制细胞因子风暴的化合物
在其激活的整个过程中，必须调节炎症反应，以防止破坏性的系统性炎症，也称为“细胞因子风暴”。许多具有抗炎特性的细胞因子对此负责，如IL-10和转化生长因子β(TGF-β)。每种细胞因子作用于炎症反应的不同部分。例如，Th2免疫反应的产物抑制Th1免疫反应，反之亦然。
通过消除炎症，可以最大限度地减少对周围细胞的间接损害，对患者的长期损害很小或没有。因此，除了使用本文所述的化合物来抑制病毒感染之外，还可以共同施用一种或多种抑制细胞因子风暴的化合物。
抑制细胞因子风暴的化合物包括靶向基本免疫途径的化合物，如趋化因子网络和胆碱能抗炎途径。
JAK抑制剂，如JAK 1和JAK 2抑制剂，可以抑制细胞因子风暴，在某些情况下，也是抗病毒的。代表性的JAK抑制剂包括美国专利号10,022,378中公开的那些抑制剂，例如Jakafi、托法替尼和巴瑞克替尼，以及LY3009104/INCB28050、帕克替尼/SB1518、VX-509、GLPG0634、INC424、R-348、CYT387、TG 10138、AEG 3482及其药学上可接受的盐和前药。
更进一步的实例包括CEP-701(Lestaurtinib)、AZD1480、INC424、R-348、CYT387、TG 10138、AEG 3482、7-碘-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(4-氨基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)丙烯酰胺、7-(3-氨基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)丙烯酰胺、N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-羧酸甲酯、N-(4-吗啉代苯基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(4-氨基-3-甲氧基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、N,N-二甲基-3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、1-乙基-3-(2-甲氧基-4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)脲、N-(4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、2-甲氧基-4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯并-1、2-氰基-N-(3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、N-(氰甲基)-2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺、N-(3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、1-乙基-3-(4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)脲、N-(3-硝基苯基)-7-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-碘-N-(3-硝基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N1-(7-(2-乙基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)苯-1,3-二胺、N-叔丁基-3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、N1-(7-碘噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)苯-1,3-二胺、7-(4-氨基-3-(三氟甲氧基)苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(2-乙基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、N-(氰甲基)-N-(3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、N-(氰甲基)-N-(4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、N-(3-(5-甲基-2-(4-吗啉苯基氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、4-(5-甲基-2-(4-吗啉苯基氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)苯磺酰胺、N-(4-(5-甲基-2-(4-吗啉苯基氨基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、7-碘-N-(4-吗啉代苯基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(2-异丙基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-溴-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N7-(2-异丙基苯基)-N2-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,7-二胺、N7-(4-异丙基苯基)-N2-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,7-二胺、7-(5-氨基-2-甲基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(氰甲基)-4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺、7-碘-N-(3-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(4-氨基-3-硝基苯基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(2-甲氧基吡啶-3-基)-N-(4-吗啉代苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、(3-(7-碘噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基氨基)苯基)甲醇、N-叔丁基-3-(2-(3-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、N-叔丁基-3-(2-(3-(羟甲基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、N-(4-吗啉代苯基)-7-(4-硝基苯硫基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-叔丁基-3-(2-(3,4,5-三甲氧基苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、7-(4-氨基-3-硝基苯基)-N-(3,4-二甲氧基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3,4-二甲氧基苯基)-7-(2-甲氧基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-叔丁基-3-(2-(3,4-二甲氧基苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、7-(2-氨基嘧啶-5-硝基苯基)-N-(3,4-二甲氧基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3,4-二甲氧基苯基)-7-(2,6-二甲氧基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3,4-二甲氧基苯基)-7-(2,4-二甲氧基吡啶-5-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-碘-N-(4-(吗啉甲基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-叔丁基-3-(2-(4-(吗啉甲基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、2-氰基-N-(4-甲基-3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯甲酸乙酯、7-溴-N-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3-(2-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、N-(氰甲基)-3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺、N-叔丁基-3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺、N-叔丁基-3-(2-(4-(1-乙基哌啶-4-基氧基)苯基氨基)噻吩并-[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、叔丁基-4-(2-(4-(吗啉甲基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1H-吡唑-1-羧酸酯、7-溴-N-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-叔丁基-3-(2-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)苯基氨基)-噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、N-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7-(1H-吡唑-4-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(氰甲基)-3-(2-(4-(吗啉甲基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯甲酰胺、N-叔丁基-3-(2-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]-嘧啶-7-基)苯磺酰胺、吡咯烷-1-基)乙氧基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苄氨基甲酸叔丁酯、3-(2-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯磺酰胺、7-(3-氯-4-氟苯基)-N-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)噻吩并-[3,2-d]嘧啶-2-胺、4-(2-(4-(1-乙基哌啶-4-基氧基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基-)-1H-吡唑-1-羧酸叔丁酯、7(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-(4-(吗啉甲基)苯基)噻吩并[3.2-d]嘧啶-2-胺、5-(2-(4-(吗啉甲基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)-1H-吲哚-1-羧酸叔丁酯、7-(2-氨基嘧啶-5-基)-N-(4-(吗啉甲基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、4-(2-(-4-(吗啉甲基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)羧酸叔丁酯、吗啉甲基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苄基氨基甲酸叔丁酯、N-(3-(2-(4-(吗啉甲基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、N-(4-(2-(4-(吗啉甲基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、N-(3-(2-(4-(吗啉甲基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲磺酰胺、7-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-N-(4-(吗啉甲基)苯基)噻吩并-[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(2-甲氧基-4-(2-(4-(吗啉甲基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)乙酰胺、7-溴-N-(3,4,5-三甲氧基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、(3-(2-(3,4,5-三甲氧基苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇、(4-(2-(3,4,5-三甲氧基苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇、(3-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇、(4-(2-(4-吗啉苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苯基)甲醇、N-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苄基)甲磺酰胺、吗啉甲基)苯基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)苄基氨基甲酸叔丁酯、N-(4-(吗啉甲基)苯基)-7-(3-(哌嗪-1-基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(6-(2-吗啉乙基氨基)吡啶-3-基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(2-乙基苯基)-N-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-(4-(氨基甲基)苯基)-N-(4-(吗啉甲基)苯基)噻吩并-[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(4-(1-乙基哌啶-4-基氧基)苯基)-7-(1H-吡唑-4-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(2,4-二甲氧基苯基)-7-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、7-溴-N-(3,4-二甲氧基苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、N-(3,4-二甲氧基苯基)-7-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-胺、及其药学上可接受的盐和前药。
可以使用下调细胞因子风暴的HMGB1抗体和COX-2抑制剂。这种化合物的实例包括Actemra(Roche)。可以使用塞来昔布(celecoxib)，一种COX-2抑制剂。还可以使用IL-8(CXCL8)抑制剂。
趋化因子受体CCR2拮抗剂，如PF-04178903可以减少肺部免疫病状。
可以使用选择性α7Ach受体激动剂，如GTS-21(DMXB-A)和CNI-1495。这些化合物减少TNF-α。败血症的晚期介质HMGB1下调IFN-γ途径，并阻止LPS诱导的IL-10和STAT 3机制的抑制。
用于治疗或预防血凝块的化合物
导致呼吸道感染的病毒，包括冠状病毒，如Covid-19，可能与肺部血凝块有关，血凝块也可能对心脏造成损害。
本文所述的化合物可与抑制血凝块形成的化合物(如血液稀释剂)或分解现有血凝块的化合物(如组织纤溶酶原激活剂(TPA)、整联蛋白(依替巴肽)、阿昔单抗(ReoPro)或替罗非班(Aggrastat))共同施用。
血液稀释剂防止血凝块形成，并防止现有的血凝块变大。有两种主要的血液稀释剂。抗凝剂，如肝素或华法林(也称为香豆定)，可以减缓产生血栓的生物过程，抗血小板聚集药物，如波立维，阿司匹林，可以防止称为血小板的血细胞聚集在一起形成血栓。
例如，通常在诊断后尽快以180mcg/kg的剂量静脉推注施用，以2mcg/kg/min的剂量连续输注(在初始推注后)达96小时的治疗。
代表性的血小板聚集抑制剂包括糖蛋白IIB/IIIA抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷再摄取抑制剂和腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂。这些可以任选地与抗凝剂联合施用。
代表性的抗凝剂包括香豆素类(维生素K拮抗剂)、肝素及其衍生物，包括非分散肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)和超低分子量肝素(ULMWH)，Xa因子的合成五糖抑制剂，包括磺达肝癸钠、Idraparinux和Idrabiotaparinux，直接作用的口服抗凝剂(DAOC)，例如达比加群、利伐沙班、阿哌沙班、依多沙班和贝曲沙班，以及抗凝血酶蛋白治疗剂/凝血酶抑制剂，例如二价药物水蛭素、来匹卢定和比伐卢定以及单价阿加曲班。
代表性的血小板聚集抑制剂有普伐他汀、波立维(硫酸氢氯吡格雷)、培达(西洛他唑)、Effient(普拉格雷)、Aggrenox(阿司匹林和双嘧达莫)、Brilinta(替格瑞洛)、卡帕珠单抗、Kengreal(坎格雷洛)、潘生丁(双嘧达莫)、Ticlid(噻氯匹定)、Yosprala(阿司匹林和奥美拉唑)。
小分子共价CoV 3CLpro抑制剂
代表性的小分子共价CoV 3CLpro抑制剂包括以下化合物：
非共价CoV 3CLpro抑制剂
代表性的非共价CoV 3CLpro抑制剂包括以下：
SARS-CoV PLpro抑制剂
代表性的SARS-Cov PLpro抑制剂包括以下：
其他化合物包括以下：
可以使用的其他化合物
可用于联合疗法的其他化合物和化合物类别包括以下：抗体，包括单克隆抗体(mAb)、阿比朵尔(umifenovir)、托珠单抗(tocilizumab)、APN01(Aperion Biologics)、ARMS-1(其包括西吡氯铵(CPC))、ASC09(Ascletis Pharma)、AT-001(AppliedTherapeutics Inc.)和其他醛糖还原酶抑制剂(ARI)、ATYR1923(aTyr Pharma，Inc.)、Aviptadil(Relief Therapeutics)、阿兹夫定、Bemcentinib、BLD-2660(BladeTherapeutics)、贝伐单抗、Brensocatib、Calquence(acalabrutinib)、甲磺酸卡莫司他(一种TMPRSS2抑制剂)、卡瑞利珠单抗、CAP-1002(Capricor Therapeutics)、CD24Fcm、克拉夫定(OncoImmune)、CM4620-IE(CalciMedica Inc.、CRAC通道抑制剂)、秋水仙碱、恢复期血浆、CYNK-001(Sorrento Therapeutics)、DAS181(Ansun Pharma)、双嘧达莫(Persantine)、多西司他钠(DSTAT)、杜韦利西布、依库丽单抗、EIDD-2801(Ridgeback Biotherapeutics)、依帕伐单抗、法曲西利(CYC065)和塞利西利(roscovitine)(细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂)、达格列净(dapagliflozin)、法维拉韦/法匹拉韦/T-705/Avigan、Galidesivir、戈诺卫(danoprevir)、Gilenya(fingolimod)(1-磷酸鞘氨醇受体调节剂)、Gimsilumab、IFX-1、Ilaris(卡那单抗)、静脉注射免疫球蛋白、伊维菌素(输入蛋白α/β抑制剂)、Kaletra/Aluvia(洛匹那韦/利托那韦)、Kevzara(萨利霉素)、Kineret(阿那白滞素)、LAU-7b(fenretinide)、Lenzilumab、Leronlimab(PRO 140)、LY3127804(一种抗Ang2抗体)、Leukine(沙格司亭，一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、氯沙坦、缬沙坦和替米沙坦(血管紧张素II受体拮抗剂)、美普拉珠单抗、Metalok(LSALT肽，一种DPEP1抑制剂)、甲泼尼龙和其他皮质类固醇、MN-166(异丁司特，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)抑制剂)、MRx-4DP0004(短双歧杆菌菌株，4D Pharma)、萘莫司他(一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)、神经氨酸酶抑制剂如Tamiflu(奥司他韦)、硝唑尼特(核壳(N)蛋白抑制剂)、纳武利尤单抗、OT-101(Mateon)、Novaferon(人造干扰素)、Opaganib(yeliva)(鞘氨醇激酶-2抑制剂)、Otilimab、PD-1封闭抗体、聚乙二醇干扰素，例如聚乙二醇干扰素lambda、Pepcid(法莫替丁)、Piclidenoson(A3腺苷受体激动剂)、Prezcobix(达鲁那韦)、PUL-042(Pulmotect，Inc.、toll样受体(TLR)结合剂)、Rebif(干扰素β-1a)、RHB-107(upamostat)(丝氨酸蛋白酶抑制剂，RedHill Biopharma Ltd.)、Selinexor(核输出选择性抑制剂(SINE))、SNG001(Synairgen，吸入干扰素β-1a)、Solnatide、干细胞，包括间充质干细胞、MultiStem(Athersys)和PLX(Pluristem Therapeutics)、Sylvant(司妥昔单抗)、胸腺素、TJM2(TJ003234)、Tradipitant(神经激肽-1受体拮抗剂)、Truvada(恩曲他滨和替诺福韦)、Ultomiris(瑞武利珠单抗-cwz)、Vazegepant(CGRP受体拮抗剂或阻断剂)和Xofluza(baloxavir marboxil)。
改变用途的抗病毒药物
许多药物，包括对其他病毒有活性的药物，已经进行了抗Covid-19的评估，并发现具有活性。这些化合物中的任何一种都可以与本文所述的化合物组合。代表性的化合物包括洛匹那韦、利托那韦、氯硝柳胺、丙嗪、PNU、UC2、辛那色林(SQ 10,643)、钙咪唑(C3930)、丹宁酸、3-异茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3,3’-二没食子酸酯、甘草甜素、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺、奈非那韦、氯硝柳胺、氯喹、羟氯喹、5-苄氧基芦竹碱、利巴韦林、干扰素，例如干扰素(IFN)-α、IFN-β及其聚乙二醇化形式，以及这些化合物与利巴韦林、盐酸氯丙嗪、盐酸三氟丙嗪、吉西他滨、甲磺酸伊马替尼、达沙替尼和伊马替尼的组合。
VIII.药物组合物
感染冠状病毒科病毒或本文所述其它病毒的宿主，包括但不限于人类，可通过在药学上可接受的载体或稀释剂存在下，向患者施用有效量的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐来治疗。活性物质可以通过任意合适的途径施用，例如以液体或固体形式口服、胃肠外、静脉内、皮内、皮下或局部施用。
优选的化合物剂量范围为每天接受者体重的约0.01至约10mg/kg，更一般地，约0.1至5mg/kg，优选约0.5至约2mg/kg，直至患者康复。在一些情况下，化合物可以以高达10μM的剂量施用，如果长时间施用，这可能被认为是相对高的剂量，但是当在一种或多种本文所述病毒感染的持续时间内施用时，这是可以接受的，该持续时间通常为几天至几周的量级。
药学上可接受的盐和前药的有效剂量范围可以基于待递送的母体化合物的重量来计算。如果盐或前药本身表现出活性，则可以使用盐或前药的重量如上估算有效剂量，或通过本领域技术人员已知的其他方法估算有效剂量。
化合物可方便地以任意合适的剂型单位施用，包括但不限于每单位剂型含有7至600mg，优选70至600mg活性成分的剂型。5-400mg的口服剂量通常是方便的。
药物组合物中活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其他因素。应注意，剂量值也将随待缓解的病况的严重程度而变化。还应理解的是，对于任意特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，并非旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。活性成分可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量，以不同的时间间隔施用。
活性化合物的优选施用方式是口服。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了治疗性口服施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂合并，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。
片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任意下列成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以含有液体载体如脂肪油。另外，单位剂型可含有改变剂量单位的物理形式的各种其他物质，例如糖、虫胶或其他肠溶剂的包衣。
化合物可以作为酏剂、悬浮液、糖浆、薄片剂(wafer)、口香糖等的组分施用。除活性化合物外，糖浆还可含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂和调味剂。
化合物或其药学上可接受的前药或盐也可以与不损害所需作用的其它活性物质混合，或与补充所需作用的物质混合，例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂或其它抗病毒化合物。用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的剂，如氯化钠或右旋糖。可以将肠胃外制剂封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
如果静脉内施用，则优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
透皮制剂
在一些实施方案中，组合物以透皮制剂的形式存在，例如在FDA批准的激动剂罗替戈汀(rotigitine)透皮贴剂(Neupro贴剂)中使用的制剂。另一种合适的制剂描述于题为“Transdermal Therapeutic System for Treating Parkinsonism”的美国公开号20080050424中。该制剂包括基于硅氧烷或丙烯酸酯的粘合剂，并且可包括增加活性物质的溶解度的添加剂，其量能有效增加基质对活性物质的溶解能力。
透皮制剂可以是单相基质(matrices)，其包括背衬层、含活性物质的自粘基质和在使用前要除去的保护膜。更复杂的实施方案包括还可以含有非粘性层和控制膜的多层基质。如果使用聚丙烯酸酯粘合剂，它可以与多价金属离子如锌、钙、铝或钛离子交联，例如乙酰丙酮铝和乙酰丙酮钛。
当使用有机硅粘合剂时，它们通常是聚二甲基硅氧烷。然而，原则上可能存在其他有机残基，例如乙基或苯基，而不是甲基。因为活性化合物是胺，所以使用耐胺粘合剂可能是有利的。代表性的耐胺粘合剂描述于例如EP 0 180 377中。
代表性的基于丙烯酸酯的聚合物粘合剂包括丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮及其组合。
粘合剂必须具有适合于活性物质的溶解能力，并且活性物质必须能够在基质内移动，并且能够穿过接触表面到达皮肤。本领域技术人员可以容易地配制具有活性物质的适当透皮转运的透皮制剂。
某些药学上可接受的盐倾向于更优选用于透皮制剂，因为它们可以帮助活性物质通过角质层的屏障。实例包括脂肪酸盐，例如硬脂酸盐和油酸盐。油酸盐和硬脂酸盐是相对亲脂性的，甚至可以作为皮肤中的渗透增强剂。
也可以使用渗透增强剂。代表性的渗透增强剂包括脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪酸酰胺、甘油或其脂肪酸酯、N-甲基吡咯烷酮、萜烯如柠檬烯、α-蒎烯(pinene)、α-萜品醇、香芹酮、香芹醇、柠檬烯氧化物、蒎烯氧化物和1,8-桉叶油素。
贴剂通常可以通过将活性剂溶解或悬浮在乙醇或另一种合适的有机溶剂中，然后在搅拌下加入粘合剂溶液来制备。可以向粘合剂溶液、活性物质溶液或含活性物质的粘合剂溶液中添加另外的辅助物质。然后可以将溶液涂覆到合适的片材上，除去溶剂，将背衬层层压到基质层上，并从整个层压材料中冲出贴剂。
纳米颗粒组合物
本文所述的化合物还可以以纳米颗粒组合物的形式施用。在一个实施方案中，控释纳米颗粒制剂包含待施用的纳米颗粒活性剂和使药剂在施用后的释放延长的速率控制聚合物。在该实施方案中，组合物可在施用后释放活性剂持续约2至约24小时或多达30天或更长的时间。包含纳米颗粒形式的活性剂的代表性控释制剂描述于例如美国专利号8,293,277中。
纳米颗粒组合物可以包含本文所述活性剂的颗粒，其具有吸附在其表面上或与其表面结合的非交联表面稳定剂。
纳米颗粒的平均粒度通常小于约800nm，更通常小于约600nm，更通常小于约400nm，小于约300nm，小于约250nm，小于约100nm，或小于约50nm。在该实施方案的一个方面，当通过光散射技术测量时，至少50％的活性剂颗粒的平均粒度分别小于约800、600、400、300、250、100或50nm。
多种表面稳定剂通常与纳米颗粒组合物一起使用，以防止颗粒结块或聚集。
代表性的表面稳定剂选自由以下组成的组：明胶、卵磷脂、葡聚糖、阿拉伯树胶、胆固醇、黄蓍胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、十八十六醇、聚西托醇(cetomacrogol)乳化蜡、脱水山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸酯、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、非结晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泰洛沙泊(tyloxapol)、泊洛沙姆(poloxamer)、泊洛沙胺(poloxamine)、泊洛沙胺908、磺基琥珀酸钠二烷基酯、月桂基硫酸钠、烷基芳基聚醚磺酸酯、蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的混合物、对异壬基苯氧基聚-(缩水甘油)、SA9OHCO、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-D-麦芽糖苷、庚酰基-N-甲基葡糖酰胺、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-硫代葡萄糖苷、正己基-D-吡喃葡糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、正壬基-D-吡喃葡萄糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、正辛基-D-吡喃葡萄糖苷和辛基-D-硫代吡喃葡萄糖苷。溶菌酶也可用作纳米颗粒组合物的表面稳定剂。已知某些纳米颗粒如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-纳米颗粒在通过静脉内(IV)或皮下(SQ)给药时靶向肝脏。
