CN117746975A

CN117746975A - 一种基于trim35和sting的计算机辅助药物筛选方法、系统及设备

Info

Publication number: CN117746975A
Application number: CN202311779514.7A
Authority: CN
Inventors: 张继凯; 王刚; 孙楠
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2023-12-22
Filing date: 2023-12-22
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本申请涉及生物信息学领域，具体涉及一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法、系统及设备。包括获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；选取所述STING蛋白、TRIM35蛋白复合物的空间结构，确定复合物结合位点作为靶向药物的结合位点；采用计算机辅助筛选药物的方法得到靶向所述结合位点的候选药物。本申请通过计算机虚拟筛选药物，极大地缩短研究周期，节约研究经费，提高研究效率，对于涉及的疾病防治研究具有重要的研究意义。

Description

一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法、系统及设备

技术领域

本申请涉及生物信息学领域，具体涉及一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法、系统、设备及计算机可读存储介质。

背景技术

I型干扰素(IFN-I)信号通路是先天免疫反应的重要组成部分，在控制和消除病原体方面发挥着至关重要的作用。STING(也称为MITA)是一种关键的衔接蛋白，在RNA和DNA病原体感染时将病毒感应受体与IRF3激活联系起来；其中，cGAS-STING通路的短暂激活对于触发宿主防御以应对病原体入侵至关重要，但慢性STING激活已被证明与多种自身炎症性疾病相关，例如AicardiGoutieres综合征(AGS)、系统性红斑狼疮(SLE)和婴儿期发病的STING相关血管病变(SAVI)，以及炎症驱动的肿瘤发生。因此，需要严格控制STING活性，以防止细胞因子持续产生，否则会导致自身免疫性疾病。而通过实验发现TRIM35与STING相互作用，TRIM35在STING介导的抗病毒免疫中具有不可或缺的作用。

随着大数据、数据挖掘，云计算，硬件加速等技术的发展，计算机辅助药物设计(Computer-aided Drug Design，CADD)逐渐成为新药研发的重要手段。基于计算机的运算和模拟技术，通过学习海量药物数据中蕴含的先验知识，挖掘目标靶点和候选药物之间的相互作用关系，可以从上百万分子中快速遴选出具有类药性的活性药物分子。这极大地降低了筛选候选药物分子的盲目性，提高了研发效率。

发明内容

针对抑制STING蛋白活性的问题，本发明提出一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选的方法，利用计算机进行虚拟筛选药物，用于调控先天性免疫疾病，具体包括：

获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；

选取所述STING蛋白、TRIM35蛋白复合物的空间结构，确定复合物结合位点作为靶向药物的结合位点；

采用计算机辅助筛选药物的方法得到靶向所述结合位点的候选药物。

进一步，所述计算机辅助筛选药物的方法过程为：

获取STING蛋白与TRIM35蛋白复合物结合位点；

基于所述STING蛋白与TRIM35蛋白复合物结合位点的空间结构在分子数据库中筛选结构相似的小分子化合物；

对筛选得到的小分子化合物与STING蛋白进行分子对接计算靶向受体的亲和性/结合能得到得分，根据所述得分进行排序得到候选药物；

优选地，计算机辅助筛选药物基于STING蛋白与TRIM35蛋白复合的活性位点筛选蛋白类似物/抗体/RNA药物；或者筛选与TRIM35相似的蛋白/抗体/RNA药物，得到候选药物。

优选地，计算机辅助筛选药物基于STING蛋白与TRIM35蛋白复合的活性位点或作用靶点筛选小分子抑制剂或抗体，得到候选药物。

进一步，对筛选到的N种小分子化合物进行抑制活性实验验证，N为大于等于1的自然数，将小分子化合物与STING蛋白液混合后计算抑制率，筛选出具有抑制作用的化合物；

优选地，对所述蛋白类似物/抗体/RNA药物抑制STING蛋白活性进行实验验证，采用免疫共沉淀分析对V5标记的蛋白类似物/抗体/RNA药物和Flag-STING共转染的细胞进行无偏筛选。

所述确定复合物结合位点的方法还包括：

构建TRIM35的n种截短表达突变体，n为大于等于1的自然数；

基于所述n种截短表达突变体进行免疫共沉淀实验得到TRIM35的C端区域SPRY是与STING相互作用的关键区域；

优选地，所述STING的跨膜结构域负责关联；

优选地，所述TRIM35的C端区域SPRY与所述STING的跨膜结构域相互作用为复合物结合位点。

本发明的目的在于提供一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选系统，包括：

数据获取单元：获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；

位点确定单元：选取所述STING蛋白、TRIM35蛋白复合物的空间结构，确定复合物结合位点作为靶向药物的结合位点；

药物筛选单元：采用计算机辅助筛选药物的方法得到靶向所述结合位点的候选药物。

本发明的目的在于提供一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选设备，包括：

存储器和处理器，所述存储器用于存储程序指令；所述处理器用于调用程序指令，当程序指令被执行时实现任意一项上述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法。

本发明的目的在于提供一种计算机可读存储介质，其上有计算机程序，包括：

所述计算机程序被处理器执行时实现任意一项上述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法。

本发明的目的在于提供STING-TRIM35蛋白复合物在调控先天性免疫功能中的应用；

优选地，TRIM35蛋白的C端区域SPRY与STING蛋白的跨膜结构域相互作用；

优选地，STING-TRIM35对cGAS-STING信号通路有干扰作用；

优选地，STING-TRIM35作用于IFN-I信号通路；

优选地，STING-TRIM35作用于IFN-I的下游。

本发明的目的在于提供一种上述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选得到的药物。

本发明的目的在于提供一种药物应用，所述药物为上述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法筛选得到的药物，所述应用包括：所述药物在抑制STING与TBK1、STING与IKKε之间的相互作用中的应用；

优选地，所述药物通过与STING相互作用干扰TBK1和/或IKKε的募集，并且所述受到干扰的TBK1和/或IKKε的募集抑制cGAS-STING信号通路中的应用；

优选地，所述药物抑制STING的信号传导，并且抑制TBK1和IKKε信号传导的应用；

优选地，所述药物在调控先天性免疫功能中的应用。

本发明的优势：

1.基于TRIM35蛋白抑制STING蛋白K63泛素化修饰的关系通过计算机虚拟筛选药物，有助于提高抑制药物的筛选效率，缩短筛选周期。

2.针对TRIM35蛋白与STING蛋白相互作用，通过空间结构筛选小分子化合物或通过蛋白的活性位点筛选蛋白类似物/抗体/RNA药物，或者筛选与TRIM35相似的蛋白/抗体/RNA药物，得到候选药物，从多个方式去筛选有用的候选化合物，提高筛选到的化合物的可用性。

3.TRIM35蛋白通过抑制STING蛋白/cGAS-STING信号通路/TBK1的磷酸化调控IFN-I信号通路，对自身免疫疾病的调控发挥重要作用，基于TRIM35-STING的关系形成的复合物或通过筛选得到的药物在临床上具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获取其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法流程示意图；

