CN117651559A - 治疗性间充质干细胞衍生外来体的产生 - Google Patents

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Abstract

本公开内容的方面包括系统、方法和组合物，其用于产生来自间充质干细胞的外来体，和任选地，给所述外来体加载一种或多种治疗试剂。所述系统、方法和组合物可以出现在自动化细胞扩增系统中，所述自动化细胞扩增系统允许可控的参数，并且从其中可以作为特定规程的一部分一次或多次收获细胞和外来体。所述外来体可以通过使用电穿孔来用一种或多种治疗试剂进行加载。在特别的方面，可以向有此需要的个体提供所述外来体，包括在所述有此需要的个体为具有所述外来体对于其来说将会是治疗性的医学病症的个体的一些情况下。

Description

治疗性间充质干细胞衍生外来体的产生
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月20日提交的美国临时申请系列号63/191,202的优先权，其通过提及而以其整体合并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款号CA214749下在政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表，其以ASCII格式以电子方式提交并且特此通过提及以其整体合并。创建于2022年5月16日的所述ASCII副本被命名为MDACP1293WO_ST25.txt并且大小为2,529个字节。
发明背景
I.公开内容的领域
一般而言，本公开内容的方面至少涉及细胞生物学、分子生物学、癌症生物学和医学的领域。
II.发明背景
用于治疗疾病和递送治疗试剂的临床选项总是有需求的并且需要改进。本公开内容通过下述方式而满足了本领域中的需要：提供用于产生外来体(作为用于疗法和/或用于治疗试剂递送的手段)的可靠的、可重现的和实际的系统。
发明概述
本公开内容涉及用于产生和使用外来体的系统、方法和组合物，任选地其中给所述外来体加载一种或多种治疗试剂。在特别的方面，本公开内容涉及用于产生用于下述目的的外来体的系统、方法和组合物：用作治疗或用作治疗的一部分，包括作为用于有此需要的个体的治疗试剂或治疗试剂的一部分，和/或作为用于向有此需要的个体递送一种或多种治疗试剂的递送试剂或递送试剂本身的一部分。在一些方面，还公开了治疗所述外来体(其任选地加载有一种或多种治疗试剂)对于其来说将会是治疗性的任何医学病症的方法。在一些方面，所述外来体(其任选地加载有一种或多种治疗试剂)可以在个体中治疗疾病或状况，以及针对与施用至所述个体的对于所述疾病或状况的其他治疗相关联的毒性进行保护。在某些方面，在外来体的产生方法中通过使用多种试剂从特定细胞产生外来体。此类外来体可以产生自特定细胞，至少包括干细胞，和例如间充质干细胞(MSC，其也可以称为间充质基质细胞)。所述MSC可以源自任何合适的组织，但是在特殊情况下，它们源自脐带组织。可以修饰此类外来体以拥有一种或多种治疗试剂，并且在一些情况下，对所述外来体进行电穿孔以使其拥有一种或多种治疗试剂。
在一些方面，在本文中公开了产生治疗性外来体的方法，其包括下列步骤：(a)培养间充质干细胞(MSC)，(b)从培养物中收集外来体；和(c)对所收集的外来体进行电穿孔以将一种或多种治疗试剂加载到所述外来体中。另外，或备选地，在一些方面，在步骤(a)之前，转染或转导MSC以将一种或多种治疗试剂加载到所述MSC中，在步骤(a)中培养MSC，并且从培养物中收集从经转染或转导的MSC生成的并且包含所述一种或多种治疗试剂的外来体。在一些方面，培养步骤(a)在特定的CO2、O2和氮浓度或条件存在下发生。在一些方面，CO2浓度为5％。在一些方面，O2浓度为20％。在一些方面，培养步骤(a)在用氮进行平衡的条件下发生。
在一些方面，所述MSC来自脐带组织、骨髓、脂肪组织、牙质组织、胎盘组织或其混合物。在一些方面，所述MSC来自脐带组织。
在一些方面，所述方法发生在自动化系统中。在一些方面，所述系统被设置成包含通过所述系统的至少一部分连续输注培养基。在一些方面，所述系统是封闭的或半封闭的。在一些方面，所述方法发生在生物反应器中。在一些方面，所述生物反应器包含多个中空纤维。在一些方面，修饰在所述生物反应器内部的一个或多个表面以允许细胞粘附。在一些方面，修饰在所述生物反应器内部的所述一个或多个表面以包含一种或多种细胞外基质蛋白质。在一些方面，所述细胞外基质蛋白质为纤连蛋白。
在一些方面，所述方法进一步包括从所述系统中提取样品的步骤。在一些方面，就所述外来体的一种或多种特征对所述样品进行测试。
在一些方面，所述方法的步骤(b)使用缺乏血小板裂解物的培养基。在一些方面，所述方法的步骤(b)使用包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的培养基。在一些方面，所述方法的培养步骤(a)使用包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的培养基。在一些方面，所述方法的培养步骤(a)使用α-MEM培养基、肝素、人血小板裂解物和L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽。在所述方法的一些方面，步骤(a)和(b)发生多于一次。在所述方法的一些方面，步骤(a)和(b)发生2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在所述方法的一些方面，步骤(b)发生多于一次,并且所述收集以大约48小时的间隔发生。
在一些方面，在步骤(c)中的电穿孔之前将所收集的外来体悬浮在无菌的、等渗的、非致热的缓冲液中。在一些方面，所述缓冲液包含Plasma-Lyte A。在一些方面，在步骤(c)中对大约1×108至大约10×1012个所收集的外来体进行电穿孔。
在一些方面，所述一种或多种治疗试剂为miRNA、siRNA、shRNA、蛋白质、肽、药物、脂质、DNA、RNA或其组合。在一些方面，所述一种或多种治疗试剂为蛋白质、肽、药物和/或脂质，并且所述蛋白质、肽、药物和/或脂质的浓度在1μg/mL和1000mg/mL之间。在一些方面，所述蛋白质包括抗体或抗体片段。在一些方面，所述一种或多种治疗试剂为miRNA，并且miRNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。在一些方面，所述miRNA包括miR-124、miR-148a、miR-let7i、miR-135a-2、miR-668、miR-942、miR-657。在一些方面，所述一种或多种治疗试剂为siRNA、shRNA和/或RNA，并且siRNA、shRNA和/或RNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。在一些方面，所述siRNA包括针对FGFR3-TACC3基因融合产物的融合断点的siRNA。在一些方面，所述DNA包含至多1000个碱基对。在一些方面，DNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。在一些方面，所述一种或多种治疗试剂的加载效率为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些方面，所述方法进一步包括将有效量的所述外来体递送至有此需要的个体的步骤。在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体提供针对由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的中枢神经系统毒性的神经保护。在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体改善或逆转由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的认知功能障碍和/或神经变性。在一些方面，所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体减轻炎症。
在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要再生的组织提供组织再生效应。在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要修复的组织提供组织修复效应。在一些方面，所述组织由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要再生或修复。在一些方面，所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，所述组织由于下述毒性而需要再生或修复：归因于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损)的毒性，和/或归因于对于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损)的在前治疗的毒性。在一些方面，所述组织由于组织损伤而需要再生或修复。组织损伤的非限制性例子包括炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述需要再生或修复的组织包括软组织(例如，脂肪、纤维组织(例如，腱和/或韧带)、肌(例如，平滑肌、骨骼肌和/或心肌)、滑膜组织、血管、淋巴管和/或神经)、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。
在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要再生的皮肤提供皮肤再生效应。在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要修复的皮肤提供皮肤修复效应。在一些方面，所述皮肤由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。在一些方面，所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，所述皮肤由于下述毒性而需要再生或修复：归因于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的毒性，和/或归因于对于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的在前治疗的毒性。在一些方面，所述皮肤由于皮肤病症而需要再生或修复。皮肤病症的非限制性例子包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
在一些方面，在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要伤口愈合的组织或皮肤提供伤口愈合效应(例如，再生性修复)。在一些方面，所述组织或皮肤由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要伤口愈合(例如，再生性修复)。在一些方面，所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，所述组织或皮肤由于下述毒性而需要伤口愈合(例如，再生性修复)：归因于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的毒性，和/或归因于对于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的在前治疗的毒性。在一些方面，所述组织或皮肤由于组织损伤或皮肤病症而需要伤口愈合(再生性修复)。组织损伤和皮肤病症的非限制性例子包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
在一些方面，所述外来体穿过血脑屏障、血瘤屏障或其组合。在一些方面，所述外来体在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的有此需要的个体中直接地或间接地治疗免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合，或者免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的一个或多个症状。在一些方面，所述一个或多个症状包括中枢神经系统毒性、认知功能障碍、神经变性、炎症、组织变性、组织损害、皮肤损害、伤口、创伤、灼伤或其组合。
在一些方面，所述免疫病症为自身免疫性病症或同种异体免疫性病症。在一些方面，所述免疫病症为移植物抗宿主病。在一些方面，所述癌症为实体肿瘤癌症。在一些方面，所述癌症为CNS癌症或CNS相关癌症。在一些方面，所述癌症为胶质母细胞瘤。在一些方面，所述组织损伤为炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述皮肤病症为炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。在一些方面，所述伤口为组织损伤或皮肤病症的结果，并且所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述灼伤为热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤或其组合。在一些方面，所述创伤为扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
在一些方面，在本文中公开了从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体；包含所述外来体的组合物；和包含所述外来体的药学组合物，其中所述药学组合物任选地进一步包含一种或多种另外的治疗试剂。
在一些方面，在本文中公开了就免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合对个体进行治疗的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体的步骤。在一些方面，所述癌症为实体肿瘤癌症。在一些方面，所述癌症为CNS癌症或CNS相关癌症。在一些方面，所述癌症为胶质母细胞瘤。在一些方面，所述免疫病症为同种异体免疫性病症或自身免疫性病症。在一些方面，所述免疫病症为移植物抗宿主病。在一些方面，所述组织损伤为炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述皮肤病症为炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。在一些方面，所述伤口为组织损伤或皮肤病症的结果，并且所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述灼伤为热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤或其组合。在一些方面，所述创伤为扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
在一些方面，在本文中公开了在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的个体中针对中枢神经系统毒性进行保护的方法，其中所述中枢神经系统毒性由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体或其组合物的步骤。
在一些方面，在本文中公开了在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的个体中改善或逆转认知功能障碍和/或神经变性的方法，其中所述认知功能障碍和/或神经变性由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体或其组合物的步骤。
在一些方面，在本文中公开了在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的个体中再生和/或修复有此需要的组织的方法。在一些方面，所述组织由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。在一些方面，所述个体所接受的所述一种或多种疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，在本文中公开了在具有组织损伤的个体中再生和/或修复有此需要的组织的方法，所述组织损伤包括炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述需要再生或修复的组织包括软组织(例如，脂肪、纤维组织(例如，腱和/或韧带)、肌(例如，平滑肌、骨骼肌和/或心肌)、滑膜组织、血管、淋巴管和/或神经)、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。在一些方面，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体或其组合物的步骤。
在一些方面，在本文中公开了在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的个体中再生和/或修复有此需要的皮肤的方法。在一些方面，所述皮肤由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。在一些方面，所述个体所接受的所述一种或多种疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，在本文中公开了在具有皮肤病症的个体中再生和/或修复有此需要的皮肤的方法，所述皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。在一些方面，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体或其组合物的步骤。
在一些方面，在本文中公开了在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的个体中在有此需要的组织或皮肤中进行伤口愈合(例如，伤口修复)的方法。在一些方面，所述组织或皮肤由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要伤口愈合(例如，伤口修复)。在一些方面，所述个体所接受的所述一种或多种疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。在一些方面，在本文中公开了在具有组织损伤或皮肤病症的个体中在有此需要的组织或皮肤中进行伤口愈合(例如，伤口修复)的方法，所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。在一些方面，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体或其组合物的步骤。
在一些方面，在本文中公开了在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、炎症、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤、灼伤或其组合的个体中减轻炎症的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的从在本文中所公开的方法中的任一种所产生的外来体或其组合物的步骤。
在本文中所公开的治疗个体的方法的一些方面，所述外来体穿过血脑屏障、血瘤屏障或其组合。在一些方面，所述MSC关于所述个体来说是自体的或同种异体的。在一些方面，所述外来体经由直肠、鼻、颊、阴道、皮下、鼻内、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内或颅内途径，或者经由植入型贮器来进行施用。在一些方面，所述外来体与至少一种另外的治疗试剂相联合地进行施用。
还公开了本公开内容的下列的方面(A)1至98。
方面1为产生治疗性外来体的方法，其包括下列步骤：(a)培养间充质干细胞(MSC)；和(b)从培养物中收集外来体，其中，在步骤(a)之前，转染或转导所述MSC以将一种或多种治疗试剂加载到所述MSC中，并且其中所述外来体从经转染或转导的MSC产生并且包含所述一种或多种治疗试剂。
方面2为产生治疗性外来体的方法，其包括下列步骤：(a)培养间充质干细胞(MSC)；(b)从培养物中收集外来体；和(c)对所收集的外来体进行电穿孔以将一种或多种治疗试剂加载到所述外来体中。
A3.A1或A2的方法，其中培养步骤(a)在特定的CO2、O2和氮浓度或条件存在下发生。
A4.A3的方法，其中CO2浓度为5％。
A5.A3或A4的方法，其中O2浓度为20％。
A6.A1至A5的方法，其中培养步骤(a)在用氮进行平衡的条件下发生。
A7.A1至A6的方法，其中所述MSC来自脐带组织、骨髓、脂肪组织、牙质组织、胎盘组织或其混合物。
A8.A1至A7的方法，其中所述MSC来自脐带组织。
A9.A1至A8的方法，其中所述方法发生在自动化系统中。
A10.A9的方法，其中所述系统被设置成包含通过所述系统的至少一部分连续输注培养基。
A11.A9或A10的方法，其中所述系统是封闭的或半封闭的。
A12.A1至A11的方法，其中所述方法发生在生物反应器中。
A13.A12的方法，其中所述生物反应器包含多个中空纤维。
A14.A13的方法，其中修饰在所述生物反应器内部的一个或多个表面以允许细胞粘附。
A15.A14的方法，其中修饰在所述生物反应器内部的所述一个或多个表面以包含一种或多种细胞外基质蛋白质。
A16.A15的方法，其中所述细胞外基质蛋白质为纤连蛋白。
A17.A9至A16的方法，其进一步包括从所述系统中提取样品的步骤。
A18.A17的方法，其中就所述外来体的一种或多种特征对所述样品进行测试。
A19.A1至A18的方法，其中步骤(b)使用缺乏血小板裂解物的培养基。
A20.A1至A19的方法，其中步骤(b)使用包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的培养基。
A21.A1至A20的方法，其中培养步骤(a)使用包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的培养基。
A22.A1至A21的方法，其中培养步骤(a)使用α-MEM培养基、肝素、人血小板裂解物和L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽。
A23.A1至A22的方法，其中步骤(a)和(b)发生多于一次。
A24.A1至A23的方法，其中步骤(a)和(b)发生2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。
A25.A1至A24的方法，其中步骤(b)发生多于一次,并且所述收集以大约48小时的间隔发生。
A26.A2至A25的方法，其中在步骤(c)中的电穿孔之前将所收集的外来体悬浮在无菌的、等渗的、非致热的缓冲液中。
A27.A26的方法，其中所述缓冲液包含Plasma-Lyte A。
A28.A2至A27的方法，其中在步骤(c)中对大约1×108至大约10×1012个所收集的外来体进行电穿孔。
A29.A1至A28的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为miRNA、siRNA、shRNA、蛋白质、肽、药物、脂质、DNA、RNA或其组合。
A30.A29的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为蛋白质、肽、药物和/或脂质，并且其中所述蛋白质、肽、药物和/或脂质的浓度在1μg/mL和1000mg/mL之间。
A31.A29或A30的方法，其中所述蛋白质包括抗体或抗体片段。
A32.A29至A31的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为miRNA，并且其中miRNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。
A33.A29至A32的方法，其中所述miRNA包括miR-124、miR-148a、miR-let7i、miR-135a-2、miR-668、miR-942、miR-657。
A34.A29至A33的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为siRNA、shRNA和/或RNA，并且其中siRNA、shRNA和/或RNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。
A35.A29至A34的方法，其中所述siRNA包括针对FGFR3-TACC3基因融合产物的融合断点的siRNA。
