CN117751286A - 生物传感器 - Google Patents

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Abstract

一种生物传感器，其包括：·‑第一基板和第二基板(1,2,10)，所述第一基板和所述第二基板在其间限定空腔；感测结构，所述感测结构具有在所述空腔内设置在所述第一基板(1,2)上的功能化活性表面(4)；·‑流动控制结构(11)，所述流动控制结构设置在所述第二基板(10)上并延伸到所述空腔中，其中所述流动控制结构的远端与所述感测结构之间的间隙提供跨所述功能化活性表面(4)的流体流动通道；以及·‑入口孔口(15a)，所述入口孔口在所述流体流动通道的一端处邻近所述流动控制结构(11)的近端，以及出口孔口(15b)，所述出口孔口在所述流体流动通道的相对端处；其中所述流动控制结构(11)被成形和配置成使得在使用中，在所述入口孔口(15a)处注入的流体流入并通过所述流体流动通道到达所述出口孔口(15b)，从而在所述功能化活性表面(4)上施加剪切力。

Description

生物传感器
技术领域
本发明一般涉及具有活性传感器表面的生物传感器，诸如基于石墨烯的生物传感器，用该生物传感器检测生物分子的方法，以及制造该生物传感器的方法。具体地，但不一定排他地，本发明涉及具有图案化且化学功能化的石墨烯表面的生物传感器。
背景技术
用于检测生物分子的传感器(称为生物传感器)已广为人知并用于诊断测试，诸如即时测试(POCT)。即时测试本质上是在患者现场或附近进行的诊断测试，其结果导致患者护理的潜在变化。此类诊断测试用于检测从患者收集的生物样本中的生物分子。在本公开的含义内的生物分子是由活有机体产生或存在于活有机体中的有机分子。术语‘生物分子’包括但不限于自然界中存在的聚合物分子及其类似物，诸如蛋白质、多糖和核酸(包括合成核酸)以及小分子，诸如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。
除了光学和其他方法之外，许多生物传感器依赖于在检测到生物分子存在或不存在时生成电信号的一般原理。结构化半导体材料在一些情况下用于形成微米级(micro-scale)或纳米级(nano-scale)的通道或其他结构。
最近，石墨烯因其独特的物理和化学特性而引起了人们的兴趣以用于生物传感器中。它具有1000西门子每米的电导率，并且热导率在1500与2500Wm-1K-1之间。此外，它表现出广泛的电化学窗口和低电荷转移电阻，并且能够通过添加影响其反应性的生物受体来功能化。
GB2471672B描述了一种石墨烯生物传感器，该石墨烯生物传感器包括生长在SiC基板上的图案化石墨烯层。图案化石墨烯结构包括至少一个通道，并且电触点设置在通道的任一侧上，使得电流可以通过该通道。该通道通过受体形式的连接体进行功能化，该受体对附着在石墨烯表面的目标(生物)分子具有结合亲和力。此类连接体的一个示例源自将硝基苯附着至石墨烯表面并且随后将其电化学还原为苯胺，尽管其他连接体对于化学官能化/固定化领域的技术人员来说是已知的。在使用中，当一种或多种目标生物分子附着到功能化通道并且电流沿着通道通过时，可以测量传感器的电特性的变化(由目标生物分子引起)。
石墨烯生物传感器的这种配置被称为石墨烯场效应晶体管(GFET)。由于石墨烯的高表面积与体积比，即使最小浓度的附着的生物分子也会改变通道的电导率，使得GFET生物传感器成为用于感测多种物质(诸如酶、过氧化氢、多巴胺和还原型b-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)分子)的有吸引力的平台。化学电阻生物传感器也是已知的，其中在生物传感器中测量的电阻随着目标生物分子的增加而增加。另一种类型的石墨烯生物传感器测量分析物(或目标生物分子)结合在功能化石墨烯表面上时液体门控GFET的漏源电流和所谓的狄拉克点(电荷中性点)位移。
基于石墨烯的生物传感器的主要优点是其多功能性和其感测各种不同生物分子或分析物的灵敏度，取决于石墨烯表面的功能化以及用于感测和量化它们的电测量。然而，基于石墨烯的传感器的性能可能会受到许多典型问题的不利影响。
该领域的一个重要的已知问题被称为非特异性吸附(NSA)。NSA(也称为非特异性结合或‘生物淤积’)是由于非特异性生物物质(即目的目标生物分子以外的物质)在活性传感器表面的不可逆吸附而发生的，这会对生物传感器的灵敏度和准确性产生不利影响，并且在POCT设备中尤其成问题，该设备不支持在物质结合阶段之后和电子检测/测量结果之前立即严格清洁传感器表面。传感器表面上NSA的存在会‘阻挡’活性区域，从而降低生物传感器的灵敏度和选择性(例如，给出假阳性结果)。在一些情况下，NSA的存在还增加被称为‘背景噪声’的基线，这反过来降低生物传感器的检测极限，因为较低浓度的目标生物分子可能被掩盖。这种与目标生物分子无法区分的噪声信号以及活性表面积的任何阻挡都会降低传感器的性能(即灵敏度、再现性和动态检测范围)。在实验室中，可以通过使用吐温-20混合磷酸盐缓冲溶液(PBS)或仅使用PBS严格清洁传感器以将NSA从传感器表面去除，但这对于小型封闭式POCT系统来说是一个严峻的挑战，因为此类传感器清洗设置不能并入其中。
