CN117752648A - 一种辣木单体在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种辣木单体在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明经过试验证明，辣木单体荭草苷呈剂量依赖性抑制破骨细胞分化，20μmol/L荭草苷效果更为显著；荭草苷可以抑制破骨细胞分化相关基因的表达；而且荭草苷是通过自噬途径抑制破骨细胞的分化的，其中荭草苷通过抑制自噬影响Akt/mTOR信号通路是抗破骨细胞活性的一个重要机制。因此，荭草苷可以作为一个破骨细胞分化抑制剂类药物，用于破骨细胞分化抑制剂以治疗相关疾病，而且作为活性药物前体，可用于破骨细胞抑制剂类药物的研发等。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种辣木单体在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用。
背景技术
破骨细胞是体内唯一负责骨吸收的细胞。它可由破骨前体细胞经过激活后分化形成具有功能的成熟的破骨细胞。由于分化成熟的破骨细胞可吸收骨质，其过度激活会造成骨质丢失、骨质疏松，所以由破骨细胞过度活化导致的疾病非常多，其中就包含炎症相关骨破坏类疾病，例如类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、牙周炎等。
牙周炎是由牙菌斑生物膜引起的，以牙龈炎症和牙槽骨丢失为主要特征的感染性疾病。牙周炎全球成年人中发病率约50％，发病率较高，会导致患者牙齿脱落、咀嚼功能障碍和营养不良，降低生活质量，对我国公共卫生系统造成严重的负担。牙周炎治疗关键是抑制牙周炎症进展和骨吸收，常规治疗方法是菌斑控制、龈上洁治及龈下洁治，在基础治疗结束后进行全身或局部药物治疗，常用药物为局部抗菌药物和非甾体类抗炎药。然而，这些药物只能延缓疾病进展，根本无法解决破骨细胞分化导致的牙槽骨吸收等，而且这些药物也具有明显的毒副作用，不能长期使用。
目前已知辣木可治疗免疫、胃溃疡、高血糖、高血脂、关节炎和结肠炎等疾病，然而，荭草苷对破骨细胞分化的作用，以及对体内牙周炎症和牙槽骨吸收的影响尚未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种辣木单体在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用。本发明经过试验证明，辣木单体荭草苷呈剂量依赖性抑制破骨细胞分化，20μmol/L荭草苷效果更为显著；荭草苷可以抑制破骨细胞分化相关基因的表达；而且荭草苷是通过自噬途径抑制破骨细胞的分化的，其中荭草苷通过抑制自噬影响Akt/mTOR信号通路是抗破骨细胞活性的一个重要机制。因此，荭草苷可以作为一个破骨细胞分化抑制剂类药物，用于破骨细胞分化抑制剂以治疗相关疾病，而且作为活性药物前体，可用于破骨细胞抑制剂类药物的研发等。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种辣木单体在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，所述辣木单体为荭草苷。
优选的，所述辣木单体通过自噬作用抑制破骨细胞分化。
优选的，所述药物由作为活性成分的荭草苷和药学上可接受的载体和/或添加剂组成。
优选的，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型、敷料剂型或者注射剂型。
优选的，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明经过试验证明，辣木单体荭草苷呈剂量依赖性抑制破骨细胞分化，20μmol/L荭草苷效果更为显著；荭草苷可以抑制破骨细胞分化相关基因的表达；而且荭草苷是通过自噬途径抑制破骨细胞的分化的，其中荭草苷通过抑制自噬影响Akt/mTOR信号通路是抗破骨细胞活性的一个重要机制。因此，荭草苷可以作为一个破骨细胞分化抑制剂类药物，用于破骨细胞分化抑制剂以治疗相关疾病，而且作为活性药物前体，可用于破骨细胞抑制剂类药物的研发等。