A36.A29至A35的方法，其中所述DNA包含至多1000个碱基对。
A37.A29至A36的方法，其中DNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。
A38.A1至A37的方法，其中所述一种或多种治疗试剂的加载效率为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
A39.A1至A38的方法，其进一步包括将有效量的所述外来体递送至有此需要的个体的步骤。
A40.A39的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体提供针对由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的中枢神经系统毒性的神经保护。
A41.A39或A40的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体改善或逆转由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的认知功能障碍和/或神经变性。
A42.A40或A41的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
A43.A39至A42的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体减轻炎症。
A44.A39至A43的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要再生和/或修复的组织提供组织再生和/或组织修复效应。
A45.A44的方法，其中所述组织由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。
A46.A44或A45的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
A47.A44至A46的方法，其中所述组织由于炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合而需要再生和/或修复。
A48.A44至A47的方法，其中所述需要再生和/或修复的组织包括软组织、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。
A49.A39至A48的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要再生和/或修复的皮肤提供皮肤再生和/或皮肤修复效应。
A50.A49的方法，其中所述皮肤由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。
A51.A49或A50的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
A52.A49至A51的方法，其中所述皮肤由于皮肤病症而需要再生和/或修复。
A53.A49至A52的方法，其中所述皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
A54.A39至A53的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要伤口愈合的组织或皮肤提供伤口愈合效应。
A55.A54的方法，其中所述组织或皮肤由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要伤口愈合。
A56.A54或A55的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
A57.A54至A56的方法，其中所述组织或皮肤由于组织损伤或皮肤病症而需要伤口愈合。
A58.A54至A57的方法，其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
A59.A39至A58的方法，其中所述外来体穿过血脑屏障、血瘤屏障或其组合。
A60.A39至A59的方法，其中所述外来体在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的有此需要的个体中直接地或间接地治疗免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合，或者免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的一个或多个症状。
A61.A60的方法，其中所述一个或多个症状包括中枢神经系统毒性、认知功能障碍、神经变性、炎症、组织变性、组织损害、皮肤损害、伤口或其组合。
A62.A60或A61的方法，其中所述免疫病症为自身免疫性病症或同种异体免疫性病症。
A63.A62的方法，其中所述免疫病症为移植物抗宿主病。
A64.A60或A61的方法，其中所述癌症为实体肿瘤癌症。
A65.A64的方法，其中所述癌症为CNS癌症或CNS相关癌症。
A66.A64或A65的方法，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
A67.A60或A61的方法，其中所述组织损伤为炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
A68.A60或A61的方法，其中所述皮肤病症为炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
A69.A60或A61的方法，其中所述伤口为组织损伤或皮肤病症的结果，并且其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
方面70为从A1至A37的方法中的任一种所产生的外来体。
方面71为组合物，其包含A70的外来体。
方面72为药学组合物，其包含A70的外来体。
A73.A72的药学组合物，其进一步包含一种或多种另外的治疗试剂。
方面74为就免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合对个体进行治疗的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
A75.A74的方法，其中所述癌症为实体肿瘤癌症。
A76.A75的方法，其中所述癌症为CNS癌症或CNS相关癌症。
A77.A75或A76的方法，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
A78.A74的方法，其中所述免疫病症为同种异体免疫性病症或自身免疫性病症。
A79.A78的方法，其中所述免疫病症为移植物抗宿主病。
A80.A74的方法，其中所述组织损伤为炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
A81.A74的方法，其中所述皮肤病症为炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
A82.A74的方法，其中所述伤口为组织损伤或皮肤病症的结果，并且其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
A83.A74至A82的方法，其进一步包括向所述个体施用对于各自的免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的第二疗法。
方面84为在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中针对中枢神经系统毒性进行保护的方法，其中所述中枢神经系统毒性由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
方面85为在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中改善或逆转认知功能障碍和/或神经变性的方法，其中所述认知功能障碍和/或神经变性由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
方面86为在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中再生和/或修复有此需要的组织的方法，其中所述组织由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
方面87为在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中再生和/或修复有此需要的皮肤的方法，其中所述皮肤由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
方面88为在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中在有此需要的组织或皮肤中进行伤口愈合的方法，其中所述组织或皮肤由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要伤口愈合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
A89.A84至A88的方法，其中所述个体所接受的所述一种或多种疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
方面90为在具有组织损伤的个体中再生和/或修复有此需要的组织的方法，其中所述组织损伤包括炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
A91.A86至A90的方法，其中所述需要再生和/或修复的组织包括软组织、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。
方面92为在具有皮肤病症的个体中再生和/或修复有此需要的皮肤的方法，其中所述皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
方面93为在具有组织损伤或皮肤病症的个体中在有此需要的组织或皮肤中进行伤口愈合的方法，其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
方面94为在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染或其组合的个体中减轻炎症的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的通过A1至A37的方法所产生的外来体、A71的组合物或者A72至A73的药学组合物的步骤。
A95.A74至A94的方法，其中所述外来体穿过血脑屏障、血瘤屏障或其组合。
A96.A74至A95的方法，其中所述MSC关于所述个体来说是自体的或同种异体的。
A97.A74至A96的方法，其中所述外来体经由直肠、颊、阴道、皮下、鼻内、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内或颅内途径，或者经由植入型贮器来进行施用。
A98.A74至A97的方法，其中所述外来体与至少一种另外的治疗试剂相联合地进行施用。
术语“治疗有效量”是指足以产生所希望的治疗结果的量，例如，足以在所述细胞所施用于的受试者中改善医学状况的至少一个症状的外来体的量。
“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，并且可以是指人或非人，例如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在特别的方面，所述受试者为人。所述受试者可以具有任何年龄、性别或种族。所述受试者可以为患者，其例如具有或被怀疑具有疾病(其可以被称为医学状况)，例如良性或恶性癌症、自身免疫性或同种异体免疫性状况、感染性疾病、组织损伤、皮肤病症或伤口。所述受试者可以正在经历或已经历治疗。所述受试者可以是无症状的。所述受试者可以是渴望预防疾病或状况的健康个体。
如在本文中所使用的，“治疗”或等价术语是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目标是阻止或减慢(减轻)不希望的生理学变化或病症，例如肿瘤或感染性疾病的生长、发展或扩散，肿瘤复发，自身免疫性或同种异体免疫性病症的表现，组织损伤的表现，皮肤病症的表现，或伤口。为了本公开内容的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于，症状的减轻或改善，疾病程度的减小，疾病的稳定化(即，不恶化)状态，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或缓和，和缓解(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以意味着相比于如果不接受治疗而预期的存活而言延长存活。“治疗”不必定表明疾病或状况或者其相关症状的完全根除或治愈。需要治疗的那些包括已经具有所述状况或病症的那些以及倾向于具有所述状况或病症的那些或其中所述状况或病症待被阻止的那些。治疗的结果可以通过本领域中已知的方法来测定，例如，例如肿瘤负荷或病毒载量的减少的测定，功能恢复的测定，或本领域中已知的其他方法。
如在本文中所使用的，“预防”和类似单词指明了用于阻止、抑制或减小疾病或状况(例如，癌症、感染性疾病、自身免疫性或同种异体免疫性病症、组织损伤、皮肤病症或伤口)的出现或复发的可能性的方法。它还是指延迟疾病或状况的开始或复发，或者延迟疾病或状况的症状的出现或复发。如在本文中所使用的，“预防”和类似单词还包括在疾病或状况的开始或复发之前减小所述疾病或状况的强度、效应、症状和/或负荷。
如在整个本申请中所使用的，术语“治疗益处”或“在治疗上有效的”是指关于该状况的医学处理而言促进或增强受试者的康宁的任何事物。这包括但不限于疾病的征候或症状的频率或严重度的减小。例如，癌症的治疗可以包括但不限于肿瘤大小的减小、肿瘤侵袭性的减小、癌症生长速率的减小或者转移的防止。癌症的治疗也可以是指延长具有癌症的受试者的存活。感染性疾病的治疗可以包括但不限于，在个体中感染性疾病扩散的减小、感染性疾病侵袭性的减小、感染性疾病传播速率的减小或者感染性疾病扩散的防止。感染性疾病的治疗也可以是指延长具有感染性疾病的受试者的存活。自身免疫性或同种异体免疫性病症的治疗可以包括但不限于，疼痛、水肿、温度升高和/或炎症的减轻，或者免疫排斥的防止。自身免疫性或同种异体免疫性病症的治疗也可以是指延长具有自身免疫性或同种异体免疫性病症的受试者的存活。组织损伤的治疗可以包括但不限于，在个体中组织损伤扩散的减小或者与组织损伤相关联的疼痛或炎症的减小。组织损伤的治疗也可以是指延长具有组织损伤的受试者的存活。皮肤病症的治疗可以包括但不限于，在个体中皮肤病症扩散的减小或者皮肤病症侵袭性的减小。皮肤病症的治疗也可以是指延长具有皮肤病症的受试者的存活。伤口的治疗可以包括但不限于，在个体中伤口扩散的减小、伤口侵袭性的减小或者伤口感染的防止。伤口的治疗也可以是指延长具有伤口的受试者的存活。
短语“药学的或在药理学上可接受的”是指这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物例如人(适当时)时不产生不利的、变应性的或其他麻烦的反应。鉴于本公开内容，包含抗体或另外的活性成分的药学组合物的制备将会是本领域技术人员已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，将会理解的是，制备物应当符合由FDA生物标准局所要求的无菌度、致热性、一般安全和纯度标准。
如在本文中所使用的，“在药学上可接受的载剂”包括任何和所有水性溶剂(例如，水，醇性/水性溶液，盐水溶液，肠胃外载料，例如氯化钠、林格氏葡萄糖溶液等)、非水性溶剂(例如，丙二醇，聚乙二醇，植物油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌试剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗试剂、吸收延迟试剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解试剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、液体和营养物补充剂，此类相似材料及其组合，如本领域普通技术人员将会已知的。在药学组合物中各种组分的pH和精确浓度按照众所周知的参数来进行调整。
在整个本申请中，术语“大约”、“实质上”和“大致”用于指明，值包括关于测量或定量方法的内在误差变化或者值或范围的可变性程度。因此，术语“大约”、“实质上”和“大致”通常意指所叙述的值±5％。
单词“a”或“an”的使用，当与术语“包含”相联合地进行使用时，可以意指“一个(种)”，但它也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或多于一个(种)”的含义相一致。
短语“和/或”意指“和”或“或”。为了举例说明，A、B和/或C包括：仅A，仅B，仅C，A和B的组合，A和C的组合，B和C的组合，或者A、B和C的组合。换言之，“和/或”作为包括性的“或”来运作。
所述组合物和关于其使用的方法可以包含在整个说明书中所公开的成分或步骤中的任一个，基本上由在整个说明书中所公开的成分或步骤中的任一个组成，或者由在整个说明书中所公开的成分或步骤中的任一个组成。基本上由所公开的成分或步骤中的任一个组成的组合物和方法将权利要求的范围限制至不实质上影响所要求保护的公开内容的基本和新颖特征的明确说明的材料或步骤。如在本说明书和权利要求书中所使用的，单词“包含”(和其任何形式)、“具有”(和其任何形式)、“包括”(和其任何形式)或“含有”(和其任何形式)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未记述的要素或方法步骤。考虑了，在本文中在术语“包含”的情景下所描述的方面也可以在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的情景下实施。
在治疗、诊断或生理学目的或效果的情景下的任何方法也可以以“用途”权利要求语言来进行描述，例如在本文中所讨论的任何化合物、组合物或试剂用于取得或实现所描述的治疗、诊断或生理学目的或效果的“用途”。
在整个本说明书中提及“一个方面”、“方面”、“特别的方面”、“相关方面”、“某个方面”、“另外的方面”或“进一步的方面”或者其组合意味着，与所述方面相联系地描述的特定的特征、结构或特点被包括在本公开内容的至少一个方面中。因此，在整个本说明书中上述短语在各个地方中的出现并不必定都是指相同的方面。进一步地，可以将所述特定的特征、结构或特点以任何合适的方式组合在一个或多个方面中。
特别考虑了，关于本公开内容的一个方面所讨论的任何限制可以应用于本公开内容的任何其他方面。进一步地，本公开内容的任何组合物可以在本公开内容的任何方法中使用，并且本公开内容的任何方法可以用于产生或利用本公开内容的任何组合物。在实施例中所阐述的实施方案的方面也是可以在不同的实施例中在别处或者在本申请中在别处(例如，在发明概述、发明详述、权利要求书和附图描述中)所讨论的方面的情景下实施的方面。
本公开内容的其他目标、特征和优点从下面的详细描述中将会变得明显。然而，应当理解，详细描述和特定实施例，虽然指明了本公开内容的特定方面，但是仅以举例说明方式给出，因为从该详细描述中，在本公开内容的精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员来说将会变得明显。
附图简述
下面的附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步证明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个以及与之相组合的在本文中所呈现的特定方面的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1.提供了关于鉴定有效的抗神经胶质瘤miRNA(miR)的示意图。
图2A-2B证明，miR-124a是有效的抗神经胶质瘤miR。
图3提供了关于对BM-hMSC进行慢病毒改造以产生包含miR-124a的外来体的示意图。
图4A-4C显示，源自人骨髓间充质干细胞(BM-hMSC)的囊泡为外来体。
图5显示，BM-hMSC衍生外来体包含miR-124a(Exo-miR124)。
图6提供了关于检定包含miR-124a的BM-hMSC衍生外来体的体外功效的示意图。
图7A-7B显示，包含miR-124a的BM-hMSC衍生外来体(Exo-miR124)抑制神经胶质瘤干细胞(GSC)生存力(图7A)和克隆发生(图7B)。
图8A-8C显示了包含miR-124a的BM-hMSC衍生外来体(Exo-miR124)的潜在作用机制，其特征在于在用Exo-miR124处理GSC267和GSC8-11后的FOXA2下调(图8A)、脂质积累(图8B)和凋亡性细胞死亡的诱导(图8C)。
图9A-9E图解说明了具有针对一组七种经完全注释的源自患者的GSC的抑制活性的miRNA的鉴定。
图10提供了关于检定包含miR-124a的外来体(Exo-miR124)在体内寻靶至肿瘤的示意图。
图11A-11B图解说明了通过不同途径施用的包含miR-124a的外来体在体内寻靶至肿瘤。
图12A-12B显示，包含miR-124a的外来体(Exo-miR124)的全身递送在体内增加携带脑肿瘤的小鼠的存活。
图13显示，在24小时内每个细胞产生的外来体的数目在脐带间充质干细胞(UC-MSC)中大于在骨髓间充质干细胞(BM-MSC)中。
图14A-14B显示，UC-MSC衍生外来体(UC-Exo)，像BM-MSC衍生外来体(BM-Exo)一样，在体内寻靶至脑肿瘤。图14A.在IA递送至携带神经胶质瘤的小鼠后，UC-MSC-Exo和BM-MSC-Exo的BLI。图14B.显示了脑图像的平均辐射效率的条线图，所述平均辐射效率通过使用下面的公式来计算：(p/s/cm2/sr)/(μW/cm2)，其中p为光子；s为秒；sr为球面度；和μW为激发狭缝。
图15A-15C图解说明了产生(图15A)、电穿孔(图15B)和评价(图15C)加载有mir-124的间充质干细胞(MSC)衍生外来体的过程。
图16显示了在经由各种程序进行电穿孔后检定miR-124水平的RT-qPCR结果。使用0ng至1μg的miRNA浓度来获得标准曲线(图的右半部分)。
图17A-17D显示了用单独的UC-Exo(单独的外来体)、经电穿孔的包含对照miRNA的UC-Exo(miR-CTRL)和经电穿孔的包含miR124a的UC-Exo(miR-124)进行处理对于GSC267(图17A、17C)和GSC8-11(图17B、17D)细胞系的生存力的效应，使用比色测定法(图17A、17B)或者通过使用锥虫蓝排除对活细胞进行计数(图17C、17D)。*P<0.05，**P<0.01。
图18A-18C显示了对于F3-T3融合断点的siRNA的设计。图18A.F3-T3断点的序列和各种定制的siRNA构建体。箭头指向构建体#5，其被显示在U87.F3T3(图18B)和SNB19.F3T3(图18C)细胞系中在耗竭F3-T3蛋白方面都是最有效的，如通过免疫印迹所图解说明的。
图19显示，加载有iF3T3的UC-Exo在体外成功地耗竭了F3-T3。qPCR测定法，其图解说明，在用在以电穿孔程序1-4进行电穿孔后加载了iF3T3的外来体进行处理后F3-T3被耗竭。＊＊＊P<.0001，非成对t-检验。
图20显示了用化学放射以及随后的用UC-Exo的处理(IV，每只小鼠，Exo1：0.8×109，Exo2：8.8×109，或Exo3：1.7×1010)进行治疗的C57/BL6小鼠(n＝8/组)的执行功能。描绘了在困难试验中到达黑暗区室所需要的平均时间。*P<0.05。
图21A-21C描述了被设计用于使用生物反应器(例如，细胞扩增系统(Terumo BCT；Lakewood,CO))从MSC产生细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)的操作程序的一个例子。
图22显示了通过使用锥虫蓝排除对活细胞进行计数所检定的用BM-MSC-外来体(BM-MSC-Exo)和两个UC-MSC-外来体(UC-MSC-Exo)样品进行处理对于GSC267胶质母细胞瘤细胞系的生存力的效应，比较了单独的外来体(空的外来体)、包含对照miRNA的MSC-Exo(ExomiR对照)和包含miR124a的MSC-Exo(miR-124)(经由慢病毒(BM-MSC-Exo)或电穿孔(UC-MSC-Exo))。结果显示，用exomiR-124进行处理显著地降低了胶质母细胞瘤干细胞的数目。
图23显示了RT-qPCR结果，其检定了在BM-MSC-外来体(通过慢病毒产生的)和UC-MSC-外来体(在使用小或大规模电穿孔过程进行电穿孔后)上的miR-124水平，采用合适的对照。使用25ng至200ng的miRNA浓度来获得标准曲线(图的右半部分)。在更低的ΔCt(其表明了在外来体中的更高拷贝数的miR124)方面，脐带组织外来体具有最好的结果。