因此，在生物传感器领域中，一直希望在传感器表面处抑制NSA和/或去除NSA，以提高生物传感器性能。
为此，已经提出了许多NSA抑制和/或去除的方法。此类方法可以分为两大类，分别是被动方法和主动方法。被动NSA抑制或预防方法可以进一步分类为物理钝化或化学钝化。物理钝化方法旨在通过用封闭剂(诸如蛋白质涂层(例如，牛血清白蛋白(BSA)))涂覆或封闭未反应的活性表面来防止NSA，这抑制NSA，但已被证明具有高批次间变异性，表现出交叉反应性并改变原始表面特性(从而影响传感器功效)。另一方面，化学钝化方法导致费力的功能化过程、高背景信号和对活性传感器表面造成损坏的可能性，以及维持活性传感器表面的长期化学稳定性的挑战。总体而言，使用钝化方法的NSA抑制，无论是物理的还是化学的，经常涉及使用通常不适合许多生物应用的刺激性化学物质。
相比之下，主动NSA抑制/去除方法已成为生物传感器领域中针对这一问题的更有前景的解决方案。此类主动方法可以分类为基于变换器的方法或基于流体的方法。基于变换器的方法使用机电波或声波进行NSA去除。基于流体的方法尚未得到广泛应用或记录，其旨在使用压力驱动的微流体流动以形成剪切力，以从传感器表面去除NSA分子。基于变换器的方法的主要缺点是需要额外的受控设备。另一方面，基于流体的NSA去除方法需要在感兴趣区域(ROI)进行精确的流体操作以有效地去除NSA。此外，在这方面已经记录的少数此类方法中，需要对非目标物质进行电泳比对以实现期望的效果。
目前的生物传感器系统依赖于NSA抑制和/或去除的被动方法或主动方法。然而，现有技术的生物传感器尚未提供为解决上述问题而提供有效、可重复且强大的解决方案的NSA抑制/去除方法。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种生物传感器，其包括：
第一基板和第二基板，该第一基板和该第二基板在其间限定空腔；
感测结构，该感测结构具有在所述空腔内设置在第一基板上的功能化活性表面；
流动控制结构，该流动控制结构设置在所述第二基板上并延伸到所述空腔中，其中流动控制结构的远端与感测结构之间的间隙提供跨所述功能化活性表面延伸的流体流动通道；以及
入口孔口，该入口孔口在所述流体流动通道的一端处邻近流动控制结构的近端，以及出口孔口，该出口孔口在流体流动通道的相对端处；
其中流动控制结构被成形和配置成使得在使用中，在液体入口孔口处滴下/注入的流体流入并通过流体流动通道到达所述出口孔口，从而在所述功能化活性表面上施加剪切力。
本发明的各个方面在独立权利要求中阐述，并且附加的和/或任选的特征在所附的从属权利要求中阐述。本发明的这些和其他特征将从以下详细描述中变得显而易见。
附图说明
现在将仅通过示例并参考附图来描述本发明的实施例，其中：
图1是根据本发明的示例性实施例的单个生物传感器的示意性剖视图；
图2是图1的生物传感器的底部封装的示意性剖视图；
图2A至图2C是在制造过程的三个相应步骤处根据本发明的示例性实施例的生物传感器的石墨烯孔的示意性平面图，即分别是：具有底部金属触点(16,17)、具有顶部金属夹持(18)、以及具有钝化层(19)；
图3是图1的生物传感器的顶部封装的示意性剖视图；
图4是根据本发明的示例性实施例的多生物传感器装置的示意性剖视图；
图5是根据本发明的示例性实施例的四分之一生物传感器装置的示意性透视图；并且
图6是根据本发明的示例性实施例的多生物传感器装置的示意性剖视图。
具体实施方式
在下面的详细描述中，描述了本发明的实施例以及关于示例性基于石墨烯的传感器芯片组的完整晶圆级制造过程，该传感器芯片组结合了新颖的微流体和芯片组封装，其旨在提供以下中的一项或多项，即，i)高传感器特异性，同时通过单个芯片组上被动和主动NSA去除方法的组合优势而产生基本上完全的NSA去除；ii)静电辅助结合/固定以改善周转时间(TAT)；以及iii)实时多重电量化(MEQ)，既有化学电阻又有GFET。然而，应当理解，一些实施例可以仅包括这些特征中的一个特征或一些特征，并且虽然本文详细地描述了优选实施例，但本发明不一定旨在限制已描述的特征的任何特定组合，除非本发明的范围由所附权利要求清楚地限定。
使用灵敏、选择性、快速且经济高效的POCT系统早期检测疾病生物标志物对于疾病预后/诊断和实时患者健康监测至关重要。特定疾病生物标志物与生物传感器表面的附着对于开发此类简单、快速和多重的感测平台来检测具有高特异性和灵敏度的各种分析物是关键的。近年来，多种免疫测定形式(例如ELISA、电化学、化学电阻、光学、磁性等)已被证明/报告可用于同时检测来自参考混合物中的多种分析物。此外，为了提高分析物捕获效率，已经开发了几种方法，包括使用传感器表面的化学修饰来扩散混合分析物，并辅以利用复杂的微流体通道的受控流体流动。无论它们的性能和功能如何，由于需要复杂的电子/磁检测程序和操作控制系统，将其纳入需要简单的现场电子诊断系统的资源有限的环境(例如POCT)中是受限制的。最近，碳纳米管(单壁碳纳米管(SW-CNT)或多壁碳纳米管(MW-CNT))已显示出作为生物传感器的巨大的潜在应用。同样，石墨烯(六边形连接碳原子的单原子厚膜)通过使用针对特定生物标志物的生物探针对其表面进行功能化，在生物传感器领域提供了潜在的应用。在过去的十年中，已经报道了高灵敏度(基于电化学、化学电阻和场效应晶体管)的基于石墨烯的生物传感器。