可以将纳米颗粒配制到其中的代表性速率控制聚合物包括壳聚糖、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、阿拉伯树胶、琼脂、瓜尔胶、谷物胶、葡聚糖、酪蛋白、明胶、果胶、角叉菜胶、蜡、虫胶、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、聚(乙烯)氧化物、烷基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、亲水性纤维素衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸偏苯三酸纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚(甲基丙烯酸烷基酯)、聚(乙酸乙烯酯)、衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸及其各自的酯的聚合物和衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸及其各自的酯的共聚物。
制备纳米颗粒组合物的方法描述于例如美国专利号5,518,187和5,862,999，均关于“Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；美国专利号5,718,388，关于“Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；和美国专利号5,510,118关于“Process of Preparing Therapeutic Compositions ContainingNanoparticles”。
纳米颗粒组合物还描述于例如美国专利号5,298,262关于“Use of Ionic CloudPoint Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,302,401关于“Method to Reduce Particle Size Growth DuringLyophilization”；美国专利号5,318,767关于“X-Ray Contrast Compositions Useful inMedical Imaging”；美国专利号5,326,552关于“Novel Formulation ForNanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular WeightNon-ionic Surfactants”；美国专利号5,328,404关于“Method of X-Ray Imaging UsingIodinated Aromatic Propanedioates”；美国专利号5,336,507关于“Use of ChargedPhospholipids to Reduce Nanoparticle Aggregation”；美国专利号5,340,564forFormulations Comprising Olin 10-G to Prevent Particle Aggregation andIncrease Stability”；美国专利号5,346,702关于“Use of Non-Ionic Cloud PointModifiers to Minimize Nanoparticulate Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,349,957关于“Preparation and Magnetic Properties of Very SmallMagnetic-Dextran Particles”；美国专利号5,352,459关于“Use of Purified SurfaceModifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,399,363和5,494,683，均关于“Surface Modified Anticancer Nanoparticles”；美国专利号5,401,492关于“Water Insoluble Non-Magnetic Manganese Particles as MagneticResonance Enhancement Agents”；美国专利号5,429,824关于“Use of Tyloxapol asaNanoparticulate Stabilizer”；美国专利号5,447,710关于“Method for MakingNanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular WeightNon-ionic Surfactants”；美国专利号5,451,393关于“X-Ray Contrast CompositionsUseful in Medical Imaging”；美国专利号5,466,440关于“Formulations of OralGastrointestinal Diagnostic X-Ray Contrast Agents in Combination withPharmaceutically Acceptable Clays”；美国专利号5,470,583关于“Method ofPreparing Nanoparticle Compositions Containing Charged Phospholipids toReduce Aggregation”；美国专利号5,472,683关于“Nanoparticulate Diagnostic MixedCarbamic Anhydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and LymphaticSystem Imaging”；美国专利号5,500,204关于“Nanoparticulate Diagnostic Dimers asX-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,518,738关于“Nanoparticulate NSAID Formulations”；美国专利号5,521,218关于“Nanoparticulate Iododipamide Derivatives for Use as X-Ray Contrast Agents”；美国专利号5,525,328关于“Nanoparticulate Diagnostic Diatrizoxy Ester X-RayContrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,543,133关于“Process of Preparing X-Ray Contrast Compositions ContainingNanoparticles”；美国专利号5,552,160关于“Surface Modified NSAID Nanoparticles”；美国专利号5,560,931关于“Formulations of Compounds as NanoparticulateDispersions in Digestible Oils or Fatty Acids”；美国专利号5,565,188关于“Polyalkylene Block Copolymers as Surface Modifiers for Nanoparticles”；美国专利号5,569,448关于“Sulfated Non-ionic Block Copolymer Surfactant as StabilizerCoatings for Nanoparticle Compositions”；美国专利号5,571,536关于“Formulationsof Compounds as Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or FattyAcids”；美国专利号5,573,749关于“Nanoparticulate Diagnostic Mixed CarboxylicAnydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic SystemImaging”；美国专利号5,573,750关于“Diagnostic Imaging X-Ray Contrast Agents”；美国专利号5,573,783关于“Redispersible Nanoparticulate Film Matrices WithProtective Overcoats”；美国专利号5,580,579关于“Site-specific Adhesion Withinthe GI Tract Using Nanoparticles Stabilized by High Molecular Weight,LinearPoly(ethylene Oxide)Polymers”；美国专利号5,585,108关于“Formulations of OralGastrointestinal Therapeutic Agents in Combination with PharmaceuticallyAcceptable Clays”；美国专利号5,587,143关于“Butylene Oxide-Ethylene Oxide BlockCopolymers Surfactants as Stabilizer Coatings for NanoparticulateCompositions”；美国专利号5,591,456关于“Milled Naproxen with HydroxypropylCellulose as Dispersion Stabilizer”；美国专利号5,593,657关于“Novel Barium SaltFormulations Stabilized by Non-ionic and Anionic Stabilizers”；美国专利号5,622,938关于“Sugar Based Surfactant for Nanocrystals”；美国专利号5,628,981关于“Improved Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X-Ray ContrastAgents and Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents”；美国专利号5,643,552关于“Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbonic Anhydrides as X-Ray ContrastAgents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,718,388关于“Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；美国专利号5,718,919关于“Nanoparticles Containing the R(-)Enantiomer of Ibuprofen”；美国专利号5,747,001关于“Aerosols Containing Beclomethasone Nanoparticle Dispersions”；美国专利号5,834,025关于“Reduction of Intravenously Administered NanoparticulateFormulation Induced Adverse Physiological Reactions”；美国专利号6,045,829“Nanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)ProteaseInhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers”；美国专利号6,068,858关于“Methods of Making Nanocrystalline Formulations of Human ImmunodeficiencyVirus(HIV)Protease Inhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers”；美国专利号6,153,225关于“Injectable Formulations of Nanoparticulate Naproxen”；美国专利号6,165,506关于“New Solid Dose Form of Nanoparticulate Naproxen”；美国专利号6,221,400关于“Methods of Treating Mammals Using Nanocrystalline Formulations ofHuman Immunodeficiency Virus(HIV)Protease Inhibitors”；美国专利号6,264,922关于“Nebulized Aerosols Containing Nanoparticle Dispersions”；美国专利号6,267,989关于“Methods for Preventing Crystal Growth and Particle Aggregation inNanoparticle Compositions”；美国专利号6,270,806关于“Use of PEG-DerivatizedLipids as Surface Stabilizers for Nanoparticulate Compositions”；美国专利号6,316,029关于“Rapidly Disintegrating Solid Oral Dosage Form”，美国专利号6,375,986关于“Solid Dose Nanoparticulate Compositions Comprising aSynergisticCombination of a Polymeric Surface Stabilizer and Dioctyl SodiumSulfosuccinate”；美国专利号6,428,814关于“Bioadhesive nanoparticulatecompositions having cationic surface stabilizers”；美国专利号6,431,478关于“Small Scale Mill”；和美国专利号6,432,381关于“Methods for targeting drugdelivery to the upper and/or lower gastrointestinal tract”，所有这些都通过引用具体并入。此外，于2002年1月31日公开的美国专利申请号20020012675A1，关于“Controlled Release Nanoparticulate Compositions”，描述了纳米颗粒组合物，并且其通过引用具体并入。
无定形小颗粒组合物描述于例如美国专利号4,783,484关于“ParticulateComposition and Use Thereof as Antimicrobial Agent”；美国专利号4,826,689关于“Method for Making Uniformly Sized Particles from Water-Insoluble OrganicCompounds”；美国专利号4,997,454关于“Method for Making Uniformly-SizedParticles From Insoluble Compounds”；美国专利号5,741,522关于“Ultrasmall,Non-aggregated Porous Particles of Uniform Size for Entrapping Gas Bubbles Withinand Methods”；和美国专利号5,776,496，关于“Ultrasmall Porous Particles forEnhancing Ultrasound Back Scatter”。
某些纳米制剂可以通过以受控方式将药物释放到肠腔(lumen)中来增强药物的吸收，从而减少溶解性问题。肠壁旨在吸收营养物并充当病原体和大分子的屏障。小的两亲性和亲脂性分子可以通过分配到脂质双层中并通过被动扩散穿过肠上皮细胞而被吸收，而由于肠壁的内在性质，纳米制剂的吸收可能更复杂。纳米颗粒口服吸收的第一个物理障碍是覆盖肠和结肠腔表面的粘液屏障。粘液屏障包含不同的层，主要由被称为粘蛋白的高度糖基化的蛋白质组成，这些蛋白质可能会阻止某些纳米制剂的吸收。可以进行修饰以得到粘液渗透性增加的纳米制剂(Ensign等人，“Mucus penetrating nanoparticles:biophysical tool and method of drug and gene delivery,”Adv Mater 24:3887-3894(2012))。
穿过粘液层后，可以通过几个步骤来调节纳米制剂跨肠道上皮细胞的运输，包括细胞表面结合、内吞作用、细胞内运输和胞吐作用，从而实现可能涉及多个亚细胞结构的转胞吞作用(transcytosis)(跨细胞内部运输)。此外，纳米制剂还可以通过开放的紧密连接在细胞之间运输，这被定义为胞吞作用(paracytosis)。非吞噬途径包括网格蛋白(clathrin)介导的和小窝(caveolae)介导的内吞作用和巨胞饮作用，是通过口服途径吸收纳米制剂的最常见机制。
非口服施用可以提供多种益处，例如直接靶向到所需的作用部位和药物作用时间延长。已经针对纳米制剂对透皮施用进行了优化，例如固体脂质纳米颗粒(SLN)和NE，其特点是具有良好的生物相容性、较低的细胞毒性和理想的药物释放调节作用(Cappel和Kreuter,“Effect of nanoparticles on transdermal drug delivery.J Microencapsul8:369-374(1991))。鼻腔施用纳米制剂使它们能够通过内吞作用经由透粘膜途径或经由载体或受体介导的转运过程穿透鼻粘膜(Illum,“Nanoparticulate systems for nasaldelivery of drugs:a real improvement over simple systems？”J.Pharm.Sci 96:473-483(2007))，其中一个实例是鼻腔施用替扎尼定(tizanidine)的壳聚糖纳米颗粒，以提高小鼠的脑部渗透和药物功效(Patel等人,“Improved transnasal transport and brainuptake of tizanidine HCl-loaded thiolated chitosan nanoparticles foralleviation of pain,”J.Pharm.Sci 101:690-706(2012))。肺部施用可以提供较大的表面积并相对容易进入。粘液屏障、气管支气管区域中的代谢酶和肺泡中的巨噬细胞通常是药物渗透的主要屏障。颗粒大小是决定纳米制剂在支气管树中扩散的主要因素，纳米级区域中的颗粒更可能到达肺泡区域，直径在1至5μm之间的颗粒有望在细支气管中沉积(Musante等人,“Factors affecting the deposition of inhaled porous drugparticles,”J Pharm Sci 91:1590-1600(2002))。对于较大的颗粒，已经显示出吸收受限，这可能是由于无法穿过空气-血液屏障。颗粒可以逐渐释放药物，从而药物可以渗透到血流中，或者颗粒可以被肺泡巨噬细胞吞噬(Bailey和Berkland,“Nanoparticle formulationsin pulmonary drug delivery,”Med.Res.Rev.,29:196-212(2009))。
某些纳米制剂在吸收部位通过生物膜的渗透极小，对于这些纳米制剂，静脉注射施用可能是在体内获得有效分布的优选途径(Wacker,“Nanocarriers for intravenousinjection-The long hard road to the market,”Int.J.Pharm.,457:50-62.,2013)。
纳米制剂的分布可以根据所使用的递送系统、纳米制剂的特性、个体之间的变异性以及纳米制剂的药物流失率而变化很大。某些纳米颗粒，例如固体药物纳米颗粒(SDN)，能够改善药物吸收，这不需要它们完好无损地到达系统循环中。其他纳米颗粒在吸收过程中幸存，从而改变了所含药物的分布和清除率。
具有一定大小和组成的纳米制剂可以通过特征明确的过程(例如增强的渗透性和保留效应)在组织中扩散，而其他纳米制剂则在特定的细胞群中聚积，这使得一种纳米制剂可以靶向特定的器官。复杂的生物屏障可以保护器官免受外源性化合物的侵害，而血脑屏障(BBB)则是许多治疗剂的障碍。BBB中存在许多不同类型的细胞，包括内皮细胞、小胶质细胞、周细胞和星形胶质细胞，BBB表现出极为严格的紧密连接，以及高活性的外排机制，从而限制了大多数药物的渗透。通过BBB运输通常仅限于由特定转运蛋白携带的小的亲脂性分子和营养物质。调节纳米制剂向脑内扩散的最重要机制之一是通过脑毛细血管内皮细胞的内吞作用。
最近的研究已经将颗粒性质与纳米制剂的进入途径和在人类BBB内皮屏障中的加工过程相关联，表明未被包覆的纳米颗粒通过BBB的渗透有限，并且表面修饰会影响内吞作用的效率和机制(Lee等人,“Targeting rat anti-mouse transferrin receptormonoclonal antibodies through blood-brain barrier in mouse,”J.Pharmacol.Exp.Ther.292:1048-1052(2000))。因此，穿过BBB并递送本文所述的一种或多种化合物的表面修饰的纳米颗粒在本公开的范围内。
肝脏中的巨噬细胞是体内巨噬细胞总数的主要来源。肝脏中的枯否(Kupffer)细胞具有许多用于选择性吞噬被调理过的颗粒的受体(补体蛋白的受体和IgG片段可结晶部分的受体)。吞噬作用可以提供靶向巨噬细胞，并提供本文所述化合物的局部递送(即，在巨噬细胞内部的递送)的机制。(TRUE？)
与聚乙二醇(PEG)相连的纳米颗粒与受体的相互作用极小，从而抑制了单核吞噬系统的吞噬(Bazile等人,“Stealth Me.PEG-PLA nanoparticles avoid uptake by themononuclear phagocytes system,”J.Pharm.Sci.84:493-498(1995))。
代表性的纳米制剂包括无机纳米颗粒、SDN、SLN、NE、脂质体、聚合物纳米颗粒和树枝状聚合物。本文所述的化合物可以包含在纳米制剂内部，或者在无机纳米颗粒和树枝状聚合物的一些情况下，化合物附着在表面上。也可以使用包含多于一种纳米制剂类别的元素的杂合纳米制剂。
SDN是不含脂质的纳米颗粒，它可以改善口服生物利用度和水溶性差的药物的暴露性(Chan,“Nanodrug particles and nanoformulations for drug delivery,”Adv.Drug.Deliv.Rev.63:405(2011))。SDN包含药物和稳定剂，它们是使用“自上而下(top-down)”(高压均质和湿磨)或自下而上(bottom-up)(溶剂蒸发和沉淀)方法生产的。
SLN由在室温下为固体的一种或多种脂质、乳化剂和水组成。使用的脂质包括但不限于甘油三酯、偏甘油酯、脂肪酸、类固醇和蜡。SLN最适合用于递送高度亲脂性药物。
在不混溶的液体中散布的小于1000nm的液滴被分类为NE。NE既用作疏水剂的载体又用作亲水剂的载体，并且可以口服、透皮、静脉内、鼻内和眼内施用。对于慢性疗法，口服施用可能是优选的，NE可以有效增强小分子、肽和蛋白质的口服生物利用度。
聚合纳米颗粒是固体颗粒，通常大小约为200-800nm，可以包括合成和/或天然聚合物，可以任选地将其聚乙二醇化以最大程度地减少吞噬作用。与传统制剂相比，聚合纳米颗粒可以提高药物和其他物质的生物利用度。它们的清除率取决于几个因素，包括聚合物的选择(包括聚合物大小、聚合物电荷和靶向配体)，大于100nm的带正电的纳米颗粒主要通过肝脏清除(Alexis等人,Factors affecting the clearance and biodistribution ofpolymeric nanoparticles.Mol Pharm 5:505-515(2008))。
树枝状聚合物是树状的纳米结构聚合物，直径通常为10-20nm。
脂质体是包括磷脂双层的球形囊泡。可以利用多种脂质，以一定程度控制降解水平。除口服施用外，脂质体还可以通过多种方式施用，包括静脉内施用(McCaskill等人,2013)、透皮施用(Pierre和Dos Santos Miranda Costa,2011)、玻璃体内施用(Honda等人,2013)以及通过肺施用(Chattopadhyay,2013)。脂质体可以与合成聚合物结合，以形成脂质-聚合物杂合纳米颗粒，从而延伸其靶向体内特定部位的能力。脂质体包裹的药物的清除率取决于药物的释放和脂质体的破坏(吞噬细胞免疫细胞摄取脂质体、聚集、pH敏感性分解等)(Ishida等人,“Liposome clearance,”Biosci Rep 22:197-224(2002))。
这些纳米颗粒制剂中的一种或多种可以用于跨血脑屏障和适当的其他位置将本文所述的活性剂递送至巨噬细胞。
控释制剂
在一个优选的实施方案中，活性化合物与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于从体内快速消除，例如控释制剂，包括但不限于植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。例如，肠溶包衣的化合物可用于保护胃酸的裂解。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。合适的材料也可以商购获得。
脂质体悬浮液(包括但不限于用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也是优选的药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811(通过引用并入)所述。例如，脂质体制剂可以通过如下方法制备：将适当的脂质(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱(arachadoyl phosphatidyl choline)和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后蒸发无机溶剂，在容器的表面上留下干燥的脂质薄膜。然后将活性化合物的水溶液引入容器中。然后用手旋转容器以从容器的侧面释放脂质材料并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。
用于描述本发明的术语是本领域技术人员通常使用和已知的。如本文所用，以下缩写具有所指示的含义：
DMSO 二甲基亚砜
DCM 二氯甲烷
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
EtOAc(AcOEt) 乙酸乙酯
HOAc 乙酸
h 小时
hex 己烷
DIPEA 二异丙基乙胺
Liq. 液体
LCMS 液相色谱质谱
TLC 薄层色谱
M 摩尔
MeOH 甲醇
EtOH 乙醇
iPrOH 异丙醇
nBuOH 正丁醇
pTsOH 对甲苯磺酸
TMSCN 三甲基硅氰化物
TMSCl 三甲基氯硅烷
TMSOTf 三甲基硅三氟甲硅烷
Et3N 三乙胺
nBuLi 正丁基锂
min 分钟
rt或RT 室温
TBAF 四丁基氟化铵
THF 四氢呋喃
IX.制备活性化合物的一般方法
容易地制备活性化合物的方法是本领域已知的，并且是由已知方法的选择性组合得到的。本文公开的化合物可以如下文详细描述或通过本领域技术人员已知的其他方法来制备。本领域的普通技术人员将理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行细节的变化，并且决不限制本发明的范围。
本文所述的某些通式中的一些化合物是市售的。对于一些化合物，本文描述的合成是示例性的，并且可以用作制备本文描述的式的其它化合物的起点。这些化合物可以各种方式制备，包括本文所示和所述的那些合成方案。本领域技术人员将能够认识到所公开的合成方法的改进，并基于本文公开的内容设计路线；所有这些修改和替代路线都在权利要求的范围内。
各种反应方案总结如下。
方案1是核苷3的合成方法。(方案中列出的碱基和其他变量如活性化合物章节所定义)
方案2是核苷3的替代合成方法。(方案中列出的碱基和其他变量如活性化合物章节所定义)
式A的化合物可以通过首先制备核苷1来制备，这进而可以由本领域普通技术人员使用下述方法来完成：(a)Rajagopalan,P.；Boudinot,F.D；Chu,C.K.；Tennant,B.C.；Baldwin,B.H.；Antiviral Nucleosides:Chiral Synthesis and Chemotheraphy:Chu,C.K.；Eds.Elsevier:2003.b)Recent Advances in Nucleosides:Chemistry andChemotherapy:Chu,C.K.；Eds.Elsevier:2002.c)Frontiers in Nucleosides&NucleicAcids,2004,Eds.R.F.Schinazi&D.C.Liotta,IHL Press,Tucker,GA,USA,pp:319-37d)Handbook of Nucleoside Synthesis:Vorbruggen H.&Ruh-Pohlenz C.John Wiley&sons2001),以及通过一般方案1-2来完成。具体地说，核苷3可以通过在路易斯酸(如TMSOTf)存在下将糖1与受保护的、甲硅烷基化的或游离的核苷碱基偶联来制备。3’-和5’-羟基的去保护得到核苷3。
类似的式B化合物可以用类似于化合物1的化合物制备，但是在2’-位用氟而不是OPr。代表性的合成方法描述在例如美国专利号8,716,262中。
类似地，类似于化合物1的化合物，但在2’-位置具有Y取代基和/或在3’-位置具有R取代基，可用于制备类似于化合物3的核苷，但分别在2’-和/或3’-位置具有Y或R取代基。
此外，也可以制备类似的化合物，其中糖环中的氧被R5定义的其它变量之一取代。
方案1核苷3的合成方法。(碱基定义见活性化合物章节)
在本文所述的方案中，如果核苷碱基包括在偶联步骤中可能干扰或分解或转化的官能团，则可以用合适的保护基团保护这些官能团。在偶联步骤之后，被保护的官能团，如果有的话，可以被去保护。
或者，核苷3可以由1’-卤代、1’-磺酸酯或1’-羟基化合物2制备。对于1’-卤代或1’-磺酸酯的情况，在碱如三乙胺或氢化钠存在下，保护的或游离的核苷碱基随后去保护，将得到核苷3。对于1’-羟基的情况，在Mitsunobu偶联剂如偶氮二羧酸二异丙酯的存在下，保护的或游离的核苷碱基随后去保护，将得到核苷3。
类似的式B化合物可以用类似于化合物1的化合物制备，但是在2’-位用氟而不是OPr。代表性的合成方法描述在例如美国专利号8,716,262中。
方案2核苷3的替代合成方法。(碱基、R1、R1B、R2、R3如活性化合物章节所定义)
类似地，类似于化合物2的化合物，但在2’-位置具有Y取代基和/或在3’-位置具有R取代基，可用于制备类似于化合物3的核苷，但分别在2’-和/或3’-位置具有Y或R取代基。
此外，也可以制备类似的化合物，其中糖环中的氧被R5定义的其它变量之一取代。
在本文所述的方案中，如果核苷碱基包括在反应步骤中可能干扰或分解或转化的官能团，则可以用可以被除去的合适的保护基团保护这些官能团。被保护的官能团，如果有的话，可以在以后去保护。
在从碱基：制备C-核苷的情况下，可以使用WO09132123、WO09132135、WO2011150288和WO2011035250中概述的方法。
在从其他碱基制备C-核苷的情况下，可以使用概述于Temburnikar K,Seley-Radtke KL.Recent advances in synthetic approaches for medicinal chemistry ofC-nucleosides.Beilstein J Org Chem.2018；14:772-785的方法。
在碳环核苷的情况下，可以使用下列参考文献中概述的方法：
-Advances in the enantioselective synthesis of carbocyclicnucleosides,Chem.Soc.Rev.,2013,42,5056
-The latest progress in the synthesis of carbocyclic nucleosides".Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids.2000,19(3):651-690
-New progresses in the enantioselective synthesis and biologicalproperties of carbocyclic nucleosides".Mini Reviews in Medicinal Chemistry2003,3(2):95-114.