图2为本发明实施例提供的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选系统示意图；

图3为本发明实施例提供的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选设备示意图；

图4为本发明实施例提供的TRIM35抑制cGAS-STING信号通路IFN-β、ISRE、和NF-κB的实验结果图

图5为本发明实施例提供的TRIM35在HEK 293T细胞和THP-1细胞中对cGAS-STING信号通路IFN-β和ISG转录的影响实验结果图；

图6为本发明实施例提供的TRIM35抑制cGAS-STING信号通路TBK1和IRF3的磷酸化的实验结果图；

图7为本发明实施例提供的TRIM35与STING相互作用的实验结果图；

图8为本发明实施例提供的TRIM35的C端SPRY区域与STING的跨膜区域相互作用的结构及实验结果图；

图9为本发明实施例提供的TRIM35减弱STING的Lys63连接的多聚泛素化的实验过程结果图；

图10为本发明实施例提供的TRIM35干扰STING招募TBK1和IKKε的实验结果图；

图11为本发明实施例提供的DelRING失去了抑制cGAS-STING信号通路介导的抗HSV-1/VSV活性的能力实验结果图；

图12为本发明实施例提供的TRIM35负调控cGAS-STING信号通路示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

在本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的描述的一些流程中，包含了按照特定顺序出现的多个操作，但是应该清楚了解，这些操作可以不按照其在本文中出现的顺序来执行或并行执行，操作的序号如S101、S102等，仅仅是用于区分开各个不同的操作，序号本身不代表任何的执行顺序。另外，这些流程可以包括更多或更少的操作，并且这些操作可以按顺序执行或并行执行。需要说明的是，本文中的“第一”、“第二”等描述，是用于区分不同的消息、设备、模块等，不代表先后顺序，也不限定“第一”和“第二”是不同的类型。

图1本发明实施例提供的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法示意图，具体包括：

S101：获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；

在一个实施例中，STING蛋白是一种含有四个跨膜结构域的蛋白，主要表达于人的巨噬细胞、T淋巴细胞、树突状细胞、内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞等的粗面内质网、线粒体及微粒体的外膜上。它被认为是继TRIF和MAVS之后的第三个衔接蛋白，在病毒、细菌及寄生虫感染触发的天然免疫反应、机体的肿瘤免疫过程以及细胞自噬过程中发挥重要的枢纽作用。

STING在DNA诱导的多种细胞类型的I型干扰素的产生中是必不可少的，对于宿主防御HSV-1(DNA病毒)的感染有着重要的作用。STING蛋白可以激活IRF3，诱导I型干扰素的产生。

此外，许多病毒可以通过与cGAS-STING通路上的信号蛋白相互作用，进而刺激机体产生与正常的免疫应答反应数量不等的干扰素，引起病毒的增殖或自身免疫性疾病；肿瘤细胞增殖能使抗原提呈细胞中的STING活化，从而激活T细胞介导的适应性免疫过程，发挥抗肿瘤作用。

在一个实施例中，TRIM35蛋白是一种与免疫相关的蛋白，具有较为广泛的作用。它参与了多种生物学过程，包括先天免疫、肿瘤免疫等。TRIM35蛋白在机体抗病毒、抗细菌和抗寄生虫感染的天然免疫应答中发挥重要作用。

在免疫方面，TRIM35蛋白是维甲酸诱导基因I(RIG-I)信号通路介导Ⅰ型干扰素(IFN)产生的正调控分子，可以促进I型干扰素的产生。TRIM35蛋白还可以通过介导LSD1赖氨酸位点422的K63泛素化来抑制LSD1的去甲基化酶活性，从而影响ERGIC1转录、自噬和IFN-γ信号传导等过程。此外，TRIM35蛋白还可以作为预测非小细胞肺癌免疫治疗结果的有希望的生物标志物，通过上调肿瘤免疫原性和T细胞浸润来抑制非小细胞肺癌的进展。

在一个具体实施例中，I型干扰素(IFN-I)信号通路是先天免疫反应的重要组成部分，在控制和消除病原体方面发挥着至关重要的作用。STING(也称为MITA、ERIS、MPYS或TMEM173)是一种关键的衔接蛋白，在RNA和DNA病原体感染时，将病毒感应受体与IRF3激活联系起来。在这里，本发明发现E3泛素连接酶三基序蛋白35(TRIM35)泛素化STING，并显著降低STING介导的IFN-β诱导。过表达TRIM35抑制cGAS-STING诱导的TBK1和IRF3磷酸化。TRIM35的过度表达会减弱病毒触发的IFNB1表达和细胞抗病毒反应。TRIM35与STING相互作用，并通过其RING结构域C36和C44位点发挥E3泛素连接酶活性靶向STING的K63连接的泛素化，从而损害了STING与TBK1或IKKε的相互作用。这些结果表明，TRIM35通过靶向STING抑制其K63连接的泛素化和下游激活，参与负调节IFN-I表达。

在一个具体实施例中，宿主细胞已经进化出多种基因编码的模式识别受体，并从入侵微生物中检测到结构保守的病原相关分子模式(PAMP)，一旦被细胞检测到，就会触发级联信号转导，最终导致抗病毒免疫反应的建立。微生物基因组RNA和DNA是主要的PAMPs，主要通过细胞质中存在的RLRs和cGAS-STING途径来鉴定。当细胞质RNA被RIG-I和MDA5检测到时，下游信号通过线粒体接头蛋白MAVS抗病毒信号被激活。细胞质中的微生物DNA或处理不当的自身DNA被cGAS感应并与DNA结合产生小的第二信使2’3’-cyclicGMP-AMP(cGAMP)，cGAMP与内质网驻留接头蛋白STING相互作用并激活STING，STING通过高尔基体从内质网转位到核周区域。当MAVS和STING被激活时，转录因子干扰素调节因子3(IRF3)和核因子kappaB(NF-κB)被磷酸化。激活后，IRF3和NF-κB转位到细胞核，启动许多先天免疫基因的转录，包括I型干扰素(IFNs)和促炎细胞因子。

在一个实施例中，含有泛素的翻译后修饰(PTM)影响靶蛋白的活性、稳定性或定位，并严格控制和调节抗病毒免疫反应的强度和持续时间。泛素是由76个氨基酸组成的保守多肽，广泛表达于真核生物的大多数组织中，通过与细胞中的其他蛋白结合发挥重要作用。泛素中的所有7个Lys残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)都可以与另一个泛素相连，从而产生不同类型的泛素链，具有不同的功能。泛素化修饰由三种协同酶介导，E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素蛋白连接酶。迄今为止，在人类基因组中已经鉴定出超过600个E3泛素蛋白连接酶，为蛋白质泛素化提供了高度的底物特异性。大量研究表明，泛素化是最常见的翻译后修饰(PTM)之一，对于微调cGAS-STING信号通路是不可或缺的。泛素化是一个由E3泛素连接酶和去泛素酶(DUB)控制的可逆过程。STING的活性受到各种泛素修饰的调控。一些E3泛素蛋白连接酶已被证明可以调节STING的转运、信号转导和降解。例如，E3泛素连接酶TRIM56和TRIM32催化K63连接的STING泛素化，从而促进TBK1向STING的募集以及STING的二聚化。RNF5靶向STING进行K48连接的泛素化和蛋白酶体依赖的降解，而RNF26催化STING在同一赖氨酸残基上进行K11连接的泛素化，从而拮抗RNF5介导的K48连接的泛素化和STING降解。TRIM13通过TM与STING相互作用，并催化STING的Lys6连接的多聚泛素化，导致ER退出减慢，加速ER触发的STING降解。

