CN117618383A - 负载ssk1的神经递质衍生纳米载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，其特征在于：该负载SSK1的神经递质衍生纳米载体通过SSK1、苯基硼酸季铵化的类脂质和NT类脂质混合后，经涡旋超声、透析后获得。该负载SSK1的神经递质衍生纳米载体能够用于制备治疗和缓解阿尔茨海默病症状的药物。

Description

负载SSK1的神经递质衍生纳米载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及负载SSK1的神经递质衍生纳米载体及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，会影响陈述性记忆和非陈述性记忆，尤其是老年人。全球有5000多万人受到阿尔茨海默病的影响，阿尔茨海默病的发病率越来越高，预计到2050年，发病人数将翻两番。阿兹海默症是导致人死亡的第6大原，是65岁以上老老人的第5大死因原因。在富含淀粉样老年斑的AD患者大脑中，经常可以观察到小胶质细胞和星形胶质细胞的持续激活、局部炎症状态、溶酶体功能失常/受损和/或神经元变性等特征。毫无疑问，衰老是诱发老年痴呆症的一个主要因素，但与淀粉样蛋白假说等其他老年痴呆症风险因素相比，人们对衰老与老年痴呆症的关系知之甚少。与年龄相关的病理组织通常会出现衰老细胞，这些细胞具有特定的形态和功能特征，包括细胞周期进展缓慢、抗凋亡和/或分泌促炎因子。因此，各种清除衰老细胞的方法可显著改善衰老小鼠的健康状况。更重要的是，越来越多的证据表明，衰老在基因、细胞和微环境水平上促进了AD的发生和发展。然而，消除衰老细胞是否能改善AD的认知障碍仍是一个未知数。

衰老是一个动态的、高度异质性的过程，因此抗衰老药物的开发在特异性和普遍性方面都受到很大限制。人们提出了各种方法来克服这一挑战。一种很有前景的策略是利用衰老过程中溶酶体酶(如β-半乳糖苷酶(β-gal))的上调，开发能被β-gal特异性激活的原药。值得注意的是，β-gal通常被认为是识别各种衰老细胞的衰老生物标志物，其表达和活化在衰老过程中会增加。据此开发了一种主要化合物SSK1(衰老特异性杀伤化合物1)，它能被β-gal特异性裂解，释放出其活性形式吉西他滨，进而诱导衰老细胞凋亡。无论衰老诱导剂是什么，SSK1对人类和小鼠的衰老细胞都有普遍的清除作用。用SSK1治疗老年小鼠可减少SA-β-gal阳性的肺组织细胞，减少与衰老和老化相关的基因特征，减轻轻度慢性炎症，并提高体能。此外，近年来越来越多的研究表明，清除大脑中的衰老细胞对治疗神经退行性疾病有积极影响。

然而，由于血脑屏障(BBB)的存在，许多在其他适应症中表现出良好疗效的治疗药物在包括AD在内的脑部疾病治疗中失效。近年来，人们在改善脑部给药包括中枢神经系统直接给药方面做出了大量努力。在这些方法中，直接向中枢神经系统给药可能会造成感染和组织损伤。此外，由于中枢神经系统的扩散距离和药物的快速外流，药物会在数小时内迅速排出中枢神经系统。虽然某些技术暂时破坏了BBB，可能会促进药物的输送。然而，BBB的破坏往往会导致大脑神经病理变化。与此相反，纳米粒子在向大脑输送诊断和/或治疗药物方面具有广阔的潜力，而且安全问题有限。各种类型的纳米颗粒已被证明能成功地通过BBB输送的载体，包括脂质体、阳离子聚合物、无机纳米颗粒和纳米胶囊，但通常需要复杂的后期修饰以确保BBB穿透能力。

故而，如何提供一种结构简单，穿透能力强，且能靶向脑神经元的药物急需给开发。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，制造了一种新型纳米药物SSK1-NPs，它能有效地将SSK1送入大脑，然后SSK1被溶酶体中表达水平较高的β-gal特异性裂解，随后释放出其活性形式吉西他滨，进而诱导细胞凋亡。这导致了老年AD小鼠脑细胞的根除、淀粉样蛋白-β累积的减少和认知功能的改善。本发明还证明了，有效消除衰老细胞可改善AD的进展，这可能是治疗AD的一种有前途的策略。

本发明提供了一种负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备治疗和缓解阿尔茨海默病症状的药物上应用，其特征在于：

上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体通过SSK1、苯基硼酸季铵化的类脂质和NT类脂质混合后，经涡旋超声、透析后获得。