本发明的实施例旨在提供一种基于石墨烯的生物传感器芯片组，其可以解决三个重要问题中的一个或多个，即1)通过(接近)绝对去除NSA来实现高特异性，2)减少TAT以及3)准确且强大的分析物量化，这一问题迄今为止阻碍了用于POCT系统的健全的电子生物传感器的开发。
因此，本发明的第一方面解决NSA抑制/去除并且旨在显著减少或基本上消除来自ROI(即传感器表面)的NSA分子。在如下文所述的本发明的示例性实施例中，这是通过独特的开环/闭环微流体通道并使用温和的电(ac)或电磁搅拌来实现的，其中微流体通道产生增强的流体动力剪切力和流体在目的区域上的定向流动。如本领域技术人员已知的，封闭剂也可用于进一步增强NSA抑制。
本发明的第二方面旨在改善周转时间(TAT)。显然，使生物传感器、尤其是POCT装置中的TAT最小化是一个关键因素，并且在以下示例性实施例中，这是使用静电结合并且通过在埋藏在功能化传感器表面之下的电容电极处施加静电势(DC电势)来提高此类结合的速度来实现的。
本发明的第三方面解决了对(接近)实时MEQ的需求，并且为此使用化学电阻测量和GFET测量两者。利用新颖的处理模块可获得(接近)实时MEQ，该处理模块被配置为在分析物结合时收集化学电阻和狄拉克点位移数据，并使用信号处理技术对目标生物分析物进行分析量化。
应当理解，在下面的详细描述中，对诸如“上”、“顶”、“底”、“下”、“下方”、“侧”等方向性术语的任何引用仅使用关于(并且仅适用于)如附图中所示的装置的定向，并且这些术语绝不旨在限制装置在使用中的定向。
参照附图中的图1，提供了根据本发明示例性实施例的生物传感器装置的示意性剖视图。该示例的装置包括可用于生物分析物的多重电量化(MEQ)的石墨烯传感器，其中提供电/电磁辅助流体搅拌和在开放/封闭微流体通道中的目的区域上的强制流体传播，连同石墨烯的静电偏压以改善TAT。为了晶圆级制造的目的，该装置包括两个独立的部分，即底部封装100和顶部封装200。如下文将更详细描述的，底部封装100包括石墨烯FET、微流体通道、入口储存器、孔/腔和外部储存器，而顶部封装200包括固体基板(例如，玻璃或其他光学透明材料/半透明材料)、梯形圆顶、和聚合物微流体通道、流体控制阀和样品输送系统。当与‘底部’封装100集成时，‘顶部’封装200形成用于生物分析物的MEQ的完整传感器平台。在本文描述的特定示例性实施例中，参考了用于检测心脏生物标志物蛋白的基于石墨烯的生物传感器，但是应当理解，本发明不旨在限制在这方面。
另外参考附图的图2和图2A至图2C，装置的‘底部’封装100包括基于石墨烯FET的生物传感器。在‘底部’封装100的制造方法中，将CVD生长的石墨烯4直接转移到预沉积的金属触点(包括Ag/AgCl参考电极12)上，其中在常见的实施方式中，石墨烯沉积在SiO2/Si上或(在该特定的示例性实施例中并且为了提高传感器系统的性能的目的，诸如降低石墨烯传感器的狄拉克点)沉积在自组装单层(SAM)涂覆的电介质/绝缘SiO2/Si基板1、2上。如在附图的图2A中可以更清楚地看到的，石墨烯通道4a在石墨烯转移和清洁过程之后被图案化。如微装置制造领域的技术人员已知的，基于石墨烯FET的生物传感器可以例如在面向研究的洁净室中可靠地制造，并且其CVD石墨烯通道4a有效地充当用于检测生物分析物的活性通道。如附图的图2A所示，电极16位于基板2上每个石墨烯通道4a的一端处的‘下方’，并且金属触点17在所有石墨烯通道4a的其相对端处的‘下方’延伸。在图2B中，可以看到顶部金属夹持层18，其将石墨烯通道4a的每一端夹持到一端处的相应电极16和另一端处的触点17。在图2C中，可以看到钝化层19，其覆盖基板2上除石墨烯通道4a和参考电极12之外的所有结构。
石墨烯通道(在附图的图1和图2中一般表示为‘4’)用合适的连接体5固定，并且所使用的探针分子6将取决于待检测的分析物(例如，在这种情况下，心脏生物标志物蛋白)。用于化学功能化石墨烯通道的合适方法描述于例如GB专利号2471672中，并且除其他方法之外，该方法对于本领域技术人员来说是已知的。因此，本文将不再进一步详细讨论制造方法的这个方面。
多个此类‘全石墨烯’FET可以被制造在单个基板上并且通过微流体通道15流体地联接在一起，使得分析物8(流体)可以被输送到每个装置的活性(功能化)石墨烯区域上，如在下文将参考附图中的图4进行更详细的说明和描述。在附图的图1中，微流体通道15a限定用于所示生物传感器的入口孔口，该入口孔口被限定在基板2上的第一光致抗蚀剂结构9a(例如任何生物相容性聚合物，诸如SU8)与邻近顶部封装200(如下文参考附图中的图3所述)上的圆顶11的近端(最大直径底部)的基板10之间。第二聚合物结构9b设置在功能化活性表面4的相对边缘处，并在其远端和顶部封装200的基板10之间限定出口孔口15b。因此，在使用中，流体经由入口孔口15a进入生物传感器并流过限定在圆顶11的远端(较小直径底部)与功能化活性表面4之间的流体流动通道，到达出口孔口15b。第三光致抗蚀剂/聚合物结构9c设置在基板2上，与第二光致抗蚀剂/聚合物结构9b间隔开，使得外部储存器29被限定在第二光致抗蚀剂/聚合物结构和第三光致抗蚀剂/聚合物结构之间。多孔聚合物轨道13设置在顶部封装200的基板10上，其延伸到外部储存器29中，并且针孔(约50-100μm)设置在邻近外部储存器29的端部(即，靠近第三光致抗蚀剂/聚合物结构9c所在的位置并且在出口孔口15b的下游)的顶部封装200的玻璃基板10中，如下文将参照附图中的图3更详细地描述的。