附图说明
图1为本发明实施例1中荭草苷对BMMs细胞活性的影响，其中：A)荭草苷的分子结构；B)CCK-8检测不同浓度荭草苷处理24、72和120小时BMMs细胞活力的结果；
图2为本发明实施例1中荭草苷抑制体外破骨细胞分化的结果，其中：A)显微镜下见多核细胞(≥3个核)，TRAP染色阳性的为破骨细胞；B)破骨细胞肌动蛋白环荧光染色，红色：鬼比环肽标记的肌动蛋白环，蓝色：DAPI标记的细胞核；C)测量TRAP+破骨细胞的数量和面积，各组间进行统计学分析；D)细胞染色后，用显微镜观察成熟破骨细胞的F-actin所占面积大小，各组间进行统计学分析，**P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001；
图3为本发明实施例1中荭草苷对体外破骨细胞相关基因表达的抑制情况，各组间进行统计学分析，**P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001；
图4为本发明实施例2中荭草苷抑制破骨前体细胞的自噬水平，其中：A)Beclin-1蛋白和LC3蛋白的WesternBlot分析；B)Beclin-1蛋白灰度值和LC3II蛋白灰度值，各组间进行统计学分析，ns表示无统计学意义*P<0.05，**P<0.01；C)MDC染色；
图5～图6为本发明实施例2中自噬激活剂雷帕霉素促进自噬逆转荭草苷抗破骨细胞分化作用结果，其中：A)Beclin-1蛋白和LC3蛋白的WesternBlot分析；B)Beclin-1蛋白灰度值和LC3II蛋白灰度值，各组间进行统计学分析；C)MDC染色；D)各破骨细胞相关基因DC-STAMP、C-Fos、TRAP、CTSK的mRNA表达水平；E)进行TRAP染色；F)测量TRAP+破骨细胞的数量和面积，各组间进行统计学分析；G)破骨细胞肌动蛋白环荧光染色，红色：鬼比环肽标记的肌动蛋白环，蓝色：DAPI标记的细胞核；H)细胞染色后，用显微镜观察成熟破骨细胞的F-actin所占面积大小，各组间进行统计学分析，**P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；
图7为本发明实施例2中荭草苷通过自噬途径影响破骨前体细胞中AKT/mTOR信号通路的情况，其中：A)WesternBoltting检测AKT/mTOR通路的蛋白表达水平；B)P-mTOR/mTOR、P-AKT/AKT的比值，**P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001；
图8为本发明实施例3中荭草苷对牙周炎大鼠生物毒性的分析结果；
图9为本发明实施例3中荭草苷对实验性牙周炎大鼠牙周炎症的减轻情况，其中：A)HE染色观察各组牙周组织的炎症改变；B)qRT-PCR分析大鼠牙周组织的炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-10的mRNA表达水平，**P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；
图10为本发明实施例3中荭草苷对体内牙周炎大鼠牙槽骨吸收的抑制情况，其中：A)Micro-CT重建三维；B)测量近远中CEJ-ABC的距离；C)TRAP染色图像，红色：TRAP+；D)观察各组TRAP+面积，**P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
本发明中使用的荭草苷购自MCE公司，货号：HY-N0405。
实施例1荭草苷抑制破骨细胞分化
1、荭草苷对骨髓间充质干细胞(BMMs)增殖的影响
荭草苷是一种水溶性类黄酮C-糖苷，可从多种药用植物中分离得到，从每克辣木水提取物中可获得10.5μg荭草苷，其分子结果如图1A所示。用不同浓度的荭草苷(0、10、20、40、80μmol/L)处理BMMs细胞24、72和120小时，使用CCK8检测细胞活力，结果如图1B所示。