在一个具体实施例中，本发明通过免疫共沉淀实验在共转染V5标签的TRIM35和Flag标签的STING的细胞中进行了无偏筛选，发现TRIM35与STING相互作用。在这项研究中，本发明发现TRIM35减弱STING的K63泛素化修饰。因此，TRIM35减弱了STING与TBK1或IKKε之间的相互作用，以及病毒感染期间的I型干扰素信号传导。本发明的研究表明TRIM35在STING介导的抗病毒免疫中具有不可或缺的作用。

在一个具体实施例中，TRIM35抑制cGAS-STING介导的IFN-β、ISRE和NF-κB报告基因活性。泛素化已成为病毒触发的I型IFN诱导途径的关键翻译后调节机制。由于STING是这些途径中重要的衔接蛋白，因此本发明尝试明确鉴定调控STING泛素化和功能的E3泛素连接酶。在前期研究已经探索了TRIM35通过促进TRAF3的Lys63泛素化调控RLR信号通路的机制。进一步，本发明探讨TRIM35在DNA传感器信号通路中的作用，充分了解TRIM35在先天免疫中的作用。本发明通过双荧光素酶报告基因实验检测TRIM35是否可以调控cGAS-STING信号通路中的因子。结果如图4所示，在图4的A、B、C部分分别展示TRIM35抑制IFN-β、ISRE和NF-κB激活(将IFN-β-Luc(100ng,A)、ISRE-Luc(100ng,B)、NF-κB-Luc(100ng、C)和pRL-TK(10ng)质粒分别与IFN-I信号分子质粒cGAS(100ng)、STING(100ng)、TRIM35(200ng)质粒或空载体质粒共转染HEK 293T细胞。转染24h进行荧光素酶报告基因检测。所有实验均至少独立重复3次。数据以mean±SD表示；N＝3，***p<0.001，****p<0.0001。Luc：荧光素酶)，表明TRIM35通过调节cGAS-STING途径有效抑制IFN-I应答。

在一个具体实施例中，检查了TRIM35对cGAS-STING通路的IFN-I下游抗病毒反应的抑制作用。结果表明，TRIM35可以抑制HEK 293T细胞中cGAS-STING诱导的IFN-β、ISG15和ISG56基因的转录，如图5所示的A部分(将cGAS(500ng)和STING(500ng)质粒与TRIM35(1μg)或空载体质粒共转染HEK293T细胞。转染24h后，RT-PCR检测IFN-β、ISG15和ISG56 mRNA的表达)；同样，当用2’3’-cGAMP刺激THP-1细胞时，TRIM35也抑制cGAS-STING通路IFN-β、ISG15和ISG56基因的转录，如图5所示的B部分(用2’3’-cGAMP刺激稳定过表达TRIM35或对照的THP-1细胞12h，用指定引物进行RT-PCR。数据以mean±SD表示；N＝3，**p<0.01，***p<0.001。所有实验均至少独立重复3次)。这些结果表明TRIM35可以抑制cGAS-STING通路的IFN-I下游基因的抗病毒反应。

在一个具体实施例中，TBK1和IRF3是IFN-I产生的重要转录因子。IRF3和TBK1的激活是以IRF3和TBK1的磷酸化为标志。为了确定TRIM35是否通过调节TBK1或IRF3磷酸化来抑制IFN-I的产生，将编码cGAS和STING的质粒与TRIM35质粒共转染到HEK 293T细胞中，结果表明，在cGAS-STING过表达刺激下，TRIM35可以阻断TBK1和IRF3的磷酸化，如图6所示的A部分(将TRIM35(1μg)质粒与cGAS(500ng)和STING(500ng)质粒共转染HEK 293T细胞。转染24h后，用NP40裂解液裂解细胞，Western blotting检测IRF3和TBK1的磷酸化水平)。类似地，在THP-1细胞中，TRIM35阻断2’3’-cGAMP刺激下TBK1和IRF3的磷酸化，如图6所示的B部分(用2’3’-cGAMP刺激稳定过表达TRIM35或对照的THP-1细胞12h，Western blotting检测IRF3和TBK1的磷酸化水平。数据以mean±SD表示；N＝3，***p<0.001，****p<0.0001。所有实验均至少独立重复3次)。这些结果表明TRIM35通过减少TBK1的磷酸化，抑制IRF3的下游激活来抑制cGAS-STING通路的IFN-I免疫应答。

在一个具体实施例中，为了探讨TRIM35是否可以调节cGAS-STING信号通路中的因子，本发明通过双荧光素酶报告基因测定评估了TRIM35对STING、TBK1、IRF3-5D(IRF3的活性形式)活性的影响。结果显示，TRIM35抑制IFN-β激活是因为TRIM35抑制STING的活性，如图7所示的A部分，表明TRIM35可能与STING相互作用。接下来，本发明进一步通过免疫共沉淀(Co-IP)筛选与TRIM35相互作用的信号分子蛋白，以确定IFN-I反应是否是通过调节cGAS-STING通路的分子间相互作用产生的。结果发现，Flag标记的STING与V5标记的TRIM35特异性结合，而其它待测分子(cGAS、TBK1和IRF3)不能与TRIM35特异性结合，如图7所示的B部分，在DNA感应通路中，STING是重要的接头分子，具有抗病毒活性。为了进一步研究，选择了STING作为下一步研究对象。此外，本发明分别验证了TRIM35和STING之间的相互作用，如图7所示的C部分(将TRIM35-V5与带有Flag标签的STING共转染HEK 293T细胞。细胞裂解后使用抗V5抗体、抗Flag抗体或对照IgG进行免疫沉淀，并按指示进行印迹)。STING是DNA传感途径中具有抗病毒活性的重要接头分子。为了更详细地研究这一点，选择STING进行进一步分析。在正常感染过程中，STING与内源性TRIM35也存在相互作用，如图7所示的D部分。此外，GST Pull-down实验证实了TRIM35-STING的相互作用。GST-TRIM35可以拉下来STING，但单独的GST标签不能拉下来STING，也就说明TRIM35与STING确实存在相互作用，如图7所示的E部分(GST Pull-down实验检测STING与TRIM35的相互作用。用GST或GST-TRIM35瞬时转染HEK 293T细胞。36h后收集细胞裂解液，与Glutathione Sepharose4 Fast Flow孵育6h。将表达Flag标签STNG的细胞裂解物混合。随后，洗去未结合的蛋白，进行蛋白质免疫印迹杂交)。随后，共聚焦显微镜证实了TRIM35和外源STING在细胞质中存在共定位,如图7所示的F部分(在Hela细胞中，TRIM35与STING共定位于细胞质。用上述质粒转染Hela细胞。转染24h后，用4％多聚甲醛固定细胞，共聚焦显微镜观察。至少进行3次独立实验)。结果表明，TRIM35通过与STING相互作用来抑制STING活性，从而限制IFN-I的产生。

