CN117672411A - 一种中药成分的Hormesis效应研究方法及中药成分小檗碱的应用 - Google Patents

一种中药成分的Hormesis效应研究方法及中药成分小檗碱的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中药成分的Hormesis效应研究方法及中药成分小檗碱的应用，该研究方法用于检测中药成分对代谢性疾病的受损细胞是否存在Hormesis效应，包括：构建、处理受损细胞及多角度细胞活力鉴定；利用量效关系函数模型进行中药成分对受损细胞是否存在Hormesis效应判断并寻找最适浓度范围；还包括对Hormesis效应的进一步验证步骤(如流式双染实验验证等)，以及对Hormesis效应机制研究等。该方法为中药成分的量效关系提供了一种新的研究思路。基于上述研究方法本发明确定了小檗碱保护受损胰岛β细胞存在Hormesis效应，并确定了最佳浓度及生物机制，为小檗碱的应用提供了科学依据。

Description

一种中药成分的Hormesis效应研究方法及中药成分小檗碱的 应用
技术领域
本发明涉及医药研究领域，特别是涉及一种中药成分的Hormesis效应研究方法及中药成分小檗碱的应用。
背景技术
糖尿病是典型的代谢性疾病,胰岛受损是糖尿病重要的病理特征，黄连的主要活性成分小檗碱降糖疗效确切且其保护胰岛细胞的功效已得到一定认可，但最新研究显示小檗碱却损伤胰岛β细胞，对这种分歧的原因至今尚无定论。
问题的聚焦点在于：
1)对小檗碱对代谢性疾病受损细胞功能影响研究体系的系统性、用药剂量的科学性及具体生物学机制探讨尚不明确；以小檗碱为代表的中药成分在正常细胞状态下无治疗作用而在受损细胞状态下的一定浓度范围有疗效，而由于剂量掌控问题，往往在新药开发过程中被遗漏，尚无完善的拟合方法和系统的真实性探讨方法。
2)缺乏多角度全面且动态的检测方法。所以导致前期报道对数据的挖掘并不全面。这很有可能是长期以来导致结论出现分歧的原因，这种分歧不仅限制了以小檗碱为代表的中药成分在药物开发应用方面的发展，甚至容易导致医患信任危机。
3)在新药开发利用时，如果不了解量效关系及作用机制，将会阻碍小檗碱或以其他类似天然中药成分的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种中药成分的Hormesis效应研究方法及中药成分小檗碱的应用，通过研究方法可以检测中药成分对代谢性疾病的受损细胞是否存在Hormesis效应，明确量效关系，以及进一步明确生物学作用机制，从而为中药成分的应用提供基础。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种中药成分的Hormesis效应研究方法，用于检测中药成分对代谢性疾病的受损细胞是否存在Hormesis效应，包括:
(1)构建、处理受损细胞及多角度细胞活力鉴定：
处理正常细胞来构建代谢性疾病受损模型；利用不同浓度的中药成分处理受损细胞，并对应进行多角度细胞活力鉴定；所述多角度细胞活力鉴定包括传统CCK8方法(传统细胞活力鉴定)及RTCA实时细胞分析方法(动态细胞活力鉴定)，所述RTCA实时细胞分析方法用于选择最佳给药时间；
(2)利用量效关系函数模型进行中药成分是否存在Hormesis效应判断并寻找最适浓度范围：
将最佳给药时间对应的细胞活力引入量效关系函数模型进行拟合，以受损的模型组活力为1，对不同浓度组细胞活力进行均一化分析，获得拟合图；所述量效关系函数模型为：Y＝alg2 x+blgx+c；其中，Y为相对细胞活力，x为中药成分浓度，a,b,c是常数，为拟合的各项系数，如果a<0且b>0则拟合曲线为倒U型，判定初步存在Hormesis效应；
在拟合图中，将激发区域的面积与曲线上从最小ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积进行比较，比值P反映兴奋效应的强度，计算公式如下：
