CN117751281A - 使用定量相差显微镜检测分子生物学对象、细胞生物学对象和细胞聚集体 - Google Patents
使用定量相差显微镜检测分子生物学对象、细胞生物学对象和细胞聚集体 Download PDFInfo
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Abstract
公开了使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法、用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置、使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法以及用于检测细胞和/或分子生物对象的装置。使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法包括制备悬浮液，所述悬浮液包括粘弹性流体和来自样品的生物细胞，其中所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2Mda至10MDa的分子量，并且其中所述悬浮液中所述剪切稀化聚合物的质量分数小于0.2％。沿着微流体通道产生所述悬浮液的流，以将所述悬浮液中的细胞聚集体粘弹性聚焦在所述定量相差显微镜的焦平面中。使用所述定量相差显微镜拍摄所述悬浮液中所述生物细胞的一个或多个相移图像，并且识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学研究和临床诊断领域。特别地，本发明涉及使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法、用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置、使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法以及用于检测细胞和/或分子生物对象的装置。
背景技术
常规的血细胞计数确定患者血样中红细胞、血小板、白细胞及其亚型的数目等参数，这些参数可用于诊断许多不同的疾病。最近的研究表明血细胞的聚集体如白细胞-血小板聚集体和白细胞聚集体也可用作多种病理学病症如心血管疾病和细菌或病毒感染的有用生物指标，参见例如M.Finsterbusch et al.,Platelets.2018Nov；29(7):677-685,J.G.Burel et al.,eLife 2019；8:e46045，以及Michelson et al,Circulation.2001；104:1533-1537。
然而，血细胞聚集体的可靠检测是具有挑战性的，因为聚集体是易碎的对象并且可能容易崩解。这阻止了使用传统方法进行血液计数如米氏散射或基于荧光的流式细胞术的分析，这可能需要复杂且耗时的样品制备，包括红细胞的选择性裂解、细胞成分的染色和/或荧光标记。样品制备以及测量本身可影响细胞形态并可导致细胞聚集体的崩解，例如由于在离心或高流量(通常为1-10m/s)的流式细胞术中对其施加的机械力所致，这是对单个细胞进行足够统计的必要条件。
数字全息显微镜使用成像光束和参考光束之间的干涉来获得由样品透射的光的相位和振幅信息，并且例如允许重建样品的定量相移图像，参见例如EP 1524491 A1和EP2357539 A1。近年来，数字全息显微镜已经成功地用于生物医学应用，例如活细胞成像。细胞的相移图像可用于基于形态参数的分析和/或使用机器学习分类器可靠地识别细胞类型。与微流体系统相结合，这例如允许进行高通量无标记血样分析，例如血细胞计数，参见例如US2019/0195774 A1，有助于疾病如疟疾、白血病和骨髓增生性肿瘤的诊断，参见例如M.Ugele et al.,Adv.Sci.1800761(2018),WO 2019/063548 A1和M.Ugele et al.,Proc.SPIE 11060,生物材料检测、表征和成像的光学方法IV(Optical Methods forInspection,Characterization,and Imaging of Biomaterials IV),110600V(2019)。此外，数字全息显微镜已经用于进行粘附到表面上的血小板聚集体的定量分析，参见例如WO2016/170180A1。然而，目前已知的方法或是不能可靠地检测细胞聚集体，或是不适合在临床环境中进行自动化的高通量分析。此外，这些方法仅提供关于细胞聚集体的组成的有限信息，因此可能不适于获得临床相关信息，其可能例如同时需要分析单个血小板以及大的血小板-血小板聚集体。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供允许快速和可靠地检测生物细胞和细胞聚集体并且适于在临床环境中进行自动化高通量分析的方法。
该目的通过使用根据权利要求1的定量相差显微镜的用于检测生物细胞的细胞聚集体的方法和根据权利要求19的用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置来实现。其实施方案在相应的从属权利要求中详细描述。
根据本发明的第一个方面，提供了使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法。根据本发明第一个方面的方法包括从样品和粘弹性流体制备包括生物细胞的悬浮液。粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2MDa至10MDa的分子量，其中剪切稀化聚合物在悬浮液中的质量分数小于0.2％。该方法进一步包括沿微流体通道产生悬浮液的流，以将悬浮液中的细胞聚集体粘弹性聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。使用定量相差显微镜拍摄悬浮液中生物细胞的一个或多个相移图像，并识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体。
所述方法可以例如使用根据下文所述根据本发明第一个方面的任何一个实施方案的用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置来进行。样品可以是从患者提取的样品，尤其是液体样品，例如血液样品。因此，生物细胞例如可以是或包括血细胞，例如红细胞(红细胞)、白细胞(白细胞)和/或血小板(血小板)，和/或罕见细胞，例如循环肿瘤细胞和/或循环内皮细胞。
悬浮液可以通过将粘弹性流体添加到样品或从样品中提取的细胞中来制备，反之亦然。粘弹性流体是既具有粘性又具有弹性特性的流体，即可以表现出粘性流体的特性以及弹性固体的特性。粘弹性流体可以是非牛顿流体，其显示出取决于所施加的剪切速率的粘度，特别是剪切稀化流体，其显示出随着所施加的剪切速率而降低的粘度。粘弹性流体的粘弹性能可以至少部分地由其中包含的剪切稀化聚合物产生。粘弹性流体可以例如是包含剪切稀化聚合物的水溶液，例如由水或磷酸盐缓冲盐水和剪切稀化聚合物组成的溶液。
当产生悬浮液流时，粘弹性流体的粘弹性性质可导致包含在悬浮液中的物体(例如细胞和/或细胞聚集体)的粘弹性聚焦。流动中的物体例如可以向剪切速率低的区域迁移，例如悬浮液流动的中心区域，其中悬浮液具有最高的流速。在微流体通道中，这可以例如在微流体通道的两个相对侧壁之间的中心平面附近，或者在微流体通道的两对相对侧壁之间的中心线附近。
调整细胞和/或细胞聚集体在悬浮液流中的粘弹性聚焦，使得悬浮液中的细胞和/或细胞聚集体聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。例如，粘弹性流体可导致细胞和/或细胞聚集体在悬浮液流动中心处，例如在微流体通道的中心平面或中心线附近的粘弹性聚焦。在一些实施方案中，微流体通道的中心平面和/或中心线可以位于定量相差显微镜的焦平面中。悬浮液中的细胞聚集体可以被聚焦，使得细胞聚集体的中心在垂直于显微镜的焦平面的方向上被限制在限制范围内。例如，至少90％的细胞聚集体，在一个实例中至少95％的细胞聚集体可以被限制在限制范围内。优选地，限制范围小于20μm，在一些实例中小于10μm，在一个实例中小于5μm。限制范围可以特别地等于或小于显微镜的景深的两倍，在一个实例中等于或小于显微镜的景深。在优选实施方案中，单个细胞也聚焦在显微镜的焦平面中，例如使得至少80％的单个细胞，在一些实例中至少90％的单个细胞，在一个实例中至少95％的单个细胞被限制在限制范围内。
用具有2MDa至10MDa的分子量、在悬浮液中的质量分数小于0.2％的剪切稀化聚合物的粘弹性聚焦可以允许细胞聚集体以及单细胞的可靠聚焦，同时降低细胞聚集体上的机械应力并防止聚合物诱导的细胞聚集。聚焦细胞聚集体，尤其是细胞聚集体和单个细胞的组合由于细胞聚集体和细胞可能具有的不同大小而具有挑战性。细胞聚集体的大小可以为例如1μm至50μm，而细胞的大小可以为1μm至20μm。例如，人血小板通常具有1μm至3μm的大小，而白细胞通常具有7μm至15μm的大小。作用在粘弹性流体中的对象上的力可以取决于对象的大小，使得不同大小的对象可以聚焦在不同点/位置，或者某一大小的对象可以根本不聚焦。同时，流体流中的剪切应力可以作用于细胞聚集体，并且可以使细胞聚集体分裂，特别是在较高的流速下。这可能限制可使用的流速范围，使得甚至更难以聚焦细胞聚集体。此外，剪切稀化聚合物可影响细胞形态，参见例如J.Gonzalez-Molina et al.，Sci Rep 9,8505(2019)，并且在一些情况下甚至可以诱导“人工”细胞聚集体的形成，例如对于红细胞，如J.K.Armstrong et al.，Biophysical Journal 87(2004),4259-4270所述。令人惊讶地，本发明的发明人已经发现，以小于0.2％的质量分数添加分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物在悬浮液中诱导粘弹性，这使得能够使用粘弹性聚焦以降低的流速充分限制悬浮液中的细胞聚集体，以防止细胞聚集体的崩解，同时不诱导“人造”细胞聚集体的形成。因此，本发明允许通过定量相差显微镜研究细胞聚集体，特别是血细胞聚集体，而不需要细胞固定和红细胞裂解。此外，可以使用常规采血管用标准采血程序进行聚集体测试。
为了检测细胞聚集体，所述方法进一步包括使用定量相差显微镜拍摄悬浮液中生物细胞的一个或多个相移图像。定量相差显微镜例如可以是叠层成像装置或数字全息显微镜，例如如下文针对根据本发明第一个方面的装置所详述的那样。拍摄一个或多个相移图像可以例如包括在悬浮液沿所述微流体通道流动时沿微流体通道捕获测量体积的图像序列。如本文所使用的，相移图像可以编码一个或多个波长的光的相移作为位置的函数，例如反射或通过成像样品传播的光的相移，例如悬浮液的流动作为成像样品中的位置的函数。在优选的设置中，与具有连续细胞测量的常规流式细胞术相反，多个细胞和/或细胞聚集体被并行成像，以补偿由于较低的流量而导致的降低的通量。
可以分析一个或多个相移图像以识别其中的细胞聚集体，例如以区分细胞聚集体和单个细胞。细胞聚集体可以例如基于与它们的大小、形状和/或结构有关的一个或多个形态学参数来识别，例如平均直径(等效直径)和/或相移(光学高度)，例如通过为各个参数定义一个或多个阈值。另外地或可选地，细胞聚集体也可以使用经典的和/或基于人工智能(基于AI)的计算机视觉技术来识别，例如使用基于神经网络的分类器。在一个或多个相移图像中识别细胞聚集体可以特别地包括确定在一个或多个相移图像中细胞聚集体的总数或分数，其中细胞聚集体的分数可以例如是细胞聚集体的总数与单个细胞和细胞聚集体的总数的比率。
在优选实施方案中，识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体包括确定独立的细胞聚集体中的细胞的数目和/或独立的细胞聚集体中的一些或全部细胞的细胞类型。这可以例如包括对与细胞聚集体相关联的相移图像的一部分(例如，仅包含细胞聚集体而不包含其它单个细胞或细胞聚集体的感兴趣区域)执行图像分割，以识别细胞聚集体的成分。图像分割可以例如使用阈值算法和/或使用分水岭算法来执行，所述阈值算法例如基于相移的一个或多个阈值，以将相移图像的部分分配给独立的组成部分，所述分水岭算法例如通过将相移解释为地形高度，并将所得地形图内的“盆地”识别为细胞聚集的组成部分。另外地或可选地，图像分割进一步可以使用基于边缘的方法来执行，例如测地线活动轮廓法，参见例如P.Marquez-Neila,L.Baumela和L.Alvarez,“基于曲率的曲线和曲面演化的形态学方法”(A morphology ap-proach to curve and surface),In:IEEE Transactions onPattern Analysis and Machine Intelligence 36.1(2013),pp.2–17，基于区域的方法，例如Chan-Vese算法，参见例如T.Chan和L.Vese,“一种没有边缘的活动轮廓模型”(Anactive contour model without edges),In:Inter-national Conference on Scale-Space Theories in Computer Vi-sion,Springer,1999,pp.141–151，和/或基于图形的方法，例如Felzenszwalb算法，参见例如P.F.Felzenszwalb和D.P.Huttenlocher,“高效的基于图形的图像分割”(Efficient graph-based image segmenta-tion),In:InternationalJournal of computer vision 59.2(2004),pp.167-181。另外地或可选地，图像分割进一步可以使用基于AI的计算机视觉技术来执行，例如使用诸如U-Net的神经网络，参见例如O.Ronneberger,P.Fischer和T.Brox,“U-Net:生物医学图像分割的卷积网络”(U-Net:Convolutional networks for biomedical images segmentation),In:Interna-tionalConference on Medical images computing and computer ssisted intervention,Springer,2015,pp.234-241，Mask R-CNN，参见例如K.He，G.Gkioxari，P.Dolljr，和R.Girshick，“XRCNN”，In：Proceedings of the IEEE International conference oncom-puter vision,2017,pp.2961–2969，和/或脉冲偶联神经网络，参见例如M.Chen,X.Yu和Y.Liu，“PCNN:短期交通拥堵预测的深度卷积网络”(PCNN:Deep convolutional net-works for short-period traffic congestion prediction),In:IEEE Transactions onIntelligent Transportation Systems 19.11(2018),pp.3550-3559。根据定量相差显微镜的景深，可以根据横向分辨率(例如，对于血小板来说最高)对总高度信息的需要，根据波长和数值孔径，对总分析进行调整。可以绘制聚集体大小分布和/或细胞组成的直方图。例如在使用活化物质的测定或患者样品的详细分析的情况下。