-Chemical synthesis of carbocyclic analogues of nucleosides".ChemicalSynthesis of Nucleoside Analogues.Hoboken:John Wiley&Sons.2003pp.535-604
Dioxolane nucleoside analags can be prepared by adapting thechemistry outlined in J.Org.Chem.1995,60,6,1546-1553.
掺入氘：
预期在核苷抗病毒剂的糖部分的代谢位点用氘单次或多次置换氢(碳-氢键变为碳-氘键)会减慢代谢速率。这可以提供相对较长的半衰期，以及较慢的从身体清除的速率。预计治疗性核苷的缓慢代谢会为治疗候选物增加额外的优势，而其他物理或生化特性不会受到影响。细胞内水解或氘交换可以导致氧化氘(D2O)的释放。
将氘掺入到氨基酸、酚、糖和碱基中的方法是本领域技术人员众所周知的。代表性方法公开于美国专利号9,045,521。
已经开发了多种酶和化学方法用于糖和核苷阶段的氘掺入，以提供高水平的氘掺入(D/H比)。氘交换的酶方法通常具有低水平的掺入。由于分离氘代单核苷酸块需要繁琐的分离技术，酶掺入具有进一步的复杂性。Schmidt等人,Ann.Chem.1974,1856；Schmidt等人,Chem.Ber.,1968,101,590描述了由2’,3’-O-异亚丙基腺苷-5’-羧酸或由甲基-2,3-异亚丙基-β-D-呋喃核糖苷酸制备的5’,5’-2H2-腺苷的合成，Dupre,M.和Gaudemer,A.,Tetrahedron Lett.1978,2783。Kintanar等人,Am.Chem.Soc.1998,110,6367报道了用硼氘代钠或氘代锂铝(98原子％2H掺入)还原适当的5’-醛，可以得到5’-氘代腺苷和5’(R/S)-氘代胸腺嘧啶的非对映异构体混合物。Berger等人,Nucleoside&Nucleotides 1987,6,395描述了通过在2H2O/吡啶混合物(1:1)中加热醛，然后用NaBD4还原醛，将2’脱氧鸟苷的5’-醛衍生物转化为5’或4’-氘-2’-脱氧鸟苷。
Ajmera等人,Labelled Compd.1986,23,963描述了获得4’-氘标记的尿苷和胸苷(98原子％2H)的步骤。Sinhababu等人,J.Am.Chem.Soc.1985,107,7628)证明了在糖合成过程中，在使用硼氘代钠将1,2:5,6-二-O-异亚丙基-β-D-己呋喃-3-酮糖立体选择性还原为1,2:5,6-二-O-异亚丙基-3-氘-β-D-核糖己呋喃糖并随后进一步进行核苷合成时，在腺苷的C3’(97原子％2H)的氘掺入。Robins等人,Org.Chem.1990,55,410报道了在乙酸中用硼氘代钠还原2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(TB DMS)3-酮核苷时，在腺苷的C3’超过95％原子2H掺入的合成，具有几乎完全的立体选择性。David,S.和Eustache,J.,Carbohyd.Res.1971,16,46和David,S.和Eustache,J.,Carbohyd.Res.1971,20,319描述了2’-脱氧-2’(S)-氘代-尿苷和胞苷的合成。通过使用1-甲基-2-脱氧-2’-(S)-氘代呋喃核糖苷进行合成。
Radatus等人,J.Am.Chem.Soc.1971,93,3086描述了合成2’-单氘代(R或S)-2’-脱氧胞苷的化学步骤。这些结构是从选择性2-单氘-2-脱氧-D-核糖合成的，所述选择性2-单氘-2-脱氧-D-核糖是通过用氘代锂铝立体选择性还原2,3-脱氢-己吡喃糖并氧化所得的糖链而获得的。Wong等人J.Am.Chem.Soc.1978,100,3548报道了通过涉及烯酮二硫缩醛衍生物的形成和LiAlD4还原的反应序列，从D-阿拉伯糖获得脱氧-1-氘-D-赤-戊糖、2-脱氧-2(S)-氘-D-赤-戊糖和2-脱氧-1,2(S)-二氘-D-赤-戊糖。
Pathak等人J.,Tetrahedron 1986,42,5427)报道了通过用LiAlD4还原打开适当的甲基2,3-脱水-β-D-核糖或β-D-lyxofuranosides，所有八种2'或2'-氘-2'-脱氧核苷的立体特异性合成。Wu等人J.Tetrahedron 1987,43,2355描述了所有2′,2″-二脱氧核苷(脱氧核苷和核糖核苷)的合成，从糖的C2’氧化开始，随后用NaBD4或LiAlD4还原，接着用氘代三丁基锡脱氧。Roy等人J.Am.Chem.Soc.1986,108,1675报道了2’,2’-双脱氧-2’-脱氧鸟苷和胸苷可以使用2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶在2H2O中从2-脱氧核糖5-磷酸酯制备，实现约90原子％的氘代。类似地，可以进行4’,5’,5’-2H3-鸟苷的合成。
因此，很明显，糖残基的每个位置都可以被选择性标记。
开发了一种有用的立体特异性氘代的替代方法来合成多氘代糖。该方法使用氘代兰尼镍催化剂在2H2O中在含羟基碳(即含羟基碳的亚甲基和次甲基质子)上用氘交换氢。
有多种技术可以用来合成完全氘化的脱氧核糖核苷和核糖核苷。因此，在一种方法中，氘代兰尼镍-2H2O与糖的交换反应，制备了许多在2’、3’和4’位置特异性标记的氘代核苷。该步骤由以下组成：通过兰尼镍-2H2O交换反应在甲基β-D-阿拉伯吡喃糖苷的2’、3’和4’位置氘代，随后通过氘代三丁基锡还原消除‘2-羟基，得到甲基β-D-2’,2’,3’,4’-2H4-2-脱氧吡喃核糖苷，将其转化为甲基β-D-2’,2’,3’,4’-2H4-2’-脱氧呋喃核糖苷并糖基化，得到各种2’,2’,3’,4’-2H4-核苷(对于H3'&H4’,2H掺入>97原子％。
例如，在Hoyer,H.(1950),Synthese des pan-Deutero-o-nitro-phenols.Chem.Ber.,83:131-136中描述了氘代酚的合成。这种化学方法可以适用于制备带有氘标记的取代苯酚。氘代酚及其取代类似物可用于例如制备氨基磷酸酯前药中的苯氧基。
氘代氨基酸的合成描述于，例如，Matthews等人,Biochimica et BiophysicaActa(BBA)-General Subjects,Volume 497,Issue 1,29March 1977,Pages 1-13。这些和类似的技术可用于制备氘代氨基酸，氘代氨基酸可用于制备本文所述核苷的氨基磷酸酯前药。
合成本文所述化合物的氘代类似物的一种方法包括合成4’-炔基取代的氘代呋喃核糖核苷；和将核碱基连接到氘代呋喃核糖核苷上以形成氘代核苷。前药，如氨基磷酸酯前药，可以通过修饰核苷上的5’-OH基团来形成。当使用氘代酚和/或氘代氨基酸时，可以制备氘代氨基磷酸酯前药。
另一种方法涉及合成具有4’-炔基取代的呋喃核糖核苷，并连接氘代核碱基以形成氘代核苷。该方法可以任选地使用氘代呋喃糖苷进行，以提供额外的氘代。与上述方法一样，核苷可以转化成前药形式，该前药形式可以任选地包括其他氘代。
第三种方法涉及合成具有4’-炔基取代的呋喃核糖核苷，连接核碱基形成核苷，并在氨基磷酸酯合成中使用氘代氨基酸或苯酚类似物中之一或两者将核苷转化为氨基磷酸酯前药。
因此，使用上述技术，可以在本文所述核苷化合物的糖、碱基和/或前药部分提供一个或多个氘原子。
具体实施例
根据以下实施例和反应顺序制备具体的代表性化合物；描述反应顺序的实施例和图表是以举例说明的方式提供的，以帮助理解本发明，并且不应该被解释为以任何方式限制在随后的权利要求中阐述的本发明。本发明化合物也可用作后续实施例中的中间体，以生产本文所述的其它化合物。没有必要尝试优化任何反应中获得的产率。本领域技术人员将知道如何通过反应时间、温度、溶剂和/或试剂的常规变化来增加这种产率。
无水溶剂购自Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee，WI)和EMDChemicals Inc.(Gibbstown，NJ)。试剂从商业来源购买。除非另有说明，实施例中使用的材料是从容易获得的商业供应商处获得的，或者是通过化学合成领域技术人员已知的标准方法合成的。熔点(mp)是在电热数字熔点仪上测定的，未经校正。在室温下在Varian UnityPlus 400光谱仪上获得1H和13C NMR光谱，并以内部四甲基硅烷的ppm低场场记录。进行氘交换、去耦实验或2D-COSY来确认质子分配。信号多重性用s(单峰)、d(双峰)、dd(双峰的双峰)、t(三峰)、q(四峰)、br(宽峰)、bs(宽单峰)、m(多峰)来表示。所有J值都以Hz为单位。使用电喷雾技术在Micromass平台LC光谱仪上测定质谱。元素分析由Atlantic MicrolabInc.(Norcross，GA)进行。在Whatman LK6F硅胶板上进行分析型TLC，在Whatman PK5F硅胶板上进行制备型TLC。在硅胶上或通过反相高效液相色谱进行柱色谱。
实施例1
以下所示的技术可用于制备本文所述的其它化合物。
实验
方案3.化合物25的合成
2-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1,2,4-三嗪
-3,5(2H,4H)-二酮(23)：
化合物22(10.5g，根据J.Org.Chem.1974,3654-3660中描述的化学方法制备)在饱和NH3/MeOH(250mL)中的混合物在室温下搅拌3天。在减压下除去挥发物后，残余物通过快速色谱法(0-20％MeOH的二氯甲烷溶液)纯化，得到23(3.5g，76％)。1H NMR(CD3OD):7.44(s,1H),6.08(d,J＝3.2Hz,1H),4.42(dd,J＝5.2Hz,J＝3.2Hz,1H),4.24(t,J＝5.6Hz,1H),3.96(m,1H),3.73(dd,J＝12.0Hz,J＝3.6Hz,1H),3.60(dd,J＝12.0Hz,J＝5.6Hz,1H)；13CNMR(CD3OD):158.27,149.97,137.36,91.71,85.87,74.42,71.91,63.43；LCMS:246(M+1)+。
2-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-5-甲氧基-1,2,4-三嗪
-3(2H)-酮(25)：
在0℃下，向23(123mg，0.5mmol，1eq)在乙腈(5毫升)中的搅拌悬浮液中滴加三乙胺(1.05mL，7.5mmol，15eq)和三甲基氯硅烷(0.32毫升，2.5毫摩尔，5eq)。移开冷却浴，将反应混合物在室温下搅拌2小时。然后将反应混合物冷却至0℃，滴加POCl3(145uL)。将反应混合物搅拌15min，加入1,2,4-三唑(345mg，5mmol，10eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后倒入pH 7.4的缓冲溶液(20mL)中。用DCM(3×30mL)萃取混合物。合并的有机相用硫酸钠干燥。在减压下除去挥发物后，将残余物溶解在MeOH/HOAc(4:1，5mL)中并搅拌过夜。除去挥发性物质后，残余物通过使用0-10％甲醇的DCM溶液的柱纯化，得到产物3(70.6mg，54％)。LCMS:282(M+Na+).1H NMR(CD3OD):7.80(s,1H),6.20(d,J＝3.2Hz,1H),4.43(dd,J＝5.2Hz,J＝3.2Hz,1H),4.28(t,J＝5.6Hz,1H),4.03-4.00(m,1H),4.01(s,3H),3.75(dd,J＝8.0Hz,J＝3.6Hz,1H),3.62(dd,J＝12.4Hz,J＝5.6Hz,1H)；13C NMR(CD3OD):166.70,155.93,130.25,93.29,86.11,74.83,71.93,63.43,55.68。
方案4.化合物38a-b和39a-b合成：a)Boc2O，DMAP，Et3N，MS，THF，rt，4h。b)NaBH4，MeOH，0℃，4h。c)H2O，回流，24h。d)H2，Pd-C，MeOH，rt，5h。e)N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺，DIPEA，n-BuOH，160℃，24h。f)Ac2O，DMAP，Et3N，MS，DCM，rt，24h。g)亚硝酸戊酯，TMSCl，MS，DCM，0-5℃，1h。h)Bu2SnO，甲苯，回流，16h。i)t-BuMgCl，L-丙氨酸，N-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧膦基]-,1-甲基乙酯，MS，THF，0℃至rt，过夜。
((1S,4R)-4-氨基环戊-2-烯-1-基)甲醇(35a)根据J.Am.Chem.Soc.2005,127,
24,8846-8855中报道的步骤制备。
将文斯内酰胺33(1当量)、二碳酸二叔丁酯(1.2当量)、DMAP(0.1当量)和Et3N(1.2当量)在THF(0.5M)中的混合物在室温下搅拌4小时，然后蒸发。将残余物溶解在AcOEt中，用1M HCl洗涤，然后用5％NaHCO3的溶液和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物通过硅胶快速色谱纯化(己烷/AcOEt-1:0至85:25)，得到纯NBoc中间体，为白色固体(92％)。将该化合物溶解在甲醇(0.3M)中，冷却至0℃。在1小时内将NaBH4(4当量)分6份加入，在0℃下搅拌反应物30min，然后在室温下搅拌4小时。蒸发挥发物，残余物在水和AcOEt(2:3)之间分配。水相用AcOEt萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。所得白色固体在水(0.25M)中回流24小时。真空下除去水，得到所需化合物(4)，为棕色油状物。
((1R,3S)-3-氨基环戊基)甲醇(35b)根据J.Am.Chem.Soc.2005,127,24,8846-
8855中报道的步骤制备。
将35a(1当量)和10％Pd-C(0.04当量)在甲醇(0.115M)中的混合物在室温下于大气压H2下搅拌4小时。在硅藻土垫上滤出Pd-C，用MeOH洗涤，蒸发合并的滤液，得到35b，为浅棕色油状物(定量产率)。
((1S,4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)环戊-2-烯-1-基)乙酸甲酯(36a)和((1R,3S)-3-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)环戊基)乙酸甲酯(36b)。
在密封容器中，向化合物35a或35b的溶液(1当量)在正丁醇(0.3M)中的溶液中，加入DIPEA(4当量)和N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺(1.5当量)。混合物在130℃下加热24小时。蒸发挥发物，粗产物用硅胶快速色谱法纯化(DCM/MeOH-1:0至95:5)。将所得化合物悬浮在DCM(0.1M)和DMAP(0.2当量)中，在室温下加入Et3N(2当量)和Ac2O(1.1当量)。将澄清溶液在室温下搅拌24小时，然后在真空下除去挥发物。残余物溶解在饱和NaHCO3溶液中，用AcOEt萃取三次。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。使用硅胶快速色谱法(DCM/MeOH-1:0至95:5)纯化残余物，得到化合物(6a、b)。
(36a).(48％，经过2步)。1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.00(d,J＝1.3Hz,1H,H8),6.26-6.19(m,3H,NH2,H2’),6.06(dq,J＝5.6,1.9Hz,1H,H3’),5.64(dddd,J＝9.0,5.9,3.5,1.8Hz,1H,H1’),4.21(dd,J＝6.1,1.2Hz,2H,H5’),3.24(ddt,J＝8.1,5.9,3.4Hz,1H,H4’),2.93-2.77(m,1H,H6’a),2.05(s,3H,C-CH3),1.83(dtd,J＝13.7,6.0,1.2Hz,1H,H6’b).13C NMR(101MHz,丙酮-d6)δ171.0(C＝O),160.6(Cquat),154.8(Cquat),151.0(Cquat),141.6(C8),138.1(C2’),131.0(C3’),125.7(Cquat),67.0(C5’),60.4(C1’),45.3(C4’),35.0(C6’),20.7(CO-CH3).HRMS-ESI(m/z)C13H14ClN5O2的[M+H]+计算值：307.0836，实测值：307.0902。
(36b).(50％，经过2步)。1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.13(s,1H,H8),6.20(bs,2H,NH2),4.88(dq,J＝9.8,8.1Hz,1H,H1’),4.22-4.03(m,2H,H5’),2.58-2.40(m,2H,H4’,H2’a),2.36-2.10(m,2H,H3’),2.05(s,3H,C-CH3),2.08-1.89(m,2H,H2’b,H6’a),1.88-1.75(m,1H,H6’b).13C NMR(101MHz,丙酮-d6)δ171.1(C＝O),160.5(Cquat),155.0(Cquat),151.0(Cquat),142.2(C8),125.9(Cquat),68.1(C5’),56.4(C1’),37.9(C4’),36.0(C2’),31.5(C3’),27.6(C6’),20.7(CO-CH3).HRMS-ESI(m/z)C13H16ClN5O2的[M+H]+计算值：309.0993，实测值：309.1063。
((1S,4R)-4-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)环戊-2-烯-1-基)乙酸甲酯(37a)和((1R,3S)-3-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)环戊基)乙酸甲酯(37b)。
将亚硝酸戊酯(6当量)在DCM(0.47M)中溶液冷却至0℃。随后滴加TMSCl(3当量)，随后加入(36a，b)在(1当量)的DCM(0.47M)中的溶液。将混合物在0至5℃之间搅拌1小时，然后用饱和Na2SO3溶液淬灭。用DCM萃取水层三次。用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过快速色谱法(Hex/AcOEt-2:8至8:2)纯化，得到化合物(7a、b)。
(37a).(74％).1H NMR(400Mhz,丙酮-d6)δ8.51(s,1H,H8),6.27(dt,J＝5.7,2.1Hz,1H,H2’),6.10(dt,J＝5.6,2.2Hz,1H,H3’),5.82(ddq,J＝9.9,6.0,2.1Hz,1H,H1’),4.16(dq,J＝11.0,5.8,5.4Hz,2H,H5’),3.26(tddd,J＝8.1,5.9,4.1,2.2Hz,1H,H4’),2.94(dt,J＝14.0,8.7Hz,1H,H6’a),2.00(s,3H,C-CH3),1.90(dt,J＝14.1,5.9Hz,1H,H6’b).13CNMR(101MHz,Acetone-d6)δ171.0(C＝O),154.3(Cquat),152.4(Cquat),151.1(Cquat),140.6(C8),139.1(C2’),132.2(Cquat),130.2(C3’),66.9(C5’),61.6(C1’),45.5(C4’),35.1(C6’),20.7(CO-CH3).HRMS-ESI(m/z)C13H12Cl2N4O2的[M+H]+计算值：326.0337，实测值：326.0408。
(37b).(76％).1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.70(s,1H,H8),5.22-5.00(m,1H,H1’),4.23-4.07(m,2H,H5’),2.65-2.47(m,2H,H4’,H2’a),2.40(dddd,J＝14.0,7.9,6.2,1.4Hz,1H,H3’a),2.35-2.23(m,1H,H3’b),2.05(s,3H,C-CH3),2.09-1.94(m,2H,H2’b,H6’a),1.93-1.78(m,1H,H6’b).13C NMR(101MHz,丙酮-d6)δ171.0(C＝O),154.5(Cquat),152.3(Cquat),151.2(Cquat),147.0(C8),132.2(Cquat),67.9(C5’),57.3(C1’),37.9(C4’),36.3(C2’),31.7(C3’),27.5(C6’),20.7(CO-CH3).HRMS-ESI(m/z)C13H14Cl2N4O2的[M+H]+计算值：328.0494，实测值：328.0565。Rf:0.4(DCM/MeOH 95:5).
