CN117701490A - 利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种利用过氧化氢促进雨生红球藻在绿藻阶段生物量积累方法及系统，首先进行了雨生红球藻种子液的培养。然后在柱式光生物反应器中，添加过氧化氢培养雨生红球藻。最后收集培养液中的藻细胞并检测雨生红球藻的生物量。本发明的雨生红球藻培养模式简单有效，当过氧化氢浓度为125μM时，雨生红球藻生物量比单独BG‑11组提高了38.74％；通过本发明的培养方法，可显著提高雨生红球藻在绿藻阶段的生物量。

Description

利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法及系统

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法。

背景技术

虾青素，因其卓越的抗氧化特性，被广泛运用于医疗、食品、化妆品和水产养殖等多个领域。天然虾青素的一个主要来源是雨生红球藻，这一资源引起了广泛关注。雨生红球藻是种单细胞淡水绿藻，其生长分为绿色阶段和红色阶段。在绿色阶段，细胞分裂迅速，活性高，有助于快速积累生物量；而在红色阶段，虽然细胞活性减弱，分裂速率降低，但是虾青素的积累量会大幅增加。

全球范围内，雨生红球藻是为数不多能进行大规模工业养殖的藻类之一。然而，该产业目前面临生物量积累低和虾青素产量低的问题，这限制了其发展。为解决这些挑战，业界通常采用两阶段培养方法：第一阶段在绿色阶段积累生物量，此时细胞活性高，在适宜条件下能实现较高的生长速度和生物量；第二阶段在红色阶段促进虾青素的合成，利用特定条件提高藻细胞中虾青素的合成和积累。这种方法有效平衡了生长和虾青素合成之间的矛盾。但目前的培养策略尚不能满足生产对生物量的需求。因此，改进雨生红球藻在绿藻阶段的生物量积累对其产业的发展至关重要。

针对雨生红球藻在绿藻培养阶段的生物量不足这一问题，现有技术面临的主要挑战可以从以下几个方面进行分析：

1)培养条件限制:

雨生红球藻的生长受多种环境因素影响，如光照、温度、CO₂浓度、营养盐和pH值等。在自然条件下，难以恒定地维持这些条件在最佳范围内，从而限制了生物量的积累。

2)资源效率低:

在大规模培养中，为了维持适宜的生长环境，需要大量资源，如水、营养盐和能源。这些资源的投入与产出效率不高，导致生产成本增加。

3)生物量产率不稳定:

雨生红球藻在绿藻阶段虽然分裂迅速，但生物量的产率受到环境波动、污染或病原体侵害等因素的影响，造成产率不稳定。

4)规模扩展难度:

在实验室或小规模条件下培养获得的优化结果难以直接扩展到工业规模。规模扩展过程中会出现新的问题，如混合不均、光照不均等。

5)遗传稳定性和适应性问题:

雨生红球藻在长期培养过程中出现遗传变异，影响其生长特性和生物量产率。此外，藻种对新环境的适应能力也是一个挑战。

6)经济效益与环境影响的平衡:

在追求最大化生物量产率的同时，还需要考虑培养过程对环境的影响和经济效益，如减少废弃物的产生、降低能源消耗等。

7)优化培养技术的需求:

如何通过优化培养技术，如调整营养配方、改善光照和CO₂供应方式，提高生物量产率，是目前技术发展的重点。

因此，解决这些技术问题需要综合考虑生物学、工程学和经济学的方法，通过创新和技术改进，提高雨生红球藻在绿藻阶段的生物量产率，以满足大规模生产的需求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法。

本发明是这样实现的，一种利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，所述方法包括：

首先进行雨生红球藻种子液的培养，使雨生红球藻细胞在适宜条件下生长，收集藻细胞待用。然后在1L的光生物反应器中，添加过氧化氢培养雨生红球藻。

进一步，所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法还包括：

种子液在含有2.5L培养基的3L锥形瓶中培养，使藻细胞生长至对数期待用；将种子液重悬到柱式光生物反应器中，确保初始接种量为3×10⁵个/毫升；添加不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻，连续通入无菌空气，并置于一定的温度和光照强度的环境下培养，检测、分析雨生红球藻的生物量。