其中，P为兴奋效应的强度；AUCH为激发区域的面积；AUCZEP为曲线上从最小等效点ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积；ZEP(min)为最小等效点，即与模型组相比具有同样细胞活力的最小浓度点；ZEP(max)为最大等效点，即与模型组相比具有同样细胞活力的最大浓度点，t为中药成分浓度的log值，Y1为细胞相对活力为1的点。
作为本发明的进一步改进，所述研究方法还包括程序性死亡程度鉴定，所述程序性死亡程度鉴定采用流式细胞术分析方法进行Annexin V-PE/7-AAD双染实验验证。
作为本发明的进一步改进，所述研究方法还包括对Hormesis效应的进一步验证步骤，所述验证步骤包括：
在实验动物层面进行验证，包括细胞分泌功能验证及TUNEL染色实验验证；
和/或，利用线粒体膜电位检测实验验证凋亡分期的关系。
作为本发明的进一步改进，所述方法中，在判断存在Hormesis效应后进行Hormesis效应机制研究，包括：
利用基因组芯片技术寻找不同浓度中药成分作用下受损细胞中的差异表达基因，找到影响中药成分量效的靶向因子及信号通路；
利用质粒转染和抑制剂进行干预确定药靶。
作为本发明的进一步改进，对Hormesis效应的最佳浓度处理组进行质粒转染实验；对高剂量处理组进行抑制剂干预实验。实时动态的确认了Hormesis效应发生的真实性。
作为本发明的进一步改进，还包括生物学指标验证、芯片基因靶定位、蛋白及mRNA水平等实验验证，所述活力实验用于研究中药成分对凋亡关键蛋白活力的影响。
第二方面，本发明提供了一种小檗碱在制备保护受损胰岛β细胞药物中的应用，基于上述方法确定小檗碱对糖尿病的受损胰岛β细胞存在Hormesis效应，所述小檗碱的最适浓度范围为0.25-5μM。
作为本发明的进一步改进，所述小檗碱的最佳浓度为2.5μM。
第三方面，本发明还提供了一种高剂量小檗碱联合p53通路抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述高剂量小檗碱为浓度在30-40μM范围内的小檗碱，所述p53通路抑制剂为针对关键基因p53、bax、puma或parp的抑制剂。
通过采用上述技术方案，本发明至少具有如下有益效果：
(1)某些天然中药成分具有对正常细胞无作用对受损细胞在特定范围内有疗效特征，其容易在药物筛选中被忽视。本发明提出的中药成分的Hormesis效应研究方法，对于构建、处理的受损细胞，进行多角度细胞活力鉴定，多角度细胞活力鉴定是在传统CCK8细胞分析方法的基础上，结合了RTCA实时细胞分析方法，即利用RTCA实时动态检测，选择最佳给药时间，完善量效时关系，再将传统CCK8细胞分析方法与最佳给药时间结合，获得最佳给药时间对应的不同浓度组细胞活力，将其引入量效关系函数模型，将大大提高判断Hormesis效应的客观真实性。
(2)本发明以受损的模型组活力为1，对不同浓度组细胞活力进行均一化分析，获得拟合图，且量效关系函数模型的浓度转换为以10为底的对数，重新定义拟合方式，这种改变可以将一些简单拟合方式容易遗漏的小剂量刺激有改善功能的中药成分筛选出来，为新药遴选和最佳浓度的确定提供可靠依据。
(3)本发明以检测中药成分小檗碱对糖尿病的受损胰岛β细胞是否存在Hormesis效应为例，开发了一种中药成分的Hormesis效应研究方法，该方法从Hormesis效应评估及具体生物机制入手来解释中药成分存在的量效现象；该方法为中药成分的量效关系提供了一种新的研究思路，突破了中医用药量大多基于药典的大致范围和医生个人经验的限制，为中医用药量提供了科学理论指导，也为发现由于剂量掌控问题在新药开发过程中被遗漏的候选天然产物提供新的方法。
(4)本发明基于上述研究方法，证明了小檗碱对受损胰岛β细胞存在Hormesis效应，确定了最适浓度范围及最佳浓度，以及确定了其生物机制与p53通路有关，基于此量效关系及生物机制的确定，为其在新药开发时提供了科学依据。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1为实时无标记细胞动态监测仪观察得到的不同浓度小檗碱对IL-1β诱导受损后各组细胞活力的影响图；其中，A为细胞指数曲线图；B为不同时间点细胞指数量化图。