发明详述
本公开内容描述了用于从间充质干细胞(MSC)产生外来体和用于用治疗试剂加载所述外来体的特定的系统、方法和组合物。如在本文中所证明的，根据所公开的操作程序制备的MSC衍生外来体是稳定的和有生物活性的，并且这些MSC衍生外来体的电穿孔可以用于产生加载有强有力的治疗剂的外来体。
在至少一些方面，源自脐带(UC)的间充质干细胞(UC-MSC)产生相比于源自骨髓(BM)的MSC(BM-MSC)而言显著更高数目的外来体。另外，在至少一些方面，像BM-MSC衍生外来体一样，UC-MSC衍生外来体(UC-Exo)在体内寻靶至肿瘤，并且表型表征确证UC-MSC和BM-MSC衍生外来体表达相同水平的外来体标志物CD9、CD63、CD47和CD81。使用电穿孔，可以用治疗试剂(包括但不限于蛋白质、核酸和小分子药物)直接加载这些外来体。该策略是有利的，因为大量产生比牵涉用慢病毒(LV)转导MSC以表达一些治疗试剂的方法更可行，并且在每个外来体中治疗剂的量的可重现性是高度受控的，从而使得该方法比LV-转导方法更可按比例放大和更“药物样”，在至少一些方面。另外，该策略将外来体的产生/分离与用治疗试剂进行加载相分开，从而允许每个阶段的质量控制。进一步地，在至少一些方面，UC-Exo在逆转在由化学放射所诱导的脑损伤后的认知功能障碍中可以是有效的，并且在继发于放射和化学疗法的神经认知毒性的治疗中可以是有效的。
所建立的方法是实际的、有效的，并且允许外来体作为治疗试剂用于下述方面的临床用途：例如，治疗具有GBM或者其他实体或液体肿瘤以及与之相关联的毒性的患者；治疗具有同种异体免疫性或自身免疫性病症的患者；治疗具有微生物感染的患者；治疗具有皮肤病症的患者；治疗伤口；用于基因和药物递送的载料；和用于再生和/或修复医学情境的治疗试剂。
I.产生外来体的系统和方法
本公开内容提供了产生作为外来体的细胞外囊泡(EV)的系统和方法。在特别的情况下，本公开内容涉及新的、符合良好生产规范(GMP)的策略以产生外来体。在一些方面，在与从特定细胞产生相组合的特定条件下产生所述外来体。
在特别的方面，所述MSC来自脐带组织，但是它们可以来自任何来源，包括但不限于骨髓、脂肪组织、牙质组织和胎盘组织。
在所述过程中的任何步骤可以具有例如特定的培养基，持续时间，以特定浓度的一种或多种特定气体的存在，移动(例如，旋转)的存在或不存在，以及其组合。在特别的方面，在一些情况下，将所述细胞与培养基一起温育(例如，在生物反应器或瓶中)特定量的时间。在这之后为洗涤并且收集所述细胞以及从所述细胞中分泌出的外来体。外来体的收集(在本文中可以称为收获)可以包括一个步骤或多个步骤；在外来体的收集发生多于一次的情况下，可以有或没有收集外来体的时间间隔，例如在收集之间至少、至多或大约12、18、24、36、48、60、72小时或更多，或者其中可导出的任何范围或值。在其中收集所述细胞和外来体的培养基可以是特别种类的，并且在收集所述细胞和外来体的特定步骤中，所述培养基缺乏血小板裂解物(无PLT)。在特别的情况下，将所述细胞培养经过大约22小时的过程，然后大约每48小时洗涤细胞并且收集从所述细胞中分泌出的外来体，在无PLT的EC培养基中(所述无PLT的EC培养基可以包含或不包含补充有2mM的GLUTAMAXTM(与L-谷氨酰胺相似并且包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的合成试剂)的αMEM培养基)。可以重复这些顺次步骤，例如重复总共2、3、4或更多次。
在特别的方面，在从细胞产生的外来体始终如一地具有相同的或实质上相同的标志物和生理学的条件下从所述系统中收获细胞和外来体的悬浮液。因此，在特别的情况下，在不同的收获时间，所述外来体由于其大多数外来体具有相同的表达标志物中的一种或多种而是相同的或实质上相同的。
在特别的方面，所述用于产生外来体的过程发生在生物反应器中，虽然在另一些情况下不是如此。在特别的方面，所述用于产生外来体的过程发生在瓶中。在特别的方面，所述过程的部分或全部发生在具有可控条件的生物反应器中，其在特定情况下可以实现自动化。虽然所述生物反应器可以是任何种类的，但是在特别的方面，所述生物反应器包含中空纤维系统，其可以包含或不包含一条或多条通路。在特别的方面，所述多个中空纤维包含适合于细胞粘附或者适合于进行修饰从而细胞可以粘附至其上的内表面。作为例子，备选的系统采用WAVE BIOREACTORTM(GE Healthcare)或系统(Wilson Wolf)。
在某些方面，所述中空纤维生物反应器可以为被设计用于粘附或非粘附细胞的大规模细胞培养的在功能上封闭(或半封闭)的系统。在至少一些生物反应器中，所述系统允许细胞在允许连续输注培养基的动态环境中生长(数目扩大)，所述动态环境在合适的条件下模拟特定的体内血管内和血管外区室。也就是说，在特别的情况下，血管内区室被设置成模拟血液系统的血管内区域，和/或血管外区室被设置成模拟血管外造血系统。在特别的情况下，所述中空纤维系统包含成百上千的半渗透性孔，其用于培养所希望的细胞，包括粘附细胞。膜可以构成中空纤维的内壁并且允许以均匀的方式进行气体和/或营养物的交换，从而使细胞的生长速率在短时间内达到最大。在特别的方面，所述过程特别地被设计成适合于MSC的生长并且允许以定制的方法收集由所述细胞所分泌的外来体。
所述生物反应器系统的部件包括用于将培养基和/或细胞引至所述系统的容器和/或区室，用于扩增细胞(和由此从扩增中/已扩增的细胞产生外来体)的容器和/或区室，和用于收获细胞、包含外来体的条件培养基等的容器和/或区室。在特别的方面，用于所述系统的任何部分的区室的例子包括细胞入口袋、培养基袋、收获物袋和废物袋。所述生物反应器系统采用数千个半渗透性中空纤维，细胞粘附在其上，要么天然地，要么因为在所述系统中的中空纤维已进行了操作从而允许所希望的细胞的粘附。在特别的方面，所述系统还包括使在培养基中的所希望的气体浓度稳定化的气体调节器(其可以被称为气体转移模块)。这样的气体调节器允许(如果希望)将一种或多种气体连续输注到所述生物反应器中。在特别的方面，用于产生所希望的外来体的过程采用明确定义的CO2(例如，大约5％)、O2(例如，大约20％)和氮(例如，所述条件是氮平衡的)的浓度。
图21A-21C提供了一个用于产生外来体的操作程序和系统的例子。在所述系统的特别的情况下，可以存在有毛细管内(IC)通路和/或毛细管外(EC)通路。在所述生物反应器包含IC和/或EC通路的情况下，它们可以通过下述来维持：决定新培养基流入所述生物反应器的每一侧的入口泵，和决定在所述生物反应器的每一侧中的培养基移动通过其回路所处的速率的循环泵。在关于所述生物反应器系统的特别的方面，采用中空纤维生物反应器系统，其由微孔形成并且分为分开的IC和EC流体通路。在特别的方面，关于IC和EC通路的流控技术通过下述来维持：决定新培养基流入所述生物反应器的每一侧的入口泵，和决定在所述生物反应器的每一侧中的培养基移动通过其回路所处的速率的循环泵。在特别的方面，将细胞接种在毛细管内区室上，而将EC区室用于用培养基饲喂细胞。
一般而言，采取合适的步骤来在加载细胞之前准备所述系统，例如准备所述系统的物理部件以推动细胞的扩增。所述系统可以是封闭的或者可以是半封闭的(如在本文中所使用的，是指在产生外来体期间，一些步骤需要所述系统的开放和将样品暴露于空气)。在使待扩增的细胞经历所述系统之前，所述生物反应器可以经历一种或多种组分和/或一种或多种条件以推动细胞粘附至所述生物反应器。可以在加载细胞之前将细胞培养基加载到所述系统中。
对于粘附细胞产生，细胞在每个纤维的内表面上附着和增殖。可以冲洗掉悬浮的细胞，从而留下粘附细胞产生以用于扩增。在特别的方面，自动化细胞进料和废物去除手段可以是所述系统的一部分。在至少一些情况下，可以提供从所述系统中的细胞/条件培养基的取样，不打断或打断所述过程。在特别的方面，在细胞扩增后，将粘附细胞从中空纤维壁释放到悬浮液中，并且收集包含细胞和从其分泌出的外来体的悬浮液。
图21A显现了可以在用于生成所希望的外来体的过程中使用的特定的开始步骤。在过程的一个实例中，第0天可以包括步骤1、2、3、4、5，或者前5个步骤的所有5个步骤。在这样的情况下，步骤1可以包括加载细胞扩增套件(Load Cell Expansion Set)步骤。在特别的方面，“加载细胞扩增套件”步骤是指将包含中空纤维生物反应器(细胞将会在那里生长)的一次性细胞扩增套件安装到细胞扩增系统上并且连接所有允许供应CO2(例如，5％)、培养基、空气的管线和用于废物的排出管线。在所述过程的步骤2期间，为“装填细胞扩增套件(Prime Cell Expansion Set)”步骤，其中通过入口和排出管线连接用没有Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)充满整个中空纤维系统，从而去除空气。
在步骤3至5期间，可以在加载细胞之前对所述生物反应器进行包覆，包括在所述系统的中空纤维内进行包覆。在一些情况下，在步骤3中，施加试剂，作为用于包覆生物反应器的步骤的一部分。在一些情况下，在施加试剂后，洗涤所述生物反应器(例如，用缓冲液，例如PBS)。在特别的情况下，在步骤3至5期间，用一种或多种化合物包覆所述生物反应器的毛细管内区室(例如，管道)的膜表面以促进在所述生物反应器中的细胞粘附。在特别的情况下，用人纤连蛋白(或任何细胞外基质型试剂，例如)包覆所述生物反应器的中空纤维以促进细胞粘附。在特别的情况下，所述纤连蛋白为来自例如人血浆的细胞外基质蛋白质(其可以商购获得)。
在一些方面，步骤6-8在第1天发生。在一些情况下，步骤6涉及IC和EC通路的洗净(并且可以需要所述系统的套件的运动，包括以中空纤维套件的-90、180和1度的移动)，和步骤7-8涉及将条件培养基添加至所述系统(并且可以具有所述系统的静止式套件)。在步骤6-8的每一个中，将IC培养基施加至EC入口，但是在一些情况下，在步骤6中，也将IC培养基施加至IC入口。在某些方面，IC培养基包含基础生长培养基来源、肝素、血小板裂解物和L-谷氨酰胺或相似化合物。在特别的方面，采用人血小板裂解物，因为它是对于胎牛血清的无异种的人同种异体替换，其包含几种对于细胞生长来说有用的生长因子(例如，表皮生长因子、血小板衍生生长因子、IL-6、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子或其组合)并且在冷冻/解冻循环后从人血液血小板获得。在特别的方面，IC培养基包含补充有2U/mL肝素、5％人血小板裂解物(hPLT)和2mM的GLUTAMAXTM的αMEM培养基。
图21B显示了在第1天中的其他步骤的例子，通过在第7天的至少一部分中的步骤，在用于外来体产生的过程的该例子中。步骤9-11涉及将细胞加载到所述系统中以在所述系统中产生均一的悬浮液。例如，在步骤9中，可以通过IC入口将细胞输入到所述系统中，随后为合适体积的IC培养基(步骤10)；在步骤11中，可以增加IC循环速率。在步骤9-11的每一个中，可以使扩增套件经历运动，例如以-90、180和1。在步骤12中，可以在停止摇摆器的运动并且允许静止条件以支持细胞在套件的中空纤维内进行粘附后，允许细胞附着。在特别的方面，步骤12包括将IC培养基输入至EC入口。
第2-5天可以分别包括所述过程的步骤13-16，其中允许细胞进行扩增，包括在静止情境下。通过IC入口来提供IC培养基，并且在特别的情况下，在步骤13-16的过程中逐渐提高IC入口速率。在特别的方面，在步骤13-17中不将IC培养基输入到EC入口中。在第6天时的步骤17包括洗涤步骤，例如用缓冲液例如PBS。
在特别的方面，图21C显示了跨越第7-15天的过程的步骤20-31的例子。在步骤20中，将无血小板的EC培养基输入到EC入口中，并且在随后的步骤21中，在将IC培养基输入到IC入口中后收获悬浮液。此后可以定期继续收获步骤，例如每天、每2天、每3天、每4天、每5天等。
一旦从所述过程中(包括在此类情况下，从所述系统中)收获细胞，就可以通过任何合适的手段来将外来体与上清液和细胞分开。在一些情况下，存在有多次从所述过程中的收获，并且可以汇集来自所述过程的上清液、细胞和外来体，之后进行任何进一步的分开或修饰步骤。在某些情况下，分开地处理来自多次收获的外来体，并且然后合并。
在一些方面，在产生过程后富集或浓缩外来体。作为一个例子，通过物理和/或化学手段来将外来体与细胞、细胞碎片和/或较大或较小的囊泡分开。在特别的情况下，通过一次或多次离心、一次或多次过滤(例如，超滤和/或渗滤)、一次或多次免疫分离、化学沉淀、大小排阻色谱法、微流控技术或其组合来浓缩外来体。不同的离心步骤可以在不同的速度下发生，和/或不同的过滤步骤可以在不同的大小下发生。
在一些方面，使用差速超离心从经培养的MSC的培养基中富集或浓缩外来体。在一些方面，差速超离心包括下列步骤：1)将上清液以2000x g离心20分钟，并且弃去包含细胞的粒状沉淀物；2)使用0.2μm过滤器来过滤上清液；3)将上清液以100000x g离心240分钟，并且获得包含外来体和细胞蛋白质的粒状沉淀物并且将其在PBS中进行洗涤；和4)将经PBS洗涤的包含外来体和细胞蛋白质的粒状沉淀物以100000x g离心70-180分钟，并且获得包含外来体的粒状沉淀物。
虽然在一些方面差速超离心提供了相当纯的外来体，但是通过使用蔗糖垫(cushion)来进行额外的纯化步骤。因此，在一些方面，使用差速超离心以及随后的通过蔗糖梯度的过滤从经培养的MSC的培养基中富集或浓缩外来体。使用蔗糖垫消除更多的污染物，例如与外来体非特异性地缔合的蛋白质，或者大的蛋白质聚集体，其通过离心而沉降但是不漂浮在蔗糖梯度上。因此，在一些方面，所记述的差速超离心步骤进一步包括下列步骤：5)将经部分纯化的外来体粒状沉淀物重悬浮在总PBS中；6)在离心管的底部处加载Tris/蔗糖/重水(D2O)溶液以制备垫；7)在不扰乱界面的情况下在蔗糖垫上方小心地添加经稀释的外来体，并且在4℃下以100,000x g离心75分钟；8)用配备有18-G针头的5-ml注射器，从管的侧面收集～3.5ml的Tris/蔗糖/D2O垫，其现在包含外来体；9)将外来体转移至新鲜的超离心管，用PBS进行稀释，并且在4℃下以100,000x g离心70分钟；和10)将粒状沉淀物重悬浮在PBS中。
可以立即或实质上立即使用外来体，并且可以在使用之前将它们进行储存，例如在-80℃下或在液氮中。
在一些方面，在进行任何种类的修饰之前浓缩外来体，而在另一些情况下，在浓缩之前修饰外来体。可以在产生过程后、在浓缩步骤后和/或在在该过程本身期间分析外来体。这样的分析包括鉴定一个或多个标志物，鉴定大小，测定浓度，测定一种或多种关于外来体的特殊活性(例如，迁移或免疫抑制，和/或抗-T细胞活性)，或其组合。
II.外来体的修饰
虽然在一些方面外来体由于从MSC(包括特别的MSC，例如来自脐带组织的)产生而包含一个或多个确定的特征或活性，但是可以进一步修饰外来体。在特别的情况下，外来体可以进一步进行修饰以拥有(携带)一种或多种治疗试剂。在一些情况下，修饰(例如，转染、转导、电穿孔等)MSC，并且通过经修饰的MSC来生成经修饰的外来体。在一些情况下，修饰(例如，转染、转导、电穿孔等)外来体本身。
外来体的修饰可以通过本领域中的任何合适方法来进行，但是在特别的情况下，通过载体、电穿孔、转染(使用阳离子脂质体转染试剂)或其组合用一种或多种治疗试剂对外来体进行加载。另外或备选地，在一些方面，通过本领域中的任何合适方法来修饰MSC，但是在特别的情况下，通过载体、电穿孔、转染(使用阳离子脂质体转染试剂)或其组合用一种或多种治疗试剂对MSC进行加载，并且从经修饰的MSC生成包含所述一种或多种治疗试剂的外来体。
在特别的方面，加载到外来体中的治疗试剂相关于MSC来说是外源的。可以通过许多不同技术来将它们引入到外来体中。在本公开内容的特别方面，通过电穿孔或使用转染试剂来对外来体进行加载。
在特别的方面，所述外来体具有特定的大小，从而其大小决定它们可以携带的治疗试剂的类型。在特别的情况下，所述外来体的大小为30-400nm，包括30-350、30-300、30-250、30-200、30-150、30-100、30-50、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-100、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200、200-400、200-350、200-300、200-250、250-400、250-350、250-300、300-400、300-350或350-400nm，或者其中可导出的任何范围或值。在一些方面，所述外来体的大小为至少、至多或大约30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、100nm、101nm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、110nm、111nm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、118nm、119nm、120nm、121nm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、131nm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm、139nm、140nm、141nm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、151nm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、171nm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、181nm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm、190nm、191nm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、291nm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、301nm、302nm、303nm、304nm、305nm、306nm、307nm、308nm、309nm、310nm、311nm、312nm、313nm、314nm、315nm、316nm、317nm、318nm、319nm、320nm、321nm、322nm、323nm、324nm、325nm、326nm、327nm、328nm、329nm、330nm、331nm、332nm、333nm、334nm、335nm、336nm、337nm、338nm、339nm、340nm、341nm、342nm、343nm、344nm、345nm、346nm、347nm、348nm、349nm、350nm、351nm、352nm、353nm、354nm、355nm、356nm、357nm、358nm、359nm、360nm、361nm、362nm、363nm、364nm、365nm、366nm、367nm、368nm、369nm、370nm、371nm、372nm、373nm、374nm、375nm、376nm、377nm、378nm、379nm、380nm、381nm、382nm、383nm、384nm、385nm、386nm、387nm、388nm、389nm、390nm、391nm、392nm、393nm、394nm、395nm、396nm、397nm、398nm、399nm或400nm。
A.外来体加载
在一些情况下，通过下述方式来修饰外来体：通过例如载体、电穿孔、使用阳离子脂质体转染试剂的转染或其组合，用一种或多种治疗试剂对MSC或外来体进行加载。
1.载体
在一个方面，可以通过用表达治疗试剂的核酸构建体转化或转染MSC来对外来体进行加载，从而当从细胞产生外来体时，所述治疗试剂存在于所述外来体中。
在另一个方面，也可以通过用表达治疗试剂的核酸构建体直接转化或转染外来体来对外来体进行加载。
在一些方面，所述编码治疗试剂的核酸构建体包含在载体中。在一些情况下，将所述编码治疗试剂的核酸构建体连接至启动子并且掺入到表达载体中，后者被细胞吸收并且表达。所述载体可以适合于在真核生物中进行复制，和在一些情况下整合。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、起始序列和启动子，其对于调控所希望的核酸序列的表达来说是有用的。例如，可以将所述核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。通常，合适的载体包含在至少一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择标记(参见例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。在一些方面，合适的载体能够穿过血脑屏障。
在某些方面，可以将所述表达载体以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域中众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人,(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。作为载体有用的病毒包括但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒(包括自失活慢病毒载体)。例如，腺病毒提供了方便的用于基因递送系统的平台。可以通过使用本领域中已知的技术来将所选择的基因插入到载体中并且包装到逆转录病毒颗粒中。然后，分离出重组病毒，并且在体内或离体将其递送至受试者的细胞。因此，在一些方面，使用重组载体例如病毒载体(包括例如慢病毒、逆转录病毒、γ-逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒)来将编码多肽序列的核酸引入到细胞中。
载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者向所靶向的细胞提供有益特性的其他组分或功能性。这样的其他组分包括例如，影响结合或靶向至细胞的组分(包括介导细胞类型的或组织特异性的结合的组分)；影响载体核酸被细胞摄取的组分；影响在摄取后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如，介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸的表达的组分。
此类组分也可以包括标记，例如可检测标记和/或选择标记，其可以用于检测或选择已吸收和正表达由所述载体所递送的核酸的细胞。此类组分可以被提供为所述载体的天然特征(例如，使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能性的病毒载体)，或者可以修饰载体以提供此类功能性。各种各样的此类载体是本领域中已知的，并且通常是可得的。当在宿主细胞中维持载体时，所述载体可以在有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定地复制，掺入到宿主细胞的基因组内，或者维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
被包括在载体中的真核表达盒特别地包含(以5′至3′方向)调控元件(包括与蛋白质编码序列可操作地相连接的真核转录启动子)，剪接信号(包括间插序列)，转录终止/多腺苷酸化序列，翻译后调控元件，和复制起点。
2.电穿孔
在本公开内容的特别方面，通过电穿孔来对MSC和/或外来体进行加载。如在本文中所使用的，“电穿孔”是指施加电流或电场以推动目的试剂进入细胞、外来体或其衍生物。本领域技术人员将会理解，本公开内容考虑了任何电穿孔方法和技术。在一些方面，可以控制电穿孔系统以产生电流，并且驱使它通过包含细胞或外来体的溶液。在一些方面，使用静态电穿孔仪器。在一些方面，使用流式电穿孔仪器。在特别的方面，以在本文中所描述的参数来使用静态或流式电穿孔。
电穿孔的过程通常牵涉通过跨越包含细胞或外来体的液体细胞悬浮液施加电场脉冲来在细胞膜中或在外来体中形成孔。所述脉冲诱导跨膜电势，其引起细胞膜的不可逆的击穿。该作用导致细胞膜的渗透或“孔形成”，这允许将治疗试剂引入到细胞或外来体中。
在电穿孔过程期间，经常将细胞或外来体悬浮在液体介质中，然后使其经历电场脉冲。所述介质可以是电解质、非电解质或者电解质和非电解质的混合物。
电穿孔过程的结果在很大程度上受所施加的电场(EF)脉冲的幅度和脉冲的持续时间控制。将场强测量为跨越电极间隙递送的电压，并且可以表达为kV/cm。场强对于超越细胞膜的电势以允许暂时的可逆渗透或孔形成在细胞膜中发生来说是关键性的，并且本公开内容的方法能够使细胞经历一系列的电场强度。场强是数个因素(包括所施加的电脉冲的电压幅度，电脉冲的持续时间，和正进行电穿孔的样品的电导率)的函数。