所述方法进一步可以包括例如从分割的图像为细胞聚集体的一些或全部成分确定一个或多个形态学参数。一个或多个形态参数例如可以包括最小直径、平均直径、最大直径、周长、纵横比、最小相移、平均相移、最大相移、相移的变化或标准偏差和/或相移的相关长度。一个或多个形态学参数可以特别地包括一个或多个纹理特征，例如熵或均匀性、能量、从共现矩阵(例如灰度共现矩阵(GLCM))提取的一个或多个特征和/或一个或多个Haralick特征。在一些实施方案中，可以使用基于AI的计算机视觉技术来提取一个或多个形态学参数，例如使用神经网络来提取特征。
所述方法进一步可以包括例如基于一个或多个形态学参数来确定细胞聚集体的一些或所有成分的细胞类型。例如，可以使用用于独立的形态参数的一个或多个阈值来确定细胞类型。另外地或可选地，可以使用回归分析、线性判别分析、决策树分类、随机森林分类、支持向量机(SVM)、二次判别分析、K均值聚类、逻辑回归和/或朴素贝叶斯分类器来确定细胞类型。在一些实施方案中，可以另外地或可选地使用基于AI的计算机视觉技术，例如使用基于神经网络的分类器来确定细胞类型。
在优选实施方案中，所述方法进一步可以包括识别一个或多个相移图像中的单细胞，例如类似于上文所述细胞聚集体的识别。单个细胞和细胞聚集体可以例如基于与它们的大小、形状和/或结构有关的一个或多个形态学参数来区分，和/或可以使用经典的和/或基于AI的计算机视觉技术来区分。所述方法进一步可以包括确定单个细胞的细胞类型，例如类似于上文所述细胞聚集体的成分的细胞类型的确定。
剪切稀化聚合物在一些实施方案中可以具有3MDa至6MDa的分子量，优选3.5MDa至4.5MDa的分子量，在一个实例中具有4.0MDa的分子量，其中Da是统一原子质量单位(u)。增加聚合物的分子量可促进对象的粘弹性聚焦，但同时也可导致聚合物诱导的“人工”细胞聚集体形成速率的增加以及由于与悬浮液中的聚合物相互作用而增加细胞聚集体上的机械应力。发明人已经发现，使用具有在这些范围的分子量的剪切稀化聚合物对于即使在低流速下也在悬浮液中实现细胞聚集体和单细胞两者的充分限制并且不诱导“人工”细胞聚集体的形成是特别有利的。优选地，剪切稀化聚合物是线性聚合物，例如包括单根无支链直链的聚合物。
在一些实施方案中，剪切稀化聚合物在悬浮液中的质量分数可以为0.03％至0.12％，优选地0.04％至0.06％，在一个实例中为0.05％。悬浮液的给定成分的质量分数可以例如定义为悬浮液中各成分的总质量与悬浮液的总质量的比率，即悬浮液的各成分的总质量之和。增加剪切稀化聚合物的质量分数可促进对象的粘弹性聚焦，但同时也可导致聚合物诱导的“人工”细胞聚集体形成速率的增加以及由于与悬浮液中的聚合物相互作用而增加细胞聚集体上的机械应力。发明人已经发现，使用质量分数在这些范围内的剪切稀化聚合物对于即使在低流速下也在悬浮液中实现细胞聚集体和单细胞两者的充分限制并且不诱导细胞聚集体的形成是特别有利的。
优选地，剪切稀化聚合物是水溶性聚合物。剪切稀化聚合物可以例如选自聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、透明质酸(HA)和聚丙烯酰胺(PAA)。优选地，剪切稀化聚合物是聚(环氧乙烷)或聚(乙烯基吡咯烷酮)。在一个实例中，剪切稀化聚合物是4MDa水溶性线性聚合物PEO，其在悬浮液中的质量分数为0.05％。在另一个实例中，剪切稀化聚合物是4MDa水溶性线性聚合物PEO，其在悬浮液中的质量分数为0.2％。在一些实施方案中，粘弹性流体可以包括一种或多种另外的剪切稀化聚合物，其中另外的剪切稀化聚合物可以例如包括相同类型但具有不同分子量的聚合物(例如分子量分布在3MDa至6MDa的PEO)和/或相同或不同分子量的不同类型的聚合物(例如除了分子量为4MDa的PEO之外，分子量为2MDa的PVP)。在这样的实施方案中，悬浮液中所有剪切稀化聚合物的总质量分数可以小于0.2％，优选地0.03％至0.12％，在一个实例中为0.04％至0.06％，和/或一些或所有剪切稀化聚合物的分子量可以为2MDa至10MDa，优选地3MDa至6MDa。在一个实例中，为3.5MDa至4.5MDa。
在优选的实施方案中，选择悬浮液沿微流体通道的流速，使得流内的剪切应力低于50Pa，优选地低于10Pa，在一个实例中低于5Pa。悬浮液在微流体通道中的流动中的剪切速率，例如流速的梯度，可以例如小于10,000s-1，在一些实例中小于5,000s-1，在一个实例中小于2,000s-1。悬浮液的流速可以例如为1mm/s至1.0m/s，优选地1mm/s至250mm/s，在一些实例中为5mm/s至100mm/s，在一个实例中为8mm/s至64mm/s。
在一些实施方案中，从微流体通道的入口到定量相差显微镜的焦点的长度为30mm至60mm，优选地35mm至50mm。微流体通道的入口例如可以是用于向微流体通道提供悬浮液的输入端口，或者是合并到微流体通道中的两个或更多个通道之间的连接处，例如流体动力聚焦连接处。在一些实例中，微流体通道可以是直的或基本上直的，其中微流体通道的入口例如也可以是在微流体通道开始处的弯曲通道部分。选择在上述范围内的微流体通道长度，可以例如促进稳定的(粘弹性的)聚焦甚至是较小的对象，例如单细胞，尤其是血小板。
优选地，悬浮液在垂直于定量相差显微镜的焦平面的方向上的流动高度为30μm至100μm，在一些实例中为30μm至70μm，在一个实例中为40μm至60μm，例如50μm。悬浮液流的高度可以例如在定量相差显微镜的焦点处测量，并且可以例如是与悬浮液流接触的微流体通道的侧壁之间的距离、悬浮液流与围绕微流体通道中的悬浮液流的一个或多个附加流之间的界面之间的距离，或它们的组合。悬浮液的流动高度可以例如由微流体通道的高度确定，所述高度可以例如在上文所述范围内。另外地或可选地，悬浮液流的高度也可以通过产生沿着微流体通道的一个或多个鞘流通过流体动力学聚焦来控制，例如如下文所述。这可以允许即使在具有较大高度的微流体通道中也产生具有在上文所述范围内的高度的悬浮液的流动。将悬浮液的流动高度选择在上文所述范围内可能例如有利于确保悬浮液内的细胞和/或细胞聚集体的稳定粘弹性聚焦。
在优选的实施方案中，所述方法进一步包括沿着微流体通道产生两个或更多个鞘流，以流体动力学地聚焦悬浮液的流动，使得悬浮液中的细胞聚集体聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。换言之，除了细胞和/或细胞聚集体在悬浮液流内的粘弹性聚焦之外，悬浮液本身的流可以通过沿着微流体通道产生的两个或更多个鞘流来流体动力学地聚焦。例如，可以产生鞘流，使得鞘流在悬浮液流和微流体通道的各个侧壁之间流动，例如使得悬浮液流夹在沿着微流体通道的相对侧面流动的一对鞘流之间。鞘流可以配置成在一个或多个方向上限制悬浮液的流动，例如，垂直于显微镜的焦平面的方向和/或平行于显微镜的焦平面的方向。流体动力学聚焦悬浮液的流动可以例如允许减小悬浮液在微流体通道中的流动的高度和/或防止悬浮液流动内的对象例如单细胞和/或细胞聚集体与微流体通道的侧壁接触。例如，如果微流体通道的高度大于100μm，优选地如果微流体通道的高度大于70μm，在一些实例中如果微流体通道的高度大于60μm，在一个实例中如果微流体通道的高度大于50μm，则可以使用流体动力聚焦。另外地或可选地，流体动力聚焦也可用于控制悬浮液在微流体通道内的流动的位置，例如用于从微流体通道的中心平面或中心线移动或偏移悬浮液的流动。
结合起来，悬浮液流中的细胞和/或细胞聚集体的粘弹性聚焦和悬浮液流的流体动力学聚焦可以被调整，使得悬浮液中的细胞和/或细胞聚集体聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。例如，可以选择两个或更多个鞘流的流速和/或流量，使得悬浮液的流动流体动力学地聚焦在微流体通道的中心区域，并且粘弹性流体可以导致细胞和/或细胞聚集体在悬浮液流动中心处的粘弹性聚焦，例如在微流体通道的中心平面或中心线附近。在一些实施方案中，微流体通道的中心平面和/或中心线可以位于定量相差显微镜的焦平面中。在其它实施方案中，悬浮液中的细胞和/或细胞聚集体可以聚焦在微流体通道的不同区域中，例如在偏离微流体通道的中心平面或中心线的平面或线附近，例如通过选择两个或更多个鞘流的不对称流速或流量。
在一些实施方案中，两个或更多个鞘流中的一些或全部可以包括粘弹性流体，尤其是包括与悬浮液相同的剪切稀化聚合物的粘弹性流体。在各个鞘流中的剪切稀化聚合物的质量分数可以例如等于或小于在悬浮液中的剪切稀化聚合物的质量分数。
在一些实施方案中，通过产生一对横向鞘流和一对垂直鞘流来流体动力学地聚焦悬浮液的流动，所述一对横向鞘流将悬浮液的流动夹在第一方向上，所述一对垂直鞘流将悬浮液的流动夹在垂直于第一方向的第二方向上，例如，以限制悬浮液沿着第一和第二方向的流动。每个横向鞘流可以例如在悬浮液流和微流体通道的各个垂直侧壁之间流动。每个垂直鞘流可以例如分别在悬浮液流和微流体通道的底壁和顶壁之间流动。在其它实例中，悬浮液的流动可仅使用一对横向鞘流或仅使用一对垂直鞘流进行流体动力学聚焦，例如以通过流体动力学聚焦来限制悬浮液沿着第一方向或沿着第二方向的流动，而细胞和/或细胞聚集体沿着另一方向的限制可例如通过粘弹性聚焦来实现。第二方向可以例如垂直于定量相差显微镜的焦平面，并且可以例如平行于定量相差显微镜的成像轴。
在优选的实施方案中，样品是全血样品，例如从患者中提取的未修饰的血液，或血液成分样品，例如包括全血样品的一种或多种组分如血浆或其部分的样品，包括白细胞和血小板的血沉棕黄层，和/或红细胞。在其它实例中，样品也可以是从患者提取的不同体液的样品或组织样品，特别是溶解到单细胞和/或细胞聚集体中的组织样品。样品例如可以是或包括人样品，例如尿液、渗出物、灌洗液或痰液，以在其上进行细胞聚集测试。在一些实例中，可以将一种或多种抑制凝血的物质，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素或柠檬酸盐分别加入到全血样品或血液成分样品中，以防止凝血。
识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体可以包括识别包括一个或多个相移图像中的由一个或多个预定类型的血细胞组成的细胞聚集体。识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体可以特别地包括识别血小板聚集体，即由血小板组成的聚集体，白细胞-血小板聚集体，即由一个或多个血小板和一个或多个白细胞组成的聚集体，和/或白细胞聚集体，即由白细胞组成的聚集体。这例如可以包括识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体的成分，确定独立的细胞聚集体的一些或全部成分的一个或多个形态学参数，以及如上文所述确定独立的成分的细胞类型。另外地或可选地，在一个或多个相移图像中识别细胞聚集体进一步可以包括识别包含肿瘤细胞的细胞聚集体，特别是包括肿瘤细胞和血细胞的细胞聚集体，例如由具有血小板和/或白细胞的肿瘤细胞组成的细胞聚集体。
另外地或可选地，所述方法进一步可以包括确定包括一种或多种特定类型细胞的至少预定数目的细胞的细胞聚集体的数目，例如包括第一类型的至少第一数目的细胞的聚集体或包括第一类型的至少第一数目的细胞和第二类型的至少第二数目的细胞的聚集体。在优选的实施方案中，所述方法包括确定包括至少预定数目的白细胞，特别是两个或更多个白细胞或三个或更多个白细胞的白细胞-血小板聚集体的数目。另外地或可选地，所述方法进一步可以例如包括确定包括两个或更多个白细胞的白细胞聚集体和白细胞-血小板聚集体和/或包括两个或更多个白细胞和两个或更多个血小板的白细胞-血小板聚集体的数目。所述方法进一步可以包括确定由一种或多种特定类型细胞的预定数目的细胞组成的细胞聚集体的数目，例如由第一类型细胞的第一数目，由第一类型细胞的第一数目和第二类型细胞的第二数目组成的聚集体，和/或由第一类型细胞的第一数目和至少第二类型细胞的第二数目组成的聚集体组成的聚集体，例如许多由两个白细胞和一个或多个血小板组成的白细胞-血小板聚集体或许多由三个白细胞和一个或多个血小板组成的白细胞-血小板聚集体。另外地或可选地，所述方法进一步可以包括确定包括至少预定数目的细胞的细胞聚集体的数目，例如三个或更多个细胞，在一个实例中是四个或更多个细胞。所述方法可以特别地包括确定包括三个或更多个细胞的白细胞聚集体和/或白细胞-血小板聚集体的数目。某种组合物的细胞聚集体的存在，例如具有至少给定数目的细胞，可能与某种医学病症或疾病有关。例如，存在包括两种或更多种白细胞的白细胞-血小板聚集体，特别是存在包括三种或更多种白细胞的白细胞-血小板聚集体可指示感染。高浓度的血小板-血小板聚集体可例如指示Covid-19患者或患有心血管疾病的患者的并发症。