((1S,4R)-4-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)环戊-2-烯-1-基)甲醇(38a)和((1R,3S)-3-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)环戊基)甲醇(38b)。
将37a、b(1当量)和Bu2SnO(3当量)在甲苯(0.0075M)中的混合物回流16-18小时，然后真空除去溶剂。残余物通过快速色谱法(Hex/AcOEt-1:9至0:1)纯化，得到化合物8a、b。
(38a).(70％).1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.57(s,1H,H8),6.26(dt,J＝5.7,2.1Hz,1H,H2’),5.97(dt,J＝5.6,2.2Hz,1H,H3’),5.77(ddq,J＝9.2,5.6,2.0Hz,1H,H1’),3.69-3.55(m,2H,H5’),3.11-2.99(m,1H,H4’),2.85(dt,J＝14.1,8.9Hz,1H,H6’a),1.81(dt,J＝14.1,5.4Hz,1H,H6’b).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ154.34(Cquat),153.55(Cquat),151.66(Cquat),147.55(C8),140.99(C2’),131.89(Cquat),129.71(C3’),65.06(C5’),62.33(C1’),49.28(C4’),35.10(C6’).HRMS-ESI(m/z)C11H10Cl2N4O的[M+H]+计算值：284.0232，实测值：284.0304。
(38b).(42％).1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.11(s,1H,H8),5.44(dq,J＝9.6,7.9Hz,1H,H1’),4.07(dd,J＝6.3,4.4Hz,2H,H5’),2.97-2.87(d,J＝12.6Hz,1H,H2’a),2.83-2.71(m,2H,H4’,H3’a),2.68-2.53(m,1H,H3’b),2.47-2.12(m,3H,H2’b,H6’a,H6’b).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ154.6(Cquat),153.4(Cquat),151.7(Cquat),147.7(C8),132.0(Cquat),66.4(C5’),58.3(C1’),41.5(C4’),36.4(C2’),32.2(C3’),27.6(C6’).HRMS-ESI(m/z)C11H12Cl2N4O的[M+H]+计算值：
286.0388，实测值：286.0460。
((((1S,4R)-4-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)环戊-2-烯-1-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(39a)和((((1R,3S)-3-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)环戊基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(39b)。
在惰性气氛下，化合物38a、b(1当量)溶解在MS无水THF(0.26M)中。将反应混合物冷却至0℃并逐滴加入t-BuMgCl(在THF中1.7M，3.1当量)。将反应物在0℃下搅拌30min，然后在室温下搅拌30min。将(S)-2-[-(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰氨基]丙酸异丙酯(2.5当量)溶解在THF(0.5M)中，在0℃下逐滴加入前述溶液中。在该温度下30min后，将反应升温至室温，搅拌过夜。然后在真空下除去挥发物，残留物用饱和NaHCO3溶液稀释。水层用AcOEt萃取3次。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过快速色谱法(Hex/AcOEt-1:1至0:1)纯化，得到化合物39a、b。
(39a).(31％).1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ(8.50(s,1H,H8),7.33(dd,J＝8.7,7.1Hz,2H,Harom),7.29-7.20(m,2H,Harom),7.14(tq,J＝7.7,1.1Hz,1H,Harom),6.29-6.18(m,1H,H2’),6.09(dt,J＝5.7,2.2Hz,1H,H3’),5.81(ddq,J＝9.9,6.0,2.1Hz,1H,H1’),4.92(p,J＝6.2Hz,1H,O-CH),4.84-4.74(m,1H,NH),4.23-4.11(m,2H,H5’),4.01-3.85(m,1H,N-CH),3.34-3.24(m,1H,H4’),2.91(dt,J＝14.1,8.8Hz,1H,H6’a),2.80(t,J＝1.1Hz,1H,NH),1.99-1.80(m,1H,H6’b),1.32(dd,J＝7.1,0.9Hz,3H,CH-CH3),1.19(dd,J＝6.2,1.7Hz,6H,2xCH-CH3).13C NMR(101MHz,Acetone-d6)δ173.5(C＝O),154.3(Cquat),152.4(Cquat),152.2Cquat),151.1(Cquat),146.7(C8),138.8(C2’),132.1(Cquat),130.5(C3’),130.3(2x Carom),125.2(Carom),121.1(2x Carom),69.5-68.3(m,C5’,O-CH),61.5(C1’),51.2(NH-CH),46.8(C4’),34.71(C6’),21.9(2x C-CH3),21,8(C-CH3).31P NMR(162MHz,丙酮-d6)δ2.78.HRMS-ESI(m/z)C23H26Cl2N5O5P的[M+H]+计算值：553.1049，实测值：553.1124。
(39b).(48％).1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.63(s,1H,H8),7.34(dd,J＝8.7,7.0Hz,2H,Harom),7.33-7.23(m,2H,Harom),7.20-7.10(m,1H,Harom),5.05(d,J＝8.1Hz,1H,H1’),4.98-4.90(m,1H,O-CH),4.92-4.77(m,1H,NH),4.14(qt,J＝10.2,6.4Hz,2H,H5’),4.01-3.87(m,1H,NH-CH),2.64-2.42(m,2H,H4’,H2’a),2.36(dtd,J＝13.4,7.8,5.5Hz,1H,H3’a),2.20(dtd,J＝12.9,9.0,7.4Hz,1H,H3’b),2.00-1.93(m,2H,H2’b,H6’a),1.92-1.79(m,1H,H6’a),1.39-1.26(m,3H,CH-CH3),1.26-1.14(m,6H,2x CH-CH3).13C NMR(101MHz,丙酮-d6)δ173.6(C＝O),154.5(Cquat),152.3(Cquat),152.3(Cquat),151.1(Cquat),146.9(C8),132.1(Cquat),130.3(2x Carom),125.2(Carom),121.2(2x Carom),70.0(C5’),69.0(O-CH),57.2(C1’),51.2(NH-CH),39.0(C4’),35.9(C2’),31.8(C3’),27.0(C6’),21.9(2x C-CH3),21.8(C-CH3).31P NMR(162MHz,丙酮-d6)δ2.66.HRMS-ESI(m/z)C23H28Cl2N5O5P的[M+H]+计算值：555.1205，实测值：555.1281。
方案5.化合物50和53的合成。
(2R,3R,4R,5R)-5-((苯甲酰氧基)甲基)-2-(3,5-二氧代-4,5-二氢-1,2,4-三嗪
-2(3H)-基)-3-甲基四氢呋喃-3,4-二基二苯甲酸酯(49)：
将6-氮杂尿嘧啶(565mg，5mmol)悬浮在微波小瓶中的乙腈(5mL)中，并加入BSA(4.5mL)。悬浮液在微波辐射下在120℃加热30min。将溶液冷却至室温，加入化合物48(580mg，1mmol)，然后加入TMSOTf(1mL)。将小瓶在120℃的微波辐射下加热30min。将反应混合物缓慢加入饱和NaHCO3水溶液(50mL)中，搅拌15min。然后用乙酸乙酯(60mL)稀释混合物，通过硅藻土垫过滤，分离有机层。用乙酸乙酯(2×40mL)萃取水层。用盐水(50mL)洗涤合并的有机层，在减压下浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱纯化，用己烷-EtOAc(4:1至1:1)洗脱，得到514mg产物(90％)，为黄色泡沫。1H-NMR(CDCl3):δ8.68(s,1H),8.14-8.11(m,4H),8.02-8.00(m,2H),7.64-7.34(m,10H),7.11(s,1H),6.03-6.01(d,1H),4.78-4.73(m,2H),4.55-4.51(m,1H),1.77(s,3H)。
2-((2R,3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)-1,2,4-三嗪
-3,5(2H,4H)-二酮(50):
向49(240mg，0.42mmol)在甲醇(4mL)中的混合物中加入浓NH4OH(5mL)。混合物在RT下搅拌过夜。蒸发挥发物，残余物通过硅胶快速色谱纯化，用CH2Cl2-MeOH(9:1至4:1)洗脱，得到86mg(79％)产物，为白色泡沫。1H-NMR(DMSO-d6):δ7.54(s,1H),5.96(s,1H),5.04(s,br,2H),4.57(s,br,1H),3.84-3.48(m,4H),1.04(s,3H)。
2-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羟甲基)-2,2,3a-三甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1,2,4-三嗪-3,5(2H,4H)-二酮(51)：
向50(140mg，0.54mmol)在无水丙酮(5mL)中的混合物中加入2,2-二甲氧基丙烷(0.66mL，5.4mmol)和p-TsOH-H2O(124mg，0.65mmol)。混合物在RT下搅拌24小时。用Et3N(2mL)淬灭反应，蒸发溶剂。残余物通过硅胶快速色谱纯化，用CH2Cl2-MeOH(9:1)洗脱，得到145mg(90％)产物，为白色粉末。1H-NMR(CD3OD):δ7.49(s,1H),6.36(s,1H),4.42-4.41(d,1H),4.25-4.21(m,1H),3.76-3.66(m,2H),1.53,1.45,1.35(3s,9H)。
((S)-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(3,5-二氧代-4,5-二氢-1,2,4-三嗪-2(3H)-基)-2,2,6a-三甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(52)：
向0℃下搅拌的51(132mg，0.44mmol)在THF(2mL)中的混合物中滴加t-BuMgCl(在THF中1.0M，0.92mL，0.92mmol)，并将混合物在0℃下搅拌30min。将混合物升温至RT，并在RT下再搅拌30min。然后将混合物冷却至0℃，逐滴加入{(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰氨基]丙酸异丙酯}(240mg，0.53mmol)在THF(1mL)中的溶液。加入后，使反应混合物升温至RT，并在RT下搅拌过夜。用MeOH(0.5mL)淬灭反应。蒸发溶剂，残余物通过硅胶快速色谱纯化，用CH2Cl2-MeOH(95:5至9:1)洗脱，得到120mg(48％)产物。1H-NMR(CD3OD):δ7.49(s,1H),7.37-7.33(m,2H),7.24-7.16(m,3H),6.35(d,1H),4.98-4.93(m,1H),4.38-4.20(m,3H),3.89-3.76(m,2H),1.51(s,3H),1.45(s,3H),1.34-1.31(m,6H),1.22(t,6H)。
((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(3,5-二氧代-4,5-二氢-1,2,4-三嗪-2(3H)-基)-3,4-二羟基
-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(53)：
将52(100mg，0.18mmol)在甲酸(2mL)和水(0.5mL)中的悬浮液在RT下搅拌6小时。蒸发溶剂，残余物通过硅胶快速色谱纯化，用CH2Cl2-MeOH(9:1)洗脱，得到30mg(32％)产物，为白色泡沫和22mg(22％)原料。1H-NMR(CD3OD):δ7.45(s,1H),7.38-7.34(m,2H),7.25-7.17(m,3H),6.18(s,1H),4.98-4.93(m,1H),4.33-4.29(m,2H),4.18-4.14(m,1H),4.03-4.01(d,1H),3.93-3.87(m,1H),1.33(d,3H),1.23(t,6H),1.19(s,3H).HRMS C21H30N4O10P(M+H+)计算值：529.1700，实测值：529.1685。
方案6化合物57和58的合成：试剂和条件：a)MeOH，Pd2(dba)3，Xantphos，Cs2CO3，甲苯，60℃，3hr，93％；b)Pd2(dba)3，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)，异丁酰胺，Cs2CO3甲苯，110℃，过夜，4％；c)甲醇钠，甲醇，rt-50℃，5hrs，4的两步产率为60％；d)叔丁基MgCl，THF，rt，过夜，25-82％。
根据以下文献中描述的化学方法制备化合物54：
(1)Sznaidman,M.；Painter,G.R.；Almond,M.R.；Cleary,D.G.；Pesyan,A.,Methods to manufacture 1,3-dioxolane nucleosides and their chiral enzymicresolution.PCT Int.Appl.2005,WO2005074654,98pp.
(2))Sznaidman,M.L.；Du,J.；Pesyan,A.；Cleary,D.G.；Hurley,P.K.；Waligora,F.；Almond,M.R.Synthesis of(-)-DAPD.Nucleosides,Nucleotides Nucleic Acids2004,23,1875-1887
((2R,4R)-4-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲基异丁酸酯(54)：
1H NMR(CDCl3,400MHz):8.53(s,1H),6.56(d,J＝4.4Hz,1H),5.35(t,J＝2.8Hz,1H),4.59-4.33(m,4H),2.64-2.57(m,1H),1.19(d,J＝6.8Hz,3H),1.14(d,J＝6.8Hz,3H).LRMS(ESI)：C13H14Cl2N4O4(M+Na)+的m/z计算值：383.03，实测值382.9。
((2R,4R)-4-(2-氯-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲基异丁酸酯(55)：
在氮气下，向54(0.9g，2.49mmol)、Xantphos(112mg，0.19mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(65mg，0.07mmol)、碳酸铯(1.15g，3.52mmol)在甲苯(12mL)中的悬浮液中加入甲醇(0.11mL，2.7mmol)。将反应混合物在60℃下加热3hr，过滤，用乙酸乙酯洗涤，浓缩，并通过使用乙酸乙酯:己烷＝2:1的快速色谱法纯化，获得55(820mg，93％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):8.26(s,1H),6.48-6.49(q,J＝0.8Hz,J＝4.8Hz,1H),5.27-5.28(t,J＝2.8Hz,1H),4.46-4.49(dd,J＝0.8Hz,J＝10.0Hz,1H),4.37-4.41(dd,J＝2.8Hz,J＝12.8Hz,1H),4.29-4.33(dd,J＝3.2Hz,J＝12.8Hz,1H),4.24-4.28(dd,J＝5.2Hz,J＝10.0Hz,1H),4.17(s,3H),2.54-2.61(m,1H),1.13-1.15(d,J＝6.8Hz,3H),1.09-1.10(d,J＝6.8Hz,3H).LRMS(ESI)：C14H18ClN4O5(M+H)+的m/z计算值：357.09，实测值356.88。((2R,4R)-4-(2-异丁酰胺基-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲基异丁酸酯(56)：
将55(112mg，0.31mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(6.5mg，0.007mmol)、xantphos(11.2mg，0.019mmol)、碳酸铯(115mg，0.35mmol)和异丁酰胺(33.5mg，0.38mmol)在甲苯(2mL)中的悬浮液在110℃下加热12h，然后通过硅藻土过滤，真空浓缩并通过快速色谱法纯化得到56(94mg，74％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):8.11(s,1H),8.10(brs,1H),6.42-6.43(d,J＝4.0Hz,1H),5.24-5.25(t,J＝2.8Hz,1H),4.47-4.50(dd,J＝1.2Hz,J＝10.0Hz,1H),4.312-4.319(d,J＝2.8Hz,2H),4.21-4.25(dd,J＝5.6Hz,J＝10.0Hz,1H),4.07(s,3H),3.10(brs,1H),2.50-2.57(m,1H),1.22-1.24(2d,J＝0.8Hz,6H),1.05-1.12(2d,J＝7.2Hz,6H).LRMS(ESI)：C18H26N5O6(M+H)+的m/z计算值：408.18，实测值407.98。((2R,4R)-4-(2-氨基-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲醇(57)：
向56(4.98mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入甲醇钠(25％，3mL)。溶液在室温下搅拌5h，然后加热至50℃保持30min。真空蒸发后，残余物通过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝60:3)得到57(800mg，60％)。1H NMR(CDCl3,400MHz):8.12(s,1H),6.30(dd,J＝1.6Hz,J＝5.6Hz,1H),5.08(t,J＝2.8Hz,1H),4.46(dd,J＝1.6Hz,J＝10.0Hz,1H),4.21(dd,J＝5.2Hz,J＝9.6Hz,1H),3.75(t,J＝2.0Hz,2H).LRMS(ESI)：C10H14N5O4(M+H)+的m/z计算值：268.10，实测值268.04。((((2R,4R)-4-(2-氨基-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸乙酯(58)：
向57(50mg，0.18mmol)在THF(3mL)中的溶液中加入叔丁基氯化镁(0.54mL，在THF中1M，0.54mmol)。将反应混合物在rt下搅拌30min，然后加入相应的氯化磷酰胺(0.54mL，在THF中1M，0.54mmol)。将反应混合物搅拌过夜，用饱和氯化铵(1mL)淬灭，并通过柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝100:1至100:5)直接纯化，得到所需化合物。
方案7化合物59的合成：试剂和条件：a)n-Bu2SnO，甲苯，130℃，过夜，65％。
((2R,4R)-4-(2,6-二氯-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲醇(59)：
将二氯嘌呤54(3g，8.30mmol)和二丁基锡(IV)氧化物(6g，24.1mmol)在甲苯(50mL)中的悬浮液加热至130℃过夜。在真空下蒸发挥发物后，残余物通过柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝100:1至100:10)直接纯化，得到59(65％)。1H NMR(CD3OD,400MHz):8.90(s,1H),6.57(d,J＝5.0Hz,1H),5.17(t,J＝2.0Hz,1H),4.65(d,J＝10.1Hz,1H),4.35-4.31(dd,J＝5.0Hz,J＝10.1Hz,1H),3.86-3.77(m,2H).LRMS(ESI)：C9H8Cl2N4O3(M+Na)+的m/z计算值：312.99，实测值312.9。
方案8:化合物60和61的合成:试剂和条件：a)NH3/CH3OH，CH3OH，rt，2天，对于2为25％，对于3为63％。
((2R,4R)-4-(2-氯-6-甲氧基-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲醇(60)和((2R,4R)-4-(6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)-1,3-二氧戊环-2-基)甲醇(61)：
将54(1g，2.76mmol)在NH3/CH3OH(10mL)中的溶液在室温下搅拌2天。挥发物蒸发后，残余物用快速色谱法(二氯甲烷:甲醇＝100:1至100:10)纯化，得到60(35％)和61(63％)。(60)：
1H NMR(CD3OD,400MHz):8.61(s,1H),6.51-6.49(dd,J＝0.8Hz,J＝4.8Hz,1H),5.15(t,J＝2.4Hz,1H),4.59-4.56(dd,J＝0.8Hz,J＝10.0Hz,1H),4.33-4.29(dd,J＝5.2Hz,J＝10.0Hz,1H),4.16(s,3H),3.84-3.80(m,2H).LRMS(ESI)：C10H11ClN4O4(M+Na)+的m/z计算值：309.04，实测值309.0。
(61)：1H NMR(CD3OD,400MHz):8.42(s,1H),6.41-6.40(dd,J＝4.4Hz,1H),5.13(d,J＝2.4Hz,1H),4.52-4.49(d,J＝10.0Hz,1H),4.30-4.26(dd,J＝5.2Hz,J＝10.0Hz,1H),3.83-3.75(m,2H).LRMS(ESI)：C9H10ClN5O3(M+Na)+的m/z计算值：294.03，实测值294.0。
方案9:化合物66的合成
按照WO2019090111 A1和Tetrahedron,2002,58,9593合成3'Me糖64。按照Bioorg.Med.Chem.2008,16,6319和Biochemistry 1992,31,45,11210-11215合成3’Me-脲苷66。
1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-4-甲基-四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮66，为白色泡沫(66％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.19(d,1H,J＝8.1Hz),6.05(d,1H,J＝7.8Hz),5.73(d,1H,J＝8.0Hz),4.05(d,1H,J＝7.8Hz),3.95(t,1H,J＝2.2Hz),3.80-3.68(m,2H),1.38(s,3H).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ164.7,151.5,141.9,101.5,87.8 87.2,77.5 76.6,60.8,18.7.HRMS-ESI C10H15N2O6的(m/z)[M+H]+计算值：259.0852，实测值：259.0930。
方案10:化合物68的合成
(2R,3S,4R,5R)-5-(4-苯甲酰胺基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2-((苯甲酰氧基)甲基)-3-甲基四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯67：在乙腈(12mL)中将4-N-苯甲酰基-胞嘧啶(1.49g，4,8mmol，1.2当量)和N,O-双三甲基甲硅烷基乙酰胺(1.9mL，8.00mmol，2当量)在55℃下加热，直到观察到澄清的溶液。然后加入(3R,4S,5R)-5-((苯甲酰氧基)甲基)-4-甲基四氢呋喃-2,3,4-三乙酸三酯64(1.58g，4mmol，1当量)并将混合物冷却至0℃。逐滴加入三氟甲基磺酸三甲基硅烷酯(2.2mL，12mmol，3当量)，混合物在室温下搅拌6h。然后将反应混合物倒入饱和NH4Cl(100mL)中，用二氯甲烷(3×50mL)萃取。合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩至干燥。粗产物通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯100/0至0/100)纯化，得到标题化合物(210mg，10％)，为白色泡沫。1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.20-8.11(m,3H),8.11-8.06(m,2H),7.72-7.60(m,2H),7.55(q,4H,J＝7.5Hz),7.29(s,1H),6.26(d,1H,J＝6.9Hz),5.57(d,1H,J＝7.0Hz),4.94(dd,1H,J＝5.3,3.9Hz),4.82-4.64(m,2H),2.14(s,3H),2.09(s,3H),1.77(s,3H).13C NMR(101MHz,丙酮-d6)δ170.5,170.4,166.4,163.7,145.2,134.3,133.7,130.6,130.33,129.6,12.4,129.1,87.7,84.5,82.2,78.9,64.3,21.8,20.5,17.9。