样品的电导率是包括电穿孔缓冲液的离子组成、待加载的试剂的浓度、细胞或外来体密度、温度和压力的参数的函数。电穿孔缓冲液的离子强度对于样品的电阻具有直接影响，而后者影响脉冲的脉冲长度或时间常数。试剂的大小和浓度将会对于用于转染细胞的电参数具有影响。较小的分子(例如，siRNA或miRNA)可能需要较高电压连同微秒脉冲长度，而较大的分子(例如，DNA和蛋白质)可能需要较低电压连同较长脉冲长度。细胞或外来体密度可以与细胞大小相关。通常，较小的细胞或外来体大小需要较高的电压，而较大的细胞或外来体大小需要较低的电压，以为了成功的细胞膜渗透。
脉冲持续时间或脉冲长度是样品暴露于电脉冲的持续时间，并且典型地测量为在微秒至毫秒范围中的时间。脉冲长度间接地与场强一起工作以增加孔形成和因此靶分子的摄取。通常，电压的增加随后应当为脉冲长度的逐渐减小。降低电压，情况则相反。除了脉冲持续时间外，也可以通过脉冲数目、脉冲宽度、脉冲形状、脉冲模式和脉冲极性来表征电脉冲。因此，在一些方面，第一和第二电脉冲进一步包含从由下列各项组成的组中选择的特征：脉冲数目、宽度、形状、模式和极性。电穿孔可以如在本文中所公开的那样作为单个脉冲或作为多个脉冲来进行，以取得最大转染效率。脉冲模式可以包括单个脉冲或多个脉冲，并且多个脉冲的组合持续时间相应于脉冲持续时间。脉冲极性可以是正的或负的。脉冲宽度取决于由电穿孔系统的脉冲发生器所生成的波形。脉冲形状或波形通常落入两个类别(方波或指数衰减波)中。方波脉冲快速上升至设定的电压水平，并且在快速关闭之前在设定的脉冲长度的持续时间期间保持该水平。指数衰减波通过允许电容器完全放电来生成电脉冲。脉冲被释放到样品中，并且电压迅速上升至峰电压设定，然后随时间下降。在指数衰减波系统中的脉冲宽度相应于时间常数，并且以脉冲能量或电压衰减至原始设定电压的1/3所采取的速率为特征。通过调整在指数衰减中的电阻和电容值来修改时间常数，并且关于该时间的计算为T＝RC，其中T为时间，R为样品的电阻，和C为电穿孔系统电源供应的电容。因此，在一些方面，指数衰减的速率是样品的电阻和用于施行电穿孔的电源供应的电容的函数。
施加至悬浮液的电场的强度和脉冲的长度(向细胞悬浮液施加电场的时间)根据细胞或外来体类型而变化。为了在细胞或外来体的外膜中创建孔，必须以这样的时间长度和这样的电压施加电场，从而增加膜的渗透性以允许治疗试剂进入细胞或外来体。只要脉冲幅度在某个阈值水平以上，脉冲的幅度或持续时间的增加通常导致治疗试剂在细胞或外来体内部的更大积累。
施加至细胞悬浮液的每个电脉冲以一定量的能量为特征，所述能量等于在电极上的电压、通过缓冲液的电流和高压脉冲的持续时间的乘积。
可以调整电穿孔参数以优化所施加的电场的强度和/或暴露持续时间，从而通过电脉冲在膜中形成的孔在一段短时间段后再封闭，在所述短时间段期间治疗试剂有机会进入细胞或外来体。
电穿孔条件可以依赖于治疗试剂的电荷和大小而变化。典型的场强在20至1000V/cm或kV/cm的范围内，例如20至100V/cm或kV/cm。在一些方面，场强为0.01至10，0.01至1，0.1至10，0.1至1，或1至10V/cm或kV/cm，或者来自0.01至10V/cm或kV/cm或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，场强为至少、至多或大约20V/cm、30V/cm、40V/cm、50V/cm、60V/cm、70V/cm、80V/cm、90V/cm、100V/cm、110V/cm、120V/cm、130V/cm、140V/cm、150V/cm、160V/cm、170V/cm、180V/cm、190V/cm、200V/cm、210V/cm、220V/cm、230V/cm、240V/cm、250V/cm、260V/cm、270V/cm、280V/cm、290V/cm、300V/cm、310V/cm、320V/cm、330V/cm、340V/cm、350V/cm、360V/cm、370V/cm、380V/cm、390V/cm、400V/cm、410V/cm、420V/cm、430V/cm、440V/cm、450V/cm、460V/cm、470V/cm、480V/cm、490V/cm、500V/cm、510V/cm、520V/cm、530V/cm、540V/cm、550V/cm、560V/cm、570V/cm、580V/cm、590V/cm、600V/cm、610V/cm、620V/cm、630V/cm、640V/cm、650V/cm、660V/cm、670V/cm、680V/cm、690V/cm、700V/cm、710V/cm、720V/cm、730V/cm、740V/cm、750V/cm、760V/cm、770V/cm、780V/cm、790V/cm、800V/cm、810V/cm、820V/cm、830V/cm、840V/cm、850V/cm、860V/cm、870V/cm、880V/cm、890V/cm、900V/cm、910V/cm、920V/cm、930V/cm、940V/cm、950V/cm、960V/cm、970V/cm、980V/cm、990V/cm、1000V/cm或者其中可导出的任何范围或值。
场强是数个因素(包括所施加的电脉冲的电压幅度，电脉冲的持续时间，和正进行电穿孔的样品的电导率)的函数。
在150mV或V至250mV或V的范围中的电压，特别是200mV或V的电压可以用于用根据本公开内容的治疗试剂对外来体进行加载。在一些方面，电脉冲的电压幅度为至多或至少大约0.001至10,000，0.01至10,000，0.1至10,000，1至10,000，1至9,000，1至8,000，1至7,000，1至6,000，1至5,000，1至4,000，1至3,000，1至2,000，或1至1,000mV或V，或者来自0.001至10,000mV或V或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，电脉冲的电压幅度是在0.001和10,000，0.01和10,000，0.1和10,000，1和10,000，1和9,000，1和8,000，1和7,000，1和6,000，1和5,000，1和4,000，1和3,000，1和2,000，或1和1,000mV或V之间，或者来自0.001至10,000mV或V或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，电脉冲的电压幅度可以为、为大约、为至少或为至多0.001、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.100、0.110、0.120、0.130、0.140、0.150、0.160、0.170、0.180、0.190、0.200、0.210、0.220、0.230、0.240、0.250、0.260、0.270、0.280、0.290、0.300、0.310、0.320、0.330、0.340、0.350、0.360、0.370、0.380、0.390、0.400、0.410、0.420、0.430、0.440、0.450、0.460、0.470、0.480、0.490、0.500、0.510、0.520、0.530、0.540、0.550、0.560、0.570、0.580、0.590、0.600、0.610、0.620、0.630、0.640、0.650、0.660、0.670、0.680、0.690、0.700、0.710、0.720、0.730、0.740、0.750、0.760、0.770、0.780、0.790、0.800、0.810、0.820、0.830、0.840、0.850、0.860、0.870、0.880、0.890、0.900、0.910、0.920、0.930、0.940、0.950、0.960、0.970、0.980、0.990、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900或10000毫伏特或伏特，或者其中可导出的任何范围或值。
在一些方面，样品的电导率是包括电穿孔缓冲液的离子组成、待加载到细胞中的试剂的浓度、细胞密度、温度和压力的参数的函数。在一些方面，样品的电导率可以为、为至少或为至多0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10西门子/米，或者其中可导出的任何范围或值。在一些方面，样品的电导率为至多或至少大约0.01西门子/米至10西门子/米，0.01西门子/米至1西门子/米，0.1西门子/米至10西门子/米，0.1西门子/米至1西门子/米，1西门子/米至10西门子/米，或者来自0.01西门子/米至10西门子/米或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，样品的电导率是在0.01西门子/米和10西门子/米，0.01西门子/米和1西门子/米，0.1西门子/米和10西门子/米，0.1西门子/米和1西门子/米，1西门子/米和10西门子/米之间，或者来自0.01西门子/米至10西门子/米或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，样品的电导率是在1.0和3.0西门子/米之间，来自1.0西门子/米至3.0西门子/米的任何值，或者其中可导出的任何范围或值。
用于电穿孔的缓冲液的离子组成可以依赖于细胞类型而变化。例如，可以使用高度导电的缓冲液例如PBS(磷酸盐缓冲盐水<30欧姆)和HBSS(Hepes缓冲液<30欧姆)或标准培养基，其可以包含血清。其他缓冲液包括低渗性缓冲液，在其中细胞在电脉冲之前不久吸收水，这可以导致细胞膨胀，并且可以降低最佳渗透电压而同时确保膜是更容易可渗透的。需要使用高电阻缓冲液(>3000欧姆)的细胞可能需要制备和洗涤细胞以去除过量的盐离子，以减少形成电弧的机会和样品损失。电穿孔缓冲液的离子强度对于样品的电阻具有直接影响，而后者影响脉冲的脉冲长度或时间常数。对于离子溶液来说，与电极相接触的液体的体积对于样品电阻也具有显著影响，并且样品的电阻与溶液的体积和pH成反比。当体积增加时，电阻减小，这增加了形成电弧和样品损失的可能性，而降低体积增加电阻并且降低电弧电势。
试剂的大小和浓度将会对于用于转染细胞的电参数具有影响。较小的分子(例如，siRNA或miRNA)可能需要较高电压连同微秒脉冲长度，而较大的分子(例如，DNA和蛋白质)可能需要较低电压连同较长脉冲长度。治疗试剂的浓度可以为、可以为至少、可以为至多或可以为大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、75、100、150、200、250、300至大约350、400、500、1000、1500、2000、3000、4000或5000μg/mL、mg/mL或g/mL，或者来自0.01至5000μg/mL、mg/mL或g/mL或其中可导出的范围的任何值。在进一步的方面，治疗试剂的浓度为至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、125、150、175、200、225、250、275或300μg/mL、mg/mL或g/mL，或者来自1至300μg/mL、mg/mL或g/mL或其中可导出的范围的任何值。在某些方面，治疗试剂的浓度为至少1μg/mL、mg/mL或g/mL。在一些方面，治疗试剂的浓度是在1μg/mL和200μg/mL之间，例如在5μg/mL和100μg/mL之间，来自5μg/mL至100μg/mL的任何值，或者其中可导出的任何范围。
细胞密度可以与细胞大小相关。通常，较小的细胞大小需要较高的电压，而较大的细胞大小需要较低的电压，以为了成功的细胞膜渗透。
在电穿孔期间维持细胞所处的温度可以影响电穿孔的效率。在高电压下进行脉冲或者暴露于多个脉冲和长脉冲持续时间的样品可以引起样品加热，这可以有助于增加的细胞死亡和更低的转染效率。将样品保持在较低温度下可以减少过热对于细胞生存力和效率的影响。通常，对于在4℃下进行电穿孔，在室温下用于细胞的标准脉冲电压应当大约加倍，以便有效地渗透细胞膜。
脉冲宽度取决于由电穿孔系统的脉冲发生器所生成的波形。脉冲形状或波形通常落入两个类别(方波或指数衰减波)中。方波脉冲快速上升至设定的电压水平，并且在快速关闭之前在设定的脉冲长度的持续时间期间保持该水平。在一些方面，脉冲发生器生成方波脉冲，并且可以直接输入脉冲宽度。指数衰减波通过允许电容器完全放电来生成电脉冲。脉冲被释放到样品中，并且电压迅速上升至峰电压设定，然后随时间下降。在一些方面，脉冲发生器生成指数衰减波脉冲，并且脉冲宽度是指数衰减的速率的函数。
在指数衰减波系统中的脉冲宽度相应于时间常数，并且以脉冲能量或电压衰减至原始设定电压的1/3所采取的速率为特征。通过调整在指数衰减中的电阻和电容值来修改时间常数，并且关于该时间的计算为T＝RC，其中T为时间，R为样品的电阻，和C为电穿孔系统电源供应的电容。因此，在一些方面，指数衰减的速率是样品的电阻和用于施行电穿孔的电源供应的电容的函数。
样品的电阻可以为、可以为至少或可以为至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900或10000欧姆，或者其中可导出的任何范围或值。样品的电阻可以为至多或至少1欧姆至10000欧姆，1欧姆至9000欧姆，1欧姆至8000欧姆，1欧姆至7000欧姆，1欧姆至6000欧姆，1欧姆至5000欧姆，1欧姆至4000欧姆，1欧姆至3000欧姆，1欧姆至2000欧姆，1欧姆至1000欧姆，1欧姆至900欧姆，1欧姆至800欧姆，1欧姆至700欧姆，1欧姆至600欧姆，1欧姆至500欧姆，1欧姆至400欧姆，1欧姆至300欧姆，1欧姆至200欧姆，1欧姆至100欧姆，1欧姆至90欧姆，1欧姆至80欧姆，1欧姆至70欧姆，1欧姆至60欧姆，1欧姆至50欧姆，1欧姆至40欧姆，1欧姆至30欧姆，1欧姆至20欧姆，1欧姆至10欧姆，或者来自1欧姆至10000欧姆或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，样品的电阻是在1欧姆和10000欧姆，1欧姆和9000欧姆，1欧姆和8000欧姆，1欧姆和7000欧姆，1欧姆和6000欧姆，1欧姆和5000欧姆，1欧姆和4000欧姆，1欧姆和3000欧姆，1欧姆和2000欧姆，1欧姆和1000欧姆，1欧姆和900欧姆，1欧姆和800欧姆，1欧姆和700欧姆，1欧姆和600欧姆，1欧姆和500欧姆，1欧姆和400欧姆，1欧姆和300欧姆，1欧姆和200欧姆，1欧姆和100欧姆，1欧姆和90欧姆，1欧姆和80欧姆，1欧姆和70欧姆，1欧姆和60欧姆，1欧姆和50欧姆，1欧姆和40欧姆，1欧姆和30欧姆，1欧姆和20欧姆，1欧姆和10欧姆之间，或者来自1欧姆至10000欧姆或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，样品的电阻是在1欧姆和1000欧姆之间，来自1欧姆至1000欧姆的任何值，或者其中可导出的任何范围。
电源供应电容可以为至多或至少1μF至1,000μF，1μF至100μF，或者来自1μF至1,000μF或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，电源供应电容是在1μF和1,000μF，1μF和100μF之间，或者来自1μF至1,000μF或其中可导出的范围的任何值。在一些方面，电源供应电容是在25μF和250μF之间，例如在25μF和125μF之间，来自25μF至250μF的任何值，或者其中可导出的任何范围。电源供应电容可以为、可以为至少或可以为至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000、40000、41000、42000、43000、44000、45000、46000、47000、48000、49000、50000、51000、52000、53000、54000、55000、56000、57000、58000、59000、60000、61000、62000、63000、64000、65000、66000、67000、68000、69000、70000、71000、72000、73000、74000、75000、76000、77000、78000、79000、80000、81000、82000、83000、84000、85000、86000、87000、88000、89000、90000、91000、92000、93000、94000、95000、96000、97000、98000、99000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000、700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000、800000、810000、820000、830000、840000、850000、860000、870000、880000、890000、900000、910000、920000、930000、940000、950000、960000、970000、980000、990000或1000000μF,或者其中可导出的任何范围或值。
所述治疗试剂可以为蛋白质和肽(合成的、天然的和模拟的，包括抗体或其片段)、寡核苷酸(反义寡核苷酸、核酶等)、小于大约1000个核苷酸的短核酸序列(例如，双链有义线性DNA、抑制性RNA、siRNA、miRNA、抗-miRNA、shRNA、表达载体等)、核糖核蛋白、载体、小分子、脂质、碳水化合物、细胞因子、血液治疗试剂、抗癌药物、抗炎药物、抗真菌药物、抗病毒药物、抗微生物药物、血栓调节试剂、免疫调节试剂等。
在某些方面，所述治疗试剂为miRNA，并且miRNA的浓度是在1μg/mL和200μg/mL之间，例如在5μg/mL和100μg/mL之间，来自5μg/mL至100μg/mL的任何值，或者其中可导出的任何范围。
在某些方面，所述治疗试剂为siRNA、shRNA和/或RNA，并且siRNA、shRNA和/或RNA的浓度是在1μg/mL和200μg/mL之间，例如在10μg/mL和50μg/mL之间，来自10μg/mL至50μg/mL的任何值，或者其中可导出的任何范围。在某些方面，所述治疗试剂为siRNA、shRNA和/或RNA，并且siRNA、shRNA和/或RNA的浓度为至少、至多或恰好1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL、20μg/mL、21μg/mL、22μg/mL、23μg/mL、24μg/mL、25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL、30μg/mL、31μg/mL、32μg/mL、33μg/mL、34μg/mL、35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL、45μg/mL、46μg/mL、47μg/mL、48μg/mL、49μg/mL、50μg/mL、51μg/mL、52μg/mL、53μg/mL、54μg/mL、55μg/mL、56μg/mL、57μg/mL、58μg/mL、59μg/mL、60μg/mL、61μg/mL、62μg/mL、63μg/mL、64μg/mL、65μg/mL、66μg/mL、67μg/mL、68μg/mL、69μg/mL、70μg/mL、71μg/mL、72μg/mL、73μg/mL、74μg/mL、75μg/mL、76μg/mL、77μg/mL、78μg/mL、79μg/mL、80μg/mL、81μg/mL、82μg/mL、83μg/mL、84μg/mL、85μg/mL、86μg/mL、87μg/mL、88μg/mL、89μg/mL、90μg/mL、91μg/mL、92μg/mL、93μg/mL、94μg/mL、95μg/mL、96μg/mL、97μg/mL、98μg/mL、99μg/mL、100μg/mL、101μg/mL、102μg/mL、103μg/mL、104μg/mL、105μg/mL、106μg/mL、107μg/mL、108μg/mL、109μg/mL、110μg/mL、111μg/mL、112μg/mL、113μg/mL、114μg/mL、115μg/mL、116μg/mL、117μg/mL、118μg/mL、119μg/mL、120μg/mL、121μg/mL、122μg/mL、123μg/mL、124μg/mL、125μg/mL、126μg/mL、127μg/mL、128μg/mL、129μg/mL、130μg/mL、131μg/mL、132μg/mL、133μg/mL、134μg/mL、135μg/mL、136μg/mL、137μg/mL、138μg/mL、139μg/mL、140μg/mL、141μg/mL、142μg/mL、143μg/mL、144μg/mL、145μg/mL、146μg/mL、147μg/mL、148μg/mL、149μg/mL、150μg/mL、151μg/mL、152μg/mL、153μg/mL、154μg/mL、155μg/mL、156μg/mL、157μg/mL、158μg/mL、159μg/mL、160μg/mL、161μg/mL、162μg/mL、163μg/mL、164μg/mL、165μg/mL、166μg/mL、167μg/mL、168μg/mL、169μg/mL、170μg/mL、171μg/mL、172μg/mL、173μg/mL、174μg/mL、175μg/mL、176μg/mL、177μg/mL、178μg/mL、179μg/mL、180μg/mL、181μg/mL、182μg/mL、183μg/mL、184μg/mL、185μg/mL、186μg/mL、187μg/mL、188μg/mL、189μg/mL、190μg/mL、191μg/mL、192μg/mL、193μg/mL、194μg/mL、195μg/mL、196μg/mL、197μg/mL、198μg/mL、199μg/mL、200μg/mL或者其中可导出的任何范围或值。
在某些方面，所述治疗试剂为DNA，所述DNA为至少、至多或大约1000个碱基对，并且DNA的浓度是在1μg/mL和200μg/mL之间，例如在10μg/mL和100μg/mL之间，来自10μg/mL至100μg/mL的任何值，或者其中可导出的任何范围。在某些方面，所述治疗试剂为DNA，所述DNA为至少、至多或大约1000个碱基对，并且DNA的浓度为至少、至多或恰好1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL、20μg/mL、21μg/mL、22μg/mL、23μg/mL、24μg/mL、25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL、30μg/mL、31μg/mL、32μg/mL、33μg/mL、34μg/mL、35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL、45μg/mL、46μg/mL、47μg/mL、48μg/mL、49μg/mL、50μg/mL、51μg/mL、52μg/mL、53μg/mL、54μg/mL、55μg/mL、56μg/mL、57μg/mL、58μg/mL、59μg/mL、60μg/mL、61μg/mL、62μg/mL、63μg/mL、64μg/mL、65μg/mL、66μg/mL、67μg/mL、68μg/mL、69μg/mL、70μg/mL、71μg/mL、72μg/mL、73μg/mL、74μg/mL、75μg/mL、76μg/mL、77μg/mL、78μg/mL、79μg/mL、80μg/mL、81μg/mL、82μg/mL、83μg/mL、84μg/mL、85μg/mL、86μg/mL、87μg/mL、88μg/mL、89μg/mL、90μg/mL、91μg/mL、92μg/mL、93μg/mL、94μg/mL、95μg/mL、96μg/mL、97μg/mL、98μg/mL、99μg/mL、100μg/mL、101μg/mL、102μg/mL、103μg/mL、104μg/mL、105μg/mL、106μg/mL、107μg/mL、108μg/mL、109μg/mL、110μg/mL、111μg/mL、112μg/mL、113μg/mL、114μg/mL、115μg/mL、116μg/mL、117μg/mL、118μg/mL、119μg/mL、120μg/mL、121μg/mL、122μg/mL、123μg/mL、124μg/mL、125μg/mL、126μg/mL、127μg/mL、128μg/mL、129μg/mL、130μg/mL、131μg/mL、132μg/mL、133μg/mL、134μg/mL、135μg/mL、136μg/mL、137μg/mL、138μg/mL、139μg/mL、140μg/mL、141μg/mL、142μg/mL、143μg/mL、144μg/mL、145μg/mL、146μg/mL、147μg/mL、148μg/mL、149μg/mL、150μg/mL、151μg/mL、152μg/mL、153μg/mL、154μg/mL、155μg/mL、156μg/mL、157μg/mL、158μg/mL、159μg/mL、160μg/mL、161μg/mL、162μg/mL、163μg/mL、164μg/mL、165μg/mL、166μg/mL、167μg/mL、168μg/mL、169μg/mL、170μg/mL、171μg/mL、172μg/mL、173μg/mL、174μg/mL、175μg/mL、176μg/mL、177μg/mL、178μg/mL、179μg/mL、180μg/mL、181μg/mL、182μg/mL、183μg/mL、184μg/mL、185μg/mL、186μg/mL、187μg/mL、188μg/mL、189μg/mL、190μg/mL、191μg/mL、192μg/mL、193μg/mL、194μg/mL、195μg/mL、196μg/mL、197μg/mL、198μg/mL、199μg/mL、200μg/mL或者其中可导出的任何范围或值。