在一个具体实施例中，上述结果证实了TRIM35与STING之间的特异性相互作用。接下来本发明进行了Co-IP实验来确定STING-TRIM35结合的结构域。首先，本发明构建了TRIM35的各种截短表达突变体并进行了Co-IP实验。结果表明，TRIM35的C端区域SPRY是与STING相互作用的关键区域，如图8所示的A、B部分。此外，本发明发现TRIM35的SPRY区域足以与STING相互作用，如图8所示的C部分。另一方面，本发明发现STING的跨膜结构域负责它们的结合，如图8所示的D、E部分。这些数据共同表明TRIM35通过C端区域与STING的跨膜结构域相互作用。

在一个具体实施例中，为了探索TRIM35在STING蛋白中的作用，将升高的野生型(WT)TRIM35与STING共转染到HEK 293T细胞中。Western blot分析显示TRIM35不影响STING蛋白表达的稳定性，如图9所示的A部分。先前的研究表明，STING被各种类型的泛素链修饰，这对于抗病毒免疫至关重要。然后，利用泛素分子检测TRIM35对STING的影响。结果表明，在泛素分子存在的情况下，TRIM35不会影响STING的稳定性，如图9所示的B部分。TRIM35具有E3泛素连接酶活性，表明它可能泛素化STING，影响IFN-I的产生。考虑到TRIM35对cGAS-STING通路的负调控作用，进行了以下泛素化实验。首先，将STING和TRIM35-V5与WT HA-Ub共转染至HEK 293T细胞中。结果表明，在WT HA-Ub存在的情况下，TRIM35会明显抑制STING的多聚泛素化，如图9所示的C部分。此外，为了确定TRIM35对STING的多聚泛素化类型，构建了赖氨酸残基单突变体(K48或K63)。结果显示TRIM35削弱了STING的Lys63连接的泛素化，但不影响Lys48连接的泛素化,如图9所示的D、E部分。为了检测TRIM35诱导的STING泛素化，本发明检测了TRIM35过表达或对照细胞中STING内源泛素化水平。与对照细胞相比，TRIM35过表达细胞中STING的内源性Lys63连接的泛素链显著减少，如图9所示的F部分(用Flag标签的STING共转染过表达TRIM35的293细胞和对照293细胞，然后用抗体进行免疫共沉淀和免疫印迹分析)。进一步，为了证实TRIM35通过K63泛素化修饰对STING进行多泛素化影响，将STING-Flag与除K63突变为精氨酸(K63)或仅K63突变为精氨酸(K63R)以外的所有赖氨酸残基共转染HEK 293T细胞。Co-IP分析表明，在仅存在K63泛素突变体但不是泛素(K63R)突变体的情况下，TRIM35降低了STING的泛素化，如图8所示的G部分(将STING-Flag、TRIM35-V5和pHA-Ub突变体(K63、K63R)共转染HEK 293T细胞。然后，进行泛素化检测，并使用指定的抗体进行印迹)。

此外，体外泛素化实验表明，在HA-K63-Ub存在的情况下，TRIM35降低了STING泛素化水平。然而，过表达RING缺失突变体(DelRING)并不影响STING泛素化修饰，如图9所示的H部分(将STING与TRIM35或DelRING共转染HEK 293T细胞。转染48小时后，用抗Flag抗体进行免疫共沉淀，然后用相应抗体进行免疫印迹分析)。TRIM蛋白的E3连接酶活性需要RING结构域中的半胱氨酸(C)残基。TRIM35的RING结构域有八个半胱氨酸残基。为了确定TRIM35的RING结构域中哪些半胱氨酸残基是STING多聚泛素化所必需的，本发明进行了体外泛素化实验。结果表明，TRIM35的两个突变体C36S和C44S对STING多聚泛素化水平的修饰显著高于野生型TRIM35，如图9所示的I、J部分(将Flag标签的STING、HA-K63-Ub和V5标签的TRIM35或其突变体共转染HEK 293T细胞，并用抗Flag抗体进行免疫沉淀。STING的泛素化通过免疫印迹法检测，并使用相应的抗体进行检测)。这些数据证实了STING的K63连接的多聚泛素化减弱是由TRIM35催化的，并且主要是TRIM35的RING结构域中的C36和C44位点在泛素化过程中发挥重要作用。

在一个具体实施例中，TBK1作为IFN-I信号通路中的关键激酶，与干扰素基因刺激因子(STING)或线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)结合，诱导STING/MAVS和TBK1磷酸化和激活。IFN调节因子3(IRF3)和TBK1的进一步募集和磷酸化，诱导IFN-I的产生。首先，本发明检查了TRIM35对TBK1稳定性的影响。将逐渐升高的野生型(WT)TRIM35与TBK1共转染至HEK 293T细胞中。Western blot分析显示TRIM35不影响TBK1的稳定性，如图10所示的A部分(HEK293T细胞共转染带有Flag标签的TBK1，并逐渐增加TRIM35-V5。用指定的抗体对细胞裂解液进行免疫印迹)。接下来，本发明探讨了TRIM35对STING和TBK1之间相互作用的影响，Co-IP结果表明TRIM35以剂量依赖的方式抑制STING与TBK1的相互作用，如图10所示的B部分(HEK293T细胞共转染Flag标签的STING、HA标签的TBK1，并逐渐增加TRIM35-V5。转染48h后，利用免疫共沉淀(Co-IP)和免疫印迹(western blotting)分析TRIM35对STING与TBK1结合的影响)。

为了确认和探索IKKε在cGAS-STING信号传导中的作用，通过Co-IP检查了STING和IKKε之间的相互作用。结果表明，STING与IKKε相互作用如图10所示的C部分(将V5标签的TRIM35和Flag标签的IKKε共转染HEK 293T细胞48h。使用指示抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀和随后的蛋白质印迹)。同样，本发明检查了TRIM35对STING募集IKKε的影响。将逐渐升高的野生型(WT)TRIM35与STING和IKKε共转染至HEK 293T细胞中。结果表明，TRIM35能够以剂量依赖的方式抑制STING与IKKε的相互作用，如图10所示的D部分(HEK 293T细胞共转染Myc标签的STING、Flag标签的IKKε，并逐渐增加TRIM35-V5。转染48h后，采用免疫共沉淀(Co-IP)和Western blotting检测TRIM35对STING与IKKε结合的影响)。这些结果共同表明，TRIM35可以通过与STING相互作用并干扰TBK1和IKKε的募集来抑制cGAS-STING通路，从而不仅抑制STING信号传导，还抑制TBK1和IKKε信号传导。

