CN117695256A - 一种功能性叶黄素复合物制备方法和缓解干眼症的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能性叶黄素复合物制备方法和缓解干眼症的应用，属于食品及保健食品技术领域。本发明提供了一种叶黄素复合物，利用藻蓝蛋白对也叶黄素进行初级包埋，通过酯化反应将三羧基苯硼酸接枝到酵母β葡聚糖上，进一步使改性酵母β葡聚糖和壳聚糖通过静电相互作用进行层层自组装，构建形成具有提高疏水性营养物质的复合物；本发明提高了叶黄素理化性质的稳定性，能够实现叶黄素的胃酸保护，提升了叶黄素在血液和眼球中的浓度，缓解干预小鼠干眼症症状，本方法的包埋保护方式，构建了功能特性纳米载运体系，充分提升天然营养物质的吸收利用度。

Description

一种功能性叶黄素复合物制备方法和缓解干眼症的应用

技术领域

本发明涉及一种功能性叶黄素复合物制备方法和缓解干眼症的应用，属于食品及保健食品技术领域。

背景技术

叶黄素是一种类胡萝卜素，其具有脂溶性且不溶于水，是一种广泛存在于水果、蔬菜、花卉、藻类中的天然活性营养物质，具有显色作用。由于人体无法合成叶黄素，所以必须通过膳食摄取或补充。叶黄素含有丰富的共扼双键和羟基，使其具有良好的清除自由基能力。叶黄素具有多种生物活性如抗氧化、抗炎、抗脂质过氧化、抗衰老，护眼和预防老年性黄斑病变功能等功能，叶黄素在人体中主要分布在黄斑区和整个视网膜，对视觉系统的发育和维持正常功能具有重要意义。

但叶黄素由于其低水溶性导致其在极性溶剂中分散低，严重限制了叶黄素的吸收利用度。并且由于其强抗氧化性，导致其在体内易被氧化分解，因此提升叶黄素的溶解分散性和稳定性，增强叶黄素的肠道吸收利用度是至关重要的。

目前主要通过构建载运体系实现对营养功能因子的保护、传递及控释，常见的载运体系类型主要包括乳液、复合物、Pickering乳液、脂质体、固体脂质复合物和水凝胶等。现有技术中，包载叶黄素的复合物在胃肠道环境中的稳定性低，在肠道吸收之前就已经将叶黄素释放，导致大量叶黄素无法进入血液系统，发挥其功能。

亟需一种可以靶向定位释放叶黄素的复合物，提高叶黄素在肠道和血清中的生物利用度，使天然活性物质活性得以充分发挥。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺点，通过藻蓝蛋白、壳聚糖和酵母β葡聚糖之间的静电层层自组装具备保护叶黄素逃逸胃酸极端环境的破坏，促进叶黄素在肠道部位的集中富集释放，增进叶黄素的吸收利用度；并通过酵母β葡聚糖对肠道派尔斑上常驻免疫细胞的特殊靶向性增强叶黄素在肠道的吸收利用度，增强叶黄素护眼功能的发挥。

本发明提供了一种功能性叶黄素复合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将三羧基苯硼酸溶解于浓度为90~98%的二甲基亚砜溶液中，使所述三羧基苯硼酸的终浓度为10~30 mg/mL，搅拌至充分溶解；再加入浓度为20~50 mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为20~30 mg/mL的4-二甲氨基吡啶，搅拌反应3~5h，得到三羧基苯硼酸活化液；

S2、将酵母β葡聚糖充分溶解于二甲基亚砜溶液中，使酵母β葡聚糖终浓度为2~5mg/mL；再逐滴加入步骤S1所述三羧基苯硼酸活化液中，并逐渐加热至40~60℃，在40~60℃下搅拌反应时30~50 h；反应结束后透析2 ~3d，再冷冻干燥获得酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物；

S3、将藻蓝蛋白充分溶解于去离子水中，使所述藻蓝蛋白终浓度为2~4 mg/mL；再加入叶黄素浓度为5~20 mg/mL的叶黄素乙醇溶液，剪切破碎，得到藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液；

S4、制备叶黄素复合物：将终浓度为10~30 mg/mL的酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物溶液和终浓度为2~4 mg/mL的壳聚糖溶液加入到步骤S3中所述藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液中进行层层自组装，搅拌反应12~24 h，反应结束后冷冻干燥，即得到叶黄素复合物。