在某些方面，所述治疗试剂为蛋白质、肽、脂质和/或药物，所述蛋白质、肽、脂质，并且蛋白质、肽、脂质和/或药物的浓度是在1μg/mL和1000mg/mL之间，例如在100μg/mL和3mg/mL之间，来自100μg/mL至3mg/mL的任何值，或者其中可导出的任何范围。在某些方面，所述治疗试剂为蛋白质、肽、脂质和/或药物，所述蛋白质、肽、脂质，并且蛋白质、肽、脂质和/或药物的浓度为1μg/mL或mg/mL，10μg/mL或mg/mL，20μg/mL或mg/mL，30μg/mL或mg/mL，40μg/mL或mg/mL，50μg/mL或mg/mL，60μg/mL或mg/mL，70μg/mL或mg/mL，80μg/mL或mg/mL，90μg/mL或mg/mL，100μg/mL或mg/mL，110μg/mL或mg/mL，120μg/mL或mg/mL，130μg/mL或mg/mL，140μg/mL或mg/mL，150μg/mL或mg/mL，160μg/mL或mg/mL，170μg/mL或mg/mL，180μg/mL或mg/mL，190μg/mL或mg/mL，200μg/mL或mg/mL，210μg/mL或mg/mL，220μg/mL或mg/mL，230μg/mL或mg/mL，240μg/mL或mg/mL，250μg/mL或mg/mL，260μg/mL或mg/mL，270μg/mL或mg/mL，280μg/mL或mg/mL，290μg/mL或mg/mL，300μg/mL或mg/mL，310μg/mL或mg/mL，320μg/mL或mg/mL，330μg/mL或mg/mL，340μg/mL或mg/mL，350μg/mL或mg/mL，360μg/mL或mg/mL，370μg/mL或mg/mL，380μg/mL或mg/mL，390μg/mL或mg/mL，400μg/mL或mg/mL，410μg/mL或mg/mL，420μg/mL或mg/mL，430μg/mL或mg/mL，440μg/mL或mg/mL，450μg/mL或mg/mL，460μg/mL或mg/mL，470μg/mL或mg/mL，480μg/mL或mg/mL，490μg/mL或mg/mL，500μg/mL或mg/mL，510μg/mL或mg/mL，520μg/mL或mg/mL，530μg/mL或mg/mL，540μg/mL或mg/mL，550μg/mL或mg/mL，560μg/mL或mg/mL，570μg/mL或mg/mL，580μg/mL或mg/mL，590μg/mL或mg/mL，600μg/mL或mg/mL，610μg/mL或mg/mL，620μg/mL或mg/mL，630μg/mL或mg/mL，640μg/mL或mg/mL，650μg/mL或mg/mL，660μg/mL或mg/mL，670μg/mL或mg/mL，680μg/mL或mg/mL，690μg/mL或mg/mL，700μg/mL或mg/mL，710μg/mL或mg/mL，720μg/mL或mg/mL，730μg/mL或mg/mL，740μg/mL或mg/mL，750μg/mL或mg/mL，760μg/mL或mg/mL，770μg/mL或mg/mL，780μg/mL或mg/mL，790μg/mL或mg/mL，800μg/mL或mg/mL，810μg/mL或mg/mL，820μg/mL或mg/mL，830μg/mL或mg/mL，840μg/mL或mg/mL，850μg/mL或mg/mL，860μg/mL或mg/mL，870μg/mL或mg/mL，880μg/mL或mg/mL，890μg/mL或mg/mL，900μg/mL或mg/mL，910μg/mL或mg/mL，920μg/mL或mg/mL，930μg/mL或mg/mL，940μg/mL或mg/mL，950μg/mL或mg/mL，960μg/mL或mg/mL，970μg/mL或mg/mL，980μg/mL或mg/mL，990μg/mL或mg/mL，1000μg/mL或mg/mL，或者其中可导出的任何范围或值。
在特别的方面，用于电穿孔脉冲的参数包括在100至240VAC之间的功率，具有在50至60Hz之间的频率和大约1500V的电压，以100A为限。
在一些方面，所有用于电穿孔的组分(包括但不限于，缓冲液、外来体和杯皿或电极)应当保持在至少大约4℃下。在一些方面，电穿孔脉冲在至少大约25℃下进行，并且在电穿孔后，例如在电穿孔后立即，将经电穿孔的外来体放置在至少大约4℃下。
电穿孔能够取得大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％(或者其中可导出的任何范围或值)的向细胞或外来体中的治疗试剂的加载或转染效率。在一些方面，治疗试剂的加载效率为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。转染效率可以通过下述方式来进行测量：通过表达所述基因的产物的细胞的百分比或者由所述基因所表达的产物的分泌水平，或者通过使用例如实时定量PCR(RT-qPCR)或相似的定量分析直接测量在外来体中所述治疗试剂的浓度。
3.转染
在本公开内容的特别方面，通过使用转染试剂来对所述MSC和/或外来体进行加载。特别的用于根据本公开内容的用途的转染试剂包括阳离子脂质和/或脂质体。
考虑使用脂质制剂来将所述治疗试剂引入到MSC和/或外来体中。在另一个方面，所述治疗试剂可以与脂质相缔合。可以将与脂质相缔合的治疗试剂包囊在脂质体的水性内部中，散置在脂质体的脂双层内，经由与脂质体和寡核苷酸都相缔合的连接分子附接至脂质体，包载在脂质体中，与脂质体相复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质相混合，与脂质相组合，作为悬浮液包含在脂质中，用胶束包含或与胶束相复合，或者与脂质相缔合。
脂质-、脂质/DNA-、脂质/表达载体-或者脂质/治疗试剂-缔合的组合物并不局限于任何在溶液中的特殊结构。例如，它们可以以下述方式存在：在双层结构中，作为胶束，或具有“塌陷的”结构。它们也可以简单地散置在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为可以天然出现或合成的脂质的脂肪物质。例如，脂质包括在细胞质中天然出现的脂肪小滴，以及这样的化合物类别，其包含长链脂肪族烃类及其衍生物，例如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类。
在某一个方面，可以将所述治疗试剂包载在脂质复合物例如脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有多个被水性介质分开的脂质层。当将磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在封闭的结构形成前经历自重排，并且将水和溶解的溶质包载在脂双层之间(Ghosh和Bachhawat,1991)。所使用的脂质体的量可以根据脂质体以及待被转染的实体的性质而变化，例如可以考虑大约5至大约20μg载体DNA/1至1×107个细胞。
由脂质体介导的治疗试剂递送和在体外治疗试剂的表达已是非常成功的(Nicolau和Sene,1982；Fraley等人,1979；Nicolau等人,1987)。还已证明了在培养的鸡胚、HeLa细胞和肝癌细胞中治疗试剂的由脂质体介导的递送和表达的可行性(Wong等人,1980)。在某些方面，可以将脂质体与血凝病毒(HVJ)相复合。这已显示出推动细胞膜的融合并且促进经脂质体包囊的DNA的细胞进入(Kaneda等人,1989)。在另一些方面，可以将脂质体与核内非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)相复合或与之相联合地进行使用(Kato等人,1991)。在另外一些方面，可以将脂质体与HVJ和HMG-1两者相复合或与之相联合地进行使用。在另一些方面，递送载料可以包含配体和脂质体。
在各种方面，适合于使用的脂质可以从商业来源获得。例如，可以从ThermoFisher Scientific,Waltham,Mass.获得lipofectamine；可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)；可以从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得二鲸蜡醇磷酸酯(“DCP”)；可以从Calbiochem-Behring获得胆固醇(“Choi”)；可以从Avanti PolarLipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质。可以将在氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液储存于大约-20℃。氯仿可以用作唯一溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括各种各样的通过生成封闭的脂双层或聚集体而形成的单层和多层脂质载料。脂质体可以被表征为具有有着磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有多个被水性介质分开的脂质层。当将磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在封闭的结构形成前经历自重排，并且将水和溶解的溶质包载在脂双层之间(Ghosh等人,(1991)Glycobiology 5:505-510)。然而，还包括了具有不同于正常的囊泡结构的在溶液中的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构，或者仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
B.治疗试剂
在特别的方面，所述外来体能够用任何类型的治疗试剂来进行加载。合适的治疗试剂的例子包括有生物活性的材料。特别适合掺入到外来体中的有生物活性的材料包括但不限于治疗和预防试剂。有生物活性的材料的例子包括但不限于：蛋白质和肽(合成的、天然的和模拟的，包括抗体或其片段)、寡核苷酸(反义寡核苷酸、核酶等)、小于大约1000个核苷酸的短核酸序列(例如，双链有义线性DNA、抑制性RNA、siRNA、miRNA、抗-miRNA、shRNA、表达载体等)、核糖核蛋白、载体、小分子、脂质、碳水化合物、细胞因子、血液治疗试剂、抗癌药物、抗炎药物、抗真菌药物、抗病毒药物、抗微生物药物、血栓调节试剂、免疫调节试剂等。
应当理解的是，也可以将其他治疗试剂引入到所述外来体中。这些目的试剂包括但不限于：平滑肌抑制剂、抗感染试剂(例如，抗生素、抗真菌试剂、抗细菌试剂、抗病毒试剂)、化学治疗试剂/抗肿瘤试剂等。所述治疗试剂可以为癌症治疗试剂、用于自身免疫性或同种异体免疫性疾病的治疗试剂、用于微生物感染的治疗试剂、用于心脏疾病的治疗试剂、用于肺疾病的治疗试剂、用于肝疾病的治疗试剂、用于肾疾病的治疗试剂、用于神经学疾病的治疗试剂或其组合。对于癌症治疗试剂，所述试剂可以为例如药物、小分子、抗体、靶向癌基因的抑制性RNA、肿瘤阻抑蛋白或者其组合或混合物。
在一些方面，所述外来体包含一种或多种短DNA序列和/或一种或多种短RNA序列。所述一种或多种短RNA序列可以包括抑制性RNA，包括miRNA、抗-miRNA、siRNA、shRNA、吗啉代物寡聚物(Morpholino oligomer)或者其组合或混合物。微小RNA(“miRNA”或“miR”)是指小单链非编码RNA分子，其通过与在mRNA分子内的互补序列进行碱基配对而在基因表达的RNA沉默和转录后调控中发挥作用。在miRNA和互补mRNA分子之间进行碱基配对后，通过下述方式来使所述mRNA分子沉默：将mRNA链切割为两段，通过其poly(A)尾的缩短来使mRNA去稳定化，和/或核糖体将mRNA翻译为蛋白质的效率降低。抗-miRNA(也称为“抗-miRNA寡核苷酸”或“AMO”)是指用于中和在细胞中的miRNA功能的合成设计的分子。通过控制调控在细胞中的mRNA的miRNA，AMO可以用作进一步的调控，通过例如立体阻断机制以及与miRNA杂交。在miRNA和AMO之间的这些相互作用在其中出现miRNA过表达/表达不足或者miRNA的失常导致编码问题的病症中可以是治疗性的。小干扰RNA(“siRNA”或“短干扰RNA”或“沉默RNA”)是指在基因表达的序列特异性抑制中起作用的一类双链RNA非编码RNA分子。siRNA通过下述方式来干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达：在转录后降解mRNA，由此阻止mRNA翻译为氨基酸和然后蛋白质。可以使用表达载体来将siRNA引入到细胞中，在所述表达载体中siRNA序列被修饰以在两条链之间引入短环。所得的转录物为短发夹RNA(“shRNA”或“短发夹RNA”)，其可以通过Dicer被加工为有功能的siRNA，Dicer是一种将双链RNA切割为siRNA(和将前微小RNA切割为微小RNA)的酶。吗啉代物寡聚物(“吗啉代物”或“二氨基磷酸酯吗啉代物寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)”或“PMO”)是指这样的寡聚物分子，其包含附接至通过二氨基磷酸酯基团相连接的亚甲基吗啉环主链的DNA碱基。吗啉代物在空间上阻断其他分子接近RNA的碱基配对表面的小的特异性序列，由此修饰基因表达。例如，吗啉代物可以修饰pre-mRNA剪接，通过干扰核糖体起始复合物从5’帽行进至起始密码子来阻断翻译，或者阻断在RNA上的其他功能位点(即，阻断miRNA活性和成熟，阻断核酶活性，等等)，取决于吗啉代物的碱基序列。
在一些方面，所述外来体包含一种或多种抗体或抗体片段。如在本文中所提及的，术语“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指至少包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补性决定区(CDR))，其散置有更保守的区域(称为构架区(FR))。在本发明中有用的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选地将会为单克隆抗体。在本发明中有用的抗体可以为嵌合抗体、CDR-嫁接抗体、纳米抗体、人或人源化抗体或者其中任一种的抗原结合部分。为了产生单克隆和多克隆抗体，实验动物典型地为非人哺乳动物例如山羊、兔子、大鼠或小鼠，但是也可以在其他物种例如骆驼科动物中产生。
术语抗体的“抗原结合部分”是指保留了与抗原特异性地结合的能力的抗体的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来施行。在术语抗体的“抗原结合部分”内所包括的结合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补性决定区(CDR)。单链抗体例如scFv抗体也意欲被包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段可以通过使用本领域中已知的常规技术来获得，并且可以就与完整抗体相同的方式使用来筛选所述片段。在本发明中使用的抗体可以是人抗体或人源化抗体。
在一些方面，用一种或多种癌症药物(包括一种或多种化学疗法)对所述外来体进行加载。根据本方面可以使用广泛多样的化学治疗试剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学疗法”或“化学治疗试剂”用于隐含在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物按其在细胞内的活性方式来进行分类，例如，是否和在什么阶段它们影响细胞周期。备选地，可以基于其下述能力来表征试剂：直接交联DNA，嵌入到DNA中，或者通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂失常。
化学疗法的例子包括：烷基化试剂，例如塞替派、丙卡巴肼和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氮杂环丙烷类和甲基三聚氰胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；乙酰精宁类(acetogenins)(尤其是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑制素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如普卡霉素和烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；烯二炔蒽环类抗生素，包括烯二炔蒽环抗生素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星和脱氧多柔比星)、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、吉西他滨、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；5-氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦生类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；利索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族化合物(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如红豆杉醇、紫杉醇和多西他赛；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如反铂、顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲类，例如维甲酸；卡培他滨；蛋白酶抑制剂，如硼替佐米；激酶抑制剂，如帕博西利(palbociclib)、依鲁替尼(ibrutinib)、达沙替尼、pp2、帕唑帕尼和吉非替尼；检查点抑制剂，如纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)和伊匹木单抗；集落刺激因子，如培非司亭和非格司亭；单克隆抗体，如贝伐珠单抗、曲妥珠单抗和利妥昔单抗；免疫调节试剂，如来那度胺；诺维本；法呢基-蛋白质转移酶抑制剂；上述中任一个的在药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及其组合。
在某些方面，用一种或多种抗微生物试剂对所述外来体进行加载。抗微生物试剂可以为天然的或合成的物质，其杀伤微生物或病原体(例如细菌、真菌、藻类或病毒)或者抑制其生长。所述抗微生物试剂可以为抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂等。
抗生素的例子包括但不限于：氨基糖苷类、安沙霉素类、碳头孢烯(carbacephem)、碳青霉烯类、头孢菌素类(第一、第二、第三、第四或第五代)、糖肽、林肯酰胺类(linocsamides)、脂肽、大环内酯类、单环内酰胺类、硝基呋喃类、噁唑烷酮类、青霉素类、多肽、喹诺酮类/氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、platensimycin、奎奴普丁/达福普汀、甲砜霉素、替吉环素、替硝唑、甲氧苄啶及其组合。氨基糖苷类可以包括但不限于：阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布拉霉素、巴龙霉素、链霉素和壮观霉素。安沙霉素类可以包括但不限于：格尔德霉素、除莠霉素和利福昔明。碳头孢烯可以包括但不限于氯碳头孢。碳青霉烯类可以包括但不限于：厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南。头孢菌素类可以包括但不限于：头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢匹林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢替坦、头孢替坦二钠、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、氯碳头孢、头孢丙烯、施复捷、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、拉氧头孢、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)和头孢比罗。糖肽可以包括但不限于：替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、达巴万星和奥利万星。林肯酰胺类可以包括但不限于：氯林肯霉素和林可霉素。脂肽可以包括但不限于达托霉素。大环内酯类可以包括但不限于：阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素和非达霉素(Fidaxomicin)。单环内酰胺类可以包括但不限于氨曲南。硝基呋喃类可以包括但不限于：呋喃唑酮和呋喃妥因。噁唑烷酮类可以包括但不限于：利奈唑胺、泊西唑利德、雷得唑胺(Radezolid)和特地唑胺(Torezolid)。青霉素类可以包括但不限于：阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、替莫西林、替卡西林、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦和替卡西林/克拉维酸盐。多肽可以包括但不限于：杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B。喹诺酮类/氟喹诺酮类可以包括但不限于：环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星和替马沙星。磺胺类可以包括但不限于：磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和氨磺胺柯衣定(Sulfoamidochrysoidine)。四环素类可以包括但不限于：地美环素、多西环素、美他环素、米诺环素、土霉素和四环素。在一些方面，所述抗生素为大环内酯。在一些方面，所述抗生素为阿奇霉素。
抗生素的例子还包括但不限于抗微生物蛋白质或肽。所述抗微生物蛋白质或肽可以是任何类别的，包括但不限于下列类别：阴离子肽(例如，皮西定(dermicidin))，线性阳离子α-螺旋肽(例如，LL37)，富含脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或色氨酸的阳离子肽，包含半胱氨酸并且形成二硫键的阴离子和阳离子肽(例如，防御素)，及其组合。防御素可以包括但不限于：反式防御素、顺式防御素和相关的防御素样蛋白质。反式防御素包括但不限于：α-防御素和β-防御素。
抗生素的例子还包括但不限于：抗分支杆菌药，包括但不限于异烟肼、利福平、链霉素、利福布汀、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺、氨基水杨酸和环丝氨酸。
抗病毒剂的例子包括但不限于：抗疱疹试剂，例如阿昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸、更昔洛韦、阿昔洛韦、碘苷、索利夫定、曲氟尿苷、伐昔洛韦和阿糖腺苷；抗逆转录病毒试剂，例如利托那韦、去羟肌苷、司他夫定、扎西他滨、替诺福韦和齐多夫定；和其他抗病毒试剂，例如但不限于金刚烷胺、干扰素-α、利巴韦林、金刚乙胺及其组合。
抗真菌剂的例子包括但不限于：多烯抗真菌剂(例如，两性霉素B、制霉菌素、游霉素等)、氟胞嘧啶、咪唑类(例如，n-替康唑、克霉唑、益康唑、酮康唑等)、三唑类(例如，伊曲康唑、氟康唑等)、灰黄霉素、特康唑、布康唑、环吡酮、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬、任何其他抗真菌剂(其可以是经脂质包囊的或复合的)及其组合。