图2为正常状态下小檗碱对胰岛细胞活力的影响图。
图3为炎症因子诱导受损状态下小檗碱对胰岛细胞活力的影响图。
图4为小檗碱作用于受损胰岛细胞Hormesis倒U型曲线图；其中，AUCH为激发区域的面积；ZEP(min)为最小等效点；ZEP(max)为最大等效点；AUCZEP为曲线上从最小等效点ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积。
图5为流式细胞仪检测不同浓度小檗碱对受损胰岛细胞凋亡影响图；其中，A为各组凋亡情况图；B为细胞凋亡程度量化图。
图6为原代胰岛细胞分离鉴定及活力考察情况图；其中，A为双硫腙染色鉴定大鼠原代胰岛图；B为吖啶橙染色观察细胞活力图；注：放大倍数：40倍，标尺：50μm。
图7为TUNEL染色考察不同浓度小檗碱对大鼠原代胰岛β细胞凋亡影响图；其中，A为TUNEL染色结果图；B为TUNEL阳性率量化结果图；注：蓝色荧光标记正常细胞，绿色荧光标记凋亡细胞。标尺：50μm。
图8为不同浓度小檗碱对IL-1β诱导受损状态下胰岛细胞胰岛素分泌的影响图；其中，A为小檗碱处理后不同糖浓度刺激下的胰岛素释放量图；B为处理后对应的胰岛素释放指数图。
图9为小檗碱胰岛Hormesis现象对线粒体膜电位影响图；其中，A为各组线粒体膜电位情况图；B为JC-1红绿荧光比值图。
图10为小檗碱保护受损胰岛细胞Hormesis效应KEGG通路富集图。
图11为p53信号通路相关基因mRNA相对表达量图；
图12为p53信号通路相关蛋白相对表达量图；其中，A为western blot结果图；B为量化结果图。
图13为干扰p53表达后Hormesis效应改变情况图；其中，A为过表达p53后小檗碱剂量组细胞活力变化图；B为低表达p53后小檗碱高剂量组细胞活力变化图；C为过表达p53后小檗碱低剂量组细胞凋亡变化图；D为低表达p53后小檗碱高剂量组细胞凋亡变化图；E,F为凋亡表达量化结果图。
图14为干扰p53表达后Hormesis效应相关蛋白的表达水平图，其中，A为过表达p53后Hormesis效应相关蛋白的表达水平图；B为低表达p53后Hormesis效应相关蛋白的表达水平图；C,D为表达量化结果图。
注：在图1、2、3、5、7、8、9、11、12、13、14中，与空白组相比，#P<0.01，##P<0.005,###P<0.001；与模型组相比*P<0.01,**P<0.005,***P<0.001；在图13、14.中与小檗碱给药组相比a P<0.01,aa P<0.005,aaa P<0.001；n.s.,无统计学意义。
具体实施方式
本发明研究发现低剂量小檗碱显著提高胰岛损伤模型的β细胞活力并促进胰岛素释放而高剂量却加重损伤。故本发明聚焦于这一特殊现象，结合动态细胞活力检测方法利用改进的多角度细胞活力评估方法对其真实性进行评估，结合改进的量效关系拟合模型评估小檗碱改善胰岛受损存在毒物兴奋效应(Hormesis)并阐释其分子机制。同时，也为与小檗碱类似的某些天然中药成分(对正常细胞无作用对受损细胞在特定范围内有疗效)提供了一种明确量效关系及生物机制的研究方法。
本发明的中药成分的Hormesis效应研究方法，用于检测中药成分对代谢性疾病(如糖尿病)的受损细胞(如胰岛细胞)是否存在Hormesis效应，包括:
(1)构建、处理受损细胞及细胞活力鉴定。
处理正常细胞，诱导细胞凋亡来构建受损细胞；利用不同浓度的中药成分处理受损细胞，并对应进行多角度细胞活力鉴定，所述多角度细胞活力鉴定包括传统CCK8方法及RTCA实时细胞分析方法；所述RTCA实时细胞分析方法用于选择最佳给药时间；
(2)利用量效关系函数模型进行中药成分对受损细胞是否存在Hormesis效应判断并寻找最适浓度范围；
(3)利用流式细胞术进行Annexin V-PE/7-AAD双染实验验证，进一步确定细胞活力现象的存在；
(4)在实验动物层面进行验证，包括细胞分泌功能验证及TUNEL染色实验验证；
(5)进一步利用线粒体膜电位检测实验验证凋亡分期的关系；