另外参考附图中的图3，生物传感器装置的‘顶部’封装200包括固体(有益地透明/半透明，例如玻璃)基板10、梯形圆顶11、在圆顶11上的Ag/AgCl参考电极12’以及玻璃中的小直径针孔14(约50-100μm)。定制圆顶11可以由诸如PDMS、SU8等的聚合物使用例如本领域技术人员熟悉的旋涂/丝网印刷技术在玻璃基板10上形成。此外，可将高度多孔的聚合物沉积(例如，使用旋涂/喷涂或丝网印刷)在固体基板10的边缘处，以便将聚合物并入多传感器封装的外部储存器29(参见图4)中。这种聚合物有助于确保流体沿一个方向流过装置，并有助于避免由于吸收液体而回流。此外，多孔聚合物层可防止传感器中的流体溢流。
现在再次参考附图的图4，顶部封装200与底部封装100集成以提供多传感器布置，传感器通过微流体通道15流体地联接在一起。顶部封装200在底部封装100的顶部上对准，使得每个梯形圆顶11精确地对准在相应的其间具有小间隙的石墨烯通道4a和外部储存器29中的多孔聚合物轨道13的‘上方’。微流体构造进一步包括入口27、孔28(在圆顶11和相应的功能化传感器表面之间)以及外部储存器29(每个传感器的下游)。血浆分离膜25设置在跨入口27上。例如，微流体通道15、入口27、孔28和外部储存器29可以使用生物相容性环氧基SU8光致抗蚀剂来制造。有利地，孔28通过第一SU8沉积形成，并且互连的微流体通道15可以通过第二SU8沉积形成，但是本发明不一定要在这方面受到限制。任何合适的聚合物都可以用于微流体的制造，并且本发明决不限于使用SU8。其他合适的聚合物对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在本发明的该特定示例性实施例中，使用基于生物素-链霉亲和素-生物素的三明治型化学来将探针分子6固定到石墨烯4上。如本领域技术人员所熟悉的，使用此类连接化学将特定探针(例如，如在这种情况下，用于心脏生物标志物检测)固定到石墨烯上。
以电化学领域技术人员熟悉的方式，可以经由上述电极向每个活性传感器表面4施加温和的交流电流体动力或电磁搅拌。在传感器表面上形成的任何NSA分子都会因此类搅拌而‘松动’。在一种示例性方法中，NSA去除可以与测试过程分开进行，或者可以将它集成到测试过程中，这取决于所进行的测试的类型以及所需的准确性和特异性等因素。因此，在示例性方法中，样品流体经由入口27滴入/注入到装置中，并且流过微流体通道15。在滴入/注入到传感器装置中之前，如此滴入/注入的样品流体可以与稀释流体(诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS))混合。或者，可以首先滴入/注入样品流体，随后注入稀释流体，稀释流体与样品流体混合并且使混合物流过传感器并流过传感器表面。测试流体中的目标分子与探针分子6结合。在传感器表面上形成的任何NSA分子都会因上述搅拌而‘松动’，并且通过流体流过装置(并且流过传感器表面)而使其从传感器表面分离。换句话说，流过微流体通道15的压力驱动流体用于将NSA分子从活性传感器表面分离。然后流体流入相应的外部储存器29中，并且多孔聚合物块13用于防止流体由于液体的吸附而沿相反方向的任何回流。当然，也可以在活性传感器表面上提供封闭剂(例如蛋白质涂层，诸如牛血清白蛋白(BSA))以抑制其上的NSA。此类NSA抑制的被动方法是本领域技术人员所熟悉的，并且用于增强本发明的该示例性实施例的NSA抑制/去除方法。
在上述实施例中，稀释的测试流体起到去除NSA的作用。然而，在替代实施例中，传感器装置内的样品流体的稀释可以与NSA去除步骤分开进行。在这种情况下，如上所述，在稀释测试样品之后，可以将流体(诸如PBS)注入装置中，以实现NSA去除。这可以经由与用于将测试样品和稀释流体输送到活性传感器表面的微流体通道相同的微流体通道15来实现。在这种情况下，并且在一些实施例中，可能需要一个或多个微流体阀以防止两种流体之间的回流和交错流混合。在替代实施例中，可以提供分离的微流体通道布置。
如前面部分所讨论的，现在描述本发明特定示例性实施例的微流体设计的计算和模拟，以证明其实际可行性。为了将NSA分子从活性表面壁上分离，剪切应力和剪切力是关键参数，并且本发明的方面提供了使用微流体对这些特性施加极大控制的可能性。需要施加适当的剪切应力，同时确保活性传感器表面上的流态是层流。通过使用微流体设计调整通道高度可以实现和控制层流流动和剪切应力。图4示出了如上所述与微流体集成的示例性四分之一生物传感器装置。通道尺寸在传感器表面位置处被圆顶11减少，并且梯形圆顶11被配置为生成剪切力并且维持层流流动(Re<2300)。目的区域(活性表面区域)与圆顶结构之间的高度间隙及其尺寸定义了生成的剪切力和压力。高度间隙越小，通道中生成的剪切力就越大。此外，剪切力也可以通过入口流动速率来控制。从理论计算和建模中可以看出，改变通道高度对剪切应力的影响比改变流速更大。如上所述，为了生成较高的剪切应力，高度间隙需要很小，但流动的性质也应该是层流的。去除NSA分子所需要的剪切力取决于分析物分子与探针分子之间的键解离能。通常，由于特异性，探针与分析物分子之间的键解离能较高，并且分离连接体、探针和分析物所需的剪切力比去除NSA分子所需的剪切力更大，特别是如果它们已经通过交流电流体动力或电磁搅拌而松动。因此，分析物溶液中存在的剩余非特异性分子与传感器表面的结合较弱(物理吸附)。这些物理吸附的NSA分子可以相对容易地从传感器表面分离，所用的剪切力比去除探针和分析物分子所需的剪切力要小。当然，所需的剪切力取决于用于传感器表面制造的连接体、探针和分析物的类型。然而，目标是生成足以去除NSA分子的剪切力。
