CN117642633A - 单细胞蛋白质分析的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于分隔和分析细胞的方法和组合物。所述分隔方法包括将单个细胞包封在微滴中，使得能够在单细胞水平上进行生物分子分析。该概念进一步的是，可以从单个红血细胞量化多种生物标志物，包括可以确定受试者是否已经经历自体血液转移的方法。

Description

单细胞蛋白质分析的方法和系统

交叉引用

本申请要求2021年5月26日提交的美国临时申请号63/193,328的权益，其通过引用并入本文。

政府权利

本发明是在美国国立卫生研究院颁布的授权编号R35 GM122480下在政府支持下完成。美国政府具有本发明的某些权利。

背景技术

许多诊断方法确定样品水平平均值，并因此忽视样品内的亚群体和/或细胞水平变化。例如，无论样品的复杂性或异质性如何，质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫组织学分析经常为每个靶标提供单一丰度值。这样的测量可能忽视从癌症等疾病到体育运动中的兴奋剂的广范围情况。

发明内容

本公开内容的各个方面提供了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子；(b)标记所述至少一种生物分子；和(c)通过降解法测序检测所述至少一种标记的生物分子，检测所述细胞的翻译后修饰水平。本公开内容的一个方面提供了一种方法，其包括：(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；(b)透化所述微滴内的细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子接触后，所述多肽偶联至所述珠子；(c)从所述微滴释放具有与其偶联的多肽的珠子；和(d)鉴定仍然偶联至所述珠子的多肽。本公开内容的一个方面提供了一种方法，其包括：(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；(b)透化所述微滴内的细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子接触后，所述多肽偶联至所述珠子；(c)从所述微滴释放具有与其偶联的多肽的珠子；和(d)使用降解法测序鉴定所述多肽。

本公开内容的一个方面提供了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子，其中所述至少一种生物分子包含第一反应部分；其中所述支持物包含第二反应部分；其中所述第一反应部分和所述第二反应部分形成共价键以形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；(b)将所述缀合物收集到容器中；(c)用至少一种可检测部分标记所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和(d)检测所述至少一种标记的生物分子。

本公开内容的一个方面提供了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种多肽，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种多肽的缀合物；(b)用至少一种可检测部分标记所述至少一种多肽以产生至少一种标记的多肽；和(c)使用降解法测序检测所述至少一种标记的多肽。

在某些实施方案中，所述微滴包含一个细胞和一个支持物。在某些实施方案中，所述微滴是油包水微滴。在某些实施方案中，所述微滴是油包水微滴。在某些实施方案中，所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。在某些实施方案中，所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。在某些实施方案中，所述微滴进一步包含缓冲液。在某些实施方案中，所述至少一种生物分子是多肽。在某些实施方案中，所述至少一种生物分子是细胞内肽或分泌型肽。在某些实施方案中，所述至少一种生物分子是蛋白质。在某些实施方案中，所述至少一种生物分子是细胞内蛋白质或分泌型蛋白质。在某些实施方案中，所述至少一种生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

在某些实施方案中，所述细胞是红血细胞。在某些实施方案中，所述支持物是珠子。在某些实施方案中，所述珠子包含条形码。在某些实施方案中，所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。在某些实施方案中，所述条形码包含非天然氨基酸。在某些实施方案中，所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

在某些实施方案中，所述第一反应部分包含巯基。在某些实施方案中，所述第一反应部分包含半胱氨酸侧链。在某些实施方案中，所述第一反应部分包含组氨酰基侧链。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含吡啶羧基醛。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含马来酰亚胺基团。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含卤代乙酰基基团。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含吡啶基二硫化物。在某些实施方案中，所述支持物包含多个第二反应部分。在某些实施方案中，所述共价键是二硫键。在某些实施方案中，所述共价键是硫醚键。

在某些实施方案中，所述收集包括添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。在某些实施方案中，所述标记包括免疫染色。在某些实施方案中，所述可检测部分包含荧光部分。在某些实施方案中，所述荧光部分包含抗体。在某些实施方案中，所述荧光部分包含荧光染料。在某些实施方案中，所述标记产生多个标记的生物分子。在某些实施方案中，所述检测包含降解法测序。

本公开内容的另一个方面提供了一种包含机器可执行代码的非短暂计算机可读介质，所述机器可执行代码在被一个或多个计算机处理器执行后实现上文或本文别处的任何方法。

本公开内容的另一个方面提供了一种系统，其包含一个或多个计算机处理器和与其偶联的计算机内存。所述计算机内存包含机器可执行代码，所述机器可执行代码在被所述一个或多个计算机处理器执行后实现上文或本文别处的任何方法。

本公开内容的其它情况和优点将从以下详细描述变得对于本领域技术人员而言显而易见，其中仅显示和描述了本公开内容的示例性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其它和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些均不背离本公开内容。因此，附图和说明在性质上应被认为是示例性的，而不是限制性的。

通过引用并入

在本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同明确地且单独地指出每篇单独的公开、专利或专利申请通过引用并入。在通过引用并入的公开和专利或专利申请与在本说明书中含有的公开内容矛盾的情况下，本说明书意图替代和/或优先于任何这样的矛盾材料。

附图说明

在所附权利要求书中具体阐述本发明的特征。通过参考阐述示例性实施方案(其中利用了本发明的原理)的下述详细说明和附图(在本文中也称作“附图”和“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中：

图1提供了微流体连接部的显微镜图像，其中油包水微滴平均而言在一个细胞和一个珠子周围形成。

图2提供了适合于本公开方法的红血细胞201和珠子202的显微镜图像。203示出了抗生蛋白链菌素珠子的马来酰亚胺官能化。

图3示出了用于鉴定来自单个细胞的生物分子水平的测定的方案。

图4示出了反应位点和捕获部分402官能化的珠子，以及描绘在非捕获部分官能化的珠子404和捕获部分官能化的珠子405上的绿色荧光蛋白(GFP)捕获的荧光显微镜图像。

图5A-5D示出了在本公开方法中使用的微流体芯片的设计。图5A示出了制造的微流体芯片，其保持在正常尺寸的计算机键盘上方用于比例；图5B提供了在微流体芯片中的4路连接部处形成的油包水微滴的图像；图5C提供了图5B的4路连接部的进一步图像，其中可以在微滴505中辨别出珠子506；图5D提供了用于形成平均而言包含一个细胞和一个珠子的微滴的双4路连接部示意图。

图6概述了多个HbA1c珠子校准物组的内容。

图7A-7C描绘了具有不同的红血细胞HbA1c:HbA比率(底部图)的两个单独的人群(顶部)。图7C显示了来自图7A的人群的具有低HbA1c水平的血液与来自图7B的人群的具有高HbA1c水平的血液的混合物的HbA1c测量结果。

图8示出了被编程或以其它方式构造为实现本文提供的方法的计算机系统。

具体实施方式

尽管本文已经显示和描述了本发明的各种实施方案，但是本领域技术人员将显而易见，这样的实施方案仅作为示例提供。本领域技术人员可以想到许多变化、改变和/或替换而不脱离本发明。应当理解，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。

虽然许多情况表现为亚群体水平畸变，例如影响受试者中特定类型细胞中的不超过10％、1％或0.1％，但监测单细胞水平的变化超出了许多诊断方法的当前限制。因此，需要用于分离和/或测量单细胞内容物的新策略来满足个性化诊断监测的日益增长的需求。本文公开了方法和/或系统，其涉及测量从样品获得的亚群体细胞中分析物(例如，生物分子)的量或表达水平，而不是测量样品中分析物的总体量或平均表达水平。本文公开的方法和/或系统还可以测量从样品获得的亚群体细胞中的多种分析物(例如，生物分子)的量或表达水平的比率。

定义

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等价于大于或等于1、大于或等于2、或大于或等于3。

每当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”位于一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等价于小于或等于3、小于或等于2、或小于或等于1。

本文中使用的术语“生物分子”通常表示与细胞相关的任何生物分子。在某些实施例中，生物分子是细胞的细胞内分子、细胞的分泌型生物分子或细胞的代谢物。在某些实施例中，生物分子是肽。在某些实施例中，生物分子是蛋白质。在某些实施例中，生物分子是细胞的细胞内蛋白质、细胞的分泌型蛋白质或细胞的蛋白质代谢物。在某些实施例中，生物分子是细胞的细胞内肽、细胞的分泌型肽、或细胞的肽代谢物。

在本文中互换使用的术语“多肽”和“肽”通常表示包含氨基酸的聚合物，其中氨基酸可以通过肽键与另一个氨基酸连接。在某些实施例中，多肽是蛋白质。氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸类似物)。所述多肽可以是直链的或支链的。所述多肽可以包括经修饰的氨基酸。所述多肽可以被非氨基酸中断。多肽可以作为单链或相关链存在。所述多肽可以包括多个氨基酸。所述多肽可以具有二级和三级结构(例如，所述多肽可以是蛋白质)。在某些实施例中，所述多肽包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000个或更多个氨基酸。所述多肽可以是较大聚合物的片段。在某些实施例中，所述多肽是较大多肽的片段，诸如蛋白质的片段。

本文中使用的术语“氨基酸”通常表示天然存在的或非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸类似物)。非天然存在的氨基酸可以是经工程改造的或合成的氨基酸。氨基酸可以含有“侧链”，它可以将氨基酸类型彼此区分开。

本文中使用的术语“氨基酸序列”、“肽序列”和“多肽序列”通常表示共价连接(例如，通过肽(酰胺)键或肽键的类似物)的至少两个氨基酸或氨基酸类似物的序列。肽序列可以表示完整序列或序列的一部分。例如，肽序列可以含有缺口、未知特性(identity)的位置或可以适应不同物种的位置。

本文中使用的术语“侧链”通常表示连接至α碳(连接氨基酸的胺和/或羧酸基团)的结构，其对于每种类型的氨基酸可以是独特的。侧链可以具有特定的形状、大小、电荷、反应性或其组合。侧链可以含有碱性部分(例如，精氨酸中的胍基基团)、酸性部分(例如，天冬氨酸中的羧酸)、极性部分(例如，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸中的羟基基团)、疏水部分(例如，亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸中的烷基基团)或其任何组合。在某些情况下，一个氨基酸含有超过一个侧链。所述侧链可以是或包括氢、烷基基团、羟基基团、芳基基团、杂芳基基团、羧酸、酰胺、胺、胍、硫醇、硫醚、硒醇或其任何组合。在某些情况下，所述侧链是氢(具有氢侧链的氨基酸可以是例如甘氨酸)。

本文中使用的术语“Edman降解”通常表示使用异硫氰酸酯(例如，异硫氰酸苯酯)从多肽的N-端末端除去氨基酸的方法。Edman降解可以与各种多肽测序和/或分析方法偶联。可以依次执行Edman降解。

本文中使用的术语“阵列”通常表示位点群。这样的位点群可以根据相对位置而彼此区分。位于阵列的不同位点的不同分子可以根据位点在阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个位点可以包括特定类型的一个或多个分子。例如，位点可以包括具有特定序列的单个多肽，或者位点可以包括具有相同序列的几个多肽。阵列的位点可以是位于同一基底上的不同特征。这样的特征可以包括但不限于在基底中的孔、在基底中或基底上的珠子(或其它颗粒)、从基底的突起、在基底上的脊或在基底中的通道。阵列的位点可以是单独的基底，每个基底承载至少一种分子。根据基底在与基底相关联的表面上的位置或者根据基底在液体或凝胶中的位置，可以鉴定附着到单独基底的不同分子。这样的不同的分子可以具有相同的或不同的序列。阵列可以包括一个或多个孔，并且一个或多个孔中的一个孔可以具有一个或多个珠子。作为一个替代方案，所述阵列可以是具有例如固定化在其上的分子的平面表面，或者作为另一个实施例，具有例如固定化在其上的一个或多个珠子的平面表面。

本文中使用的术语“标记”通常表示可以偶联至反应基团的分子或大分子构建体。所述标记可以包含至少一个反应基团(例如，第一反应基团和第二反应基团)。所述至少一个反应基团可以被构造成偶联至多肽。所述至少一个反应基团可以被构造成偶联至支持物。所述至少一个反应基团可以被构造成偶联至报告部分。标记可以提供可测量的信号。

本文中使用的术语“聚合物基质”通常表示包含至少一种聚合物的(例如，连续的)相材料。在某些实施方案中，所述聚合物基质表示至少一种聚合物以及未被聚合物占据的间隙空间。聚合物基质可以由一种或多种类型的聚合物组成。聚合物基质可以包括直链、支链和/或交联的聚合物单元。聚合物基质还可以含有插入在其未被聚合物链占据的间隙空间内的非聚合物物质。插入的物质可以是固体、液体或气体物质。例如，术语“聚合物基质”可以涵盖干燥的水凝胶、水合的水凝胶和/或含有玻璃纤维的水凝胶。

本文中使用的术语“报告部分”通常指产生可测量信号的试剂。这样的信号可以包括但不限于荧光(例如，染料)、可见光、移动(例如，质量标签)、辐射或核酸序列(例如，条形码)。这样的信号可以包括但不限于荧光、磷光或辐射。这样的信号可以是光(或电磁辐射)。所述光可以包括在电磁光谱的可见部分中的频率或频率分布。例如，所述光可以是红外线或紫外线。所述信号可以是静电、传导或阻抗信号。所述信号可以是电荷。“报告物”可以包含“报告部分”。所述报告物可以包含反应基团。所述反应基团可以被构造成偶联至标记。

本文中使用的“降解法测序”表示一种用于分析生物分子的方法，所述方法包括：(a)提供多肽，其中所述多肽包含至少一个标记的内部氨基酸；(b)检测来自所述多肽的至少一个信号或信号变化以鉴定所述多肽的序列的至少一部分；和(c)使所述多肽处于足以从所述多肽除去至少一个氨基酸的条件。在某些实施方案中，所述多肽被固定化至支持物。在某些实施方案中，从所述多肽的N-端除去至少一个氨基酸。在某些实施方案中，在(c)之后，所述至少一个标记的内部氨基酸变成标记的末端氨基酸。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸来自多个标记的氨基酸，其中至少一个信号或信号变化包含来自所述多个标记的氨基酸的共同信号。在某些实施方案中，所述多个标记的氨基酸包含具有不同标记的氨基酸。在某些实施方案中，所述不同标记产生具有不同信号模式的信号。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸包含一个或多个选自赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组的成员。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸包含具有与其共价地连接的标记的氨基酸，所述标记产生所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸包含具有与其偶联的染料的氨基酸，所述染料产生所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化是光学信号。

在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化包含不同强度的多个信号。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化包含不同频率或频率范围的多个信号。在某些实施方案中，通过降解反应从所述多肽除去所述至少一个氨基酸。在某些实施方案中，所述降解反应是Edman降解。在某些实施方案中，用具有单分子灵敏度的光学检测器检测所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，在某些实施方案中，所述方法进一步包括相对于参考序列处理所述序列的至少一部分以鉴定所述多肽或衍生出所述多肽的蛋白质。在某些实施方案中，所述方法进一步包括，在(c)之后，(i)鉴定所述多肽的序列的至少部分以鉴定所述多肽，和(ii)使用在(i)中鉴定的多肽来量化所述多肽或衍生出所述多肽的蛋白质。在某些实施方案中，在(a)中，所述多肽的少于所有氨基酸被标记。在某些实施方案中，所述方法进一步包括(i)重复(b)和(c)以检测来自所述多肽的至少一个另外信号或信号变化和(ii)使用所述至少一个信号或信号变化和所述至少一个另外信号或信号变化来鉴定所述序列的所述至少部分。

本文中使用的术语“荧光”表示由已经吸收了不同波长的光的物质发射的可见光。在某些实施方案中，荧光提供基于特定波长的荧光发射来跟踪和/或分析生物分子的非破坏性方法。蛋白质(包括抗体)、肽、核酸、寡核苷酸(包括单链和双链引物)可以用被称为荧光团的多种外源荧光分子“标记”。荧光素的异硫氰酸酯衍生物，诸如羧基荧光素，是可以缀合至蛋白质(诸如用于免疫组织化学的抗体)或核酸的荧光团的一个例子。在某些实施方案中，荧光素可以缀合至核苷三磷酸和掺入核酸探针(诸如”荧光缀合的引物”)中用于原位杂交。在某些实施方案中，缀合至羧基荧光素的分子被称为“FAM标记的”。

本文中使用的“在单分子水平”的肽测序表示从不同肽分子的混合物中的单个(即单独)肽分子获得的氨基酸序列信息。本公开内容不必限于其中从单个肽分子获得的氨基酸序列信息是单个肽分子的完整或连续氨基酸序列的方法。在某些实施方案中，获得仅部分氨基酸序列信息就足够，从而允许鉴定肽或蛋白质。部分氨基酸序列信息，包括例如在单个肽分子内的特定氨基酸残基(即赖氨酸)的模式可能足以独特地鉴定单个肽分子。例如，可以对照给定生物体的已知蛋白质组来搜索氨基酸模式，诸如X-X-X-Lys-X-X-X-X-Lys-X-Lys，其指示在个别肽分子内的赖氨酸分子的分布，以鉴定所述个别肽分子。在单分子水平上肽的测序无意限于鉴定在个别肽分子中的赖氨酸残基模式；任何氨基酸残基(包括多个氨基酸残基)的序列信息可以用于鉴定不同肽分子的混合物中的个别肽分子。

本文中使用的“单分子分辨率”表示从不同肽分子的混合物中的个别肽分子获取数据(包括，例如，氨基酸序列信息)的能力。在一个非限制性实施例中，可以将多种肽分子的混合物固定化在固体表面上(包括，例如，载玻片或其表面已经被化学修饰的载玻片)。在一个实施方案中，这可以包括同时记录分布在玻璃表面上的多个个别(即单个)肽分子的荧光强度的能力。可以以这种方式应用的光学装置是商购可得的。例如，可得到配备全内反射照明和增强电荷耦合器件(CCD)检测器的显微镜。使用高灵敏度CCD照相机的成像允许仪器同时记录分布在表面上的多个个别(即单个)肽分子的荧光强度。在一个实施方案中，可以使用图像分离器执行图像采集，所述图像分离器引导光穿过两个带通滤波器(每个适合一种荧光分子)，以在CCD表面上记录为两个并排图像。使用带有自动聚焦控制的电动显微镜载物台对流动池中的多个载物台位置成像，可以允许在一个实验中对数百万个单个的个别肽(或更多肽)进行测序。

本文中使用的术语“共同信号”表示由附着至个别肽分子的第一和第二标记产生的组合信号。本文中使用的术语“实验周期”表示一轮单分子测序，包括单个氨基酸残基的Edman降解，随后是荧光强度的TIRF测量。

本文中使用的术语“赫兹”或“Hz”表示形成分隔的速率。在某些实施方案中，所述分隔是形成油包水微滴。在某些实施方案中，所述分隔是形成水包油微滴。在某些实施方案中，在本公开内容中的分隔物可以以Hz或分隔物/秒为单位形成。在某些实施方案中，在本公开内容中的微滴可以以Hz或分隔物/秒为单位形成。

用于分离细胞的方法和系统

本文公开了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；(b)将所述缀合物收集到容器中；(c)用至少一种可检测部分标记所述容器中的所述缀合物的所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和(d)检测所述至少一种标记的生物分子。本文公开了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子，其中所述至少一种生物分子包含第一反应部分；其中所述支持物包含第二反应部分；其中所述第一反应部分和所述第二反应部分形成共价键以形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；(b)将所述缀合物收集到容器中；(c)用至少一种可检测部分标记所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和(d)检测所述至少一种标记的生物分子。

本文公开了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种多肽，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；(b)用至少一种可检测部分标记所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和(c)使用降解法测序检测所述至少一种标记的生物分子。本文公开了一种方法，其包括：(a)将生物样品分类以提取细胞的亚集；(b)在微滴中使来自所述细胞亚集的至少一种生物分子与支持物接触，其中所述细胞包含所述至少一种生物分子，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；(c)在所述接触之后，将所述缀合物收集到容器中；(d)在所述收集之后，用至少一种可检测部分标记所述容器中的所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和(e)检测所述至少一种可检测部分。本文公开了一种组合物，其包含：(a)至少一种多肽；和(b)单独支持物，其中所述至少一种生物分子和所述单独支持物通过共价键偶联在一起，且其中所述至少一种生物分子和所述单独支持物被包封在微滴中。