(6)利用全基因组芯片技术寻找不同浓度中药成分作用下受损细胞中的差异表达基因，找到影响中药成分量效的靶向因子及信号通路；
(7)利用质粒转染和抑制剂进行干预确定药靶；
(8)生物学指标验证、芯片基因靶定位、蛋白及mRNA水平实验验证以及活力实验验证，所述活力实验用于研究中药成分对凋亡关键蛋白的蛋白活力的影响。
糖尿病是一种代谢性疾病，胰岛受损是主要特征之一，下面以小檗碱对受损胰岛β细胞的Hormesis效应研究为例进行说明：
一、实验方法
1、细胞培养和药物处理
模式细胞Rinm5F细胞来自美国类型细胞培养库(ATCC,Manassas,VA,USA)。细胞培养于RPMI 1640。所有培养基含有10％的胎牛血清，100单位/mL的青霉素-链霉素和100mg/mL链霉素在5％的CO2环境中。所有实验中细胞均培养至70～80％融合。
在体外实验中，小檗碱现用现配于培养基中稀释到目标浓度。重组白细胞介素-1β溶于超纯水中，加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)保存，终浓度为10ug/ml。
以10ng/ml IL-1β处理Rinm5F细胞和大鼠原代胰岛β细胞，再以不同浓度的BBR处理细胞，诱导细胞凋亡。
为了诱导细胞凋亡，先用10ng/ml IL-1β处理Rinm5F细胞和大鼠原代胰岛β细胞，然后用浓度增加的BBR处理。同时，其中最佳浓度BBR组(2.5μM)用质粒预处理。空质粒pcDNA3.1和大鼠p53过表达质粒pcDNA3.1-大鼠p53(NM_030989)使用lipofectamine 3000转染到Rinm5F细胞中。高剂量BBR组(30μM)用p53抑制剂聚氟乙烯酯-α(PFT-ɑ)预处理。
2、多角度细胞活力测定
实时细胞分析(RTCA)实时监测细胞活力；将1640完全培养基(每孔50μL)添加到E-plate 16孔板中，并置于RTCA TP中进行基线校准。调整Rinm5F细胞悬液浓度，将细胞接种于E-plate 16孔板。采用RTCA法检测各组细胞指数。计算给药时的归一化细胞指数(NCI)，获得生长曲线。筛选出最佳给药时间。
CCK8检测不同处理后细胞活力；将Rinm5F细胞接种于96孔板，分别加入10ng/mLIL-1β和不同浓度BBR处理，在最佳给药时间时，在450nm处测定吸光度，酶标仪检测吸光度。计算细胞存活率:实验组OD值/非药物组OD值×100％。
3、兴奋性的检测和评估
为观察BBR对损伤Rinm5F细胞的兴奋作用机制，将各组剂量(浓度)及相应细胞活力引入特殊的函数模型进行拟合。在得到的图中将激发区域的面积与曲线上从最小ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积进行比较。比值P反映兴奋效应的强度。
公式如下：
Y＝alg2 x+blgx+c(Y为相对细胞活力，x为中药成分浓度，a,b,c是常数，为拟合的各项系数；如果a<0且b>0则拟合曲线为倒U型，判定初步存在Hormesis效应)。
其中，P为兴奋效应的强度；AUCH为激发区域的面积；AUCZEP为曲线上从最小等效点ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积；ZEP(min)为最小等效点，即与模型组相比具有同样细胞活力的最小浓度点；ZEP(max)为最大等效点，即与模型组相比具有同样细胞活力的最大浓度点，t为中药成分浓度的log值，Y1为细胞相对活力为1的点。
以季铵生物碱小檗碱为例的许多植物有效成分都存在着Hormesis现象且有效剂量和有害剂量差异较大，如果用二次函数模型并不能很好的拟合，为使曲线更符合正态分布R2能够大于0.85，将浓度转换为以10为底的对数。同时以模型组为参照，受损的模型组活力为1，对不同浓度组细胞活力进行均一化分析，这种改变可以将一些简单拟合方式容易遗漏的小剂量刺激有改善胰岛功能的化合物筛选出来，为新药遴选和最佳浓度的确定提供可靠依据。
4、Annexin V-PE/7-AAD染色