在一种实施方式中，步骤S2中所述透析使用100~1000Da的透析袋。

在一种实施方式中，步骤S3中所述剪切条件为5000~8000rpm，时长4~6min。

在一种实施方式中，步骤S4中壳聚糖溶液pH为4.5~5.5，浓度为0.03%~0.2%w/v；所述酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸浓度为2~4 mg/mL。

在一种实施方式中，步骤S4中所述冰乙酸浓度为0.02~0.05%w/v，pH为4.0~6.0。

在一种实施方式中，步骤S4中所述搅拌的转速为600~800 rpm。

本发明还提供了由上述方法制备的功能性叶黄素复合物，包括以下组分：藻蓝蛋白含量为50~60%w/w，三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖含量为10~20%w/w，壳聚糖含量为10~15%w/w，叶黄素含量为5~25%w/w。

在一种实施方式中，所述叶黄素复合物包括以下组分：藻蓝蛋白含量为55%w/w，三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖复合物含量为13.8%w/w，壳聚糖含量为12.5%w/w，叶黄素含量为18.7%w/w。

本发明还提供了提高叶黄素的生物利用度的方法，以叶黄素为芯材，以藻蓝蛋白、三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖复合物和壳聚糖为壁材，制备叶黄素复合物。

本发明还提供了功能性叶黄素复合物在制备缓解干眼症的药品中的应用。

在一种实施方式中，所述药品还包括药物载体和/或辅料。

有益效果：

本发明利用藻蓝蛋白对叶黄素进行初级包埋，进一步使三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖复合物和壳聚糖通过静电相互作用的层层自组装构建了具有提高叶黄素生物利用度的功能性复合物。本发明能够保护叶黄素逃逸胃酸极端环境，增强叶黄素在血液内的浓度（提高2.5倍），与游离的叶黄素相比，叶黄素复合物能够更显著的缓解小鼠的干眼症症状。本方法的包埋保护方式，构建具有功能特性的纳米载运体系，充分提升天然营养物质的吸收利用度。

附图说明

图1为实施例1中叶黄素复合物TEM透射电镜图(×40K)；

图2为实施例1中叶黄素复合物TEM透射电镜粒径分布图；

图3为对比例1，对比例2和实施例1中的叶黄素复合物的包封率；

图4为对比例1，对比例2和实施例1中的叶黄素复合物的担载率；

图5为对比例1，对比例2和实施例1中的叶黄素复合物的紫外稳定性；

图6为对比例1，对比例2和实施例1中的叶黄素复合物的加热稳定性；

图7为实施例1中叶黄素复合物标记FITC后与RAW264.7细胞孵育8小时后的激光共聚焦图片；

图8为抑制剂预处理后，实施例1中叶黄素复合物标记FITC后与RAW264.7细胞孵育8小时后的激光共聚焦图片；

图9为实施例1中不同浓度的叶黄素复合物与角膜上皮细胞孵育24小时后的细胞活力图；

图10为实施例1中叶黄素复合物灌胃56天后的小鼠肝脏苏木素伊红染色切片；

图11为健康小鼠的肝脏苏木素伊红染色切片；

图12为实施例1中叶黄素复合物在模拟胃液和模拟肠液中的释放率；

图13为实施例1中叶黄素和叶黄素复合物在大鼠血清中不同时间点的叶黄素含量图；

图14为实施例1中叶黄素和叶黄素复合物在大鼠眼球中不同时间点的叶黄素含量图；

图15为实施例1中叶黄素，商业叶黄素和叶黄素复合物在干预干眼症小鼠不同时间点的小鼠角膜荧光评分图；

图16为实施例1中叶黄素，商业叶黄素和叶黄素复合物在干预干眼症小鼠不同时间点的小鼠角膜玫瑰红评分图；

图17为实施例1中叶黄素，商业叶黄素和叶黄素复合物在干预干眼症小鼠不同时间点的小鼠泪液分泌量图；

图18为实施例1中叶黄素，商业叶黄素和叶黄素复合物在干预干眼症小鼠不同时间点的小鼠泪膜破裂时间图。

附图9,15~18中，a，b，c和d符号标明显著性，P<0.05。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。

下述实施例中叶黄素含量的测定方法：

（1）吸光光度法检测叶黄素含量：

标准曲线的制备：将叶黄素标准品（98%，成都普思生物公司）稀释为0.5，1，1.5，2，2.5，3 μg/mL的标准液，通过紫外分光光度计分别检测其在450 nm处的吸光度，并绘制标准曲线。

