CN117624298A - 一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，并研究了其对肿瘤细胞的治疗效果。通过在哑铃型多肽组装基元中引入硫酸酯化的氨基酸，设计合成了响应性多肽组装前体分子EIYsIYsE，通过将前体多肽分子EIYsIYsE与蛋白配体修饰多肽衍生物以共组装策略构筑抗肿瘤超分子PROTACs，并根据两种配体的蛋白结合亲和力合理优化共组比例。超分子PROTACs仅在过表达硫酸酯酶的癌细胞中发生酶响应组装成纳米纤维的结构，体外和体内研究均表明超分子PROTACs通过降解Bcl‑xL并激活caspase依赖的凋亡通路，对乳腺癌细胞产生特异性的细胞毒性，以及在与化疗药物联合给药时具有良好的生物安全性和抑制肿瘤生长的能力。

Description

一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的 制备方法
技术领域
本发明属于多肽纳米药物及递送载体技术领域，具体涉及一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法。
背景技术
具有两个共价连接配体的异型双功能PROTAC分子能够同时募集目标蛋白(POI)和E3泛素连接酶，化学诱导的POI和E3连接酶之间的接近会导致POI泛素化，从而启动泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解POI。与传统的占用驱动小分子药物相比，PROTAC作为催化剂以可重复的方式启动POI的降解，使得PROTAC的剂量和给药频率低于小分子药物，甚至解决了不可用药的问题。尽管PROTAC技术取得了很大的进步，但PROTACs仍然存在膜通透性低，靶向传递能力较差，从而产生严重的副作用。此外，高剂量的PROTAC药物倾向于形成二元复合物导致蛋白降解效力受限。因此，开发能够同时解决上述问题的新的PROTAC策略是至关重要的。
多肽由氨基酸组成，具有良好的生物相容性、广泛的生物功能和稳定的非共价相互作用。多肽组装成明确的纳米结构是开发生物医学材料作为递送载体和软物质的有效策略。通过内部或外部刺激调节的靶向位点周围的多肽的原位组装提供了一个多功能的工具包，以解决药代动力学问题，从而提高治疗效果。到目前为止，大量的刺激已经被用来控制溶液和生命系统中肽的组装，包括在病理条件下经常过表达的酶，例如碱性磷酸酶、基质金属蛋白酶、半胱天蛋白酶、组织蛋白酶和酪氨酸酶。溶酶体芳基硫酸酯酶是一种催化芳基硫酸酯水解的酶，在许多不同的癌细胞中过表达。硫酸酯酶在溶酶体中表现出特异性的酶活性，从而赋予了调节活细胞内的化学反应的机会。目前，已有硫酸酯酶响应的成像探针、药物输送载体被开发，但溶酶体芳基硫酸酯酶在调节肽组装中的作用仍有待探索。
发明内容
本发明目的是解决PROTAC递送效率低，蛋白降解能力受限的问题，从而使其通过降解靶蛋白治疗肿瘤的效果有限的问题，本发明提供了一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法。
本发明的技术方案为：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，所述抗肿瘤超分子PROTACs为EIYsBE3，制备步骤如下：
步骤1：多肽EIYsIYsE、L1和L2的合成；
1)采用标准Fmoc多肽固相合成方法(SPPS)进行多肽合成。使用Rink酰胺4-甲基苯甲胺(MBHA)树脂(树脂上NH2基团载量：0.352mmol/g)合成。将Fmoc保护的氨基酸、HBTU(当合成Ys时使用PyAOP)和DIEA以相对于Rink树脂的摩尔比为4：4：6溶解于DMF中，混匀后加入合成管中反应，接着用25％哌啶去除Fmoc保护基团；
2)完成所有的偶联反应后，使用体积比为95：2.5：2.5的TFA，Tips和水组成的切割剂将L1和L2多肽从树脂上裂解下来。使用体积比为50：45：2.5：2.5的TFA，DCM，Tips和水组成的切割剂裂解多肽EIYsIYsE，以避免硫酸化酪氨酸水解。
步骤2：通过将EIYsIYsE、L1和L2共组装制备EIYsBE3；
首先将多肽EIYsIYsE、L1和L2的冻干粉溶于超纯水中，用氢氧化钠(1M)将溶液pH调整至7.4后，用水定量溶液体积，得到浓度分别为4mM的EIYsIYsE和1mM的L1及L2的多肽母液。将EIYsIYsE、L1和L2的母液以86：6：8的摩尔比混合后得到浓度为2mM的EIYsBE3的母液；退火并静置24小时使其组装。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明所形成的多肽组装体具有生物兼容性、低免疫原性和生物降解性等优点。(2)本发明所有的反应条件非常温和，制备方法简单，操作简便。(3)本发明得到的超分子PROTACs能够降解Bcl-xL并激活Caspase依赖的凋亡通路，对乳腺癌细胞具有特异性的细胞毒性，能明显抑制肿瘤生长，具有良好的生物安全性。(4)本发明制备的抗肿瘤超分子PROTACs不仅为操纵活细胞内多肽的组装提供了一种新的方法，也为开发具有高靶向传递和POI降解效率的PROTACs建立了一种可靠的策略。