理论模型表明，当R/h<0.25时，室上的流体剪切应力等于壁上的剪切应力，其中R是室的直径，并且h是微流体通道的高度。所需的壁剪切应力，或简单地去除NSA分子的剪切应力，取决于室的总结合力。分离具有一定直径的分子所需的通道高度可以根据理论计算来估计。已经观察到，较小的通道高度对分子产生较高的剪切应力。例如，可以进行计算建模来确定去除NSA分子所需的尺寸和剪切力。可以优化圆顶的角和边缘尺寸，以最大限度地减少孔中的压降。基于多物理场的建模可以用来形成合适的具有圆顶的微流体设计。
在示例性测试方法中，可以在一段时间内(例如15s)注入(经由入口进入传感器装置)样品流体。由于入口部分之前的扩散，平滑的脉冲进入传感器，这可以通过流动室入口处的高斯分布来描述。附图中描述和图示的设计导致在狭窄的目的区域(即在传感器表面上)上产生更大的剪切应力，并且由于通道高度的差异而在通道的其余部分中产生更低的剪切应力。连接体、探针和分析物分子之间的键解离能根据它们的化学特性而变化。需要约2-10Pa的NSA去除剪切应力，以确保表面清洁而不使目标分子从传感器表面解离。可以精确地调整圆顶与ROI之间的间隙，以实现所需的剪切力，以最大限度地去除NSA，同时保持探针-分析物键完整及/或将固定探针从传感器表面解离。如上所述，通过控制剪切力，可以从表面去除所有弱结合的NSA分子。对于本领域技术人员来说是显而易见的，所需的剪切力可以根据理论计算来估计，并且取决于用于检测的连接体和探针分子的类型。一般来说，去除NSA分子所需的剪切力约为粘合强度的50％。通过改变微流体通道尺寸，特别是圆顶与活性通道之间的高度间隙，可以根据要求调节剪切力。
如上所述，本文所示和描述的装置不仅用于去除NSA，而且还提供分析物流体的定向流动。定向流动(防止回流)对于避免分析物被NSA分子污染至关重要。否则，传感器可能会显示大量背景噪声，并且对于识别原始分析物信号是有挑战性的。‘顶部’封装200的玻璃基板10中的针孔14有助于防止通道或孔中分析物流体流动的阻挡，这可能是由内部气压的累积引起的。针孔14可以被透气的聚合物(例如薄的PDMS聚合物)层覆盖，其仅允许空气通过并且阻挡流体。如上所述，该完整的顶部封装200需要与底部封装100对准，这形成用于分析物流体流动的流体通道。所描述的装置设计还适合用于在制造过程中固定连接体、探针和封闭剂，以及在正常使用期间促进上述NSA去除。
因此，在制造过程中，顶部封装100和底部封装200是分开制造的。底部封装的石墨烯通道4可以与相应的基于微针的喷嘴对准，以在通过对准顶部封装和底部封装来完成封装过程之前将一定量的功能化流体输送至孔/空腔内的活性表面。通过使用这种设计的装置，可以同时对每个孔/空腔进行功能化并且不会交叉污染。例如，这使得可以提供包括多个孔/空腔的多重生物传感器装置，每个孔包含多个石墨烯通道，其中石墨烯表面被功能化以吸引不同的目标分子。这可以在纳米级和非常快速的制造过程中实现。
使用剪切力去除NSA分子的方法的重要要求之一是以最小的压降在整个目的区域中保持基本上均匀的剪切力。理想地，为了有效去除NSA分子，通道中应该有很小的压降或没有压降。然而，目的区域(ROI)中的通道长度与压降之间总是存在权衡。较长的通道长度导致通道内显著的压降，这不利于均匀去除NSA。如上所述，在目的区域通道高度降低，以实现更高的剪切力，同时确保流动保持层流。本发明结合了微流体技术和分析物流体的电搅拌以有效去除NSA分子。流体动力剪切力可以通过改变生物传感器中ROI上的微流体通道尺寸来调节。同时电脉冲搅拌有助于将NSA分子从表面去除。
因此，总而言之，与目标分析物分子相比，大多数NSA分子被物理吸附或弱结合到传感器表面。一般，目标分析物分子经由强化学相互作用与特定探针/受体结合。与物理吸附的NSA分子相比，特定探针与分析物分子之间的键解离能较高，并且需要更高的剪切力来解离键。通过调整适当的剪切力，可以从表面去除弱结合的NSA分子。在本发明的示例性实施例中，针对基于生物素-链霉亲和素的连接体优化了所需的剪切力。所描述的设计不仅去除了NSA，而且还提供了分析物液体的定向流动。本发明的各方面提供了去除NSA并将NSA分子从活性表面分离的有效方法。
在现有技术的生物传感器中，可以通过从化学电阻、电化学和/或场效应晶体管传感器收集平均独立电信号来实现免疫传感器的量化。然而，没有现有技术的生物传感器结构提供独特的方案，从而收集来自单个传感器装置的两种或更多种类型的信号并用于提供健全的平均量化。在本发明的各方面中，装置结构提供多重电量化(MEQ)，同时在单个装置平台上测量化学电阻和液体顶部/底部门控G-FET信号。因此，它提供了测量的生物测定数据的健全的平均量化(化学电阻加液体门控FET信号的平均)。实时MEQ可以通过处理模块来实现，该处理模块被配置为在分析物结合时收集多个数据并进行信号处理以生成作为目标生物分析物的分析量化的平均百分比变化输出。