本文公开了一种方法，其包括：(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；(b)透化所述微滴内的所述细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子发生接触后，所述多肽偶联至所述珠子；(c)从所述微滴释放具有与其偶联的所述多肽的所述珠子；和(d)鉴定仍然偶联至所述珠子的所述多肽。本文公开了一种方法，其包括：(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；(b)透化所述微滴内的所述细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子发生接触后，所述多肽偶联至所述珠子；(c)从所述微滴释放具有与其偶联的所述多肽的所述珠子；和(d)使用降解法测序鉴定所述多肽。本文公开了一种方法，其包括：(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子；(b)标记所述至少一种生物分子；和(c)通过降解法测序检测所述至少一种标记的生物分子，从而检测所述细胞的翻译后修饰水平。

本公开内容的各种实施方案提供了用于分开或分离样品的物质或部分的方法。在许多情况下，这样的分开或分离包括收集在分隔物内的样品的物质或部分。在某些实施方案中，可以将样品的物质或部分分离成微滴。在某些情况下，可以将样品的物质或部分分离到孔、微孔、乳液内的连续相、试管、点、隔室或胶囊中。

在某些情况下，分隔物可以将物质与其环境分离。在某些情况下，隔离物可以将样品的一部分与其环境分离。例如，分隔物可以包含防止物质从分隔物流入或流出的固体屏障(例如，试管壁)。分隔物还可以将样品的物质或部分与其环境部分地分离。在某些实施方案中，分隔物可以是油包水微滴，其中油微滴的外层是蛋白质不可渗透的，但溶剂分子和/或小分析物可以通过其扩散。作为另一个例子，油包水微滴可以防止大物质(例如，外核体和/或蛋白质)和/或带电物质的扩散，同时允许小物质(诸如类固醇和/或聚酮化合物)的扩散。

在各种情况下，本公开内容的方法包括分隔、分离或分开感兴趣的细胞或生物物质。所述感兴趣的细胞或生物物质可以源自包含多个细胞或生物物质的样品，并且所述分隔、分离或分开可以从所述样品中分开或分离所述细胞或所述生物物质。在某些情况下，分隔物可以包含细胞。在某些情况下，分隔物可以包含感兴趣的生物物质。在某些情况下，分隔物可以包含捕获试剂，诸如捕获部分官能化的珠子。在某些情况下，分隔物可以包含多种捕获试剂，诸如多个捕获部分官能化的珠子。分隔物可以包含感兴趣的细胞或生物物质和/或捕获试剂(例如，珠子)。在某些情况下，用试剂(例如，用于细胞或核裂解的试剂；或用于生物分子检测的试剂)来分隔感兴趣的细胞或生物物质。在某些情况下，在没有试剂的情况下分隔感兴趣的细胞或生物物质。

在某些实施方案中，分隔物或微滴可以被包含在液体培养基内。在某些实施方案中，所述微滴可以是悬浮于水溶液中的油包水微滴。在某些实施方案中，油包水微滴可以悬浮于水溶液中以形成乳液。

根据本公开内容的用于微滴产生的方法包括流动聚焦(例如，微流体流动聚焦或流体动力学流动聚焦)、共同流动微滴形成、横向流动微滴形成、微滴融合和/或微滴分裂。例如，可以通过将油注射(例如，通过喷嘴)进水中来产生油包水微滴。可以使用微流体或纳流体流动装置来产生微滴。在这样的情况下，例如通过将第一液体注入或流入第二液体中，可以在两个或更多个通道之间的汇合处(例如，连接部)产生微滴。在某些情况下，试剂通过第一通道流入连接部，并且细胞通过第二通道流过连接部。在某些情况下，试剂通过第一通道流入连接部，细胞通过第二通道流过连接部，和/或微滴介质(例如，油)通过第三通道流入连接部。在某些情况下，连接部包含成熟的微滴可以流过的流出通道。在某些实施方案中，可以通过流体速度和/或通道尺寸来控制微滴的尺寸。在某些情况下，使含有细胞的微滴与含有珠子的微滴合并以形成含有细胞和珠子的微滴。

在某些情况下，可以使用一个流体通道或多个流体通道来形成微滴。在某些情况下，所述微滴在多个通道的汇合点处形成。在某些情况下，所述流体通道的直径可能影响微滴的尺寸。在某些情况下，流体通道包含从约10μm至约100μm、从约100μm至约150μm、从约150μm至约200μm、从约200μm至约250μm、从约250μm至约300μm、从约300μm至约350μm、从约350μm至约400μm、从约400μm至约450μm、从约450μm至约500μm、从约500μm至约600μm、从约600μm至约700μm、从约700μm至约800μm、从约800μm至约900μm或从约900μm至约1000μm的直径。在某些情况下，流体通道包含至少约1000μm、至少约750μm、至少约500μm、至少约400μm、至少约300μm、至少约200μm、至少约100μm、至少约50μm、至少约25μm或至少约10μm的直径。在某些情况下，流体通道包含约1000μm、约750μm、约500μm、约400μm、约300μm、约200μm、约100μm、约50μm、约25μm或约10μm的直径。在某些情况下，流体通道包含至多约1000μm、至多约750μm、至多约500μm、至多约400μm、至多约300μm、至多约200μm、至多约100μm、至多约50μm、至多约25μm或至多约10μm的直径。

可以以多种速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约5Hz至约1,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约5Hz至约50Hz、从约50Hz至约100Hz、从约100Hz至约150Hz、从约150Hz至约200Hz、从约200Hz至约250Hz、从约250Hz至约300Hz、从约300Hz至约350Hz、从约350Hz至约400Hz、从约400Hz至约450Hz、从约450Hz至约500Hz、从约500Hz至约600Hz、从约600Hz至约700Hz、从约700Hz至约800Hz、从约800Hz至约900Hz、或从约900Hz至约1,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至少约5Hz、至少约50Hz、至少约100Hz、至少约150Hz、至少约200Hz、至少约250Hz、至少约300Hz、至少约350Hz、至少约400Hz、至少约450Hz、至少约500Hz、至少约550Hz、至少约600Hz、至少约650Hz、至少约700Hz、至少约750Hz、至少约800Hz、至少约850Hz、至少约900Hz、至少约950Hz或至少约1,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约5Hz、约50Hz、约100Hz、约150Hz、约200Hz、约250Hz、约300Hz、约350Hz、约400Hz、约450Hz、约500Hz、约550Hz、约600Hz、约650Hz、约700Hz、约750Hz、约800Hz、约850Hz、约900Hz、约950Hz或约1,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约5Hz、至多约50Hz、至多约100Hz、至多约150Hz、至多约200Hz、至多约250Hz、至多约300Hz、至多约350Hz、至多约400Hz、至多约450Hz、至多约500Hz、至多约550Hz、至多约600Hz、至多约650Hz、至多约700Hz、至多约750Hz、至多约800Hz、至多约850Hz、至多约900Hz、至多约950Hz或至多约1,000Hz的速率执行所述分隔。

可以以多种速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约1,000Hz至约100,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约1,000Hz至约5,000Hz、从约5,000Hz至约10,000Hz、从约10,000Hz至约25,000Hz、从约25,000Hz至约50,000Hz、从约50,000Hz至约75,000Hz、或从约75,000Hz至约100,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约1,000Hz至约5,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约25,000Hz至约50,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以从约75,000Hz至约100,000Hz的速率执行所述分隔。

在某些实施方案中，以至少约1,000Hz、至少约5,000Hz、至少约10,000Hz、至少约25,000Hz、至少约50,000Hz、至少约75,000Hz、或至少约100,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至少约5,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至少约20,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至少约40,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至少约60,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至少约80,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约1,000Hz、至多约5,000Hz、至多约10,000Hz、至多约25,000Hz、至多约50,000Hz、至多约75,000Hz、或至多约100,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约5,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约20,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约40,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约60,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以至多约80,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约1,000Hz、约5,000Hz、约10,000Hz、约25,000Hz、约50,000Hz、约75,000Hz、或约100,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约5,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约20,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约40,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约60,000Hz的速率执行所述分隔。在某些实施方案中，以约80,000Hz的速率执行所述分隔。

可以将生物物质(例如细胞)或捕获试剂加入微滴中，例如通过使微滴与包含细胞和/或捕获试剂的流体接触。在某些实施方案中，所述捕获试剂是珠子。可以在多个位置(例如，多个产生微滴的连接部)执行所述分隔。所述分隔可以导致一定范围的分隔物占据水平。一种分隔方法可以产生多个分隔物，其中一个亚集可以包含刚好一个细胞和刚好一个珠子。可以控制细胞或捕获试剂向微滴的添加，使得所述微滴包含预定数目的细胞和/或捕获试剂。在某些情况下，细胞和捕获试剂向微滴的添加导致从约30％至约40％、从约40％至约50％、从约50％至约60％、从约60％至约70％、从约70％至约80％、从约80％至约85％、从约85％至约90％、从约90％至约95％或从约95％至约99.5％的含有至少一个细胞和一个捕获试剂的微滴包含刚好一个细胞和刚好一个捕获试剂。在某些情况下，细胞和捕获试剂向微滴的添加导致至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的含有至少一个细胞和一个捕获试剂的微滴包含刚好一个细胞和刚好一个捕获试剂。在某些情况下，细胞和捕获试剂向微滴的添加导致约30％、约35％约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或约99.5％的含有至少一个细胞和一个捕获试剂的微滴包含刚好一个细胞和刚好一个捕获试剂。在某些情况下，细胞和捕获试剂向微滴的添加导致至多约30％、至多约35％、至多约40％、至多约45％、至多约50％、至多约55％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约98％、至多约99％或至多约99.5％的含有至少一个细胞和一个捕获试剂的微滴包含刚好一个细胞和刚好一个捕获试剂。

在某些情况下，细胞和捕获试剂向微滴的添加导致至多约10％、至多约5％、至多约1％、至多约0.1％、至多约0.01％或少于0.001％的微滴含有超过两个细胞或超过两个捕获试剂。

在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过约45％、超过约50％、超过约55％、超过约60％、超过约65％、超过约70％、超过约75％、超过约80％、超过约85％、超过约90％、超过约95％、超过约98％、超过约99％、超过约99.5％、超过约99.75％或超过约99.99％的微滴含有至少一个细胞和至少一个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致超过约70％、超过约75％、超过约80％、超过约85％、超过约90％、超过约95％、超过约98％、超过约99％、超过约99.5％、超过约99.75％或超过约99.99％的微滴含有刚好一个细胞和刚好一个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致超过约80％的微滴含有至少一个细胞和至少一个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致超过约90％的微滴含有至少一个细胞和至少一个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致超过约80％的微滴含有刚好一个细胞和刚好一个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致超过约90％的微滴含有刚好一个细胞和刚好一个珠子。

在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致约10％、约5％、约1％、约0.1％、约0.01％或约0.001％的微滴含有超过两个细胞和/或超过两个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致至多约5％的微滴含有超过两个细胞和/或超过两个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致至多约10％、至多约5％、至多约1％、至多约0.1％、至多约0.01％或至多约0.001％的微滴含有超过两个细胞和/或超过两个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致至多约5％的微滴含有超过两个细胞和/或超过两个珠子。在某些情况下，用于形成微滴的方法可以导致至多约1％的微滴含有超过两个细胞和/或超过两个珠子。在某些情况下，仅形成的微滴的亚集将含有至少一个细胞和至少一个珠子。

图1提供了在流动聚焦连接部处形成的油包水微滴的图像。将珠子从顶部流动流引入油流，并且将红血细胞(RBC)从底部连接部引入油流。油包水微滴在连接部处形成并包含红血细胞和珠子。图2显示了红血细胞201和抗生蛋白链菌素官能化的珠子202的100×DIC(微分干涉差)显微图像，所述珠子202通过在抗生蛋白链菌素官能化的珠子的表面上的生物素接头203偶联至马来酰亚胺捕获试剂。

在某些情况下，分隔物可以是微滴。在某些实施方案中，微滴可以包含细胞和支持物。在某些实施方案中，所述微滴可以是油包水微滴。在某些实施方案中，所述微滴可以进一步包含细胞裂解试剂。在某些实施方案中，所述细胞裂解试剂是细胞裂解溶液。在某些实施方案中，所述细胞裂解溶液是低渗的细胞裂解溶液。在某些实施方案中，所述细胞裂解试剂可以包含聚氧乙烯山梨醇酯(例如，吐温)、2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇(例如，Triton X-100)和/或十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些实施方案中，所述微滴可以进一步包含缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液可以是磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷或磷酸盐缓冲盐水。

在某些情况下，分隔物(例如，微滴)的尺寸可以大于珠子、细胞、感兴趣的生物物质、试剂和/或缓冲液的组合宽度或体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约15nm至约5μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约15nm至约50nm、从约50nm至约100nm、从约100nm至约250nm、从约250nm至约500nm、从约500nm至约750nm、从约750nm至约1μm、从约1μm至约3μm或从约3μm至约5μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约100nm至约500nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约500nm至约1μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约1μm至约3μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约3μm至约5μm的平均直径。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约15nm、至少约50nm、至少约100nm、至少约250nm、至少约500nm、至少约750nm、至少约1μm、至少约2μm、至少约3μm、至少约4μm或至少约5μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约250nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约500nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约1μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约2μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约3μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约4μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约5μm的平均直径。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约15nm、至多约50nm、至多约100nm、至多约250nm、至多约500nm、至多约750nm、至多约1μm、至多约2μm、至多约3μm、至多约4μm或至多约5μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约250nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约500nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约1μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约2μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约3μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约4μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约5μm的平均直径。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约15nm、约50nm、约100nm、约250nm、约500nm、约750nm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm或约5μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约250nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约500nm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约1μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约2μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约3μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约4μm的平均直径。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约5μm的平均直径。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约0.5pL至约50pL、从约50pL至约100pL、从约100pL至约150pL、从约150pL至约200pL、从约200pL至约250pL、从约250pL至约300pL、从约300pL至约350pL、从约350pL至约400pL、从约400pL至约450pL、从约450pL至约500pL、从约500pL至约550pL、从约550pL至约600pL、从约600pL至约650pL、从约650pL至约700pL或从约700pL至约750pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约0.5pL至约250pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约250pL至约500pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有从约500pL至约750pL的平均体积。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约0.5pL、至少约50pL、至少约100pL、至少约150pL、至少约200pL、至少约250pL、至少约300pL、至少约350pL、至少约400pL、至少约450pL、至少约500pL、至少约550pL、至少约600pL、至少约650pL、至少约700pL或至少约750pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约50pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约100pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约150pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约200pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至少约500pL的平均体积。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约0.5pL、至多约50pL、至多约100pL、至多约150pL、至多约200pL、至多约250pL、至多约300pL、至多约350pL、至多约400pL、至多约450pL、至多约500pL、至多约550pL、至多约600pL、至多约650pL、至多约700pL或至多约750pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约50pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约100pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约150pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约200pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有至多约500pL的平均体积。

在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约0.5pL、约50pL、约100pL、约150pL、约200pL、约250pL、约300pL、约350pL、约400pL、约450pL、约500pL、约550pL、约600pL、约650pL、约700pL或约750pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约50pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约100pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约150pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约200pL的平均体积。在某些实施方案中，分隔物(例如，微滴)可以具有约500pL的平均体积。

生物分子

在某些情况下，在分隔或分离之前在流体装置内对细胞进行分选。在某些情况下，使用按大小分离细胞的技术对细胞进行分选。在某些情况下，使用通过区分物理性质来分离细胞的技术对细胞进行分选。在某些情况下，使用离心可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用荧光活化的细胞分选(FACS)可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用浮力活化的细胞分选(BACS)可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用基于磁性的细胞分选可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用荧光活化的细胞分选可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用粘附可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用过滤可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用沉降可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用密度梯度介质进行离心，可以分选包含多个细胞的样品。在某些情况下，使用过滤可以分选包含多个细胞的样品。例如，可以在细胞分隔成微滴之前从全血级分中选择红血细胞。

在某些实施方案中，生物分子是细胞内肽。在某些实施方案中，生物分子是细胞内蛋白质。在某些实施方案中，生物分子是分泌型肽。在某些实施方案中，生物分子是分泌型蛋白质。在某些实施方案中，所述生物分子是通过翻译后修饰引入的生物分子。在某些实施方案中，所述生物分子是通过酶反应引入的生物分子。在某些实施方案中，所述生物分子是指示疾病的生物标志物。在某些实施方案中，所述生物分子是指示健康状况的生物标志物。在某些实施方案中，所述生物分子可以选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。在某些实施方案中，所述生物分子是氧化的蛋白质。在某些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白质。在某些实施方案中，所述生物分子是HbA。在某些实施方案中，所述生物分子是血红蛋白A1c(HbA1c)。

肿瘤异质性(即，含有癌细胞以及健康细胞的混合物的肿瘤组织的物理状态)使得蛋白质诊断和治疗干预具有挑战性。每个单独细胞的蛋白质组或蛋白质组亚集的图谱分析会提供鉴定出现在肿瘤组织中的不同细胞的数目和类型的信息。在某些实施方案中，蛋白质突变可以与癌症的存在相关联。在某些实施方案中，所述突变的蛋白质是KRAS蛋白质。在某些实施方案中，本公开内容的方法可以用于检测蛋白质突变的存在以鉴定癌症。在某些实施方案中，本公开内容的方法可以用于检测蛋白质突变的不存在以鉴定癌症。在某些实施方案中，使用本公开内容的方法可以检测细胞内蛋白质靶标。在某些实施方案中，所述细胞内蛋白质靶标是激酶。在某些实施方案中，所述激酶是原癌基因酪氨酸-蛋白质1(ROS1)激酶。在某些实施方案中，所述激酶是促分裂原活化蛋白质激酶(MAPK)。

捕获试剂

本公开内容的各个方面提供了包括用捕获试剂分隔单个细胞的方法。在某些实施方案中，捕获试剂可以包含珠子、聚合物基质、纳米棒、纳米点、基于蛋白质的纳米结构(例如，蛋白质纳米颗粒)、二氧化硅点、基于核酸的纳米结构、脂质体或其任何组合。在某些实施方案中，捕获试剂包含珠子。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有球形形状。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有非球形形状(例如，立方体形状)。在某些实施方案中，捕获试剂可以包含平坦表面。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有不均匀的尺寸。在某些实施方案中，捕获试剂可以包含脊、凹槽、凹痕、突起或其它复杂的表面特征。在某些实施方案中，捕获试剂可以是多孔的。在某些实施方案中，捕获试剂可以是无孔的。

捕获试剂可以包含珠子(例如，颗粒)。珠子可以是例如大理石、聚合物珠子、二氧化硅珠子、官能化的珠子、磁珠、活化的珠子、条形码化的珠子、标记的珠子、PCA珠子、磁珠或其任何组合。在某些实施方案中，珠子可以是聚合物珠子，例如，多糖珠子、纤维素珠子、合成的聚合物珠子或天然的聚合物珠子。在某些实施方案中，珠子可以是磁珠，例如，超顺磁的氧化铁纳米颗粒(SPION)。