附图说明
图1.EIYsIYsE,EIYIYE,BH3 PEP,LAHypYI,L1,L2,TAMRA-EIYsIYsE和TAMRA-EIYIYE的化学结构式。
图2.(a)硫酸酯酶处理前后硫酸化酪氨酸(Fmoc-Tyr(SO3H)-OH，Ys)的UPLC迹线和相应的质谱，其中Ys转化为Fmoc-Tyr-OH(Y)。(b)硫酸化多肽或天然多肽的化学结构，以及经硫酸酯酶处理的不同时间点的EIYsIYsE的UPLC痕迹，以及在UPLC痕迹中观察到的三种组分的相应质谱。(c)多肽EIYsIYsE及其天然对应物EIYIYE的CD谱。(d-g)由多肽EIYsIYsE(d和f)和EIYIYE(e和g)形成的组装体的TEM(d和e)和AFM(f和g)图像。插图显示了纳米颗粒的直径或所选纳米纤维高度的分布。TEM样品用乙酸双氧铀(2wt％)染色。
图3.经硫酸酯酶处理的EIYsBE3的UPLC痕迹。
图4.(a)EIYsIYsE与L1和L2共组装成EIYsBE3，在硫酸酯酶催化水解下转变为EIYBE3的示意图。(b)组装体EIYsBE3、EIYsE3以及EIYsB的CD谱。(c)组装体EIYBE3、EIYE3以及EIYB的CD谱。(d和e)EIYBE3(d)和EIYBE3(e)的TEM图像。(f)肽组装体EIYBE3、EIYsBE3与蛋白Bcl-xL和VHL结合过程随配体L1或L2浓度变化的MST分析曲线。
图5.多肽L1、L2、EIYB、EIYE3与蛋白Bcl-xL和VHL结合的MST分析曲线。
图6.(a)流式细胞仪检测4T1细胞在不同时间点对EIYBE3和EIYsBE3的摄取情况。(b)用EIYBE3、EIYsE3、EIYsB和EIYsBE3处理4T1细胞后不同时间点的流式细胞术的平均荧光强度定量统计图。(c)4T1细胞与EIYsBE3共孵育2、4、8和12小时的CLSM图像。(d)经不同处理的4T1细胞的Lyso-Red Tracker和TAMAR信号之间的PCC值。比例尺：10μm。(e)与EIYsIYsE孵育12小时的3T3细胞的生物TEM图像。(f)4T1细胞与EIYsBE3共孵育12小时的生物TEM图像。在(e)和(f)中，右边的图像是从左边的部分开始的放大区域。(f)中的黑色箭头表示原位形成的纳米原纤维。
图7.(a)4T1细胞与不同浓度的Supra-PROTAC EIYBE3，pro-Supra-PROTACEIYsBE3和pro-Supra-PROTAC EIYsBE3-1：1孵育24h后的细胞活力。(b)不同处理诱导的4T1细胞在24小时的细胞凋亡率和定量统计。(c)用PBS(对照)和EIYsIYsE、EIYsE3、EIYsB以及EIYsBE3处理4T1细胞24小时后的Bcl-xL、Caspase-3和Cleaved-Caspase-3表达的WB测定。(d)相应蛋白质的相对表达统计量。在WB测试中，β-actin被用作负载参考。(e和f)ELISA测定PBS、EIYsIYsE、EIYsE3、L1、EIYsB和EIYsBE3处理24小时的4T1细胞中Caspase-9(e)和Caspase-3(f)的活性。采用单因素方差(ANOVA)分析进行统计学分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图8.(a)4T1细胞与不同浓度的EIYsIYsE和EIYIYE孵育24h后的细胞活力。(b).4T1细胞与不同浓度的EIYsE3、EIYsB和EIYsBE3孵育24h后的细胞活力。(c)3T3细胞与不同浓度的EIYsIYsE、EIYIYE、L1、L2、EIYsE3、EIYsB和EIYsBE3孵育24h后的细胞活力。
图9.(a)用PBS(对照)和EIYBE3、EIYsBE3-1：1和EIYsBE3处理4T1细胞24小时后的Bcl-xL表达的WB测定。(b)Bcl-xL的相对表达统计量。
图10.(a)在不同时间点注射了pro-Supra-PROTAC EIYsBE3的荷瘤小鼠的体内荧光图像，以及给药24h后解剖的小鼠主要器官和肿瘤组织的体外荧光图像。(b和c)给药处理后的体内肿瘤组织在不同时间点的定量平均荧光强度分析(b)和给药24小时后解剖的肿瘤组织和主要器官的定量平均荧光强度分析(c)。(d和e)用EIYsBE3(d)和EIYBE3(e)处理的荷瘤小鼠肿瘤组织冷冻切片的CLSM图像。(f)经PBS、EIYsE3、L1、EIYsB、EIYsBE3、PTX、EIYsBE3+PTX处理后的小鼠体内肿瘤组织的生长曲线。(g和h)注射不同治疗的小鼠在给药后第19天解剖的肿瘤的代表性图像(g)和重量(h)。(i)用EIYsBE3+PTX处理的小鼠的主要器官(心脏、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织的H&E染色图像。采用单因素方差(ANOVA)分析进行统计学分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图11.从用PBS、EIYsE3、L1、EIYsB、EIYsBE3和PTX处理小鼠19天后收集的主要组织(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的H&E染色图像。比例尺：50μm。