进一步，所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法包括以下步骤：

步骤一，进行种子液的培养；

步骤二，使用不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻；

步骤三，利用干重法测定步骤二得到的培养液中雨生红球藻的生物量。

进一步，所述步骤一中的种子液的培养包括：

使用BG-11培养基在3L的锥形瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期待用。

进一步，所述种子液培养体积为2.5L。

进一步，所述种子培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1。

进一步，所述种子液培养阶段无菌空气的通气量为1vvm。

进一步，所述雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

进一步，所述步骤二中的使用不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻包括：

以BG-11培养基为基础培养基，添加不同浓度的过氧化氢培养种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵cells/mL；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。

进一步，所述过氧化氢的浓度为0、31.25、62.5、125、250、500μM。

进一步，所述温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

进一步，利用干重法测定步骤二得到的培养液中雨生红球藻细胞的生物量包括：

将由步骤二得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。

本发明还提供了一种用于提高雨生红球藻(Haematococcuspluvialis LUGU)生物量积累的系统，该系统包括：

用于培养雨生红球藻种子液的容器，该容器为3L锥形瓶，内含2.5L BG-11培养基；

一个柱式光生物反应器，容量为1L，用于进一步培养雨生红球藻；

一个控制单元，用于调节过氧化氢的添加浓度，其中过氧化氢浓度设置范围为0、31.25、62.5、125、250、500μM；

一个温度控制系统，保持环境温度在25±1℃；

一个光照系统，提供30μmol m^-2s^-1的光照强度；

用于连续通入无菌空气的通气系统，其通气量设定为1vvm；

一个数据收集和分析单元，用于监测和分析雨生红球藻的生物量积累情况。

本发明还提供了一种用于测定雨生红球藻生物量的系统，该系统包括：

用于培养雨生红球藻的柱式光生物反应器，内含基于BG-11培养基的培养液，容量为1L；

一个控制单元，用于调节过氧化氢的添加浓度，并控制接种量为3×10⁵cells/mL；

一个温度控制系统，保持环境温度在25±1℃；

一个光照系统，提供30μmol m^-2s^-1的光照强度；

一个通气系统，用于连续通入无菌空气，通气量设定为1vvm；

一个采样系统，用于从反应器中取样，包括离心管和超净台；

一个离心机，用于离心培养液样本，速度设定为3500r/min；

一个冷冻设施，用于在-80℃条件下保存藻细胞样本；

一个冻干机，用于冻干处理藻细胞样本，持续时间为24小时；

一个精密天平，用于测量干燥后的雨生红球藻样本的净重，以确定生物量。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明结果表明添加过氧化氢可显著提高雨生红球藻的生物量，通过此培养方法，显著促进了雨生红球藻的生长，提高了雨生红球藻的生物量积累。当过氧化氢浓度为125μM时，雨生红球藻第三天的生物量达到了0.77克/升，比对照组提高了37.50％。比生长速率和细胞数分别为0.47克/升/天和99.45×10⁴个/毫升，分别比对照组提高了30.56％和29％。

本发明工序简单、易操作、高效，可显著提高雨生红球藻绿藻阶段的生物量。

第二，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：提高了雨生红球藻绿藻阶段的生物量积累，为雨生红球藻的大规模生产提供高效的绿藻生物量积累策略。

第三，利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量的方法带来的显著技术进步主要包括以下几个方面：

1)提高生物量产率:

通过控制过氧化氢的添加浓度，该方法能显著提高雨生红球藻的生物量产率，这对于商业化生产具有重要意义，尤其是在生物燃料、食品补充剂和化妆品行业。

2)优化生长条件:

该方法通过精确控制培养条件(如温度、光照强度、通气量等)，为雨生红球藻的生长创造了最佳环境。这种优化有助于提高藻类的生长速度和质量。

3)提高操作效率:

使用自动化控制系统(如温度控制和光照系统)减少了人工监测和调整的需要，提高了整个培养过程的操作效率和可重复性。

4)增强的测量准确性:

采用干重法测定生物量的方法提供了一种精确、可靠的方式来评估藻类生物量的增长，这对于科学研究和商业生产都非常重要。

5)环境可持续性:

该方法的实施有助于提高雨生红球藻的生产效率，有望减少对自然资源的依赖和对环境的影响，从而促进环境可持续性。

6)扩展应用范围:

这种方法的成功实施会鼓励进一步的研究和创新，扩展到其他类型的藻类和微生物的培养，为生物技术领域带来更广泛的应用前景。

综上所述，这种使用过氧化氢提高雨生红球藻生物量的方法不仅在技术上带来了显著进步，也为相关行业的发展提供了新的动力和性。

第四，本发明提供的用于提高和测定雨生红球藻(Haematococcus pluvialisLUGU)生物量积累的系统带来的显著技术进步包括：

1)优化的培养条件：

通过精确控制培养环境(如温度、光照强度和通气)为雨生红球藻提供了最适宜的生长条件，从而显著提高藻类的生物量和生长速率。

2)精确的化学添加剂调节：

控制单元对过氧化氢添加浓度的精确调节，有助于优化藻类的应激响应和代谢活动，进一步提高生物量的积累。

3)提高生物反应器的效率：

柱式光生物反应器的使用增加了光合作用的效率，使得藻类能更有效地利用光能，从而提升了生物量的生产。

4)系统化的培养和测定流程：

通过整合培养和测定流程，该系统为雨生红球藻的大规模生产提供了可靠和高效的技术支持。

5)自动化和数据驱动的管理：

自动化的控制和数据驱动的分析减少了人为误差，提高了培养过程的可重复性和稳定性。

6)减少环境污染和资源浪费：

系统的设计减少了化学添加剂和水资源的使用，有助于减少环境污染和资源浪费。

7)提高经济效益：

通过提高生物量积累和优化培养过程，该系统能够提高雨生红球藻的商业生产效率，增强经济效益。

8)促进科学研究：

该系统为雨生红球藻的科学研究和工业应用提供了强有力的工具，有助于深入理解其生长机制和商业潜力。

本发明提供的系统在提高雨生红球藻生物量积累方面取得了显著的技术进步，对于生物技术、环境科学和可持续发展领域具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法流程图；

图2是本发明实施例提供的不同浓度过氧化氢对雨生红球藻生物量的影响图；

图3是本发明实施例提供的不同浓度过氧化氢对雨生红球藻第三天比生长速率的影响图。

图4是本发明实施例提供的不同浓度过氧化氢对雨生红球藻第三天细胞数的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

应用实施例1:生产天然虾青素

1)培养雨生红球藻种子液:

在3L的锥形瓶中使用BG-11培养基培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialisLUGU)，在25±1℃和30μmol m^-2s^-1光照强度的环境下进行，直至藻细胞达到对数生长期。

2)使用过氧化氢培养:

将培养至对数期的藻细胞重悬到1L的柱式光生物反应器中，确保初始接种量为3×10⁵cells/mL。

向培养基中加入不同浓度的过氧化氢(0、31.25、62.5、125、250、500μM)，连续通入无菌空气，维持培养温度和光照强度。

3)收集和处理:

在培养过程结束后，利用离心和冻干技术收集藻细胞，提取虾青素。

虾青素作为一种高价值的天然色素，可用于食品、化妆品和饲料行业。

应用实施例2:生物燃料生产

1)大规模培养雨生红球藻:

在大型培养设施中，使用BG-11培养基在25±1℃和30μmol m^-2s^-1光照强度下培养雨生红球藻。

初始接种量控制在3×10⁵cells/mL，使用1L或更大容量的柱式光生物反应器。

2)过氧化氢促进生物量增长:

向培养系统中添加不同浓度的过氧化氢，以优化生物量产率。

维持适宜的培养条件，监控藻细胞的生长和生物量积累。

3)生物燃料提取:

在培养周期结束后，收集藻细胞，经过适当的加工和提炼过程，提取生物燃料。

所提取的生物燃料可以作为可再生能源，用于发电或作为交通燃料的替代品。

这两个应用实施例展示了利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量的方法在不同领域的具体应用，体现了该技术的多样性和实用性。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法包括以下步骤：