符合本公开内容的珠子包括胶束、脂质体、金属珠子、金属氧化物珠子、无机氧化物珠子、氧化铁珠子、银珠子、金珠子、钯珠子、铂珠子、钛珠子、二氧化硅珠子、共聚物珠子、三元共聚物珠子、具有金属核心的聚合物珠子、具有金属氧化物核心的聚合物珠子、聚苯乙烯磺酸酯珠子、聚氧化乙烯珠子、聚氧乙烯二醇珠子、聚乙烯亚胺珠子、聚乳酸珠子、聚己内酯珠子、聚乙醇酸珠子、聚(丙交酯-共-乙交酯)聚合物珠子、纤维素醚聚合物珠子、聚乙烯吡咯烷酮珠子、聚乙酸乙烯酯珠子、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物珠子、聚乙烯醇珠子、丙烯酸酯珠子、聚丙烯酸珠子、巴豆酸共聚物珠子、聚乙烯膦酸酯珠子、聚亚烷基珠子、羧基乙烯基聚合物珠子、海藻酸钠珠子、角叉菜胶珠子、黄原胶珠子、金合欢胶珠子、阿拉伯胶珠子、瓜尔胶珠子、普鲁兰多糖珠子、琼脂珠子、甲壳质珠子、壳聚糖珠子、果胶珠子、卡拉牙胶珠子、槐豆胶珠子、麦芽糊精珠子、直链淀粉珠子、玉米淀粉珠子、马铃薯淀粉珠子、米淀粉珠子、木薯淀粉珠子、豌豆淀粉珠子、甘薯淀粉珠子、大麦淀粉珠子、小麦淀粉珠子、羟丙基化的高直链淀粉珠子、葡聚糖珠子、果聚糖珠子、elsinan(爱生兰)珠子、谷蛋白珠子、胶原珠子、乳清蛋白质分离物珠子、酪蛋白质珠子、乳蛋白质珠子、大豆蛋白质珠子、角蛋白珠子、聚乙烯珠子、聚碳酸酯珠子、聚酸酐珠子、多羟基酸珠子、聚丙基富马酸酯珠子、聚己内酯珠子、多胺珠子、聚缩醛珠子、聚醚珠子、聚酯珠子、聚原酸酯珠子、聚氰基丙烯酸酯珠子、聚氨酯珠子、聚膦腈珠子、聚丙烯酸酯珠子、聚甲基丙烯酸酯珠子、聚氰基丙烯酸酯珠子、聚脲珠子、聚胺珠子、聚苯乙烯珠子、聚(赖氨酸)珠子、壳聚糖珠子、葡聚糖珠子、聚(丙烯酰胺)珠子、衍生化的聚(丙烯酰胺)珠子、明胶珠子、淀粉珠子、壳聚糖珠子、葡聚糖珠子、明胶珠子、淀粉珠子、聚-β-氨基-酯珠子、聚(酰氨基胺)珠子、聚乳酸-共-羟乙酸珠子、聚酸酐珠子、可生物还原的聚合物珠子和/或2-(3-氨基丙基氨基)乙醇珠子或其任何组合。

在某些情况下，捕获试剂(例如，支持物或珠子)可以包含多个反应位点，其可以被构造成偶联至捕获部分，所述捕获部分被构造成捕获生物分子。在某些实施方案中，捕获试剂可以通过共价相互作用被捕获部分官能化。在某些实施方案中，捕获试剂可以通过非共价相互作用被捕获部分官能化。在某些实施方案中，捕获试剂可以被反应部分官能化，且所述反应部分可以结合至捕获部分的反应位点。在某些实施方案中，捕获试剂(例如，支持物或珠子)可以是抗生蛋白链菌素官能化的捕获试剂，且捕获部分可以偶联至抗生蛋白链菌素官能化的捕获试剂的抗生蛋白链菌素基团。在某些实施方案中，所述捕获部分包含偶联至抗生蛋白链菌素官能化的捕获试剂的生物素基团，且所述捕获部分可以进一步包含第二反应部分以缀合至生物分子。在某些实施方案中，所述第二反应部分可以包含2-吡啶基甲醛(PCA)基团。在某些实施方案中，所述第二反应部分可以包含马来酰亚胺基团。在某些实施方案中，所述第二反应部分可以包含吡啶基二硫化物基团。

在某些实施方案中，捕获试剂可以共价结合捕获部分以形成缀合物。在某些实施方案中，所述捕获试剂和捕获部分通过二硫键结合。在某些实施方案中，所述捕获试剂和捕获部分通过硫醚键结合。在某些实施方案中，在生物分子的第一反应部分和支持物上的第二反应部分之间形成所述共价键。在某些实施方案中，所述第一反应部分包含巯基。在某些实施方案中，所述第一反应部分包含半胱氨酸侧链。在某些实施方案中，所述第一反应部分包含组氨酰基侧链。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含吡啶羧基醛。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含马来酰亚胺基团。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含卤代乙酰基基团。在某些实施方案中，所述第二反应部分包含吡啶基二硫化物。在某些实施方案中，所述支持物包含多个第二反应部分。在某些实施方案中，所述共价键是二硫键。在某些实施方案中，所述共价键是硫醚键。

在某些实施方案中，本公开内容的方法可以使用抗生蛋白链菌素-缀合的珠子。在某些实施方案中，本公开内容的方法可以使用抗生蛋白链菌素-缀合的磁珠。在某些实施方案中，本公开内容的方法可以使用官能化的珠子。在某些实施方案中，可以将珠子官能化成包含PCA反应部分。在某些实施方案中，可以将珠子官能化成包含马来酰亚胺基团。在某些实施方案中，可以将珠子官能化成包含吡啶基二硫化物基团。在某些实施方案中，使用包含生物素部分的接头可以将抗生蛋白链菌素珠子官能化。在某些实施方案中，使用双功能的接头可以将抗生蛋白链菌素珠子官能化，所述双功能的接头包含作为第一反应部分的生物素和第二反应部分。在某些实施方案中，所述第二反应部分可以包含PCA基团、马来酰亚胺基团或吡啶基二硫化物基团。

捕获试剂(例如，支持物或珠子)可以具有从约1μm至约50μm的平均直径。捕获试剂(例如，支持物或珠子)可以具有从约15nm至约5μm的平均直径。捕获试剂(例如，支持物或珠子)可以具有从约1μm至约5μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有从约1μm至约10μm、从约10μm至约20μm、从约20μm至约30μm、从约30μm至约40μm或从约40μm至约50μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有从约10μm至约20μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有从约20μm至约30μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有从约30μm至约40μm的平均直径。

在某些实施方案中，捕获试剂可以具有约1μm、约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm或约50μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有约10μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有约20μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有约30μm的平均直径。在某些实施方案中，捕获试剂可以具有约40μm的平均直径。

捕获试剂可以包含从约10²至约10³个、从约10³至约10⁴个、从约10⁴至约10⁵个、从约10⁵至约10⁶个、从约10⁶至约10⁷个或从约10⁷至约10⁸个反应位点。捕获试剂可以包含至少约10²个、至少约10³个、至少约10⁴个、至少约10⁵个、至少约10⁶个、至少约10⁷个或至少约10⁸个反应位点。捕获试剂可以包含约10²个、约10³个、约10⁴个、约10⁵个、约10⁶个、约10⁷个或约10⁸个反应位点。捕获试剂可以包含至多约10⁸个、至多约10⁷个、至多约10⁶个、至多约10⁵个、至多约10⁴个、至多约10³个或至多约10²个反应位点。

在某些实施方案中，捕获试剂可以包含单一类型的反应位点。在某些实施方案中，捕获试剂可以包含多个类型的反应位点。在某些实施方案中，所述反应位点可以均匀地分布在所述捕获试剂的表面上。在某些实施方案中，所述反应位点可以不均匀地分布在所述捕获试剂的表面上。在某些实施方案中，所述反应位点可以按类型聚集在所述捕获试剂的表面上。在某些实施方案中，所述反应位点可以随机分布在所述捕获试剂的表面上。在某些实施方案中，所述反应位点可以间隔开以便最小化捕获的蛋白质的变性。例如，包含生物分子特异性的捕获部分的反应位点可以包含至少5nm的平均间隔，从而最小化生物分子的拥挤(其包含约5nm的尺寸)和/或与捕获试剂结合的生物分子的可能变性。

在某些实施方案中，反应位点可以包含从约1nm至约2nm、从约2nm至约4nm、从约4nm至约6nm、从约6nm至约8nm、从约8nm至约10nm、从约10nm至约12nm、从约12nm至约14nm、从约14nm至约16nm、从约16nm至约18nm或从约18nm至约20nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至少约1nm、至少约1.5nm、至少约2nm、至少约2.5nm、至少约3nm、至少约4nm、至少约5nm、至少约6nm、至少约8nm、至少约10nm、至少约12nm、至少约15nm或至少约20nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至少约1nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至少约2nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至少约5nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至少约10nm的平均间距。

在某些实施方案中，反应位点可以包含至多约1nm、至多约1.5nm、至多约2nm、至多约2.5nm、至多约3nm、至多约4nm、至多约5nm、至多约6nm、至多约8nm、至多约10nm、至多约12nm、至多约15nm或至多约20nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至多约1nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至多约2nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至多约5nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含至多约10nm的平均间距。

在某些实施方案中，反应位点可以包含约1nm、约1.5nm、约2nm、约2.5nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约8nm、约10nm、约12nm、约15nm或约20nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含约1nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含约2nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含约5nm的平均间距。在某些实施方案中，反应位点可以包含约10nm的平均间距。

捕获试剂(例如，珠子)可以包含多个捕获部分。多个捕获部分可以偶联至多个反应位点。相反，多个捕获部分可以直接连接至所述捕获试剂。在某些情况下，捕获部分包含化学反应基团，其被构造成偶联至特定类型的生物分子。在某些情况下，捕获部分包含形成硫醚键的化学反应基团。在某些情况下，捕获部分包含形成二硫键的化学反应基团。在某些实施方案中，所述化学反应基团包含马来酰亚胺基团。在某些实施方案中，所述化学反应基团包含PCA基团。在某些实施方案中，所述化学反应基团包含卤代乙酰基基团。在某些实施方案中，所述化学反应基团包含吡啶基二硫化物基团。在某些实施方案中，所述化学反应基团对肽的N-端具有反应性。在某些实施方案中，所述化学反应基团对肽的特定氨基酸具有反应性。在某些实施方案中，所述化学反应基团对半胱氨酸残基具有反应性。在某些情况下，来自所述多个捕获部分的捕获部分可以包含对特定生物分子或生物分子类别的亲和力。在某些情况下，支持物或珠子可以包含多个捕获部分。

捕获试剂可以包含从约10²至约10³个、从约10³至约10⁴个、从约10⁴至约10⁵个、从约10⁵至约10⁶个、从约10⁶至约10⁷个或从约10⁷至约10⁸个捕获部分。捕获试剂可以包含至少约10²个、至少约10³个、至少约10⁴个、至少约10⁵个、至少约10⁶个、至少约10⁷个或至少约10⁸个捕获部分。捕获试剂可以包含约10²个、约10³个、约10⁴个、约10⁵个、约10⁶个、约10⁷个或约10⁸个捕获部分。捕获试剂可以包含至多约10⁸个、至多约10⁷个、至多约10⁶个、至多约10⁵个、至多约10⁴个、至多约10³个或至多约10²个捕获部分。在某些情况下，捕获部分包含芳族或杂芳族甲醛。在某些情况下，所述芳族或杂芳族甲醛是PCA。在某些情况下，所述多个捕获部分包含醛、马来酰亚胺、硫醇、羧酸、琥珀酰亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、脲、酰氨基酯、叠氮化物、丙烯基叠氮化物、芳基二卤化物、砜、戊二醛、二马来酰亚胺、酸酐、二甲酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、四嗪、烯烃、炔烃、马来酰亚胺或其任何组合。

在某些情况下，与珠子或珠子上的反应位点结合的捕获部分是不可逆的。在某些实施方案中，捕获部分共价结合至生物分子的肽。在某些实施方案中，捕获部分共价结合至生物分子的氨基酸残基。在某些实施方案中，捕获部分通过二硫键共价结合至生物分子的氨基酸残基。在某些实施方案中，捕获部分通过硫醚键共价结合至生物分子的氨基酸残基。

在某些情况下，与珠子或珠子上的反应位点结合的捕获部分是可逆的。例如，通过在乙腈中加入甲酸，可以从包含抗生蛋白链菌素反应位点的珠子洗脱含有生物素的捕获部分。捕获部分还可以包含可切割的部分，诸如可水解的(2-吡啶基二硫)戊酸酯(SPP)接头或重氮苯部分。

在某些情况下，捕获部分包含表位特异性抗体。在某些情况下，所述表位特异性抗体被构造成结合细胞的生物分子。在某些情况下，所述表位特异性抗体被构造成结合捕获部分(诸如具有两个相同或不同的反应基团的双功能捕获部分)的反应基团。例如，反应位点可以包含偶联至双功能的接头的抗生蛋白链菌素，所述双功能的接头包含抗生蛋白链菌素结合部分(例如，生物素)和肽捕获部分(例如，马来酰亚胺)。在某些情况下，所述双功能的接头包含生物素-PEG(11)-马来酰亚胺、生物素-PEG(11)-PCA、生物素-PEG(11)-吡啶基二硫化物、生物素-PEG(11)-卤代乙酰基。

在某些情况下，捕获部分被构造用于切割。捕获部分可以包含可切割的结构域。捕获部分还可以偶联至包含可切割的结构域的接头(例如，双功能的接头)。所述可切割的结构域可以是可化学切割的结构域、可pH切割的结构域、可光切割的结构域、可酶切割的结构域或其任何组合。在某些情况下，捕获部分可以被逆转剂(例如，肼)切割。

在某些情况下，珠子可以包含被构造成从细胞捕获特定百分比的蛋白质或肽的多个反应位点或捕获部分。例如，分隔物(例如，微滴)可以包含含有约5×10⁹个蛋白质的单个细胞(例如，红血细胞)和包含5×10⁵个肽特异性的反应位点的珠子，并且因此被构造成捕获0.01％的源自所述单个细胞的肽或蛋白质。在某些实施方案中，分隔物可以包含含有10⁶个蛋白质或肽单个细胞(例如，小原核细胞)和包含3×10⁶个肽特异性的反应位点(例如，捕获部分)的珠子，并且因此被构造成捕获源自所述单个细胞的所有蛋白质或肽。

在某些实施方案中，支持物或珠子可以包含多个反应位点，其被构造成捕获从约0.001％至约0.01％、从约0.01％至约0.1％、从约0.1％至约1％、从约1％至约10％、从约10％至约20％、从约20％至约30％、从约30％至约40％、从约40％至约50％、从约50％至约60％、从约60％至约70％、从约70％至约80％、从约80％至约90％或从约90％至约100％的源自单个细胞的肽或蛋白质。在某些实施方案中，支持物或珠子可以包含多个反应位点，其被构造成捕获至少约0.001％、至少约0.01％、至少约0.1％、至少约1％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的源自单个细胞的肽或蛋白质。在某些实施方案中，支持物或珠子可以包含多个反应位点，其被构造成捕获约0.001％、约0.01％、约0.1％、约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的源自单个细胞的肽或蛋白质。在某些实施方案中，支持物或珠子可以包含多个反应位点，其被构造成捕获至多约0.001％、至多约0.01％、至多约0.1％、至多约1％、至多约10％、至多约20％、至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约70％、至多约80％、至多约90％或约100％的源自单个细胞的肽或蛋白质。

条形码分子

在某些情况下，分隔物(例如，微滴)可以包含一个条形码分子或多个条形码分子。所述条形码分子可以连接(例如，共价结合)至珠子，诸如连接至珠子上的反应位点。条形码可以连接到捕获部分或设置在捕获部分内。例如，捕获部分可以包含使得能够连接至珠子结合的抗生蛋白链菌素的生物素部分、用于结合肽N-端的马来酰亚胺部分、和/或独特鉴定细胞、珠子或分隔物的寡肽条形码分子。条形码分子可以连接至源自细胞的分子。例如，可以在分隔物内裂解细胞，并且可以将来自细胞的肽的N-端偶联至条形码分子上的马来酰亚胺部分。可以从珠子或捕获部分切割条形码分子。例如，条形码分子可以包含可水解的二硫化物基团。

在某些情况下，条形码分子包含独特鉴定微滴、捕获试剂(例如，珠子)或细胞的序列。因此，条形码可以实现对来自合并样品的分析物的细胞源鉴定。多个分隔物可以包含多个不同的条形码，使得随后可以从合并的样品中鉴定生物分子或捕获试剂。

条形码分子可以包含脱氧核糖核酸(DNA)。条形码分子可以包含核糖核酸(RNA)。条形码分子可以包含肽核酸。条形码分子可以包含肽(例如，寡肽、多肽或蛋白质)。在某些情况下，捕获部分包含条形码分子。在某些情况下，双功能的接头包含条形码分子。在某些情况下，在从捕获试剂(诸如珠子)切割或解离后，条形码仍然连接至捕获部分或双功能的接头。

在某些情况下，条形码分子包含含有从约2至50个氨基酸的寡肽。在某些实施方案中，条形码分子可以包含从约1至约10个氨基酸、从约10至约20个氨基酸、从约20至约30个氨基酸、从约30至约40个氨基酸或从约40至约50个氨基酸。在某些情况下，所述条形码分子可以包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或苯丙氨酸。在某些情况下，所述条形码可以包含经修饰的氨基酸，诸如甲基咪唑或磷酸酪氨酸。在某些情况下，所述条形码可以包含非天然氨基酸。在某些情况下，通过测序可以鉴定寡肽条形码。在某些情况下，通过荧光测序可以鉴定寡肽条形码。在某些情况下，可以用串联质谱法鉴定寡肽条形码。

在某些情况下，方法包含检测偶联至生物分子的条形码分子。在某些情况下，可以从所述生物分子切割所述条形码分子。在某些情况下，检测条形码分子包含质谱法分析(例如，串联质谱法)。在某些情况下，检测条形码分子包含荧光测序。在某些情况下，检测条形码分子包含光学检测。在某些情况下，所述光学检测包含成像。在某些情况下，所述检测包含对所述条形码分子的至少一部分进行荧光测序。在某些情况下，在测定中使用的多个条形码分子中的每个条形码分子具有独特的质谱法或串联质谱法指纹。在某些情况下，在测定中使用的多个珠子中的每个珠子与独特类型的条形码分子相关联。

在某些情况下，检测条形码分子包含测序，诸如纳米孔测序、核酸下一代测序(NGS)或肽荧光测序。在某些情况下，所述测序包含Edman降解。在某些情况下，检测所述条形码分子会鉴定生物分子所源自的细胞。在某些情况下，该原理可以扩展到多细胞测定，其中可以为多个生物分子中的每一个分配来源细胞。

用于测定肽或蛋白质的方法和/或系统

本公开内容提供了用于分析来自单个细胞的生物分子的方法和/或系统。在某些情况下，所述方法包括分隔单个细胞和检测源自所述细胞的至少一种生物分子。在某些实施方案中，分隔物是油包水微滴。在某些实施方案中，刚好一个细胞和一个珠子可以被包封在油包水微滴中。在某些情况下，所述分隔物包含一个细胞和两个或更多个珠子。在某些情况下，所述分隔物包含两个或更多个细胞和一个珠子。在某些情况下，所述分隔物包含两个或更多个细胞和两个或更多个珠子。在某些情况下，所述珠子包含多个反应位点，其被构造成捕获来自所述单个细胞的生物分子(例如，肽)。在某些情况下，所述多个反应位点包含捕获部分。在某些情况下，方法包含使单个细胞的内容物在所述分隔物内可接近(例如，裂解所述细胞)。在某些情况下，方法包括使细胞核的内容物在所述分隔物内可接近。在某些情况下，所述方法包括将源自单个细胞的多个生物分子固定化到珠子上，例如通过将来自所述细胞的生物分子与捕获部分偶联(例如，化学偶联)。在某些情况下，所述固定化是可逆的(例如，通过捕获部分切割)。在某些情况下，所述方法包括将条形码分子偶联至生物分子或珠子。

在某些情况下，所述细胞可以源自血液样品。在某些情况下，所述细胞可以源自组织样品。在某些情况下，所述细胞可以源自细胞培养物。在某些情况下，可以在测定之前将细胞与细胞外物质分离。例如，从样品获得红血细胞可以包括首先从样品除去细胞外组分(例如，无细胞DNA和/或白蛋白)，在第一类珠子上纯化，并然后用第二类珠子分隔进行测定。

在某些实施方案中，所述细胞是红血细胞、干细胞、骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、性细胞、胰腺细胞或癌细胞。在某些实施方案中，所述细胞是红血细胞。在某些实施方案中，所述细胞是皮肤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是肌肉细胞。在某些实施方案中，所述细胞是内皮细胞。在某些实施方案中，所述细胞是癌细胞。