在一些方面，用一种或多种用于治疗自身免疫性或同种异体免疫性疾病的治疗试剂对所述外来体进行加载。自身免疫性或同种异体免疫性疾病疗法的例子包括但不限于：抗微生物试剂(例如，抗生素、抗病毒试剂和抗真菌试剂)、抗肿瘤试剂(例如，氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、紫杉醇、氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星或长春新碱)、免疫耗竭试剂(例如，氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星或长春新碱)、免疫抑制试剂(例如，硫唑嘌呤，或糖皮质激素，例如地塞米松或泼尼松)、抗炎试剂(例如，糖皮质激素例如氢化可的松、地塞米松或泼尼松，或者非类固醇抗炎试剂例如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)、细胞因子(例如，白介素-10或转化生长因子-β)、激素(例如，雌激素)或疫苗。另外，可以施用免疫抑制或致耐受试剂，其包括但不限于：钙依赖磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素)；麦考酚酸酯，抗体(例如，其识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化学治疗试剂(例如，氨甲蝶呤、曲奥舒凡、白消安)；辐射；或者趋化因子、白介素或其抑制剂(例如，BAFF、IL-2、抗-IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制剂)。
在备选的方面，不用治疗药物而是用一种或多种基因修饰组分(其例如包含CRISPR-Cas系统，包括特异性指导RNA和核酸内切酶)对所述外来体进行加载。通常，“CRISPR系统”集体地是指在CRISPR-相关(“Cas”)基因的表达中所牵涉的或者指引CRISPR-相关(“Cas”)基因的活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列，tracr(反式激活性CRISPR)序列(例如，tracrRNA或有活性的部分tracrRNA)，tracr-mate序列(包括“直接重复序列”和经tracrRNA加工的部分直接重复序列，在内源性CRISPR系统的情景下)，指导序列(也称为“间隔子”，在内源性CRISPR系统的情景下)，和/或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括：非编码RNA分子(指导)RNA，其与DNA以序列特异性方式结合；和具有核酸酶功能性(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。
在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括特异于靶序列的crRNA和固定的tracrRNA的融合物)引入到细胞中。通常，指导序列为任何这样的多核苷酸序列，其具有足够的与靶多核苷酸序列的互补性，以与靶序列杂交并且指引CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合。典型地，“靶序列”通常是指指导序列被设计与之具有互补性的序列，其中在靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。CRISPR系统可以在靶位点处诱导双链断裂(DSB)，随后为破裂或改变，如在本文中所讨论的。在其他方面，使用Cas9变体(认为的“切口酶”)来在靶位点处切刻单链。在其他方面，将在催化方面无活性的Cas9与异源效应结构域例如转录阻遏物或激活物相融合，以影响基因表达。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，例如在细胞的细胞器中。
在一些方面，可以将加载有一种或多种载体的外来体引入到细胞中以驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达，从而CRISPR系统的元件的表达指引在一个或多个靶位点处的CRISPR复合物的形成。也可以经由外来体将组分递送至细胞，作为蛋白质和/或RNA。例如，Cas酶、与tracr-mate序列相连接的指导序列和tracr序列各自可以与在分开的载体上的分开的调控元件可操作地连接。备选地，可以将从相同或不同调控元件表达的元件中的两个或更多个组合在单个载体中，其中一个或多个另外的载体提供未包括在第一载体中的所述CRISPR系统的任何组分。所述载体可以包含一个或多个插入位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些方面，一个或多个插入位点位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体来将CRISPR活性靶向在细胞内的多个不同的相应的靶序列。载体可以包含与编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列可操作地连接的调控元件。
III.使用外来体的方法
在特别的方面，外来体对于治疗一种或多种医学状况来说是有用的。所述外来体可以用于治疗性化合物的全身或局部递送。本公开内容包括用于通过使用外来体作为递送载料来递送目的治疗试剂的方法。本公开内容还包括治疗需要一种或多种治疗试剂的患者的方法，其包括向所述患者施用有效量的包含所述治疗试剂的外来体。
本公开内容的外来体可以或可以不在产生后直接使用。在一些情况下，储存它们以用于后来目的。无论如何，都可以在用于哺乳动物受试者(人、狗、猫、马等)例如患者的治疗性或预防性应用中使用它们。所述个体可能由于任何种类的医学状况(包括例如癌症、任何种类的感染、任何免疫病症、任何组织损伤、任何皮肤病症、任何伤口、任何创伤和/或任何灼伤)而需要基于外来体的疗法。可以相关于这样的个体采用这些方法，所述个体已被测试为对于医学状况来说是阳性的，具有医学状况的一个或多个症状，或者被认为处于发展出这样的状况的风险中。
用本发明的基于外来体的疗法进行治疗的个体可以在接受所述基于外来体的疗法之前已经或未曾就特别的医学状况进行治疗。在一些方面，所述患者已接受了至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多次对于医学状况的在前治疗。所述在前治疗可以包括在本文中所描述的治疗或疗法。在一些方面，所述在前治疗包括常规的化学疗法、常规的放射疗法、常规的抗病毒疗法、常规的抗菌和抗细菌疗法、常规的免疫抑制疗法、常规的抗炎疗法、常规的灼伤治疗疗法等。在一些方面，所述患者在施用本公开内容的当前组合物和外来体的10、20、30、40、50、60、70、80或90天或小时内已接受了在先疗法。在一些方面，所述患者为已经历了在先疗法并且因为所述在前治疗无效或因为所述在前治疗被认为毒性太大而使得所述在前治疗失败的患者。
加载有一种或多种在本文中所考虑的治疗试剂的外来体和/或包含其的药学组合物可以单独地或者以任何组合(和在至少一些方面，与在药学上可接受的载剂或赋形剂一起)进行施用，并且可以用于预防、治疗或改善任何种类的癌症、免疫病症、心脏疾病、肺疾病、微生物感染、组织损伤、皮肤病症、伤口、创伤和/或灼伤。加载有一种或多种在本文中所考虑的治疗试剂的外来体和/或包含其的药学组合物也可以用于减轻由化学疗法和放射疗法所诱导的CNS毒性，和治疗其他由化学疗法或放射所诱导的维持生命必需器官毒性，牵涉心脏、肺、肾、肠胃道，在其中经常需要再生或修复特性。
加载有一种或多种在本文中所考虑的治疗试剂的外来体和/或包含其的药学组合物也可以用于减轻由化学疗法和放射疗法所诱导的CNS毒性，和治疗其他由化学疗法或放射所诱导的维持生命必需器官毒性，牵涉心脏、肺、肾、肠胃道，在其中经常需要再生或修复特性。
本公开内容的方面包括用于治疗、逆转或改善响应于由化学疗法和放射疗法所诱导的中枢神经系统(CNS)毒性的认知功能障碍或者提供针对由化学疗法和放射疗法所诱导的中枢神经系统(CNS)毒性的神经保护的方法。在特别的方面，衍生自源自脐带组织的MSC的外来体(UC-Exo)对于治疗或逆转响应于由化学疗法和放射疗法所诱导的中枢神经系统(CNS)毒性的认知功能障碍或者提供针对由化学疗法和放射疗法所诱导的中枢神经系统(CNS)毒性的神经保护来说是有用的。本公开内容的方法和组合物允许从UC-Exo生成大规模的经激活的外来体，其携带治疗试剂，至少包括miR、抗-miR、siRNA和治疗药物，其用于治疗或逆转响应于由化学疗法和放射疗法所诱导的中枢神经系统(CNS)毒性的认知功能障碍或者提供针对由化学疗法和放射疗法所诱导的中枢神经系统(CNS)毒性的神经保护。
在某些方面，将所述外来体(例如，UC-Exo)用于出于任何原因需要组织的再生和/或修复的个体。所述需要再生和/或修复的组织可以是任何种类的，但是在特别的方面，所述组织为软组织(例如，脂肪、纤维组织(例如，腱和/或韧带)、肌(例如，平滑肌、骨骼肌和/或心肌)、滑膜组织、血管、淋巴管和/或神经)、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。例如，所述个体可能由于由化学疗法或放射所诱导的维持生命必需器官毒性而需要再生和/或修复心脏、肺、肾和/或肠胃道组织。所述个体可能由于炎症、创伤(例如，挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损)、灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或其组合而需要再生和/或修复软组织(例如，脂肪、纤维组织(例如，腱和/或韧带)、肌(例如，平滑肌、骨骼肌和/或心肌)、滑膜组织、血管、淋巴管和/或神经)。在一些方面，所述组织由于下述毒性而需要再生或修复：归因于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损)的毒性，和/或归因于对于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损)的在前治疗的毒性。在特别的方面，通过在本文中所包括的方法产生的外来体作为用于靶向软组织和器官(包括脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸和骨，作为靶组织的例子)的再生和/或修复疗法是有用的。在此类情况下，所述外来体是治疗性的，至少部分地因为它们适合于在所述个体中迁移。
在某些方面，将所述外来体(例如，UC-Exo)用于出于任何原因需要皮肤的再生和/或修复的个体。例如，所述个体可能由于由化学疗法或放射所诱导的维持生命必需器官毒性而需要再生和/或修复皮肤。所述个体可能由于下述毒性而需要再生或修复皮肤：归因于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的毒性，和/或归因于对于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)而施用的在前治疗的毒性。所述个体可能由于皮肤病症而需要再生和/或修复皮肤。皮肤病症的非限制性例子包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
在某些方面，将所述外来体(例如，UC-Exo)用于出于任何原因需要伤口愈合(例如，伤口修复)的个体。例如，所述个体可能由于由化学疗法或放射所诱导的维持生命必需器官毒性而需要再生和/或修复受伤的皮肤或组织。所述个体可能由于下述毒性而需要再生和/或修复受伤的皮肤或组织：归因于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的毒性，和/或归因于对于灼伤(例如，热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤)或创伤(例如，扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口)的在前治疗的毒性。所述个体可能由于炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合而需要再生和/或修复受伤的皮肤或组织。
本公开内容的方面包括用于治疗癌症的方法。在一些情况下，所述外来体对于一种或多种癌症来说是有用的。在特别的方面，衍生自源自脐带组织的MSC的外来体(UC-Exo)对于治疗癌症和对于全身递送用于癌症的治疗性化合物来说是有用的。本公开内容的方法和组合物允许从UC-Exo生成大规模的经激活的外来体，其携带治疗试剂，至少包括miR、抗-miR、siRNA和治疗药物，其用于治疗癌症。
本发明的外来体对其来说有用的癌症包括任何恶性细胞类型，例如在实体肿瘤或血液学肿瘤中发现的那些。在所述个体具有癌症的情况下，所述癌症可以是原发的、转移性的、对疗法有抵抗性的等。在特别的情况下，本发明的疗法对于具有已在临床上指出经历免疫细胞调节的癌症的个体来说是有用的，所述癌症包括例如多种类型的实体肿瘤(黑素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌和头颈癌)。示例性的实体肿瘤可以包括但不限于从由下列各项组成的组中选择的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳腺。示例性的血液学肿瘤包括骨髓的肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用在本文中所提供的方法来进行治疗的癌症的进一步例子包括但不限于：胶质母细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、胃部或胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑素瘤。
所述癌症可以特别地是下列组织学类型的，虽然并不限于这些：赘生物，恶性的；癌；癌，未分化的；巨大和纺锤状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；合并的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性的；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无被囊性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液囊腺癌；粘液囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢基质瘤，恶性的；泡膜细胞瘤，恶性的；粒层细胞瘤，恶性的；男性细胞瘤，恶性的；塞托利细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳房外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；恶性雀斑样痣黑素瘤；肢端雀斑样痣黑素瘤；结节性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合瘤，恶性的；米勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性的；布伦纳瘤，恶性的；分叶状瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢甲状腺肿，恶性的；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间质性软骨肉瘤；骨的巨大细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性的；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形胶质细胞瘤；原浆性星形胶质细胞瘤；纤维性星形胶质细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性的；粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞的；恶性淋巴瘤，大细胞的，弥漫性的；恶性淋巴瘤，滤泡性的；蕈样霉菌病；其他特化的非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度淋巴母细胞NHL；高度小无裂细胞NHL；巨块疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS-相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞白血病；嗜酸细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；多毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性成淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；和慢性原始粒细胞白血病。
在一些方面，本发明的外来体对其来说有用的癌症为多形性胶质母细胞瘤(GBM)。众所周知，成人胶质母细胞瘤对于大多数疗法是顽固性的，不仅因为其分子、细胞和免疫生物学相比于其他癌症而言是独特的，而且由于由血脑/血瘤屏障(BBB/BTB)所强加的大得令人生畏的的递送挑战。因此，存在鉴定特异性地靶向GBM的抗癌疗法并且阐明用于递送这些新试剂穿过BBB/BTB的策略的急迫需要。在一些情况下，外来体有效地寻靶至人神经胶质瘤，从而克服了BBB/BTB。
在一些情况下，用抗-GMB miRNA miR-124对用于治疗GBM的外来体进行加载。验证研究证明，miR-124针对所有亚型的神经胶质瘤干细胞都是高度有效的，其通过下述方式来发挥作用：下调GBM相关的靶标，特别是FOXA2，并且导致凋亡性细胞死亡。miR-124还通过抑制STAT-3(一种已知的在GBM中的免疫抑制的介体)来增强T-细胞应答，这进一步支持了其治疗潜力。近期工作还已显示，miR-124逆转在脑损伤后的神经变性，这使得miR-124成为还可以减轻神经毒性的首要抗神经胶质瘤试剂之一。
本公开内容的方面包括用于治疗免疫病症的方法。在一些情况下，所述外来体对于一种或多种免疫病症来说是有用的。在特别的方面，衍生自源自脐带组织的MSC的外来体(UC-Exo)对于治疗免疫病症和对于全身递送用于免疫病症的治疗性化合物来说是有用的。本本公开内容的方法和组合物允许从UC-Exo生成大规模的经激活的外来体，其携带治疗试剂，至少包括miR、抗-miR、siRNA和治疗药物，其用于治疗免疫病症。
本发明的外来体对其来说有用的免疫病症包括自身免疫性病症或炎性病症。自身免疫性病症或炎性病症的非限制性例子包括：斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、贝赫切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、腹部爆发性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-斯综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉-巴综合症、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、肾病综合征(例如微小病变疾病、局灶性肾小球硬化或膜性肾病)、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、赖特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎(例如，结节性多动脉炎，高安动脉炎，颞动脉炎/巨大细胞动脉炎，或疱疹样皮炎，脉管炎)、白斑、移植物抗宿主病(GVHD)和韦格纳肉芽肿病。因此，可以使用在本文中所公开的方法来进行治疗的自身免疫性疾病的一些例子包括但不限于多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、肾小球肾炎、强直性脊椎炎、脉管炎或银屑病。所述受试者也可以具有变应性病症例如哮喘。
本公开内容的方面包括用于治疗任何种类的心脏疾病(至少包括冠状动脉疾病、心力衰竭、心肌病、心脏瓣膜疾病、心律失常、心脏的遗传缺陷等)的方法。
本公开内容的方面包括用于治疗肺疾病(例如，肺动脉高压、哮喘、支气管肺发育不良(BPD)、变态反应、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、胸腔积液等)的方法。
本公开内容的方面包括用于治疗任何种类的微生物感染(包括病原体感染)的方法。所述感染可以是细菌性的、病毒性的、真菌性的或原生动物性的。细菌的例子包括但不限于：放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、博德特氏菌属(Bordetella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)、衣原体属(Chlamydia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜皮菌属(Dermatophilus)、肠球菌属(Enterococcus)、埃里希氏体属(Ehrlichia)、埃希氏菌属(Escherichia)、佛朗西丝氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、血巴通氏体属(Haemobartonella)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、L-型细菌、钩端螺旋体属(Leptospira)、利斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、枝原体属(Mycoplasma)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、罗卡利马氏体属(Rochalimaea)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、A族链球菌、B族链球菌、密螺旋体属(Treponema)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。真菌的例子包括但不限于：犁头霉属(Absidia)、枝顶孢属(Acremonium)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、蛙粪霉属(Basidiobolus)、离蠕孢霉属(Bipolaris)、芽酵母属(Blastomyces)、假丝酵母属(Candida)、球孢子菌属(Coccidioides)、耳霉属(Conidiobolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、弯孢霉属(Curvalaria)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、外瓶霉属(Exophiala)、地霉属(Geotrichum)、组织孢浆菌属(Histoplasma)、马杜拉分支菌属(Madurella)、马拉色霉菌属(Malassezia)、小孢霉属(Microsporum)、小丛梗孢属(Moniliella)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、拟青霉素(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、单胞瓶霉属(Phialemonium)、瓶霉属(Phialophora)、原藻属(Prototheca)、假性阿利什利菌属(Pseudallescheria)、假小托菌属(Pseudomicrodochium)、腐霉属(Pythium)、鼻孢子菌属(Rhinosporidium)、根霉属(Rhizopus)、线状担子菌属(Scolecobasidium)、孢子丝菌属(Sporothrix)、匍柄霉属(Stemphylium)、发癣菌属(Trichophyton)、丝孢酵母属(Trichosporon)和木丝霉属(Xylohypha)。原生动物的例子包括但不限于：巴贝虫属(Babesia)、肠袋虫属(Balantidium)、贝西诺原虫属(Besnoitia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、艾美虫属(Eimeria)、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)、内阿米巴属(Entamoeba)、贾第虫属(Giardia)、哈蒙德虫属(Hammondia)、肝簇虫属(Hepatozoon)、等孢子球虫属(Isospora)、利什曼原虫属(Leishmania)、微孢子目(Microsporidia)、新孢子虫属(Neospora)、小孢子虫属(Nosema)、五鞭毛滴虫属(Pentatrichomonas)、疟原虫属(Plasmodium)。蠕虫寄生虫的例子包括但不限于：棘唇线虫属(Acanthocheilonema)、猫圆线虫属(Aelurostrongylus)、钩口线虫属(Ancylostoma)、管圆线虫属(Angiostrongylus)、蛔虫属(Ascaris)、布鲁丝虫属(Brugia)、仰口线虫属(Bunostomum)、毛细线虫属(Capillaria)、夏氏线虫属(Chabertia)、库珀线虫属(Cooperia)、环体线虫属(Crenosoma)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、膨结线虫属(Dioctophyme)、棘唇线虫属(Dipetalonema)、裂头绦虫属(Diphyllobothrium)、复孔绦虫属(Dipylidium)、恶丝虫属(Dirofilaria)、龙线虫属(Dracunculus)、蛲虫属(Enterobius)、丝虫属(Filaroides)、血矛线虫属(Haemonchus)、兔唇蛔虫属(Lagochilascaris)、罗阿丝虫属(Loa)、曼森线虫属(Mansonella)、缪勒线虫属(Muellerius)、隐孔侏形吸虫属(Nanophyetus)、板口线虫属(Necator)、细颈线虫属(Nematodirus)、结节线虫属(Oesophagostomum)、盘尾丝虫属(Onchocerca)、后睾吸虫属(Opisthorchis)、胃线虫属(Ostertagia)、副丝虫属(Parafilaria)、并殖吸虫属(Paragonimus)、副蛔虫属(Parascaris)、泡翼线虫属(Physaloptera)、原圆线虫属(Protostrongylus)、鬃丝虫属(Setaria)、旋尾线虫属(Spirocerca)、迭宫绦虫属(Spirometra)、冠丝虫属(Stephanofilaria)、类圆线虫属(Strongyloides)、圆线虫属(Strongylus)、吸吮线虫属(Thelazia)、弓蛔线虫属(Toxascaris)、弓蛔虫属(Toxocara)、毛线虫属(Trichinella)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)、鞭虫属(Trichuris)、钩虫属(Uncinaria)、吴策线虫属(Wuchereria)、肺囊虫属(Pneumocystis)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、裂体吸虫属(Schistosoma)、泰勒虫属(Theileria)、弓形虫属(Toxoplasma)和锥虫属(Trypanosoma)。病毒的例子包括：腺病毒、甲病毒、杯状病毒、冠状病毒(包括SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS)、温热病毒、埃博拉病毒、肠道病毒、黄病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、传染性腹膜炎病毒、白血病病毒、马尔堡病毒、诺沃克病毒、正粘病毒、乳头瘤病毒、副流感病毒、副粘病毒、细小病毒、瘟病毒、小RNA病毒、痘病毒、狂犬病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、轮状病毒和痘苗病毒。