在一些实施方案中，制备悬浮液包括将全血样品或血液成分样品分别按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选地为1:50至1:200，在一个实例中为1:80至1:120。用这些范围内的比例稀释全血或血液部分可以确保悬浮液中的细胞和细胞聚集体足够稀疏，使得在相移图像中可以容易地区分各个对象，同时进一步提供足够高密度的对象以允许分析大量对象。
在优选的实施方案中，制备悬浮液不包括红细胞的裂解、血小板和/或红细胞的球形化和/或细胞的标记或染色。例如，制备悬浮液可以仅包括将粘弹性流体添加到血液样品，特别是全血样品或血液成分样品中，例如以上文所述范围内的比例稀释血液样品。这可以实现样品的快速处理，例如防止细胞聚集体从样品中自发崩解。此外，上文所述样品制备程序可影响细胞形态和/或可导致细胞聚集体从样品中崩解。在一些实例中，一种或多种凝血抑制物质如乙二胺四乙酸(EDTA)可以包含在粘弹性流体中和/或可以添加到血液样品中。
在一些实施方案中，所述方法进一步可以包括添加血小板和/或白细胞活化物质以诱导血小板聚集和/或白细胞-血小板聚集，例如研究凝血过程或白细胞功能，例如研究形态学变化和聚集形成。凝结速度和/或程度的增加或降低可以例如与某些病理状况相关。来自患有冠状动脉疾病的患者的样品可以例如表现出比来自健康个体的样品更强的凝结，参见M.I.Furman et al.，J.Am.Coll.Cardiol.Vol.31,No.3,292-296(2009)。血小板活化物质可例如选自二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶受体活化肽(TRAP)、表啡肽、凝血酶、血管假性血友病因子和C反应蛋白(CRP)。反之亦然，可以加入抑制剂，例如阿司匹林或氯吡格雷。可选地或除血小板活化外，可加入白细胞活化物质，如细胞因子。此外，可以添加药物，例如检查点抑制剂，一种或多种抗体药物缀合物和/或一种或多种双特异性T-细胞结合抗体构建体，以例如研究细胞聚集行为和抑制。在一个实例中，所述方法进一步可以包括加入诱导形成包括肿瘤细胞与白细胞和/或血小板组合的聚集体的物质。
根据第一个方面，本发明进一步提供一种使用根据本文所述的本发明的第一个方面的实施方案中的任一个的方法检测生物细胞的细胞聚集体的装置。所述装置包括底座，其被配置成接收包括测量体积的微流体系统。所述装置进一步包括显微镜，其被配置成拍摄测量体积中的生物细胞的相移图像。所述装置进一步包括微流体单元，其被配置成接收来自样品的包括生物细胞的样品流体和粘弹性流体，其中粘弹性流体包括分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物，并且其中剪切稀化聚合物在样品流体中的质量分数小于0.2％。微流体单元被配置成产生通过测量体积的样品流体流，以将样品流体流中的细胞聚集体粘弹性聚焦在显微镜的焦平面中。所述装置进一步包括控制器，其被配置成识别从显微镜获得的样品流体流的相移图像中的细胞聚集体。
底座可被配置成将微流体系统保持在例如相对于显微镜的固定参考位置。优选地，底座被配置成相对于显微镜定位微流体系统，例如沿着一个或多个方向移动微流体系统和/或围绕一个或多个轴倾斜微流体系统。在一些实例中，底座进一步可以包括用于连接微流体系统的端口的一个或多个流体连接器，例如微流体系统的一个或多个输入端口和输出端口。微流体系统的测量体积例如可以是微流体通道或其一部分。在一些实施方案中，所述装置可以包括微流体系统。
显微镜是定量相差显微镜，例如数字全息显微镜或叠层成像装置，其被配置成拍摄相移图像，即作为位置函数的编码一个或多个波长的光的相移的图像。优选地，显微镜被配置成确定相移的绝对值。在其它实例中，显微镜可仅经配置以确定相移模2π。例如，显微镜可以被配置成通过光的干涉，例如在探针或成像光束和参考光束之间获得相移。在其它实例中，显微镜可以是被配置成例如通过记录不具有参考相位的干涉图案而在不具有参考光束的情况下执行叠层成像的叠层成像装置。显微镜可以被配置成拍摄一个或多个干涉图像，并且根据一个或多个干涉图像重建相移图像。
在优选实施方案中，显微镜是数字全息显微镜，其被配置成拍摄相移图像以及振幅或强度图像，其中强度图像可以编码作为位置函数的光强度，例如从成像样品反射或透射成像样品(例如样品流体流)的光强度，作为成像样品中位置的函数。例如，数字全息显微镜可以被配置成将成像样品(例如透射通过成像样品的成像光束)的图像与参考光束干涉，其中参考光束可以通过成像样品或者可以不通过成像样品。数字全息显微镜可以被配置成从一个或多个干涉图像提取或重建相移和强度图像，例如通过重建通过成像样品透射或反射的光的波前。数字全息显微镜可以是离轴数字全息显微镜，其中成像光束和参考光束在干涉时沿着相同的轴传播。优选地，数字全息显微镜是离轴数字全息显微镜，其中成像光束和参考光束以一定角度干涉，并且可以配置成从成像样品的单个干涉图像中提取相移图像。这种数字全息显微镜例如可以从EP 152491A1和EP 2357539 A1中获知。
微流体单元可以例如包括用于接收样品流体的储液器和/或可以包括用于接收包含样品流体的储液器的槽，例如测试管或样品管。微流体单元进一步可以包括一个或多个流体连接器，用于连接微流体系统的端口和/或底座的端口。微流体单元进一步可以包括一个或多个压力源，例如泵和/或一个或多个阀，用于产生样品流体流和/或另外的流，例如一个或多个鞘流体流。
控制器可以用硬件、软件或其组合来实现。控制器可以例如包括处理装置和存储器，存储器存储由处理装置执行的指令，以提供本文所述的功能。控制器可以例如被配置成从显微镜读出一个或多个相移图像并且识别其中的细胞聚集体，例如，如上文针对根据本发明的第一个方面的方法所述的。控制器进一步可以被配置成控制装置的一些或所有其它部件，特别是如下文所述的微流控单元和/或样品制备单元。优选地，控制器被配置成执行根据本文所述的根据本发明第一个方面的实施方案之一的用于检测生物细胞的细胞聚集体的方法的一些或全部步骤。
在优选的实施方案中，微流体系统进一步包括与测量体积流体连通的流体动力聚焦连接处。流体动力聚焦连接处可配置成产生围绕样品流体流的两个或更多个鞘流，以流体动力地将样品流体流聚焦在测量体积中。微流体单元可以被配置成向流体动力聚焦连接处提供鞘流体，以流体动力地聚焦测量体积中的样品流体流，使得样品流体流中的细胞聚集体聚焦在显微镜的焦平面中。在流体动力聚焦连接处，例如可以配置成将样品流体流引导至测量体积的样品通道可以与两个或更多个鞘流通道相交，每个鞘流通道例如可以配置成将鞘流中的各个引导至测量体积，使得各个鞘流在样品流体流和测量体积的各个壁之间流动。
在优选的实施方案中，所述装置进一步包括样品制备单元，其被配置成提供包括分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物的粘弹性流体，以从样品和粘弹性流体制备包括生物细胞的样品流体，其中剪切稀化聚合物在样品流体中的质量分数小于0.2％。样品制备单元可以例如包括用于接收样品或其一部分，例如全血样品或血液成分样品的储液器，或用于接收包含样品的储液器的槽。样品制备单元可以进一步包括用于接收粘弹性流体的储液器，并且可以被配置成例如通过将粘弹性流体添加到样品中或反之亦然来混合粘弹性流体和样品或其部分。在一些实例中，样品制备单元和微流控单元可以集成到单个单元中。
优选地，样品制备单元被配置成调节样品流体中剪切稀化聚合物的质量分数，例如至少0.03％至0.12％，在一些实例中至少0％至0.2％。样品流体可以例如配置成调节添加到样品流体中的粘弹性流体的量、粘弹性流体中剪切稀化聚合物的浓度和/或除了粘弹性流体之外添加到样品流体中的另一流体(例如水或水溶液)的量。
另外地或可选地，样品制备单元被配置成将样品流体按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选地1:50至1:200。用给定比例稀释样品流体可以例如是指将粘弹性流体和/或其它流体以这样的量添加到样品或其一部分中，使得样品或其一部分以质量或体积构成样品流体的各个部分。在优选的实施方案中，样品制备单元进一步被配置成调节稀释比例，例如在上文所述的范围内。
在一些实施方案中，样品制备单元进一步被配置成将一种或多种血小板活化物质和/或一种或多种白细胞活化物质添加到样品流体和/或鞘流体中。样品制备单元可以例如包括用于一种或多种血小板活化物质中的每一种和/或用于一种或多种白细胞活化物质中的每一种的各自的储液器，并且可以被配置成将预定量的这些物质中的一种或多种添加到样品流体和/或鞘流体中。
优选地，微流体单元被配置成控制测量体积中的样品流体流的流速，其中样品流体流的流速可以例如为1mm/s至1.0m/s，优选地1mm/s至250mm/s，在一些实例中为5mm/s至100mm/s，在一个实例中为8mm/s至64mm/s。微流体单元可以例如被配置成调节提供给流体动力聚焦连接处的样品流体的流量。微流体单元进一步可以配置成调节提供给流体动力聚焦连接处的鞘流体的流量，优选地使得两个或更多个鞘流中的每一个的流速或流量可以单独控制，例如移动或调节样品流体流被鞘流限制到的聚焦区域。
在优选的实施方案中，控制器被配置成执行用于分析上文所述根据本发明第一个方面的方法的相移图像的一些或全部步骤。特别地，控制器可以被配置成确定在相移图像中识别的细胞聚集体中的细胞的数目和/或在相移图像中识别的细胞聚集体中的一些或全部细胞的细胞类型，例如如上文所述。控制器可以被配置成识别相移图像中的血小板聚集体和/或白细胞-血小板聚集体。优选地，控制器进一步被配置成确定在相移图像中包括两个或更多个白细胞的白细胞-血小板聚集体的数目和/或包括三个或更多个细胞的细胞聚集体的数目，例如如上文所述。
附图说明
在下文中，参考附图给出本发明及其示例性实施方案的详细描述。附图示意性地示出了，
图1：根据本发明第一个方面的示例性实施方案的用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置；
图2：根据本发明第一个方面的示例性实施方案的图1装置的显微镜；
图3：根据本发明第一个方面的使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法的流程图；
图4：使用根据本发明第一个方面的示例性实施方案的方法获得的单个细胞和细胞聚集体的相移图像的示例；
图5的a、图5的b：根据本发明第一个方面的示例性实施方案的用于识别细胞聚集体成分的图像分割；
图6：根据本发明第一个方面的示例性实施方案的不同大小的血小板聚集体的识别；
图7的a、图7的b：由各种浓度的剪切稀化聚合物诱导的聚集体的形成的分析；
图8：根据本发明第二个方面的示例性实施方案的使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法的流程图；
图9a、图9b、图9c：根据本发明第二个方面的示例性实施方案，用标记物标记生物对象以形成复合聚集体；和
图10：使用根据本发明第二个方面的示例性实施方案的方法获得的包括T辅助细胞和标记物的复合聚集体的相移图像。
具体实施方式
图1示出了根据本发明第一个方面的示例性实施方案的用于检测生物细胞104A、104B(未示出)的细胞聚集体102A、102B(未示出)的装置100的示意图(未按比例)。图2中描绘了装置100的显微镜108的示意性图示(未按比例)。装置100可用于执行根据本文所述的根据本发明第一个方面的实施方案中的任一个的用于检测细胞聚集体的方法，例如下文参考图3所述的方法300。
装置100包括底座106，其被配置成接收微流体系统200，其中微流体系统200包括测量体积202和流体动力聚焦连接处204。测量体积202和流体动力聚焦连接处204可以例如布置在包括一个或多个层的基底中，每个层可以例如包括玻璃、塑料(特别是透明热塑性塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA)、金属或其组合或由玻璃、塑料(特别是透明热塑性塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA)、金属或其组合组成。
测量体积202例如可以是微流体通道或其一部分，并且可以例如在图1和图2的视图方向上具有50μm至1000μm的宽度，在图1和图2的Z方向上具有30μm至500μm的高度，并且在图1和图2的X方向上具有50μm至60mm的长度。在一个实例中，测量体积202具有矩形横截面，其宽度为300μm至700μm，例如500μm，高度为30μm至100μm，例如50μm。测量体积202的中心(其可以例如与显微镜108的焦点对准)与流体动力聚焦连接处204之间的距离可以例如为30mm至60mm，在一些实例中为35mm至50mm，例如40mm。测量体积202包括检测窗口202A，其例如可以是测量体积202的透明侧壁或其一部分，或者可以是布置在测量体积202的侧壁中的透明窗口。检测窗口202A被优化用于相移测量。例如，检测窗口202A的透射波前误差可以小于λ/2，优选地小于λ/4，在一个实例中小于λ/8。检测窗口202A例如可以包括透明热塑性塑料、硼硅酸盐玻璃和/或熔凝石英，或由透明热塑性塑料、硼硅酸盐玻璃和/或熔凝石英组成。微流体系统200进一步包括用于照明测量体积202的照明窗口202B，其中照明窗口202B可以例如布置在测量体积202的与图2所示的检测窗口202A相对的一侧，并且优选地也被优化用于相移测量。
在流体动力聚焦连接处204处，样品通道206A与多个鞘流通道206B相交，使得从样品通道206A进入测量体积202的样品流体流208A可以被两个或更多个鞘流208B包围，所述两个或更多个鞘流208B在样品流体流208A和测量体积202的各个壁之间流动。在图1的实例中，微流体系统200包括两个垂直的鞘流通道206B，其被配置成产生一对垂直的鞘流208B，所述鞘流208B将样品流体流208A夹在图1和图2的Z方向上，以便沿Z方向流体动力学地聚焦样品流体流208A。Z方向例如可以与显微镜108的光轴对准，即可以对应于垂直于显微镜108的焦平面的方向。此外，微流体系统200进一步可以包括两个水平或横向鞘流通道(未示出)，其被配置成产生一对水平或横向鞘流，其将样品流体流208A夹在图1和图2的视图方向的中间，以便沿着图1和图2的视图方向流体动力学地聚焦样品流体流208A。