4-氨基-1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-4-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2(1H)-酮68向化合物67(0.21g,mmol,当量)在甲醇(8ml)中鼓泡通入NH3(g)。将反应物在室温下搅拌24小时，然后蒸发并通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇100/0至85/15)纯化，得到标题化合物(88.8mg，85％)，为白色泡沫。1H NMR(400Mhz,甲醇-d4)δ8.03(d,1H,J＝7.5Hz),5.95(d,1H,J＝7.5Hz),5.89(d,1H,J＝7.5Hz),4.07(d,1H,J＝7.5Hz),3.93(t,1H,J＝2.9Hz),3.77-3.60(m,2H),1.34(s,3H).13C NMR(101Mhz,甲醇Methanol-d4)δ166.1,157.6,142.7,94.9,89.4,87.8,78.0,76.7,60.9,47.3,47.1,46.9,18.8.HRMS-ESIC10H16N3O5的(m/z)[M+H]+计算值：258.1012，实测值：258.1089。
方案11:化合物71的合成
方案12:化合物74的合成
(1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2,6a-三甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮69在室温下将66(55mg，0.21mmol,1当量)在丙酮(4.2ml)中的溶液中加入二甲氧基丙烷(0.11ml，0.84mmol，4当量)和浓硫酸(0.002ml，0.042mmol，0.2当量)。将所得反应混合物搅拌3小时。然后，加入碳酸钠，过滤所得混合物，并在真空下除去挥发物。残余物通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇，100/0至90/10)纯化，得到标题化合物(50.1mg，80％)，为白色泡沫。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.79(d,1H,J＝8.0Hz),5.86(d,1H,J＝2.1Hz),5.73(d,1H,J＝8.0Hz),4.53(d,1H,J＝2.1Hz),4.12-3.10(m,1H),3.82-3.70(m,2H),1.55(s,3H),1.48(s,3H),1.41(s,3H).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ164.7,150.5,141.3,114.0,99.6,90.2,89.9,87.7,87.3,58.3,27.1,26.2,17.3.HRMS-ESI C13H19N2O6的(m/z)[M+H]+计算值：299.1195，实测值：299.1244。
((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基-3-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯71在惰性气氛下，将化合物31(0.21g，0.7mmol，1当量)溶于无水THF(2.7ml，0.26M)中，用分子筛。将混合物冷却至0℃，逐滴加入t-BuMgCl(THF中1M，2.18ml，2.18mmol，3.1当量)。将反应物在0℃下静置30min，然后在室温下静置30min。然后将反应物冷却至0℃，加入{(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰氨基]丙酸异丙酯}70(0.48g，1.05mmol，1.5当量)在无水THF(2.1ml，0.5M)中的溶液。反应在室温下搅拌过夜，反应完成后，在0℃下逐滴加入HCl(12M，20当量)。混合物在室温下搅拌7h。加入氨的甲醇(10ml)溶液后，在真空下除去挥发物。所得残余物通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇，100/0至90/10)纯化，得到标题化合物(111mg，经过2步30％)，为白色泡沫。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)11.37(s,1H),7.69(d,1H,J＝8.1Hz),7.38(t,2H,J＝7.8Hz),7.26-7.15(m,3H),6.09(dd,1H,J＝12.9,10.0Hz),5.86(d,1H,J＝8.0Hz),5.56(d,1H,J＝8.1Hz),5.50(d,1H,J＝6.3Hz),5.00(s,1H),4.86(p,1H,J＝6.3Hz),4.14(dt,1H,J＝10.2,4.8Hz),4.05(dt,1H,J＝10.9,4.7Hz),3.96(d,1H,J＝4.4Hz),3.86-3.74(m,2H),1.22(d,J＝7.0Hz,3H),1.19-1.12(m,9H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.5,162.9,151.0,150.6,140.7,129.6,124.6,120.1,102.1,85.6,84.5,75.7,75.6,68.0,65.5,49.7,21.4,21.3,19.8.31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ3.68。
((((3aS,4R,6R，6aR)-6-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2,2,3a-三甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯72在惰性气氛下，将异亚丙基衍生物69(0.21g，0.7mmol，1当量)溶于无水THF(2.7ml，0.26M)中，用分子筛。将混合物冷却至0℃，逐滴加入t-BuMgCl(THF中1M，2.18ml，2.18mmol，3.1当量)。将反应物在0℃下静置30min，然后在室温下静置30min。将{(S)-2-[(S)-(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰氨基]丙酸异丙酯}70(0.48g，1.05mmol，1.5当量)在无水THF(2.1ml,0.5M)中的溶液滴加到反应物中。在室温下搅拌过夜后，用饱和NaHCO3(25ml)稀释反应物，并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。合并有机层，用盐水(20mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩至干燥。残余物通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇，100/0至90/10)纯化，得到标题化合物(300mg，77％)，为白色泡沫。1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ10.15(s,1H),7.68(d,1H,J＝8.1Hz),7.41-7.33(m,2H),7.29(dt,2H,J＝7.6,1.3Hz),7.18(ddq,1H,J＝8.6,7.6,1.1Hz),5.87(d,1H,J＝2.2Hz),5.63(dq,1H,J＝8.1,1.0Hz),4.95(hept,1H,J＝6.3Hz,),4.85(s,1H),4.65(d,1H,J＝2.2Hz),4.38-4.23(m,1H),4.27-4.18(m,2H),3.94(tq,1H,J＝9.8,7.1Hz),1.52(d,6H,J＝3.8Hz),1.38(s,3H),1.34(dd,3H,J＝7.1,0.9Hz),1.20(dd,6H,J＝6.2,1.8Hz).13C NMR(101MHz,Acetone-d6)183.2,173.1,161.8,160.7,151.5,140.0,135.1,130.9,124.7,112.6,100.9,100.0,97.8,96.0,78.8,74.97,60.8,37.9,37.0,31.5,30.4,29.3.31P NMR(162MHz,丙酮-d6)δ2.95.HRMS-ESI C25H35N3O10P的(m/z)[M+H]+计算值：568.1982，实测值：568.2072。
((((3aS,4R,6R，6aR)-6-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2,2,3a-三甲基四氢呋喃并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯73在0℃下，向1,2,4-三唑(750mg，10.85mmol，31当量)在乙腈(20ml，0.088M)中的溶液中加入Et3N(1.65mL，11.69mmol，33.4当量)和磷酰氯(0.17mL，1.82mmol，5.2当量)。将混合物在0℃下搅拌3小时，然后加入72(200mg，0.8mmol，1当量)在ACN(4.5ml，0.35M)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后用乙酸乙酯(100ml)稀释反应物，过滤，用饱和NaHCO3(20ml)和盐水(20ml)洗涤。真空浓缩有机层，残余物通过快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯，100/0至20/80)纯化，得到所需的三唑中间体。在室温下，向该中间体在1,4-二噁烷(3mL)中的溶液中加入氨水(0.5mL)。将所得反应混合物搅拌2.5小时，然后在真空下蒸发挥发物。残余物通过快速色谱法(二氯甲烷/甲醇，100/0至90/10)纯化，得到标题化合物(42.1mg，经过2步22％)，为白色泡沫。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.70(d,1H,J＝7.5Hz),7.35(t,2H,J＝7.8Hz),7.28-7.22(m,2H),7.19(t,1H,J＝7.4Hz),5.89(d,1H,J＝7.5Hz),5.82(d,1H,J＝1.8Hz),4.96(h,1H,J＝6.2Hz),4.47(d,1H,J＝1.9H),4.28(dddd,3H,J＝24.9,12.1,6.6,3.5Hz),3.89(dq,1H,J＝9.6,7.1Hz),1.52(s,3H),1.43(s,3H),1.37(s,3H),1.33(d,3H,J＝7.1Hz),1.21(d,6H,J＝6.3Hz).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ173.0,166.4,156.4,150.7,141.6,129.3,124.8,120.1,120.0,114.1,94.8,91.2,90.0,86.9,85.5,85.4,68.7,64.8,50.2,26.9,25.8,20.5,19.0,18.2.31P NMR(162MHz,甲醇-d4)δ3.71。
((2R,3R,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基-3-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯74将化合物73(43mg，0.076mmol，1当量)溶于甲醇(2ml)中并在0℃下逐滴加入HCl(12M，0.3ml)。混合物在室温下搅拌5h，然后加入氨在甲醇(10ml)中的饱和溶液。真空除去挥发物，残余物用快速色谱法(二氯甲烷/甲醇，100/0至85/15)纯化，得到标题化合物(17.4毫克，45％)，为白色泡沫。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.68(d,1H,J＝7.6Hz),7.27(dd,2H,J＝8.8,7.2Hz),7.19-7.07(m,3H),5.92(d,1H,J＝7.3Hz),5.82-5.70(m,1H),4.86(p,1H,J＝6.3Hz,),4.28-4.08(m,2H),4.04 -4.00(m,1H),3.82-373(m,2H),1.26-1.17(m,6H),1.12(dd,J＝6.2,2.2Hz,6H).).13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ172.8,166.0,157.7,150.6,150.5,141.3,129.6,129.5,124.9,120.0,95.4,88.3,85.1,78.2,76.3,68.8,65.8,50.3,20.5,20.4,19.2,18.9.31P NMR(162MHz,Methanol-d4)δ3.59。
实施例2
细胞毒性测定
如前所述，在Vero、人PBM、CEM(人淋巴母细胞)、MT-2和HepG2细胞中评估了化合物的毒性(参见Schinazi R.F.,Sommadossi J.-P.,Saalmann V.,Cannon D.L.,Xie M.-Y.,Hart G.C.,Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990,34,1061-67)。包括环己酰亚胺作为阳性细胞毒性对照，并且包括未处理的暴露于溶剂的细胞作为阴性对照。使用先前描述的中值有效方法从浓度-反应曲线获得细胞毒性IC50(参见Chou T.-C.&Talalay P.Adv.Enzyme Regul.1984,22,27-55；Belen’kii M.S.&SchinaziR.F.Antiviral Res.1994,25,1-11)。
实施例3
HepG2细胞中的线粒体毒性测定：
i)化合物对细胞生长和乳酸生产的影响：对HepG2细胞生长的影响可通过在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM药物存在下孵育细胞来确定。可将细胞(每孔5×104个)接种到最低基本必需培养基中的12孔细胞培养簇中，该最低基本必需培养基含有非必需氨基酸，补充了10％胎牛血清、1％丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素，并在37℃下孵育4天。在孵育期结束时，可以使用血细胞计数器确定细胞数量。也由Pan-Zhou X-R,Cui L,Zhou X-J,Sommadossi J-P,Darley-Usmer VM."Differential effects of antiretroviralnucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells,"Antimicrob.Agents Chemother.2000；44:496-503所述。
为了测量化合物对乳酸产生的影响，可以稀释来自储备培养物的HepG2细胞，并以2.5×104细胞/孔的密度铺在12孔培养板中。可以加入各种浓度(0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM)的化合物，并且可以在37℃下在湿润的5％CO2气氛中孵育4天。在第4天，可以确定每个孔中的细胞数量并收集培养基。然后过滤培养基，使用比色乳酸测定法(Sigma-Aldrich)测定培养基中的乳酸含量。由于乳酸产物可被认为是线粒体功能受损的标志物，在测试化合物存在下生长的细胞中检测到的乳酸产生水平升高表明了药物诱导的细胞毒性效应。
ii)化合物对线粒体DNA合成的影响：已经开发了精确定量线粒体DNA含量的实时PCR测定法(参见Stuyver LJ,Lostia S,Adams M,Mathew JS,Pai BS,Grier J,TharnishPM,Choi Y,Chong Y,Choo H,Chu CK,Otto MJ,Schinazi RF.Antiviral activities andcellular toxicities of modified2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidineanalogs.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46:3854-60)。该分析可用于本申请中描述的所有研究，以确定化合物对线粒体DNA含量的影响。在该测定中，将低传代次数的HepG2细胞以5,000细胞/孔接种在胶原涂布的96孔板中。向培养基中加入测试化合物，以获得0μM、0.1μM、10μM和100μM的最终浓度。在培养第7天，可以通过使用市售的柱(RNeasy 96试剂盒；Qiagen)制备细胞核酸。这些试剂盒共同纯化RNA和DNA，因此，总核酸从柱上洗脱。线粒体细胞色素c氧化酶亚基II(COXII)基因和β-肌动蛋白或rRNA基因可以使用多重Q-PCR方案从5μl洗脱的核酸中扩增，所述多重Q-PCR方案使用合适的引物和探针用于靶标和参比扩增。对于COXII，可以分别使用以下有义、探针和反义引物：5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3'、5'-四氯-6-羧基荧光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3’和5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'。对于β-肌动蛋白基因(GenBank登录号E01094)的外显子3，有义、探针和反义引物分别是5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'、5'-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3'和5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。rRNA基因的引物和探针可从Applied Biosystems购得。由于所有基因都获得了相同的扩增效率，相当的CT方法可用于研究线粒体DNA合成的潜在抑制。相当的CT方法使用算术公式，其中靶标(COXII基因)的量被标准化为内源参比(β-肌动蛋白或rRNA基因)的量，并与校准品(在第7天没有药物的对照)相关。该方法的算术公式由2-ΔΔCT给出，其中ΔΔCT为(平均靶标测试样品的CT-靶标对照的CT)-(平均参比测试的CT-参比对照的CT)(参见Johnson MR,K Wang,JB Smith,MJ Heslin,RB Diasio.Quantitationof dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reversetranscription polymerase chain reaction.Anal.Biochem.2000；278:175-184)。在药物存在下生长的细胞中线粒体DNA含量的减少表明线粒体毒性。
实施例4
线粒体毒性-Glu/Gal
方案概要
将HepG2细胞铺在96或384孔组织培养聚苯乙烯板上。24hr后，给细胞施用一定浓度范围的测试化合物，并在补充有半乳糖或葡萄糖的培养基中孵育72hr。如果在含半乳糖的培养基中生长的细胞比在含葡萄糖的培养基中生长的细胞对测试化合物更敏感，则测试化合物据说会引起线粒体毒性。
目的：以测量在含有半乳糖或葡萄糖的培养基中生长的HepG2细胞对测试化合物的敏感性。
实验步骤
将HepG2人肝细胞癌细胞铺在含有半乳糖或葡萄糖的96或384孔组织培养聚苯乙烯板上，并孵育过夜，所述板含有补充有10％胎牛血清和抗生素的培养基。向细胞施用浓度增加的测试化合物(最终DMSO浓度为0.5％；对于八点剂量反应曲线，典型的最终测试化合物浓度为100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03μM；每个浓度n＝3次重复)并将细胞孵育72hr。适当的对照同时用作质量对照。使用Hoechst染色和通过HCS读数器进行细胞计数来测量细胞活力。
实施例5
Neuro2A细胞中的线粒体毒性测定：
为了估计本文所述化合物引起神经元毒性的可能性，小鼠Neuro2A细胞(美国典型培养物保藏中心131)可用作模型系统(参见Ray AS,Hernandez-Santiago BI,Mathew JS,Murakami E,Bozeman C,Xie MY,Dutschman GE,Gullen E,Yang Z,Hurwitz S,Cheng YC,Chu CK,McClure H,Schinazi RF,Anderson KS.Mechanism of anti-humanimmunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropylamino-2’,3’-didehydro-2’,3’-dideoxyguanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2005,49,1994-2001)。抑制细胞生长50％所需的浓度(CC50)可以使用基于3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料的测定法来测量，如所述。如上所述，可以在确定的药物浓度下进行细胞乳酸和线粒体DNA水平的扰动。ddC和AZT可用作对照核苷类似物。
实施例6
骨髓细胞毒性测定
原代人骨髓单核细胞可以从Cambrex Bioscience(Walkersville，MD)商业获得。在50单位/mL人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子存在下，使用双层软琼脂进行CFU-GM测定，而BFU-E测定使用含有1单位/mL红细胞生成素的乙基纤维素基质(参见Sommadossi JP,Carlisle R.Toxicity of 3’-azido-3’-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells invitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31:452-454；Sommadossi,JP,Schinazi,RF,Chu,CK,and Xie,MY.Comparison of cytotoxicity of the(-)and(+)enantiomer of 2’,3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bone marrow progenitorcells.Biochem.Pharmacol.1992；44:1921-1925)。每个实验可以在来自三个不同供体的细胞中重复进行。AZT用作阳性对照。可以在化合物存在下，在37℃和5％CO2下孵育细胞14-18天，并且可以使用倒置显微镜对大于50个细胞的集落进行计数，以确定IC50。50％抑制浓度(IC50)可以通过药物浓度的对数对BFU-E存活分数的最小二乘线性回归分析获得。可以用独立非配对样本的学生t检验进行统计学分析。
实施例7
体外人类线粒体RNA聚合酶(POLRMT)测定
使用POLRMT(INDIGO Biosciences)的体外RNA核苷酸掺入测定可以如前所述进行(Arnold等人,2012)。简而言之，32P放射性标记的RNA引物(5’-UUUUGCCGCGCC)可以与3摩尔过量的合适的DNA模板(5’-GGGAATGCANGGCGCGGC，其中N位可以被A、T或C替代)杂交。125nM的POLRMT可以与500nM的5’-放射性标记的RNA/DNA杂交体、10mM MgCl2和100μM的相应核苷三磷酸一起孵育。对于非核苷类似物，100μM的抑制剂可以与100μM UTP同时加入。掺入可以在30℃下进行2h，通过加入10mM EDTA和甲酰胺来终止反应。在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上观察样品。可以通过将每个核苷三磷酸类似物的产物分数标准化为相应的天然核苷三磷酸的产物分数来分析数据。
实施例8
核苷酸类似物对DNA聚合酶和线粒体DNA聚合酶γ核酸外切酶活性的影响
i)人聚合酶γ的纯化：聚合酶γ的重组大小亚基可以如前所述纯化(参见GravesSW,Johnson AA,Johnson KA.Expression,purification,and initial kineticcharacterization of the large subunit of the human mitochondrial DNApolymerase.Biochemistry.1998,37,6050-8；Johnson AA,Tsai Y,Graves SW,JohnsonKA.Human mitochondrial DNApolymerase holoenzyme:reconstitution andcharacterization.Biochemistry 2000；39:1702-8)。蛋白质浓度可以在280nm下用分光光度法测定，聚合酶γ的大小亚基的消光系数分别为234,420和71,894M-1cm-1。