结果表明：荭草苷对BMMs细胞毒性小，0-20μM细胞存活率大于80％，其余浓度对存活率有影响，但存活率仍较高。
2、荭草苷抑制体外破骨细胞分化
为了检测荭草苷对破骨细胞分化的影响，在α-MEM培养基中诱导破骨细胞，并分别设置空白对照组、破骨细胞分化因子RANKL处理组、10μmol/L荭草苷处理组和20μmol/L荭草苷处理组进行比较，处理5天后，对荭草苷处理后的细胞进行TRAP染色及F-肌动蛋白环形成的检测，检测结果如图2所示。
结果显示，破骨细胞分化因子RANKL可以诱导BMMs形成大量TRAP阳性多核的破骨细胞，加入荭草苷后，破骨细胞体积减小、数目减少，并且随着荭草苷浓度的增加，多核细胞的数量显著降低。此外，F-肌动蛋白环形成的检测显示荭草苷组的肌动蛋白环的周长与RANKL组相比变小，20μmol/L荭草苷效果更为显著。这些结果表明荭草苷呈剂量依赖性抑制破骨细胞分化。
3、荭草苷对破骨细胞相关基因表达的影响
为了进一步研究荭草苷对破骨细胞分化的影响，不同浓度荭草苷预处理细胞1小时，随后加入含或不含RANKL培养基培养5d，使用GreenqPCRSuperMix试剂盒(Transgen公司，货号：AQ101-01)通过实时定量聚合酶链反应分析破骨细胞相关基因DC-STAMP、C-Fos、TRAP、CTSK的mRNA表达水平。结果如图3所示。
结果显示，未诱导成破骨细胞组中的BMMs组中各基因的表达最低，破骨细胞组中各基因的表达最高，但在加入荭草苷处理后各基因的表达降低，并且随着荭草苷的浓度的增加而降低。这表明荭草苷可以抑制破骨细胞分化相关基因的表达。
实施例2荭草苷通过自噬影响Akt/mTOR信号通路进而抑制破骨细胞分化
1、荭草苷抑制破骨前体细胞的自噬活性
为了检测自噬在荭草苷介导的破骨细胞分化过程中的影响，使用不同浓度Ori预处理BMMs1小时，随后加入含RANKL的培养基处理3天。采用Westernblotting检测自噬蛋白LC3-II和Beclin-1的表达，结果如图4所示。
结果发现，与空白对照组相比，BMMs加入RANKL后，LC3II、Beclin-1的表达上升，表明自噬活性增加，而加入荭草苷后，LC3-II、Beclin-1表达量随着浓度的增加而下降。同时，MDC染色显示，与阴性对照组相比，RANKL组MDC荧光强度增加，细胞内酸性自噬泡呈点状分布，与RANKL组相比，荭草苷组细胞内的自噬泡减少。以上结果均表明，荭草苷能有效抑制体外破骨细胞的自噬活性。
2、自噬激活剂雷帕霉素促进自噬逆转荭草苷抗破骨细胞分化作用
为进一步证明自噬参与了荭草苷介导的抗破骨细胞分化作用，用自噬激活剂雷帕霉素处理破骨细胞，增强其自噬水平，具体操作方法为：20μmol/LOri和2μmol/L雷帕霉素预处理BMMs1小时，随后加入含RANKL的培养基处理3天，然后检测LC3-II、Beclin-1蛋白表达水平，结果如图5A～图5C所示。
Westernbolting结果显示，在加入雷帕霉素后，LC3-II、Beclin-1蛋白表达增加，加入荭草苷后，它们的表达降低了(图5A，B)。同样，MDC染色表明加入雷帕霉素后，细胞内酸性自噬泡点状分布更明显，而在加入荭草苷后，细胞内酸性自噬泡减少(图5C)。以上结果表明在雷帕霉素可以显著提高荭草苷刺激的破骨前体细胞中自噬水平。
进一步的，使用20μmol/L荭草苷和2μmol/L雷帕霉素预处理BMMs1小时，随后加含或不含RANKL培养基处理5d，通过实时定量聚合酶链反应分析破骨细胞相关基因DC-STAMP、C-Fos、TRAP、CTSK的mRNA表达水平。结果发现，雷帕霉素上调了被荭草苷抑制的TRAP、C-fos、CTSK、DC-STAMP的表达(图5D)。
同时，TRAP染色发现，与荭草苷组相比，荭草苷与雷帕霉素联合组明显增加了破骨细胞的生成(图6E，F)。与之一致的是，荭草苷抑制了肌动蛋白环的形成，而雷帕霉素逆转了荭草苷这种抑制作用并促进肌动蛋白环的形成(图6G，H)。