在一些实施方案中，微流体系统200可以不包括流体动力聚焦连接处204，例如在样品流体流208A中的细胞聚集体102A、102B和单细胞104A、104B仅通过粘弹性聚焦聚焦来聚焦的情况下。在这样的实例中，在测量体积204中可以没有鞘流，并且样品流体流208A可以在测量体积202的整个高度上延伸，例如从包括照明窗口202B的底壁延伸到包括检测窗口202A的顶壁。为了在样品流体流208A中提供细胞聚集体102A、102B和单细胞104A、104B的充分限制，在这些情况下可以例如使用具有较小高度的测量体积202。测量体积202的高度可以例如为30μm至70μm，在一些实例中为40μm至60μm，例如50μm。
底座106被配置成将微流体系统200保持在相对于显微镜108的固定参考位置。底座106进一步可以被配置成相对于显微镜108定位微流体系统200，例如，沿着一个或多个方向移动微流体系统200和/或使微流体系统200围绕一个或多个轴倾斜，例如，使测量体积202的中心平面或中心线与显微镜108的焦平面对准。
装置100的显微镜108是定量相差显微镜，特别是数字全息显微镜，其被配置成通过检测窗202A拍摄测量体积202中的样品流体流208A的相移图像和强度图像。为此，显微镜108包括具有物镜110的成像系统、全息成像系统112和成像透镜114，其中成像系统被配置成将显微镜108的焦平面成像到照相机116上，照相机116例如可以是CCD或CMOS照相机。显微镜108进一步包括照明源118，其被配置成通过照明窗口202B照明测量体积202。显微镜108进一步包括显微镜控制器108A，用于控制全息成像系统112、照相机116和/或照明源118。
物镜110例如可以是数值孔径大于0.4的高NA物镜，在一些实例中，数值孔径大于0.5。物镜110的景深可以小于10μm，优选地小于5μm，在一个实例中为2μm至3μm，其中景深可以例如被定义为由物镜110聚焦的激光束的最小瑞利(Rayleigh)长度，例如在1064nm的波长。这可以允许精确地聚焦测量体积202中的对象，例如细胞聚集体102A、102B，并且可以提供足够的空间分辨率以分辨单个细胞的形态特征。
全息成像系统112被配置成例如通过将成像光束与照相机116上的参考光束进行干涉来在照相机116上创建干涉图像。成像光束例如可以是穿过测量体积202并沿着穿过全息成像系统112的第一光路从显微镜108的焦平面传播到照相机116的光束。参考光束例如可以是沿着穿过全息成像系统112的第二光路传播到照相机116的光束。在一些实例中，参考光束可以例如使用分束器或衍射光栅从成像光束分离，即参考光束也可以穿过测量体积202并且可以沿着第二光路从显微镜108的焦平面传播到照相机116。在其它实例中，参考光束可以没有穿过测量体积202，并且可以例如从测量体积202前面的成像光束分离。
数字全息显微镜108可以是轴上数字全息显微镜，其中成像光束和参考光束在干涉时沿着相同的轴传播，即以0°角干涉。显微镜控制器108A可以例如被配置成通过使用全息成像系统112改变参考光束和成像光束之间的相位偏移，从多个干涉图像提取或重建测量体积202中的样品流体流208A的相移图像以及强度图像。优选地，显微镜108是离轴数字全息显微镜，其中成像光束和参考光束以一定角度干涉。在这种情况下，显微镜控制器108A可以被配置成从单个干涉图像中提取或重建相移图像以及样品流体流208A的强度图像。或者，显微镜108可以是叠层成像装置，并且可以进行叠层图像的分析以分类细胞聚集体。
照明源118被配置成通过空间和/或时间相干光来照明测量体积202，其中照明光的相干长度可以例如大于显微镜108的视场，并且照明光的相干时间可以例如大于成像和参考光束之间的时间延迟，即使得可以在照相机116上观察到干涉图案。照明源108可以例如包括激光器或发光二极管，并且可以被配置成发射单色光，例如波长为500nm至1100nm。
显微镜控制器108A可以用硬件、软件或其组合来实现。显微镜控制器108A可以被配置成将相移和强度图像提供给另一个装置，特别是提供给装置100的控制器124，并且可以由另一个装置(例如控制器124)控制。在一些实例中，显微镜控制器108A或其一部分可以集成到控制器124中。除了重建相移和强度图像之外，显微镜控制器108A进一步可以被配置成分析相移和/或强度图像，例如，如下文针对方法300所详述的。
装置100进一步包括微流体单元120和样品制备单元122，其在一些实施方案中可以集成到单个单元中。样品制备单元122被配置成例如在试管中接收包括生物细胞的液体样品。特别地，液体样品可以是全血样品，其包括单细胞，例如血小板104A，白细胞(白细胞)104B以及红细胞(未示出)。全血样品可以进一步包括血细胞的聚集体，例如由多个血小板组成的血小板聚集体102A，由一个或多个血小板和一个或多个白细胞组成的白细胞-血小板聚集体102B和/或由多个白细胞组成的白细胞聚集体(未示出)。在其它实例中，液体样品也可以是血液成分样品，例如包含全血样品的一种或多种组分的样品。样品制备单元122被配置成通过向样品中添加粘弹性流体来从样品中制备包括生物细胞的样品流体，例如如下文方法300所述。
微流体单元120被配置成接收来自样品制备单元122的样品流体，并且被配置成通过将样品流体提供到样品通道206A的入口来产生通过测量体积202的样品流体流208A。微流体单元120进一步配置成通过向鞘流通道206B的入口提供鞘流来产生用于流体动力学地聚焦样品流体流208A的鞘流体流208B。微流体单元120可以例如包括用于样品流体和鞘流体的独立的储液器以及用于将样品流体和鞘流体提供到微流体系统200的独立的入口的一个或多个泵。
装置100包括控制器124，其被配置成控制显微镜控制器108A、微流控单元120和/或样品制备单元122。控制器124进一步被配置成分析从显微镜108获得的相移图像，并且特别地被配置成识别细胞聚集体，例如其中的细胞聚集体102A、102B，例如下文针对方法300所述。优选地，控制器124被配置成至少部分地执行方法300。控制器124可以用硬件、软件或其组合来实现。控制器124例如可以包括处理装置(未示出)和存储器(未示出)，存储器存储由处理装置执行的指令，以提供本文所述的功能。控制器124例如可以包括中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)和/或微控制器。
图3示出了根据本发明第一个方面的使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法300的流程图。方法300可例如用于检测样品(例如全血样品)中细胞聚集体的存在，其用作下文用于说明目的的非限制性实例。在其它实例中，样品可以例如是血液成分样品。方法300例如可以用图1和图2的装置100和微流体系统200来实现，其在下文用作实例说明的目的。然而，这并不意味着以任何方式进行限制，并且方法300也可以使用具有定量相差显微镜的不同装置和/或使用不同的微流体系统来实现。此外，方法300不限于图3的流程图中所示的执行顺序。只要在技术上可行，方法300可以以任意顺序执行，并且其部分可以至少部分地同时执行，例如步骤304至步骤308。
在步骤302中，制备悬浮液，其包括粘弹性流体和来自样品的生物细胞，例如单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B。悬浮液，以下也称为样本流体，可以例如使用装置100的样品制备单元122，例如通过将粘弹性流体添加到样品制备单元122的容器中的全血样品中或者反之来制备。粘弹性流体包括线性水溶性剪切稀化聚合物，例如聚(环氧乙烷)(PEO)或聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)，其中剪切稀化聚合物的分子量为2MDa至10MDa，优选地3.5MDa至4.5MDa，例如4.0MDa。制备样品流体，使得样品流体中剪切稀化聚合物的质量分数小于0.2％，优选地0.04％至0.06％，例如0.05％。在样品流体中，全血样品可以按比例稀释，稀释比例为1:50至1:200，例如1:100的比例，例如通过加入适量的粘弹性流体和/或另一种流体如水或水溶液。
在步骤302中，制备悬浮液优选不包括红细胞的裂解、血小板和红细胞的球形化和细胞的标记或染色中的任何一种。在一些实施方案中，可向全血样品中加入凝血抑制物质如乙二胺四乙酸(EDTA)以防止凝血，例如在制备样品流体之前或制备样品流体时。在一些实例中，可将血小板活化物质如凝血酶受体活化肽(TRAP)加入到全血样品或样品流体中。
在步骤304中，例如使用微流体单元120，通过微流体系统200的测量体积202产生包含单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B的样品流体的流208A。由于剪切稀化聚合物引起的剪切稀化，粘弹性流体可以在样品流体流208A中的单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B上施加流体动力。这可以引起垂直于流动方向的运动，使得单个细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B粘弹性地聚焦在样品流体流208A的中心区域，所述中心区域可以与显微镜108的焦平面对准。
同时，在步骤306中，可以通过测量体积202产生两个或更多个鞘流208B，以除了粘弹性聚焦之外进一步流体动力学地聚焦样品流体流208A，例如通过向微流体系统200的鞘流通道206B的入口提供鞘流。一对垂直鞘流208B可以在图1和图2的Z方向上夹住样品流体流208A，并且一对水平鞘流可以在图1和图2的视图方向上夹住样品流体流208A，从而在两个正交方向上限制样品流体流208A。通过调节鞘流208B的流量，可以控制测量体积202中的样品流体流208A的位置，例如使得样品流体流208A沿着测量体积202的中心线流动，并且包含在其中的单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B聚焦在显微镜108的焦平面中。在一些实施方案中，包含在粘弹性流体中的剪切稀化聚合物也可以添加到鞘流体中以用于鞘流体流动，例如使得鞘流体也变成剪切稀化流体。在一些实例中，方法300可不包括在步骤306中产生鞘流208B，而是样品流体流208A中的单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B可例如仅通过粘弹性聚焦而聚焦在显微镜108的焦平面中。例如，可以不向鞘流通道206B或没有鞘流通道206B的微流体系统200提供鞘流，并且可以使用流体动力聚焦连接处204。测量体积202沿着图2的Z方向的高度可以独立地选择，并且可以例如30μm至70μm，在一些实例中40μm至60μm，例如50μm。
为了避免损坏细胞聚集体102A、102B，选择样品流体流208A和鞘流208B的流速，使得细胞聚集体102A、102B在样品流体流208A中遭受的剪切应力小于50Pa，优选地小于10Pa，例如通过独立地调节通过样品通道206A和鞘流通道206B的流量。例如，可以选择流量，使得测量体积202中的样品流体流208A的流速为5mm/s至100mm/s，在一个实例中为8mm/s至64mm/s。
当样品流体流208A流过测量体积202时，用显微镜108拍摄样品流体流208A中的单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B的一个或多个相移图像。例如，可以选择样品流体中样品的稀释比例，使得每个相移图像包含5至50个的单个细胞或细胞聚集体，以便于将单个细胞和细胞聚集体彼此区分开。优选地，采用相移图像序列，例如具有每秒10帧至每秒200帧的帧速率。这可以允许在短时间内分析大量的单个细胞和细胞聚集体，从而有助于检测样品中很少出现的细胞聚集体类型。
在步骤310和步骤312中，例如使用装置108的显微镜控制器108A和/或控制器124来分析在步骤308中拍摄的相移图像。这包括在步骤310中识别各个相位图像中的细胞聚集体102A、102B以及单细胞104A、104B。细胞聚集体和单个细胞可以例如基于形态参数(例如平均直径和最大相移)的组合来区分，例如通过在由形态参数跨越的参数空间中定义各个区域，例如使用各个参数的一个或多个阈值。另外地或可选地，细胞聚集体也可以使用计算机视觉技术如基于神经网络的分类器来识别。步骤310进一步可以包括确定单细胞的总数、细胞聚集体的总数和/或细胞聚集体的分数，即细胞聚集体的总数与单细胞和细胞聚集体的总数的比率。
在步骤312中，可以进一步分析在步骤310中识别的单细胞104A、104B和细胞聚集体102A、102B。这尤其可以包括确定细胞聚集体102A、102B中的细胞的数目以及确定单个细胞104A、104B的细胞类型和细胞聚集体102A、102B中的细胞的细胞类型。为了确定细胞聚集体102A、102B中的细胞的数目，可以通过对与细胞聚集体102A、102B相关联的相移图像的一部分执行图像分割来识别细胞聚集体102A、102B的组成，例如使用如下文参考图5详细所述分水岭算法。随后，可以为细胞聚集体102A、102B的成分以及单细胞104A、104B确定一个或多个形态学参数，以便确定细胞聚集体102A、102B的成分和单细胞104A、104B的成分的细胞类型。例如，可以通过在由形态参数跨越的参数空间中定义各个区域来确定细胞类型。在其它实例中，可以例如使用回归分析、线性判别分析、决策树分类、随机森林分类和/或基于神经网络的分类器来确定细胞类型。
步骤312特别可用于识别相移图像中的血小板聚集体、白细胞-血小板聚集体和/或白细胞聚集体，例如用于确定相移图像中的各个聚集体的总数或分数。步骤312进一步可以包括测定包括两个或更多个白细胞的白细胞-血小板聚集体的数目或分数和/或包括三个或更多个细胞的白细胞-血小板聚集体和/或血小板聚集体的数目或分数，例如作为细菌感染的指示剂。