快速的传感器响应时间或实现较小的TAT是生物传感器领域的另一个关键挑战，特别是对于用于诊断危重患者和/或紧急情况下的POCT装置，其中速度和准确性是重要的。TAT主要取决于生物物质(探针和分析物分子)与石墨烯表面之间的化学反应动力学，这由生物物质在稀释溶剂中的扩散速率进一步定义。
在本发明的实施例中，生物物质(探针和分析物分子)结合/固定可以通过埋藏在活性石墨烯通道区域下方的电极的电偏压来加速。电极上存在的相反电荷(电偏压)有助于改善反应动力学，同时将生物分子从溶剂溶液吸引到石墨烯表面。这种静电辅助探针/分析物结合导致较短的周转时间(TAT)，这是POCT装置非常需要的。
因此，与现有技术装置相比，上述石墨烯生物传感器装置(并且代表本发明的示例性实施例)可以增强生物传感器的灵敏度、选择性、检测极限和再现性，并且提供对背景噪声的增强的抑制。
在进行临床诊断时，非常希望最大限度地减少POCT系统的手动操作。本发明的各方面的目的是提供一种用于实际样品收集、稀释、输送以及进行特定分析物的灵敏度检测的健全的自动系统，同时通过上述所提出的主动NSA去除方案实现最大程度的NSA去除。
参考附图中的图6，其示意性地示出了具有替代顶部封装结构的传感器芯片封装。应当理解，在存在与上述实施例的特征相同的特征的情况下，在图6中使用相同的附图标记。图6所示的封装包括一对微型阀，其可以使用电磁/机电装置致动，从而提供一定程度的样品混合、稀释和通过空气/流体压力控制的NSA去除的自动化。自动化的优点是精确控制流体流动、去除NSA所需的压力和TAT。
生物传感器封装在使用时的描述如下；
1.原始样品输送和稀释：样品输送平台可以包括第一O形环33，其可以由
PTFE或另一种合适的材料制成，在该示例性实施例中，其具有约2-3mm的内径和约5-7mm的外径，其可以支撑(粘附)在软橡胶第二O形环35上，第二O形环35的内径为约2-3mm，并且外径为约5-7mm。第一O形环33和第二O形环35可以进一步支撑具有适当体积的锥形聚合物移液管36以容纳约2-10μL的血液样品。第一O形环33、第二O形环35和移液管36都是基板组件的一部分。这些组件的功能如下：
a.第一O形环33(例如PTFE/特氟龙垫圈)：用于收集并引导血液从指尖进入移液管36；
b.第二O形环35(例如软橡胶)用作第一O形环33(例如PTFE/特氟龙垫圈)和(例如PTFE)移液管36的缓冲垫。
c.移液管(类似结构)36：用于容纳血液样品并通过质膜25过滤血浆。
移液管内的膜25还有助于将稀释溶剂(例如，PBS)保持在储存器21中并避免在运输期间通过移液管泄漏。根据应用的类型(例如，
为了分析食品加工厂中的清洁水以检测食品加工中的过敏原或任何其他不涉及血液、质膜(具体来说，可能不一定是所需要的))，膜25可以由多孔膜代替。由第一O形环33的内径和移液管36在膜25上方的部分构成的体积可以限定稀释之前的原始样品的体积。
可以通过触摸第一O形环33的中心处刺破的手指来直接输送血液样品。通过质膜25过滤的血浆可以与稀释通道/储存器21中预存的稀释介质(例如，PBS)混合，以提供预定的样品浓度。另一方面，不涉及血液的样品可以通过微移液管直接输送到第一O形环33中，以便穿过(在这种情况下是多孔的)膜25以与储存器21中的稀释流体混合。储存器21的尺寸和设计可以确定稀释流体的体积，并且因此储存器21可以被设计成利用由移液管的体积限定的给定体积的原始样品来实现100、200、500等样品稀释。或者，通过电磁/机电驱动阀(类似于本实施例中所示的第一阀30和第二阀31，并在下文中描述)，可以将固定体积的稀释流体从构造顶部封装(图6中未示出)的另一个储存器输送到通道/储存器21中。例如，如中国专利号CN104132613中所述，移液管中原始样品的体积还可以通过非接触式光学体积测量来精确估计。非接触式光学体积测量的组件可以与电子读出系统集成。在这种情况下，样品输送平台的所有关键组件都需要是生物相容性的。
2.稀释样品输送：第一微型阀30可以由铁磁材料或任何聚合材料(例如PTFE/
特氟隆等)组成，其设计方式使得其最初阻挡稀释样品输送至位于空腔28中的传感器。然后，第一阀30由安装在电子读出系统中的电磁/机电开关致动，以打开阀并控制流体的流动。第一阀30的电子致动(打开/关闭)可以通过结合有数据分析方案的软件程序来编程，使得可以实现流体流动的自动化。事实上，利用稀释样品的给定流速和第一阀30的时间切换，可以限定待输送到传感器表面的样品剂量(以μl为单位)。
3.通过受控压力的NSA去除：通过ROI上的剪切力实现NSA去除。适当大小的剪切力可以通过由活塞形的第二阀31吹送加压空气/流体来实现。第二阀31可以由铁磁材料或任何聚合材料(例如PTFE/特氟隆等)组成，并且可以支撑软聚合圆盘37。适量的流体可隐藏在顶部封装内的外壳38中，在一端保持活塞阀31，并且在另一端保持多孔膜39。多孔膜39可透过加压空气/