S101，利用BG-11培养基培养种子液；

S102，利用不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻；

S103，利用干重法测定S102得到的培养液中雨生红球藻的生物量。

作为优选实施例，本发明实施例提供的利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，具体包括以下步骤：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用125μM的过氧化氢培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，添加125μM的过氧化氢培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵cells/mL；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。

实施例1：

本发明实施例提供的过氧化氢浓度为31.25μM的情况下，检测、分析雨生红球藻的生物量，具体步骤如下：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用31.25μM的过氧化氢培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，添加31.25μM的过氧化氢培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵个/毫升；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。在第三天，其生物量和比生长速率分别为0.63克/升和0.40克/升/天，分别比对照组提高了12.5％和11.11％(见图2～3)，细胞数为87.75×10⁴个/毫升，是对照组的1.14倍(见图4)。

实施例2：

本发明实施例提供的过氧化氢浓度为62.5μM的情况下，检测、分析雨生红球藻的生物量，具体步骤如下：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用62.5μM的过氧化氢培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，添加62.5μM的过氧化氢培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵个/毫升；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。在第三天，其生物量比生长速率分别为0.72克/升和0.44克/升/天，分别比对照组提高了28.57％和22.22％(见图2～3)，细胞数为90.60×10⁴个/毫升，是对照组的1.18倍(见图4)。

实施例3：

本发明实施例提供的过氧化氢浓度为125μM的情况下，检测、分析雨生红球藻的生物量，具体步骤如下：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用125μM的过氧化氢培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，添加125μM的过氧化氢培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵个/毫升；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。在第三天，其生物量比生长速率分别为0.77克/升和0.47克/升/天，分别比对照组提高了37.5％和30.56％(见图2～3)，细胞数为99.45×10⁴个/毫升，是对照组的1.29倍(见图4)。

实施例4：

本发明实施例提供的过氧化氢为250μM的情况下，检测、分析雨生红球藻的生物量，具体步骤如下：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用250μM的过氧化氢培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，添加250μM的过氧化氢培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵个/毫升；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。在第三天，生物量比生长速率分别为0.765克/升和0.46克/升/天，分别比对照组提高了36.61％和27.78％(见图2～3)，细胞数为97.95×10⁴个/毫升，是对照组的1.27倍(见图4)。

实施例5：

本发明实施例提供的过氧化氢为500μM的情况下，检测、分析雨生红球藻的生物量，具体步骤如下：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用500μM的过氧化氢培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，添加500μM的过氧化氢培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵个/毫升；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。在第三天，其生物量比生长速率分别为0.59克/升和0.37克/升/天，较对照组没有显著性变化(见图2～3)，细胞数为80.55×10⁴个/毫升，是对照组的1.04倍(见图4)。

本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

对比例：

本发明对比例提供的在新鲜BG-11培养基培养下，检测、分析雨生红球藻生物量，具体步骤如下：

(1)利用BG-11培养基培养种子液：使用BG-11培养基在3L三角瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后待用；其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气的通气量为1vvm，并且所用雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU。

(2)利用BG-1培养基培养雨生红球藻：以BG-11培养基为基础培养基，培养第一阶段的种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵个/毫升；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。其中，培养的环境温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1，无菌空气通气量为1vvm。

(3)利用干重法测定步骤(2)得到的培养液中雨生红球藻的生物量：将由步骤(2)得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。在第三天，其生物量和比生长速率分别为0.56克/升和0.36克/升/天(见图2～3)，细胞数为77.10×10⁴个/毫升(见图4)。

本发明结果表明添加过氧化氢可显著提高雨生红球藻的生物量，通过此培养方法，实现了雨生红球藻在绿藻阶段的生物量积累。

本发明提供的两种系统——一种用于提高雨生红球藻(Haematococcuspluvialis LUGU)生物量积累的系统，以及另一种用于测定雨生红球藻生物量的系统——的工作原理如下：

第一，用于提高雨生红球藻生物量积累的系统

1)种子液的培养:

在3L的锥形瓶中添加2.5L的BG-11培养基，用于培养雨生红球藻种子液。这种培养基提供了藻类生长所需的所有营养物质。

2)光生物反应器培养:

将培养好的种子液转移至1L的柱式光生物反应器中进行进一步培养。这种反应器允许更好的光照控制和更均匀的藻类生长。

3)过氧化氢添加:

控制单元用于调节过氧化氢的添加浓度，范围设置为0、31.25、62.5、125、250、500μM。过氧化氢作为一种信号分子，可刺激藻类的生长，从而提高生物量积累。

4)温度和光照控制:

温度控制系统维持反应器环境在25±1℃，光照系统则提供30μmol m^-2s^-1的光照强度，这两者都是促进雨生红球藻生长的关键条件。

5)通气系统:

通气系统连续提供无菌空气(通气量设定为1vvm)，确保藻类有足够的CO₂供应，并移除培养过程中产生的氧气。

6)数据收集和分析:

数据收集单元监测藻类的生长状况和环境参数，如pH值、溶解氧量、光照强度和温度等，以优化生长条件并提高生物量产率。

第二，用于测定雨生红球藻生物量的系统

1)光生物反应器培养:

同上述系统，使用柱式光生物反应器和BG-11培养基培养雨生红球藻。

2)过氧化氢添加与接种量控制:

控制单元调节过氧化氢添加浓度，并控制藻类接种量为3×10⁵cells/mL。

3)样本采集:

采样系统用于从反应器中取样，包括使用离心管和超净台以保持样品无菌。

4)样本处理:

利用离心机(3500r/min)离心培养液样本，然后在-80℃的条件下冷冻保存藻细胞样本。

5)干燥和称重:

冻干机用于处理藻细胞样本(持续时间24小时)，去除水分后利用精密天平测量干燥后的雨生红球藻样本的净重，从而确定其生物量。

通过这些系统的应用，可以有效提高雨生红球藻的生物量积累，并准确测定其生物量。

用于提高和测定雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)生物量积累的系统的工作原理如下：

提高雨生红球藻生物量积累的系统：

1)培养初始阶段：

使用3L锥形瓶内含2.5L BG-11培养基作为雨生红球藻种子液的培养容器。这种特定的培养基和容器为雨生红球藻提供必需的营养物质和生长环境。

2)进一步培养阶段：

使用1L容量的柱式光生物反应器进一步培养雨生红球藻。此阶段可实现更高效的光合作用和生物量积累。

3)过氧化氢添加与控制：

一个控制单元用于精确调节过氧化氢的添加浓度。过氧化氢作为氧化剂，通过调节其浓度，可以优化藻类的生长速率和应激响应。

4)环境温度控制：

温度控制系统维持环境温度在25±1℃，为雨生红球藻提供适宜的生长温度。

5)光照条件控制：

光照系统提供30μmol m-2s-1的光照强度，确保藻类进行有效的光合作用。

6)通气系统：

通气系统持续通入无菌空气，保持培养环境的适宜气体交换，对藻类生长至关重要。

7)数据收集与分析：

数据收集和分析单元监测雨生红球藻的生物量积累情况，为进一步调节培养条件提供数据支持。

测定雨生红球藻生物量的系统：

1)培养与控制：

使用柱式光生物反应器内含BG-11培养基的培养液进行藻类培养。控制单元精确调节过氧化氢添加浓度，并控制接种量。

2)环境条件维持：

同样的温度和光照系统用于维持适宜的培养条件。

3)样本采集与处理：

采样系统从反应器中取样，离心机用于离心培养液样本，随后样本在冷冻设施中保存，并通过冻干机处理。

4)生物量测定：

使用精密天平测量干燥后的藻样本的净重，从而确定生物量。

这两个系统共同构成了一个完整的流程，用于有效培养雨生红球藻并测定其生物量。通过精确的环境控制、添加剂使用、样本处理和数据收集，这些系统能够优化藻类的生长条件，提高生物量积累，并准确测定藻类生物量，对于工业规模的藻类培养和生物产品生产具有重要意义。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述方法包括：

