CN117679442A - 羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用，属于羊胎盘临床研究技术领域，本发明研究发现以新鲜羊胎盘采用低温冷冻工艺生产的羊胎盘粉，经口服后可明显促进实验大鼠股骨骨折愈合，可能为临床加速骨折愈合提供一个新的选项。

Description

羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用

技术领域

本发明属于羊胎盘临床研究技术领域，具体涉及羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用。

背景技术

骨折是常见的骨科疾病之一，骨折自然愈合需要一个漫长的过程，且有5％-10％的患者会出现骨折不愈合或者延迟愈合。骨折不仅给患者带来巨大痛苦，也给家庭带来沉重的经济负担。寻找到可以加速骨折愈合的低廉药物，对于骨折群体的康复而言，都是至关重要的研究课题。中医中药在促进骨折愈合、防治骨质疏松及相关疾病方面有着悠久的历史，其中羊胎盘更是本证实具有抗氧化、改善微循环、提高免疫力等作用，在公开号为CN116585355A的专利申请文件，我们公开了羊胎盘制剂在制备预防骨质疏松的药物中的应用，然而骨质疏松与骨折的病理存在巨大差异，羊胎盘制剂是否能促进骨折愈合，仍是不可知的状态。

发明内容

本发明的目的在于提供羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用及工艺，以拓展羊胎盘在促进骨折愈合药物上的新应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用。

作为优选地，所述羊胎盘为羊胎盘粉。

进一步地，所述羊胎盘粉的制备过程为：取新鲜羊胎盘，去除脂肪、胎儿、羊膜，清洗干净后进行绞切，绞切后的组织再进一步打成匀浆，匀浆装盘后于-32℃预冻，预冻完成后进行真空干燥，经过低温下的粗碎和超微粉碎后，过80目网筛，得细粉，在Co60辐照灭菌后即得羊胎盘粉。

更进一步地，所述羊胎盘粉的给药剂量为150mg·kg^-1·d^-1。

更进一步地，所述羊胎盘粉的给药方式为口服。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现以新鲜羊胎盘采用低温冷冻工艺生产的羊胎盘粉，经口服后可明显促进实验大鼠股骨骨折愈合，可能为临床加速骨折愈合提供一个新的选项。

附图说明

图1为第2、4、6、8周X线观察各组大鼠骨折愈合情况图；

图2为第4、8周Micro-CT三维重建结果观察骨折愈合情况图；

图3为骨折区域HE染色(×100)结果镜检图；

图4为第8周血管造影显示骨折部位血管生长情况图。

具体实施方式

下面结合附图以及各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

实施例1

本实施例利用羊胎盘进行如下试验：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

85只SPF级2月龄SD雌性大鼠，平均体重200±20g，购自空军军医大学实验动物中心(许可证号：SCXK(陕)2019-001)，饲养于联勤保障部队第九四〇医院实验动物中心(许可证编号：SYXK(军)2017-0047)。大鼠自由进食、摄水，光照时间8:00-20:00，温度24℃±1℃。动物实验方案获得本院实验动物伦理委员会批准(批准号：2023KYLL099)。

1.1.2药物与试剂

羊胎盘粉由兰州明德药业有限公司提供，其制作流程为：取产自甘南藏区的妊娠2-3月的新鲜绵羊胎盘，去除脂肪、胎儿、羊膜等杂质，清洗干净后进行绞切，绞切后的组织再进一步打成匀浆，匀浆装盘后于-32℃预冻，预冻完成后进行真空干燥，经过低温下的粗碎和超微粉碎后，过80目网筛，得细粉，Co60辐照灭菌后得最终产品，产品符合《甘肃省中药材标准》2020版。

仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司)、Microfil血管造影剂(美国Flow Tech公司)、注射用低分子量肝素钠(江苏万邦生化医药集团有限责任公司)、戊巴比妥钠(上海国药集团)、血清ELISA检测试剂盒(睿信生物科技有限公司)、EDTA-2Na(索莱宝科技生物有限公司)、4％的多聚甲醛中性组织固定液等。