TRIM35削弱cGAS-STING信号介导的抗HSV-1和抗VSV反应的影响。由于TRIM35参与STING的K63泛素化和病毒触发的IFN-β诱导，本发明研究了其在细胞抗病毒反应中的作用。首先，本发明通过双荧光素酶报告基因实验证明TRIM35的RING结构域在调控cGAS-STING信号通路的激活中发挥重要作用。结果显示，与对照相比，DelRING几乎完全失去了对cGAS-STING信号的负调控作用,如图11所示的A部分。此外，本发明发现DelRING在Hela细胞中失去了抑制cGAS-STING信号介导的抗HSV-1活性的能力，如图11所示的B部分(将TRIM35或DelRING转染Hela细胞12h后，转染2’3’-cGAMP(2mg/mL)刺激12h。用MOI为0.05的HSV-1-GFP感染细胞20h，Westernb lotting检测病毒GFP蛋白表达)。同样，本发明发现TRIM35显著抑制cGAS-STING通路的抗病毒反应，促进VSV-GFP的复制。在HEK 293T细胞中，通过荧光显微镜和流式细胞仪(如图11所示的C和D部分，将上述表达质粒转染HEK 293T细胞。24h后，用MOI为0.01的VSV-GFP感染细胞12h。通过荧光显微镜(C)观察VSV复制的GFP信号，并通过流式细胞术(D)分析感染的细胞。至少进行3次独立实验)观察到DelRING丧失了抑制cGAS-STING信号介导的抗VSV活性的能力。这表明RING结构域在TRIM35调控cGAS-STING通路介导的抗病毒反应中发挥关键作用。总而言之，所有这些数据表明TRIM35抑制STING的Lys63连接泛素化，破坏STING和TBK1/IKKε之间的相互作用，从而抑制触发的信号传导激活和抗病毒反应。

在一个具体实施例中，大多数病毒感染会触发一系列信号级联反应，导致I型IFN的表达，在细胞抗病毒反应中发挥关键作用。cGAS-STING的DNA传感通路在诱导IFN产生和抑制病毒(特别是DNA病毒)复制方面发挥着关键作用。STING是一种ER相关蛋白，对于诱导细胞内DNA或DNA病原体(包括细菌和DNA病毒)的IFN反应至关重要。当细胞质DNA与cGAS结合产生2’3’-cGAMP时，STING二聚体经历自身低聚化，从内质网转移到高尔基体，最后到溶酶体降解。当STING从ERGIC转位后，STING招募TBK1来诱导IFN和其他细胞因子的产生。在本研究中，本发明的结果表明TRIM35对cGAS-STING信号通路和STING信号依赖的抗HSV-1发挥负调控作用。目前的研究结果表明，TRIM35与STING相互作用。TRIM35靶向STING，抑制STING的K63连接泛素化，干扰STING和TBK1/IKKε的相互作用，从而抑制IFN反应应答,如图12所示。

在一个具体实施例中，病毒触发的I型IFN诱导和抗病毒反应受到信号通路各分子泛素化调控。泛素化已成为病毒触发的I型IFN诱导途径的关键翻译后调控机制。不同连接的多聚泛素链与不同的生理功能有关。在过去的几年中，K48和K63连接的泛素化被广泛研究，而由K6，K11，K27，K29和K33残基连接的其他类型的泛素化研究较少；DNA病毒感染后，STING经历四种形式的多聚泛素化：K11连接、K27连接、K48连接和K63连接，从而对STING介导的免疫信号产生不同的影响。特别是，K27连接和K63连接的多聚泛素化会激活STING。与已公开的数据一致，K63-E3连接酶TRIM32和TRIM56的过表达增强了STING依赖的IFN-I应答，并显著增强了cGAMP对STING的作用。然而，K27-E3连接酶AMFR本身或与cGAMP一起不能诱导IFN-Is，这表明AMFR的作用机制与TRIM32和TRIM56不同。本发明的研究表明，TRIM35能够通过抑制STING的K63泛素化来抑制cGAS-STING通路，从而减少IFN的产生。

在一个具体实施例中，三结构域蛋白(Tripartitemotif，TRIM)家族成员参与多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、发育、肿瘤发生、凋亡和抗病毒活性等。TRIM35最初被鉴定为肿瘤抑制因子，具有降低肿瘤细胞增殖、克隆形成和致瘤性的潜能。TRIM35包括N端RBCC结构域和C端PRY/SPRY结构域。多项研究表明，TRIM35在RLR信号天然免疫中发挥重要作用，因为它可以在病毒感染过程中催化泛素化过程。然而，TRIM35在调节cGAS-STING天然免疫中的作用尚不清楚。本发明的研究结果表明，与以往的研究相比，TRIM35采用了不同的策略来调控cGAS-STING抗病毒天然免疫反应，丰富了TRIM家族蛋白调控STING的机制，为抗病毒天然免疫调控提供了思路。

在一个具体实施例中，STING被其DNA异常激活，引起I型IFNs水平升高，导致SLE等炎症性疾病。因此，抑制I型IFNs被认为是治疗SLE的一种有前途的策略。考虑到TRIM35是STING介导的信号通路的负调控因子，TRIM35可能作为SLE治疗的靶点。TRIM35可能是治疗SLE患者I型IFN活性异常的靶点。除了STING在抗病毒天然免疫和自身免疫性炎症性疾病中的作用外，越来越多的证据表明STING参与抗肿瘤免疫反应。STING激动剂目前正作为一种新的癌症治疗策略被广泛开发。进一步明确TRIM35在肿瘤细胞STING通路中的作用，可能为开发新的肿瘤治疗药物提供新思路。

在一个具体实施例中，TRIM35是一种新型靶向STING的E3泛素连接酶。TRIM35由于其N端RING指结构域而具有E3泛素连接酶活性。体外和体内实验表明野生型TRIM35会引起STING的泛素化，但缺少RING指结构域的截短突变体不会引起STING泛素化。TRIM35的过表达抑制了STING的K63泛素化。定点突变实验表明TRIM35通过其C36和C44位点泛素化STING。尽管在I型IFN诱导和应答RNA病毒的抗病毒先天免疫机制方面已经取得了相当大的进展，但DNA病原体如何触发先天抗病毒反应尚不清楚。本发明的研究首次证明TRIM35可以靶向STING进行K63连接的泛素化并减弱其活化，在cGAS-STING信号传导中调节DNA病毒的免疫反应。因此，本发明了解到TRIM35在免疫调节过程中扮演着不同的角色，发挥着不同的作用。综上所述，这些结果表明STING的泛素化和功能受不同的E3连接酶和连锁特异性泛素的调控。本发明的发现为细胞抗病毒反应的调控机制提供了新的见解。

在一个具体实施例中，IFN-β、ISRE和NF-κB启动子荧光素酶报告质粒，GST或V5标记的TRIM35及其突变体和TBK1、IRF3和IKKε的哺乳动物表达质粒已被描述。通过标准的分子生物学技术构建了人类Flag或Myc标签的STING及其突变体的哺乳动物表达质粒。所有构建的质粒均经DNA测序证实。