（2）高效液相色谱法检测叶黄素含量：将叶黄素标准品（98%，成都普思生物公司）稀释为0.2，0.4，0.78，1.56，3.13，6.75 μg/mL的标准液，通过高效液相色谱绘制标准曲线。集中流动相为(A)二氯甲烷:甲醇:乙腈:水(5:85:45:4.5,v/v)和(B)二氯甲烷:甲醇:乙腈:水(22:28:45:4.5,v/v)，线性梯度洗脱(0-8 min, 0% A;8 ~ 20min 100% A)。在450 nm处用C18色谱柱(4 μm, 4.6 × 150 mm)，流速为1 mL/min进行高效液相分析。

实施例1叶黄素复合物的制备

一种具有提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物，包括下述组分：藻蓝蛋白含量为55%w/w，壳聚糖含量为12.5 %w/w，三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖含量为13.8%w/w，叶黄素含量为18.7%w/w。

所述具有提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备三羧基苯硼酸羧基活化液：称取三羧基苯硼酸400 mg溶解于浓度98%的20ml 二甲基亚砜缓冲溶液中，在800 rpm条件下充分搅拌溶解，得到三羧基苯硼酸溶液；再向三羧基苯硼酸溶液中加入质量为400 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和400 mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在800 rpm条件下充分搅拌反应5 h；

S2、制备酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物：将酵母β葡聚糖充分溶解于二甲基亚砜溶液中，使酵母β葡聚糖终浓度为2 mg/mL；再将所得酵母β葡聚糖溶液逐滴加入步骤S1所述三羧基苯硼酸活化液中，并逐渐加热至55℃，在55℃下搅拌反应40 h；反应结束后使用500Da透析袋透析3d，再冷冻干燥获得酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物；

S3、制备藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液：将藻蓝蛋白充分溶解于去离子水中，使所述藻蓝蛋白终浓度为2 mg/mL；再加入的叶黄素乙醇溶液，使叶黄素终浓度为20 mg/mL，在4℃冰浴条件下剪切破碎，剪切切条件为8000 rpm，时长4~6min，得到藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液；

S4、制备提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物：将步骤S2中所述酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物溶解于离子水中，得到终浓度为2 mg/mL的酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物溶液；将壳聚糖溶解于冰乙酸溶液中，得到终浓度为2 mg/mL的壳聚糖溶液；再将10 ml酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物溶液和10 ml壳聚糖溶液加入到40 ml步骤S3中所述藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液中进行层层自组装，800 rpm搅拌反应24 h，反应结束后冷冻干燥，即得到提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物。

其中，步骤S4冰乙酸浓度为0.02%w/v，pH为5.0。壳聚糖溶液pH为4.5.~5.5，浓度为0.03%~0.2%w/v。

对比例1

一种具有提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物制备方法，具体实施方式参考实施例1，区别在于，所负载的叶黄素含量不同，步骤S3为：

S3、将藻蓝蛋白充分溶解于去离子水中，使所述藻蓝蛋白终浓度为2 mg/mL；再加入叶黄素乙醇溶液，使叶黄素终浓度为10 mg/mL在4℃冰浴条件下剪切破碎，剪切切条件为8000 rpm，得到藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液。

对比例2

一种具有提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物制备方法，具体实施方式参考实施例1，区别在于，所负载的叶黄素含量不同，步骤S3为：

S3、将藻蓝蛋白充分溶解于去离子水中，使所述藻蓝蛋白终浓度为2 mg/mL；再加入叶黄素乙醇溶液，使叶黄素终浓度为5 mg/mL，在4℃冰浴条件下剪切破碎，剪切切条件为8000 rpm，得到藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液。

实施例2叶黄素复合物的性质表征

1、粒径分析

取实施例1步骤S4所述的“提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物”进行TEM扫描电镜呈像。如附图1所示，TEM扫面电镜呈像结果，叶黄素复合物形态接近球形。如附图2所示，通过Image J软件对叶黄素复合物的TEM图像结果进行粒径分析，结果表明叶黄素复合物尺寸集中分布于82.78 nm。