流体。使用工业规模的自动化制造方法以及在制造顶部封装时，外壳38可填充并储存空气/流体，并且储存器21可填充稀释流体，以及第一O形环33、第二O形环35的装配以及移液管36与膜25的组装。同样，第二阀31的致动可以通过电磁/机电布置来进行，如上面第2段中所讨论的。该第二阀31的目的是提供所需的NSA效果，同时通过膜39将空气/流体推入腔室，其用于在ROI处生成所需的压力，以从传感器表面(在这种情况下，为石墨烯)
去除NSA。离开底部封装中的通道和空腔的推入/冲洗的流体可以被位于储存器29中的多孔膜13吸收。使用空气代替额外流体(或样品流体)来去除NSA的优点在于，空气防止多孔膜13被额外流体饱和并且避免流体从储存器29潜在地回流到空腔28中。同样，与第一阀30一样，第二阀31的自动致动可以使用软件模块来实现，用于样品输送(在上文第2段中讨论)。这些微型阀30、31的可编程电磁/机电致动可以提供样品稀释、定量和NSA去除效果的自动化，这对于小型手持式POCT系统来说是非常需要的。
根据前面的描述，本领域技术人员将清楚，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以对所描述的实施例进行修改和变化。

Claims (33)

1.一种生物传感器，其包括：
-第一基板和第二基板，所述第一基板和所述第二基板在其间限定空腔；
-感测结构，所述感测结构具有在所述空腔内设置在所述第一基板上的功能化活性表面；
-流动控制结构，所述流动控制结构设置在所述第二基板上并延伸到所述空腔中，其中所述流动控制结构的远端与所述感测结构之间的间隙提供跨所述功能化活性表面的流体流动通道；以及
-入口孔口，所述入口孔口在所述流体流动通道的一端处邻近所述流动控制结构的近端，以及出口孔口，所述出口孔口在所述流体流动通道的相对端处；
其中所述流动控制结构被成形和配置成使得在使用中，在所述入口孔口处滴下/注入的流体流入并通过所述流体流动通道到达所述出口孔口，从而在所述活性表面上施加剪切力。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其中所述感测结构包括由连接体和探针分子功能化的石墨烯层，所述连接体和探针分子被配置为与目的分析物分子结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的生物传感器，其中所述流动控制结构包括邻近所述入口孔口的外表面，所述外表面相对于从所述入口孔口到所述出口孔口的流体流动路径呈圆形且凸出。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其中所述流动控制结构可以包括具有基本上平行的平面第一基底和第二基底的梯形或截顶圆顶，其中所述第一基底的直径大于所述第二基底的直径，并且其中所述第一基底在所述第二基板上，并且所述第二基底位于最靠近所述功能化活性表面处，其中在其间具有所述间隙。
5.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中所述第二基板是固体介电基板。
6.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中所述流动控制结构包含聚合物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其包括位于所述功能化活性表面的第一端处并延伸到所述空腔中的在所述第一基板上的第一结构，其中所述第一结构的远端与所述第二基板之间的间隙限定所述入口孔口。
8.根据权利要求7所述的生物传感器，其中所述第一结构包含任何生物相容性聚合物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其包括位于所述功能化活性表面下游的在所述第一基板上的第二结构，其中所述第二结构的远端与所述第二基板之间的间隙限定所述出口孔口。
10.根据权利要求9所述的生物传感器，其中所述第二结构包含任何生物相容性聚合物。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的生物传感器，其包括位于所述第一基板上的第三结构，所述第三结构与所述第二结构和所述出口孔口间隔开并位于所述第二结构和所述出口孔口的下游，其中所述第二结构和所述第三结构之间的空间限定外部储存器。
12.根据权利要求11所述的生物传感器，其中所述第三结构包含生物相容性聚合物。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的生物传感器，其进一步包括从所述第二基板延伸到所述外部储存器中的多孔聚合物块。
14.根据权利要求13所述的生物传感器，其中小直径孔设置在所述第二基板中并延伸到所述多孔聚合物块下游的所述外部储存器中。
15.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其进一步包括位于所述感测结构与所述第一基板之间的电极，用于向所述感测结构施加静电势。
16.根据权利要求15所述的生物传感器，其中所述电极位于所述感测结构的一端，并且导电触点位于相对端和其下游，所述导电触点设置在所述第一基板和所述感测结构之间。