Annexin V-PE/7-AAD凋亡检双染法检测Rinm5F细胞凋亡。简而言之，在指定的处理后收集细胞。用冷PBS冲洗两次后，细胞在含Annexin V-PE和7-AAD的结合缓冲液中避光孵育。用流式细胞仪检测细胞内荧光强度，用FlowJo软件分析细胞凋亡率。
5、大鼠原代胰岛β细胞的分离及鉴定
SD大鼠适应性喂养一周后，腹腔注射10％的水合氯醛进行麻醉。麻醉后超净台内对大鼠进行全身消毒后采用仰卧位固定，胸腔部位小心剃去毛发，酒精再一次消毒；剪开腹部皮肤，暴露胰、胆总管，定位胰腺，于胰管紧靠肠壁处结扎。将预冷的胶原酶V沿胆总管逆行注射，放入含胶原酶V的Hanks液的中使其消化后取出，冰浴条件下将其镊碎，移入锥形瓶中轻轻振摇，当其呈细沙状时加入含5％血清的Hanks液终止消化，过800m不锈钢筛网收集细胞悬液，低速离心机弃上清，加入血清和Hanks重悬，再次离心，随后加预冷的Hanks液重悬洗涤，低速离心机弃上清，即得。加入Ficoll溶液重悬，参照不连续密度梯度离心法选择纯化胰岛细胞。随后利用双硫腙(Dithizone，DTZ)染色后鉴定，显微镜下观察染色情况并鉴别。另取分离纯化后大鼠原代胰岛细胞，PBS洗涤后加入吖啶橙染色剂4℃下避光孵育后荧光显微镜下观察胰岛细胞活力。
6、TUNEL染色检测
大鼠原代胰岛β细胞鉴定成功后，培养于1640完全培养基中，待细胞汇合度80％后以接种细胞于6孔板中，分成空白组，模型组，BBR(L)组，BBR(H)组，贴壁数小时后进行不同处理，用于后续TUNEL染色观察各组凋亡情况。
孵育16h后胰酶收集细胞，离心后重悬于PBS中，滴管吸取细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，另取载玻片轻柔的涂开。将载玻片浸入4％多聚甲醛下固定、洗涤。每个样本上滴加Proteinase K溶液进行通透处理，室温孵育5min，PBS清洗；每组滴加1×Equilibration Buffer，同样保证载玻片被完全覆盖，25℃下孵育25min。吸掉1×Equilibration Buffer后，各组加入末端转移酶孵育缓冲液，37℃孵育60min。清洗2次后DAPI染色10min洗涤玻后于荧光显微镜下观察并拍照。
7、胰岛素功能测定
进行GSIS糖刺激实验，检测IL-1β诱导状态下予以不同浓度小檗碱对β细胞胰岛素分泌的影响。对胰岛Rinm5F细胞予以IL-1β刺激后，加入不同浓度的小檗碱。加入含3mM葡萄糖的KRBH溶液稳定细胞状态。用22mM葡萄糖分别处理细胞0、60min，离心收取上清。利用放射免疫法(RIA)对胰岛释放胰岛素功能进行判断。观察不同浓度小檗碱对IL-1β诱导受损状态下胰岛素分泌的影响。
8、线粒体膜电位检测实验验证凋亡分期的关系
采用JC-1染色法检测Rinm5F细胞的ΔΨm。简单地说，处理后细胞收集于PBS中，并在黑暗中用JC-1染料37℃染色。用JC-1染色缓冲液洗涤两次后，样品于流式细胞仪上检测，并通过FlowJo软件分析。
9、差异表达基因分析
提取各组总RNA。采用NanoDrop和Agilent 2100生物分析仪检测RNA的数量和质量。逆转录后合成互补RNA(cRNA)与标记的cRNA靶点与Rat 4×44K全基因组芯片杂交。原始数据经基于R语言的limma程序包进行分位数算法归一化。通过p值和Fold change鉴定差异表达基因。p值小于0.05后，Fold change按降序排列。利用KEGG数据库筛选与本研究相关性强的TOP 20结果并进行富集，利用生物信息学平台进行数据可视化。
10、逆转录定量PCR
提取总RNA，NanoDrop分光光度计检测mRNA表达。用RT MasterMix试剂盒将合格的mRNA逆转录为cDNA。采用SYBR-Green qPCR Mastermix进行RT-qPCR实验。所用引物见表S1。与管家基因比较后，得到各组mRNA相对表达量与对照组比较。引物信息表如表1：
表1引物信息表
11、western blot