进一步地，本发明提供的应用，其特征还在于：

上述NT类脂质与苯基硼酸季铵化的类脂质的质量比为3：7-27。

进一步地，本发明提供的应用，其特征还在于：

上述SSK1的添加量为类脂质混合物总重量的10-100％。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备清除衰老细胞的产品上应用。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备清除经H₂O₂诱导衰老的细胞的产品上的应用。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备诱导衰老细胞中p38的磷酸化的产品上的应用。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备清除p21和Aβ蛋白的试剂上的应用。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备改善和恢复AD患者认知能力的药物上的应用。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备改善和恢复AD患者身体功能，生活质量的产品上的应用。

针对上述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体，本发明还提供了其在制备检测衰老水平的试剂盒上的应用。

本发明的作用和效果：

如图1所示，本发明制造的SSK1-NPs经尾静脉注射，然后穿透BBB。SSK1-NPs到达脑部病灶后，进入神经细胞并释放SSK1，然后被溶酶体β-gal裂解，在衰老细胞中释放其活性形式吉西他滨。吉西他滨通过p38 MAPK信号通路诱导细胞凋亡，进而减少淀粉样斑块的积累。

由此，本发明开发了一种高BBB穿透性纳米粒子，它能有效地将SSK1负载并递送到AD小鼠的脑损伤处，在那里SSK1被β-gal选择性激活，进而诱导衰老细胞凋亡和Aβ斑块清除，最终恢复认知活动。与SSK1-NP不同，未包装的SSK1在清除脑内衰老细胞方面效果有限，并且未能恢复AD老年小鼠的认知功能，这可能是由于其BBB渗透能力差以及在脑病变处的剂量不足。此外，SSK1-NP在体内显示出良好的载货能力、血清稳定性和出色的安全性，这为其进一步临床开发提供了支持。

有趣的是，SSK1-NPs还能恢复老年小鼠的身体功能，如肌肉活动，这可能会进一步改善AD患者的生活质量。

总之，本发明设计出了一种新型纳米药物SSK1-NPs，它具有强大的抗注意力缺失症活性和良好的安全性，可为注意力缺失症治疗提供一种前景广阔的策略。

附图说明

图1、SSK1-NPs的制造和应用示意图；

图2、SSK1选择性地抑制衰老神经元细胞的生长；

图3、SSK1 NP选择性地抑制衰老细胞的生长；

图4、(A)NT1-O12B、PBA-Q76O16B、游离形式的SSK1、SSK1-NP、破乳获得的SSK1的MS光谱。(B)游离形式的SSK1和破乳获得的SSK1的性能比较。

图5、SSK1-NPs的特征。(A)描绘了NT脂质掺杂LNP的配方，用于将货物输送到大脑。(B)含有不同数量PBA-Q76O16B的NT1-O12B中SSK1成分的图像(采用重量比)。观察到原始SSK1-NP载体为混浊混合物，而随着PBA-Q76-O16B类脂掺杂比例的增加，胶囊从透明溶液转变为均匀透明的象牙色溶液。DLS测量用于确定各种NT-LNP制剂的流体力学尺寸。(D)使用荧光捕获了小鼠大脑的代表性图像，该图像是在静脉注射一次DiR-NPs(1毫克/千克)1小时后剖开的。(E)SSK1-NPs或NPs的大小和示意图。(F)SSK1-NPs和NPs的放大TEM图像。(G)纳米颗粒的稳定性检测。(H)SSK1-NPs在PBS溶液中的药物释放曲线。数据以平均值±SEM表示(n＝3，*P<0.05，**P<0.01)。

图6.一次性静脉注射DiR负载的NT1-O12B/PBA-Q76-O16B LNPs(1mg/kg)后1小时解剖的小鼠大脑的代表性荧光图像。DiR在LNP中的重量比为10％。并且通过小动物体内成像系统再次定量来自大脑的荧光强度。

图7、SSK1负载。使用由理论药物浓度相对于测量的峰面积产生的标准曲线来计算SSK1的负载。标准曲线的相关系数(r2)>0.99。

图8.SSK1-NPs对衰老细胞的细胞毒性。(A)体外细胞实验示意图。(B)用载体、SSK1或SSK1-NP处理N2a细胞后的SA-β-gal染色图像和测量结果。缩放条，200μm。(C-D)左侧为代表性流式细胞图，右侧为存活和凋亡细胞百分比的量化。这些细胞在经过每组3天的处理后，使用annein V和PI染色对衰老细胞进行处理(n＝3)。(E-F)使用Western印迹法，在衰老或非衰老细胞中用载体、SSK1或SSK1-NPs SSK1(0.5μM)孵育3天后，WB检测phos-p38 MAPK。数据与对照组(箭头)进行单因素方差分析比较，然后进行Dunnett后检验。所有行为测试柱状图或曲线图均以平均值±SEM表示(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