1.1.3仪器

Vision 90型X线扫描仪(丹东奥龙射线仪器集团有限公司)、Prodigy型双能X射线骨密度仪(美国GE公司)、NEMO NMC-200型Micro-CT扫描仪(平生医疗科技有限公司)、QX-W500型万能生物材料试验机(上海企想检测仪器有限公司)、DX1型数字切片扫描系统(山东斯瑞缔医疗科技有限公司)钛合金克氏针(张家港市华阳医疗器械厂)、骨科钻等(上海紫霭医疗器械有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型制备

大鼠适应性饲养1周后，采用柏鑫等人在《模拟高原环境对大鼠骨折愈合的影响研究》记载的方法，建立大鼠股骨骨折模型。腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，右下肢备皮消毒，沿股骨切开皮肤，钝性分离肌肉层，充分暴露股骨。使用0.8mm克氏针垂直于股骨打两个间距为1cm的孔，使用装有圆形锯片的骨科钻在两孔中间锯断股骨，将4-0可吸收线穿过两孔，之后将1.2mm克氏针自断端向股骨近端穿入，穿透肌肉、皮肤等组织，露出克氏针后接上骨钻，再将克氏针从断端穿向股骨远端，之后进行对股骨进行复位矫正，使其达到解剖复位，将可吸收线打结并剪去多余克氏针，最后逐层缝合伤口。给药剂量参考《药理实验方法学》，大鼠与人的转换系数为6.3，仙灵骨葆胶囊(XLGB组)给药剂量为：(0.5g/粒×2粒×3次/d)/60kg×6.3＝315mg·kg^-1·d^-1，同样方法换算得羊胎盘给药中剂量为150mg·kg^-1·d^-1，则羊胎盘低(L组)、高(H组)剂量组分别为75、300mg·kg^-1·d^-1。术后第二天开始灌胃给药，对照组(Con组)给予等量的生理盐水，每周灌胃6d，连续给药8周。

1.2.2动物一般情况观察及脏器处理

每两周称量一次大鼠体重并记录，观察大鼠体重变化。第8周处死所有大鼠，取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器称重并计算器官指数，器官指数＝器官重量/大鼠体重。

1.2.3X线摄片检查

分别于第2、4、6、8周拍摄X光片。将大鼠麻醉后取俯卧位置于X线扫描仪中，拍片后观察右侧股骨骨折愈合情况，并进行骨痂评分。

1.2.4Micro-CT扫描

于术后第4、8周各组随机抓取3只大鼠处死，剥取术侧股骨，分离肌肉等附着组织后拔出克氏针，固定于4％多聚甲醛中，48h后进行Micro-CT扫描，扫描参数为为：电压90KV，电流0.05mA，分辨率为中度。使用设备自带软件进行三维重建获得原始图像，观察骨折愈合情况。

1.2.5股骨病理学观察

将Micro-CT扫描完的股骨用10％EDTA彻底脱钙石蜡包埋，常规切片，进行HE染色，DX1数字切片扫描系统扫描后分析骨折处骨组织再生及形态学变化情况。

1.2.6血管造影

于第8周各组随机抓取3只大鼠，将大鼠麻醉后，打开腹腔，充分暴露心脏，使用采血针刺入左心室，剪开右心耳，首先灌注生理盐水(含低分子肝素钠10IU/ml)至血液排净，之后灌注4％多聚甲醛80ml，最后灌注20ml左右的Microfil溶液，灌注完毕后，连同右心耳一起结扎，大鼠4℃冷藏过夜，取出术侧股骨，拔出克氏针，4％多聚甲醛固定48h后使用EDTA溶液脱钙处理1个月。处理完成后，进行Micro-CT扫描，扫描条件：电压90KV，电流0.05mA，分辨率6.5μm，扫描完成后并进行三维重建，获得原始数据，观察骨折处血管生长情况。

1.2.7骨密度及生物力学检测

第8周处死大鼠后，取出术侧股骨拔出克氏针，使用万能生物材料试验机，以骨痂处为加压点，进行三点弯曲试验(跨度9mm，加载速度2mm/min)，记录最大载荷和刚度。取健侧股骨放于双能X线骨密度仪检查床上，进行骨密度(BMD)检测。

1.2.8血清骨代谢生化指标分析

第8周麻醉大鼠后，自腹主动脉采血，静置30分钟后以3000r/min离心15min，吸取上层血清，分装冻存于-80℃。采用ELISA法检测血清骨形成指标BALP、PINP和骨吸收指标TRAP、CTX-1水平，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.2.9统计学处理