使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取分离各处理组的蛋白，然后采用BCA法进行总蛋白的测定。等量的蛋白质用10％的SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜。在5％w/v脱脂乳中封闭后，用p53(53kDa；1:1000)、puma(23kDa；1:1000)，cleaved PARP(89kDa；1:1000)和β-actin(42kDa；1:500)一抗在4℃过夜。随后与相应的二抗(1:10000)孵育。用Photoshop 5.0软件分析蛋白条带的吸光度值。
12、统计分析
采用Prism 6.0统计程序进行统计分析。结果以平均值±标准差表示。采用Student's t检验或单因素方差分析，再进行Tukey's后检验，P<0.05为差异有统计学意义。
二、实验结果：
1、本实施例以诱导胰岛细胞凋亡的可靠诱导剂炎症因子进行胰岛β细胞损伤造模，研究相对宽泛浓度范围内的小檗碱药效。
2、应用RTCA技术，实时动态无标记的观察不同浓度小檗碱对受损Rinm5F细胞活力的影响。当细胞功能状态改变时，其贴壁电极界面阻抗改变。RTCA培养板孔底带有微电极列阵，故可实时记录细胞指数，胰岛细胞活力与细胞指数正相关。配合图1所示，小檗碱给药处理后，连续监测细胞指数，发现16h后曲线平稳，本研究确定了Rinm5F细胞的最佳给药时间为16h。以各组CI值均值绘制生长曲线。随着作用的时间增加，RTCA结果与细胞毒实验结果相符，即低剂量小檗碱一定程度上逆转了胰岛细胞的受损，而高剂量使受损细胞皱缩、悬浮且活力下降。进一步动态证实其Hormesis效应真实性，明确最佳量-效-时。
3.CCK8细胞活力检测结果提示，以促炎症因子白介素-1β(IL-1β)引起的胰岛损伤模型为例，低剂量小檗碱(最适的浓度范围为0.25-5μM，最佳浓度是2.5uM)显著提高胰岛损伤模型的β细胞活力并促进胰岛素释放而高剂量却加重损伤(如图2、3所示)，与重要概念Hormesis的基本特征有一定相似性。
3、兴奋效应的评估准则包括5点:
1)是否有未观察到的有害作用剂量(NOAEL)；2)低于NOAEL的剂量数目；3)低剂量刺激的范围大小；4)刺激效应是否有统计学意义；5)是否可以重复。
外界刺激的强度有效的决定了糖尿病的胰岛保护程度。即胰岛细胞表面接受外源性物质影响时，会改变细胞的生物学特性，引发生化反应产生活力变化，产生动力学变化。故本实施例拟利用这一模型，进一步详细验证低剂量小檗碱改善胰岛损伤的作用存在Hormesis现象。借助细胞动力学监测技术，试图多方位全面的印证中药成分对胰岛的内环境影响是否存在微干扰，使机体开启修复和维持机制，从而保护胰岛细胞免受进一步损害。利用模型构建进行的Hormesis效应的识别，借助相应拟合统计分析进行Hormesis效应判断。
对Hormesis的机制判断需满足三个条件：
1)具有剂量/浓度响应定量特征的可重复双相效应；
2)剂量/浓度响应刺激须假设由特定受体或细胞信号介导；
3)该假设需要通过该受体或细胞信号的特异性拮抗剂进行验证。以这些条件为标准，本实施例着力寻找小檗碱对胰岛细胞产生Hormesis效应背后的关键影响因子，寻求其可能作用机制利用模型构建进行Hormesis效应的识别，借助线性拟合统计分析进行Hormesis效应判断。
配合图4所示对该效应进行验证评估。以受损的模型组活力为1对各组细胞活力进行均一化，拟合得到函数方程为：Y＝-0.7561t2+0.1961t+1.904，c＝1.904,t＝lgx。以模型组即最小等效点ZEP(min)的点作为0点，最大等效点为ZEP(max)。利用AUCH/AUCZEP得到小檗碱在受损胰岛细胞中的Hormesis效应P值为40.78％，R2可以达到0.862，用传统方法拟合R2只有0.662。
4、利用体外模型验证Hormesis现象的真实性。应用流式细胞术对Rinm5F胰岛β模型细胞系程序性死亡指标进行Annexin V-PE/7-AAD双染检测。配合图5所示，通过观察不同浓度小檗碱对IL-1β诱导受损状态下胰岛Rinm5F细胞凋亡的情况。明确了小檗碱对IL-1β诱导Rinm5F细胞凋亡存在低剂量改善高剂量加重的双相作用。