在一个具体实施例中，病毒操纵。当细胞生长至80％融合时进行病毒感染。将培养基更换为无血清DMEM，根据具体实验将HSV-1/HSV-1-GFP以不同感染复数(MOI)加入培养基中。1h后，去除培养基，细胞用含10％FBS的DMEM培养。

在一个具体实施例中，抗体：anti-STING(19851-1-AP；Proteintech),anti-Myc(M4439 Sigma Aldrich),anti-HA(51064–2-AP；Proteintech),anti-V5(V8012,V8137；Sigma Aldrich),anti-GST(10000–0-AP；Proteintech),anti-Flag(F1804,F7425；SigmaAldrich),anti-GAPDH(10494–1-AP；Proteintech),anti-IRF3(4302；CST),anti-TBK1(3504；CST),phospho-TBK1(Ser172)(5483；CST),andphospho-IRF3(Ser396)(4947；CST)。Alexa Fluor 633goat anti-mouse IgG(H+L)(A21050)and Alexa Fluor 488donkeyanti-rabbit IgG(H+L)(A21206)购自Life Technologies公司。Dy Light 800goat anti-mouse IgG(H+L)(072–07-18-06)and Dy Light 700goat anti-rabbit IgG(H+L)(072–07-15-06)均由KPL公司提供，按照标准操作程序稀释抗体，进行western blot和免疫荧光检测。

在一个具体实施例中，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)。将上述质粒转染HEK 293T细胞。转染24h后，收集细胞，用NP40裂解液裂解细胞。对于每个IP反应，1mL的裂解液与相应的抗体在4℃下缓慢摇动孵育12h，然后加入指示体积的琼脂糖珠在4℃下孵育8h。用PBS洗涤后，用指示抗体进行免疫印迹。

在一个具体实施例中，Western blotting检测。将上述质粒共转染HEK 293T细胞。转染后24h，用NP40裂解液裂解细胞。收集细胞总蛋白，煮沸10min，加入5×SDS上样缓冲液，4℃下10000×g离心10min，取上清液进行SDS-PAGE电泳。在室温下用5％牛奶封闭2小时，然后在4℃下与特异性一抗孵育12小时。用TBST洗涤后，将膜与二抗在室温下孵育1小时。然后用Odyssey观察蛋白条带并成像。

在一个具体实施例中，GST-Pull Down实验。首先，纯化GST或GST-TRIM35融合蛋白，与表达Flag-STING的细胞裂解物在4℃下混合过夜。用鼠抗Flag和兔抗GST抗体进行Western blot，以检测被GST-琼脂糖拖拽的蛋白。

在一个具体实施例中，免疫荧光检测。细胞用4％多聚甲醛室温固定30min，然后用0.5％TritonX-100透化。PBS漂洗3次后，用3％BSA室温封闭1h。一抗(兔抗V5抗体,小鼠抗Flag抗体)室温孵育1h，二抗室温孵育40min。最后，DAPI染色后，使用Zeiss LSM880扫描共聚焦显微镜获得共聚焦图像。

在一个具体实施例中，双荧光素酶报告基因检测。使用Lipofectamine^TM2000将报告质粒IFN-β-Luc(100ng)、ISRE-Luc(100ng)和NF-κB-Luc(100ng)分别与pRL-TK质粒(10ng)和指示质粒或空载体质粒共转染HEK 293T细胞。转染24h后，用1×裂解液(passivelysis buffer，PLB)在室温下处理细胞20min，然后离心收集上清，使用双荧光素酶报告系统测定萤火虫和海肾荧光素酶的活性。所有实验均至少独立重复3次。

在一个具体实施例中，统计学分析。本研究数据采用Graph Pad Prism8软件进行处理，结果以算术平均值±标准差表示。组内或组间差异采用Student’s-t检验进行分析。所有实验至少重复三次。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****p<0.0001定义为具有统计学意义。

在一个具体实施例中，Real-time PCR分析。从指示细胞中提取总RNA，使用PrimeScript^TMRT试剂盒将1μg RNA逆转录为cDNA。取1μL cDNA作为模板，在Lightcycler480系统中使用SYBR green qPCR mix进行RT-PCR。用人GAPDH进行归一化处理，结果采用2^-ΔΔCT法计算。所有样品均重复3次。

S102：选取所述STING蛋白、TRIM35蛋白复合物的空间结构，确定复合物结合位点作为靶向药物的结合位点；

在一个实施例中，虚拟筛选在靶向药物设计中是一种重要方法。其流程大致如下：

首先，基于已知的药物与靶标蛋白的复合物结构，研究药物与靶标蛋白的结合模式，确定关键的氨基酸残基。这一步骤有助于了解药物如何与靶标蛋白相互作用，并为后续的虚拟筛选提供依据。

接下来，利用计算机辅助药物设计方法，对大量的小分子化合物进行虚拟筛选。在这个过程中，小分子化合物与靶标蛋白的结合能力会被预测和评估。通常，结合能低、形状互补性好的小分子会被选为潜在的候选药物。

最后，对筛选出的候选药物进行进一步的实验验证，确认其与靶标蛋白的相互作用以及生物活性。

在一个实施例中，在虚拟筛选中，结合位点是指靶蛋白上与小分子化合物结合的区域。为了进行基于受体的虚拟筛选，首先需要确定靶蛋白的结合位点。这通常通过对靶蛋白的结构进行分析和研究来实现。

一旦确定了结合位点，就可以使用计算机辅助药物设计的方法，将小分子化合物库中的化合物与靶蛋白进行对接。对接过程中，计算机会模拟化合物与结合位点的相互作用，并评估它们的结合能力。根据对接结果，可以筛选出与靶蛋白结合能力较强的小分子化合物，作为潜在的候选药物。虚拟筛选结合位点的确定对于药物设计的成功与否至关重要。因此，在确定结合位点时，需要考虑多种因素，如靶蛋白的结构特点、已知配体的结合模式等。同时，在虚拟筛选过程中，也需要对结合位点进行合理的处理和优化，以提高筛选的准确性和效率。

在一个实施例中，所述确定复合物结合位点的方法还包括：

构建TRIM35的n种截短表达突变体，n为大于等于1的自然数；

优选地，所述STING的跨膜结构域负责关联；

S103：采用计算机辅助筛选药物的方法得到靶向所述结合位点的候选药物。

在一个实施例中，计算机辅助药物筛选是一种利用计算机辅助药物设计方法进行药物筛选的技术。它可以帮助研究人员在大量小分子化合物中快速筛选出与靶标蛋白结合能力强、具有潜在药效的候选药物。

在一个实施例中，分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。它主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。这种方法在药物研发的早期阶段被广泛使用，可以帮助科研人员快速筛选出具有潜在药效的化合物。

分子对接方法主要关注的是空间匹配和能量匹配。空间匹配是指药物分子与受体蛋白之间的几何形状互补，而能量匹配则是指药物分子与受体蛋白之间相互作用的最小化。对于几何匹配的计算，通常采用格点计算、片段生长等方法，而能量计算则使用模拟退火、遗传算法等方法。