在某些实施方案中，裂解微滴中的细胞，使得细胞的内容物可接近。在某些实施方案中，微滴可以包含水溶液。在某些情况下，所述方法包括从细胞、外核体、细胞器、细胞核、囊泡或其任何组合释放或收集生物分子。在某些实施方案中，微滴包含水溶液。在某些实施方案中，微滴可以包含细胞裂解溶液。在某些实施方案中，微滴可以包含低渗的裂解溶液。在某些实施方案中，所述细胞裂解溶液包含聚氧乙烯山梨醇酯。在某些实施方案中，所述细胞裂解溶液包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇。在某些实施方案中，所述细胞裂解溶液包含十二烷基硫酸钠。在某些实施方案中，所述细胞裂解溶液包含三氟乙醇。在某些实施方案中，所述裂解可以包含加热、冷冻、声处理、细胞裂解、化学裂解、渗透冲击、空化、化学品(例如，去污剂)、蛋白质、碱性或酸性条件、电流或其任何组合。所述裂解可以是细胞类型特异性形式的裂解。在某些实施方案中，裂解方法或裂解试剂组可以影响红血细胞，但不影响其它类型的细胞。在某些实施方案中，所述裂解还可以包含稳定细胞裂解物的组分的条件。在某些实施方案中，红血细胞裂解缓冲液可以为血红蛋白提供稳定的介质。裂解方法或裂解试剂组可以针对快速或慢速裂解进行优化。在某些实施方案中，细胞裂解溶液或细胞裂解缓冲液可以以纳秒、微秒、毫秒、秒、分钟或小时的量级进行裂解。

在某些实施方案中，微滴可以包含水溶液。在某些实施方案中，微滴可以进一步包含缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液包含磷酸钠。在某些实施方案中，所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。在某些实施方案中，所述缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水。

在某些情况下，使细胞的内容物可接近可以包括透化所述细胞。所述透化可以包含加热、电流、渗透冲击、化学品(例如，去污剂)或其任何组合。所述透化可以导致大部分细胞内组分或少至0.1％的细胞内组分从细胞中扩散。在某些情况下，所述透化使细胞器保持完整。在某些情况下，所述透化是可逆的。

本文中公开的方法进一步包括使来自细胞的至少一种生物分子与微滴中的支持物(例如，珠子)接触。在某些实施方案中，所述生物分子是细胞内肽。在某些实施方案中，所述生物分子是细胞内蛋白质。在某些实施方案中，所述生物分子是分泌型肽。在某些实施方案中，所述生物分子是分泌型蛋白质。在某些实施方案中，所述接触形成包含支持物(例如，珠子)和/或至少一种生物分子的缀合物。在某些实施方案中，所述接触导致生物分子的反应基团和/或支持物或珠子的捕获部分形成键。在某些实施方案中，所述键是共价键。在某些实施方案中，所述键是支持物或珠子与捕获部分的反应基团之间的共价键。在某些实施方案中，所述键是支持物或珠子与生物分子的反应基团之间的共价键。在某些实施方案中，所述键是二硫键。在某些实施方案中，所述键是硫醚键。

在某些情况下，所述方法包括将多个生物分子(诸如来自细胞的多个肽或蛋白质)捕获到珠子上。所述珠子可以包含多个反应位点，其被构造成捕获至少一部分被构造成捕获源自细胞的多个生物分子(例如，肽或蛋白质)中的至少0.001％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.05％、至少0.08％、至少0.1％、至少0.12％、至少0.15％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.8％、至少1％、至少1.2％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少4％或至少5％。所述生物分子可以是特定类型或类别的生物分子。例如，珠子可以捕获来自细胞的所有蛋白质的0.1％，或者珠子可以捕获来自细胞的特定类别或类型(例如，血红蛋白)的所有蛋白质的0.1％。

在某些情况下，多个细胞可以与多个珠子一起温育。多个细胞中的细胞数目与多个珠子中的珠子数目之比可以为从约100:1至约80:1、从约80:1至约60:1、从约60:1至约50:1、从约50:1至约40:1、从约40:1至约30:1、从约30:1至约20:1、从约20:1至约15:1、从约15:1至约10:1、从约10:1至约8:1、从约8:1至约5:1、从约5:1至约2:1、从约2:1至约1.5:1、从约1.5:1至约1:1、从约1:1至约1:1.5、从约1:1.5至约1:2、从约1:2至约1:5、从约1:5至约1:8、从约1:8至约1:10、从约1:10至约1:15、从约1:15至约1:20、从约1:20至约1:30、从约1:30至约1:40、从约1:40至约1:50、从约1:50至约1:60、从约1:60至约1:80、或从约1:80至约1:100。在某些情况下，多个细胞可以与多个珠子一起温育。多个细胞中的细胞数目与多个珠子中的珠子数目之比可以为至少约100:1、至少约80:1、至少约60:1、至少约50:1、至少约40:1、至少约30:1、至少约20:1、至少约15:1、至少约10:1、至少约8:1、至少约5:1、至少约2:1、至少约1.5:1、至少约1:1、至少约1:1.5、至少约1:2、至少约1:5、至少约1:8、至少约1:10、至少约1:15、至少约20:1、至少约30:1、至少约40:1、至少约50:1、至少约60:1、至少约80:1或至少约1:100。多个细胞中的细胞数目与多个珠子中的珠子数目之比可以为约100:1、约80:1、约60:1、约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约15:1、约10:1、约8:1、约5:1、约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:5、约1:8、约1:10、约1:15、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约80:1或约1:100。多个细胞中的细胞数目与多个珠子中的珠子数目之比可以为至多约100:1、至多约80:1、至多约60:1、至多约50:1、至多约40:1、至多约30:1、至多约20:1、至多约15:1、至多约10:1、至多约8:1、至多约5:1、至多约2:1、至多约1.5:1、至多约1:1、至多约1:1.5、至多约1:2、至多约1:5、至多约1:8、至多约1:10、至多约1:15、至多约20:1、至多约30:1、至多约40:1、至多约50:1、至多约60:1、至多约80:1或至多约1:100。

微滴在被打开之前可以存在预定的时间长度。微滴可以存在从约1分钟至约2分钟、从约2分钟至约3分钟、从约3分钟至约5分钟、从约5分钟至约8分钟、从约8分钟至约12分钟、从约12分钟至约15分钟、从约15分钟至约20分钟、从约20分钟至约30分钟、从约30分钟至约40分钟、从约40分钟至约50分钟、从约50分钟至约60分钟、从约60分钟至约80分钟、从约80分钟至约100分钟、从约100分钟至约120分钟、从约120分钟至约150分钟、从约150分钟至约180分钟、从约180分钟至约210分钟、从约210分钟至约240分钟、从约240分钟至约300分钟、从约300分钟至约360分钟、从约360分钟至约540分钟、从约540分钟至约720分钟、从约720分钟至约900分钟、从约900分钟至约1080分钟、从约1080分钟至约1440分钟、从约1440分钟至约2880分钟或从约2880分钟至约4320分钟。微滴在被打开之前可以存在预定的时间长度。微滴可以存在至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约5分钟、至少约8分钟、至少约12分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟、至少约60分钟、至少约80分钟、至少约100分钟、至少约120分钟、至少约150分钟、至少约180分钟、至少约210分钟、至少约240分钟、至少约300分钟、至少约360分钟、至少约540分钟、至少约720分钟、至少约900分钟、至少约1080分钟、至少约1440分钟、至少约2880分钟或至少约4320分钟。微滴可以存在约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约80分钟、约100分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟、约210分钟、约240分钟、约300分钟、约360分钟、约540分钟、约720分钟、约900分钟、约1080分钟、约1440分钟、约2880分钟或约4320分钟。微滴可以存在至多约1分钟、至多约2分钟、至多约3分钟、至多约5分钟、至多约8分钟、至多约12分钟、至多约15分钟、至多约20分钟、至多约30分钟、至多约40分钟、至多约50分钟、至多约60分钟、至多约80分钟、至多约100分钟、至多约120分钟、至多约150分钟、至多约180分钟、至多约210分钟、至多约240分钟、至多约300分钟、至多约360分钟、至多约540分钟、至多约720分钟、至多约900分钟、至多约1080分钟、至多约1440分钟、至多约2880分钟或至多约4320分钟。

微滴在被打开之前可以存在预定的时间长度。微滴可以存在至多约1分钟、至多约2分钟、至多约3分钟、至多约5分钟、至多约8分钟、至多约12分钟、至多约15分钟、至多约20分钟、至多约30分钟、至多约40分钟、至多约50分钟、至多约60分钟、至多约80分钟、至多约100分钟、至多约120分钟、至多约150分钟、至多约180分钟、至多约210分钟、至多约240分钟、至多约300分钟、至多约360分钟、至多约540分钟、至多约720分钟、至多约900分钟、至多约1080分钟、至多约1440分钟、至多约2880分钟或至多约4320分钟。

可以在过程(例如，珠子上的肽捕获试剂和/或细胞衍生的肽之间的偶联反应)期间收集(例如，在流体装置的隔室内)和/或稳定地温育多个微滴。微滴存在的时间长度可能足以发生一个或多个过程(例如细胞裂解和/或珠子上的蛋白质收集)并任选地接近完成。

本文中公开的方法进一步包括将生物分子缀合物收集到样品中。在形成生物分子缀合物之后，微滴可能破裂。在某些实施方案中，包含至少一种生物分子和支持物的微滴的内容物可以通过添加试剂来释放。在某些实施方案中，所述试剂是有机溶剂，例如，异丙醇。

在释放微滴的内容物之后，可以将微滴的内容物收集到单独的分隔物或单独的样品中。在某些实施方案中，所述样品是孔。在某些实施方案中，所述样品是管。在某些实施方案中，多个微滴的内容物可以组合在样品(例如，孔或管)内。例如，流体装置可以在分隔物(例如，试管)中收集微滴。

可以将微滴收集为单独的分隔物。在某些情况下，微滴可以与单独的分隔物合并。例如，可以将微滴收集在孔或管中。两个或更多个微滴可以组合(例如，在两个或更多个通道的汇合处)以形成在孔或管中的组合分隔物，和/或所述孔或管可以包含两个或更多个组合的微滴的内容物的全部或亚集。

分隔物可以包含容器，例如，孔或管。在某些情况下，分隔到容器中包含将流体转移(例如，移液)到容器中。在某些情况下，分隔到容器中包含重力沉降。在某些情况下，分隔到容器中包含离心。在某些实施方案中，分隔包含向支持物施加磁场，其中所述支持物是磁珠。在某些情况下，使微滴沉积到孔中。在某些情况下，通过将系统或装置的出口流引向孔而使微滴沉积到孔中。在某些情况下，分隔可以包含将多个细胞分隔到多个孔中。

可以在细胞分隔之前、在分隔物内或在已经从分隔物中除去生物分子之后进行化学修饰。在某些情况下，方法包含在收集之后用至少一种可检测部分对生物分子进行化学修饰以产生至少一种标记的生物分子。在某些情况下，方法包含在检测生物分子之前对生物分子进行化学修饰。在某些情况下，方法包含在分隔之后但在检测生物分子之前对生物分子进行化学修饰。

在某些情况下，所述化学修饰包含还原生物分子。在某些情况下，所述还原剂包含2-巯基乙醇、2-巯基乙醇胺、TCEP、(三(2-羧基乙基)膦、二硫苏糖醇、抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸盐(例如，亚硫酸钠)或巯基乙酸盐(例如，巯基乙酸钠)。在某些情况下，可以在消化之前还原蛋白质。在某些情况下，可以在分析之前还原蛋白质。例如，二硫键或辅因子可以被还原(例如，血红蛋白铁血红素可以被还原为亚铁血红素)。

在某些情况下，化学修饰包含使生物分子片段化。在某些情况下，所述片段化包含消化(例如，酶消化)。在某些情况下，所述消化包含酶促肽消化，例如通过蛋白质酶诸如胃蛋白酶、氨肽酶、明胶酶B、明胶酶A、α-糜蛋白酶、羧肽酶、胞内蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、管腔胃蛋白酶、弹性蛋白酶、二肽基肽酶、肠肽酶和/或水解酶、NS3、粒酶B、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、硫代亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)或其任何组合。在某些情况下，所述消化包含化学肽消化，例如通过溴化氰、BNPS粪臭素、甲酸、羟胺、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)或其任何组合。例如，通过红血细胞的透化释放的血红蛋白可以在分析之前用蛋白质酶片段化。

所述方法可以进一步包含在检测之前对生物分子进行化学修饰。所述化学修饰可以包含还原生物分子(例如，还原生物分子中的二硫键)。所述化学修饰可以包含消化生物分子(例如，用蛋白质酶切割生物分子)。所述化学修饰可以包含使生物分子变性(例如，使肽变性)。变性剂可以包含甲酰胺、水杨酸钠、二甲亚砜(DMSO)、丙二醇、高氯酸盐、十二烷基硫酸钠、胍、脲或其任何组合。

在某些情况下，所述测定包含将抗体偶联至生物分子。所述抗体可以包含特定生物分子的互补位、一类生物分子的互补位(例如，蛋白质家族的互补位)、生物分子的化学修饰形式(例如，生物分子的氧化形式或具有特定翻译后修饰的蛋白质)的互补位。在某些情况下，所述翻译后修饰包含糖化。在某些情况下，所述翻译后修饰包含糖基化。在某些情况下，所述翻译后修饰包含氧化。

在某些情况下，所述抗体包含标记，且所述测定包含检测所述标记。在某些情况下，多个抗体中的每种类型的抗体可以包含独特类型的标记。标记可以是光学可检测的(例如，所述标记可以包含荧光团)。在某些情况下，所述标记的检测包含电化学检测、光学检测、电泳检测、成像(例如，电子显微术)、测序、抗体(例如，免疫染色)或其任何组合。在某些实施方案中，所述标记包含免疫染色。

在某些情况下，测定生物分子包含将氨基酸特异性标记偶联至所述生物分子。在某些情况下，所述氨基酸特异性标记包含可检测部分(例如，光学可检测部分)。在某些情况下，所述可检测部分是荧光部分。在某些情况下，所述氨基酸特异性标记具有偶联至组氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或在其R-基团中包含羧酸的氨基酸的特异性。在某些实施方案中，所述荧光部分包含抗体。在某些实施方案中，所述荧光部分包含荧光染料。在某些实施方案中，所述荧光部分包含Alexa Fluor 488。在某些实施方案中，所述荧光部分包含Atto647N。

在某些情况下，在形成包含支持物和至少一种生物分子的缀合物之后标记生物分子。在某些情况下，在将所述缀合物收集到容器中之后对生物分子进行标记。在某些实施方案中，将所述缀合物收集到容器中，洗涤以除去细胞裂解试剂和不希望的细胞材料，然后标记生物分子。在某些实施方案中，谷氨酰基/天冬氨酰基残基的羧酸酯侧链可以用可检测标记进行标记。在某些实施方案中，可以选择性地标记生物分子的侧链，例如以靶向半胱氨酸和赖氨酸。在某些实施方案中，使用碘乙酰胺、胍基化试剂和色氨酸标记试剂选择性地标记生物分子的侧链。

在某些情况下，所述测定包含鉴定所述生物分子。在某些情况下，所述测定包含鉴定生物分子上的化学修饰(例如，翻译后修饰)。在某些情况下，所述测定包含测定生物分子的浓度或表达水平。

本公开内容的各个方面提供了用于分析来自生物样品的多个细胞的方法。本公开内容的某些方面提供了用于将多个细胞分隔成单独的分隔物的方法。在某些情况下，所述分隔可以产生接受单个细胞的分隔物。

在某些情况下，所述分隔可以导致所述多个细胞中的从约10％至约20％、从约20％至约30％、从约30％至约40％、从约40％至约50％、从约50％至约60％、从约60％至约70％、从约70％至约80％、从约80％至约90％、从约90％至约95％、从约95％至约98％、从约98％至约99％、从约99％至约99.5％、从约99.5％至约99.9％的细胞最终处于单个细胞分隔物中。在某些情况下，所述分隔可以导致所述多个细胞中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.9％、至少约99.99％或至少约99.999％的细胞最终处于单个细胞分隔物中。在某些情况下，所述分隔可以导致所述多个细胞中的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、约99.5％、约99.9％、约99.99％或约99.999％的细胞最终处于单个细胞分隔物中。在某些情况下，所述分隔可以导致所述多个细胞中的至多约10％、至多约20％、至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约70％、至多约80％、至多约90％、至多约95％、至多约98％、至多约99％、至多约99.5％、至多约99.9％、至多约99.99％或至多约99.999％的细胞最终处于单个细胞分隔物中。

方法可以定量生物分子，例如通过确定生物分子所来源的细胞内的拷贝数或浓度。例如，方法可以包含将源自红血细胞的蛋白质捕获到珠子上，鉴定珠子上蛋白质的至少一个亚集，和/或外推所鉴定的蛋白质的群体以确定在红血细胞内的那些蛋白质的群体。所述测定还可以鉴定生物分子的结构(例如，在特定位点处的糖化或特定糖基化模式)或结构的一部分，并且还可以定量包含所述结构或其结构部分的生物分子的群体。例如，所述测定可以鉴定蛋白质的翻译后修饰或者可以鉴定在细胞中存在的特定蛋白质的同种型。在生物分子是寡聚体或多聚体的情况下(例如，当生物分子包含肽时)，所述测定可以鉴定生物分子的序列。在某些情况下，所述测定可以鉴定或定量在细胞内的多个生物分子。

方法可以包含释放结合至珠子的生物分子或结合至珠子的生物分子的一部分。可以收集释放的生物分子或其部分用于进一步分析。例如，方法可以包含从珠子释放多个肽、用氨基酸特异性标记对所述多个肽进行标记、将所述多个肽固定化至载玻片、和/或对所述多个肽进行荧光测序。所述释放可以在分隔物内或分隔物外执行。例如，所述释放可以在微滴或包含微滴内容物的孔内进行，或者可以在从多个微滴收集的合并的多个珠子上进行。所述释放可以包含在珠子上的化学修饰或与其结合的生物分子的消化。

方法可以包含消化(例如，胰蛋白质酶消化)结合至珠子的肽，从而从肽和珠子释放一个肽片段或多个肽片段。在某些情况下，所述方法可以包含(i)提供与珠子偶联的多个肽，(ii)使所述多个肽变性以提供肽片段。可以收集所述肽片段或将其用于进一步的测定中。在某些情况下，所述方法可以包含(i)提供与珠子偶联的多个肽，(ii)使所述多个肽变性；和(iii)还原所述多个肽和珠子之间的共价键以提供肽片段。在某些情况下，所述方法可以包含(i)提供与珠子偶联的多个肽，(ii)通过将珠子悬浮在包含4M氯化胍的pH 8.5溶液中来使所述多个肽变性，(iii)通过将珠子在2mM二硫苏糖醇(DTT)中温育2小时，还原所述多个肽的二硫键，(iv)将珠子重新悬浮于pH 7.8NH₄(HCO₃)中，和/或(v)使所述多个肽与200ng胰蛋白质酶在37℃接触12小时。可以收集所述多个肽片段和/或将其用于进一步的测定，诸如荧光测序测定。

方法可以包括校准物。所述校准物可以实现或提高靶分析物定量的准确性。所述校准物可以包含用已知量的靶生物分子官能化的珠子。例如，用于测量HbA的测定可以包含含有已知量的HbA的校准珠子，从而能够在测定期间进行信号校准(例如，信号强度与珠子上的靶生物分子的量的关联)。

图3示出了用于鉴定来自单个细胞的生物分子水平的测定的方案。在该方案中，可以将包含细胞301的生物样品和包含珠子302的样品输入到产生微滴的流体装置中，如图1中所描述。所述细胞和珠子可以流过单独通道(分别为303和304)，所述通道在产生微滴的连接部305(例如，包含将油微滴注入到充满水的通道中的喷嘴的连接部)处相遇，使得微滴306平均而言包含一个细胞307和一个珠子308。多个或大部分微滴可以是空的或者可以仅包含珠子，并且包含细胞的大部分分隔物包含单个细胞和单个珠子。所述细胞可以在微滴内被透化。

珠子308可以包含多个捕获部分320。所述捕获部分可以结合来自细胞的生物分子，诸如从透化的细胞释放的血红蛋白分子。可以将多个珠子309收集在分隔物310(诸如试管或孔)中。所述分隔物可以收集来自所述产生微滴的流体装置的微滴。珠子可以包含来自细胞的生物分子311，与其一起被分隔物在微滴中。可以将标记312和313或多个标记加入分隔物中。所述标记可以选择性地标记来自细胞的生物分子。例如，所述多个标记可以包含结合HbA的第一抗体和结合HbA1c的第二抗体。标记可以包含可检测部分，诸如光学可检测的染料分子。在许多情况下，多个标记包含多个独特的且可辨别的标记(314)。例如，具有不同互补位的两种抗体可以包含不同的荧光染料。可以对珠子进行分析315(例如，光学分析)。所述分析可以鉴定或量化与珠子结合的生物分子所结合的标记。可以单独分析珠子，从而提供对应于来自生物样品301的单个细胞的数据316(例如，箭头指示从具有升高的HBA1c的红血细胞获得的数据)。