2、包封率和担载率

取对比例1，对比例2和实施例1所述的“提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物”溶解于1 mL去离子水中，与3 mL正己烷混合，涡旋1 min后，以6000 rpm转速离心5min，测量上清液在450 nm处的吸光度。利用预先建立的标准曲线测定上清液中的叶黄素含量，并计算包封率和担载率。如附图3所示，对比例1，对比例2和实施例1中叶黄素复合物的叶黄素包封率分别为94.85 %, 94.12 %和95.87 %，表明实施例1中的实施步骤所制备的复合物包封效果最好。叶黄素复合物的叶黄素担载率分别为3.26 μg/mg, 6.21 μg/mg和11.98 μg/mg，表明实施例1中的实施步骤所制备的复合物担载效果最好。

3、稳定性

将叶黄素溶解于无水乙醇中，将对比例1，对比例2和实施例1所述的“提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物” 溶解于去离子水中，使四种溶液的叶黄素终浓度相同。然后将样品置于紫外线照射1、2、3、4、5小时，或在60℃水浴锅中加热30、60、90、120、150、180分钟。使用正己烷从样品中提取叶黄素，利用预先建立的标准曲线测定溶液中叶黄素含量并计算叶黄素保留率。如附图5所示，紫外灯照射5小时后，单独叶黄素、对比例1，对比例2和实施例1中叶黄素复合物叶黄素保存率分别为62.45%、71.87%、74.57%和76.87%。表明实施例1中制备的叶黄素复合物具有更好的紫外稳定性。如附图6所示，室温下贮藏14天后，单独叶黄素、对比例1，对比例2和实施例1中叶黄素复合物叶黄素保存率分别为48.52%、55.62%、60.74%和66.17%。表明实施例1中制备的叶黄素复合物具有更好的热稳定性。

4、细胞靶向实验

酵母β葡聚糖可以通过dectin-1受体特异性靶向到肠道派尔斑上的常驻免疫细胞，RAW264.7细胞是常驻免疫细胞的一种。为了观察实施例1所述的“提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物”对RAW264.7细胞上dectin-1受体的靶向作用，使用FITC标记叶黄素复合物。设置对照组、实验组和抑制组，将RAW264.7细胞（1×10⁶个）置于细胞培养皿中使用DMEM培养基（Gibco，赛默飞世尔科技有限公司）培养24小时后，抑制剂组预先用含有1mg/mL昆布多糖的培养基预处理细胞3小时，昆布多糖是一种dectin-1受体抑制剂，可以实现对dectin-1的特异性抑制作用。对照组和实验组不做上述处理。处理结束后，实验组和抑制组中分别加入1mg/mL叶黄素复合物孵育细胞8小时。然后去除细胞培养基，并通过流式细胞仪观察靶向结果。

如附图7所示，孵育叶黄素复合物8小时后，其平均荧光强度为502，表明叶黄素复合物可以聚集到RAW264.7细胞上。相反，如附图8所示用dectin-1受体抑制剂昆布多糖预处理RAW264.7细胞后，在8小时内只平均值为108的荧光强度。表明实施例1中制备的叶黄素复合物可以通过dectin-1受体特异性靶向到常驻免疫细胞——RAW264.7细胞上。

5、生物安全性

将角膜上皮细胞（HCECs）以1×10⁶个的接种量接种于96孔板中培养24 小时，取实施例1所述的“提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物”分别溶于DMEM培养基（Gibco，赛默飞世尔科技有限公司）中，使终浓度为1.57, 3.13, 6.25, 12.5, 25和50 μg/mL。孵育24 h后，加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂继续孵育4 h。最后，向细胞中加入150 μL DMSO，振荡10 min。通过酶标仪检测并计算细胞活力情况。如附图9所示，不同浓度的实施例1中的叶黄素复合物与角膜上皮细胞孵育24小时后，细胞活力仍在80%以上，表明实施例1中的叶黄素复合物没有明显的细胞毒性。

取实施例1所述的“提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物”灌胃于雄性BALB/c小鼠(6周龄，体重24±2g)中，连续灌胃56天后将灌胃小鼠和健康小鼠同时处死，将肝脏取出，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后进行苏木素伊红染色。如附图10和11所示，长期灌胃实施例1中的叶黄素复合物的肝脏切片与健康小鼠的肝脏切片无明显区别，表明了叶黄素复合物的生物安全性。

实施例4叶黄素复合物在胃肠道中的释放特性

取实施例1步骤S4所述的提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物10 mg，将复合物样品溶解于5 mL模拟唾液（上海源叶生物科技有限公司）中，在37 ℃的振荡台上以100 r/min搅拌5 min。将另外的20 mL模拟胃液（上海源叶生物科技有限公司）添加到反应系统中，并且在37 ℃下以100 rpm继续孵育2 h。最后，将50 mL模拟肠液（上海源叶生物科技有限公司）添加到混合溶液中，以100 r/min振荡5 h。每30分钟从混合溶液中取出4 mL上清液，检测其叶黄素浓度并补充等量模拟肠液。

