CN117737033A - 一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用，所述Cas12a变体的氨基酸序列如SED ID NO.1所示。本发明通过构建FnCas12a的K1065E突变体，提高FnCas12a对双链DNA切割的靶向特异性，降低其脱靶概率。所述Cas12a变体的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，特别涉及一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用。
背景技术
基于CRISPR/Cas系统的基因编辑方法自问世以来，在基础研究、疾病诊断和临床治疗等领域得到了广泛的应用。除了最早被应用于基因编辑的CRISPR/Cas9系统，Cas12a作为CRISPRⅡ类效应蛋白的成员，亦受到了科学界的广泛关注。相比于Cas9蛋白需要crRNA和tracrRNA两个分子才实现对双链DNA分子的切割，Cas12a只需要单一的crRNA诱导即可完成对目标双链DNA的有效切割(如图1)。同时，CRISPR/Cas12a蛋白在完成对目标双链DNA的顺式切割后保持催化活化状态，随后开启对单链DNA的非靶向反式切割，具有疾病和病毒检测的潜在应用。此外，通常Cas9偏好的PAM序列通常富含G，而Cas12a所偏好的PAM序列则富含T，此特性更能与Cas9优势互补，拓宽基因编辑的范围。目前，仅有Francisella tularensisCas12a(FnCas12a)、Acidaminococcus sp.Cas12a(AsCas12a)与Lachnospiraceaebacterium Cas12a(LbCas12a)三种Cas12a蛋白被报道具有核酸内切酶和基因组编辑的功能。尽管现有的野生型Cas12a的脱靶率低于Cas9，但其脱靶问题依然存在，即Cas12a可以耐受部分靶标区域序列的碱基错配，可识别并切割非完全互补的靶向区域。因此如何降低CRISPR/Cas基因编辑系统的脱靶概率是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用。本发明聚焦于FnCas12a，将FnCas12a的1065号位点的赖氨酸(K)替换成谷氨酸(E)，得到一种新型的K1065E突变体，相较于野生型的FnCas12a，提高了其靶向特异性，减少脱靶。
本发明提供一种Cas12a变体，所述Cas12a变体的氨基酸序列如SED ID NO.1所示，所述Cas12a变体蛋白具有增加的相对于相应的野生型Cas12a蛋白的DNA切割选择性。
本发明还提供一种重组表达载体，所述重组载体表达所述的Cas12a变体。
进一步的，所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的任意一种。
本发明还提供一种重组菌或重组细胞系或重组病毒，包含所述的重组表达载体。
本发明还提供一种重组病毒，所述重组病毒采用所述的病毒载体包装获得，所述重组病毒包括表达所述的Cas12a变体的腺病毒或慢病毒。
本发明还提供所述的Cas12a变体、所述的重组表达载体、所述的重组菌或重组细胞系和所述的重组病毒在基因编辑中的应用。
本发明还提供一种包括所述Cas12a变体的CRISPR/Cas12a基因编辑系统。
进一步的，所述系统还包括：靶向目标基因的crRNA。
本发明还提供一种对受体中的目的基因进行基因编辑的方法，借助CRISPR/Cas12a系统对受体中的目的基因进行基因编辑，所述方法包括通过将所述的重组表达载体导入受体提供Cas12a变体。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
本发明通过构建FnCas12a的K1065E突变体，提高FnCas12a对双链DNA切割的靶向特异性，降低其脱靶概率。本发明FnCas12a的K1065E突变体具有比野生型FnCas12a更高的靶向特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为现有技术中Cas12a的示意图。
图2为本发明实施例提出的野生型和K1065E突变型FnCas12a的单一错配体外切割实验。
图3为本发明实施例提出的野生型和K1065E突变型FnCas12a的双错配体外切割实验。
图4为本发明实施例提出的野生型和K1065E突变型FnCas12a的针对非经典PAM序列体外切割实验。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明提供一种新型的FnCas12a突变体K1065E，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。FnCas12a的K1065E突变体氨基酸序列蛋白质全长为1326个氨基酸。体外双链DNA酶切实验显示，该突变体FnCas12a比野生型FnCas12a对单一碱基错配序列更敏感。即在靠近protospacer adjacent motif(PAM)区域的单一碱基错配即可有效降低潜在的脱靶效应。进一步的实验显示K1065E突变体能够规避野生型FnCas12a蛋白在第5和第6位双位点突变的非特异性切割，证明K1065E突变体具有更高的靶向特异性。