图4示出了使用根据本发明第一个方面的示例性实施方案的方法(例如方法300)获得的单个细胞和细胞聚集体的相移图像的四个实例。从外科重症监护中的患者的稀释和稳定的全血样品获得图像。作为预分析步骤，将血液样品在粘弹性聚合物溶液中以比例1:100稀释。聚合物溶液由99.95％磷酸盐缓冲盐水(PBS)和0.05％ PEO(4MDa)组成。在测量过程中，使用1.6μl/s的总流量和0.2μl/s的样品流量。左侧的图像包含单个血小板，中左的图像包含由三个血小板组成的血小板聚集体，中右的图像包含由三个白细胞和多个血小板组成的白细胞-血小板聚集体，右侧的图像包含由单个白细胞和多个血小板组成的白细胞-血小板聚集体。
图5的a、图5的b示出了根据本发明第一个方面的示例性实施方案的用于识别细胞聚集体的成分的图像分割的实例，其中图5的a示出了由两个白细胞和单个血小板组成的白细胞-血小板聚集体的实例，而图5的b示出了由两个白细胞和两个血小板组成的白细胞-血小板聚集体的实例。左侧的图形表示各个相移图像，右侧的图形表示在对相移图像进行分割之后的结果。使用逆距离变换经由分水岭分割来执行分割。标准变换的反向形式导致在细胞边界处的高强度和在细胞中部的低强度。在这种情况下，逆距离图中的局部最小值理想地对应于细胞的质心，并且对细胞内部的高梯度是鲁棒性的。
图6示出了根据本发明第一个方面的示例性实施方案的不同大小的单个细胞和血小板聚集体的识别。为此，从相移图像中提取单细胞和细胞聚集体的两个形态学参数，即分别绘制在左图的X和Y轴上的平均直径(当量直径)和最大相移(光学高度最大值)。在该参数空间中，如左侧的图形中的实黑线所示定义多个区域，每个区域对应于特定大小的聚集体，即单个血小板(最左边的区域)、“小聚集体”(从左侧数的第二区域)、“聚集体1”(从左侧数的第三区域)、“聚集体2”(从左侧数的第四区域)、“聚集体3”(从右侧数的第三区域)、“聚集体4”(从右侧数的第二区域)和“聚集体5”(最右侧的区域)。图6提供了分析单个细胞和细胞聚集体的相差图像的简单和容易实现的方法的实例。这种分析只依赖于两个形态学参数，而且这两个形态学参数可以容易地从相差图像中获得，并且对于图像质量的变化是鲁棒性的。即使由这两个形态学参数传递的信息不足以允许确定聚集物中血小板的数目，但是它仍然提供了一种快速和有效的按大小分类血小板聚集物的方法，例如确定聚集物大小分布的直方图。例如，可以通过确定另外的形态学参数和/或使用基于神经网络的分类器(例如，Mask R-CNN)来获得另外的信息，例如每个集合的血小板的数目。查阅K.He,G.Gkioxari,P.Doll'r，和R.Girshick，“Mask RCNN”，In:Proceedings of the IEEE Internationalconfer-ence on computer vision,2017,pp.2961-2969。
图7的a、图7的b显示了研究剪切稀化聚合物对形成血小板聚集体的影响的实验结果，其中图7的b是图7的a底部放大图。为此，制备包括血小板浓缩物和粘弹性流体的悬浮液，所述粘弹性流体含有分子量为4MDa的聚(环氧乙烷)(PEO)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且测定悬浮液中各种浓度的PEO的血小板聚集体的分数作为时间的函数。作为参考，用仅包括全血样品和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的悬浮液进行相同的实验，即不添加PEO。在PEO质量分数为0.05％和0.1％时，在PBS参比物上没有观察到明显的另外的血小板聚集体的形成。在PEO质量分数为0.15％时，观察到血小板聚集体的分数略微增加，而PEO质量分数为0.2％已经导致血小板聚集体的分数显著增加。这强调了选择悬浮液中剪切稀化聚合物的适当质量分数的重要性，以避免影响通过聚合物诱导的细胞聚集体的形成的测量结果。
根据本发明第一个方面的用于检测生物细胞的细胞聚集体的方法可以包括根据下文所述本发明第二个方面的用于检测细胞和/或分子生物对象的方法的一些或全部特征和/或步骤。根据本发明第一个方面的用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置可以包括根据下文所述本发明第二个方面的用于检测细胞和/或分子生物对象的装置的一些或全部特征和/或部件。
本发明的发明人进一步发现，如上文所述的粘弹性流体进一步特别适用于聚焦除细胞聚集体以外的物体，特别是聚焦包括彼此结合或粘附的两种或更多种成分的复合物体。如上文详述，在悬浮液中包括分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物的悬浮液中的物体的粘弹性聚焦在悬浮液中的质量分数小于0.2％时可允许各种大小的物体(例如复合物体和非复合物体)的可靠聚焦，同时降低物体上的机械应力，从而防止复合物体的损坏或崩解。
这样，如上文所述的粘弹性流体可以例如用于聚焦诸如成像标记物的标记物标记的对象，特别是生物对象。标记物可以例如被配置成选择性地结合到特定类型的对象(例如，结合到特定类型的细胞)，并且可以具有允许区分图像中的不同类型的对象(例如，不同类型的细胞)的特征几何和/或光学特性。常规的成像标记可以例如具有特征光谱特性，例如特征吸收和/或发射光谱(例如在荧光成像标记中使用的)。或者，可基于成像标记物的大小或其吸收特性(例如透射率)来区分成像标记物，参见例如H.Im et al.，PNAS vol.112,no.18,5613-5618(2015)。
用定量相差显微镜获得的相移图像可以包含比例如用常规明场显微镜获得的强度图像更多的形态学信息，并且因此可以允许区分不同类型的细胞(例如不同类型的血细胞，例如红细胞、白细胞和血小板)，而不使用成像标记，即无标记。然而，某些类型或子类型的细胞可能表现出非常相似的形态，因此即使在相移图像中也可能具有区别的挑战性。这例如适用于淋巴细胞的亚型，特别是T细胞的亚型。诸如分子对象(例如蛋白质)的其它对象可能太小而不能在显微图像中分辨这种对象的结构或形态特征。因此，即使当使用定量相差显微镜时，标记物对象的使用对于某些应用是有利的，以便能够进行可靠的检测，特别是对于临床环境中的自动高通量分析。
因此，本发明的另一个目的是提供方法，其允许快速和可靠地检测细胞和分子生物对象，并适于在临床环境中进行自动化的高通量分析。
该目的通过使用根据权利要求29的定量相差显微镜和根据权利要求41的用于检测细胞和/或分子生物对象的装置来检测细胞和/或分子生物对象的方法来实现。其实施方案在相应的从属权利要求中详细描述。
根据本发明的第二个方面，提供了使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法。所述方法包括用标记物标记来自样品的生物对象以形成复合聚集体，其中每个复合聚集体包括一个或多个所述生物对象和一个或多个所述标记物对象。制备悬浮液，其中悬浮液包括复合聚集体和粘弹性流体。粘弹性流体包括分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物，其中剪切稀化聚合物在悬浮液中的质量分数小于0.2％。悬浮液的流动沿着微流体通道产生，以将悬浮液中的复合聚集体粘弹性聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。使用定量相差显微镜拍摄悬浮液中生物对象和/或复合聚集体的一个或多个相移图像，并且在一个或多个相移图像中识别复合聚集体。
根据本发明的第二个方面的用于检测细胞和/或分子生物对象的方法可以进一步包括根据本文所述的任一实施方案的根据本发明的第一个方面的用于检测生物细胞的细胞聚集体的方法的一些或全部特征和/或步骤。
特别地，悬浮液、粘弹性流体和/或剪切稀化聚合物可以具有与以上对于根据本发明的第一个方面的方法所述类似或相同的性质。例如，剪切稀化聚合物在一些实施方案中可具有3MDa至6MDa的分子量，优选地具有3.5MDa至4.5MDa的分子量，在一个实例中具有4.0MDa的分子量。另外地或可选地，在悬浮液中剪切稀化聚合物的质量分数可以为0.03％至0.12％，优选地0.04％至0.06％，在一个实例中为0.05％。剪切稀化聚合物可以是水溶性聚合物，并且可以例如选自聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、透明质酸(HA)和聚丙烯酰胺(PAA)。优选地，剪切稀化聚合物是聚(环氧乙烷)或聚(乙烯基吡咯烷酮)。
用标记物标记的生物对象可以是或包括细胞生物对象，例如单细胞和/或细胞聚集体，特别是血细胞和/或其聚集体。一些或所有的所述生物对象可以各自例如是细胞生物对象，但是在一些实例中也可以包含另外的成分(即可以包括细胞生物对象)。细胞聚集体例如可以是彼此粘附的细胞簇。细胞聚集体可以例如包括2至100个的细胞，在一些实例中包括2至20个的细胞，在一个实例中包括2至10个的细胞。
另外地或可选地，用标记物标记的生物对象可以是或包括分子生物对象(例如生物分子)，特别是生物大分子如蛋白质和/或核酸。一些或所有的所述生物对象可以各自例如是分子生物对象，但是在一些实例中也可以包含另外的成分(即可以包括分子生物对象)。
根据本发明第二个方面的方法也可用于检测细胞聚集体，如上文针对根据本发明第一个方面的方法所详述的。细胞聚集体可以是待检测的生物对象(例如，可以使用标记物对象标记)或除了所述生物对象之外可以检测。所述方法可以例如用于检测标记的生物对象(例如标记的大分子、标记的单个细胞和/或标记的细胞聚集体)以及用于检测非标记的和/或标记的细胞聚集体。换言之，根据本发明的第一个和第二个方面的方法可以被组合用于检测(标记的)细胞和/或分子生物对象和(标记的和/或非标记的)细胞聚集体。悬浮液可以包括来自样品的生物细胞，例如以复合聚集体的形式和/或除了复合聚集体之外。可以产生悬浮液的流动，使得复合聚集体以及细胞聚集体(和任选的单细胞)聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。在一个或多个相移图像中，可以识别复合聚集体以及(标记的和/或非标记的)细胞聚集体(以及任选标记的和/或非标记的单个细胞)。
标记物没有特别限制，并且可以是或包括任何类型的对象，其可以在相移图像和/或强度图像中被识别，例如与各个图像中的其它对象区分开。标记物可以例如具有特征几何特性(例如，特征性的大小和/或形状)和/或特征性的光学特性(例如，特征性的透射率、特征性的反射率、特征性的吸收和/或发射光谱和/或特征性的折射率和/或相移)。在一些实施方案中，标记物例如可以是或包括荧光成像标记物，例如荧光基团标记的抗体，量子点和/或氮空位中心。
优选地，标记物是或包括微珠，即大小小于1mm的颗粒。微珠例如可以是椭球形和/或基本上椭球形的颗粒，特别是球形和/或基本上球形的颗粒。微珠可以例如具有特征性的大小、特征性的透射率和/或可以与特征性的相移(例如，作为特征性的大小和折射率的结果)相关联，所述特征性的相移允许识别图像中的微珠，特别是相移图像中的微珠。在一些实施方案中，微珠可以不是荧光的和/或可以是透明的(即，可以不吸收用于获得相移图像的波长的光)。
微珠可以各自具有0.5μm至100μm，优选0.5μm至30μm，在一些实例中1μm至20μm，在一个实例中2μm至10μm的物理大小(例如长度、宽度和/或高度)，特别是直径。微珠可包括具有与水的折射率(n≈1.33)显著不同和/或大于红细胞的典型折射率(n≈1.418)的折射率n(即，复折射率的实部，其确定相速度并因此确定相移)的材料或由其组成。微珠可以例如包括或由折射率为至少1.4的材料组成，在一些实例中至少1.45，在一些实例中至少1.5，优选地至少1.6，在一个实例中至少1.7，并且在一个实例中至少2.0。另外地或可选地，微珠可以例如包括折射率不大于1.1，优选地不大于0.9，在一个实例中不大于0.6的材料组成。微珠可以例如包括或由聚合物材料(例如聚苯乙烯)、金属(例如金和/或银)和/或玻璃(例如熔凝二氧化硅)组成。在一些实施方案中，标记物也可以是或包括纳米颗粒，即大小小于1μm的颗粒，在一些实例中小于500μm。
标记物可以被配置成选择性地结合到某种类型的生物对象，例如结合到与某种类型的生物对象相关联(例如存在或提供)的某种类型的结合位点。因此，来自样品的这种特定类型的生物对象(“目标对象”)可以被选择性地标记，而来自样品的其它类型的生物对象可以例如不用标记物标记，或者可以用不同类型的标记物标记，如下文详述。标记可以使用本领域已知的任何细胞标记技术进行，例如通过基于链霉抗生物素蛋白/生物素和/或基于抗体的细胞标记。本文所用的生物对象类型可以例如是指某种类型的细胞(例如某种类型的血细胞，如红细胞、白细胞或血小板)或某种亚型的细胞(例如某种白细胞亚型，如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞；一定的淋巴细胞亚型，例如B细胞、T细胞或自然杀伤细胞；或某种T细胞亚型如T辅助细胞/CD4+细胞)。在其它实例中，一种类型的生物对象可以指某种核酸或某种蛋白质。标记物可以被配置成结合到单个生物对象(例如，使得复合对象由单个生物对象和单个标记物组成)，或者可以被配置成结合到多个生物对象(例如，使得复合对象由多个生物对象和单个标记物组成)。
样品可以是从患者中提取的样品，特别是液体样品，例如血液样品(例如全血样品或血液成分样品)，例如如上文详述的。悬浮液可以例如如上文对于根据本发明的第一个方面的方法所述那样制备，例如通过将粘弹性流体(或剪切稀化聚合物)添加到样品中或反之，并且任选地稀释样品。生物对象可以在制备包括粘弹性流体的悬浮液之前和/或之后用标记物物体标记。换言之，标记生物对象和制备悬浮液的步骤可以以任意顺序执行，并且尤其进一步可以至少部分地同时执行。标记生物对象可以例如包括将标记物添加到样品和/或悬浮液中，例如通过添加包含标记物的标记流体。在一些实施方案中，粘弹性流体可以是标记流体，即也可以包含标记物。生物对象可以暴露于标记物的时间量足以允许形成复合物体，即在获取相移图像之前标记物与生物对象的结合，反之亦然。
悬浮液沿微流体通道的流动例如可以如上文针对根据本发明第一个方面的方法所详述的那样产生。悬浮液的组成，悬浮液的流速或流量和/或微流体通道的大小和/或形状可以被调整，以便在显微镜的焦平面中实现复合聚集体的粘弹性聚焦。在一些实例中，复合聚集体可以另外地或可选地流体动力学地聚焦，例如如上文详述。