图12活细胞中基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的示意图。多肽EIYsIYsE包含两个硫酸化酪氨酸(Ys)表现出硫酸酯酶响应性的组装特性，将EIYsIYsE通过氨基己酸分别与来自于促凋亡Bak蛋白的BH3结构域GQVGRQLAIIGDDINR多肽序列和来自于缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的LAHypYI多肽序列连接得到配体L1和L2。配体L1和L2分别能够与抗凋亡蛋白Bcl-xL和E3泛素连接酶VHL结合，在L1和L2对Bcl-xL和VHL蛋白结合亲和力的指导下，将EIYsIYsE与配体L1及L2以适当的摩尔比共组装构筑了前超分子PROTACEIYsBE3，EIYsBE3在过表达硫酸酯酶的肿瘤中发生酶响应原位组装成超分子PROTACEIYBE3，进而降解Bcl-xL并激活Caspase依赖的凋亡通路用于肿瘤治疗。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案做进一步说明，其中本发明所涉及EIYsIYsE,EIYIYE,BH3 PEP,LAHypYI,L1,L2,TAMRA-EIYsIYsE和TAMRA-EIYIYE的化学结构式如附图1所示。
实施例1：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，所述抗肿瘤超分子PROTACs为EIYsBE3，制备方法包括如下步骤：
步骤1：多肽EIYsIYsE、L1和L2的合成；
1)采用标准Fmoc多肽固相合成方法(SPPS)进行多肽合成。使用Rink酰胺4-甲基苯甲胺(MBHA)树脂(树脂上NH2基团载量：0.352mmol/g)合成。将Fmoc保护的氨基酸、HBTU(当合成Ys时使用PyAOP)和DIEA以相对于Rink树脂的摩尔比为4：4：6溶解于DMF中，混匀后加入合成管中反应，接着用25％哌啶去除Fmoc保护基团；
2)完成所有的偶联反应后，使用体积比为95：2.5：2.5的TFA，Tips和水组成的切割剂将L1和L2多肽从树脂上裂解下来。使用体积比为50：45：2.5：2.5的TFA，DCM，Tips和水组成的切割剂裂解多肽EIYsIYsE，以避免硫酸化酪氨酸水解。
步骤2：通过将EIYsIYsE、L1和L2共组装制备EIYsBE3；
首先将多肽EIYsIYsE、L1和L2的冻干粉溶于超纯水中，用氢氧化钠(1M)将溶液pH调整至7.4后，用水定量溶液体积，得到浓度分别为4mM的EIYsIYsE和1mM的L1及L2的多肽母液。将EIYsIYsE、L1和L2的母液以86：6：8的摩尔比混合后得到浓度为2mM的EIYsBE3的母液，退火并静置24小时使其组装。
实施例2：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的硫酸酯酶响应性和结构表征：
使用UPLC、圆二色谱、原子力显微镜和透射电子显微镜对组装构象、形貌和酶响应性进行表征。方法如下：
1)酶响应实验：向含有多肽的NaOAc缓冲液(0.5M，pH 5)中加入硫酸酯酶(50U/mL，34mM Nacl)；在37℃下孵育不同时间，利用UPLC-MS对EIYsBE3进行分析；
2)圆二色性光谱：CD光谱由Biologic MOS-500光谱仪在25℃下使用2mm石英比色皿记录；通过将2mM多肽母液稀释至100μM制备CD样品；CD光谱扫描均以1.0nm的波长间隔和185至260nm的波长范围进行记录；
3)原子力显微镜：AFM图片由CSPM 5500仪器在轻敲模式下进行拍摄；通过将多肽母液稀释至500μM或者是100μM制备AFM样品；将10μL多肽溶液滴至新切割的云母片表面放置5分钟，然后用滤纸去除剩余的溶液并在大气条件下干燥后用于样品测试；
4)透射电子显微镜：TEM图像由HITACHI HT7700 Exalens显微镜在100kV的加速电压下记录；通过将母液稀释至1mM或者是200μM制备TEM样品；将5μL多肽溶液滴在碳涂层铜网上放置5分钟并用滤纸除去剩余溶液之后，滴加5μL，2wt％醋酸双氧铀溶液染色5分钟；将铜网放置于干燥器中干燥以备后期测试。
实验结果：如图2、3所示，超高效液相色谱分析表明，在含硫酸化酪氨酸的Ys、EIYsIYsE和EIYsBE3溶液中加入硫酸酯酶后，硫酸化酪氨酸Ys转化为Fmoc-Tyr-OH(Y)、硫酸化肽EIYsIYsE转化为肽EIYIYE，EIYsBE3中的硫酸化肽EIYsIYsE迅速转化为肽EIYIYE，表明Ys、EIYsIYsE和EIYsBE3都具有硫酸酯酶响应性；如图2、4所示，圆二色谱结果表明含硫酸化酪氨酸的肽组装体在溶液中形成无规卷曲的二级结构，而不含硫酸化酪氨酸的肽组装体在溶液中则形成β-折叠二级结构。AFM和TEM图像显示含硫酸化酪氨酸的肽组装体形成纳米颗粒平均直径约为40nm，而不含硫酸化酪氨酸的肽组装体形成纳米纤维。