5、大鼠胰岛原代细胞分离鉴定情况及活力考察分离得到细胞团后利用双硫腙(DTZ)染色，该染色剂可以对人和部分动物的胰岛细胞进行染色，是一种常用、简便、理想的鉴定胰岛的方法。配合图6所示，染色后，胰岛细胞特异性呈现猩红色。镜下观察细胞状态良好，染色均匀。
吖啶橙作为一种经典荧光染料，用于观察细胞存活率，可透过正常细胞膜及凋亡细胞膜与细胞核酸结合，区别在于正常细胞荧光呈绿色或黄绿色均匀荧光，而凋亡细胞中由于染色质固缩或形成凋亡小体，因此荧光呈致密黄绿色荧光或黄绿色颗粒。镜下检查可明显通过荧光颜色判断细胞活力。本实验中分离得到大鼠原代胰岛细胞经AO染色后镜下观察到均匀绿色荧光表明分离得到大鼠原代胰岛细胞活力较好。至此分离得到大鼠原代胰岛细胞，可满足后续相关实验。
6、BBR基于Hormesis改善受损大鼠原代胰岛β细胞凋亡
TUNEL染色用于检测大鼠原代胰岛细胞凋亡情况，其中蓝色荧光标记正常细胞，绿色荧光标记细胞凋亡过程中，染色体DNA断裂形成的粘性末端3’-OH末端。配合图7所示，将各组正常细胞蓝色荧光显微照片与绿色荧光显微照片融合后可见，与空白组相比，模型组凋亡比例明显增加；而与模型组相比，BBR(L)组与BBR(H)组分别呈现出低剂量凋亡比例下降，高剂量组凋亡比例增加的趋势。同时BBR(H)组凋亡明显高于BBR(L)组。这些趋势与Rinm5F细胞低剂量促进细胞存活，高剂量抑制细胞。
7、进一步分析小檗碱对胰岛分泌功能的改善作用。配合图8所示，利用RIA计数法测定胰岛细胞分泌胰岛素的浓度，进而验证了小檗碱对胰岛细胞分泌功能存在低剂量改善的作用，当小檗碱高剂量作用时，它对胰岛细胞的分泌功能无改善作用。证实小檗碱改善胰岛功能Hormesis效应的真实性。
8、配合图9所示，在JC-1染料的流式细胞分析中，具有高线粒体的正常细胞ΔΨm,JC-1自发地形成了JC-1聚集物的复合物，带有强烈的红色荧光。另一方面，在低ΔΨm的凋亡细胞中，JC-1仍保持单体形式，显示绿色荧光。使用荧光染料JC-1染色测定了小檗碱对线粒体膜电位的影响。流式细胞术表明，低剂量的小檗碱可以逆转IL-1β诱导的ΔΨm降低。而高剂量BBR组则相反，ΔΨm降低程度加重。
9、为了确定信号通路和分子机制，利用全基因组芯片技术寻找不同浓度BBR作用下受损胰腺β细胞中的差异表达基因。使用KEGG数据库进行基因组注释和途径鉴定。KEGG图谱聚集了多种通路，表明致热机制与凋亡和p53信号通路有关(配合图10所示)。
10、利用qPCR从转录水平上考察p53信号通路上p53、bax、puma、parp等关键基因mRNA的变化情况结果表明小檗碱处理后该条通路中这些蛋白相对表达均呈现低剂量下降，高剂量增加的趋势(配合图11所示)。
12、Western blot结果与qPCR结果一致从蛋白水平验证研p53、parp、puma、bax蛋白表达均呈现低剂量下降，高剂量恢复了这种下降(配合图12所示)。
13、干扰p53通路减弱BBR的Hormesis效应的作用
这与之前验证的小檗碱低剂量凋亡水平下降，高剂量凋亡水平增加的趋势一致。进一步分别通过转染过表达质粒及加入p53抑制剂PFT-α对p53表达进行干预，干预后观察受损Rinm5F细胞活力变化。配合图13所示，结果显示，无论是过表达还是抑制小檗碱所引起的细胞活力和凋亡程度的Hormesis现象都消失了。
而相应的蛋白表达情况也证实了BBR在胰岛细胞中的Hormesis效应与P53通路相有关(配合图14所示)。
中医用药大多基于药典的大致范围和医生个人经验。自古便有“中医不传之秘在于量”的说法，而对中药用量缺乏科学的理论指导和客观标准是阻碍中医发展的重要问题之一。本发明严格的从Hormesis效应评估准则及具体生物机制入手来解释中药降糖存在的量效现象。Hormesis效应恰能对中药用药存在的模糊和经验性问题做出清晰的定量分析。本发明为小檗碱改善胰岛损伤提供理论基础及科学依据，以期对中药成分治疗糖尿病的全面开发应用提供新思路，同时，也为与小檗碱类似的中药成分提供了一种全新的研究思路，为新药的应用提供了科学依据。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种中药成分的Hormesis效应研究方法，其特征在于，用于检测中药成分对代谢性疾病的受损细胞是否存在Hormesis效应，包括:
(1)构建、处理受损细胞及多角度细胞活力鉴定：
处理正常细胞来构建代谢性疾病细胞受损模型；利用不同浓度的中药成分处理受损细胞，并对应进行多角度细胞活力鉴定；所述多角度细胞活力鉴定包括传统CCK8方法及RTCA实时细胞分析方法；所述RTCA实时细胞分析方法用于选择最佳给药时间；
(2)利用量效关系函数模型进行中药成分是否存在Hormesis效应判断并寻找最适浓度范围：
将最佳给药时间对应的细胞活力引入量效关系函数模型进行拟合，以受损的模型组活力为1，对不同浓度组细胞活力进行均一化分析，获得拟合图；所述量效关系函数模型为：Y＝alg2 x+blgx+c；其中，Y为相对细胞活力，x为中药成分浓度，a,b,c是常数，为拟合的各项系数；如果a<0且b>0则拟合曲线为倒U型，则判定初步存在Hormesis效应；
在拟合图中，将激发区域的面积与曲线上从最小ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积进行比较，比值P反映兴奋效应的强度，计算公式如下：
其中，P为兴奋效应的强度；AUCH为激发区域的面积；AUCZEP为曲线上从最小等效点ZEP(min)到最大等效点ZEP(max)的面积；ZEP(min)为最小等效点，即与模型组相比具有同样细胞活力的最小浓度点；ZEP(max)为最大等效点，即与模型组相比具有同样细胞活力的最大浓度点，t为中药成分浓度的log值，Y1为细胞相对活力为1的点。
2.根据权利要求1所述的Hormesis效应研究方法，其特征在于，所述研究方法还包括程序性死亡程度鉴定，所述程序性死亡程度鉴定采用流式细胞术分析方法进行Annexin V-PE/7-AAD双染实验验证。
3.根据权利要求1所述的Hormesis效应研究方法，其特征在于，所述研究方法还包括对Hormesis效应的进一步验证步骤，所述验证步骤包括：
在实验动物层面进行验证，包括细胞分泌功能验证及TUNEL染色实验验证；
和/或，利用线粒体膜电位检测实验验证凋亡分期的关系。
4.根据权利要求1-3任一项所述的Hormesis效应研究方法，其特征在于，所述方法中，在判断存在Hormesis效应后进行Hormesis效应机制研究，包括：
利用基因组芯片技术寻找不同浓度中药成分作用下受损细胞中的差异表达基因，找到影响中药成分量效的靶向因子及信号通路；
利用质粒转染和抑制剂进行干预确定药靶。
5.根据权利要求4所述的Hormesis效应研究方法，其特征在于，对Hormesis效应的最佳浓度处理组进行质粒转染实验；对高剂量处理组进行抑制剂干预实验。
6.根据权利要求4所述的Hormesis效应研究方法，其特征在于，还包括生物学指标验证、芯片基因靶定位、蛋白及mRNA水平实验验证以及活力实验验证，所述活力实验用于研究中药成分对凋亡关键蛋白活力的影响。
7.一种小檗碱在制备保护受损胰岛β细胞药物中的应用，其特征在于，基于权利要求1-6任一项所述的方法确定小檗碱对糖尿病的受损胰岛β细胞存在Hormesis效应，所述小檗碱的最适浓度范围为0.25-5μM。
8.根据权利要求7所述的小檗碱在制备保护受损胰岛β细胞药物中的应用，其特征在于，所述小檗碱的最佳浓度为2.5μM。
9.一种高剂量小檗碱联合p53通路抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的高剂量小檗碱联合p53通路抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述高剂量小檗碱为浓度在30-40μM范围内的小檗碱；所述p53通路抑制剂为针对关键基因p53、bax、puma或parp的抑制剂。
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