图9.N2a细胞对FITC-NPs的吸收。比例尺＝200μm。

图10.用SSK1-NP治疗衰老的3Tg小鼠的动物实验。在8周的时间里，12个月大的小鼠每两周静脉注射一次SSK1 NP(0.5mg/kg)、SSK1(0.5g/kg)、NP(0.5mg/kg)或载体(DMSO)，持续三天。

图11.SSK1-NPs可消除3Tg AD小鼠体内的衰老细胞。(A-B)用SSK1,载体或SSK1-NP处理3Tg小鼠的大脑，获得代表性图像以及p21和淀粉样蛋白沉积免疫荧光定量(n＝6)。比例尺为40μm。(C-D)通过WB检测用SSK1-NPs、SSK1、NPs或载体处理的3Tg小鼠的磷酸化-p38MAPK、淀粉样沉积和P21。(E)阿尔茨海默病患者(左)和健康人(右)MAPT、APP、GLB1、CDKN1A和CDKN2A mRNA表达的相关图。数据与对照组(箭头)进行了单因素方差分析和邓尼特事后检验。所有行为测试条形图或曲线图均以平均值±SEM表示(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

图12.AD患者和健康个体中MAPT、APP、GLB1、CDKN1A和CDKN2A mRNA表达图。

图13.实验设计和水迷宫示意图。(A)小动物水迷宫示意图。(B)各组小鼠在水迷宫实验中的运动轨迹。(C)各组小鼠经处理后的逃逸潜伏期行为实验结果。(D)各组穿越平台的频率。(E)各组小鼠在各象限所花费的时间比例。所有数据均与对照组进行比较。与对照组(箭头)的数据比较采用单因素方差分析，然后进行Dunnett后检验。所有行为测试柱状图或曲线图均以平均值±SD表示(*P<0.05)。

图14.在药物治疗之前，使用Morris水迷宫测试来测试小鼠的空间学习。记录小鼠寻找平台的游泳速度和潜伏期。所有行为测试条形图均以平均值±SEM表示(n＝6，*P<0.05，**P<0.01)。

图15.SSK1-NPs的体内安全性。(A)药物安全性试验示意图。(B)照片显示的是用药物或SSK1-NP治疗8周的小鼠的活组织切片。(C)血液生化检查。评估药物组和SSK1-NP治疗组血液样本中的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿酸(UA)和血浆尿素(BUN)水平，以及粒细胞(GR)、淋巴细胞(LY)、白细胞、红细胞和PLT的浓度。数据与对照组(箭头)进行单因素方差分析比较，然后进行Dunnett后检验。所有行为测试条形图或曲线图均以平均值±SEM表示(*P<0.05)。

具体实施方式

本发明能够实施多种变更且能够具有各种实施例，因而要在附图中例示各特定实施例并对其进行说明。但这并不是要将本发明限定在特定的实施方式，而应当理解为包括落入本发明的思想以及技术范围的所有变更、等同物乃至替代物。

一、材料

过氧化氢30％(WH2012)购自威奥生物科技有限公司(中国上海)。(中国上海)购买。Neuro-2a(CL-0168)和SH-SY5Y(CL-0208)细胞购自Procell公司(中国武汉)。磷酸盐缓冲盐水(20012027)、杜氏磷酸盐缓冲盐水(14190144)、杜氏改良老鹰培养基(11995065)、胎牛血清(10099141C)和青霉素/链霉素溶液(15140122)购自Gibco(美国)。细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自Dojindo分子技术公司(日本熊本)。p38 MAPK(D13E1)兔mAb(8690S)、Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9)/>兔mAb(4511T)、APP(E4H1U)兔mAb(76600)和p21 Waf1/Cip1(E2R7A)兔mAb(37543S)购自Cell Signaling Technology(MA,USA)。其他抗体均购自Abcam公司(中国上海)。

二、合成

(1)类脂质的合成

阳离子类脂质，头胺(2-(pyrrolidin-1-yl)ethan-1-amine，2-(1H-indol-3-yl)ethan-1-amine)和丙烯酸酯以1:2.4的摩尔比在特氟隆内衬玻璃旋口瓶中加热48小时。采用硅胶闪蒸色谱法提纯原料。ESI-MS确认了脂质成分。

NT1-Neu系使用干燥烧瓶将棕榈酸-5-羟基硬脂酸和二氯甲烷(DCM)混合，然后逐渐加入溶于二氯甲烷的(COCl)₂。反应2小时后，通过旋转蒸发去除多余的(COCl)₂。随后，将溶于二氯甲烷的色胺引入干燥烧瓶，并让其反应12小时。之后，溶液经过浓缩，并通过硅胶闪蒸色谱法进行纯化。