实施例3：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3对Bcl-xL和VHL蛋白的结合亲和力研究；
使用微量热按照制造商提供的标准说明对Bcl-xL和VHL蛋白进行标记，用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液将标记的蛋白稀释到适当的浓度，以控制荧光信号，符合检测要求。通过梯度稀释方式从多肽母液中稀释制备16个肽样品(在Bcl-xL研究中，L1浓度为3nM至100μM，EIYB、EIYsBE3和EIYBE3浓度为3.66nM至120μM；在VHL研究中，L2浓度为4.57nM至150μM，EIYE3、EIYsBE3和EIYBE3浓度为4.88nM至160μM)。室温孵育多肽和蛋白混合液30分钟，通过Monolith NT.115仪器测试得到多肽和Bcl-xL以及VHL蛋白的Kd值。
实验结果：如图5所示，L1与Bcl-xL以及L2与VHL之间的结合常数分别为6.3μM和8.5μM，L1和L2结合亲和力之比引导我们将组装肽EIYIYE、配体L1和L2以摩尔比43：3：4，创建超分子PROTACs EIYBE3。如图4所示，我们发现EIYB和EIYBE3对Bcl-xL蛋白的结合亲和力分别为3.13μM和3.09μM，而EIYE3和EIYBE3与VHL的结合亲和力分别为4.15μM和4.19μM。与自由配体相比，将L1或L2共组装成肽纳米原纤维提高了配体与相应蛋白质的结合亲和力。此外，EIYsBE3与两种蛋白质的结合亲和力很低，这一结果证明了肽纳米原纤维的形成在配体-蛋白相互作用和PROTAC功能中的关键作用。
实施例4：
4T1细胞对一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的细胞摄取研究；
1、细胞摄取检测：4T1细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中，并在37℃下培养24小时；然后，向所述细胞中添加含有4％TAMRA标记多肽的EIYsBE3及其对照组，其中TAMRA部分的剂量为4μM；孵育2、4、8h后，用PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化，收集细胞并通过流式细胞仪进行分析。
实验结果：如图6所示，随着孵育时间的延长，4T1细胞中的荧光强度逐渐提高，说明多肽组装体成功被4T1细胞摄取，并且随着摄取时间的延长，摄取量不断增加。另外我们还观察到与EIYBE3相比，EIYsBE3处理的4T1细胞具有更高的荧光强度，说明小的纳米颗粒尺寸可能导致硫酸化组装体的高细胞摄取率。
2、内/溶酶体逃逸研究：4T1细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于共聚焦小皿中，并在37℃下培养24小时，然后，向细胞中添加含有4％TAMRA标记多肽的100μM的EIYsBE3以及其他对照组，孵育2、4、8h后，用PBS洗涤细胞3次后，将细胞与50nM Lyso-Tracker Red在37℃下孵育30分钟，4％多聚甲醛固定20min，DAPI染色20min后，PBS洗细胞3次，利用共聚焦激光扫描显微镜成像。
实验结果：如图6所示，在用EIYsBE3处理后的4T1细胞中，TAMRA和Lyso-Tracker信号之间的皮尔逊相关系数(PCC)值约为0.65，而延长孵育时间到12小时时下降到0.23。这说明多肽纳米药物是通过内体/溶酶体-介导的内吞途径被细胞摄取，并且能够实现内体/溶酶体逃逸进入细胞质。
3、生物透射电镜：将4T1和3T3细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板中过夜。然后将EIYsIYsE和EIYsBE3分别加入到4T1细胞中(总浓度为200μM)，共孵育12h。同时，用EIYsBE3处理3T3细胞12h(总浓度为200μM)。收集细胞，然后在2.5％二醛中固定过夜。去除固定液后，用PBS洗涤三次，再用1％柠檬酸溶液固定2h。随后，用PBS洗涤三次，用梯度乙醇-PBS溶液(从30％、50％、70％、80％、90％到95％)脱水每次15min，并用100％乙醇或丙酮处理20min。细胞样品分别用包埋剂与丙酮(体积比1:1)的混合物处理1h，用另一种包埋剂与丙酮(体积比3:1)的混合物处理3h，用纯包埋剂过夜。包埋后在70℃下加热过夜，得到包埋的巨噬细胞样品。用LEICAEMUC7超薄切片机对样品进行切片，得到宽度约为70-90nm的切片。最后，分别用柠檬酸铅溶液和醋酸铀酰溶液(50％乙醇)染色5-10min。生物透射电镜图像由FEI Tecnai Spirit在80kV加速电压下记录。
实验结果：如图6所示，多肽EIYsIYsE处理的3T3细胞的细胞质中没有检测到纳米原纤维，但在用EIYsBE3处理的4T1细胞中观察到大量的长束状纳米原纤维。因为在过表达硫酸酯酶的乳腺癌4T1细胞中，硫酸化多肽经过硫酸酯酶水解从纳米颗粒转化为纳米纤维，而3T3细胞中硫酸酯酶含量低不足以促进硫酸盐水解，从而维持硫酸化多肽形成的纳米颗粒。这些结果为多肽被溶酶体介导的内吞途径内化到4T1细胞后在细胞质中组装成明确的纳米原纤维提供了强有力的支持。