以上结果均表明自噬可能参与体外破骨细胞生成，并且说明了荭草苷通过自噬途径抑制破骨细胞的分化。
3、荭草苷通过自噬途径影响破骨前体细胞中AKT/mTOR信号通路
使用20μmol/L荭草苷和2μmol/L雷帕霉素预处理BMMs1小时，随后加入含RANKL的培养基3天，WesternBoltting检测AKT/mTOR通路的蛋白表达水平，结果如图7所示。
结果发现，荭草苷增加Akt/mTOR磷酸化表达，相反，加入雷帕霉素后降低了Akt/mTOR的磷酸化表达。这些结果表明，荭草苷可以促进破骨细胞前体细胞中Akt/mTOR信号通路的表达，而雷帕霉素会抑制破骨细胞前体细胞中的Akt/mTOR信号途径。因此，我们认为荭草苷通过抑制自噬影响Akt/mTOR信号通路是抗破骨细胞活性的一个重要机制。
实施例3荭草苷抑制牙周炎炎症与牙槽骨吸收
1、荭草苷对牙周炎大鼠的生物毒性分析
建立牙周炎动物模型，分为空白对照组，牙周炎组和荭草苷组。在处理后提取大鼠的重要脏器组织进行HE染色，检测荭草苷对SD大鼠的生物毒性，结果如图8所示。
结果显示，荭草苷安全性高，各脏器组织结构正常，未见明显病理学改变。因此，我们初步判断，荭草苷生物安全性高，不会产生不良反应。
2、荭草苷减轻实验性牙周炎大鼠的牙周炎症
为了研究荭草苷对大鼠牙周炎模型的作用，使用柱法(EZBioscience公司，货号：EZB-RN5)提取各组大鼠左侧上颌第一磨牙周围牙龈组织的TotalRNA，采用qRT-PCR法检测炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-10的表达，结果如图9所示。
结果发现与牙周炎组相比，荭草苷组的促炎因子TNF-α、IL-1β表达显著降低，而抗炎因子IL-10则升高(图9A)。H&E染色显示牙周炎组的牙周组织中见大量的炎性细胞浸润，然而荭草苷组炎症细胞的数量明显减少(图9B)。以上结果表明局部应用荭草苷可减轻大鼠牙周炎模型的牙周炎症。
3、荭草苷抑制实验性牙周炎大鼠的破骨细胞分化及牙槽骨吸收
为了检测荭草苷对牙周炎大鼠模型中破骨细胞分化及牙槽骨吸收的作用，截取大鼠左侧上颌牙槽骨，通过Micro-CT扫描和图像重建对牙槽骨吸收情况进行评估，结果如图10所示。
结果显示，空白对照组中牙槽骨高度靠近釉牙骨质界，无明显吸收，牙周炎组见牙槽骨吸收严重，根分叉暴露明显，但是荭草苷治疗组牙槽骨吸收程度有明显好转(图10A)。我们测量各组近远中釉牙骨质界至牙槽嵴顶(CEJ-ABC)的距离，结果发现与牙周炎组相比，荭草苷组CEJ-ABC距离缩短(图10B)。随后我们进行TRAP染色观察大鼠左侧上颌第一磨牙周围牙槽骨中破骨细胞数目，发现牙周炎组TRAP染色中破骨细胞数目较多，而荭草苷组的破骨细胞数目表达明显降低(图10C，D)。这些结果表明，荭草苷可以抑制体内破骨细胞的生成及牙槽骨吸收。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种辣木单体在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，其特征在于，所述辣木单体为荭草苷。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述辣木单体通过自噬作用抑制破骨细胞分化。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物由作为活性成分的荭草苷和药学上可接受的载体和/或添加剂组成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型、敷料剂型或者注射剂型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型是药学上可接受的口服剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂。
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