17.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中所述感测结构包括多个间隔开的通道，每个通道限定功能化活性表面。
18.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其进一步包括在所述感测结构上的参考电极。
19.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中所述功能化活性表面包括在其上的NSA阻断物质的层或涂层。
20.根据权利要求15或权利要求16所述的生物传感器，其进一步包括用于向所述电极施加静电势的装置，所述静电势具有作用于吸引目的分析物分子的极性。
21.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其进一步包括用于向所述感测结构施加机械搅拌的装置。
22.根据权利要求20所述的生物传感器，其中用于向所述感测结构施加机械搅拌的所述装置包括交流电流体动力或电磁搅拌装置。
23.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其进一步包括量化模块，所述量化模块被布置和被配置为：在使用中，从所述感测结构接收电信号，并且确定流过所述流体流动通道的样品流体中目的分析物分子的存在和/或浓度。
24.根据权利要求22所述的生物传感器，其中所述量化模块被配置为根据所述化学电阻信号和GFET信号，基于从其导出的平均量来确定与所述功能化活性表面相结合的分析物分子的存在和/或浓度。
25.根据权利要求23所述的生物传感器，其中所述量化模块被配置为生成表示为所述目的分析物分子的分析量化的组合的化学电阻信号和GFET信号的平均百分比变化。
26.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中所述第二基板是固体、光学透明/半透明电介质。
27.一种生物传感器装置，所述生物传感器装置包括通过微流体通道流体地联接在一起的至少两个根据权利要求1至25中任一项所述的生物传感器。
28.根据权利要求26所述的生物传感器装置，其包括用于接收一定量流体的入口，所述入口流体地联接到多个生物传感器的每个入口孔口。
29.一种生物传感器，其包括：
-第一基板和第二基板，所述第一基板和所述第二基板在其间限定空腔；
-感测结构，所述感测结构具有所述空腔内设置在所述第一基板上的功能化活性表面，所述功能化活性表面包括被配置为与目的分析物分子结合的探针分子；
-入口孔口，所述入口孔口在所述感测结构的一端处；以及出口孔口，所述出口孔口在所述感测结构的相对端处，其中流体流动通道跨所述功能化活性表面从所述入口孔口延伸至所述出口孔口；以及
-电极，所述电极位于所述感测结构和所述第一基板之间；
所述生物传感器进一步包括用于经由所述电极向所述功能化活性表面施加静电势的装置，所述静电势的极性与所述目的分析物分子的极性相反，以便在使用中将所述目的分析物分子吸引朝向所述功能化活性表面。
30.一种生物传感器，其包括：
-第一基板和第二基板，所述第一基板和所述第二基板在其间限定空腔；
-感测结构，所述感测结构具有在所述空腔内设置在所述第一基板上的功能化活性表面，所述功能化表面包括被配置为与目的分析物分子结合的探针分子；
-电触点，所述电触点被布置和配置为从所述感测结构收集电信号，其中所述感测结构的电特性在使用中通过与其结合的目的分析物分子的存在而改变；
-装置，所述装置用于经由所述电触点从所述感测结构收集化学电阻信号和GFET信号；以及
-量化模块，所述量化模块用于在使用中接收所述化学电阻信号和GFET信号，并且基于从其导出的数据而从其确定与所述功能化活性表面相结合的分析物分子的存在和/或浓度。
31.根据权利要求29所述的生物传感器，其中所述量化模块被配置为根据所述化学电阻信号和GFET信号，基于从其导出的平均量来确定与所述功能化活性表面相结合的分析物分子的存在和/或浓度。
32.根据权利要求30所述的生物传感器，其中所述量化模块被配置为生成表示为所述目的分析物分子的分析量化的组合的化学电阻信号和GFET信号的平均百分比变化。
33.一种制造根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器的方法，所述方法包括以下步骤：
制造底部封装，所述底部封装包括在其上具有感测结构的第一基板，所述感测结构包括限定相应传感器表面的多个通道；
将所述底部封装提供给包括多个喷嘴的输送站，并且将所述多个通道中的每一个通道与相应的喷嘴对准，并且从而将一定量的功能化流体或封闭剂输送到所述相应的活性表面；
制造顶部封装，所述顶部封装包括在其上具有多个流动控制结构的第二基板；
执行封装操作，以便将所述顶部封装和所述底部封装联接在一起，其中在其间具有空腔，其中每个流动控制结构与相应的通道对准，使得所述流动控制结构的远端与所述相应的传感器表面之间的间隙提供跨所述传感器表面的流体流动通道，其中入口孔口在所述流体流动通道的一端处邻近所述流动控制结构的近端，并且出口孔口在所述流体流动通道的相对端处。
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