本公开内容的外来体组合物可以通过任何合适的方式来进行施用。向人或动物受试者的施用可以选自直肠、颊、阴道、胃肠外、肌内、大脑内、血管内(包括静脉内)、皮内、皮下、鼻内、心内、脑室内、腹膜内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内或颅内途径，或者透皮施用，或者经由植入型贮器。
所述外来体可以作为组合物来进行递送。所述组合物可以被配制成用于任何合适的施用方式，包括直肠、颊、阴道、胃肠外、肌内、大脑内、血管内(包括静脉内)、皮内、皮下、鼻内、心内、脑室内、腹膜内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内或颅内途径，或者透皮施用，或者经由植入型贮器。用于肠胃外施用的组合物可以包括无菌水性溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。可以将本公开内容的外来体配制在药学组合物中，其除了所述外来体外，还可以包含在药学上可接受的载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂和其他在药学上可接受的载剂或赋形剂等。
“在药学上可接受的载剂”(赋形剂)为药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他在药理学上惰性的载料，其用于向受试者递送一种或多种核酸。典型的在药学上可接受的载剂包括但不限于：粘合剂(例如，预明胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙甲纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如、淀粉、羟乙酸淀粉钠等)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠等)。
在本文中所提供的组合物可以另外包含其他在药学组合物中常规地存在的辅助组分。因此，例如，所述组合物可以包含另外的相容的在药学上有活性的材料，或者可以包含另外的在以物理方式配制本发明的组合物的各种剂型中有用的材料，例如染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、乳浊剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，此类材料应当不会过度地干扰在本文中所提供的组合物的组分的生物学活性。
施用治疗有效量的组合物。所产生的外来体的治疗有效量为在正在进行治疗的受试者中取得所希望的效应的量。例如，这可以是这样的外来体的量，其对于抑制癌症的前进或引起癌症的消退来说是必需的，或者其能够缓解由癌症所引起的症状。这可以是这样的外来体的量，其对于抑制自身免疫性或同种异体免疫性疾病的前进或引起自身免疫性或同种异体免疫性疾病的消退来说是必需的，或者其能够缓解由自身免疫性疾病所引起的症状，例如疼痛和炎症。它也可以是这样的外来体的量，其对于抑制微生物感染的前进或引起微生物感染的消退来说是必需的，或者其能够缓解由微生物感染所引起的症状。
所产生的外来体可以以与所述疾病相一致的治疗制度方案来进行施用，例如在一至几天内单个或几个剂量以改善疾病状态，或者在延长的一段时间内定期剂量以抑制疾病进展和防止疾病复发。所述剂量可以根据各种参数(尤其是根据待治疗的患者的状况的严重度、年龄和体重；施用途径；和所要求的制度方案)来确定。医师将能够确定关于任何特定患者的所需要的施用途径和用量。最佳用量可以依赖于独个构建体的相对效力而变化，并且通常可以基于被发现在体外和体内动物模型中有效的EC50来估计。通常，用量为0.01mg/kg至100mg/kg体重。典型的日剂量为大约0.1至50mg/kg，优选地大约0.1mg/kg至10mg/kg体重，根据特定构建体的效力，待治疗的受试者的年龄、体重和状况，疾病的严重度，以及施用的频次和途径。依赖于施用是通过肌内注射还是全身(静脉内或皮下)注射，可以施用不同用量的构建体。在一些情况下，单次或多次全身注射的剂量在10至100mg/kg体重的范围中。
在一些情况下，所述个体可能不得不重复进行治疗，例如，每日、每周、每月或每年一次或多次。本领域普通技术人员可以基于所测量的所述构建体在体液或组织中的停留时间和浓度而容易地估计出关于按剂量给药的重复率。在成功的治疗后，可以希望使个体经历维持疗法，其中所述构建体以维持剂量来进行施用，从0.01mg/kg至100mg/kg体重变动，每日一次或多次至每20年一次。
IV.试剂盒
可以将任何在本文中所描述的组合物包含在试剂盒中。在一个非限制性实例中，可以将细胞、用于产生细胞的试剂和用于产生外来体的试剂和/或其组分包含在试剂盒中。在某些方面，可以将外来体包含在试剂盒中，并且它们可以表达或可以还不表达一种或多种治疗试剂。这样的试剂盒可以具有或可以不具有待加载到所述外来体中的一种或多种治疗试剂，包括用于生成其的试剂和/或用于操纵所述外来体以加载所述试剂的试剂。此类试剂包括例如小分子、蛋白质、核酸、抗体、缓冲液、引物、核苷酸、盐和/或其组合。
在特别的方面，所述试剂盒包含本公开内容的基于外来体的疗法并且还包含另一种疗法。在一些情况下，除了基于外来体的疗法方面外，所述试剂盒还包括第二疗法，例如化学疗法、激素疗法、免疫疗法和/或抗微生物疗法。所述试剂盒可以被调整适合于特定疾病以用于个体，并且包含各自的用于所述个体的第二疗法。
所述制造品或试剂盒可以进一步包含包装插页，其包含关于使用所述外来体来在个体中治疗疾病(例如，癌症、感染或免疫病症)或延迟其进展或者增强具有癌症、感染或免疫病症的个体的治疗的说明书。可以在所述制造品或试剂盒中包括任何在本文中所描述的外来体。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。所述容器可以由各种各样的材料例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或)形成。在一些方面，所述容器容纳所述制剂，并且在该容器上或与该容器相连的标签可以指明使用说明。所述制造品或试剂盒可以进一步包括从商业或用户立场所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装插页。在一些方面，所述制造品进一步包括一种或多种另外的试剂(例如，化学治疗试剂、抗肿瘤试剂、抗微生物试剂)。合适的用于所述一种或多种试剂的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
实施例
包括了下面的实施例以示范本公开内容的方面。本领域技术人员应当意识到，在下面的在实施例中所公开的技术代表了由发明人发现在本公开内容的实践中很好地发挥功能的技术。但是，根据本公开内容，本领域技术人员应当意识到，在所公开的特别的方面中可以进行许多变化，并且其仍然获得同样或相似的结果，而不背离本公开内容的精神和范围。
实施例1
使用外来体作为用于治疗货物的递送载料的平台方法
本实施例提供了新型、稳固、符合GMP的平台，以从源自脐带的间充质干细胞/基质细胞(UC-MSC)或源自骨髓的间充质干细胞/基质细胞(BM-MSC)生成外来体并且用高度强有力的和新型的治疗剂对它们进行加载，所述治疗剂包括miR-124、其他治疗性miR(例如，miR-135-a-2，Let7i，miR-148、-375、-657、-668、-485、-520d、-569、-943、-1181、-198、-521-1、-24-1)、用于其他癌症的抗肿瘤miR和siRNA(例如，针对基因融合例如FGFR-TACC融合的siRNA)。
特别地，发明人开发出了使用慢病毒转导的方法(其中以慢病毒方式将miR-124转导到MSC中，从之中生成外来体)以及用于有效地将治疗试剂加载到MSC-Exo中的有效且符合GMP的方法，并且已显示经加载的MSC-Exo在体外针对宽范围的在分子上异质的GSC是高度有效的。在关键性的临床前体内小鼠研究中，发明人证明，经加载的MSC-Exo可以在全身递送后根除颅内人神经胶质瘤并且下调蛋白质和核酸靶标。在一些方面，新颖性和潜在的临床影响是该治疗剂根除GBM而同时改善由化学疗法和放射疗法所诱导的脑损伤的双重性。该方法可以充当用于许多不同的治疗剂(包括miR、siRNA或其组合，以及其他治疗基因)的平台。所建立的方法是实际的、有效的，并且在一些方面，允许BM或UC-MSC-外来体作为治疗试剂用于下述方面的临床用途：用于治疗具有GBM和其他实体和液体肿瘤的患者，以及用于具有同种异体免疫性或自身免疫性病症、组织损伤、皮肤病症、伤口的患者，作为用于基因和药物递送的载料，和作为在再生医学情境下的治疗试剂。
1.用于治疗胶质母细胞瘤的miR的鉴定
为了鉴定有效的用于治疗GBM的miR，选择了八种miR(miR-27a、miR-100、miR-124、miR-122、miR-133、miR-138、miR-145、Let-7b)并且就其针对五个神经胶质瘤干细胞系(GSC)(代表了所有TCGA-定义的GBM亚型)(GSC267、GSC6-27、GSC8-11、GSC2-14、GSC20)的抗神经胶质瘤效应进行筛选(图1)。在所有GSC中，miR-124均导致最大的生存力降低(P<0.010)，从而将miR-124a鉴定为高度有效的抗-GBM miR(图2A、2B)。
改造离体培养的人间充质干细胞(MSC)(其分泌外来体(在血液中稳定的纳米尺度的囊泡))，以将miR-124包装入待进行收集并且用于将miR-124全身递送至GBM的外来体中。用包含miR-124的慢病毒转导MSC，并且从上清液中分离外来体(Exo-miR-124)(图3)。电子显微术(图4A)、Western印迹法(图4B)和NanosightTM(图4C)都证明，所分离的囊泡为外来体。qPCR揭示，在Exos-miR-124中的miR-124a水平是不包含miR-124a的对照外来体的60倍(P<0.0001)(图5)。为了证明Exos-miR-124能够在体外抑制GSC的生长(图6)，用Exos-miR-124a、Exos-miR-Ctrl或Exos-空处理五种GSC(106/细胞)，并且仅在用Exos-miR-124进行处理后显示出所有GSC的生存力(图7A)和克隆发生(图7B)的显著降低(p<0.001)。在一些方面，Exo-miR124的可能作用机制显示，Exos-miR-124能够下调FoxA2(一种已知的miR-124靶基因)(图8A)，诱导脂质积累(图8B)，并且促进在GSC经处理的细胞中的细胞死亡(图8C)。
进一步定义了用于治疗所有类别的GBM的最佳miR。特别地，针对一组七种经完全注释的源自患者的GSC进行miR的无偏高通量、大规模筛选。这些GSC代表了GBM的所有分子亚组，即促神经的(MDA-GSC7-11、MDA-GSC8-11)、经典的(MDA-GSC11、MDA-GSC7-2、MDA-GSC231、MDA-GSC6-27)和间充质的(MDA-GSC20)。流程图和示意图显示了所述筛选和数据处理的关键步骤(图9A)。在该研究中所使用的lenti-miR文库包含578种慢病毒，其编码539种独个miR和39种miR簇，导致总共603种成熟的miR。将这些GSC中的每一种用汇集的文库以0.3的MOI进行转导，从而每个细胞被不超过一种miR感染。对于每个时间点从每种GSC中分离DNA，并且进行嵌套式PCR。进行下一代测序(NGS)，并且将每种miR的相对丰度测定为在第x天关于特定miR的NGS读数计数除以在第x天关于所有miR的读数总数目。在28天的跨度上横跨各GSC的总原始读数计数(第3天(平均)：1721939±177003；第28天(平均)：1797286±403928)保持相似(第3天对第28天；p-值0.68)。
为了对所述603种miR进行分级，将丰度计数的log10标准化至对于GSC来说特异的第3天的那种。当针对时间进行绘制时，该经标准化的计数导致这样的斜率值，其中负值表示随时间miR的耗竭和正值表示随时间miR的富集(第3、7、14和28天；斜率和颜色代码的例子显示在图9B中)。关于每种miR的横跨各GSC的斜率值显示在热图中，其中横跨7种GSC具有一致的负斜率值的miR显示在顶部(图9C)。根据该斜率在每种GSC内对miR进行分级，并且在GSC之上对于每种miR对等级进行总结。该分析导致横跨所有GSC的最有效的miR(具有最低的等级总和)的等级次序，选择其中的前25种miR作为用于进一步研究的最有可能的候选物(图9D)。重要的是，miR-124出现在该组中，这给予了在筛选过程中的信心。
然后，就其在阻断GSC增殖中的有效性来评价从初步筛选中鉴定出的推定命中。用独个地过表达前25种miR中的每一种的慢病毒转导六种GSC，并且评估它们对于GSC增殖的效应。用包含前体miR的慢病毒(LV)转导GSC，并且测定细胞生存力以验证当以非汇集方式进行测试时每种LV-miR是有效的。如在热图中所显示的(图9E)，在分层聚类后，miR-124、148a、let7i、135a-2、668、942、657的过表达导致生存力的50-80％下降(取决于所测试的GSC)，并且聚类在一起(图9D)。这些结果显示，等级靠前的独个LV-miR是有效的，其中使GSC生存力降低50％至80％。特别地，miR-124、148a、let7i、135a-2、668、942、657具有最高的针对所有GSC的抑制能力。
2.在体内miR向脑肿瘤的外来体递送
为了证明外来体能够在体内将miR-124递送至脑肿瘤，BM-Exo显示出具有在全身注射后寻靶至脑肿瘤的内在能力。通过超离心从BM-MSC中分离出BM-Exo并且用XENOLIGHTTMDiR(一种近红外活体染料)(Caliper Life Sciences)进行标记，并且用PBS进行洗涤以去除游离的染料。将这些经DiR标记的外来体(DiR-Exo，1010个Exo/100μl)经由IP、IV(尾静脉)或IA(颈动脉)途径注射到拥有GSC17或U87原位异种移植物的小鼠中(N＝3只小鼠/组)。在注射后8小时，使用生物发光成像(BLI)系统200系列(Xenogen)对脑进行分析(图10)。使用Live Image 2.11版软件覆盖(Xenogen)，将荧光图像叠加在灰度照片图像上以允许在脑内定位光源。定量分析显示，用DiR-Exo进行治疗导致在动脉内(IA)途径的情况下在肿瘤内的高信号，用腹膜内(IP)和静脉内(IV)注射也产生有效的寻靶(图11)。这些数据表明，在一些方面，MSC-Exo能够克服BBB/BTB而寻靶至脑肿瘤，并且暗示，在一些方面，可能在减少首过损失方面存在对于IA递送的优势，但是IV注射也是有效的(图11A、11B)。
为了评估在体内Exos-miR-124的功效，将GSC267植入裸鼠的额叶中(N＝8/组)，并且在7天后每隔一天通过IP注射(作为关于IV注射的替代)用BM-Exo-miR-124、BM-Exo-miR-对照或PBS治疗动物(1010Exo/100μl)。在第14和21天还IA注射外来体。所有对照都在肿瘤植入后60天内死亡(中值存活：BM-Exo-miR-对照：54天；PBS：55天)，而50％的用BM-Exo-miR-124进行治疗的动物在110天时还是活的(中值：79天，P＝0.009)(图12A)。存活小鼠的组织学分析显示了肿瘤被根除，这表明Exo-miR-124的全身递送在体内是有效的(图12B)。总之，这些数据表明，在一些方面，miR-124是高度有效的抗-GBM治疗剂，和在一些方面，BM-MSC衍生外来体可以用于全身递送miR-124a，以取得颅内GBM的治愈。
3.脐带间充质干细胞衍生外来体的制备和表征
虽然外来体最初分离自BM-MSC，但是BM-MSC的供应可能是有限的，并且从正常供者中提取骨髓可能是昂贵的。相反地，在一些方面，容易可得的脐带组织可以是极具吸引力和低成本的备选的MSC来源(UC-MSC)。重要的是，UC-MSC显示展现出比BM-MSC更高的扩增能力和更大的外来体产量/细胞(图13)。鉴于UC-MSC相对于BM-MSC而言作为外来体来源的优势，可以在一些方面将UC-Exo在脑肿瘤疗法中用作递送载料，而在与所选择的疾病和情形相关的其他方面，可以使用BM外来体。
像BM-Exo一样，UC-Exo显示出在体内寻靶至脑肿瘤。特别地，给小鼠植入U87细胞，并且在7天后，经由IA注射递送经DiR标记的BM-Exo或UC-Exo(1010个外来体/100μl)(n＝3/组)。在24小时后，通过BLI来评估外来体寻靶。相比于对照(无注射，仅注射DiR)而言，在3/3小鼠中，在肿瘤中但未在周围的正常脑中检测到经荧光标记的UC-Exo。定量分析证明了在用UC-Exo进行治疗的U87肿瘤中的相比于用BM-Exo进行治疗而言在统计学上显著更高的荧光水平，这支持了在一些方面在临床情境中应用UC-Exo(图14A-14B)。
4.对外来体进行电穿孔以加载miR
对于临床开发来说同等重要的是将miR-124加载到外来体中的方法。在一些情况下，用于产生Exo-miR-124的策略依赖于用包含miR-124的cDNA的慢病毒(LV)转导MSC，随后为从上清液中分离Exo-miR-124。在其他情况下，将成熟miR-124模拟物通过电穿孔直接加载到外来体中(图15A、15B和15C)。
开发出了标准操作程序(SOP)用于将miR-124电穿孔到UC-Exo中，其是符合GMP的并且可以被解冻和直接输注到患者中，因为输注试剂是经FDA批准用于临床用途的。特别地，培养UC-MSC，收集上清液，并且通过离心来分离UC-Exo。将人miR-124双链成熟miR-模拟物(Sigma Aldrich)电穿孔到UC-Exo中。初始的优化实验包括16个反应，其测试了15个不同的nucleofector程序加上一个对照(未电穿孔的)，它们在16-孔nucleocuvette条中进行。每个电穿孔反应包含大约1μg的总外来体蛋白质(其通过microBCA来测量并且等于1×108个UC-Exo，通过NANOSIGHTTM所测定的)和0.5μg miR-124(其通过NANODROPTM来测量)，它们在20μl GMP-水平缓冲液(Plasma-Lyte A)中混合。使用系统(Lonza)对这些外来体进行电穿孔，从而产生Exo-miR-124。
为了评估加载到UC-Exo中的miR-124的量，用RNA酶处理Exo-miR-124(或者没有用RNA酶，作为对照)以消除任何游离的miR-124，使用TRIZOLTM来分离总RNA，并且使用特异于miR-124的引物来进行RT-qPCR。同时，对具有已知量的miR-124的样品进行检定以制作出标准曲线。基于所述结果，鉴定出两个电穿孔程序，其横跨所有重复始终具有最低Ct值。随后，使用100μl杯皿(其中，2μg的总外来体蛋白质(2×108个UC-Exo)和1.0μg miR-124混合在100μl GMP-水平缓冲液(Plasma-Lyte A)中)来确证来自使用所述两个预先选择的程序的初始优化实验的结果，并且再次通过RT-qPCR来检定RNA含量(图16)。暴露于RNA酶揭示，包囊在外来体内保护了miR-124免于降解(图16)。从标准或常态曲线的外推表明，2μg外来体蛋白质(等于2×108个UC-Exo)包含～350ng的miR-124(即，35％的1μg miR-124被加载到外来体中)。这转换为1.75×10-3pg miR-124/UC-Exo或7.6×104个miR-124分子/UC-Exo(分子量：miR-124＝13,857M)。总之，这些研究证明，在一些方面，使用该电穿孔策略可以成功地产生包含充足miR-124的UC-Exo。
如在图22中所显示的，用exomiR-124进行处理显著地减少了GSC267胶质母细胞瘤干细胞的数目。通过使用锥虫蓝排除对活细胞进行计数来检定用BM-MSC-外来体(BM-MSC-Exo)和两个UC-MSC-外来体(UC-MSC-Exo)样品进行处理对于GSC267胶质母细胞瘤细胞系的生存力的效应，比较了单独的外来体(空的外来体)、包含对照miRNA的MSC-Exo(ExomiR对照)和包含miR124a的MSC-Exo(miR-124)(经由慢病毒(BM-MSC-Exo)或电穿孔(UC-MSC-Exo))。
如在图23中所显示的，更高拷贝数的miR124被加载到脐带组织外来体中。对于在BM-MSC-外来体(通过慢病毒产生的)和UC-MSC-外来体(在使用小或大规模电穿孔过程进行电穿孔后)上的miR-124水平获得RT-qPCR结果，采用合适的对照。使用25ng至200ng的miRNA浓度来获得标准曲线(图的右半部分)。在更低的ΔCt(其表明了在外来体中的更高拷贝数的miR124)方面，脐带组织外来体具有最好的结果。
5.在体外将加载有miR的经电穿孔的外来体递送至神经胶质瘤干细胞
为了证明所述电穿孔策略导致有效的Exo-miR-124，进行实验以确证，像BM-Exo-miR-124一样，通过用成熟miR-124模拟物对UC-Exo进行电穿孔而产生的Exo-miR-124能够抑制人神经胶质瘤的生长。特别地，从在GMP条件下在无外来体的培养基中生长的离体培养的UC-MSC的上清液中分离UC-Exo。通过下述方式来按比例扩大产生：混合80μg UC-Exo(80×108个Exo)与40μg的成熟miR-124模拟物(Sigma-Aldrich)(2:1比)，并且使用1ml杯皿在经FDA批准的缓冲液中使用LV系统(Lonza)进行电穿孔。然后，将外来体冷冻至-80℃直至其使用。为了测试功效，用Exo-miR-124、Exo-miR-混杂的(2×108个经加载的外来体/孔；350ng或50nM miR-混杂的或miR-124)、单独的UC-Exo(2×108/孔)或PBS处理GSC-267和GSC8-11(2.5×103/孔)3天，并且在1周后检定细胞生存力(图17A-17D)，模仿了使用BM-Exo-miR-124的实验。所述两种GSC的处理均导致细胞生存力的60-80％降低(p<0.01，图17A-17D)，这表明，在一些方面，通过电穿孔从UC-Exo产生的Exo-miR-124是有效的并且所述产生方法是有效的。
6.对外来体进行电穿孔以加载siRNA