实施例5：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的细胞毒性效果及其诱导细胞死亡的机制研究；
1、细胞毒性检测：将所述4T1细胞或3T3细胞以每孔5000个的密度接种于含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的96孔板中；孵育24小时后，将所述细胞与不同浓度的EIYsBE3及其它对照组再共孵育24小时，其中所述不同浓度的EIYsBE3的L1部分的浓度分别为：0、0.01、0.19、0.38、0.75、1.5、3、6、7.5、12和24μM；或L2部分的浓度分别为：0、0.13、0.25、0.5、1、2、4、8、10、16和32μM；随后，加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液并进一步培养4小时；最后，去除上清液，每孔注入100μL DMSO溶解紫色晶体，在酶标仪上通过记录490nm处的吸收强度测量所述细胞的活力。
实验结果：如图7所示，用EIYsIYsE和EIYIYE处理4T1细胞并没有导致细胞活力的显著下降，表明这些多肽具有生物相容性。用EIYsBE3孵育3T3细胞并没有显示出细胞活力的明显下降，表明超分子PROTACs EIYsBE3对过表达硫酸酯酶的癌细胞具有选择性细胞毒性。如图8所示，在所有处理组中，超分子PROTACs EIYsBE3的细胞毒性最强，半抑制浓度IC50约为117.7μM(L1和L2分别为7.02和9.36μM)，这一结果表明了将配体以合理的比例加入超分子PROTACs中在其细胞毒性中的关键作用。此外，EIYBE3的半抑制浓度值为171μM(L1和L2分别为10.26μM和13.68μM)，与EIYsBE3相比，EIYBE3的低细胞毒性可能是由于其内化程度相对较低所致。
2、细胞凋亡检测：将4T1细胞以2×105/孔的细胞密度接种在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的6孔板中，在CO2培养箱内培养过夜。向孔板中加入含有EIYsBE3及其他对照组(PBS、EIYsIYsE、L1、EIYsE3和EIYsB，L1和L2部分的剂量分别为7.5和10μM，总肽浓度为125μM)的新鲜培养基，孵育24小时后，弃培养基并用PBS洗涤细胞3次，用不含有EDTA的胰酶消化细胞，用PBS清洗2次后收集细胞。然后用AnnexinV-FITC和PI溶液在黑暗中染色10分钟，在流式细胞仪下进行检测。
实验结果：如图7所示，EIYsBE3处理的4T1细胞凋亡率明显高于其他处理组，表明超分子PROTACs EIYsBE3具有较强的细胞毒性。其他处理组的细胞凋亡率较低是由于其半抑制浓度值均高于超分子PROTACs EIYsBE3。
3、蛋白质印迹检测：将4T1细胞以2×105的密度接种于六孔板中在DMEM培养基中培养过夜，然后，使用250μM的EIYsBE3及其对照组持续培养24小时之后，弃除培养基，使用PBS清洗，将细胞用2％的SDS处理并收集，通过Bradford蛋白质定量检测试剂盒测量蛋白质浓度后，将蛋白质与上样缓冲液在100℃下孵育10分钟，随后，将每个样品中20μg的蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶并电泳转移到PVDF膜上，将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后在相应的特异性一抗(Bcl-xL、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)中在4℃下孵育过夜，与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1h后，在Tanon-5200Multi仪器下用ECL化学发光检测对蛋白条带进行成像。
实验结果：如图7、9所示，结果显示与对照组相比超分子PROTACs EIYsBE3处理后的4T1细胞的Bcl-xL水平明显降低，而其他肽组装体处理后并没有导致蛋白水平的明显下降。这些结果直接暗示了超分子PROTACs EIYsBE3诱导的Bcl-xL的降解。在细胞凋亡机制中，Caspase-3被裂解并启动凋亡途径，用EIYsBE3孵育4T1细胞会导致Caspase-3水平的降低，而被裂解的Caspase-3水平增加，从而导致细胞死亡。我们还通过对EIYsBE3-1：1和EIYsBE3进行WB检测，研究了超分子PROTACs中的配体比例对蛋白降解的影响。WB结果显示，与PBS处理的4T1细胞相比，EIYsBE3处理的4T1细胞导致75％的Bcl-xL降解，而EIYsBE3-1：1孵育的4T1细胞中Bcl-xL水平下降了约64％。这一结果与不同配体比例的超分子PROTACs的细胞毒性相一致，表明合理优化超分子PROTACs中的配体比例有助于三元复合物的形成，从而降解靶蛋白。此外，预先形成的超分子PROTACs EIYBE3与4T1细胞共孵育后导致55％的Bcl-xL降解，这表明超分子PROTACs EIYsBE3的高细胞摄取导致其高降解效率。