根据简化的程度和方式，分子对接方法可以分为刚性对接、半柔性对接和柔性对接。刚性对接方法在计算过程中，参与对接的分子构像不发生变化，仅改变分子的空间位置与姿态。半柔性对接则在计算中允许部分构像发生变化。柔性对接则允许更多的构像变化。

在一个实施例中，虚拟筛选中使用的分子库主要有以下几种：

ZINC：包含超过2.5亿个可购买到的化合物，用于小分子虚拟筛选。

PubChem：包含生物活性物质，用于小分子虚拟筛选。

DrugBank：包含药物和小分子，用于药物设计和发现。

ChEMBL：包含小分子，用于药物发现和化学基因组学研究。

ChemDB：包含大量已知小分子，用于化学基因组学研究和药物发现。

HMDB：包含大量已知小分子，用于化学基因组学研究和药物发现。

BindingDB：包含大量已知小分子，用于化学基因组学研究和药物发现。

SMPDB：包含大量已知小分子，用于化学基因组学研究和药物发现。

此外，还有一些商业数据库如ChemDiv、Enamine、Lifechemicals、

Specs、Chembridge、Maybridge、Microsource、Vitas-M和Interbioscreen等，

这些数据库也常被用于虚拟筛选。

在一个实施例中，所述计算机辅助筛选药物的方法过程为：

获取STING蛋白与TRIM35蛋白复合物结合位点；

在一个实施例中，对筛选到的N种小分子化合物进行抑制活性实验验证，N为大于等于1的自然数，将小分子化合物与STING蛋白液混合后计算抑制率，筛选出具有抑制作用的化合物；

在一个实施例中，对所述蛋白类似物/抗体/RNA药物抑制STING蛋白活性进行实验验证，采用免疫共沉淀分析对V5标记的蛋白类似物/抗体/RNA药物和Flag-STING共转染的细胞进行无偏筛选。

在一个实施例中，在分子对接中，亲和性是指分子与受体结合的紧密程度。高亲和性意味着结合更加稳定，而低亲和性则表示结合不那么稳定。亲和性通常是通过计算得到的，例如通过计算结合自由能(ΔG)或结合常数(Kd)。

在分子对接过程中，亲和性取决于分子与受体之间的相互作用，包括氢键、范德华力、静电相互作用等。这些相互作用共同决定了分子与受体之间的结合方式，从而影响了亲和性。

为了评估亲和性，通常会采用一些评分系统或打分方法来量化分子与受体之间的相互作用。这些评分方法基于不同的算法和物理模型，可以反映分子与受体之间的结合能、相互作用类型和亲和力等。

在一个实施例中，基于蛋白设计蛋白类似物、抗体等药物的过程和方法可以归纳为以下几个方面：

确定目标蛋白：首先需要确定要设计药物的目标蛋白，即靶点。靶点可以是已知的疾病相关蛋白、病毒抗原或其他生物分子。

蛋白结构分析：对目标蛋白进行结构分析，了解其三维构象、表面构型、亚域结构等特征。这可以通过X射线晶体衍射、核磁共振等技术获得。

确定药物与蛋白的相互作用：研究药物与目标蛋白之间的相互作用机制，包括结合位点、结合方式以及结合动力学等。这可以通过计算机模拟、实验室实验等方法完成。

设计药物：根据药物与目标蛋白的相互作用机制，设计能够与目标蛋白特异性结合的药物分子。这包括选择合适的药物类型、设计分子的化学结构、优化分子的药效和药代动力学性质等。

合成和验证药物：通过化学合成等方法制备药物分子，并对其进行生物活性、安全性和药代动力学性质的验证。这包括细胞实验、动物实验和临床试验等不同阶段。

在一个实施例中，蛋白类似物指的是与体内某种蛋白质具有相似结构和功能的物质。它们可以模拟蛋白质的功能，从而在疾病治疗中发挥重要作用。例如，胰岛素就是一种蛋白类似物，用于治疗糖尿病。

抗体是机体免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗体的结构主要分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y”的两臂末端。

RNA药物是基于RNA的特性和在细胞内的作用机制而设计的一类药物。RNA在细胞内可以作为信使RNA(mRNA)指导蛋白质的合成，也可以作为微RNA(miRNA)调控基因的表达。因此，设计合理的RNA药物可以用于调节细胞内的基因表达，从而达到治疗疾病的目的。例如，许多研究正在探索使用mRNA疫苗来预防和治疗各种传染病。

在一个实施例中，小分子化合物进行抑制活性实验的一般步骤如下：

选择合适的靶蛋白：根据研究目的和疾病目标，选择合适的靶蛋白作为实验对象。确保靶蛋白与所研究的小分子化合物具有潜在的相互作用。

制备小分子化合物：合成或购买所需的小分子化合物，并确保其纯度和结构准确性。根据需要，可以对小分子化合物进行修饰或改造，以优化其抑制活性。

酶活性测定：设计适当的酶活性测定方法，以评估小分子化合物对靶蛋白的抑制活性。这可以通过荧光共振能量转移(FRET)、放射性同位素标记、酶联免疫吸附试验(ELISA)等技术实现。确保测定方法可靠、灵敏，并能够准确反映小分子化合物与靶蛋白的相互作用。

实验操作：将不同浓度的小分子化合物与靶蛋白混合，在适当的条件下孵育一段时间，然后测定酶活性。根据实验设计，可以设置对照组和实验组，以比较不同小分子化合物的抑制活性。

数据分析：通过对实验数据进行统计分析，确定小分子化合物的IC50值(即抑制50％酶活性所需的化合物浓度)。IC50值越小，表示小分子化合物的抑制活性越强。此外，还可以绘制剂量-效应曲线，以直观展示小分子化合物的抑制活性。

结果解释和讨论：根据实验结果，分析小分子化合物对靶蛋白的抑制活性，并结合其结构和性质进行讨论。探讨可能的结合模式、作用机制以及与已知抑制剂的比较。此外，还可以进一步研究小分子化合物对细胞或生物体的影响，以评估其潜在的药物候选性。

在一个实施例中，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白来鉴定体内相关的蛋白-蛋白相互作用，是研究蛋白质互作的经典方法。特异性抗体捕获样品中的靶蛋白，形成抗体-靶蛋白复合物，然后利用能够与抗体结合的珠状支持物(例如Nanoab-Agarose)来固定和沉淀复合物，同时与靶蛋白相互作用的蛋白也会被沉淀下来，最后洗去与靶蛋白相结合的非特异性蛋白，再通过SDS-PAGE进行分析、Westernblot检测。

在一个实施例中，共转染是指同时转染两个独立的核酸分子，例如质粒DNA和siRNA，是稳定转染的常用程序。共转染的物理过程是将两种核酸分子整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达，它涉及到选择正确的共转染试剂并使用先进的脂质纳米颗粒技术实现卓越的转染性能和可重现的结果。共转染的目的是使细胞同时表达两种不同的基因标记，例如对某种毒素产生抗性。