如附图12所示，为叶黄素复合物在模拟胃液和模拟肠液中对于叶黄素的释放量，结果表明，模拟唾液消化5 min后，叶黄素复合物仅释放5.46%的叶黄素，模拟胃消化2 h后叶黄素的相对累积释放率达到22.03%。随着叶黄素复合物在模拟肠液中消化时间的延长，叶黄素的相对累积释放率缓慢增加。叶黄素在模拟肠液中消化5 h后释放率为41.83%。表明仍有58.17%的叶黄素纳米可以被常驻免疫细胞所转运。叶黄素复合物在模拟胃液和肠液中的延迟释放是由于载体中的酵母β-葡聚糖能够抵抗胃酸降解和壳聚糖在肠道中的黏附。

实施例5叶黄素复合物提高血液和眼球中叶黄素的生物利用度

禁食24 h后，将SD大鼠分为两组(每组3只)，分别给予叶黄素和实施例1步骤S4所述的提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物(叶黄素剂量为10 mg/kg)灌胃。在不同时间点，将血液样本收集到含有抗凝剂ETDA的离心管中。同样，在不同时间点灌胃后，处死SD大鼠，取眼球组织，置于-80℃保存。血浆在4℃下10000 rpm离心10 min获得上层血浆，随后向眼球组织中加入生理盐水，在冰浴中粉碎成匀浆。将上血浆和眼球匀浆加入氯仿:甲醇=2:1(v/v)的混合液中涡旋1 min，然后加入正己烷，离心10 min。通过氮气干燥有机层并且用二氯甲烷重悬。使用高效液相色谱检测大鼠血清和眼球中的叶黄素含量。

如附图13所示，为叶黄素和叶黄素复合物在大鼠血清中不同时间点的叶黄素浓度，最高浓度由428.33 ng/mL增加到1072.33 ng/mL，增加2.5倍。如附图14所示，为叶黄素和叶黄素复合物在大鼠眼球中不同时间点的叶黄素浓度，最高浓度由251.8ng/mL增加到469.4ng/mL，增加1.86倍。结果表明，叶黄素复合物显著提高了血液和眼球中的叶黄素浓度，从而提高了血液和眼球中的叶黄素生物利用度，为叶黄素复合物干预干眼症提供了支持。

实施例6叶黄素复合物改善干眼症状

将雄性BALB/c小鼠(6周龄，体重24±2g)随机分为5组，每组5只， 5组小鼠分别不进行灌胃（阳性对照组）、灌胃0.9%生理盐水（对照组）、叶黄素（98%，成都普思生物公司）、商品化叶黄素(来益牌叶黄素咀嚼片, 叶黄素剂量为50 mg/kg/天，磨粉灌胃)和实施例1步骤S4所述的提高生物利用度和缓解干眼症的叶黄素复合物(叶黄素剂量为50 mg/kg/天)。口服给药14天后，除对照组外，其余各组小鼠均给予0.2%苯扎氯铵滴眼液建立干眼模型。通过泪液量测量、角膜荧光素染色、孟加拉玫瑰红染色评分判断DED模型建立成功。模型建立后，分别于第0、7、14、21、28天评估小鼠泪液量、泪膜破裂时间和裂隙灯染色成像。简单地说，用泪液检测滤纸条测量泪液量，将其置于下睑外眦区域，用直尺测量长度来确定泪液量。用0.125%荧光素钠滴入小鼠结膜囊1 μL，手动眨眼3次后用裂隙灯观察，从眨眼开始，直到出现第一个黑色病灶即泪膜破裂时间。将1%荧光素钠和孟加拉玫瑰红滴入小鼠结膜囊，用裂隙灯进行成像。将每只角膜分为4个象限，根据4分量表计算评分标准：0分，缺失；1、点状染色<30点，2、点状染色>30个点：3、大面积弥漫性染色；4、荧光素斑块染色阳性。由3名双盲评价者进行评分。