ii)核苷酸掺入的动力学分析：可以进行预稳态动力学分析，以确定DNA聚合酶γ对核苷-TP和天然dNTP底物的掺入催化效率(k/K)。这允许确定这种酶掺入修饰的类似物和预测毒性的相对能力。DNA聚合酶γ掺入核苷酸类似物的稳态前(Pre-steady-state)动力学分析基本上如前所述进行(参见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,AndersonKS.Investigating the effects of stereochemistry on incorporation and removalof 5-fluorocytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma:comparisonofD-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004,62,57-64；Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationship betweenantiviral activity and host toxicity:comparison of the incorporationefficiencies of2’,3’-dideoxy-5-fluoro-3’-thiacytidine-triphosphate analogs byhuman immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004,48,1300-6)。简而言之，可以将聚合酶γ的大(250nM)和小(1.25mM)亚基和60nM DNA模板/引物在50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.8中的预孵育混合物加入到含有MgCl2(2.5mM)和各种浓度核苷酸类似物的溶液中。如前所述，可以淬灭反应并进行分析。数据可以符合上述相同的方程。
iii)人聚合酶γ3’5’核酸外切酶活性的测定：人聚合酶γ核酸外切酶的活性可以通过在没有dNTP的情况下测量切割产物的形成速率来研究。可以通过将MgCl2(2.5mM)加入到聚合酶γ大亚基(40nM)、小亚基(270nM)和1,500nM链终止的模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl、pH 7.8中的预孵育混合物中来引发反应，并在指定的时间点用0.3M EDTA淬灭。所有反应混合物将在20％变性聚丙烯酰胺测序凝胶(8M尿素)上分析，在Bio-Rad GS-525分子成像系统上成像，并用Molecular Analyst(Bio-Rad)定量。从早期时间点形成的产物将作为时间的函数作图。数据将通过线性回归与Sigma Plot(Jandel Scientific)拟合。线的斜率可以除以反应中的活性酶浓度，以计算核酸外切酶活性的kexo(参见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistryon incorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrialDNApolymerase gamma:comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004；62:57-64；Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationship between antiviral activity and host toxicity:comparison of the incorporation efficiencies of 2’,3’-dideoxy-5-fluoro-3’-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type1reverse transcriptase and human mitochondrial DNA polymerase.AntimicrobAgents Chemother.2004；48:1300-6)。
实施例9
NTP对人DNA聚合酶的抑制作用
研究目的
确定核苷三磷酸类似物是否抑制人DNA聚合酶α、β和γ，并计算IC50值。
材料和方法
人DNA聚合酶α-酶可从Chimerx(cat#1075)购买，并根据他们的建议进行测定，但需做一些修改。用无机焦磷酸酶(Sigma)处理2’-甲基-UTP以除去任何焦磷酸污染。500μM终浓度的2’-甲基UTP可与1mM DTT、50mM Tris、50mM NaCl、6mM MgCl2和1单位焦磷酸酶一起在37℃下孵育1小时，然后在95℃下灭活10分钟。0.05单位的人DNA聚合酶α和与48nt DNA模板(5’-CAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAG C)退火的5’末端放射性标记的24nt DNA引物(5’-TCAGGTCCCTGTTCGGGCGCCACT)的混合物可以与浓度从0到100μM递增的化合物在60mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM乙酸镁、0.3mg/ml牛血清白蛋白、1mM二硫苏糖醇、0.1mM精胺、0.05mM的dCTP、dGTP、dTTP、dATP，在最终反应体积20μl、37℃下混合5min(所有浓度代表混合后的最终浓度)。通过与0.3M(最终)EDTA混合可以终止反应。产物在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在Bio-Rad Molecular Imager FX上定量。实验的结果可以符合剂量反应方程，(y min+((y max)-(y min)))/(1+(化合物浓度)/IC50)^斜率)，以使用GraphpadPrism或SynergySoftware Kaleidagraph确定IC50值。数据可以标准化为对照。
人DNA聚合酶β-酶可从Chimerx(cat#1077)购买，并根据他们的建议进行测定，但需做一些修改。0.1单位的人DNA聚合酶β和与48nt DNA模板(5’-CAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGC)退火的5’末端放射性标记的24nt DNA引物(5’-TCAGGTCCCTGTTCGGGCGCCACT)的混合物可以与浓度从0到100μM递增的化合物在50mM Tris-HCl(pH 8.7)、10mM KCl、10mM MgCl2、0.4mg/ml牛血清白蛋白、1mM二硫苏糖醇、15％(v/v)甘油和0.05mM的dCTP、dGTP、dTTP、dATP，在最终反应体积20μl、37℃下混合5min(所有浓度代表混合后的最终浓度)。通过与0.3M(最终)EDTA混合可以终止反应。产物可以在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在Bio-Rad Molecular Imager FX上定量。实验的结果可以符合剂量反应方程，(y min+((y max)-(y min)))/(1+(化合物浓度)/IC50)^斜率)，以使用GraphpadPrism或SynergySoftware Kaleidagraph确定IC50值。数据可以标准化为对照。
人DNA聚合酶γ-酶可从Chimerx(cat#1076)购买，并根据他们的建议进行测定，但需做一些修改。0.625单位的人DNA聚合酶γ和与36nt DNA模板(5’-TCTCTAGAAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGC)退火的5’末端放射性标记的24nt DNA引物(5’-TCAGGTCCCTGTTCGGGCGCCACT)的混合物可以与浓度从0到100μM递增的化合物在50mM Tris-HCl(pH 7.8)、100mM NaCl、5mM MgCl2和0.05mM的dCTP、dGTP、dTTP、dATP，在最终反应体积20μl、37℃下混合200min(所有浓度代表混合后的最终浓度)。通过与0.3M(最终)EDTA混合可以终止反应。产物可以在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在Bio-Rad Molecular ImagerFX上定量。实验的结果可以符合剂量反应方程，(y min+((y max)-(y min)))/(1+(化合物浓度)/IC50)^斜率)，以使用Graphpad Prism或SynergySoftware Kaleidograph确定IC50值。数据可以标准化为对照。
实施例10
HepG2细胞的细胞药理学
HepG2细胞从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得，并在225cm2组织培养瓶中在补充有非必需氨基酸、1％青霉素-链霉素的最低必需培养基中生长。培养基每三天更新一次，细胞每周传代培养一次。将粘附的单层暴露于30mL胰蛋白酶-EDTA 10分钟并用培养基连续洗涤三次后，将融合的HepG2细胞以每孔2.5×106个细胞的密度接种于6孔板中，并暴露于10μM[3H]标记的活性化合物(500dpm/pmol)保持特定的时间段。
细胞保持在37℃和5％的CO2气氛下。在选定的时间点，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞三次。
通过在-20℃下用60％甲醇孵育细胞沉淀过夜，然后在冰浴中用另外20pal甲醇提取1小时，提取细胞内活性化合物及其相应的代谢物。然后合并提取物，在温和的过滤气流下干燥，并在-20℃下储存，直至HPLC分析。
实施例11
PBM细胞的细胞药理学
在37℃下，将测试化合物在50μΜ的PBM细胞中孵育4小时。然后除去含有药物的培养基，并用PBS洗涤PBM细胞两次，以除去细胞外药物。使用1mL 70％冰冷甲醇(含有10nM内标ddATP)从10×106PBM细胞中提取细胞内药物。沉淀后，样品在室温下保持15min，然后涡旋30秒，然后在-20℃下储存12h。然后将上清液蒸发至干燥。在-20℃下储存干燥样品，直至进行LC-MS/MS分析。在分析之前，每个样品在100μL流动相A中重构，并以20,000g离心以去除不溶性颗粒。
在Hypersil GOLD柱(100x 1.0mm，3μm颗粒尺寸；Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)上进行梯度分离。流动相A由2mM磷酸铵和3mM己胺组成。乙腈在15min内从10％增加到80％，并在80％保持3min。在10％乙腈中平衡持续15min。
总运行时间为33min。流速保持在50μL/min，并使用10μL注射液。自动进样器和柱室通常分别保持在4.5和30℃。
分析的前3.5min被转移到废液中。质谱仪在正离子模式下操作，喷雾电压为3.2kV。
实施例12
基孔肯雅病毒抗病毒活性测定
评估本文所述化合物抗基孔肯雅病毒(一种代表性的披膜病毒科病毒)的功效的方法显示于例如Ehteshami,M.,Tao,S.,Zandi,K.,Hsiao,H.M.,Jiang,Y.,Hammond,E.,Amblard,F.,Russell,O.O.,Mertis,A.,and Schinazi,R.F.:Characterization ofβ-D-N4-hydroxycytidine as a novel inhibitor of chikungunya virus.Antimirob AgentsChemother,2017Apr；61(4):e02395-16。
抗基孔肯雅病毒活性也可以如“Anti-Chikungunya Viral Activities ofAplysiatoxin-Related Compounds from the Marine Cyanobacterium Trichodesmiumerythraeum”Gupta,D.K.；Kaur,P.；Leong,S.T.；Tan,L.T.；Prinsep,M.R.；Chu,J J.H.MarDrugs.Jan 2014；12(1):115-127；10.3390/md12010115和其中引用的参考文献中所述进行评估。
实施例13
测定化合物抗马雅罗病毒感染的功效:
用于确定本文所述化合物抗马雅罗病毒(另一种代表性披膜病毒科病毒)功效的代表性测定法公开于Cavalheiro等人,“Macrophages as target cells for Mayarovirus infection:involvement of reactive oxygen species in the inflammatoryresponse during virus replication,”Anais da Academia Brasileira de Ciências(2016)88(3):1485-1499,(Annals of the Brazilian Academy of Sciences)。
步骤总结如下。
细胞培养和病毒增殖
RAW 264.7(一种小鼠白血病巨噬细胞系)和J774(一种小鼠网状组织肉瘤细胞系)可以在37℃、含5％CO2的加湿培养箱中在补充有10％胎牛血清(FBS；Invitrogen LifeTechnologies)的RPMI-1640培养基(LGC)中保持。小鼠腹腔巨噬细胞可以通过腹腔注射1mL无菌的3％乙硫醇酸盐从C57Bl/6动物中获得。96小时后，可采集腹膜巨噬细胞，用RPMI洗涤，并以1,500rpm离心5分钟。然后，可以将巨噬细胞以2×106细胞/孔的密度铺在含有补充有10％FBS的RPMI-1640的6孔板中，并在37℃、5％CO2下一起孵育。24小时后，可在分析前用RPMI洗涤平板以除去非粘附细胞。
MAYV(ATCC VR 66，菌株TR 4675)和SINV(AR339)可以在生长于补充有10％的FBS的α-最低必需培养基(α-MEM；Invitrogen Life Technologies)的BHK-21细胞中增殖。可以以0.1的感染复数(MOI)感染细胞。SINV在16h后，MAYV在30h后，可采集培养基，并通过以2,000×g离心10min除去细胞碎片，可以在-80℃下储存上清液。可通过BHK-21细胞中的噬菌斑测定来确定病毒原液滴度。
巨噬细胞感染测定
细胞可与MAYV或SINV一起在MOI为1(对于RAW 264.7和J774)或5(对于原代腹膜巨噬细胞)的条件下，在37℃、5％CO2中孵育1h。然后，可以除去含有未吸附病毒的培养基，可以用无血清培养基洗涤细胞，并在补充有5％FBS的RPMI中在37℃、5％CO2下培养。在所需的感染期后，可以收集条件培养基用于病毒滴定、LDH测定和细胞因子定量。细胞提取物可用于MTT和流式细胞术测定。通过在65℃加热30min灭活的病毒可用作对照。在一些实验中，在用MAYV感染后可以用10mM N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC；Sigma-Aldrich)或50μM夹竹桃麻素(Sigma-Aldrich)处理15h。
斑点测定法病毒滴定
例如，可以将BHK-21细胞以1.25×105细胞/孔的密度接种在12孔板中，并在37℃下孵育过夜。可以在α-MEM中制备病毒样品的10倍连续稀释液，并在37℃下与细胞一起孵育1h(每孔0.2mL)。吸附1h后，可将补充有2％FBS的α-MEM中的2mL 1％羧甲基纤维素(w/v)(Sigma-Aldrich)置于感染的单层上，并可将细胞在37℃下分别孵育30h或48h，用于SINV或MAYV。通过用20％乙醇中的1mL 1％结晶紫对单层进行染色，可以观察到斑块。
细胞活力测定
可以通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)或乳酸脱氢酶(LDH)释放测定来评估感染期间巨噬细胞活力的测定。对于MTT测定，细胞可以在PBS溶液中与0.5mL 0.5mg/mL MTT(USB Corporation)一起在37℃下孵育90min。然后，可以丢弃未反应的染料，并且甲臜晶体可以是溶解在0.04M Hcl的异丙醇溶液(1mL/孔)中的An AcadBras Cienc(2016)88(3)1488Mariana G.Cavalheiro等。可以在570nm和650nm处测量样品的吸光度，用于背景校正。从感染的巨噬细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)可以通过使用LDH检测试剂盒(Promega CytoTox 96测定试剂盒)来测定。这些步骤可以根据制造商的说明进行。
通过流式细胞术定量感染的细胞
可以进行流式细胞术分析，通过检测细胞内病毒抗原来评估MAYV或SINV感染细胞的频率。在所需的感染期后，可以用PBS洗涤细胞，通过刮擦分离，采集并在室温下在4％甲醛的PBS中固定15min。洗涤后，可以用0.1％皂苷的PBS透化细胞，并在室温下与封闭溶液(补充有2％FBS和0.1％牛血清白蛋白的PBS)一起孵育20min。然后，细胞可以与小鼠抗东方马脑炎病毒单克隆抗体(Chemicon International，Millipore)一起孵育1h，该单克隆抗体与所有甲病毒共有的E1表位反应。然后，可以洗涤细胞并用与Alexa Fluor 488(Invitrogen)缀合的抗小鼠IgG染色30min。感染细胞的百分比可以通过FACScan流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。
细胞死亡的表征
感染后的细胞凋亡/坏死可以通过双重染色法使用Vybrant细胞凋亡测定试剂盒#2(Molecular Probes)进行定量。在感染期后，可以用PBS洗涤RAW 264.7细胞，通过刮擦分离，采集并用膜联蛋白V Alexa Fluor 488(0.5μg/mL)和碘化丙锭(PI，0.25μg/mL)染色。为了进一步表征MAYV诱导的细胞死亡，可以使用适于流式细胞术的MuseTM半胱天冬酶-3/7试剂盒(Millipore)测量半胱天冬酶3和7的活性。根据制造商的方案，细胞可以用PBS洗涤，通过刮擦分离，采集并与MuseTM半胱天冬酶-3/7试剂1:8和MuseTM半胱天冬酶7-AAD一起孵育。对于这两种分析，凋亡和坏死细胞的百分比可以通过FACScan流式细胞仪使用CellQuest软件(Bectan Dickinson)进行分析。UV辐射的细胞和经受冻融步骤的细胞可用作对照。
活性氧(ROS)的定量
细胞内活性氧(ROS)的量可以通过5-(和6-)-氯甲基-2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCF，Molecular Probes)的氧化衍生物的形成来测量。用MAYV感染15h后，可用PBS洗涤粘附细胞，并用DCF 0.5μM孵育45min。然后，可以再次洗涤细胞，通过刮擦分离细胞，采集细胞，并通过FACScan流式细胞仪使用CellQuest软件(Bectan Dickinson)进行分析。
细胞因子的定量巨噬细胞培养物的条件培养基中细胞因子的浓度可以通过ELISA测定。根据制造商的方案，可以使用标准ELISA开发试剂盒(PeproTech)对TNF浓度进行定量。
实施例14
黄热病病毒(YFV)抗病毒活性测定:抗病毒活性的初步分析
人横纹肌肉瘤(RD)细胞单层将在96孔板中在含2％灭活FBS的MEM中生长。受试化合物将与YFV一起在MOI＝1下重复三次加入孔中。然后将该板在37℃、5％CO2下孵育72小时。对于每种化合物的每个浓度，将进行三次重复的测定。三天后，将在显微镜下观察平板，作为病毒复制抑制的量度的细胞病变效应(CPE)的程度将表示为病毒对照的百分产率。将根据制造商的方案通过进行MTS分析(Promega，WI，美国)对结果进行评估。所有实验将独立重复三次。
病灶形成单位减少测定(FFURA)
每种化合物的抗病毒活性将通过测量用增加浓度的每种化合物处理后RD细胞中YFV感染病灶数量的减少来确定。简而言之，将用不同浓度的每种化合物处理的受感染的RD细胞将在感染后使用补充有2％FBS和1.5％羧甲基纤维素(CMC)的条件生长培养基孵育2天。每种化合物的抗病毒活性将在观察和病毒病灶计数后确定。将使用Elispot机器计数YFV病灶的数量，并将病毒滴度表示为病灶形成单位(FFU)。化合物的抗病毒活性将通过使用以下公式计算相对于同时进行的对照组的病灶减少百分比(％RF)来确定：RF(％)＝(C-T)×100/C，其中，C是没有添加化合物的三次重复处理(载体对照)的病灶数的平均值，T是使用相应化合物的每次处理测量的三次重复的病灶数的平均值。结果将表示为来自三个独立实验的三次重复测定的平均值(SEM)的平均值±标准误差。结果通过使用定量RT-PCR的病毒产量减少测定来确认。
病毒产量减少测定
将在96孔细胞培养微量板中制备RD细胞的单层，并用YFV(moi＝0.1)覆盖1小时。病毒吸附后，用冷的无菌PBS洗涤细胞3次，以除去未附着的病毒，然后用增加浓度的测试化合物处理细胞2天。2天后，将分别从感染/处理的细胞和上清液中提取YFV RNA，并使用一步特异性定量RT-PCR对YFV的YFV产量进行定量。然而，每个核苷类似物的抗病毒活性将使用如前所述的病灶形成单位减少测定(FFURA)进行研究。
加药时间测定
将在96孔细胞培养板中制备RD细胞的融合单层，并在用YFV以MOI＝1感染前、感染同时以及感染后1、2、4和6小时用EC90的每种有效药物预处理2h。然后将细胞在化合物的存在下孵育48h。在孵育期结束时，将使用如上所述的qRT-PCR确定每个治疗时间点的病毒载量。
统计学分析
Graph Pad Prism for Windows，第5版(Graph Pad Software Inc.,San Diego,CA,2005)将用于确定每种有效化合物的半最大有效浓度EC50值和EC90。所有EC50和EC90值将被计算为来自三个独立实验的三次重复测定的平均值的±平均标准误差(SEM)。
实施例15
HCV复制子测定1
含有HCV复制子RNA的Huh 7克隆B细胞可以以5000细胞/孔接种在96孔板中，接种后立即以10μΜ检测化合物，重复三次。孵育五天后(37℃，5％CO2)，可以使用来自Gentra的versaGene RNA纯化试剂盒分离总细胞RNA。复制子RNA和内部对照(TaqMan rRNA对照试剂，Applied Biosystems)可以在单步多重实时RT-PCR分析中扩增。通过从无药物对照(ACtHCV)的阈值RT-PCR循环中减去测试化合物的阈值RT-PCR循环，可以计算化合物的抗病毒功效。3.3的ACt相当于复制子RNA水平降低1个对数级(相当于起始材料减少90％)。化合物的细胞毒性也可以通过使用ACt rRNA值来计算。2'-C-Me-C可用作阳性对照。为了确定EC90和IC50值，ACt：可以首先被转换成原料的部分的值，然后可以用于计算抑制％。
实施例16
本文所述化合物抗登革热的功效
特定病毒蛋白(登革病毒包膜蛋白(E))在病毒传播中的重要作用。Mondotte等人,J.Virol.July 2007,vol.81no.13 7136-7148公开了一种用于鉴定治疗由登革热病毒引起的感染的化合物的测定方法，并且该测定方法可用于鉴定本文所述的对抗登革热有活性的那些化合物。
另一测定方法描述于Levin,14th International Symposium on HepatitisCVirus&Related Viruses,Glasgow,UK,9-13September 2007。该测定方法涉及人和登革热病毒聚合酶，其中可以在一定浓度范围内，例如从0.8mM至100mM，针对酶检测推定的化合物，优选重复两次。化合物也可以与对照(无抑制剂)、溶剂稀释液(0.016％至2％DMSO)和参考抑制剂一起运行。
适用于登革热的高通量检测方法描述于Lim等人,Antiviral Research,Volume80,Issue 3,December 2008,Pages 360-369。登革病毒(DENV)NS5在其N-末端氨基酸序列具有甲基转移酶(MTase)活性，并负责在病毒基因组RNA中形成1型帽结构m7GpppAm2′-O。使用纯化的重组蛋白和短的生物素化GTP封端的RNA模板可以表征DENV2 2′-O-MTase活性的最佳体外条件。从初始速度导出的稳态动力学参数可用于建立用于化合物检测的稳健的闪烁邻近测定。Lim等人,Antiviral Research,Volume 80,Issue 3,December 2008,Pages360-369研究了预孵育，显示MTase-AdoMet和MTase-RNA复合物具有同等的催化能力，这种酶支持随机双向动力学机制。Lim用竞争性抑制剂S-腺苷-高半胱氨酸和两种同系物西奈芬净(sinefungin)和脱氢西奈芬净(dehydrosinefungin)验证了该测定。存在于DENV2 MTaseN-末端的GTP结合口袋可以预先假定为帽结合位点。这种分析允许快速和高灵敏度地检测2′-O-MTase活性，并且可以容易地适用于抑制性化合物的高通量筛选。
实施例17
抗诺如病毒活性
化合物可通过抑制诺如病毒聚合酶和/或解旋酶、通过抑制复制周期中所需的其他酶或通过其他途径表现出抗诺如病毒活性。
目前没有针对诺如病毒感染的经批准的药物治疗方法(http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)，这可能至少部分是由于缺乏细胞培养系统。最近，已经为最初的Norwalk G-I菌株开发了复制子系统(Chang,K.O.,等人(2006)Virology 353:463-473)。
诺如病毒复制子和丙型肝炎复制子都需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶起作用，以使复制子复制发生。最近，报道了利用诺如病毒基因组I和II接种物的体外细胞培养感染性测定(Straub,T.M.等人(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3):396-403)。该测定在利用微载体珠上的小肠上皮细胞的旋转壁生物反应器中进行。感染性测定可用于筛选进入抑制剂。
诺如病毒感染的诊断
可以通过使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定受影响的人的粪便中的病毒RNA来诊断诺如病毒感染。可以从症状发作后48至72小时内采集的粪便样本中鉴定出该病毒，尽管可以使用RT-PCR对症状发作后长达7天采集的样本获得满意的结果。其他诊断方法包括电子显微镜和血清学测定，以检测至少相隔三周收集的成对血清中滴度的升高。也有可用的商业酶联免疫测定，但这些往往具有相对较低的灵敏度，限制了它们用于疾病暴发的病原学诊断。经常使用诺如病毒感染的临床诊断，特别是当已经排除了肠胃炎的其他致病因子时。
实施例18
确定化合物抗ZIKV和DENV感染的功效
用于ZIKV和DENV(血清型1-4)感染测定的材料和方法：