4、Caspase-3/9活性检测：将4T1细胞以2×105的密度接种于六孔板中在DMEM培养基中培养过夜。吸掉培养基后用PBS清洗细胞2次。向六孔板中分别加入含有EIYsBE3及其他对照组(PBS、EIYsIYsE、EIYsE3、L1和EIYsB)的新鲜无血清培养基(其中L1或L2部分的剂量分别为7.5μM和10μM；总肽浓度为125μM)。与细胞共孵育12h后收集细胞，用PBS洗涤并离心，随后加入裂解液重悬沉淀，并置于冰上裂解15min。然后在4℃下16000g离心15min，最后将40μL的上清液和10μL的Ac-LEHD-pNA/Ac-DEVD-pNA(2mM)缓冲溶液一起加入到96孔板中，在37℃的条件下孵育6小时。通过酶标仪(TECAN Infinite M Nano)记录405nm处的吸光度来确定Caspase-3/9的活性。
实验结果：如图7所示，用EIYsBE3处理4T1细胞，可增强Caspase-9和Caspase-3的活性，从而激活细胞凋亡信号通路。这些结果有力地证明了超分子PROTACs EIYsBE3可以招募VHL诱导4T1细胞中的蛋白Bcl-xL降解，从而激活Caspase依赖的细胞凋亡途径，促使细胞死亡。
实施例6：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的体内生物分布的研究；
1、体内/体外荧光成像：6-8周雌性BALB/c小鼠购自查尔斯河实验动物科技有限公司，所有体内实验均按照南开大学动物护理与使用委员会批准的方案进行；将4T1细胞(3×106/只)皮下注射到雌性BALB/c小鼠腋下来建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到70mm3时，将小鼠随机分组，对小鼠尾静脉注射含有80μM TAMRA标记多肽的EIYsBE3及其它对照组，分别在给药2、4、8、16和24小时后，使用活体成像系统IVIS Lumina对小鼠进行成像，监测纳米药物的活体分布情况。在24小时后，处死小鼠，并收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾)和肿瘤组织用于离体成像和分析。
实验结果：如图10所示，给予EIYsIYsE、EIYsE3、EIYsB和EIYsBE3的小鼠肿瘤组织表现出强烈的荧光信号，并在给药4h后荧光强度达到最高，表明它们在肿瘤组织中有效积累。肿瘤部位肽组装体的荧光信号保留了至少24小时，这意味着它们在肿瘤部位的保留时间较长。相比之下，注射了游离配体L1的小鼠的肿瘤组织显示出微弱的荧光信号。此外，注射EIYBE3的小鼠体内肿瘤组织的荧光信号强度低于硫酸化肽组装体。这些结果表明，通过给药前体原位制备超分子PROTACs有助于其肿瘤保留，从而有可能提高治疗效果。体外荧光成像结果显示注射多肽组装体的小鼠的肿瘤组织表现出显著的荧光强度并均明显强于正常器官，证明了其肿瘤靶向特性。
2、肿瘤渗透性能研究：将4T1细胞(3×106/只)皮下注射到雌性BALB/c小鼠腋下来建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到70mm3时，将小鼠随机分组，对小鼠尾静脉注射100μl含TAMRA-EIYsIYsE或TAMRA-EIYIYE的EIYsBE3或EIYBE3溶液(TAMRA部分剂量为80μM，总肽浓度为2mM)。给药6小时后，解剖获得肿瘤组织，进行冷冻切片和DAPI染色，通过与TAMRA部分相关的荧光信号显示多肽纳米药物的肿瘤渗透情况。
实验结果：如图10所示，注射EIYsBE3的小鼠肿瘤组织切片的CLSM图像显示在肿瘤组织深部有荧光信号，而经EIYBE3处理的小鼠肿瘤组织仅在表面观察到荧光信号。结果分析表明，原位制备由纳米颗粒转化为纳米纤维形态的超分子PROTACs有助于其在肿瘤组织中的保留，这是因为与预先形成的超分子PROTACs EIYBE3相比，EIYsBE3具有先进的肿瘤穿透能力。
实施例7：
一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的体内抗肿瘤治疗效果的研究；
1、体内肿瘤治疗效果研究：将4T1细胞(3×106)皮下注射到雌性BALB/c小鼠右侧腋下，建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到70mm3时，将小鼠随机分组，通过尾静脉对小鼠进行不同的处理。在实验开始的第1天至第5天，每天通过尾静脉给药1次，共给药五次。另外，每隔一天监测和记录每只小鼠的体重和肿瘤体积。在给药后第19天，安乐处死所有小鼠。收集肿瘤组织和主要器官(心、肝、脾、肺、肾)用4％多聚甲醛固定，进行苏木精和伊红(HE)染色试验。
从给药的小鼠身上收集了眼眶血，采用迈瑞S32自动生化分析仪(BS-240VET)和迈瑞自动血液分析仪(BC-2800VET)测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(BIL)、血尿素氮(BUN)、尿尿酸(UA)和血小板(PLT)的水平。