首先进行雨生红球藻种子液的培养，使雨生红球藻细胞在适宜条件下生长，收集藻细胞待用；然后在光生物反应器中，添加过氧化氢培养雨生红球藻。

2.如权利要求1所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法还包括：

种子液在含有2.5L培养基的3L锥形瓶中培养，使藻细胞生长至对数期待用；将种子液重悬到柱式光生物反应器中，确保初始接种量为3×10⁵个/毫升；添加不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻，连续通入无菌空气，并置于一定的温度和光照强度的环境下培养，检测、分析雨生红球藻的生物量。

3.如权利要求1所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法还包括以下步骤：

步骤一，进行种子液的培养；

步骤二，使用不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻；

步骤三，利用干重法测定步骤二得到的培养液中雨生红球藻的生物量。

4.如权利要求3所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述步骤一中的进行种子液的培养包括：

使用BG-11培养基在3L的锥形瓶中培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期待用。

5.如权利要求4所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述雨生红球藻为雨生红球藻Haematococcuspluvialis LUGU；种子液培养体积为2.5L；种子培养的环境温度为25±1℃；光照强度为30μmol m^-2s^-1；无菌空气的通气量为1vvm。

6.如权利要求3所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述步骤二中的使用不同浓度的过氧化氢培养雨生红球藻包括：

以BG-11培养基为基础培养基，添加不同浓度的过氧化氢培养种子液至1L的柱式光生物反应器中，确保雨生红球藻接种量为3×10⁵cells/mL；连续通入无菌空气，并置于一定温度和光照强度的环境下培养，得到最终的培养液。

7.如权利要求6所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述培养体系中过氧化氢浓度为0、31.25、62.5、125、250、500μM；所述温度为25±1℃，光照强度为30μmol m^-2s^-1。

8.如权利要求3所述利用过氧化氢提高雨生红球藻生物量积累的方法，其特征在于，所述步骤三中的利用干重法测定步骤二得到的培养液中雨生红球藻的生物量包括：

将由步骤二得到的培养液在无菌超净台中取10mL转入离心管中，利用离心机经3500r/min离心3分钟后弃上清，收集藻细胞，置于-80℃冰箱中冷冻过夜，利用冻干机冻干24h后称重，最终测得雨生红球藻的生物量干重。

9.一种基于权利要求1所述方法的用于提高雨生红球藻(Haematococcus pluvialisLUGU)生物量积累的系统，其特征在于，该系统包括：

用于培养雨生红球藻种子液的容器，该容器为3L锥形瓶，内含2.5L BG-11培养基；

一个柱式光生物反应器，容量为1L，用于进一步培养雨生红球藻；

一个控制单元，用于调节过氧化氢的添加浓度，其中过氧化氢浓度设置范围为0、31.25、62.5、125、250、500μM；

一个温度控制系统，保持环境温度在25±1℃；

一个光照系统，提供30μmol m^-2s^-1的光照强度；

用于连续通入无菌空气的通气系统，其通气量设定为1vvm；

一个数据收集和分析单元，用于监测和分析雨生红球藻的生物量积累情况。

10.一种基于权利要求1所述方法的用于测定雨生红球藻生物量的系统，其特征在于，该系统包括：

用于培养雨生红球藻的柱式光生物反应器，内含基于BG-11培养基的培养液，容量为1L；

一个控制单元，用于调节过氧化氢的添加浓度，并控制接种量为3×10⁵cells/mL；

一个温度控制系统，保持环境温度在25±1℃；

一个光照系统，提供30μmol m^-2s^-1的光照强度；

一个通气系统，用于连续通入无菌空气，通气量设定为1vvm；

一个采样系统，用于从反应器中取样，包括离心管和超净台；

一个离心机，用于离心培养液样本，速度设定为3500r/min；

一个冷冻设施，用于在-80℃条件下保存藻细胞样本；

一个冻干机，用于冻干处理藻细胞样本，持续时间为24小时；

一个精密天平，用于测量干燥后的雨生红球藻样本的净重，以确定生物量。