在一个实施例中，通过计算机辅助筛选药物技术筛选药物的包括下列的一种或几种：蛋白-小分子对接、蛋白-蛋白对接、蛋白-核酸对接。

在一个实施例中，蛋白-小分子对接是指通过一定的算法和程序，将蛋白质和小分子(如药物分子)的结构对接在一起的计算模拟过程。这个过程可以用来研究蛋白质与小分子之间的相互作用，以及可能的生物功能。

在蛋白-小分子对接中，通常采用DOCK等软件进行计算模拟。DOCK是一款自动化程度较高的药物设计软件，能够实现小分子配体与生物大分子受体之间的对接。它采用了基于片段的打分方法，能够实现快速、准确的对接。DOCK软件的基本算法包括两个阶段。第一个阶段是低精度阶段，主要搜索小分子配体与生物大分子受体之间的粗略匹配。第二个阶段是高精度阶段，在这个阶段会考虑全部的侧链构象，计算更加精确的相互作用能量。在低精度阶段，DOCK软件会随机平移和转动小分子配体，并进行一定数量的刚性体移动，然后计算相互作用能量。输出最低的构象后，进入高精度阶段。在高精度阶段，程序会进行更多的优化和调整，以实现更加精确的对接。

在一个实施例中，蛋白-蛋白对接是指通过一定的算法和程序，将两个蛋白质的结构对接在一起的计算模拟过程。这个过程可以用来研究蛋白质之间的相互作用，以及可能的生物功能。

RosettaDock是一种常用的蛋白-蛋白对接软件，它采用了基于片段的打分方法，能够实现快速、准确的蛋白质对接。该软件能够实现对接过程中对侧链构象的精确调整，并考虑了多种复杂的相互作用，如氢键、离子键、疏水相互作用等。RosettaDock的基本算法包括两个阶段。第一个阶段是低精度阶段，主要搜索两个蛋白质之间的骨架形状相适配的程度。第二个阶段是高精度阶段，在这个阶段会考虑全部的侧链构象，计算更加精确的相互作用能量。在低精度阶段，程序会随机平移和转动一个蛋白质分子的某个组分，并进行一定数量的刚性体移动，然后计算相互作用能量。输出最低的构象后，进入高精度阶段。在高精度阶段，程序会进行50次MCMPCycle：重新排列构象并最小化相互作用能量，以此作为初始出发构象。

在一个实施例中，蛋白-核酸对接是指通过一定的算法和程序，将蛋白质和核酸(如DNA或RNA)的结构对接在一起的计算模拟过程。这个过程可以用来研究蛋白质与核酸之间的相互作用，以及可能的生物功能。

在蛋白-核酸对接中，通常采用NAflex等软件进行计算模拟。NAflex是一款专门针对核酸结构预测和设计而开发的软件，能够实现DNA或RNA分子的准确建模和对接。NAflex软件采用了基于片段的打分方法，能够实现快速、准确的对接。它考虑了多种复杂的相互作用，如氢键、离子键、疏水相互作用等，并能够实现对接过程中对侧链构象的精确调整。NAflex软件的基本算法包括两个阶段。第一个阶段是低精度阶段，主要搜索蛋白质与核酸之间的粗略匹配。第二个阶段是高精度阶段，在这个阶段会考虑全部的侧链构象，计算更加精确的相互作用能量。在低精度阶段，NAflex软件会随机平移和转动核酸分子，并进行一定数量的刚性体移动，然后计算相互作用能量。输出最低的构象后，进入高精度阶段。在高精度阶段，程序会进行更多的优化和调整，以实现更加精确的对接。

图2本发明实施例提供的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选系统示意图，具体包括：

数据获取单元：获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；

图3本发明实施例提供的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选设备示意图，具体包括：

存储器和处理器；所述存储器用于存储程序指令；所述处理器用于调用程序指令，当程序指令被执行任意一项上述的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法。

一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时任意一项上述的一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法。

STING-TRIM35蛋白复合物在调控先天性免疫功能中的应用；

优选地，TRIM35蛋白的C端区域SPRY与STING蛋白的跨膜结构域相互作用；优选地，STING-TRIM35对cGAS-STING信号通路有干扰作用；

优选地，STING-TRIM35作用于IFN-I信号通路；

优选地，STING-TRIM35作用于IFN-I的下游。

一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法筛选得到的药物。

药物的应用，所述药物为基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法筛选得到的药物，所述应用包括：所述药物在抑制STING与TBK1、STING与IKKε之间的相互作用中的应用；

优选地，所述药物在调控先天性免疫功能中的应用。

本验证实施例的验证结果表明，为适应症分配固有权重相对于默认设置来说可以改善本方法的性能。所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为描述的方便和简洁，上述描述的系统，装置和单元的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的系统，装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。另外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能单元的形式实现。本领域普通技术人员可以理解上述实施例的各种方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件来完成，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器(ROM，Read Only Memory)、随机存取存储器(RAM，Random AccessMemory)、磁盘或光盘等。

本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，上述提到的介质存储可以是只读存储器，磁盘或光盘等。

以上对本发明所提供的一种计算机设备进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法，其特征在于，所述方法具体包括：

获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；

2.根据权利要求1所述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法，其特征在于，

所述计算机辅助筛选药物的方法过程为：

获取STING蛋白与TRIM35蛋白复合物结合位点；

优选地，计算机辅助筛选药物基于STING蛋白与TRIM35蛋白复合的活性位点筛选蛋白类似物/抗体/RNA药物；或者筛选与TRIM35相似的蛋白/抗体/RNA药物，得到候选药物；

3.根据权利要求2所述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法，其特征在于，对筛选到的N种小分子化合物进行抑制活性实验验证，N为大于等于1的自然数，将小分子化合物与STING蛋白液混合后计算抑制率，筛选出具有抑制作用的化合物；

4.根据权利要求1或2所述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法，其特征在于，

所述确定复合物结合位点的方法还包括：

构建TRIM35的n种截短表达突变体，n为大于等于1的自然数；

优选地，所述STING的跨膜结构域负责关联；

5.一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选系统，其特征在于，包括：

数据获取单元：获取STING蛋白、TRIM35蛋白数据；

6.一种基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选设备，其特征在于，包括：

存储器和处理器，所述存储器用于存储程序指令；所述处理器用于调用程序指令，当程序指令被执行时实现权利要求1-4任意一项上述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法。

7.一种计算机可读存储介质，其上有计算机程序，其特征在于，包括：

所述计算机程序被处理器执行时实现权利要求1-4任意一项上述的基于TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法。

8.STING-TRIM35蛋白复合物在调控先天性免疫功能中的应用；

优选地，STING-TRIM35对cGAS-STING信号通路有干扰作用；

优选地，STING-TRIM35作用于IFN-I信号通路；

优选地，STING-TRIM35作用于IFN-I的下游。

9.一种基于权利要求1-4中TRIM35和STING的计算机辅助药物筛选方法筛选得到的药物。

10.药物的应用，所述药物为权利要求9中的药物，所述应用包括：所述药物在抑制STING与TBK1、STING与IKKε之间的相互作用中的应用；

优选地，所述药物在调控先天性免疫功能中的应用。