病毒：从疾病控制和预防中心获得ZIKV PRVABC59菌株(NCBI保藏号KU501215)。在C6/36或Vero细胞上产生病毒原液，并通过在Vero(非洲绿猴肾)或人类细胞，包括成神经细胞瘤(U251)和肝母细胞瘤(Huh7)中的终点滴定来确定病毒滴度。在Vero或幼仓鼠肾细胞(BHK)中生成DENV原液(由Dr.Guey Chuen Perng(Emory University&Cheng KungUniversity,中国台湾)提供)(Clark等人,2016)。
ZIKV或DENV的细胞病变减少测定：对于细胞病变减少测定，将细胞(Vero、U251或Huh7)以1×104细胞/孔接种在96孔板中，并孵育过夜。第二天，加入含有50％细胞培养感染剂量的ZIKV或DENV(在Vero或BHK细胞中检测)的培养基，之后加入化合物的2倍连续稀释液。加入化合物后4天(Vero)或5天(U251或Huh7)，通过MTS读出系统(CellTiter 96AQueousOne Solution Proliferation试剂盒，Promega)测量细胞病变效应(CPE)，以确定ZIKV复制抑制的水平(Zmurko等人,2016；Gavegnano et al.,2017)。对于DENV血清型1-4，在Vero或BHK细胞中加入化合物后4至5天测量CPE。
病灶形成测定：对于病灶形成测定(FFA)，Vero细胞通常以1.5×104细胞/孔接种于96孔板中，并孵育过夜。接下来，将含有70-100个ZIKV或DENV(血清型1-4)病灶形成单位的培养基加上化合物的2倍连续稀释液加入细胞中，孵育2h，然后加入覆盖甲基纤维素培养基。孵育2-3天后，用抗黄病毒组抗原(4G2，Millipore)对病灶进行染色，然后用HRP-抗小鼠IgG和TrueBlue底物进行染色，并用CTL-Immunospot S6微量分析仪进行成像(Priyamvada等人,2016)。
实时RT-PCR测定：对于RT-PCR测定，将Vero、U251或Huh7细胞(15,000个/孔)接种在96孔微量培养板中，并在用于感染ZIKV(对于Vero MOI＝0.001，对于U251或huh 7MOI-0.5)或DENV(对于Vero细胞血清型1-4的不同原液，MOI从0.001至0.1不等)之前培养过夜。在感染ZIKV或DENV后1-2h以剂量依赖的方式加入化合物。孵育四天后，将纯化的RNA逆转录成cDNA，并在一步RT-PCR多重反应中用LightCycler 480RNA主水解探针((Roche,Indianapolis,IN)扩增，使用与来自ZIKV包膜基因的76bp片段互补的高度保守序列，如前文Lanciotti(Lanciotti等人,2008)所述，和内源对照(TaqMan核糖体RNA对照或β珠蛋白试剂；Applied Biosystems)通过使用LightCycler 480Instrument II(Roche)。为了检测登革热病毒，我们利用血清型特异性的寡核苷酸引物和探针，在四重RT-PCR试验中快速检测所有四种血清型(Johnoson等人,2005)。对于所有的病毒学检测，使用CalcuSyn软件(Biosoft)测定抑制百分比和EC50值(抑制病毒抗原表达或病毒复制50％的化合物浓度)。
ZIKV或DENV的组合研究。
一个目标是将重点放在具有亚-μM浓度的化合物上，用于hit到lead开发，细胞选择性指数(SI)≥100。显示出抗病毒能力而没有明显细胞毒性的Hit化合物可以被选择用于与显示出相对于其他化合物不同作用机制(包括病毒进入和宿主抑制剂等)的化合物的药物-药物组合；这些组合可产生协同效应和最佳低剂量，以快速消除受感染个体中的ZIKV或DENV。
可以使用Chou和Talalay方法(Chou&Talalay,1984年)来确定协同作用、拮抗作用或相加性(Bassit等人,2008；Schinazi等人,2012)，特别是在组合方面。
用于ENV2(血清型2)复制子测定的材料和方法：
表达登革热病毒血清型2的幼仓鼠肾(BHK-21)稳定细胞系[DENV2,New Guinea Cstrain,Qing等人,2010)]由Mehul S.Suthar(Emory University)提供。
将携带DENV2制子的幼仓鼠肾(BHK)细胞暴露于浓度为0.2至20μM的检测化合物中，以评估抗病毒活性。加入测试化合物48小时后，定量海肾萤光素酶(Renillaluciferase)水平(Promega)，以确定复制抑制水平(EC50，μM)。
参考文献
1.Clark,K.B.,Hsiao,H.M.,Bassit L.,Crowe J.E.Jr.,Schinazi R.F.,PerngG.C.,Villinger F.Characterization of dengue virus 2growth in megakaryocyte-erythrocyte progenitor cells.Virology.493,162-72(2016).
2.Zmurko,J.,Marques,R.E.,Schols,D.,Verbeken,E.,Kaptein,S.J.F.&Neyts,J.The Viral Polymerase Inhibitor 7-Deaza-2’-C-Methyladenosine Is a PotentInhibitor of In Vitro Zika Virus Replication and Delays Disease Progressionin a Robust Mouse Infection Model.PLoS Neglected Tropical Diseases 10,e0004695,doi:10.1371/journal.pntd.0004695(2016).
3.Gavegnano C,Bassit LC,Cox BD,Hsiao H-M,Johnson EL,Suthar M,Chakraborty R,Schinazi RF.Jak inhibitors modulate production of replication-competent Zika Virus in Human Hofbauer,Trophoblasts,and Neuroblastomacells.Pathogens&immunity.2,199-218(2017).
4.Priyamvada L,Quicke KM,Hudson WH,Onlamoon N,Sewatanon J,EdupugantiS,Pattanapanyasat K,Chokephaibulkit K,Mulligan M J,Wilson PC,Ahmed R,SutharMS,Wrammert J.Human antibody responses after dengue virus infection arehighly cross-reactive to Zika virus.PNAS113,7852-7857,(2016).
5.Lanciotti R,Kosoy O,Laven J,Velez J,Lambert A,Johnson A,StanfieldS,Duffy M.Genetic and serologic properties of Zika virus associated withanepidemic,Yap State,Micronesia,2007.Emerg Infect Dis.14,1232-1239(2008).
6.Johnson BW,Russell BJ,Lanciotti RS.Serotype-specific detectionofdengue viruses in a fourplex real-time reverse transcriptase PCR assay.JClinMicrobiol 43(10),4977-4983(2005).
7.Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effectrelationships:thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.AdvEnzyme Regul.22,27-55(1984).
8.Bassit L,Grier J,Bennett M,Schinazi RF.Combinations of2'-C-methylcytidine analogues with interferon-alpha2b and triple combinationwithribavirin in the hepatitis C virus replicon system.Antivir ChemChemother.19(1),25-31(2008).
9.Schinazi RF,Bassit L,Clayton MM,Sun B,Kohler JJ,Obikhod A,Arzumanyan A,Feitelson MA.Evaluation of single and combination therapieswithtenofovir disoproxil fumarate and emtricitabine in vitro and in a robustmouse modelsupporting high levels of hepatitis B virus replication.AntimicrobAgentsChemother.56(12),6186-91(2012).
10.Qing M,Liu W,Yuan Z et al.,A high-throughput assay using dengue-1virus like particles for drug discovery.Antiviral Res.86(2),163-71(2010).
实施例19
MERS测定
细胞和病毒：
人肺癌细胞(A-549)可用于初级抗病毒测定，并可从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.,美国)获得。细胞可以在补充有10％胎牛血清的基本培养基(含0.15％NaCHO3的MEM，Hyclone Laboratories，Logan，Utah，美国)中传代。当评估化合物的功效时，血清可以减少到2％的最终浓度，培养基可以含有浓度为50μg/mL的庆大霉素(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)。因为MERS-Co病毒不产生可检测的病毒细胞病变效应，所以可以通过滴定Vero 76细胞中受感染的化合物处理的A549细胞的病毒上清液来检测A549细胞中的病毒复制。
Vero 76细胞可以从ATCC获得，并且可以在补充有5％胎牛血清、含0.15％NaCHO3的MEM中进行常规传代。评估化合物时，可将血清降低至2％的终浓度，并补充50μg/mL的庆大霉素。
中东冠状病毒株EMC(MERS-CoV)是来自人的原始分离物，由Ron Fouchier(Erasmus Medical Center,Rotterdam,荷兰)在细胞培养中扩增，并从疾病控制中心(Atlanta,Ga.)获得。
对照：
(干扰素αcon-1，一种重组非天然存在的I型干扰素(Blatt,L.,etal.,J.Interferon Cytokine Res.(1996)16(7):489-499and Alberti,A.,BioDrugs(1999)12(5):343-357)可用作所有抗病毒测定中的阳性对照药物。干扰素＝0.03ng/mL。
抗病毒测定：
可以在MEM中将病毒稀释至感染复数＝0.001，并且可以使用半对数8稀释系列在MEM+2％FBS中稀释每种化合物。可以首先将化合物加入到融合的A549细胞的96孔板中，随后在5min内加入病毒。可以从负三次评估每个检测化合物稀释液的抑制作用。铺板后，可将板在37℃下孵育4天。然后将板在-80℃下冷冻。
病毒产量减少测定：
可以确定抗病毒测定中每个孔的感染性病毒产量。抗病毒测定的每个板都可以解冻。在Vero 76细胞中，通过CPE测定，可以合并每个测试化合物浓度的样品孔，并对感染性病毒进行滴定。可以对孔进行CPE评分，并计算病毒滴度。然后通过回归分析可以计算出病毒产量减少90％。这表示与未处理的病毒对照相比，滴度抑制了一个log10。
实施例20
VEEV测定
可以制备HeLa-Ohio细胞的96孔板并孵育过夜。平板可以以每孔4×104个细胞接种，这在过夜孵育后在每个孔中产生90-100％的融合单层。DMSO中的检测化合物可以从100μM的浓度开始。制备在含有0.1％DMSO、0％FBS和50μg/mL庆大霉素的MEM培养基中检测化合物浓度的8倍连续稀释。可以向96孔板的5个测试孔中加入100μL的每种浓度，并且可以将该板在37℃+5％CO2下孵育孵育2h或18h。可以加入含有TC-83株委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC，原液滴度：106.8CCID50/mL)的每个稀释液的3个孔，所述病毒在如上所述在培养基中制备。2孔(未感染的毒性对照)可以加入无病毒的MEM。6孔可感染未经处理的病毒对照。可以向6个孔中添加培养基，仅作为细胞对照。一种盲法的、已知的活性化合物可作为阳性对照进行平行检测。该板可在37℃+5％CO2下孵育3d。该板可通过显微镜读板，以观察CPE，也可使用BIO-TEK Instruments INC.EL800显示中性红染料板。对于病毒产量减少测定，可以从每个浓度收集上清液。温度可以保持在-80℃，每种化合物可以重复测试三次。CC50可以通过使用毒性对照孔与细胞对照的CPE进行回归分析来确定。可以使用标准终点稀释CCID50测定法重复三次检测病毒滴度，并且可以使用Reed-Muench(1948)方程确定滴度计算。使用回归分析，可以计算将病毒产量降低1个log10(90％)所需的化合物浓度(EC90值)。使用回归分析，可以计算将病毒产量降低50％所需的化合物浓度(EC50值)。
实施例21
裂谷热测定
可以使用本领域技术人员已知的方法测定本文所述化合物抗裂谷热病毒的活性(例如描述于Panchal等人,Antiviral Res.(2012)93(1):23-29)。
实施例22
确定化合物抗HCoV-OC43和SARS-CoV-2感染的功效
病毒
HCoV-OC43获自ATCC(Manasas,VA)，SARS-CoV-2由BEI Resources(NR-52281:USA-WA/2020)提供。HCoV-OC43和SARS-CoV-2分别在Huh-7和Vero细胞中繁殖，并通过TCID50法滴定，随后在-80℃下储存等分试样直至进一步使用。
使用病毒产量测定方法的抗病毒活性测定
为了确定病毒产量测定的最佳时间点，分别在Vero、Caco2、Calu3和Huh-7细胞中进行SARS-CoV-2和HCoV-OC43的动力学复制，并且如前所述，使用针对每种病毒的特异性q-RT PCR，在不同间隔时间点从病毒感染细胞的上清液中评估子代病毒的产量。我们确定感染后48和72h分别是SARS-CoV-2和HCoV-OC43的最佳时间点，因为在感染的细胞上没有观察到细胞死亡和细胞病变效应(CPE)，更重要的是，对于SARS-CoV-2和HCoV-OC43，在那个时间观察到从感染细胞的上清液中采集的病毒RNA拷贝数显著增加。
在确定每种化合物的抗病毒活性的下一步中，我们使用病毒产量抑制测定，通过测定收集的上清液中的病毒RNA拷贝数，与来自感染但未处理的细胞以及作为必要对照的未感染和未处理的细胞的结果相比较，以剂量依赖性方式评估了每种化合物对SARS-CoV-2和HCoV-OC43的抗病毒活性。所有实验重复进行三次，每个实验独立重复三次，以获得可靠的、有统计学意义的结果。
使用GraphPad PRISM for Mac，第7版(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,2005)计算半数有效浓度(EC50)和具有90％抑制效果的浓度(EC90)，并报告为平均±标准偏差(SD)。
表1
实施例23
SARS-CoV-2RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂的酶促评价
严重急性呼吸综合征-冠状病毒2(SARS-CoV-2)的爆发导致了全球冠状病毒(COVID-19)疫情流行。RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，也称为nsp12，是病毒复制和转录复合物的核心成分，处理病毒RNA的复制和转录(Yi Jiang等人,“RNA-dependent RNApolymerase:Structure,mechanism,and drug discovery for COVID-19,”Biochemicaland Biophysical Research Communications,Volume 538,2021,Pages 47-53)。RdRp似乎也是抗病毒药物瑞德西韦的主要靶点。
COVID-19病毒nsp12与辅因子nsp7和nsp8形成复合物。图1显示了COVID-19病毒nsp12-nsp7-nsp8复合物的结构，包括COVID-19病毒nsp12的结构域组织。域间边界用残基数标记。没有cryo-EM图谱密度的N-末端部分和在图谱中不能观察到的C-末端残基不包括在分配中。聚合酶基序的颜色如下：基序A，黄色；基序B，红色；基序C，绿色；基序D，紫罗兰色；基序E，青色；基序F，蓝色；和基序G，浅棕色。该复合物公开于Gao等人,“Structure ofthe RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19virus,”Science 368(6492),779-782(2020)。
图2是RdRp的N-末端NiRAN结构域和β发夹结构的示意图。RdRp结构域和NiRAN结构域的手掌和手指亚结构域中的相互作用残基通过标记来识别。
图3是显示三磷酸抑制剂如何干扰RNA合成的一个实施方案的示意图。RNA聚合酶是一种从DNA模板合成RNA的酶。如图3所示，当生长的RNA链与RNA聚合酶和天然存在的核苷三磷酸接触时，RNA链被延伸。然而，当存在非天然的三磷酸抑制剂时，当RNA聚合酶试图将三磷酸抑制剂添加到生长的RNA链上时，就会出现错误。
为了测量修饰的核苷三磷酸抑制剂破坏RNA合成的能力，通过混合三种蛋白，然后在冰上孵育30分钟，制备0.1μM RdRP复合物(由三种单独的nsp蛋白重建)。
使用25mM Tris-HCl(pH 8)缓冲该复合物。向RdRP复合物的缓冲溶液中加入50μM的17聚体RNA引物和1μM的43聚体RNA模板，溶液在冰上孵育约15分钟。
一旦复合物形成，加入0.1μM热GTP，随后加入NTP混合物(50mM ATP、CTP和TTP；25mM GTP)以提供RNA合成所需的核苷三磷酸。然后，加入对照(水)或抑制剂三磷酸。评估了两种抑制剂三磷酸酯，即瑞德西韦和
体积约为10μL的总反应混合物在30℃下保持10min，随后加入5mM MnCl2，然后混合物在30℃下保持30min以上。聚合酶抑制和/或RNA合成抑制的结果如图4所示。
如图4所示，当加入或瑞德西韦时，RNA合成以剂量依赖性方式被抑制。在1、10和100μM的浓度下，RNA合成没有被显著抑制。然而，在250和500μM的浓度下观察到显著的抑制作用因为病毒通常不会持续很长时间，所以在有限的施用时间内，这种药物浓度水平是可以安全耐受的。
本公开不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述和附图中是显而易见的。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物，其公开内容通过引用整体并入。

Claims (117)

1.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(A)或式(A1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
Y和R独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤素、任选取代的O-连接的氨基酸、取代或未取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的C2-6烯基、取代或未取代的C2-6炔基、取代或未取代的C3-6环烷基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、OR'、SR'，其中每个R’独立地是-C(O)-C1-12烷基、-C(O)-C2-12烯基、-C(O)-C2-12炔基、-C(O)-C3-6环烷基、-C(O)O-C1-12烷基、-C(O)O-C2-12烯基、-C(O)O-C2-12炔基、-C(O)O-C3-6环烷基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基和C3-6环烷基，其中所述基团可以被一个或多个选自由卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基和氰基组成的组的取代基取代，
R1是和R1A独立地是H、CH3、CH2F、CHF2或CF3，其中，当R1是Me时，它所连接的碳可以全部或部分是R或S或其任何混合物，或者R1和R1A可以结合形成C3-7环烷基环；
R2是H、CN、N3、F、CH2-卤素、CH2-N3、O-CH2-P-(OH)3、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基或取代或未取代的C2-8炔基；
当R5是O时，R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的C2-8炔基或N3，和
当R5是CH2、Se、CHF、CF2、-C(CH3)-、-C(环丙基)-、C＝CF2或C＝CH2时，R3选自由H、F、N3、取代或未取代的(C1-8)烷基、取代或未取代的(C2-8)烯基、取代或未取代的(C2-8)炔基、O-(C1-8)烷基和N3组成的组，
R5是O、CH2、Se、CHF、CF2、-C(CH3)-、-C(环丙基)-、C＝CF2或C＝CH2，
R8和R8’独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤素、任选取代的O-连接的氨基酸、取代或未取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的C2-6烯基、取代或未取代的C2-6炔基、取代或未取代的C3-6环烷基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、OR'、SR'，其中每个R’独立地是-C(O)-C1-12烷基、-C(O)-C2-12烯基、-C(O)-C2-12炔基、-C(O)-C3-6环烷基、-C(O)O-C1-12烷基、-C(O)O-C2-12烯基、-C(O)O-C2-12炔基、-C(O)O-C3-6环烷基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基，其中该基团可以被一个或多个选自由卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基和氰基组成的组的取代基取代，
R4是OH、任选取代的O-连接的氨基酸、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、-O-C(O)O-C3-6环烷基、OC1-6烷基、OC1-6卤代烷基、OC1-6烷氧基、OC2-6烯基、OC2-6炔基、OC3-6环烷基、O-P(O)R6R7、O-CH2-P-(OH)3、O-CH2-P-(OH)3或单-、二-、或三磷酸酯，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或其任何混合物，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基，如苯基和吡啶基组成的组，其中芳基和杂芳基任选被0-3个独立选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
其中R16独立地是H、取代或未取代的C1-20烷基，衍生自被C1-6烷基、C1-6烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
(b)D-或L-氨基酸的酯R17和R18独立地是H、C1-20烷基，衍生自任选被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-(C3-7)环烷基、C-(C1-6)卤代烷基、C-(C1-6)羟烷基、C-OR22、C-N(R22)2、C-卤素、C-CN或N，
X1’是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-卤素、C-CN或N
R9和X2独立地是H、OH、NH2、卤素(即F、Cl、Br或I)、SH、NHOH、O(C1-10)烷基、O(C2-10)烯基、O(C2-10)炔基、O(C3-7)环烷基、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、-O-C(O)O-C3-6环烷基、S(C1-10)烷基、S(C2-10)烯烃、S(C2-10)炔、S(C3-7)环烷基、任选不饱和的NH(C1-10)烷基、任选不饱和的N((C1-10)烷基)2、NH(C3-7)环烷基、任选不饱和的NH(CO)(C1-20)烷基、任选不饱和的NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、任选不饱和的NHO(CO)(C1-20)烷基、或任选不饱和的NHO(CO)NH(C1-20)烷基、(C1-3)烷基，
R9’是OH、NH2、SH、NHOH、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、或-O-C(O)O-C3-6环烷基，
R10是H或F，
X2’是N或CH，和
W是O或S。
2.根据权利要求1所述的方法，其中R5是O。
3.根据权利要求2所述的方法，其中R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中R3是H。
5.根据权利要求1所述的方法，其中R1是和R1A是H。
6.根据权利要求1所述的方法，其中R8和R8’是OH。
7.根据权利要求1所述的方法，其中R4是OH或O-P(O)R6R7。
8.根据权利要求1所述的方法，其中碱基是
9.根据权利要求8所述的方法，其中R9’是OH、NH2或NHOH。
10.根据权利要求1所述的方法，其中碱基是