附图15为小鼠角膜荧光评分的结果图，结果表明，造模后，除对照组外所有组的小鼠角膜内维持明显的荧光斑，荧光评分均在10分以上，说明小鼠角膜损伤严重。随着干预时间的增加，观察到叶黄素、商品化叶黄素制品和叶黄素复合物组角膜荧光斑的产生减少。值得注意的是，叶黄素复合物干预作用强于商品化叶黄素和游离叶黄素。28天后阳性对照组的荧光评分为12.33±1.15，叶黄素复合物、商品叶黄素、游离叶黄素的荧光评分分别为3±1、5.33±0.58、9±2，表明叶黄素复合物对角膜损伤的缓解效果较好。与阳性对照组相比，叶黄素复合物组的荧光强度降低4.11倍，小鼠角膜损伤恢复至与对照组相当的水平。

角膜玫瑰红染色可反映泪膜破裂情况。附图16为小鼠角膜玫瑰红评分的结果图，结果表明，干预28天后，阳性对照组的荧光评分为12.67±0.58，叶黄素复合物组玫瑰红评分为2.67±1.15，商品化叶黄素组和游离叶黄素组分别为5.33±0.58和10.67±1.15，提示叶黄素复合物对泪膜的缓解效果优于商品化叶黄素组。

附图17为小鼠泪液分泌量的结果图，结果显示，干预28天后，叶黄素组、商业叶黄素组、叶黄素复合物组泪液分泌量分别为2.33±0.3、2.97±0.18、4.57±0.14 mm。与阳性对照组相比，叶黄素复合物组的泪液分泌量提高3.26倍，与商业叶黄素组相比，叶黄素复合物组的泪液分泌量提高1.54倍，恢复至与对照组相当的水平，这表明叶黄素复合物对缓解泪液干燥有更好的作用。

附图18为小鼠泪膜破裂时间的结果图，泪膜破裂时间可作为泪液稳定性的指标。结果表明，经口给药28天后，阳性对照组小鼠的泪膜破裂时间最短，为1.53±0.21秒，叶黄素组、商业组和叶黄素复合物组分别为2.04±0.16、3.07±0.15和3.52±0.18秒，表明叶黄素复合物组相对于叶黄素组和商业叶黄素组恢复泪膜稳定性的效果更好。以上结果表明，叶黄素复合物显著减轻了苯扎氯铵诱导的小鼠干眼症症状。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种功能性叶黄素复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备三羧基苯硼酸羧基活化液：配制终浓度为10～30mg/mL的三羧基苯硼酸溶液，然后向三羧基苯硼酸溶液中加入终浓度为20～50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和终浓度为20～30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应3～5h，得到三羧基苯硼酸羧基活化液；

S2、制备酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物：配制终浓度为2～5mg/mL的酵母β葡聚糖溶液，然后将酵母β葡聚糖溶液逐滴加入步骤S1所述三羧基苯硼酸羧基活化液中，加热至40～60℃，搅拌反应30～50h；反应结束后透析2～3d并干燥，获得酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物；

S3、制备藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液：配制终浓度为2～4mg/mL的藻蓝蛋白溶液，然后加入终浓度为5～20mg/mL的叶黄素溶液，剪切破碎，得到藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液；

S4、制备叶黄素复合物：将终浓度为1～3mg/mL的酵母β葡聚糖-三羧基苯硼酸复合物溶液和终浓度为2～4mg/mL的壳聚糖溶液加入到步骤S3中所述藻蓝蛋白和叶黄素的剪切液中进行层层自组装，搅拌反应12～24h，反应结束后冷冻干燥，即得到叶黄素复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述透析使用100～1000Da的透析袋。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述剪切条件为5000～8000rpm，时长4～6min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S4中壳聚糖溶液pH为4.5～5.5，浓度为0.03％～0.2％w/v。

5.由权利要求1～4任一所述方法制备得到的叶黄素复合物。

6.根据权利要求5所述的叶黄素复合物，其特征在于，所述叶黄素复合物中藻蓝蛋白含量为50～60％w/w，三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖含量为10～20％w/w，壳聚糖含量为10～15％w/w，叶黄素含量为5～25％w/w。

7.一种提高叶黄素的生物利用度的方法，其特征在于，以叶黄素为芯材，以藻蓝蛋白、三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖复合物和壳聚糖为壁材，制备叶黄素复合物。

8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述叶黄素复合物中藻蓝蛋白含量为50～60％w/w，三羧基苯硼酸-酵母β葡聚糖含量为10～20％w/w，壳聚糖含量为10～15％w/w，叶黄素含量为5～25％w/w。

9.权利要求5～7任一所述叶黄素复合物在制备缓解干眼症的药品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药品中还包括药物载体和/或辅料。