在某些情况下，所述方法包含分隔生物样品，其中至少一个第一分隔物包含来自第一多个细胞的一个细胞和第一珠子，并且至少一个第二分隔物包含来自第二多个细胞的一个细胞和第二珠子；测量源自至少一个第一分隔物的分子的第一表达水平和源自至少一个第二分隔物的分子的第二表达水平；以及确定所述第一表达水平和所述第二表达水平之间的差异。在某些情况下，所述方法包含分隔生物样品，其中至少一个第一分隔物包含来自第一多个红血细胞的一个红血细胞和第一珠子，并且至少一个第二分隔物包含来自第二多个红血细胞的一个红血细胞和第二珠子；测量源自至少一个第一分隔物的分子的第一表达水平和源自至少一个第二分隔物的分子的第二表达水平；以及确定所述第一表达水平和所述第二表达水平之间的差异。

在某些实施方案中，本公开内容的方法包含检测至少一种标记的生物分子。在某些实施方案中，所述检测是通过流式细胞计量术。在某些实施方案中，所述检测是通过荧光测序或降解法测序。

荧光测序

荧光测序(降解法测序)表示在单分子水平上对复杂蛋白质样品中的肽进行测序。在某些实施方案中，并行观察数百万个单独的荧光标记的肽，监测随着N-端氨基酸依次被除去荧光强度的变化模式，和使用得到的荧光签名(荧光序列)来独特地鉴定个别肽。在某些实施方案中，氨基酸被选择性地标记在固定化的肽上，和氨基酸经历除去肽N-末端残基(Edman降解)和对个别肽分子的荧光强度的相应降低进行成像的连续循环。在某些实施方案中，使用化学降解、光化学降解或酶降解来切割氨基酸。本公开内容的方法能够产生充分反映肽序列的模式，以允许独特地鉴定来自一个物种的大多数蛋白质。由此产生的荧光减少的阶梯模式提供了选定氨基酸残基的位置信息。该部分模式经常足以通过与参考蛋白质组对比来独特地鉴定肽。切割模式(即使对于蛋白质的一部分)提供了足够的信息来鉴定在已知蛋白质组(即预先知道蛋白质序列的情况)中的大部分蛋白质。在一个实施方案中，本申请的单分子技术允许对生物样品中给定的肽或蛋白质进行鉴定和绝对定量。

在某些实施方案中，本文中公开的方法可以用于如下在单分子水平执行单个完整肽(未变性)的大规模测序(包括、但不限于部分测序)：选择性地标记在固定化的肽上的氨基酸，然后进行肽氨基端氨基酸的标记和除去的连续循环。本公开内容的方法和系统可以鉴定肽中的氨基酸，包括包含非天然氨基酸的肽。在一个实施方案中，本公开内容包含用第一标记标记N-端氨基酸和用第二标记标记内部氨基酸。在某些实施方案中，所述标记是荧光标记。在其它实施方案中，所述内部氨基酸是赖氨酸。在其它实施方案中，基于每个肽在单分子水平上的荧光签名来鉴定肽中的氨基酸。

本公开内容的各个方面提供了用于肽荧光测序的组合物和/或方法，也称为降解法测序。符合本公开内容的方法可以对肽进行荧光测序和/或其它形式的分析。例如，可以用免疫染色检查血红蛋白分子的糖化，和/或然后随后消化和/或进行荧光测序以进行测序分析。在一个实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定和定量在给定复杂样品内的单个肽和/或蛋白质分子的大规模并行且快速方法。

在某些实施方案中，本公开内容的方法包含：(a)提供多肽，其中所述多肽包含至少一个标记的内部氨基酸；(b)检测来自所述多肽的至少一个信号或信号变化以鉴定所述多肽的序列的至少一部分；和(c)使所述多肽处于足以从所述多肽除去至少一个氨基酸的条件。在某些实施方案中，从所述多肽的N-端除去所述至少一个氨基酸。在某些实施方案中，在(c)之后，所述至少一个标记的内部氨基酸变成标记的末端氨基酸。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸来自多个标记的氨基酸，和其中所述至少一个信号或信号变化包含来自所述多个标记的氨基酸的共同信号。在某些实施方案中，所述多个标记的氨基酸包含具有不同标记的氨基酸。在某些实施方案中，所述不同标记产生具有不同信号模式的信号。

在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸包含一个或多个选自由赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组的成员。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸包含具有与其共价地连接的标记的氨基酸，所述标记产生所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述至少一个标记的内部氨基酸包含具有与其偶联的染料的氨基酸，所述染料产生所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化是光学信号。在某些实施方案中，用具有单分子灵敏度的光学检测器检测所述至少一个信号或信号变化。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化包含不同强度的多个信号。在某些实施方案中，所述至少一个信号或信号变化包含不同频率或频率范围的多个信号。

在某些实施方案中，通过降解反应从所述多肽除去至少一个氨基酸。在某些实施方案中，所述降解反应是Edman降解。在某些实施方案中，所述方法进一步包含相对于参考序列处理所述序列的至少部分以鉴定所述多肽或衍生出所述多肽的蛋白质。在某些实施方案中，所述方法进一步包含，在(c)之后，(i)鉴定所述多肽的序列的至少部分以鉴定所述多肽，和(ii)使用在(i)中鉴定的多肽来量化所述多肽或衍生出所述多肽的蛋白质。在某些实施方案中，在(a)中，所述多肽的少于所有氨基酸被标记。在某些实施方案中，所述方法进一步包含(i)重复(b)和(c)以检测来自所述多肽的至少一个另外信号或信号变化和(ii)使用所述至少一个信号或信号变化和所述至少一个另外信号或信号变化来鉴定所述序列的至少部分。

许多荧光测序方法的一个特有特征是将氨基酸标记与待测序的肽偶联。标记可以是氨基酸特异性的标记(例如，被构造成偶联至特定类型的氨基酸或特定的一组类型的氨基酸)。荧光测序方法可以包含用单独的氨基酸类型特异性的标记来标记多种类型的氨基酸。荧光测序方法可以包含标记主题肽或蛋白质中的一、二、三、四、五、六种或更多种不同类型的氨基酸残基。多个氨基酸残基可以包括例如N-端氨基酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸或其任何组合。这些氨基酸残基中的每一个可以用不同的标记部分标记。多个氨基酸残基可以用相同的标记部分标记，诸如(i)天冬氨酸和/或谷氨酸或(ii)丝氨酸和/或苏氨酸。

在一个实施方案中，标记肽的方法包含：a)提供，i)肽，其具有至少一个半胱氨酸氨基酸、至少一个赖氨酸氨基酸、N-端末端、具有至少一个羧酸酯侧基的氨基酸、C-端末端和至少一个色氨酸氨基酸，和ii)第一化合物，iii)第二化合物，iv)第三化合物，v)第四化合物，和vi)第五化合物；和b)用所述第一化合物标记所述半胱氨酸，c)用所述第二化合物标记所述赖氨酸，d)用所述第三化合物标记所述N-端末端，e)用所述第四化合物标记所述羧酸酯侧基和所述C-端末端；和f)用所述第五化合物标记所述色氨酸，以提供具有特定标记的肽。在一个实施方案中，b-f按照从b至f的顺序依次进行。在一个实施方案中，在b-f中的标记在一种(单一)溶液中进行。在一个实施方案中，b-f按照从b至f的顺序连续且在一种溶液中执行。在一个实施方案中，所述第一化合物是碘乙酰胺。在一个实施方案中，所述第二化合物是2-甲硫基-2-咪唑啉氢碘酸盐(MDI)。在一个实施方案中，所述第三化合物是l-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基二乙基磷酸酯(Phos-ivDde)。在一个实施方案中，所述第四化合物选自由苄胺(BA)、3-二甲基氨基丙胺和异丁基胺组成的组。在一个实施方案中，所述第五化合物是2,4-二硝基苯磺酰氯。

在一个实施方案中，本文中公开了处理肽的方法，所述方法包含：a)提供固定化在固体支持物上的多个肽，每个肽包含N-端氨基酸和内部氨基酸，所述内部氨基酸包含赖氨酸，每个赖氨酸用第一标记标记，所述第一标记产生每个肽的第一信号，和每个肽的N-端氨基酸用第二标记标记，所述第二标记不同于所述第一标记；b)在使得每个肽的每个N-端氨基酸被除去的条件下处理所述多个固定化的肽；和c)在单分子水平检测每个肽的第一信号。在一个实施方案中，所述第二标记通过胺反应性染料进行连接。在一个实施方案中，所述第二标记选自由异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明或其它合成的荧光异硫氰酸酯衍生物组成的组。在一个实施方案中，所述第一标记的发射谱的部分不与所述第二标记的发射谱重叠。在一个实施方案中，在使得剩余的肽各自具有新的N-端氨基酸的条件下完成在b)中N-端氨基酸的除去。在一个实施方案中，所述方法进一步包含d)将所述第二标记添加至所述剩余肽的新N-端氨基酸。在一个实施方案中，在所述剩余肽中，新的末端氨基酸是赖氨酸。在一个实施方案中，所述方法进一步包含e)在单分子水平检测每个肽的下一个信号。

在一个实施方案中，所述方法进一步包含在使得每个肽的每个N-端氨基酸通过Edman降解反应被除去的条件下处理所述固定化的肽；和在单分子水平检测每个肽的信号。在一个实施方案中，所述标记通过共价键连接至荧光团。在一个实施方案中，当在Edman降解反应溶剂中温育时，所述荧光团和所述共价键耐受降解效应。在某些实施方案中，所述荧光团是在Edman降解测序期间保持完整且连接至标记的荧光团。

在单分子水平重复检测每个肽的信号会产生一种模式。得到的模式对于多个固定化的肽内的单个肽而言是独特的。在一个实施方案中，将所述单个肽模式与生物体的蛋白质组进行对比以鉴定所述肽。在一个实施方案中，在多个固定化的肽中测量标记的强度。在某些实施方案中，通过半胱氨酸残基固定化所述肽。在某些实施方案中，用具有单分子分辨率的光学器件完成在c)中的检测。在一个具体实施方案中，所述多个肽中的一个或多个包含一个或多个非天然氨基酸。

在某些实施方案中，所述第一标记的发射谱不与所述第二标记的发射谱重叠。在某些实施方案中，在使得剩余的肽各自具有新的N-端氨基酸的条件下完成b)中N-端氨基酸的除去。在一个实施方案中，所述方法进一步包含d)将所述第二标记添加至所述剩余肽的新N-端氨基酸。在某些实施方案中，在所述剩余肽中，所述新的末端氨基酸是赖氨酸。在一个实施方案中，所述方法进一步包含e)在单分子水平检测每个肽的下一个信号。在一个实施方案中，在所述多个固定化的肽中测量所述第一和第二标记的强度。在某些实施方案中，所述肽通过半胱氨酸残基固定化。在某些实施方案中，用能够实现单分子分辨率的光学器件完成在c)中的检测。在一个实施方案中，所述多个肽中的一个或多个包含一个或多个非天然氨基酸。在一个实施方案中，所述非天然氨基酸包含选自由羟基羧酸酯、醛、硫醇和烯烃组成的组的部分。在一个实施方案中，所述多个肽中的一个或多个包含一个或多个β氨基酸。

在一个实施方案中，所述方法进一步包含在使得每个肽的每个N-端氨基酸通过Edman降解反应被除去的条件下处理固定化的肽(例如，支持物或珠子)；和在单分子水平检测每个肽的信号。在某些实施方案中，除去所述N-端氨基酸和所述检测连续重复从约1次至约5次、从约5次至约10次、从约10次至约20次、从约20次至约30次、从约30次至约40次、从约40次至约50次、从约50次至约60次、从约60次至约70次、从约70次至约80次、从约80次至约90次或从约90次至约100次。在某些实施方案中，除去所述N-端氨基酸和所述检测连续重复至少约5次、至少约10次、至少约20次、至少约30次、至少约40次、至少约50次、至少约60次、至少约70次、至少约80次、至少约90次或至少约100次。在某些实施方案中，除去所述N-端氨基酸和所述检测连续重复约5次、约10次、约20次、约30次、约40次、约50次、约60次、约70次、约80次、约90次或约100次。在某些实施方案中，除去所述N-端氨基酸和所述检测连续重复至多约5次、至多约10次、至多约20次、至多约30次、至多约40次、至多约50次、至多约60次、至多约70次、至多约80次、至多约90次或至多约100次。

标记可以包含可检测部分。所述可检测部分(即，标记)可以是可光学检测的(例如，荧光的、磷光的、发光的或吸光的)。所述可检测部分可以是电化学可检测的(例如，具有特征氧化或还原电势的氧化还原活性部分)。所述可检测部分可以包含质量标签(例如，用于用质谱法进行鉴定)。可检测部分可以鉴定其所连接的标记。多个标记可以包含多个可检测部分，其通过其类型来鉴定多个标记中的标记。例如，方法可以包含多种类型的标记，其被构造成偶联至不同的氨基酸，每种标记包含通过其类型独特地鉴定标记的不同的可检测部分。

标记特异性可能是荧光测序方法的主要挑战。在许多情况下，标记可以包含针对多种氨基酸类型的反应性。例如，某些马来酰亚胺标记可以与半胱氨酸、赖氨酸和/或N-端胺反应。区分相似反应性氨基酸残基可能需要对标记步骤进行精确排序。在上述马来酰亚胺实例中，可以如下区分赖氨酸和半胱氨酸：首先用半胱氨酸特异性的标记步骤(例如，在pH 7-8的碘乙酰胺偶联)使半胱氨酸反应，从而防止在随后的赖氨酸标记步骤中进一步进行半胱氨酸标记。方法可以包含在赖氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在天冬氨酸和/或谷氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在色氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在酪氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在丝氨酸和/或苏氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在组氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在精氨酸标记之前进行半胱氨酸标记。方法可以包含在谷氨酸标记之前进行赖氨酸标记。方法可以包含在天冬氨酸标记之前进行赖氨酸标记。方法可以包含在色氨酸标记之前进行赖氨酸标记。方法可以包含在酪氨酸标记之前进行赖氨酸标记。方法可以包含在赖氨酸标记之前进行酪氨酸标记。方法可以包含在丝氨酸和/或苏氨酸标记之前进行赖氨酸标记。方法可以包含在精氨酸标记之前进行赖氨酸标记。方法可以包含在色氨酸标记之前进行羧酸酯侧链(例如，谷氨酸和/或天冬氨酸侧链)标记。方法可以包含在酪氨酸标记之前进行羧酸酯侧链(例如，谷氨酸和/或天冬氨酸侧链)标记。方法可以包含在丝氨酸标记之前进行羧酸酯侧链(例如，谷氨酸和/或天冬氨酸侧链)标记。方法可以包含在丝氨酸和/或苏氨酸标记之前进行羧酸酯侧链(例如，谷氨酸和/或天冬氨酸侧链)标记。方法可以包含在组氨酸标记之前进行羧酸酯侧链(例如，谷氨酸和/或天冬氨酸侧链)标记。方法可以包含在精氨酸标记之前进行羧酸酯侧链(例如，谷氨酸和/或天冬氨酸侧链)标记。方法可以包含在赖氨酸标记之前进行C-端羧酸酯标记。方法可以包含在酪氨酸标记之前进行C-端羧酸酯标记。方法可以包含在组氨酸标记之前进行C-端羧酸酯标记。方法可以包含在色氨酸标记之前进行C-端羧酸酯标记。方法可以包含在谷氨酸和/或天冬氨酸标记之前进行C-端羧酸酯标记。方法可以包含在丝氨酸和/或苏氨酸标记之前进行C-端羧酸酯标记。方法可以包含按被构造成最小化或防止标记交叉反应性(例如，标记多于预期的一种或多种类型的氨基酸)的顺序进行的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个氨基酸标记步骤。方法可以包含按被构造成最小化或防止标记交叉反应性(例如，标记多于预期的一种或多种类型的氨基酸)的顺序进行的2个、3个、4个、5个或6个氨基酸标记步骤。

荧光测序可以包含在主题肽检测之后或之前通过诸如Edman降解之类的技术除去肽。连续的肽除去可以产生序列或位置特异性信息。例如，在N-端氨基酸除去步骤之后荧光的减少可能指示，标记的氨基酸和/或因此特定类型的氨基酸被布置在肽N-端。每个氨基酸残基的除去可以用多种不同的技术进行，包括Edman降解和/或蛋白质水解性切割。所述技术可以包括使用Edman降解来除去末端氨基酸残基。可替换地，所述技术可以涉及使用酶来除去末端氨基酸残基。可以从肽链的C-端或N-端除去这些末端氨基酸残基。在使用Edman降解的情况下，在肽链N-端处的氨基酸残基被除去。

在一个实施方案中，所述标记通过共价键连接至荧光团。在一个实施方案中，当在Edman降解反应溶剂中温育时，所述荧光团和所述共价键耐受降解效应。在本申请中使用的标记部分可以被构造成耐受除去一个或多个氨基酸残基的条件。可以用于本发明的方法中的潜在标记部分的一些非限制性例子包括例如在红色至红外光谱中发射荧光信号的那些，诸如Alexa 染料、Atto染料、Janelia />染料、罗丹明染料或其它类似的染料。能够耐受除去氨基酸残基的条件的这些染料中的每一种的例子包括Alexa />405、罗丹明B、四甲基罗丹明、Janelia />549、Alexa />555、Atto647N和/或(5)6-萘基荧光素。在某些实施方案中，标记部分是四甲基罗丹明、Si-罗丹明、罗丹明B、罗丹明B N,N'-二甲基乙二胺、罗丹明B磺酰氯、Alexafluor555、Alexa Fluor 405、Atto647N、(5)6-萘基荧光素、其变体和衍生物等。在一个实施方案中，所述荧光团选自由四甲基罗丹明、Si-罗丹明、罗丹明B、罗丹明B N,N'-二甲基乙二胺、罗丹明B磺酰氯、Alexafluor555、AlexaFluor 405、Atto647N、(5)6-萘基荧光素、其变体和衍生物组成的组。所述标记部分可以是荧光肽或蛋白质或量子点。在某些实施方案中，两色单分子肽测序反应可以用于使用两种或更多种荧光分子来鉴定和量化生物分子。

在某些实施方案中，可以从生物分子的羧基端除去氨基酸，从而揭示C-端序列而不是N-端序列。在某些实施方案中，使用经工程改造的羧肽酶模仿Edman降解。

在某些实施方案中，本文中公开的方法包含鉴定肽中的氨基酸，包含：a)提供固定化在固体支持物上的多个肽，每个肽包含N-端氨基酸和内部氨基酸，所述内部氨基酸包含赖氨酸，每个赖氨酸用第一标记标记，所述第一标记产生每个肽的第一信号，和每个肽的N-端氨基酸用第二标记标记，所述第二标记不同于所述第一标记和选自由Alexa fluor染料和Atto染料组成的组，其中所述多个肽的亚集包含具有所述第一和第二标记的N-端赖氨酸；b)在使得每个肽的每个N-端氨基酸通过Edman降解反应被除去的条件下处理所述多个固定化的肽；和c)在使得包含N-端赖氨酸的肽的亚集被鉴定的条件下，在单分子水平检测每个肽的第一信号。优选的是，在使得剩余的肽各自具有新的N-端氨基酸的条件下完成在b)中N-端氨基酸的除去。在一个实施方案中，本公开内容进一步考虑鉴定肽中的氨基酸的方法，所述方法包含：a)提供固定化在固体支持物上的多个肽，每个肽包含N-端氨基酸和内部氨基酸，所述内部氨基酸包含赖氨酸，每个赖氨酸用第一标记标记，所述第一标记产生每个肽的第一信号，和每个肽的N-端氨基酸用第二标记标记，所述第二标记不同于所述第一标记和选自由Alexa fluor染料和Atto染料组成的组，其中所述多个肽的亚集包含不是赖氨酸的N-端氨基酸；b)在使得每个肽的每个N-端氨基酸通过Edman降解反应被除去的条件下处理所述多个固定化的肽；和c)在使得包含不是赖氨酸的N-端氨基酸的肽的亚集被鉴定的条件下，在单分子水平检测每个肽的第一信号。优选的是，在使得剩余的肽各自具有新的N-端氨基酸的条件下，完成在b)中N-端氨基酸的除去。优选的是，所述肽通过半胱氨酸残基固定化。在一个实施方案中，所述多个肽中的一个或多个包含一个或多个非天然氨基酸。在一个实施方案中，所述非天然氨基酸包含选自由羟基羧酸酯、醛、硫醇和烯烃组成的组的部分。在一个实施方案中，所述多个肽中的一个或多个包含一个或多个β氨基酸。