生物对象和标记物对象的复合聚集体与细胞聚集体在复合聚集体也由彼此结合或粘附的两种或更多种成分组成的意义上是相似的。复合聚集体也可以是易碎的并且易于断裂，例如当暴露于机械力时。此外，复合聚集体可以在大小上不同于单独的生物对象或其它复合聚集体。因此，由于与细胞聚集体相同的原因，使用包括如上文所述的粘弹性流体的悬浮液对于使复合聚集体成像可能是有利的。特别地，这种悬浮液可以允许各种大小的物体(例如复合物体和非复合物体)的可靠聚焦，同时减小物体上的机械应力，从而防止复合物体的损坏或分解。
悬浮液和包含在其中的复合聚集体和/或生物对象的一个或多个相移图像可以如以上对于根据本发明的第一个方面的方法所述那样拍摄，例如使用数字全息显微镜，其中显微镜可以例如成像微流体通道的一部分。
一个或多个相移图像中的复合聚集体可以例如类似于上文所述细胞聚集体的识别来识别。这尤其可以包括将包括一个或多个标记物对象的复合聚集体与其他对象区分开，所述其他对象例如非聚集标记物对象(即，复合聚集体中不包含的单独的/单个标记物对象)和/或非标记生物对象(例如，不与标记物对象形成复合聚集体的单个细胞和/或细胞聚集体)。这可以进一步包括识别复合聚集体的成分，例如其中包含的生物对象(特别是细胞)的数目和/或类型和/或其中包含的标记物的数目和/或类型。标记物和/或复合聚集体可以例如基于与它们的大小、形状和/或结构有关的一个或多个形态学参数，例如平均直径(当量直径)和/或相移(光学高度)来识别(例如与生物对象区分开)。另外地或可选地，标记物和/或复合聚集物也可以使用经典的和/或基于人工智能(基于AI)的计算机视觉技术来识别，例如使用基于神经网络的分类器。此外，标记的和/或未标记的细胞聚集体和/或单细胞也可以在一个或多个相移图像中被识别，例如如上文详述。
在优选的实施方案中，在一个或多个相移图像中的合成聚合体被识别，而不依赖于或使用强度图像，即，可以仅基于一个或多个相移图像来识别。在其它实施方案中，识别一个或多个相移图像中的复合聚合体可以包括分析与一个或多个相移图像相关联的一个或多个强度图像。相移图像中的复合聚合体可以例如基于或使用各个强度图像(例如，从与相移图像相同的干涉图像重建的强度图像)来识别，例如通过识别强度图像中的各个聚合体的一个或多个组成部分。
在一些实施方案中，可以使用两种或更多种不同类型的标记物(例如，不同类型的微珠)。标记物例如可以包括第一类型的标记物和第二类型的标记物。
不同类型的标记物可以在一个或多个几何和/或光学特性上不同，从而可以在相移图像和/或强度图像中区分不同类型的标记物。不同类型的标记物(例如，第一类型的标记物和第二类型的标记物)可以例如在大小(例如，诸如直径的物理大小)和折射率中的一个或两个方面不同。例如，不同类型的标记物的物理大小(例如，对于所使用的标记物的类型的所有可能的排列)可以相差至少1μm，优选地至少2μm，最优选地至少3μm(例如，第一类型的标记物的物理大小可以比第二类型的标记物的物理大小小或大至少1μm，优选地至少2μm，最优选地至少3μm)。另外地或可选地，不同类型的标记物包括或由不同类型的标记物组成的材料的折射率可以相差至少0.1，在一些实例中相差至少0.2，优选地相差至少0.3，在一个实例中相差至少0.5。例如，可以选择物理大小和/或折射率，使得与不同类型的标记物(例如，平均、中值或最大相移/光学高度)相关的相移相差至少π(λ/2)，优选地相差至少2π(λ)，最优选地相差至少4π(2λ)。
基于它们的不同几何和/或光学特性，可以在相移图像和/或强度图像中区分不同类型的标记物。标记物的类型可以例如基于与其大小、形状和/或结构有关的一个或多个形态参数来确定，例如通过例如为各个参数定义一个或多个阈值来确定诸如平均直径(等效直径)和/或相移(光学高度)的大小。另外地或可选地，标记物的类型也可以使用传统的和/或基于人工智能(基于AI)的计算机视觉技术来确定，例如使用基于神经网络的分类器。
优选地，基于与各个标记物相关联的相移，例如使用用于所述相移的一个或多个阈值，在一个或多个相移图像中区分不同类型的标记物。例如，第二类型的标记物可以与第一类型的标记物在折射率(以及可选地在它们的大小)方面不同，并且所述方法进一步可以包括在一个或多个相移图像中，基于与各个标记物相关联的相移，将第二类型的标记物与第一类型的标记物区分开。如果所述相移低于分类阈值，则标记物可以例如被分类为第一类型的标记物，并且如果所述相移高于分类阈值，则标记物可以被分类为第二类型的标记物。在一些实施方案中，仅基于与各个标记物相关联的相移来区分不同类型的标记物(例如，不依赖于除相位信息或相移之外的任何信息)。在其它实施方案中，可以使用更复杂的分类度量来区分不同类型的标记物，例如基于标记物的相移和大小(例如，图像平面中的物理维度)的分类度量。
不同类型的标记物可以被配置成选择性地结合到生物对象上的不同类型的结合位点(例如，结合到不同的分子结构，例如不同的抗原或表位)。例如，第一类型的标记物可以被配置成选择性地结合生物对象上的第一类型的结合位点(例如，结合第一抗原)，并且第二类型的标记物可以被配置成选择性地结合生物对象上的第二类型的结合位点(例如，结合第二抗原)。
不同类型的结合位点可以与不同类型的生物对象相关联，例如，通过附着于其上的不同类型的标记物来区分不同类型的生物对象。例如，第一类型的结合位点可以是第一类型的生物对象(例如第一类型或亚型的细胞)上的结合位点，第二类型的结合位点可以是第二类型的生物对象(例如第二类型或亚型的细胞)上的结合位点。
另外地或可选地，不同类型的结合位点可以与相同类型的生物对象相关联，例如以形成包括两个或更多个标记物的复合聚集体(例如，具有夹层结构的复合聚集体，所述夹层结构包括布置在第一标记物和第二标记物之间的生物对象。例如，第一类型的结合位点和第二类型的结合位点可以是相同类型的生物对象上的不同结合位点(例如，某种类型的细胞上的不同表位或某种蛋白质上的不同分子结构)。
在一些实施方案中，用标记物标记的生物对象是或包括白细胞，尤其是淋巴细胞。第一类型的标记物可以被配置成选择性地结合第一类型的白细胞，特别是结合第一类型的淋巴细胞(例如结合T细胞或T细胞亚型，例如辅助T细胞/CD4+细胞)。第二类型的标记物可以被配置成选择性地结合第二类型的白细胞，特别是结合第二类型的淋巴细胞(例如结合B细胞或自然杀伤细胞或不同亚型的T细胞，例如细胞毒性T细胞/CD8+细胞)。这可以例如允许区分不同类型的淋巴细胞，特别是不同类型的T细胞，这由于它们相似的形态而可能难以在相移图像中彼此区分。
一些或所有标记物可以包括磁性材料或由磁性材料组成，例如顺磁性材料(例如磁化率大于10-5，优选地大于2·10-5的材料)或抗磁性材料(例如磁化率小于-10-5，优选地小于-2·10-5的材料)。优选地，各个标记物包括亚铁磁材料和/或铁磁材料或由亚铁磁材料和/或铁磁材料组成。在一个实例中，标记物中的一些或全部是超顺磁性对象。由磁性材料制成的标记物例如可以允许使用磁场来操纵复合聚集体，例如用于对对象进行分类和/或用于在某些区域中聚集对象。
另外地或可选地，一些或全部标记物可以包括具有高声阻抗的材料或由具有高声阻抗的材料组成。如本文所用，高声阻抗例如可以是指至少10N.s/m3，优选地至少30N.s/m3，在一个实例中至少50N.s/m3的声阻抗。由具有高声阻抗的材料制成的标记物例如可以允许使用诸如超声波的声波来操纵复合聚集体，例如用于分类对象和/或用于在某些区域中累积对象。
在一些实施方案中，标记物中的一些或全部可以被功能化。各个标记物例如可以包括被配置成与生物对象相互作用(例如化学地)的物质。物质例如可以是化学信使，其被配置成结合生物对象上的受体，例如激活或抑制生物对象的响应。物质可以例如布置在标记物的表面上和/或布置在标记物的表面层中。生物对象例如可以是或包括血小板和/或白细胞。一些或所有标记物对象可包括血小板活化物质以诱导血小板聚集和/或白细胞-血小板聚集，凝血抑制物质和/或白细胞活化物质，例如如上文针对根据本发明第一个方面的方法所详述的。血小板活化物质可例如选自二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶受体活化肽(TRAP)、表啡肽、凝血酶、血管假性血友病因子、C反应蛋白(CRP)、选择素P配体(PSGL-1)、纤维蛋白原、血栓烷、组织因子和胶原。另外地或可选地，一些或全部标记物可以例如包含药物，例如关卡抑制剂，一种或多种抗体药物缀合物和/或一种或多种双特异性T-细胞结合抗体构建体。
根据本发明第二个方面的方法不限于将复合聚集体聚焦在定量相差显微镜的焦平面中的特定方式，特别是不限于上文所述粘弹性聚焦。在一些实施方案中，悬浮液中的复合聚集体因此可以以与上文所述不同的方式聚焦。例如，可以使用具有不同分子量的剪切稀化聚合物，特别是具有低于2MDa的分子量的剪切稀化聚合物。另外地或可选地，悬浮液中剪切稀化聚合物的质量分数可以不同，例如0.2％或更高。此外，除了或代替粘弹性聚焦，可以使用其它聚焦技术，例如流体动力聚焦。
因此，本发明进一步提供了一种使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法，所述方法包括：(1)用标记物对象标记来自样品的生物对象以形成复合聚集体，其中每个复合聚集体包括一个或多个所述生物对象和一个或多个所述标记物对象；(2)制备包括复合聚集体的悬浮液；(3)沿着微流体通道产生悬浮液的流动，以将悬浮液中的复合聚集体粘弹性和/或流体动力学地聚焦在定量相差显微镜的焦平面中；(4)使用定量相差显微镜拍摄悬浮液中的生物对象和/或复合聚集体的一个或多个相移图像；以及(5)识别一个或多个相移图像中的复合聚集体。上文所述编号仅仅是为了清楚，并不意味着一定的执行顺序。只要在技术上可行，所述方法可以以任意顺序执行，并且其步骤可以至少部分地同时执行，例如生物对象的标记和悬浮液的制备。所述方法进一步可以包括根据本文所述的任何一个实施方案的根据本发明的第一个和第二个方面的方法的一些或全部特征和/或步骤。
根据第二个方面，本发明进一步提供了用于检测细胞和/或分子生物对象的装置，其使用根据本文所述的本发明的第二个方面的任一实施方案的用于检测细胞和/或分子生物对象的方法。装置包括配置成接收包括测量体积的微流体系统的底座。装置进一步包括显微镜，其被配置成拍摄生物对象和/或测量体积内的复合聚集体的相移图像。装置进一步包括配置成接收样品流体的微流体单元。样品流体是包括粘弹性流体和复合聚集体的悬浮液，其中每个复合聚集体包括来自样品的一个或多个生物对象和用于标记生物对象的一个或多个标记物对象。粘弹性流体包含具有2MDa至10MDa的分子量的剪切稀化聚合物，其中剪切稀化聚合物在样品流体中的质量分数小于0.2％。微流体单元被配置成产生通过测量体积的样品流体流，以将样品流体流中的复合聚集体粘弹性聚焦在显微镜的焦平面中。装置进一步包括控制器，其被配置成识别从显微镜获得的样品流体流的相移图像中的复合聚集体。
根据本发明第二个方面的装置和/或其包括微流体系统的部件可以分别类似于根据本发明第一个方面的装置及其部件。根据本发明第二个方面的装置可以包括上文所述根据本发明第一个方面的装置的一些或全部特征和/或部件，例如图1和图2的装置100的一些或全部特征和/或部件。例如，装置100可以适于检测细胞和/或分子生物对象，而不是细胞聚集体，或者除了细胞聚集体之外，例如通过独立地调整显微镜108、微流体单元120和/或控制器124。在一些实施方案中，根据本发明的第二个方面的装置进一步可以被配置成使用根据本文所述的根据本发明的第一个方面的实施方案中的任一个的方法来检测细胞聚集体。
在优选的实施方案中，根据本发明第二个方面的装置进一步包括样品制备单元，在一些实例中，所述样品制备单元可以与微流控单元集成到单个单元中。样品制备单元可以配置成提供包括分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物的粘弹性流体，以制备包括复合聚集体和粘弹性流体的样品流体，其中剪切稀化聚合物在样品流体中的质量分数小于0.2％，例如如上文对于根据本发明第一个方面的装置所详述的。样品制备单元可以被配置成调节样品流体中剪切稀化聚合物的质量分数和/或稀释样品流体，例如，如上文针对根据本发明第一个方面的装置所述。
另外地或可选地，样品制备单元可以被配置成提供用于标记来自样品的生物对象的标记物。每个标记物被配置成与一个或多个生物对象结合以形成复合聚集体，例如如上文针对根据本发明的第二个方面的方法所讨论的。样品制备单元可以例如被配置成将标记物(例如以包含标记物的标记物流体的形式)添加到样品，样品流体/悬浮液和/或粘弹性流体。在一些实施方案中，标记物可以包含在粘弹性流体中。
控制器可以被配置成执行根据本文所述的根据本发明的第二个方面的实施方案中的任一个的用于检测细胞和/或分子生物对象的方法的一些或全部步骤，例如下文所述的方法800的一些或全部步骤。为此，控制器可以被配置成例如通过产生独立的数字和/或模拟控制信号来独立地控制装置的一些或所有其它部件，特别是控制显微镜、微流控单元和/或样品制备单元。控制器可以被配置成识别相移图像中的标记物和/或例如基于与标记物相关联的大小和/或相移从如上文所述的相移图像确定标记物的类型。在一些实施方案中，控制器进一步可以被配置成执行根据本文所述的根据本发明第一个方面的实施方案中的任一个的用于检测生物细胞的细胞聚集体的方法的一些或全部步骤。
图8示出了根据本发明第二个方面的使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法800的流程图。方法800可例如用于检测样品(例如全血样品)中的细胞和/或分子生物对象，其用作以下用于说明目的的非限制性实例。在其它实例中，样品可以例如是血液成分样品或不同体液的样品。例如，方法800可以用图1和图2的装置100和微流体系统200来实现，其在以下用作说明目的的实例。然而，这并不意味着以任何方式进行限制，并且方法800也可以使用具有定量相差显微镜的不同装置和/或使用不同的微流体系统来实现。在一个实例中，方法800由装置100的控制器124至少部分地或整体地执行。此外，方法800不限于图8的流程图中所示的执行顺序。只要在技术上可行，方法800可以以任意顺序执行，并且其部分可以至少部分地同时执行，例如步骤802和步骤804。