11.根据权利要求10所述的方法，其中X2是NH2、OH或SH。
12.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(B)或(B1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、Y、R、R1、R1A、R2、R3、R5和R8’如式A中所定义，
A是O或S，和
D选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基，如苯基和吡啶基组成的组，其中芳基和杂芳基任选被0-3个独立选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
(b)D-或L-氨基酸的酯R17和R18独立地是H、C1-20烷基，衍生自任选被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；和
(c)其中R30选自由取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、取代或未取代的(C2-10)烯、取代或未取代的(C2-10)炔、C1-4(烷基)芳基、芳基、杂芳基和C1-6卤代烷基组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中R5是O。
14.根据权利要求12所述的方法，其中R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
15.根据权利要求12所述的方法，其中R3是H。
16.根据权利要求12所述的方法，其中R8是OH。
17.根据权利要求12所述的方法，其中Y是H。
18.根据权利要求12所述的方法，其中R1和R1A是H。
19.根据权利要求12所述的方法，其中A是O。
20.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(C)或(C1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R、R1、R1A、R2、R3、R5、R8、R8’和Y如式A中所定义，
X是OH、NH2、SH、NHOH、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、或-O-C(O)O-C3-6环烷基，
Z是H或F，和
W是O或S。
21.根据权利要求20所述的方法，其中R5是O。
22.根据权利要求20所述的方法，其中R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
23.根据权利要求20所述的方法，其中R3是H。
24.根据权利要求20所述的方法，其中R8和R8’是OH。
25.根据权利要求20所述的方法，其中Y是H。
26.根据权利要求20所述的方法，其中R是H。
27.根据权利要求20所述的方法，其中Z是H。
28.根据权利要求20所述的方法，其中X是OH、NH2或NHOH。
29.根据权利要求20所述的方法，其中W是O。
30.根据权利要求20所述的方法，其中R1和R1A是H。
31.根据权利要求20所述的方法，其中R4是OH或O-P(O)R6R7。
32.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(D)或(D1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中R、R1、R1A、R2、R3、R5、R8’和Y如式A中所定义，A和D如式C中所定义。
33.根据权利要求32所述的方法，其中R5是O。
34.根据权利要求32所述的方法，其中R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
35.根据权利要求32所述的方法，其中R3是H。
36.根据权利要求32所述的方法，其中R8是OH。
37.根据权利要求32所述的方法，其中Y是H。
38.根据权利要求32所述的方法，其中R是H。
39.根据权利要求32所述的方法，其中Z是H。
40.根据权利要求32所述的方法，其中X是OH、NH2或NHOH。
41.根据权利要求32所述的方法，其中W是O。
42.根据权利要求32所述的方法，其中R1和R1A是H。
43.根据权利要求32所述的方法，其中R4是OH或O-P(O)R6R7。
44.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(E)或(E1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、R1、R1A、R2、R3和R4如式A中所定义，
R30是O或CH2，
R31是O或S，
当R30是S时，R31是O，和
R32和R33独立地是H、F、C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
45.根据权利要求44所述的方法，其中R30是O。
46.根据权利要求44所述的方法，其中R31是O。
47.根据权利要求44所述的方法，其中R32和R33独立地是H或F。
48.根据权利要求44所述的方法，其中R3是H。
49.根据权利要求44所述的方法，其中R2是N3或取代或未取代的C2-8炔基。
50.根据权利要求44所述的方法，其中R1和R1A是H。
51.根据权利要求44所述的方法，其中R4是OH或O-P(O)R6R7。
52.根据权利要求44所述的方法，其中碱基是
53.根据权利要求52所述的方法，其中X1是N。
54.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(F)或(F1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、R1、R1A、R2、R3和R4如式A中所定义，
R34是O或CH2，和
R35和R36独立地是H、F或CH3。
55.根据权利要求54所述的方法，其中R35和R36是H。
56.根据权利要求54所述的方法，其中R34是CH2。
57.根据权利要求54所述的方法，其中R4是OH或O-P(O)R6R7。
58.根据权利要求54所述的方法，其中R3是H。
59.根据权利要求54所述的方法，其中R2是H或取代或未取代的C2-8炔基。
60.根据权利要求54所述的方法，其中R1和R1A是H。
61.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的具有下式之一的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药。
62.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的下式之一的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药。
63.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的下式之一的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述化合物可以β-D或β-L构型存在。
65.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2、MERS、SARS或OC-43。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2。
68.根据权利要求1至63中任一项的方法，其中所述化合物与一种或多种其他活性化合物共同施用，所述其他活性化合物选自由融合抑制剂、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、抗病毒核苷、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、JAK抑制剂、血管紧张素转换酶2(ACE2)抑制剂、SARS-CoV特异性人单克隆抗体，包括CR3022，和不同或未知机制的药物组成的组。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述化合物与瑞德西韦、N-羟基胞苷或其药学上可接受的盐或前药共同施用。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述的其他活性化合物是JAK抑制剂，并且所述JAK抑制剂是Jakafi、托法替尼或巴瑞克替尼或其药学上可接受的盐或前药。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述一种或多种其他活性药物包括抗凝剂或血小板聚集抑制剂。
72.根据权利要求68所述的方法，其中所述一种或多种其他活性药物包括ACE-2抑制剂、CYP-450抑制剂或NOX抑制剂。
73.根据权利要求1至63中任一项所述的化合物在制备用于治疗或预防冠状病毒、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的药物中的用途。
74.根据权利要求73所述的用途，其中所述感染是冠状病毒科感染。
75.根据权利要求74所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2、MERS、SARS或OC-43。
76.根据权利要求74所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2。
77.根据权利要求73所述的用途，其中所述药物进一步包含一种或多种其他活性化合物，所述其他活性化合物选自由融合抑制剂、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、抗病毒核苷、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、JAK抑制剂、血管紧张素转换酶2(ACE2)抑制剂、SARS-CoV特异性人单克隆抗体，包括CR3022，和不同或未知机制的药物组成的组。
78.根据权利要求73所述的用途，其中所述药物进一步包含瑞德西韦、N-羟基胞苷或其药学上可接受的盐或前药。
79.根据权利要求73所述的用途，其中所述药物进一步包含JAK抑制剂，并且所述JAK抑制剂是Jakafi、托法替尼或巴瑞克替尼或其药学上可接受的盐或前药。
80.根据权利要求73所述的用途，其中所述药物进一步包含抗凝剂或血小板聚集抑制剂。
81.根据权利要求73所述的用途，其中所述药物进一步包含ACE-2抑制剂、CYP-450抑制剂或NOX抑制剂。
82.根据权利要求73所述的用途，其中所述药物是透皮组合物或纳米颗粒组合物。
83.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(A)或式(A1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
Y和R独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤素、任选取代的O-连接的氨基酸、取代或未取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的C2-6烯基、取代或未取代的C2-6炔基、取代或未取代的C3-6环烷基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、OR'、SR'，其中每个R’独立地是-C(O)-C1-12烷基、-C(O)-C2-12烯基、-C(O)-C2-12炔基、-C(O)-C3-6环烷基、-C(O)O-C1-12烷基、-C(O)O-C2-12烯基、-C(O)O-C2-12炔基、-C(O)O-C3-6环烷基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基和C3-6环烷基，其中所述基团可以被一个或多个选自由卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基和氰基组成的组的取代基取代，
R1是和R1A独立地是H、CH3、CH2F、CHF2或CF3，其中，当R1是Me时，它所连接的碳可以全部或部分是R或S或其任何混合物，或者R1和R1A可以结合形成C3-7环烷基环；
R2是H、CN、N3、F、CH2-卤素、CH2-N3、O-CH2-P-(OH)3、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基或取代或未取代的C2-8炔基；
当R5是O时，R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的C2-8炔基或N3，和
当R5是CH2、Se、CHF、CF2、-C(CH3)-、-C(环丙基)-、C＝CF2或C＝CH2时，R3选自由H、F、N3、取代或未取代的(C1-8)烷基、取代或未取代的(C2-8)烯基、取代或未取代的(C2-8)炔基、O-(C1-8)烷基和N3组成的组，
R5是O、CH2、Se、CHF、CF2、-C(CH3)-、-C(环丙基)-、C＝CF2或C＝CH2，
R8和R8’独立地选自由以下组成的组：H、OH、卤素、任选取代的O-连接的氨基酸、取代或未取代的C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的C2-6烯基、取代或未取代的C2-6炔基、取代或未取代的C3-6环烷基、氰基、氰烷基、叠氮基、叠氮烷基、OR'、SR'，其中每个R’独立地是-C(O)-C1-12烷基、-C(O)-C2-12烯基、-C(O)-C2-12炔基、-C(O)-C3-6环烷基、-C(O)O-C1-12烷基、-C(O)O-C2-12烯基、-C(O)O-C2-12炔基、-C(O)O-C3-6环烷基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基，其中该基团可以被一个或多个选自由卤素(氟、氯、溴或碘)、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、硝基和氰基组成的组的取代基取代，
R4是OH、任选取代的O-连接的氨基酸、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、-O-C(O)O-C3-6环烷基、OC1-6烷基、OC1-6卤代烷基、OC1-6烷氧基、OC2-6烯基、OC2-6炔基、OC3-6环烷基、O-P(O)R6R7、O-CH2-P-(OH)3、O-CH2-P-(OH)3或单-、二-、或三磷酸酯，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或其任何混合物，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基，如苯基和吡啶基组成的组，其中芳基和杂芳基任选被0-3个独立选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
其中R16独立地是H、取代或未取代的C1-20烷基，衍生自被C1-6烷基、C1-6烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
(b)D-或L-氨基酸的酯R17和R18独立地是H、C1-20烷基，衍生自任选被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；
碱基是
X1是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-(C3-7)环烷基、C-(C1-6)卤代烷基、C-(C1-6)羟烷基、C-OR22、C-N(R22)2、C-卤素、C-CN或N，
X1’是CH、C-(C1-6)烷基、C-(C2-6)烯基、C-(C2-6)炔基、C-卤素、C-CN或N
R9和X2独立地是H、OH、NH2、卤素(即F、Cl、Br或I)、SH、NHOH、O(C1-10)烷基、O(C2-10)烯基、O(C2-10)炔基、O(C3-7)环烷基、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、-O-C(O)O-C3-6环烷基、S(C1-10)烷基、S(C2-10)烯烃、S(C2-10)炔、S(C3-7)环烷基、任选不饱和的NH(C1-10)烷基、任选不饱和的N((C1-10)烷基)2、NH(C3-7)环烷基、任选不饱和的NH(CO)(C1-20)烷基、任选不饱和的NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、任选不饱和的NHO(CO)(C1-20)烷基、或任选不饱和的NHO(CO)NH(C1-20)烷基、(C1-3)烷基，
R9’是OH、NH2、SH、NHOH、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、或-O-C(O)O-C3-6环烷基，
R10是H或F，
X2’是N或CH，和
W是O或S。
84.根据权利要求83所述的方法，其中R5是O，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基，R3是H，R1是和R1A是H，R8和R8’是OH，R4是OH或O-P(O)R6R7，R9’是OH、NH2或NHOH，和/或X2是NH2、OH或SH。
85.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(B)或(B1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、Y、R、R1、R1A、R2、R3、R5和R8’如式A中所定义，
A是O或S，和
D选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基，如苯基和吡啶基组成的组，其中芳基和杂芳基任选被0-3个独立选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
(b)D-或L-氨基酸的酯R17和R18独立地是H、C1-20烷基，衍生自任选被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基-C1-6烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的脂肪醇或C1-20烷基的碳链；其中取代基是C1-5烷基或被C1-6烷基、烷氧基、二(C1-6烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基或环烷基取代的C1-5烷基；和
(c)其中R30选自由取代或未取代的C1-20烷基、取代或未取代的C3-6环烷基、取代或未取代的(C2-10)烯、取代或未取代的(C2-10)炔、C1-4(烷基)芳基、芳基、杂芳基和C1-6卤代烷基组成的组。
86.根据权利要求85所述的方法，其中R5是O，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基，R3是H，R8’是OH，Y是H，R1和R1A是H，和/或A是O。
87.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(C)或(C1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R、R1、R1A、R2、R3、R5、R8、R8’和Y如式A中所定义，
X是OH、NH2、SH、NHOH、-O-C(O)-C1-12烷基、-O-C(O)-C2-12烯基、-O-C(O)-C2-12炔基、-O-C(O)-C3-6环烷基、-O-C(O)O-C1-12烷基、-O-C(O)O-C2-12烯基、-O-C(O)O-C2-12炔基、或-O-C(O)O-C3-6环烷基，
Z是H或F，和
W是O或S。
88.根据权利要求87所述的方法，其中R5是O，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基，R3是H，R8和R8’是OH，Y是H，R是H，Z是H，X是OH、NH2或NHOH，W是O，R1和R1A是H，和/或R4是OH或O-P(O)R6R7。
89.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(D)或(D1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中R、R1、R1A、R2、R3、R5、R8’和Y如式A中所定义，A和D如式C中所定义。
90.根据权利要求89所述的方法，其中R5是O，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基，R3是H，R8’是OH，Y是H，R是H，Z是H，X是OH、NH2或NHOH，W是O，R1和R1A是H，和/或R4是OH或O-P(O)R6R7。
91.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(E)或(E1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、R1、R1A、R2、R3和R4如式A中所定义，
R30是O或CH2，
R31是O或S，
当R30是S时，R31是O，和
R32和R33独立地是H、F、C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基。
92.根据权利要求91所述的方法，其中R30是O，R31是O，R32和R33独立地是H或F，R3是H，R2是N3或取代或未取代的C2-8炔基，R1和R1A是H，R4是OH或O-P(O)R6R7，和/或X1是N。
93.一种治疗或预防冠状病毒科、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的方法，包括向需要治疗或预防的患者施用治疗或预防量的式(F)或(F1)的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
碱基、R1、R1A、R2、R3和R4如式A中所定义，
R34是O或CH2，和
R35和R36独立地是H、F或CH3。
94.根据权利要求93所述的方法，其中R35和R36是H，R34是CH2，R4是OH或O-P(O)R6R7，R3是H，R2是H或取代或未取代的C2-8炔基，和/或R1和R1A是H。
95.根据权利要求83至94中任一项所述的方法，其中所述化合物可以β-D或β-L构型存在。
96.根据权利要求83至94中任一项所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2、MERS、SARS或OC-43。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2。
99.根据权利要求83至94中任一项的方法，其中所述化合物与一种或多种其他活性化合物共同施用，所述其他活性化合物选自由融合抑制剂、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、抗病毒核苷、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、JAK抑制剂、血管紧张素转换酶2(ACE2)抑制剂、SARS-CoV特异性人单克隆抗体，包括CR3022，和不同或未知机制的药物组成的组。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述化合物与瑞德西韦、N-羟基胞苷或其药学上可接受的盐或前药共同施用。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述的其他活性化合物是JAK抑制剂，并且所述JAK抑制剂是Jakafi、托法替尼或巴瑞克替尼或其药学上可接受的盐或前药。
102.根据权利要求99所述的方法，其中所述一种或多种其他活性药物包括抗凝剂或血小板聚集抑制剂。
103.根据权利要求99所述的方法，其中所述一种或多种其他活性药物包括ACE-2抑制剂、CYP-450抑制剂或NOX抑制剂。
104.根据权利要求83至94中任一项所述的化合物在制备用于治疗或预防冠状病毒、黄病毒科、小RNA病毒科、布尼亚病毒科或披膜病毒科感染的药物中的用途。
105.根据权利要求104所述的用途，其中所述感染是冠状病毒科感染。
106.根据权利要求105所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2、MERS、SARS或OC-43。
107.根据权利要求106所述的用途，其中所述冠状病毒是SARS-CoV2。
108.根据权利要求104所述的用途，其中所述药物进一步包含一种或多种其他活性化合物，所述其他活性化合物选自由融合抑制剂、进入抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、抗病毒核苷、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、JAK抑制剂、血管紧张素转换酶2(ACE2)抑制剂、SARS-CoV特异性人单克隆抗体，包括CR3022，和不同或未知机制的药物组成的组。
109.根据权利要求108所述的用途，其中所述药物进一步包含瑞德西韦、N-羟基胞苷或其药学上可接受的盐或前药。
110.根据权利要求108所述的用途，其中所述药物进一步包含JAK抑制剂，并且所述JAK抑制剂是Jakafi、托法替尼或巴瑞克替尼或其药学上可接受的盐或前药。
111.根据权利要求108所述的用途，其中所述药物进一步包含抗凝剂或血小板聚集抑制剂。
112.根据权利要求108所述的用途，其中所述药物进一步包含ACE-2抑制剂、CYP-450抑制剂或NOX抑制剂。
113.根据权利要求108所述的用途，其中所述药物是透皮组合物或纳米颗粒组合物。
114.根据权利要求1至72或83至103中任一项所述的方法，其中所述化合物与NS5A抑制剂组合施用。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述NS5A抑制剂为达卡他韦。
116.根据权利要求73至82或104至113中任一项所述的用途，其中所述化合物与NS5A抑制剂组合施用。
117.根据权利要求116所述的用途，其中所述NS5A抑制剂为达卡他韦。
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