检测固定化的肽可以包含捕获包含所述肽的图像。所述图像可以包含所述肽特有的空间地址。可以在单个图像中检测多个肽，其中一个或多个肽可以包含在所述图像内的空间地址。所述表面可以在可见光谱和/或红外光谱内是光学透明的。所述表面可以具有低折射率(例如，在1.3至1.6之间的折射率)。所述表面可以是10至50nm厚、20至80nm厚、50至200nm厚、100至500nm厚、200至800nm厚、500nm至1μm厚、1至5μm厚、2至10μm厚、5至20μm厚、20至50μm厚、50至200μm厚、200至500μm厚或大于500μm厚。所述表面可以对有机溶剂具有化学耐受性。所述表面可以对强酸诸如三氟乙酸或硫酸具有化学耐受性。多种基底(如含氟聚合物(Teflon-AF(Dupont)、(Asahi Glass，日本))、芳族聚合物(聚二甲苯(聚对二甲苯,Kisco,Calif.)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯)和金属表面(金涂层))、涂层方案(旋涂、浸涂、金属电子束沉积、热气相沉积和/或等离子体增强的化学气相沉积)和/或官能化方法(聚烯丙胺接枝、在PECVD中使用氨气、掺杂长链末端官能化的氟代烷烃等)可以在本文描述的方法中用作有用的表面。由/>制成的20nm厚的、光学透明的含氟聚合物表面可以用在本文描述的方法中。本文使用的表面可以进一步用多种氟代烷烃衍生化，所述氟代烷烃将分隔肽用于测序和/或修饰靶标用于选择。可替换地，氨基硅烷修饰的表面可以用在本文描述的方法中。所述方法可以包含将所述肽固定化在珠子、树脂、凝胶、石英颗粒、玻璃珠或其组合的表面上。在某些非限制性例子中，所述方法考虑使用已经被固定化在珠子、/>树脂或其它类似珠子或树脂的表面上的肽。本文使用的表面可以涂有聚合物，诸如聚乙二醇。所述表面可以是胺官能化的或硫醇官能化的。

本文描述的测序技术可以涉及对肽或蛋白质进行成像以确定与所述肽偶联的一个或多个标记部分(例如，氨基酸标记)的存在。所述测序技术可以包含对多个肽或蛋白质进行成像以确定一种或多种标记部分在所述多个肽中的各个肽上的存在。所述测序技术可以包含对从约10³至约10⁴个、从约10⁴至约10⁵个、从约10⁵至约10⁶个、从约10⁶至约10⁷个或从约10⁷至约10⁸个蛋白质或肽进行成像。所述测序技术可以包含对至少约10³个、至少约10⁴个、至少约10⁵个、至少约10⁶个、至少约10⁷个或至少约10⁸个或更多个蛋白质或肽进行成像(例如，对包含至少约10³个至至少约10⁸个蛋白质或肽的表面的部分进行成像)。所述测序技术可以包含对约10³个、约10⁴个、约10⁵个、约10⁶个、约10⁷个或约10⁸个或更多个蛋白质或肽进行成像(例如，对包含约10³至约10⁸个蛋白质或肽的表面的部分进行成像)。所述测序技术可以包含对至多约10³个、至多约10⁴个、至多约10⁵个、至多约10⁶个、至多约10⁷或至多约10⁸个或更多个蛋白质或肽进行成像(例如，对包含至多约10³个至至多约10⁸个蛋白质或肽的表面的部分进行成像)。

可以在每次除去氨基酸残基之后拍摄这些图像，并因此可以使得能够确定特定氨基酸在肽序列中的位置。例如，C-端固定化的肽可以包含KDDYAGGGAAGKDA的序列(从N-端到C-端)(其中‘K’表示赖氨酸，‘D’表示天冬氨酸，‘Y’表示酪氨酸，‘A’表示丙氨酸，且‘G’表示甘氨酸)，和/或可以包含偶联至每个赖氨酸和/或酪氨酸残基的标记。包含C-端固定化的肽的第一图像可以表明在肽中存在两个赖氨酸和/或一个酪氨酸。可以除去N-端氨基酸(例如，通过Edman降解)，使得包含C-端固定化的肽的第二图像可以表明在肽中存在一个赖氨酸和/或一个酪氨酸。可以重复该过程，直到为肽鉴定出KXXYXXXXXXXKX的序列，其中‘X’指示非赖氨酸、非酪氨酸氨基酸，‘K’指示赖氨酸，且‘Y’指示酪氨酸。本公开内容的方法可以鉴定特定氨基酸在肽序列中的位置。可以使用一种方法来确定特定氨基酸残基在肽序列中的位置，或者可以使用这些结果来确定在肽序列中氨基酸残基的完整列表。一种方法可以涉及确定肽序列中一个或多个氨基酸残基的位置和/或将这些位置与已知的肽序列进行对比，这可以鉴定在肽序列中的氨基酸残基的完整列表。例如，鉴定人蛋白质的40个氨基酸片段中赖氨酸和/或半胱氨酸的位置可以独特地鉴定所述蛋白质(例如，只有一种人蛋白质含有在40个氨基酸片段中鉴定的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的特定模式)。

一种成像方法可以涉及多种不同的分光光度法和/或显微法，诸如荧光测定法、漫反射、干涉散射、拉曼、共振增强拉曼、红外吸光度、可见光吸光度、紫外吸光度和/或荧光。在某些实施方案中，配备了全内反射照明和/或增强电荷耦合器件(CCD)检测器的显微镜可以用于成像。根据所使用的荧光Edman标记的吸收和发射光谱，可以使用适当的滤光片来记录标记的发射强度。所述荧光方法可以采用这样的荧光技术，诸如荧光偏振、Forster共振能量转移(FRET)或时间分辨荧光。分光光度法或显微法可以用于确定与单个肽偶联的一种或多种荧光团的存在。这样的成像方法可以用于确定标记在特定肽序列上的存在或不存在。在除去氨基酸残基和/或对主题肽进行成像的重复循环之后，可以确定标记的氨基酸残基在肽中的位置。

对于每个Edman循环，在每个切割步骤后记录标记的荧光强度。在每个切割步骤和偶联步骤之后标记的丢失和摄取用作1)除去的氨基酸残基的数目的计数器，和2)指示每个固定化的肽的每轮Edman降解成功完成的内部错误对照。

在经过图像处理以过滤噪音和鉴定肽的位置和在收集的图像组中映射相同肽的位置之后，标记的强度分布作为Edman循环的函数与每个肽相关联。每个无错误肽测序反应的标记强度分布被转化为二元序列，其中“1”在荧光强度的下降和其位置(即在二元序列内的位置)之前。鉴定进行的Edman循环的数目。预测的潜在蛋白质的数据库用作参考数据库。然后将单分子显微术生成的每个肽的二元强度分布与模拟肽数据库中的条目进行对比。可以通过对源自观察的每种蛋白质的肽进行计数来完成定量。

应用

本公开内容的方面提供了用于区分生物样品中的第一多个细胞与第二多个细胞的方法。在许多情况下，所述方法包含量化生物样品中第一细胞和第二细胞的总丰度或相对丰度。在特定情况下，第一多个细胞和第二多个细胞可以包含不同的特征或性质，并且所述方法可以包含测量来自样品的特征或性质的差异以区分所述第一多个细胞与所述第二多个细胞。在某些情况下，可以区分三个或更多个多个细胞。

在某些实施方案中，所述细胞是红血细胞、干细胞、骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、性细胞、胰腺细胞或癌细胞。在某些实施方案中，所述细胞是红血细胞。在某些实施方案中，所述细胞是皮肤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是肌肉细胞。在某些实施方案中，所述细胞是内皮细胞。在某些实施方案中，所述细胞是癌细胞。

本公开内容的方面提供了用于区分生物样品中的第一多个红血细胞与第二多个红血细胞的方法。在许多情况下，所述方法包含量化生物样品中第一和第二红血细胞的总丰度或相对丰度。在特定情况下，第一多个红血细胞和第二多个红血细胞可以包含不同的血红蛋白特性(例如，不同比例的血红蛋白类型，诸如HbA和/或HbA1c)，并且所述方法可以包含测量来自样品的红血细胞的血红蛋白特性以区分第一多个红血细胞与第二多个红血细胞。在某些情况下，可以区分三个或更多个多个红血细胞。

这样的技术的一个相关具体应用是鉴定职业运动中的自体输血。由于过去几十年已经提供了关于类固醇和/或生长激素使用的一系列检测技术，运动员已经逐渐转向“血液兴奋剂”，即输入之前的血液以增加红血细胞计数并从而提高携氧能力的做法。血液兴奋剂仍然是一种难以发现的做法，因为平均血液生物标志物水平经常因输血而可忽略不计地偏移。因此，在单细胞水平上鉴定生物标志物的方法可能特别适合用于鉴定运动员的血液兴奋剂。

本公开内容的多个方面提供了用于区分生物样品中的第一多个细胞与第二多个细胞的方法。在许多情况下，所述方法对第一多个细胞和第二多个细胞进行定量。例如，方法可以确定生物样品中第一多个细胞和第二多个细胞之间的比率。在某些情况下，所述方法包含分隔生物样品，从而产生至少一个第一分隔物，其包含来自第一多个细胞的一个细胞和一个珠子，以及至少一个第二分隔物，其包含来自第二多个细胞的一个细胞和一个珠子。在某些情况下，所述方法包含测量来自至少一个第一分隔物的分子的第一表达水平和测量来自至少一个第二分隔物的分子的第二表达水平，并确定所述第一表达水平和所述第二表达水平之间的差异。在某些情况下，所述第一表达水平和第二表达水平对应于相同类型的分子或不同类型的分子。

所述第一和第二表达水平可以指示生物学状态或状况。例如，糖化血红蛋白水平在自体输注的红血细胞中可能升高，但也可以指示许多代谢障碍，诸如糖尿病。如图7所示，鉴定自体输血的一个挑战是大量血红蛋白分析(例如，从一组细胞中取平均值)可能无法区分具有掺杂的糖化血红蛋白水平和/或样品中所有细胞间糖化血红蛋白水平具有小幅增加的红血细胞的亚群体。图7A-7B描绘了具有不同红血细胞HbA1c:HbA比率(下图)的两个单独人群(上图)。底部图提供了血液中HbA1c与HbA的相对水平的直方图，其中x轴提供了HbA1c与HbA比率，和/或y轴提供了在每个比率下的细胞计数。从这些图可以看出，两个人群可以通过他们的平均红血细胞HbA1c水平容易地区分，这由虚线701和702描绘。但是，在将来自第二群体的少量血液加入来自第一群体的血液样品中后(如图7C所示)，样品中血细胞的平均HbA1c:HbA比率(虚线703)可能仅偏移小量，使得测量的平均值无法将掺杂样品与来自第一群体的纯样品区分开。但是，通过在单细胞水平测量HbA1c:HbA比率，可以容易地区分两个单独的群体704和705。因此，本公开内容的方法提供了在单细胞基础上测量表达水平。在许多情况下，可以分辨细胞亚群体的存在，从而比如果针对多个细胞测量平均生物分子水平更清楚地定义患者的生物学状态。

红血细胞含有大量表达产物，其可以充当多种生物状态的标志物。在某些情况下，测量的表达水平可以表示乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质或糖基化的蛋白质的量。在某些情况下，所述分子是HbA。在某些情况下，所述分子是HbA1c。在自体血液转移的情况下，HbA1c水平可能相对于HbA水平升高。但是，与天然红血细胞水平相比，自体输注的红血细胞的丰度经常较低。因此，自体血液转移经常提供平均红血细胞HbA1c水平的小漂移，这不足以确定样品是否包含自体转移的血液。但是，当在单细胞水平测量HbA1c水平时，来自自体转移的血液的红血细胞群体可以容易地与天然血细胞群体区分开，并因此可以充当准确的诊断标志物。

在某些情况下，所述方法包含在分隔生物样品之后，裂解来自第一多个红血细胞的一个红血细胞和来自第二多个红血细胞的一个红血细胞。在某些情况下，所述方法包含在测量表达水平之前将来自第一分隔物和第二分隔物的HbA片段化。在某些情况下，所述方法包含在测量表达水平之前将来自第一分隔物和第二分隔物的HbA分别固定化至第一珠子和第二珠子。

可以用多种方法测量第一和第二表达水平。所述测量可以对一类分子(例如，任何形式的血红蛋白)或对特定形式的生物分子具有特异性。例如，测量可以特异性地检测具有特定翻译后修饰的蛋白质，诸如N-端缬氨酸糖化的HbA。在某些情况下，所述测量包含检测翻译后修饰，所述翻译后修饰包含氧化、糖化或糖基化。

在某些情况下，所述测量包含将第一抗体偶联至表达产物。此外，所述测量可以包含将第二抗体偶联至第一抗体表达产物。在某些情况下，所述第一抗体对某种类型的蛋白质具有特异性，和/或所述第二抗体对特定翻译后修饰具有特异性。以此方式，可以测量一种蛋白质的表达水平和/或翻译后修饰的普遍性。例如，所述测量可以包含将第一抗体偶联至HbA上的第一表位和/或将第二抗体偶联至HbA上的特定翻译后修饰，诸如N-端缬氨酸糖化。

试剂盒

本公开内容的多个方面提供了用于测定来自细胞的分子的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于分隔细胞的试剂。所述试剂盒可以包含用于检测来自细胞的生物分子的试剂。所述试剂盒可以包含与商业销售分选仪器兼容的试剂或组分。在某些情况下，试剂盒包含用于测量来自细胞的分子的表达水平的多个珠子和/或多个检测部分。在某些情况下，所述细胞是红血细胞。在某些情况下，珠子包含蛋白质捕获部分。在某些情况下，所述蛋白质捕获部分包含马来酰亚胺。在某些情况下，珠子是磁性的(例如，是聚合物包被的SPION)。在某些情况下，所述试剂盒包含使用多个珠子和/或多个检测部分来测定来自细胞的分子的说明书。

在某些实施方案中，本文公开了用于测定来自细胞的生物分子的试剂盒，其包含：(a)多个珠子，其中所述多个珠子包含蛋白质捕获部分；(b)多个检测部分，其用于测量来自细胞的生物分子的表达水平；和/或(c)关于使用所述多个珠子和所述多个检测部分来测定来自细胞的生物分子的说明书。在某些实施方案中，所述多个珠子包含蛋白质捕获部分，所述蛋白质捕获部分包含与靶生物分子形成共价键的反应基团。在某些实施方案中，所述多个珠子包含蛋白质捕获部分，所述蛋白质捕获部分包含马来酰亚胺基团。在某些实施方案中，所述多个珠子包含蛋白质捕获部分，所述蛋白质捕获部分包含卤代乙酰基基团。在某些实施方案中，所述多个珠子包含蛋白质捕获部分，所述蛋白质捕获部分包含吡啶基二硫化物基团。

在某些实施方案中，本文公开了用于量化单个红血细胞中的HbA和/或HbA1c水平的试剂盒，其包含：(i)多个珠子，其中至少一个珠子包含马来酰亚胺捕获部分；(ii)包含第一标记的HbA1c靶向抗体；(iii)包含第二标记的HbA靶向抗体；(iv)三(2-羧基乙基)膦(TCEP)；(v)裂解缓冲液；(vi)变性试剂；(vii)牛血清白蛋白质；和/或(viii)关于使用多个珠子与抗体和/或试剂来量化单个红血细胞中的HbA和/或HbA1c水平的说明书。

所述试剂盒可以包含另外的组分。在某些情况下，所述试剂盒包含裂解试剂。在某些情况下，所述试剂盒包含变性试剂。在某些情况下，所述变性试剂包含去污剂。在某些情况下，所述试剂盒包含蛋白质酶。在某些情况下，所述试剂盒包含校准物。在某些情况下，所述校准物包含用确定量的靶生物分子官能化的珠子。例如，用于测量HbA1c的测定可以包含用已知量的HbA1c官能化的校准珠子，从而允许将来自测定的信号(例如，信号强度)校准至获得的靶生物分子的量。在某些情况下，所述试剂盒包含还原剂。在某些情况下，所述试剂盒包含偶联剂。在某些情况下，所述偶联剂是酶促偶联剂。在某些情况下，所述试剂盒包含缓冲液。在某些情况下，所述缓冲液是裂解缓冲液。在某些情况下，在缓冲液中提供试剂(例如，变性试剂)。在某些情况下，在不同的缓冲液中提供两种试剂。在某些情况下，所述分子是乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白A1c(HbA1c)或血红蛋白F(HbF)。在某些情况下，所述分子是血红蛋白。在某些情况下，所述分子是HbA或HbA1c。

在某些情况下，所述细胞是红血细胞。在某些情况下，所述生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)和血红蛋白F(HbF)组成的组。在某些情况下，所述多个珠子被磁性标记。在某些情况下，所述多个珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。在某些情况下，所述多个珠子包含从约1μm至约5μm的平均直径。在某些情况下，所述多个珠子包含至少10⁶个捕获部分。在某些情况下，所述多个珠子包含至少10⁷个捕获部分。

在某些情况下，所述多个珠子包含条形码。在某些情况下，所述条形码是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、多肽或其组合。在某些情况下，所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。在某些情况下，所述条形码包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或苯丙氨酸。在某些情况下，所述条形码包含非天然氨基酸。在某些情况下，所述多个检测部分包含氨基酸特异性标记。

在某些情况下，所述多个检测部分包含氨基酸特异性标记。所述氨基酸特异性标记可以包含结合特定类型(例如，组氨酸)或类别(带有羧酸侧链的)氨基酸的部分。所述氨基酸特异性标记可以包含结合特定翻译后修饰(诸如磷酰基基团或特定糖基化模式)的部分。所述氨基酸特异性标记的部分可以共价连接至靶氨基酸，和/或可以包含小分子，诸如马来酰亚胺。所述氨基酸特异性标记可以是光学可检测的。在某些情况下，所述氨基酸特异性标记包含用于检测的光学活性标记，诸如染料。在某些情况下，所述氨基酸特异性标记是光学可检测的。在某些情况下，所述多个检测部分包含第一抗体和第二抗体。

在某些情况下，所述多个检测部分包含抗体。在某些情况下，所述多个检测部分包含第一抗体和第二抗体。在某些情况下，所述第一抗体和所述第二抗体包含对于不同形式的血红蛋白的互补位。例如，所述第一抗体可以包含HbA的互补位，并且所述第二抗体可以包含糖化的HbA(HbA1c)的互补位。

在某些情况下，给多个氨基酸特异性标记提供不同的光学可检测标记。例如，一组5种氨基酸特异性标记可以包含具有不同荧光谱的5种单独染料，从而允许通过荧光区分这5种标记。在某些情况下，试剂盒包含具有第一标记的第一抗体和具有第二标记的第二抗体。在某些情况下，所述第一标记和第二标记包含不同的光学可检测的部分。

在某些情况下，所述试剂盒能够量化单个红血细胞中的HbA和/或HbA1c水平。在某些情况下，所述试剂盒包含多个珠子、包含第一标记的HbA1c靶向抗体、包含第二标记的HbA靶向抗体、还原剂、裂解缓冲液和/或变性试剂。在某些情况下，至少一个珠子包含马来酰亚胺捕获部分。在某些情况下，所述试剂盒包含牛血清白蛋白质。在某些情况下，所述还原试剂包含三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。在某些情况下，所述试剂盒包含关于使用多个珠子与抗体和/或试剂来量化单个红血细胞中的HbA和/或HbA1c水平的说明书。