在步骤802中，方法800包括用标记物标记来自样品的生物对象以形成复合聚集体。复合聚集体是包括一个或多个生物对象和一个或多个标记物的聚集体或簇。用于标记生物对象的例子在图9a至图9c中示意性地示出。
例如，如图9a所示，可以将第一类型的标记物900-I添加到样品中(或者添加到在步骤804中从样品制备的样品流体或悬浮液中)。标记物900-I可以例如是直径2μm至20μm，在一些实例中是2μm至10μm，在一个实例中是4μm至8μm的微珠，并且可以例如包括聚苯乙烯或由聚苯乙烯组成。标记物900-I被配置成选择性地结合到第一类型的生物对象上，例如结合到第一类型的细胞上，例如结合到白细胞的某种亚型上，特别是结合到第一类型的T细胞104B-I上，例如结合到T辅助细胞上。标记物900-I可以例如被配置成与第一类型的结合位点902-I结合，该结合位点902-I可以存在于或提供于第一类型的T细胞104B-I上。标记可以使用本领域已知的任何细胞标记技术进行，例如通过基于链霉抗生物素蛋白/生物素和/或基于抗体的细胞标记。
在一些实施方案中，第二类型的标记物900-II，例如第二类型的微珠，可以被添加到样品中(或者添加到在步骤804中从样品制备的样品流体或悬浮液中)，也如图9a所示。标记物900-II被配置成选择性地结合第二类型的生物对象，例如结合第二类型的细胞，例如结合不同亚型的白细胞，特别是结合第二类型的T细胞104B-II，例如细胞毒性T细胞。标记物900-II可以例如被配置成与第二类型的结合位点902-II结合，所述结合位点902-II可以在第二类型的T细胞104B-II上存在或提供。
第一类型的标记物900-I和第二类型的标记物900-II在一个或多个几何和/或光学特性上不同，从而可以在相移图像和/或强度图像中区分不同类型的标记物。例如，如图9a所示，标记物900-II可以大于标记物900-I。标记物900-II的直径可以例如为2μm至10μm，大于标记物900-I的直径。
图9b示意性地示出了用于标记生物对象的另一个例子。在该实例中，使用第一类型的标记物对象900-I和第二类型的标记物对象900-II标记生物大分子904如蛋白质。标记物900-I被配置成选择性地结合生物大分子904上的第一类型的结合位点902-I。标记物900-II被配置成选择性地结合相同生物大分子904上的第二类型的结合位点902-II，其中结合位点902-II可以例如被布置在生物大分子904的与结合位点902-I被布置在其上的生物大分子904的一侧相对的一侧上，以形成如图9b所示的具有夹层结构的复合聚集体。生物大分子904本身可能例如太小而不能在用显微镜108拍摄的相移图像中分辨。用标记物对象900-I和/或900-II标记生物大分子904形成复合聚集体，其大小可以显著大于生物大分子904的大小，从而可以使用显微镜108容易地检测复合聚集体。
在该示例中，标记物900-I和900-II具有相同的大小，但是它们的折射率不同，如图9b中的不同阴影线所示。标记物900-I和900-II例如可以是包括不同材料或由不同材料组成的微珠，例如折射率n(复折射率的实部)相差至少0.3的材料。标记物900-I可以例如由聚苯乙烯(n≈1.6)制成，而标记物900-II可以例如由金刚石(n≈2.4)、金(n≈0.26@λ＝1064nm)或镀金聚苯乙烯制成。
图9c示意性地示出了用于标记生物对象的又一个实例。在该实例中，功能化标记物900用于标记和激活血小板104A。标记物900可以被配置成选择性地结合到血小板104A，反之亦然。标记物900包括血小板活化物质906的表面层(例如表面涂层)，其中血小板活化物质906可以例如选自由二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶受体活化肽(TRAP)、表啡肽、凝血酶、血管假性血友病因子、C反应蛋白(CRP)、选择素P配体(PSGL-1)、纤维蛋白原、血栓素、组织因子和胶原组成的组。血小板活化物质906可以诱导血小板聚集，例如使得血小板聚集物102A形成在标记物900的表面上或附近，如图9c所示。这可以例如允许实施用于探测血小板聚集的测定。
方法800进一步包括，在步骤804中，制备包括粘弹性流体和复合聚集体的悬浮液(样品流体)，例如类似于方法300的步骤302。粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，其分子量为2MDa至10MDa，优选地3.5MDa至4.5MDa，例如4.0MDa。在悬浮液中剪切稀化聚合物的质量分数小于0.2％，优选地0.04％至0.06％，例如0.05％。在步骤802中，在标记生物对象之前或之后，可以将剪切稀化聚合物或含有剪切稀化聚合物的流体添加到样品中。剪切稀化聚合物例如可以是聚(环氧乙烷)(PEO)或聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)。
在步骤806中，悬浮液的流208A沿着微流体通道例如测量体积202产生，以将悬浮液中的复合聚集体粘弹性聚焦在定量相差显微镜例如显微镜108的焦平面中，例如类似于方法300的步骤304和步骤306。优选地，产生流208A，使得非标记的生物对象，例如非标记的单个细胞和/或非标记的细胞聚集体也聚焦在显微镜108的焦平面中。
在步骤808中，例如类似于方法300的步骤308，使用显微镜108拍摄流过测量体积202的悬浮液中的生物对象和/或复合聚集体的一个或多个相移图像。
方法800进一步包括在步骤810和步骤812中分析一个或多个相移图像，例如类似于在方法300的步骤310和步骤312中执行的图像分析。图像分析可以例如由装置100的控制器124执行。
在步骤810中，在一个或多个相移图像中识别复合聚集体。这例如可以包括识别一个或多个相移图像中的标记物，并确定另一对象(即，由各个标记物标记的生物对象)是否与标记物接触或紧邻标记物，例如在距离阈值内，反之亦然。因此，可以将单个标记物与结合在复合聚集体中的标记物区分开来。标记物和/或复合聚集体可以基于与它们的大小、形状和/或结构有关的一个或多个形态参数来识别，例如平均直径(等效直径)和/或相移(光学高度)，例如通过为各个参数定义一个或多个阈值。
在步骤812中，可以为在步骤810中识别的一些或全部复合聚集体和/或标记物确定标记物的类型，例如，以区分第一类型的标记物900-I和第二类型的标记物900-II。这可以例如允许区分第一类型的T细胞104B-I和第二类型的T细胞104B-II。标记物的类型可以例如基于与其大小、形状和/或结构有关的一个或多个形态参数来确定，例如，平均直径(等效直径)和/或相移(光学高度)，例如通过为各个参数定义一个或多个阈值。步骤812进一步可以包括识别在步骤810中识别的复合聚集体的其它成分，例如确定复合聚集体中的生物对象的数目和/或类型和/或确定复合聚集体中的标记物的数目。
分析一个或多个相移图像进一步可以包括识别一个或多个相移图像中的单个细胞和/或细胞聚集体，以及可选地分析单个细胞和/或细胞聚集体，例如以确定细胞类型，从而识别细胞聚集体的成分和/或确定细胞聚集体中的细胞数目，例如通过至少部分地执行方法300的步骤310和/或步骤312。
图10示出了复合聚集体的相移图像，其中每个聚集体包括T辅助细胞(CD4+细胞)和一对标记物对象。使用根据本发明第二个方面的示例性实施方案的方法如方法800获得相移图像，其中聚苯乙烯微珠用作标记辅助T细胞的标记物。顶部图像显示由一对各自直径为2μm的微珠标记的T辅助细胞，中心图像显示由一对各自直径为4μm的微珠标记的T辅助细胞，底部图像显示由一对各自直径为8μm的微珠标记的T辅助细胞。右侧的图形描绘了与分别用2μm珠子、4μm珠子和8μm珠子标记的T辅助细胞相比，非标记T辅助细胞的与(复合材料)对象相关的光学高度最大值(最大相移)的中值。分别用4μm珠子和8μm珠子标记的T辅助细胞显示出显著高于未标记的T辅助细胞的光学高度最大值。
本文所公开的本发明的实施方案仅构成用于说明目的的具体实例。本发明可以以各种方式和许多修改来实现，而不改变基本的基本特性。因此，本发明仅由下文所述的权利要求来限定。
参考符号列表
100–用于检测细胞聚集体和/或用于检测细胞和/或分子生物对象的装置
102A–血小板聚集体
102B–白细胞-血小板聚集体
104A–血小板
104B–白细胞
104B-I–第一类型的T细胞
104B-II–第二类型的T细胞
106–底座
108–显微镜
108A–显微镜控制器
110–对象
112–全息成像系统
14–成像透镜
116–照相机
118–照明源
120–微流体单元
122–样品制备单元
124–控制器
200–微流体系统
202–测量体积
202A–检测窗口
202B–照明窗口
204–流体动力聚焦连接处
206A–样品通道
206B–鞘流通道
208A–样品流体流
208B–鞘流
300–用于检测细胞聚集体的方法
302–从样品和粘弹性流体制备包含生物细胞的悬浮液的步骤
304–产生悬浮液流的步骤
306–产生两个或更多个鞘流的步骤
308–拍摄一个或多个相移图像的步骤
310–在一个或多个相移图像中识别细胞聚集体的步骤
312–分析一个或多个相移图像中的细胞聚集体的步骤
800–用于检测细胞和/或分子生物对象的方法
802–将生物对象从具有标记对象的样品标记为复合聚集体的步骤
804–制备包含复合聚集体和粘弹性流体的悬浮液的步骤
806–产生用于粘弹性聚焦的悬浮液流的步骤
808–拍摄生物对象和/或复合聚集体的一个或多个相移图像的步骤
810–在一个或多个相移图像中识别复合聚集体的步骤
812–确定一个或多个相移图像中的标记物的类型的步骤
900-I–第一类型的标记物
900-II–第二类型的标记物对象
902-II–第一类型的结合位点
902-II–第二类型的结合位点
904–生物高分子
906–血小板活化物质
Claims (43)
1.使用定量相差显微镜(108)检测生物细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)的方法(300)，所述方法(300)包括：
制备悬浮液，所述悬浮液包括粘弹性流体和来自样品的生物细胞(104A、104B)，其中所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2MDa至10MDa的分子量，并且其中所述悬浮液中所述剪切稀化聚合物的质量分数小于0.2％；
沿着微流体通道(202)产生悬浮液的流(208A)，以将悬浮液中的细胞聚集体(102A、102B)粘弹性地聚焦在定量相差显微镜(108)的焦平面中；
使用定量相差显微镜(108)拍摄悬浮液中生物细胞(104A、104B)的一个或多个相移图像；和
识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102A、102B)。
2.根据权利要求1所述的方法(300)，其中识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102A、102B)包括确定单独的细胞聚集体(102A、102B)中的细胞的数目和/或单独的细胞聚集体(102A、102B)中的一些或全部细胞(104A、104B)的细胞类型。
3.根据权利要求2所述的方法(300)，其中确定单独的细胞聚集体(102A、102B)中的细胞的数目和/或单独的细胞聚集体(102A、102B)中的一些或全部细胞(104A、104B)的细胞类型包括：
对与所述细胞聚集体(102A、102B)相关联的相移图像的一部分执行图像分割，以识别所述细胞聚集体(102A、102B)的成分(104A、104B)；
从分割的图像确定所述细胞聚集体(102A、102B)的一些或全部成分(104A、104B)的一个或多个形态参数；和
基于所述一个或多个形态学参数确定各个成分(104A、104B)的细胞类型。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述方法(300)进一步包括识别所述一个或多个相移图像中的单个细胞(104A、104B)，以及确定所述单个细胞(104A、104B)的细胞类型。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物具有3.5MDa至4.5MDa的分子量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物在所述悬浮液中的质量分数为0.03％至0.12％，优选0.04％至0.06％。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物是聚(环氧乙烷)或聚(乙烯基吡咯烷酮)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中选择所述悬浮液沿着所述微流体通道(202)的流速，使得所述流(208A)内的剪切应力低于50Pa，优选地低于10Pa。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中从所述微流体通道的入口到所述定量相差显微镜(108)的焦点的长度为30mm至60mm，优选35mm至50mm。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述悬浮液在垂直于所述定量相差显微镜(108)的所述焦平面的方向上的流(208A)的高度为30μm至100μm，优选40μm至60μm。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其进一步包括沿着所述微流体通道(202)产生两个或更多个鞘流(208B)以流体动力学地聚焦所述悬浮液的流(208A)，使得所述悬浮液中的细胞聚集体(102A、102B)聚焦在所述定量相差显微镜(108)的所述焦平面中。
12.根据权利要求11所述的方法(300)，其中所述两个或更多个鞘流(208B)中的一些或全部包括粘弹性流体。