实验结果：如图10所示，肿瘤生长曲线显示用EIYsBE3或PTX治疗小鼠后，肿瘤组织生长缓慢，而注射EIYsE3、L1和EIYsB的小鼠的肿瘤体积与PBS组相当。用EIYsBE3+PTX治疗组的小鼠肿瘤的生长被显著抑制。此外，EIYsBE3和PTX联合治疗小鼠的肿瘤组织的大小和重量明显小于其他治疗组小鼠。这些结果说明了超分子PROTACs EIYsBE3和化疗药物联用具有良好的肿瘤治疗效果。如图11所示，苏木精/伊红染色分析显示，EIYsBE3+PTX联合治疗组的肿瘤组织中细胞明显收缩和凋亡，表明与其他治疗组相比，EIYsBE3+PTX联合治疗组对4T1荷瘤小鼠的治疗效果更好。同时，小鼠的心脏、肝、脾、肺、肾等正常器官未见明显的病理损伤，表明多肽组装体和PTX具有良好的生物安全性。
需要进一步说明的是，本发明并不涉及疾病的诊断和治疗，提供的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs，可用于制备治疗抗肿瘤药物或载药平台方面，其中实施例6和7虽然将所得产品作用于有生命的小鼠，但其结果并非为了直接得到对疾病的诊断及治疗结果。其中实施例研究所得抗肿瘤超分子PROTACs在体内生物分布情况，验证其肿瘤靶向特性，实施例7是对抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的体内抗肿瘤治疗效果的研究，证明了其生物安全性，为所得抗肿瘤超分子PROTACs用于治疗相关药物提供依据。

Claims (10)

1.一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤超分子PROTACs为EIYsBE3，制备步骤如下：
步骤1：多肽EIYsIYsE、L1和L2的合成；
1)采用标准Fmoc多肽固相合成方法SPPS进行多肽合成。使用Rink酰胺4-甲基苯甲胺MBHA树脂合成，其中树脂上NH2基团载量：0.352mmol/g，将Fmoc保护的氨基酸、HBTU和DIEA以相对于上述Rink酰胺4-甲基苯甲胺MBHA树脂的摩尔比为4：4：6溶解于DMF中，混匀后加入合成管中反应，接着用25％哌啶去除Fmoc保护基团；其中在合成Ys时缩合剂选用PyAOP；
2)完成所有的偶联反应后，使用体积比为95：2.5：2.5的TFA、Tips和水组成的切割剂将L1和L2多肽从树脂上裂解下来，使用体积比为50：45：2.5：2.5的TFA、DCM、Tips和水组成的切割剂裂解多肽EIYsIYsE，以避免硫酸化酪氨酸水解；
步骤2：通过将EIYsIYsE、L1和L2共组装制备EIYsBE3；
首先将多肽EIYsIYsE、L1和L2的冻干粉溶于超纯水中，用1M的氢氧化钠将溶液pH调整至7.4后，用水定量溶液体积，得到浓度分别为4mM的EIYsIYsE和1mM的L1及L2的多肽母液，将EIYsIYsE、L1和L2的母液以86：6：8的摩尔比混合后得到浓度为2mM的EIYsBE3的母液，退火并静置24小时使其组装。
2.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的表征，包括硫酸酯酶响应实验、临界聚集浓度、圆二色性光谱、原子力显微镜和透射电子显微镜的表征，各种表征方法如下：
1)酶响应实验：向含有多肽的0.5M、pH 5的NaOAc缓冲液中加入50U/mL溶解于34mMNaCl缓冲液中的硫酸酯酶；在37℃下孵育不同时间，利用UPLC-MS对EIYsBE3进行分析；
2)圆二色性光谱：CD光谱由Biologic MOS-500光谱仪在25℃下使用2mm石英比色皿记录；通过将2mM多肽母液稀释至100μM制备CD样品；CD光谱扫描均以1.0nm的波长间隔和190至260nm的波长范围进行记录；
3)原子力显微镜：AFM图片由CSPM 5500仪器在轻敲模式下进行拍摄；通过将多肽母液稀释至500μM或者是100μM制备AFM样品；将10μL多肽溶液滴至新切割的云母片表面放置5分钟，然后用滤纸去除剩余的溶液并在大气条件下干燥后用于样品测试；
4)透射电子显微镜：TEM图像由HITACHI HT7700 Exalens显微镜在100kV的加速电压下记录；通过将母液稀释至1mM或者是200μM制备TEM样品；将5μL多肽溶液滴在碳涂层铜网上放置5分钟并用滤纸除去剩余溶液之后，滴加5μL，2wt％醋酸双氧铀溶液染色5分钟；将铜网放置于干燥器中干燥以备后期测试。
3.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的蛋白结合亲和力的测定，通过微量热泳动仪检测多肽和Bcl-xL以及VHL蛋白的结合力，方法如下：
对Bcl-xL和VHL蛋白进行标记，将标记后的蛋白溶液使用含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液稀释至适当的浓度；分别向里面加入多肽样品，室温孵育多肽和蛋白混合液30分钟，通过Monolith NT.115仪器测试得到多肽和Bcl-xL以及VHL蛋白的Kd值。