采用SPSS25.0软件进行统计分析，计量数据以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

实验过程中，各组大鼠精神如常，毛色、食欲及饮水情况无异常。体重变化如表1所示，各组体重均逐渐增加，但组间体重差异始终无统计学意义(P＞0.05)。第8周处死所有大鼠后，主要脏器未见明显异常，器官指数无统计学差异(P＞0.05)(表2)。

表1实验过程中大鼠体质量变化情况(±s，n＝12)

表2各组大鼠主要脏器器官指数(±s，n＝12)

2.2X线片观察结果

如图1所见，Con组从第2周起可见骨折断端产生云雾状骨痂，但至8周时骨痂仍未闭合，骨折线清晰可见；XLGB组骨折愈合速度明显快于Con组，第8周时骨折线消失，髓腔再通；L组与Con组情况接近，但在第8周时的骨折间隙明显小于Con组；M组愈合情况明显好于L组，第4周即形成闭合骨痂，第6周骨折线几乎消失，第8周形成连续皮质骨；H组与XLGB组情况接近，第8周时形成连续皮质骨，髓腔再通。X线评分结果如表3所示，第2周时各组间无明显差别，第4周时XLGB组和H组显著高于Con组(P<0.05)，第6、8周时XLGB组、M组和H组均显著高于Con组(P＜0.05)

表3第2、4、6、8周X线评分比较(±s，n＝9)

注：与Con组比较，^*P＜0.05

2.3Micro-CT扫描分析结果

Micro-CT扫描重建结果见图2，第4周时，Con组骨折断端可见明显的骨折间隙，L组和M组的骨折间隙相对Con组较小，XLGB组和H组看不到骨折间隙，但可见明显膨大的骨痂。第8周时，Con组和L组骨折间隙明显减小，但仍可见未闭合的缺损区域，M组骨痂完全闭合，但膨出明显，表明尚处于骨痂塑型期。XLGB组和H的骨折线完全消失，骨折处表面平整，显示骨痂塑形已经完成。

2.4骨组织病理学观察结果

如图3所示，第1周时，Con组骨折端形成大量肉芽组织，并且有明显的炎性细胞浸润，XLGB组和H组除肉芽组织外，均可看到呈团块状分布的软骨骨痂，L组和M组情况介于Con组和H组之间。第2周时，Con组也可看到团块状的软骨骨痂，但XLGB组和H组已形成软骨骨痂和编织骨骨痂共存的局面。第4周时，Con组骨折区形成大量软骨骨痂，仅见少量编织骨，XLGB组和H组是则以编织骨为主，仅见少量软骨骨痂。第8周时，Con组仍可见软骨骨痂分布于骨折区，XLGB组和H组均已由编织骨形成较致密的皮质骨，内侧可见髓腔及骨髓组织。L组和M组情况总体介于Con组和H组之间，M组愈合情况好于L组(图片未显示)。

2.5血管造影结果

如图4所示，第8周血管造影显示，Con组仅有少量血管穿过骨折区域，血管直径小，骨折间隙明显。L组和M组穿过骨折断端的血管较Con组增多，血管直径增大，但骨折区仍明显可见。XLGB组和H组均有直径较大的血管贯穿骨折端，已观察不到明显的骨折线位置。

2.6骨密度及骨生物力学检测结果

第8周健侧股骨BMD检测结果如表4所示，与Con组比较，XLGB组和H组BMD显著升高(P＜0.05)，L组与Con组接近，也显著低于XLGB组(P＜0.05)。术侧股骨三点弯曲试验结果显示，XLGB组和H组的最大载荷均显著高于Con组(P＜0.01)，抗压强度显著高于Con组(P＜0.05)，M组仅最大载荷显著高于Con组(P＜0.05)，L组与Con组接近，最大载荷显著低于XLGB组(P＜0.05)。

表4第8周各组大鼠股骨BMD、最大载荷、抗压强度比较(±s，n＝6)