13.根据权利要求11或12所述的方法(300)，其中通过在第一方向上产生夹住悬浮液的流(208A)的一对横向鞘流和在垂直于第一方向的第二方向(Z)上产生夹住悬浮液的流(208A)的一对垂直鞘流(208B)来流体动力学地聚焦悬浮液的流(208A)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述样品是全血样品或血液成分样品，并且识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102A、102B)包括识别血小板聚集体(102A)和/或白细胞-血小板聚集体(102B)。
15.根据权利要求14所述的方法(300)，其进一步包括，在所述一个或多个相移图像中，确定包括两个或更多个白细胞(104B)的白细胞-血小板聚集体(102B)的数目和/或包含三个或更多个细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)的数目。
16.根据权利要求14或15所述的方法(300)，其中制备悬浮液包括分别将全血样品或血液成分样品按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选1:50至1:200。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法(300)，其中制备所述悬浮液不包括红细胞的裂解、血小板和/或红细胞的球形化和/或细胞的标记或染色。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法(300)，其进一步包括添加血小板活化物质和/或白细胞活化物质以诱导血小板聚集和/或白细胞-血小板聚集。
19.装置(100)，其用于使用根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)检测生物细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)，所述装置(100)包括：
底架(106)，其被配置成接收包括测量体积(202)的微流体系统(200)；
显微镜(108)，其被配置成拍摄测量体积(202)中的生物细胞(104A、104B)的相移图像；
微流体单元(120)，其被配置成接收样品流体，其中所述样品流体是包括粘弹性流体和来自样品的生物细胞(104A、104B)的悬浮液，所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2Mda至10MDa的分子量，并且所述剪切稀化聚合物在所述样品流体中的质量分数小于0.2％，其中所述微流体单元(120)被配置成产生通过所述测量体积(202)的样品流体流(208A)，以将所述样品流体流(208A)中的细胞聚集体(102A、102B)粘弹性聚焦在所述显微镜(108)的焦平面中；和
控制器(124)，其被配置成从显微镜(108)获得的样品流体流(208A)的相移图像中识别细胞聚集体(102A、102B)。
20.根据权利要求19所述的装置(100)，其中：
微流体系统(200)，其进一步包括与测量体积(202)流体连通的流体动力聚焦连接处(204)，流体动力聚焦连接处(204)被配置成产生围绕样品流体流(208A)的两个或更多个鞘流(208B)，以将样品流体流(208A)流体动力地聚焦在测量体积(202)中；和
微流体单元(120)，其被配置成向流体动力聚焦连接处(204)提供鞘流体，以流体动力地聚焦测量体积(208)中的样品流体流(208A)，使得样品流体流(208A)中的细胞聚集体(102A、102B)聚焦在显微镜(108)的焦平面中。
21.根据权利要求19或20所述的装置(100)，其进一步包括，样品制备单元(122)，其被配置成提供粘弹性流体，所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2MDa至10MDa的分子量，以从所述样品和所述粘弹性流体制备包括生物细胞(104A、104B)的所述样品流体，其中所述剪切稀化聚合物在所述样品流体中的质量分数小于0.2％。
22.根据权利要求21所述的装置(100)，其中所述样品制备单元(122)被配置成将所述样品流体中的所述剪切稀化聚合物的质量分数调节为至少0.03％至0.12％，优选至少0％至0.2％。
23.根据权利要求21或22所述的装置(100)，其中所述样品制备单元(122)被配置成将所述样品流体按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选1:50至1:200。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的装置(100)，其中所述样品制备单元(122)进一步被配置成将血小板活化物质和/或白细胞活化物质添加到所述样品流体和/或所述鞘流体中。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的装置(100)，其中所述微流体单元(120)被配置成控制所述测量体积(202)中的所述样品流体流(208A)的流速，其中所述样品流体流(208A)的流速为1mm/s至250mm/s，优选5mm/s至100mm/s。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的装置(100)，其中所述控制器(124)被配置成确定所识别的细胞聚集体(102A、102B)中的细胞的数目和/或所识别的细胞聚集体(102A、102B)中的一些或全部细胞的细胞类型。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的装置(100)，其中所述控制器(124)被配置成识别所述相移图像中的血小板聚集体(102A)和/或白细胞-血小板聚集体(102B)，特别地，其中所述控制器(124)进一步被配置成确定所述相移图像中包括两个或更多个白细胞(104B)的白细胞-血小板聚集体(102B)的数目和/或包括三个或更多个细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A)的数目。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的装置(100)，其中所述控制器(124)被配置成执行权利要求1至18中任一项所述的检测生物细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)的方法(300)。
29.使用定量相差显微镜(108)检测细胞和/或分子生物对象(102A、102B、104A、104B、904)的方法(800)，所述方法(800)包括：
用标记物(900、900-I、900-II)标记来自样品的生物对象(102A、102B、104A、104B、904)以形成复合聚集体，其中所述复合聚集体中的每一个包括一个或多个所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)和一个或多个所述标记物(900、900-I、900-II)；
制备悬浮液，所述悬浮液包括复合聚集体和粘弹性流体，其中所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2MDa至10MDa的分子量，并且其中所述剪切稀化聚合物在所述悬浮液中的质量分数小于0.2％；
沿着微流体通道(202)产生悬浮液的流(208A)，以将悬浮液中的复合聚集体粘弹性地聚焦在定量相差显微镜(108)的焦平面中；
使用定量相差显微镜(108)拍摄悬浮液中生物对象(102A、102B、104A、104B、904)和/或复合聚集体的一个或多个相移图像；和
识别所述一个或多个相移图像中的复合聚集体。
30.根据权利要求29所述的方法(800)，其中所述剪切稀化聚合物具有3.5MDa至4.5MDa的分子量。
31.根据权利要求29或30所述的方法(800)，其中所述剪切稀化聚合物在所述悬浮液中的质量分数为0.03％至0.12％，优选0.04％至0.06％。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法(800)，其中所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)是或包括生物大分子(904)、单细胞(104A、104B)和细胞聚集体(102A、102B)中的一种或多种。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法(800)，其中所述标记物(900、900-I、900-II)是或包括微珠，所述微珠具有物理大小，尤其是0.5mm至30mm的直径，和/或包括具有至少1.45或不大于1.1的折射率的材料或由具有至少1.45或不大于1.1的折射率的材料组成。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法(800)，其中所述标记物(900、900-I、900-II)包括第一类型的标记物(900-I)和第二类型的标记物(900-II)，所述第二类型的标记物(900-II)在大小和折射率中的至少一个方面不同于所述第一类型的标记物(900-I)。
35.根据权利要求34所述的方法(800)，其中所述第二类型的标记物(900-II)在折射率方面不同于所述第一类型的标记物(900-I)，并且所述方法(800)进一步包括在所述一个或多个相移图像中，基于与所述各个标记物相关联的相移，将所述第二类型的标记物(900-II)与所述第一类型的标记物(900-I)区分开。
36.根据权利要求34或35所述的方法(800)，其中所述第一类型的标记物(900-I)被配置成选择性地结合到所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)上的第一类型的结合位点(902-I)，并且所述第二类型的标记物(900-II)被配置成选择性地结合到所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)上的第二类型的结合位点(902-II)。
37.根据权利要求36所述的方法(800)，其中：
第一类型的结合位点(900-I)为第一类型的生物对象(104B-I)上的结合位点，第二类型的结合位点(900-II)为第二类型的生物对象(104B-II)上的结合位点；或
第一类型的结合位点(900-I)和第二类型的结合位点(900-II)是相同类型的生物对象(904)上的不同结合位点。
38.根据权利要求36或37所述的方法(800)，其中所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)是或包括白细胞(104B)，尤其是淋巴细胞，第一类型的标记物(900-I)被配置成选择性地结合第一类型的白细胞(104B-I)，尤其是第一类型的淋巴细胞，并且第二类型的标记物(900-II)被配置成选择性地结合第二类型的白细胞(104B-II)，尤其是第二类型的淋巴细胞。
39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法(800)，其中所述标记物(900、900-I、900-II)中的一些或全部包括磁性材料和/或声阻抗至少为10N.s/m3，优选地至少为30N.s/m3的材料。
40.根据权利要求29至39中任一项所述的方法(800)，其中所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)是或包括血小板(104A)和/或白细胞(104B)，并且一些或全部所述标记物(900、900-I、900-II)包括诱导血小板聚集和/或白细胞-血小板聚集的血小板活化物质(906)、凝血抑制物质和/或白细胞活化物质。
41.装置(100)，其用于使用根据权利要求29至40中任一项所述的方法(800)检测细胞和/或分子生物对象(102A、102B、104A、104B、904)，所述装置(100)包括：
底架(106)，其被配置成接收包括测量体积(202)的微流体系统(200)；
显微镜(108)，其被配置成拍摄生物对象(102A、102B、104A、104B、904)和/或测量体积(202)中的复合聚集体的相移图像；
微流体单元(120)，其配置成接收样品流体，其中所述样品流体是包括粘弹性流体和复合聚集体的悬浮液，所述复合聚集体中的每一个包括来自样品的一个或多个生物对象(102A、102B、104A、104B、904)和用于标记所述生物对象(102A、102B、104A、104B、904)的一个或多个标记物对象(900、900-I、900-II)，所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2MDa至10MDa的分子量，并且所述剪切稀化聚合物在所述样品流体中的质量分数小于0.2％，其中所述微流体单元(120)被配置成产生通过所述测量体积(202)的所述样品流体流(208A)，以将所述样品流体流(208A)中的复合聚集体粘弹性聚焦在所述显微镜(108)的焦平面中；和
控制器(124)，其被配置成从显微镜(108)获得的样品流体流(208A)的相移图像中识别复合聚集体。
42.根据权利要求41所述的装置(100)，其进一步包括样品制备单元(122)，其被配置成提供：
粘弹性流体，其包括分子量为2MDa至10MDa的剪切稀化聚合物，以制备包括复合聚集体和粘弹性流体的样品流体，其中所述剪切稀化聚合物在所述样品流体中的质量分数小于0.2％；和/或
用于标记来自样品的生物对象(102A、102B、104A、104B、904)的标记物(900、900-I、900-II)，其中标记物(900、900-I、900-II)中的每一个被配置成与一个或多个生物对象(102A、102B、104A、104B、904)结合以形成复合聚集体。
43.根据权利要求41或42所述的装置(100)，其中所述控制器(124)被配置成执行根据权利要求29至40中任一项所述的检测细胞和/或分子生物对象(102A、102B、104A、104B、904)的方法(800)。
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