计算机系统

本公开内容提供了被编程以实现本公开内容的方法的计算机系统。图8显示了计算机系统801，其被编程或以其它方式构造成实现本文公开的方法或方法的部分，包括编译、分析和/或显示通过本方法获得的数据。计算机系统801可以调节本公开内容的各个方面，诸如、例如控制细胞分隔和/或光学成像装置。计算机系统801可以是用户的电子设备或者相对于电子设备位于远程的计算机系统。所述电子设备可以是移动式电子设备。

计算机系统801包括中央处理单元(CPU，本文中也被称作“处理器”和/或“计算机处理器”)805，其可以是单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统801还包括存储器或存储器位置810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元815(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它系统通信的通信接口820(例如，网络适配器)和/或外围设备825，诸如高速缓冲存储器、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器810、存储单元815、接口820和/或外围设备825通过通信总线(实线)诸如母板与CPU 805通信。存储单元815可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统801可以借助于通信接口820可操作地偶联至计算机网络(“网络”)830。网络830可以是因特网、因特网和/或外联网、或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在某些情况下，网络830是电信和/或数据网络。网络830可以包括一台或多台计算机服务器，其可以实现分布式计算，诸如云计算。在某些情况下，借助于计算机系统801，网络830可以实现点对点网络，其可以使得偶联至计算机系统801的设备能够充当客户端或服务器。

CPU 805可以执行一系列机器可读的指令，其可以体现在程序或软件中。所述指令可以存储在存储器位置中，诸如存储器810。所述指令可以被引导至CPU 805，其可以随后对CPU 805进行编程或以其它方式构造以实现本公开内容的方法。由CPU 805执行的操作的例子可以包括获取、解码、执行和/或写回。

CPU 805可以是电路(诸如集成电路)的一部分。系统801的一个或多个其它组件可以被包括在所述电路中。在某些情况下，所述电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元815可以存储文件，诸如驱动程序、文库和/或保存的程序。存储单元815可以存储用户数据，例如用户偏好和/或用户程序。在某些情况下，计算机系统801可以包括在计算机系统801外部的一个或多个附加数据存储单元，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统801通信的远程服务器上。

计算机系统801可以通过网络830与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统801可以与用户的远程计算机系统(例如，荧光计或细胞分选装置)通信。远程计算机系统的例子包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板电脑或笔记本计算机(例如，iPad、/>Galaxy Tab)、电话、智能手机(例如/>iPhone、支持Android的设备、/>)或个人数字助理。用户可以通过网络830访问计算机系统801。

通过存储在计算机系统801的电子存储位置上(诸如、例如存储器810或电子存储单元815上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码，可以实现本文描述的方法。机器可执行的或机器可读的代码可以以软件的形式提供。在使用过程中，可以由处理器805执行代码。在某些情况下，可以从存储单元815检索代码并将其存储在存储器810上以供处理器805迅速访问。在某些情况下，可以排除电子存储单元815，和/或将机器可执行的指令存储在存储器810上。

所述代码可以被预编译和/或被构造为与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间被编译。可以以编程语言来提供代码，可以选择所述编程语言来使得所述代码能够以预编译的或编译(as-compiled)的方式执行。

本文提供的系统和方法的方面，诸如计算机系统801，可以以编程来体现。所述技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制成品”，通常以在一种类型的机器可读介质上承载或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器、或其关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器和/或类似物，它们可以随时提供非暂时性存储进行软件编程。全部或部分的软件有时可以通过因特网或各种其它电信网络进行通信。这样的通信例如可以实现将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件要素的另一种类型的介质包括光波、电波和/或电磁波，诸如通过有线和/或光固定(landline)网络和/或通过各种空中链路跨本地设备之间的物理接口使用。承载这样的波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文中使用的，除非限于非暂时的、有形的“存储”介质，否则术语诸如计算机或机器“可读介质”表示参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，机器可读介质诸如计算机可执行代码可以采取多种形式，包括、但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如在任何计算机中的任何存储设备或类似物质，诸如可以用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和/或光纤，包括构成计算机系统内的总线的电线。载波传输介质可以采用电或电磁信号、或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和/或红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡片纸带、带有孔模式的任何其它物理存储介质、RAM、ROM、PROM和/或EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储芯片或筒、传输数据或指令的载波、传输这样的载波的电缆或链路、或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。许多这些形式的计算机可读介质可参与将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。

计算机系统801可以包括电子显示器835或与电子显示器835通信，电子显示器835包含用户界面(UI)840，其提供例如用于控制在细胞分选装置中的流速的命令和/或选项。UI的例子包括但不限于图形用户界面(GUI)和/或基于网络的用户界面。

本公开内容的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。一种算法可以通过软件由中央处理单元805执行后来实现。所述算法可以例如使用二次判别分析(QDA)、支持向量机(SVM)、线性判别分析(LDA)、二次判别分析(QDA)、朴素贝叶斯、随机森林或任何其它合适的方法确定相关性。

实施例

实施例1：用于蛋白质捕获的官能化的珠子

本实施例提供了包含多个反应位点的珠子。所述反应位点通过允许珠子结合被设计成结合感兴趣的生物分子的捕获部分来为珠子提供模块化。以此方式，包含捕获部分的珠子可以作为多功能试剂提供(例如，在试剂盒中)，并且可以随后为特定测定被官能化。

图4示出了反应位点和捕获部分(402)官能化的珠子(401)，以及描绘在非捕获部分官能化的珠子和捕获部分官能化的珠子上的绿色荧光蛋白质(GFP)捕获的荧光显微镜图像。20μm珠子401包含多个抗生蛋白链菌素反应位点402。第一组珠子用包含生物素(用于结合珠子上的抗生蛋白链菌素)和蛋白质捕获试剂PCA(其能够结合蛋白质N-末端)的捕获部分403官能化。第二组珠子未偶联至捕获部分。然后将第一组和第二组珠子与1mg/mL GFP一起温育、洗涤并在显微镜下成像。图像404显示了未官能化(缺乏捕获部分)珠子的结果，提供为重叠的明视野和FITC通道图像。图像405显示了捕获部分官能化的珠子的结果，提供为重叠的明视野和FITC通道图像。比例条406描绘了200μm。捕获部分官能化的珠子的图像提供比未官能化的珠子高得多的荧光强度，从而证明捕获部分、特别是PCA官能化的珠子能够结合蛋白质。

实施例2：实验室集成单细胞测定

图5A-5D示出了可以在两个仪器上执行的符合本公开内容的测定，以及在本公开内容中使用的微流体芯片的设计。图5A提供了能够形成包含细胞和珠子的油包水微滴的微流体芯片的视图。图5B提供了图5A的微流体芯片中的微流体连接部的显微镜图像，其中形成油包水微滴。微流体连接部501包含通道502，包含细胞和珠子的水性介质通过其流入；两个通道502，油通过其流入；以及通向排出通道504的狭窄开口503。狭窄开口为在连接部处形成的微滴505提供均匀性。图5C提供了微流体连接部的显微镜图像，其中可以在微滴505中看到珠子506。

图5D提供了在微流体连接部处形成微滴的示意图。第二微流体连接部507设置在其中形成油包水微滴的微流体连接部508的上游。在该连接部，细胞和试剂通过第一通道509流入，以与通过第二通道510流入的珠子会聚。在每个通道中的流速和浓度都经过优化，使得平均微滴包含一个珠子和一个细胞。

实施例3：HbA和HbA1c校准珠子组

本实施例提供了一组可用作HbA1c测定中的校准物的珠子。该校准物组包含四种溶液，其含有5.0％、7.9％、10.9％和13.7％HbA1c(相对于总血红蛋白)，以干燥的低压冻干形式提供，并且其可以用缓冲液(例如，裂解缓冲液)重构。然后通过温育不同量(10⁶、10⁷或10⁸)的马来酰亚胺官能化的珠子，从重构的HbA1c样品中产生校准珠子。

图6总结了用于产生每种校准物的珠子计数和HbA1c水平。产生两种荧光抗体表位：1)具有Alexa fluor 488的HbA-α链(1-37氨基酸)；和2)具有Atto647N的HbA-β链HbA1c。产生的三组珠子具有5.0、7.9、10.9和13.7的HbA1c相对水平(相对于血红蛋白的百分比)。所述校准物旨在重现在红血细胞中的HbA1c变化性。校准物组还能够确定测定的最低定量限度。

校准珠子可以充当阳性或阴性对照。阴性对照珠子可以包含非靶生物分子，诸如牛血清白蛋白质，并且因此可以提供基线信号，诸如与珠子结合的非特异性荧光抗体的估计值。阳性对照珠子(例如，包含96％纯的HbA1c蛋白质)可以充当校准物，并且还可以使得能够定量靶分析物。组合物、方法或试剂盒可以提供多个包含不同水平的靶分析物的校准珠子。组合物、方法或试剂盒可以提供阳性对照珠子和/或阴性对照珠子。

实施例4：通过荧光测序检测标记和生物分子

通过荧光测序鉴定被固定化在捕获珠子上的生物分子，诸如肽。简而言之，该过程包括以下：(1)用荧光团标记在肽上的氨基酸：基于氨基酸侧链的化学反应性，安装不同的荧光团。每种氨基酸类型用选择的荧光团标记，并且荧光团具有相互可区分的荧光性能。C-端羧酸被选择性修饰以形成炔烃部分。(2)然后从珠子释放荧光标记的肽，并使用铜辅助的点击化学固定化在叠氮化物官能化的玻璃载玻片上。(3)将肽固定化在玻璃载玻片上之后，使用全内部反射荧光(TIRF)显微镜光学器件以单分子分辨率对荧光肽进行成像。(4)通过流体管线进行Edman降解化学，其涉及以下循环：在40℃碱温育(20％异硫氰酸苯酯(v/v于吡啶中)40分钟，然后在TFA中在40℃温育30分钟。每个循环都从肽主链切割N-端氨基酸。(5)在Edman降解的每个循环之后，物镜扫描玻璃载玻片，从而获取一千个(1000s)视野的图像并生成数百万个单独肽点的强度分布。(6)进行图像处理和计算分析以鉴定荧光氨基酸的位置，从而鉴定每个单独肽的荧光序列。将荧光序列与参考肽的数据库进行匹配以确认肽的身份并允许对混合物中的肽进行量化。

尽管在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员明显的是，这样的实施方案仅作为示例提供。本发明无意受限于在说明书内提供的具体实施例。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和/或例证无意以限制性含义进行解释。现在本领域技术人员将做出众多变动、变化和/或替换而不脱离本发明。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体叙述、构造或相对比例，其取决于各种条件和/或变量。应当理解，本文描述的发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。因此，本发明意在还应涵盖任何这样的替代、修改、变动或等同。以下权利要求意图限定本发明的范围，并且由此覆盖在这些权利要求范围内的方法和结构和它们的等同方案。

实施方案

以下非限制性的实施方案提供了本发明的示例性实施例，但不限制本发明的范围。

实施方案1.一种方法，其包含：

a.在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；

b.将所述缀合物收集到容器中；

c.用至少一种可检测部分标记所述容器中的缀合物的至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和

d.检测所述至少一种标记的生物分子。

实施方案2.实施方案1的方法，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

实施方案3.实施方案1或2的方法，其中所述微滴包含水溶液。

实施方案4.实施方案1-3中的任一个的方法，其中所述微滴是油包水微滴。

实施方案5.实施方案1-4中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

实施方案6.实施方案1-5中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约100pL至约200pL的平均体积。

实施方案7.实施方案1-6中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

实施方案8.实施方案1-7中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含低渗的裂解溶液。

实施方案9.实施方案7的方法，其中所述细胞裂解溶液包含聚氧乙烯山梨醇酯。

实施方案10.实施方案7的方法，其中所述细胞裂解溶液包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇。

实施方案11.实施方案7的方法，其中所述细胞裂解溶液包含十二烷基硫酸钠。

实施方案12.实施方案1-11中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

实施方案13.实施方案12的方法，其中所述缓冲液包含磷酸钠。

实施方案14.实施方案12的方法，其中所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。

实施方案15.实施方案12的方法，其中所述缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水。

实施方案16.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是多肽。

实施方案17.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是蛋白质。

实施方案18.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内肽。

实施方案19.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内蛋白质。

实施方案20.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是分泌型肽。

实施方案21.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是分泌型蛋白质。

实施方案22.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

实施方案23.实施方案1-15中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是血红蛋白A1c(HbA1c)。

实施方案24.实施方案1-23中的任一个的方法，其中所述细胞是红血细胞。

实施方案25.实施方案1-24中的任一个的方法，其中所述支持物是珠子。

实施方案26.实施方案25的方法，其中所述珠子是磁珠。

实施方案27.实施方案25的方法，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

实施方案28.实施方案25的方法，其中所述珠子包含从约1μm至约5μm的平均直径。

实施方案29.实施方案25的方法，其中所述珠子包含捕获部分。

实施方案30.实施方案29的方法，其中所述捕获部分包含吡啶羧基醛。

实施方案31.实施方案29的方法，其中所述捕获部分包含马来酰亚胺。

实施方案32.实施方案29的方法，其中所述捕获部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案33.实施方案29的方法，其中所述捕获部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案34.实施方案25的方法，其中所述珠子包含多个捕获部分。

实施方案35.实施方案34的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶羧基醛。

实施方案36.实施方案34的方法，其中所述多个捕获部分包含马来酰亚胺基团。

实施方案37.实施方案34的方法，其中所述多个捕获部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案38.实施方案34的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案39.实施方案25的方法，其中所述珠子包含条形码。

实施方案40.实施方案39的方法，其中所述条形码是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、多肽或其组合。

实施方案41.实施方案39的方法，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

实施方案42.实施方案39的方法，其中所述条形码包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

实施方案43.实施方案39的方法，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

实施方案44.实施方案39的方法，其中用纳米孔测序鉴定所述条形码。

实施方案45.实施方案39的方法，其中用串联质谱法鉴定所述条形码。

实施方案46.实施方案41的方法，所述方法进一步包含用包含Edman降解的方法对寡肽条形码分子进行测序。

实施方案47.实施方案1-46中的任一个的方法，其中所述缀合物包含二硫键。

实施方案48.实施方案1-46中的任一个的方法，其中所述缀合物包含硫醚键。

实施方案49.实施方案1-48中的任一个的方法，其中所述收集包含离心。

实施方案50.实施方案1-49中的任一个的方法，其中所述收集包含向所述支持物施加磁场，其中所述支持物是磁珠。

实施方案51.实施方案1-49中的任一个的方法，其中所述收集包含添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。

实施方案52.实施方案51的方法，其中所述试剂是有机溶剂。

实施方案53.实施方案52的方法，其中所述有机溶剂是异丙醇。

实施方案54.实施方案1-53中的任一个的方法，其中所述容器是孔。

实施方案55.实施方案1-53中的任一个的方法，其中所述容器是管。

实施方案56.实施方案1-55中的任一个的方法，其中所述标记包括免疫染色。

实施方案57.实施方案1-56中的任一个的方法，其中所述可检测部分包含荧光部分。

实施方案58.实施方案57的方法，其中所述荧光部分包含抗体。

实施方案59.实施方案57的方法，其中所述荧光部分包含荧光染料。

实施方案60.实施方案57的方法，其中所述荧光部分包含Alexa Fluor 488。

实施方案61.实施方案57的方法，其中所述荧光部分包含Atto647N。

实施方案62.实施方案1-61中的任一个的方法，其中所述标记产生多个标记的生物分子。

实施方案63.实施方案1-62中的任一个的方法，其中所述检测包含流式细胞计量术。

实施方案64.实施方案1-62中的任一个的方法，其中所述检测包含降解法测序。

实施方案65.一种方法，其包含：

(a)在微滴中使细胞与支持物接触，

其中所述细胞包含至少一种生物分子，其中所述至少一种生物分子包含第一反应部分；

其中所述支持物包含第二反应部分；

其中所述第一反应部分和所述第二反应部分形成共价键以形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；

(b)将所述缀合物收集到容器中；

(c)用至少一种可检测部分标记所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和

(d)检测所述至少一种标记的生物分子。

实施方案66.实施方案65的方法，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

实施方案67.实施方案65或66的方法，其中所述微滴包含水溶液。

实施方案68.实施方案65-67中的任一个的方法，其中所述微滴是油包水微滴。

实施方案69.实施方案65-68中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

实施方案70.实施方案65-69中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约100pL至约200pL的平均体积。

实施方案71.实施方案65-70中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

实施方案72.实施方案65-71中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含低渗的裂解溶液。

实施方案73.实施方案71的方法，其中所述细胞裂解溶液包含聚氧乙烯山梨醇酯。

实施方案74.实施方案71的方法，其中所述细胞裂解溶液包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇。

实施方案75.实施方案71的方法，其中所述细胞裂解溶液包含十二烷基硫酸钠。

实施方案76.实施方案65-75中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

实施方案77.实施方案76的方法，其中所述缓冲液包含磷酸钠。

实施方案78.实施方案76的方法，其中所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。

实施方案79.实施方案76的方法，其中所述缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水。

实施方案80.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是多肽。

实施方案81.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是蛋白质。

实施方案82.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内肽。

实施方案83.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内蛋白质。

实施方案84.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是分泌型肽。

实施方案85.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是分泌型蛋白质。

实施方案86.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

实施方案87.实施方案65-79中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是血红蛋白A1c(HbA1c)。

实施方案88.实施方案65-87中的任一个的方法，其中所述细胞是红血细胞。

实施方案89.实施方案65-88中的任一个的方法，其中所述支持物是珠子。

实施方案90.实施方案89的方法，其中所述珠子是磁珠。

实施方案91.实施方案89的方法，其中所述珠子包含条形码。

实施方案92.实施方案91的方法，其中所述条形码是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、多肽或其组合。

实施方案93.实施方案91的方法，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

实施方案94.实施方案91的方法，其中所述条形码包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

实施方案95.实施方案91的方法，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

实施方案96.实施方案91的方法，其中用纳米孔测序鉴定所述条形码。

实施方案97.实施方案91的方法，其中用串联质谱法鉴定所述条形码。

实施方案98.实施方案93的方法，所述方法进一步包含用包含Edman降解的方法对寡肽条形码分子进行测序。

实施方案99.实施方案89的方法，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

实施方案100.实施方案89的方法，其中所述珠子包含从约1μm至约5μm的平均直径。

实施方案101.实施方案65-100中的任一个的方法，其中所述第一反应部分包含巯基。

实施方案102.实施方案65-100中的任一个的方法，其中所述第一反应部分包含半胱氨酸侧链。

实施方案103.实施方案65-100中的任一个的方法，其中所述第一反应部分包含组氨酰基侧链。

实施方案104.实施方案65-103中的任一个的方法，其中所述第二反应部分包含吡啶羧基醛。

实施方案105.实施方案65-103中的任一个的方法，其中所述第二反应部分包含马来酰亚胺基团。

实施方案106.实施方案65-103中的任一个的方法，其中所述第二反应部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案107.实施方案65-103中的任一个的方法，其中所述第二反应部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案108.实施方案65-107中的任一个的方法，其中所述支持物包含多个第二反应部分。

实施方案109.实施方案65-108中的任一个的方法，其中所述共价键是二硫键。

实施方案110.实施方案65-108中的任一个的方法，其中所述共价键是硫醚键。

实施方案111.实施方案65-110中的任一个的方法，其中所述收集包含向所述支持物施加磁场，其中所述支持物是磁珠。

实施方案112.实施方案65-111中的任一个的方法，其中所述收集包含添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。

实施方案113.实施方案112的方法，其中所述试剂是有机溶剂。

实施方案114.实施方案113的方法，其中所述有机溶剂是异丙醇。

实施方案115.实施方案65-114中的任一个的方法，其中所述容器是孔。

实施方案116.实施方案65-114中的任一个的方法，其中所述容器是管。

实施方案117.实施方案65-116中的任一个的方法，其中所述标记包含免疫染色。

实施方案118.实施方案65-117中的任一个的方法，其中所述可检测部分包含荧光部分。

实施方案119.实施方案118的方法，其中所述荧光部分包含抗体。

实施方案120.实施方案118的方法，其中所述荧光部分包含荧光染料。

实施方案121.实施方案118的方法，其中所述荧光部分包含Alexa Fluor 488。

实施方案122.实施方案118的方法，其中所述荧光部分包含Atto647N。

实施方案123.实施方案65-122中的任一个的方法，其中所述标记产生多个标记的生物分子。

实施方案124.实施方案65-123中的任一个的方法，其中所述检测包含流式细胞计量术。

实施方案125.实施方案65-123中的任一个的方法，其中所述检测包含荧光测序。

实施方案126.实施方案65-123中的任一个的方法，其中所述检测包含降解法测序。

实施方案127.一种方法，其包含：

(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种多肽，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种多肽的缀合物；