注：与Con组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与XLGB组比较，^#P＜0.05。

2.7血清骨代谢指标检测结果

如表5所示，与Con组比较，XLGB组大鼠血清骨形成指标BALP和PINP显著升高(P＜0.01)，L组与Con组无统计学差别，BALP水平显著低于XLGB组(P<0.05)。M组仅PINP水平显著高于Con组(P<0.05)，H组的BALP显著高于Con组(P<0.05)，PINP极显著高于Con组(P<0.01)。骨吸收指标中，与Con组比较，XLGB组TRAP和CTX-1水平显著降低(P<0.01)，L组和M组与Con组无统计学差异，L组与XLGB组比较，CTX-1水平显著升高(P<0.05)。H组的TRAP和CTX-1水平均显著低于Con组(P<0.05)，与XLGB组相比无统计学差异。

表5大鼠血清骨形成(BALP、PINP)和骨吸收(TRAP、CTX-1)指标检测结果(±s，n＝9)

注：与Con组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与XLGB组比较，^#P＜0.05

3讨论

中草药治疗骨折伤在我国历史悠久，已发现多种中草药及其有效成分在促进骨折愈合方面有显著疗效，如骨碎补、续断等。羊胎盘既是中药，又是食品，如能被证明可促进骨折愈合，则服用非常方便，较其他中药有明显特点。

本实验中，X光片检查在第4周即观察到H组断端已形成闭合梭形骨痂，骨折线模糊，第8周时，髓腔贯通，形成连续皮质骨(图1)。Micro-CT扫描检查进一步证明了X线片的结果，提示8周时骨痂重塑已基本完成，恢复到了骨折前的生理结构(图2)。同时，骨折处的病理学观察发现，Con组在8周时仍有大量软骨骨痂存在，导致X片上仍可见清晰的骨折线，而H组和仙灵骨葆阳性对照组一样，已经接近完成从编织骨到板层骨的过渡(图3)。

骨折的愈合有赖于受损局部的血管再生，良好充足的血供能够提供充足的营养物质和成骨细胞，缩短骨折愈合周期。已有许多研究证明，中药能够促进血管再生，从而促进骨折愈合。本实验中的血管造影结果显示，Con组骨折部位只有少量、细小的血管穿过断端，而H组和XLGB组一样，在骨折区域有数量更多、直径更大的血管贯穿(图4)。

骨生物力学是评价骨骼机械强度和骨折相关风险的重要参数，能够反映骨折愈合后承受力学的能力。本实验三点弯曲试验结果证明，各干预组均能够提高大鼠股骨的最大载荷和抗压强度，其中H组和XLGB组效果接近，均显著改善了骨折处的生物力学性能。骨密度是评价骨骼中骨量损失或增加的常用参数。本研究通过对大鼠检测股骨骨密度的检测，发现XLGB组和羊胎盘各剂量组均提高了大鼠BMD，尤以H组提高效果最为明显。本实验还检测了血清骨代谢指标，发现H组骨形成指标BALP和PINP水平较Con组显著提高，而骨吸收指标TRAP和CTX-1水平显著降低，表明此剂量羊胎盘既能促进骨形成又能抑制骨吸收，应是提高其BMD和促进骨折愈合的重要原因。

综上所述，本研究各项检测结果表明，羊胎盘即可促进骨形成，又可抑制骨吸收，同时还能够促进骨折区血管再生，以三方面作用机制促进骨折愈合，提高股骨生物力学性能。上述结果表明，骨折患者有可能通过口服羊胎盘粉来促进骨折愈合，缩短骨折愈合时间，减少骨不连和骨延迟愈合的发生。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.羊胎盘在制备促进骨折愈合药物上的应用。

2.如权利要求1所述的应用，所述羊胎盘为羊胎盘粉。

3.如权利要求2所述的应用，所述羊胎盘粉的制备过程为：取新鲜羊胎盘，去除脂肪、胎儿、羊膜，清洗干净后进行绞切，绞切后的组织再进一步打成匀浆，匀浆装盘后于-32℃预冻，预冻完成后进行真空干燥，经过低温下的粗碎和超微粉碎后，过80目网筛，得细粉，在Co60辐照灭菌后即得羊胎盘粉。

4.如权利要求3所述的应用，所述羊胎盘粉的给药剂量为150mg·kg^-1·d^-1。

5.如权利要求3所述的应用，所述羊胎盘粉的给药方式为口服。