4.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的细胞摄取的表征，通过流式细胞仪确定EIYsBE3的细胞摄取情况，方法如下：
4T1细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中，并在37℃下培养24小时；然后，向所述细胞中添加含有TAMRA标记多肽的多肽组装体EIYsBE3及其他对照组，其中TAMRA部分的剂量为4μM；孵育2、4、8h后，用PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化，收集细胞并通过流式细胞仪进行分析。
5.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的内/溶酶体逃逸的表征，通过共聚焦显微镜观察EIYsBE3的内/溶酶体逃逸情况，方法如下：
4T1细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于共聚焦小皿中，并在37℃下培养24小时，然后，向细胞中添加含有4％TAMRA标记多肽的100μM多肽组装体EIYsBE3及其他对照组，孵育2、4、8h后，用PBS洗涤细胞3次后，将细胞与50nM Lyso-TrackerRed在37℃下孵育30分钟，4％多聚甲醛固定20min，DAPI染色20min后，PBS洗细胞3次，利用共聚焦激光扫描显微镜成像。
6.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的体外细胞毒性的表征，
通过使用标准MTT测试确定EIYsBE3对4T1细胞和3T3细胞的细胞毒性，方法如下：
1)将所述4T1细胞或3T3细胞以每孔5000个的密度接种于含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的96孔板中；
2)孵育24小时后，将所述细胞与不同浓度的EIYsBE3及其他对照组再共孵育24小时；
3)随后，加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液并进一步培养4小时；
4)最后，去除上清液，每孔注入100μL DMSO溶解紫色晶体，在酶标仪上通过记录490nm处的吸收强度测量所述细胞的活力。
7.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3调控细胞内蛋白表达的表征，通过免疫蛋白印迹的方法验证EIYsBE3调控细胞内蛋白表达的情况，方法如下：
对4T1细胞暴露于EIYsBE3及其他对照组后细胞中Bcl-xL和VHL的表达进行了蛋白质印迹研究；细胞以2×105的密度接种于六孔板中在DMEM培养基中培养过夜，然后，使用250μM的多肽持续培养24小时，之后，将细胞用2％的SDS处理并收集，通过Bradford蛋白质定量检测试剂盒测量蛋白质浓度后，将蛋白质与上样缓冲液在100℃下孵育10分钟，随后，将每个样品中20μg的蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶并电泳转移到PVDF膜上，将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后在相应的特异性一抗中在4℃下孵育过夜，与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1h后，在Tanon-5200Multi仪器下用ECL化学发光检测对蛋白条带进行成像。
8.根据权利要求1所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs的制备方法，其特征在于，得到的抗肿瘤超分子PROTACs EIYsBE3的体外细胞凋亡的表征，通过流式细胞仪检测EIYsBE3诱导细胞凋亡的情况，方法如下：
Caspase-3/9活性检测：将4T1细胞以2×105的密度接种于六孔板中在DMEM培养基中培养过夜，吸掉培养基后用PBS清洗细胞2次，向六孔板中分别加入含有PBS、EIYsIYsE、EIYsE3、L1、EIYsB和EIYsBE3的新鲜无血清培养基，其中L1或L2部分的剂量分别为7.5μM和10μM，总肽浓度为125μM，与细胞共孵育12h后收集细胞，用PBS洗涤并离心，随后加入裂解液重悬沉淀，并置于冰上裂解15min，然后在4℃下16000g离心15min，最后将40μL的上清液和10μL、2mM的Ac-LEHD-pNA/Ac-DEVD-pNA缓冲溶液一起加入到96孔板中，在37℃的条件下孵育6小时，通过酶标仪记录405nm处的吸光度来确定Caspase-3/9的活性。
9.一种基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs，其特征在于，通过权利要求1-8任一项方法制备得到，该抗肿瘤超分子PROTACs为EIYsBE3。
10.权利要求9所述的基于硫酸酯酶响应的原位组装抗肿瘤超分子PROTACs在抗肿瘤药物或载药平台方面的应用。
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