除了用miR对外来体进行加载外，也可以将合成的干扰RNA(siRNA)加载到MSC衍生外来体中。开发出针对FGFR3-TACC3融合的siRNA并且将其加载到外来体中。FGFR3-TACC3融合(F3-T3)已显示出驱动神经胶质瘤生成。在一些方面，使用对于该融合断点的定制siRNA来耗竭F3-T3可以导致F3-T3+GBM的成功抑制。在U87和SNB19系中过表达F3-T3，并且鉴定出两种F3-T3+神经胶质瘤样干细胞(GSC13和231)。改造10种独特的siRNA(iF3T3)，其特别地以变化的重叠程度跨越最常见的F3-T3断点，并且这些siRNA中的7/10被证明降低F3-T3的表达(图18A-18C)。重要的是，这两种融合接点siRNA不耗竭野生型FGFR3或TACC3。iF3T3在F3T3+GBM细胞系中降低细胞生存力。UC-MSC外来体在体外成功地递送了iF3T3，从而导致F3-T3耗竭(图19)。这些研究显示，在一些方面，UC-MSC外来体可以是似乎有理的用于递送iF3T3的载料。
7.施用脐带间充质干细胞衍生外来体以治疗由放射和化学疗法所诱导的毒性
除了UC-Exo将治疗试剂递送至神经胶质瘤的能力外，还证明了UC-MSC减轻由治疗所诱导的CNS毒性的潜力。基于表明外来体能够逆转创伤性脑损伤和炎症的近期证据，在一些方面，在逆转由化学放射疗法所诱导的脑损伤时，用MSC衍生外来体进行治疗可以是与MSC一样有效的。在C57BL/6小鼠中建立了由化学放射疗法所诱导的脑损伤的稳固的临床前模型。特别地，向全小鼠脑递送颅照射至20Gy的总剂量(2Gy/分割x 10个分割)，其中使用具有图像引导的Precision X-射线Xrad225小动物辐照器，以允许用可重复的放射剂量测定法进行每日分割。在颅照射前2小时以33mg/kg的剂量通过经口管饲法给予TMZ。在一个月后，使动物经历一系列的经验证的行为测试：(1)新物体位置识别和Y-迷宫，用于评估学习和记忆，(2)谜箱，用于测量执行功能；和(3)高架零迷宫(elevated zero maze)、强迫游泳和旷场测试，用于评估情绪和运动能力。这些分析一致地显示，化学放射疗法导致降低的认知功能(横跨各行为样式)，而对于情绪或运动功能没有不利影响。通过使用由G.S.Chiu等人,Oncotarget.2018 Oct 30,9(85):35581-97和J.Ma等人,Acta NeuropatholCommun.2018 Oct 1,6(1):103所描述的谜箱来评估执行功能。
使用该模型，概念验证实验揭示，在化学放射疗法后2和4天给予的UC-Exo的IV施用(剂量：Exo1＝0.8×109/150μl，Exo2＝8.8×109/150μl，Exo3＝1.7×1010/150μl)导致在化学放射疗法后1个月认知功能障碍的剂量依赖性逆转(谜箱测试)，其中1.7×1010个外来体/150μl将认知功能改善至对照的80％(图20)。这些数据暗示，在一些实施方案中，UC-Exo在继发于放射和化学疗法的神经认知毒性的治疗中可以是有效的。
＊＊＊
所有在本文中所公开的和所要求保护的方法都可以根据本公开内容来进行制作和施行，而无需过度的实验。虽然已经按照优选的方面描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说将会明显的是，可以对于在本文中所描述的方法和在本文中所描述的方法的步骤中或步骤顺序中施加变化，而不背离本公开内容的构思、精神和范围。更特别地，将会明显的是，某些在化学上和在生理学上都相关的试剂可以替代在本文中所描述的试剂，而将会取得相同或相似的结果。所有此类对于本领域技术人员来说明显的相似的替代和修饰都被认为在本公开内容的精神、范围和构思之内，如由所附的权利要求书所定义的。
序列表
<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM
<120> 治疗性间充质干细胞衍生外来体的产生
<130> MDAC.P1293WO/1001211974
<150> 63/191,202
<151> 2021-05-20
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 1
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<210> 2
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
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gacgtccacc gacgtaaagg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 4
acgtccaccg acgtaaaggc g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
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<220>
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
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<400> 7
tccaccgacg taaaggcgac a 21
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 8
ccaccgacgt aaaggcgaca c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 9
caccgacgta aaggcgacac a 21
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 11
ggacctggac cgtgtcctta ccgtgacgtc caccgacgta aaggcgacac aggaggagaa 60
ccggga 66

Claims (98)

1.产生治疗性外来体的方法，其包括下列步骤：
(a)培养间充质干细胞(MSC)；和
(b)从培养物中收集外来体，
其中，在步骤(a)之前，转染或转导所述MSC以将一种或多种治疗试剂加载到所述MSC中，并且
其中所述外来体从经转染或转导的MSC产生并且包含所述一种或多种治疗试剂。
2.产生治疗性外来体的方法，其包括下列步骤：
(a)培养间充质干细胞(MSC)；
(b)从培养物中收集外来体；和
(c)对所收集的外来体进行电穿孔以将一种或多种治疗试剂加载到所述外来体中。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中培养步骤(a)在特定的CO2、O2和氮浓度或条件存在下发生。
4.权利要求3的方法，其中CO2浓度为5％。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中O2浓度为20％。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中培养步骤(a)在用氮进行平衡的条件下发生。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述MSC来自脐带组织、骨髓、脂肪组织、牙质组织、胎盘组织或其混合物。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述MSC来自脐带组织。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法发生在自动化系统中。
10.权利要求9的方法，其中所述系统被设置成包含通过所述系统的至少一部分连续输注培养基。
11.权利要求9或10的方法，其中所述系统是封闭的或半封闭的。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法发生在生物反应器中。
13.权利要求12的方法，其中所述生物反应器包含多个中空纤维。
14.权利要求13的方法，其中修饰在所述生物反应器内部的一个或多个表面以允许细胞粘附。
15.权利要求14的方法，其中修饰在所述生物反应器内部的所述一个或多个表面以包含一种或多种细胞外基质蛋白质。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞外基质蛋白质为纤连蛋白。
17.权利要求9-16中任一项的方法，其进一步包括从所述系统中提取样品的步骤。
18.权利要求17的方法，其中就所述外来体的一种或多种特征对所述样品进行测试。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中步骤(b)使用缺乏血小板裂解物的培养基。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中步骤(b)使用包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的培养基。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中培养步骤(a)使用包含L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽的培养基。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中培养步骤(a)使用α-MEM培养基、肝素、人血小板裂解物和L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)发生多于一次。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)发生2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中步骤(b)发生多于一次,并且所述收集以大约48小时的间隔发生。
26.权利要求2-25中任一项的方法，其中在步骤(c)中的电穿孔之前将所收集的外来体悬浮在无菌的、等渗的、非致热的缓冲液中。
27.权利要求26的方法，其中所述缓冲液包含Plasma-Lyte A。
28.权利要求2-27中任一项的方法，其中在步骤(c)中对大约1×108至大约10×1012个所收集的外来体进行电穿孔。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为miRNA、siRNA、shRNA、蛋白质、肽、药物、脂质、DNA、RNA或其组合。
30.权利要求29的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为蛋白质、肽、药物和/或脂质，并且其中所述蛋白质、肽、药物和/或脂质的浓度在1μg/mL和1000mg/mL之间。
31.权利要求29或权利要求30的方法，其中所述蛋白质包括抗体或抗体片段。
32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为miRNA，并且其中miRNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。
33.权利要求29-32中任一项的方法，其中所述miRNA包括miR-124、miR-148a、miR-let7i、miR-135a-2、miR-668、miR-942、miR-657。
34.权利要求29-33中任一项的方法，其中所述一种或多种治疗试剂为siRNA、shRNA和/或RNA，并且其中siRNA、shRNA和/或RNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。
35.权利要求29-34中任一项的方法，其中所述siRNA包括针对FGFR3-TACC3基因融合产物的融合断点的siRNA。
36.权利要求29-35中任一项的方法，其中所述DNA包含至多1000个碱基对。
37.权利要求29-36中任一项的方法，其中DNA的浓度在1μg/mL和200μg/mL之间。
38.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述一种或多种治疗试剂的加载效率为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其进一步包括将有效量的所述外来体递送至有此需要的个体的步骤。
40.权利要求39的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体提供针对由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的中枢神经系统毒性的神经保护。
41.权利要求39或权利要求40的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体改善或逆转由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的认知功能障碍和/或神经变性。
42.权利要求40或权利要求41的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
43.权利要求39-42中任一项的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体减轻炎症。
44.权利要求39-43中任一项的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要再生和/或修复的组织提供组织再生和/或组织修复效应。
45.权利要求44的方法，其中所述组织由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。
46.权利要求44或权利要求45的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其中所述组织由于炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合而需要再生和/或修复。
48.权利要求44-47中任一项的方法，其中所述需要再生和/或修复的组织包括软组织、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。
49.权利要求39-48中任一项的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要再生和/或修复的皮肤提供皮肤再生和/或皮肤修复效应。
50.权利要求49的方法，其中所述皮肤由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复。
51.权利要求49或权利要求50的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
52.权利要求49-51中任一项的方法，其中所述皮肤由于皮肤病症而需要再生和/或修复。
53.权利要求49-52中任一项的方法，其中所述皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
54.权利要求39-53中任一项的方法，其中在向有此需要的个体进行递送后，所述外来体向需要伤口愈合的组织或皮肤提供伤口愈合效应。
55.权利要求54的方法，其中所述组织或皮肤由于由一种或多种递送至所述个体的另外的疗法所诱导的毒性而需要伤口愈合。
56.权利要求54或权利要求55的方法，其中所述一种或多种递送至所述个体的另外的疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
57.权利要求54-56中任一项的方法，其中所述组织或皮肤由于组织损伤或皮肤病症而需要伤口愈合。
58.权利要求54-57中任一项的方法，其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
59.权利要求39-58中任一项的方法，其中所述外来体穿过血脑屏障、血瘤屏障或其组合。
60.权利要求39-59中任一项的方法，其中所述外来体在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的有此需要的个体中直接地或间接地治疗免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合，或者免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的一个或多个症状。
61.权利要求60的方法，其中所述一个或多个症状包括中枢神经系统毒性、认知功能障碍、神经变性、炎症、组织变性、组织损害、皮肤损害、伤口、创伤、灼伤或其组合。
62.权利要求60或权利要求61的方法，其中所述免疫病症为自身免疫性病症或同种异体免疫性病症。
63.权利要求62的方法，其中所述免疫病症为移植物抗宿主病。
64.权利要求60或权利要求61的方法，其中所述癌症为实体肿瘤癌症。
65.权利要求64的方法，其中所述癌症为CNS癌症或CNS相关癌症。
66.权利要求64或权利要求65的方法，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
67.权利要求60或权利要求61的方法，其中所述组织损伤为炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
68.权利要求60或权利要求61的方法，其中所述皮肤病症为炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
69.权利要求60或权利要求61的方法，其中所述伤口为组织损伤或皮肤病症的结果，并且其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
70.从权利要求1-37的方法中的任一种所产生的外来体。
71.组合物，其包含权利要求70的外来体。
72.药学组合物，其包含权利要求70的外来体。
73.权利要求72的药学组合物，其进一步包含一种或多种另外的治疗试剂。
74.就免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合对个体进行治疗的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
75.权利要求74的方法，其中所述癌症为实体肿瘤癌症。
76.权利要求75的方法，其中所述癌症为CNS癌症或CNS相关癌症。
77.权利要求75或权利要求76的方法，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
78.权利要求74的方法，其中所述免疫病症为同种异体免疫性病症或自身免疫性病症。
79.权利要求78的方法，其中所述免疫病症为移植物抗宿主病。
80.权利要求74的方法，其中所述组织损伤为炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
81.权利要求74的方法，其中所述皮肤病症为炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合。
82.权利要求74的方法，其中所述伤口为组织损伤或皮肤病症的结果，并且其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合。
83.权利要求74-82中任一项的方法，其进一步包括向所述个体施用对于各自的免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的第二疗法。
84.在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中针对中枢神经系统毒性进行保护的方法，其中所述中枢神经系统毒性由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
85.在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中改善或逆转认知功能障碍和/或神经变性的方法，其中所述认知功能障碍和/或神经变性由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
86.在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中再生和/或修复有此需要的组织的方法，其中所述组织由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
87.在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中再生和/或修复有此需要的皮肤的方法，其中所述皮肤由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要再生和/或修复，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
88.在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合的个体中在有此需要的组织或皮肤中进行伤口愈合的方法，其中所述组织或皮肤由于由一种或多种为了治疗所述免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染、组织损伤、皮肤病症、伤口或其组合而递送至所述个体的疗法所诱导的毒性而需要伤口愈合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
89.权利要求84-88中任一项的方法，其中所述个体所接受的所述一种或多种疗法包括化学疗法、放射疗法或其组合。
90.在具有组织损伤的个体中再生和/或修复有此需要的组织的方法，其中所述组织损伤包括炎症、挫伤、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
91.权利要求86-90中任一项的方法，其中所述需要再生和/或修复的组织包括软组织、脑、肺、脾、肝、心脏、肾、胰腺、肠、睾丸或骨。
92.在具有皮肤病症的个体中再生和/或修复有此需要的皮肤的方法，其中所述皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口或其组合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
93.在具有组织损伤或皮肤病症的个体中在有此需要的组织或皮肤中进行伤口愈合的方法，其中所述组织损伤或皮肤病症包括炎症、衰老、皮肤癌、痤疮、唇疱疹、水疱、血清肿、血肿、溃疡、痈、疣、银屑病、湿疹、蜂窝织炎、狼疮、光化性角化病、毛发角化病、带状疱疹、荨麻疹、黑斑病、脓疱病、晒伤、皮炎、酒渣鼻、热灼伤、化学灼伤、电灼伤、冻伤、皮肤伤口损害、挫伤、切伤、裂伤、深长伤口、撕裂、刺伤、刮伤、擦伤、抓伤、咬伤、螫伤、瘀伤、压迫伤、挤压伤、切口、扭伤、肌腱炎、粘液囊炎、应力性损伤、劳损或其组合，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
94.在具有免疫病症、癌症、心脏疾病、肾疾病、肺疾病、肝疾病、感染或其组合的个体中减轻炎症的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的通过权利要求1-37中任一项的方法所产生的外来体、权利要求71的组合物或者权利要求72-73的药学组合物的步骤。
95.权利要求74-94中任一项的方法，其中所述外来体穿过血脑屏障、血瘤屏障或其组合。
96.权利要求74-95中任一项的方法，其中所述MSC关于所述个体来说是自体的或同种异体的。
97.权利要求74-96中任一项的方法，其中所述外来体经由直肠、颊、阴道、皮下、鼻内、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内或颅内途径，或者经由植入型贮器来进行施用。
98.权利要求74-97中任一项的方法，其中所述外来体与至少一种另外的治疗试剂相联合地进行施用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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MX2022001769A (es) * 2019-08-14 2022-06-09 Codiak Biosciences Inc Construcciones de vesícula extracelular-oligonucleótido antisentido (aso) que se dirigen a la proteína beta de unión al potenciador ccaat (cebp)/beta.

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