除特殊说明外，本发明采用的所有的试剂、原材料、技术服务和仪器设备均可通过市场购买获得。
实施例
使用野生型和K1065E突变型的FnCas12a分别对WT位点(无错配)，1至7号错配位点的质粒进行切割，具体操作如下，分为两个部分：
第一部分为碱基不匹配的DNA产物构建；
第二部分为体外的Cas12a切割实验。
(一)碱基不匹配的DNA产物构建
碱基互补的寡核苷酸经退火后，导入质粒pUC19的EcoRⅠ和HindIII酶切位点之间。该寡核苷酸的靶标链与FnCas12a的crRNA互补，含有单一碱基的不匹配，或含有双碱基的不匹配，序列如表1所示。将酶切连接后的pUC19质粒转入感受态大肠杆菌中，涂板，挑选大肠杆菌单克隆做测序，确定重组后质粒的序列。构建好所有的质粒后，取2μg质粒，加入到1×的rCutSmart缓冲液，使用40个单位的SspI-HF限制性内切酶在37℃下反应2小时，使其充分线性化质粒，最终的反应体积为20μL。随后，65℃加热20分钟，使SspI-HF酶失活。即可得到Cas12a切割所用的DNA产物。
表1crRNA和寡核苷酸序列
(二)Cas12a的体外切割实验
首先将FnCas12a和crRNA在镁离子存在的条件下于37℃孵育10分钟，随后再加入(一)中所得到的DNA产物，进行切割反应。具体的反应比例如表2所示：
表2
| 母液为10μM的FnCas12a | 加入5μL(终浓度为2.5μM) |
| 母液为10μM的crRNA | 加入2μL(终浓度为1μM) |
| 母液为100mM MgCl2 | 加入1μL(终浓度为5mM) |
| 线性化后的DNA | 加入250ng |
| 无核酸酶的水 | 补齐至终体积为20μL |
切割反应在37℃的条件下反应10分钟后，加入EDTA和蛋白酶K至终浓度分别为80mM和0.8mg/mL，在37℃条件下孵育30分钟，使其终止切割反应。将切割后的产物加入6×的DNA上样缓冲液，上样到琼脂糖胶中，施加电压，使其分离，随后拍照成像。
单一错配体外切割的结果如图2所示，野生型和K1065E突变型FnCas12a对无错配的质粒都可以完全切割，得到切割产物1和2。但野生型的FnCas12a对第1至第7号错配位点依然有切割，而K1065E突变型FnCas12a对第1至第7号错配位点的切割较少，说明其相对于野生型具有更高的特异性。
双错配体外切割的结果如图3所示，野生型和K1065E突变型FnCas12a对第5和第6位的连续双突变的切割特性具有显著区别。野生型的FnCas12a蛋白对第5和第6位的连续双突变具有较高的非特异性切割活性，但K1065E突变型FnCas12a几乎无法对含有第5和第6位的连续双突变的DNA双链实施切割，说明其相对于野生型具有更高的特异性。
非经典PAM序列体外切割的结果如图4所示，野生型和K1065E突变型FnCas12a针对非经典PAM(TTTN)的其他PAM序列(如CTTN，TCTN，TTCN，CCTN)切割特异性具有显著区别。K1065E突变型FnCas12a蛋白可有效降低针对TCTN，TTCN，CCTN三种PAM序列的非特异性切割，说明其相对于野生型具有更高的特异性。
综合以上实施例，本发明的Cas12a变体不论是针对单一错配、双错配还是非经典PAM序列时相对于野生型均具有更高的特异性，所述Cas12a变体能够进一步扩大基因编辑工具的种类，在CRISPR/Cas基因编辑系统的应用中具有重要作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Cas12a变体，其特征在于，所述Cas12a变体的氨基酸序列如SED ID NO.1所示，所述Cas12a变体蛋白具有增加的相对于相应的野生型Cas12a蛋白的DNA切割选择性。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组载体表达权利要求1所述的Cas12a变体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的任意一种。
4.一种重组菌或重组细胞系或重组病毒，其特征在于，包含权利要求2所述的重组表达载体。
5.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒采用权利要求3所述的病毒载体包装获得，所述重组病毒包括表达权利要求1所述的Cas12a变体的腺病毒或慢病毒。
6.权利要求1所述的Cas12a变体、权利要求2～3任一项所述的重组表达载体、权利要求4所述的重组菌或重组细胞系和权利要求5所述的重组病毒在基因编辑中的应用。
7.一种包括权利要求1所述Cas12a变体的CRISPR/Cas12a基因编辑系统。
8.根据权利要求7所述的CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，所述系统还包括：靶向目标基因的crRNA。
9.一种对受体中的目的基因进行基因编辑的方法，其特征在于，借助CRISPR/Cas12a系统对受体中的目的基因进行基因编辑，所述方法包括通过将权利要求2～3任一项所述的重组表达载体导入受体提供Cas12a变体。
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