(b)用至少一种可检测部分标记所述至少一种多肽以产生至少一种标记的多肽；和

(c)使用降解法测序检测所述至少一种标记的多肽。

实施方案128.实施方案127的方法，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

实施方案129.实施方案127或128的方法，其中所述微滴包含水溶液。

实施方案130.实施方案127-129中的任一个的方法，其中所述微滴是油包水微滴。

实施方案131.实施方案127-130中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

实施方案132.实施方案127-131中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约100pL至约200pL的平均体积。

实施方案133.实施方案127-132中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

实施方案134.实施方案127-133中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含低渗的裂解溶液。

实施方案135.实施方案133的方法，其中所述细胞裂解溶液包含聚氧乙烯山梨醇酯。

实施方案136.实施方案133的方法，其中所述细胞裂解溶液包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇。

实施方案137.实施方案133的方法，其中所述细胞裂解溶液包含十二烷基硫酸钠。

实施方案138.实施方案127-137中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

实施方案139.实施方案138的方法，其中所述缓冲液包含磷酸钠。

实施方案140.实施方案138的方法，其中所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。

实施方案141.实施方案138的方法，其中所述缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水。

实施方案142.实施方案127-141中的任一个的方法，其中所述至少一种多肽是细胞内肽。

实施方案143.实施方案127-141中的任一个的方法，其中所述至少一种多肽是细胞内蛋白质。

实施方案144.实施方案127-141中的任一个的方法，其中所述至少一种多肽是分泌型肽。

实施方案145.实施方案127-141中的任一个的方法，其中所述至少一种多肽是分泌型蛋白质。

实施方案146.实施方案127-141中的任一个的方法，其中所述至少一种多肽选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

实施方案147.实施方案127-141中的任一个的方法，其中所述至少一种多肽是血红蛋白A1c(HbA1c)。

实施方案148.实施方案127-147中的任一个的方法，其中所述细胞是红血细胞。

实施方案149.实施方案127-148中的任一个的方法，其中所述支持物是珠子。

实施方案150.实施方案149的方法，其中所述珠子是磁珠。

实施方案151.实施方案149的方法，其中所述珠子包含条形码。

实施方案152.实施方案151的方法，其中所述条形码是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、多肽或其组合。

实施方案153.实施方案151的方法，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

实施方案154.实施方案151的方法，其中所述条形码包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

实施方案155.实施方案151的方法，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

实施方案156.实施方案151的方法，其中用纳米孔测序鉴定所述条形码。

实施方案157.实施方案151的方法，其中用串联质谱法鉴定所述条形码。

实施方案158.实施方案153的方法，所述方法进一步包含用包含Edman降解的方法对所述寡肽条形码分子进行测序。

实施方案159.实施方案149的方法，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

实施方案160.实施方案149的方法，其中所述珠子包含从约1μm至约5μm的平均直径。

实施方案161.实施方案149的方法，其中所述珠子包含捕获部分。

实施方案162.实施方案161的方法，其中所述捕获部分包含吡啶羧基醛。

实施方案163.实施方案161的方法，其中所述捕获部分包含马来酰亚胺基团。

实施方案164.实施方案161的方法，其中所述捕获部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案165.实施方案161的方法，其中所述捕获部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案166.实施方案149的方法，其中所述珠子包含多个捕获部分。

实施方案167.实施方案166的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶羧基醛。

实施方案168.实施方案166的方法，其中所述多个捕获部分包含马来酰亚胺基团。

实施方案169.实施方案166的方法，其中所述多个捕获部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案170.实施方案166的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案171.实施方案127-170中的任一个的方法，其中所述缀合物包含二硫键。

实施方案172.实施方案127-170中的任一个的方法，其中所述缀合物包含硫醚键。

实施方案173.实施方案127-172中的任一个的方法，其中所述收集包含离心。

实施方案174.实施方案127-172中的任一个的方法，其中所述收集包含向所述支持物施加磁场，其中所述支持物是磁珠。

实施方案175.实施方案127-174中的任一个的方法，其中所述收集包含添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。

实施方案176.实施方案175的方法，其中所述试剂是有机溶剂。

实施方案177.实施方案176的方法，其中所述有机溶剂是异丙醇。

实施方案178.实施方案127-177中的任一个的方法，其中所述容器是孔。

实施方案179.实施方案127-177中的任一个的方法，其中所述容器是管。

实施方案180.实施方案127-179中的任一个的方法，其中所述标记包含免疫染色。

实施方案181.实施方案127-180中的任一个的方法，其中所述可检测部分包含荧光部分。

实施方案182.实施方案181的方法，其中所述荧光部分包含抗体。

实施方案183.实施方案181的方法，其中所述荧光部分包含荧光染料。

实施方案184.实施方案181的方法，其中所述荧光部分包含Alexa Fluor 488。

实施方案185.实施方案181的方法，其中所述荧光部分包含Atto647N。

实施方案186.实施方案127-185中的任一个的方法，其中所述标记产生多个标记的多肽。

实施方案187.一种方法，其包含：

(a)分选生物样品以提取细胞的亚集；

(b)在微滴中使来自所述细胞亚集的至少一种生物分子与支持物接触，其中所述细胞包含所述至少一种生物分子，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；

(c)在所述接触之后，将所述缀合物收集到容器中；

(d)在所述收集之后，用至少一种可检测部分标记所述容器中的所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和

(e)检测所述至少一种可检测部分。

实施方案188.实施方案187的方法，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

实施方案189.实施方案187或188的方法，其中所述微滴包含水溶液。

实施方案190.实施方案187-189中的任一个的方法，其中所述微滴是油包水微滴。

实施方案191.实施方案187-190中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

实施方案192.实施方案187-191中的任一个的方法，其中所述微滴具有从约100pL至约200pL的平均体积。

实施方案193.实施方案187-192中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

实施方案194.实施方案187-193中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含低渗的裂解溶液。

实施方案195.实施方案193的方法，其中所述细胞裂解溶液包含聚氧乙烯山梨醇酯。

实施方案196.实施方案193的方法，其中所述细胞裂解溶液包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇。

实施方案197.实施方案193的方法，其中所述细胞裂解溶液包含十二烷基硫酸钠。

实施方案198.实施方案187-197中的任一个的方法，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

实施方案199.实施方案198的方法，其中所述缓冲液包含磷酸钠。

实施方案200.实施方案198的方法，其中所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。

实施方案201.实施方案198的方法，其中所述缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水。

实施方案202.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是多肽。

实施方案203.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是蛋白质。

实施方案204.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内肽。

实施方案205.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内蛋白质。

实施方案206.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是分泌型肽。

实施方案207.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是分泌型蛋白质。

实施方案208.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

实施方案209.实施方案187-201中的任一个的方法，其中所述至少一种生物分子是血红蛋白A1c(HbA1c)。

实施方案210.实施方案187-209中的任一个的方法，其中所述细胞是红血细胞。

实施方案211.实施方案187-210中的任一个的方法，其中所述支持物是珠子。

实施方案212.实施方案211的方法，其中所述珠子是磁珠。

实施方案213.实施方案211的方法，其中所述珠子包含条形码。

实施方案214.实施方案213的方法，其中所述条形码是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、多肽或其组合。

实施方案215.实施方案213的方法，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

实施方案216.实施方案213的方法，其中所述条形码包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

实施方案217.实施方案213的方法，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

实施方案218.实施方案213的方法，其中用纳米孔测序鉴定所述条形码。

实施方案219.实施方案213的方法，其中用串联质谱法鉴定所述条形码。

实施方案220.实施方案215的方法，所述方法进一步包含用包含Edman降解的方法对所述寡肽条形码分子进行测序。

实施方案221.实施方案211的方法，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

实施方案222.实施方案211的方法，其中所述珠子包含从约1μm至约5μm的平均直径。

实施方案223.实施方案211的方法，其中所述珠子包含捕获部分。

实施方案224.实施方案223的方法，其中所述捕获部分包含吡啶羧基醛。

实施方案225.实施方案223的方法，其中所述捕获部分包含马来酰亚胺基团。

实施方案226.实施方案223的方法，其中所述捕获部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案227.实施方案223的方法，其中所述捕获部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案228.实施方案211的方法，其中所述珠子包含多个捕获部分。

实施方案229.实施方案228的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶羧基醛。

实施方案230.实施方案228的方法，其中所述多个捕获部分包含马来酰亚胺基团。

实施方案231.实施方案228的方法，其中所述多个捕获部分包含卤代乙酰基基团。

实施方案232.实施方案228的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶基二硫化物。

实施方案233.实施方案187-232中的任一个的方法，其中所述缀合物包含二硫键。

实施方案234.实施方案187-232中的任一个的方法，其中所述缀合物包含硫醚键。

实施方案235.实施方案187-234中的任一个的方法，其中所述收集包含离心。

实施方案236.实施方案187-234中的任一个的方法，其中所述收集包含向所述支持物施加磁场，其中所述支持物是磁珠。

实施方案237.实施方案187-234中的任一个的方法，其中所述收集包含添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。

实施方案238.实施方案237的方法，其中所述试剂是有机溶剂。

实施方案239.实施方案238的方法，其中所述有机溶剂是异丙醇。

实施方案240.实施方案187-239中的任一个的方法，其中所述容器是孔。

实施方案241.实施方案187-239中的任一个的方法，其中所述容器是管。

实施方案242.实施方案187-241中的任一个的方法，其中所述标记包含免疫染色。

实施方案243.实施方案187-242中的任一个的方法，其中所述可检测部分包含荧光部分。

实施方案244.实施方案243的方法，其中所述荧光部分包含抗体。

实施方案245.实施方案243的方法，其中所述荧光部分包含荧光染料。

实施方案246.实施方案243的方法，其中所述荧光部分包含Alexa Fluor 488。

实施方案247.实施方案243的方法，其中所述荧光部分包含Atto647N。

实施方案248.实施方案187-247中的任一个的方法，其中所述标记产生多个标记的生物分子。

实施方案249.实施方案187-248中的任一个的方法，其中所述检测包含流式细胞计量术。

实施方案250.实施方案187-248中的任一个的方法，其中所述检测包含降解法测序。

实施方案251.一种组合物，其包含：(a)至少一种多肽；和(b)单独支持物，其中所述至少一种生物分子和所述单独支持物通过共价键偶联在一起，且其中所述至少一种生物分子和所述单独支持物被包封在微滴中。

实施方案252.实施方案251的组合物，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

实施方案253.实施方案251或252的组合物，其中所述微滴包含水溶液。

实施方案254.实施方案251-253中的任一个的组合物，其中所述微滴是油包水微滴。

实施方案255.实施方案251-254中的任一个的组合物，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

实施方案256.实施方案251-255中的任一个的组合物，其中所述微滴具有从约100pL至约200pL的平均体积。

实施方案257.实施方案251-256中的任一个的组合物，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

实施方案258.实施方案251-257中的任一个的组合物，其中所述微滴进一步包含低渗的裂解溶液。

实施方案259.实施方案257的组合物，其中所述细胞裂解溶液包含聚氧乙烯山梨醇酯。

实施方案260.实施方案257的组合物，其中所述细胞裂解溶液包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇。

实施方案261.实施方案257的组合物，其中所述细胞裂解溶液包含十二烷基硫酸钠。

实施方案262.实施方案251-261中的任一个的组合物，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

实施方案263.实施方案262的组合物，其中所述缓冲液包含磷酸钠。

实施方案264.实施方案262的组合物，其中所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。

实施方案265.实施方案262的组合物，其中所述缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水。

实施方案266.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是多肽。

实施方案267.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是蛋白质。

实施方案268.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是细胞内肽。

实施方案269.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是细胞内蛋白质。

实施方案270.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是分泌型肽。

实施方案271.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是分泌型蛋白质。

实施方案272.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

实施方案273.实施方案251-265中的任一个的组合物，其中所述至少一种生物分子是血红蛋白A1c(HbA1c)。

实施方案274.实施方案251-271中的任一个的组合物，其中所述支持物是珠子。

实施方案275.实施方案272中的任一个的组合物，其中所述珠子是磁珠。

实施方案276.实施方案272的组合物，其中所述珠子包含条形码。

实施方案277.实施方案274的组合物，其中所述条形码是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、多肽或其组合。

实施方案278.实施方案274的组合物，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

实施方案279.实施方案274的组合物，其中所述条形码包含谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

实施方案280.实施方案274的组合物，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

实施方案281.实施方案272的组合物，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

实施方案282.实施方案272的组合物，其中所述珠子包含从约1μm至约5μm的平均直径。

实施方案283.实施方案251-282中的任一个的组合物，其中所述缀合物包含二硫键。

实施方案284.实施方案251-282中的任一个的组合物，其中所述缀合物包含硫醚键。

实施方案285.实施方案251-282中的任一个的组合物，其中所述缀合物进一步包含荧光部分。

实施方案286.实施方案285的组合物，其中所述荧光部分包含抗体。

实施方案287.实施方案285的组合物，其中所述荧光部分包含荧光染料。

实施方案288.实施方案285的组合物，其中所述荧光部分包含Alexa Fluor 488。

实施方案289.实施方案285的组合物，其中所述荧光部分包含Atto647N。

实施方案290.一种方法，其包含：

(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；

(b)透化所述微滴内的细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子接触后，所述多肽偶联至所述珠子；

(c)从所述微滴释放具有与其偶联的多肽的珠子；和

(d)鉴定仍然偶联至所述珠子的多肽。

实施方案291.一种方法，其包含：

(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；

(b)透化所述微滴内的细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子接触后，所述多肽偶联至所述珠子；

(c)从所述微滴释放具有与其偶联的多肽的珠子；和

(d)使用降解法测序鉴定所述多肽。

实施方案292.一种方法，其包含：

(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子；

(b)标记所述至少一种生物分子；和

(c)通过降解法测序检测所述至少一种标记的生物分子，检测所述细胞的翻译后修饰水平。

Claims (65)

1.一种方法，其包括：

(a)在微滴中使细胞与支持物接触，

其中所述细胞包含至少一种生物分子，其中所述至少一种生物分子包含第一反应部分；

其中所述支持物包含第二反应部分；

其中所述第一反应部分和所述第二反应部分形成共价键以形成包含所述支持物和所述至少一种生物分子的缀合物；

(b)将所述缀合物收集到容器中；

(c)用至少一种可检测部分标记所述至少一种生物分子以产生至少一种标记的生物分子；和

(d)检测所述至少一种标记的生物分子。

2.权利要求1所述的方法，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

3.权利要求1所述的方法，其中所述微滴是油包水微滴。

4.权利要求1所述的方法，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

5.权利要求1所述的方法，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

6.权利要求1所述的方法，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

7.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物分子是多肽。

8.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内肽或分泌型肽。

9.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物分子是蛋白质。

10.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物分子是细胞内蛋白质或分泌型蛋白质。

11.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物分子选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

12.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是红血细胞。

13.权利要求1所述的方法，其中所述支持物是珠子。

14.权利要求13所述的方法，其中所述珠子包含条形码。

15.权利要求14所述的方法，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

16.权利要求14所述的方法，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

17.权利要求13所述的方法，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

18.权利要求1所述的方法，其中所述第一反应部分包含巯基。

19.权利要求1所述的方法，其中所述第一反应部分包含半胱氨酸侧链。

20.权利要求1所述的方法，其中所述第一反应部分包含组氨酰基侧链。

21.权利要求1所述的方法，其中所述第二反应部分包含吡啶羧基醛。

22.权利要求1所述的方法，其中所述第二反应部分包含马来酰亚胺基团。

23.权利要求1所述的方法，其中所述第二反应部分包含卤代乙酰基基团。

24.权利要求1所述的方法，其中所述第二反应部分包含吡啶基二硫化物。

25.权利要求1所述的方法，其中所述支持物包含多个第二反应部分。

26.权利要求1所述的方法，其中所述共价键是二硫键。

27.权利要求1所述的方法，其中所述共价键是硫醚键。

28.权利要求1所述的方法，其中所述收集包括添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。

29.权利要求1所述的方法，其中所述标记包含免疫染色。

30.权利要求1所述的方法，其中所述可检测部分包含荧光部分。

31.权利要求30所述的方法，其中所述荧光部分包含抗体。

32.权利要求30所述的方法，其中所述荧光部分包含荧光染料。

33.权利要求1所述的方法，其中所述标记产生多个标记的生物分子。

34.权利要求1所述的方法，其中所述检测包含降解法测序。

35.一种方法，其包括：

(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种多肽，其中所述接触形成包含所述支持物和所述至少一种多肽的缀合物；

(b)用至少一种可检测部分标记所述至少一种多肽以产生至少一种标记的多肽；和

(c)使用降解法测序检测所述至少一种标记的多肽。

36.权利要求35所述的方法，其中所述微滴包含一个细胞和一个支持物。

37.权利要求35所述的方法，其中所述微滴包含水溶液。

38.权利要求35所述的方法，其中所述微滴是油包水微滴。

39.权利要求35所述的方法，其中所述微滴具有从约0.5pL至约750pL的平均体积。

40.权利要求35所述的方法，其中所述微滴进一步包含细胞裂解溶液。

41.权利要求35所述的方法，其中所述微滴进一步包含缓冲液。

42.权利要求35所述的方法，其中所述至少一种多肽是细胞内肽或分泌型肽。

43.权利要求35所述的方法，其中所述至少一种多肽是细胞内蛋白质或分泌型蛋白质。

44.权利要求35所述的方法，其中所述至少一种多肽选自由乳酸、烟酰胺、5-氧代脯氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、葡萄糖、苹果酸、腺嘌呤、血红蛋白A(HbA)、血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白A1(HbA1)、血红蛋白F(HbF)、氧化的蛋白质和糖基化的蛋白质组成的组。

45.权利要求35所述的方法，其中所述细胞是红血细胞。

46.权利要求35所述的方法，其中所述支持物是珠子。

47.权利要求46所述的方法，其中所述珠子包含条形码。

48.权利要求47所述的方法，其中所述条形码是包含从约2个氨基酸至约30个氨基酸的寡肽。

49.权利要求47所述的方法，其中所述条形码包含非天然氨基酸。

50.权利要求46所述的方法，其中所述珠子包含从约15nm至约5μm的平均直径。

51.权利要求46所述的方法，其中所述珠子包含多个捕获部分。

52.权利要求51所述的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶羧基醛。

53.权利要求51所述的方法，其中所述多个捕获部分包含马来酰亚胺基团。

54.权利要求51所述的方法，其中所述多个捕获部分包含卤代乙酰基基团。

55.权利要求51所述的方法，其中所述多个捕获部分包含吡啶基二硫化物。

56.权利要求35所述的方法，其中所述缀合物包含二硫键。

57.权利要求35所述的方法，其中所述缀合物包含硫醚键。

58.权利要求35所述的方法，其中所述收集包括添加试剂，其中所述试剂从所述微滴释放所述缀合物。

59.权利要求35所述的方法，其中所述可检测部分包含荧光部分。

60.权利要求59所述的方法，其中所述荧光部分包含抗体。

61.权利要求59所述的方法，其中所述荧光部分包含荧光染料。

62.权利要求35所述的方法，其中所述标记产生多个标记的多肽。

63.一种方法，其包括：

(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；

(b)透化所述微滴内的所述细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子接触后，所述多肽偶联至所述珠子；

(c)从所述微滴释放具有与其偶联的所述多肽的所述珠子；和

(d)鉴定仍然偶联至所述珠子的所述多肽。

64.一种方法，其包括：

(a)提供包含细胞和珠子的微滴，其中所述细胞包含多肽；

(b)透化所述微滴内的所述细胞，从而使所述多肽与所述珠子接触，其中在所述多肽与所述珠子接触后，所述多肽偶联至所述珠子；

(c)从所述微滴释放具有与其偶联的所述多肽的所述珠子；和

(d)使用降解法测序鉴定所述多肽。

65.一种方法，其包括：

(a)在微滴中使细胞与支持物接触，其中所述细胞包含至少一种生物分子；

(b)标记所述至少一种生物分子；和

(c)通过降解法测序检测所述至少一种标记的生物分子，来检测所述细胞的翻译后修饰水平。