(2)SSK1的合成

将吉西他滨(2.0当量，0.340mmol,89.5mg)和DIPEA(2.4当量，0.402mmol,70μL)溶于4mL DMF中。在微波反应容器中搅拌20min后，加入1(1等量，0.170mmol,113mg)将反应置于CEM Discover微波反应器(100℃)中辐照45min。然后，真空除去DMF，残留物经闪蒸柱层析纯化，得到所需产品SSK1白色固体。

离子检测模式为多重反应监测(MRM)，离子化模式为电喷雾离子化(ESI)，离子极性为正离子模式，毛细管电压为1.00kV，脱溶剂为氮气，脱溶剂温度为550℃，流量为1000L.h-1，挡板锥气体为氮气，流量为50L.h-1，碰撞气体为氩气。

(3)SSK1-NPs纳米材料的合成

将300μL二甲基亚砜(DMSO)与1毫克SSK1和1毫克的纳米载体(纳米载体由NT1-O12B和PBA-Q76O16B＝3：7混合)。将混合物涡旋并超声30分钟。为了进一步清除DMSO和SSK1，用透析管(截留分子量为35kDa)将混合物与蒸馏水稀释12小时。

三、实验方法

(1)流式细胞仪分析

流式细胞术用于分析经SSK1或SSK1-NPs处理后的细胞，以检测细胞凋亡情况。简言之，N2a和SH-SY5Y细胞经SSK1或SSK1-NPs(0.2μm)处理12小时。然后消化细胞并离心。随后，按照制造商的建议进行Annein V-FITC染色(Beyotime Biotechnology，C1063)。在FACSVerse(BD Biosciences)上进行流式细胞仪检测，检测时间为1小时。使用FlowJo LLC开发的FlowJo软件进行数据分析。

(2)细胞活性

为了评估SSK1或SSK1-NPs处理衰老和非衰老细胞的可行性，CCK8检测使用了CCK8试剂盒(Dojindo，中国上海)。在96孔板中每孔接种2104个细胞，培养基为100μl。用指定浓度的NPs或SSK1-NPs处理细胞后，再培养15小时。用PBS冲洗N2a细胞两次，然后在每个孔中加入100μL含10％(v/v)CCK-8的培养基。一小时后，微孔板阅读器在450纳米波长处记录光密度值。

(3)SA-β-gal活性

SA-β-gal活性的测定是利用SA-β-gal染色试剂盒(Beyotime生物技术研究所)进行的。简言之，先用PBS冲洗细胞，然后用SA-β-gal试剂盒中的固定液在室温下固定细胞15分钟。PBS冲洗后，将细胞置于检测衰老的溶液中37℃培养过夜。之后，使用发光显微镜检查细胞。

(4)DiR标记的NT-LNP在小鼠脑中的生物荧光信号分布

在100％的乙醇中，我们以10:1的重量比将NT类脂质和DiR混合并溶解。然后，将100μl溶液小心地以小量添加到300μl的醋酸钠缓冲液(25mM，pH 5.2)中，并用涡旋快速混合。在去离子水(分子量截止值为35kDa)中透析12小时后，我们成功去除了制剂中的乙醇。随后，我们给雌性BALB/C小鼠(6周大)静脉注射了DiR-NPs。持续1小时后，小鼠失去知觉，随后用生理盐水冲洗。随后，收集小鼠的大脑。利用SpectrumCT生物光子成像仪(PerkinElmer，马萨诸塞州波士顿)观察荧光信号的分布。

(5)小鼠实验

5.1.实验动物来源和处理

3Tg AD小鼠购自HFK(北京，HFK生物科学有限公司，北京)。动物实验程序经中国上海长征医院伦理委员会批准，并在该院进行。动物实验在无特定病原体的环境中进行。实验期间，受试小鼠均在温控室(20-24℃)中进行，相对湿度在50％至60％之间，光照/黑暗时间为12小时/12小时。小鼠通过吸入二氧化碳安乐死。在整个实验过程中，小鼠可自由饮水和进食。

5.2.行为测试和脑样本制备

为了评估工作记忆和空间记忆，对三重转基因小鼠进行了水迷宫测试。行为观察时间为下午6:00至晚上9:00。莫里斯水迷宫中的空间参照记忆是利用一个直径为1.2米的白色不透明塑料制成的圆形水箱进行评估的。水箱中装满水，通过添加溶于水的无毒的脱脂奶粉使其不透明。在学习测试期间，每天进行4次，每次60秒，连续5天，以获得18厘米见方的隐藏平台。小鼠的表现由ANY-maze视频跟踪系统(Stoelting Co.)

5.3.蛋白质印迹

收获前，使用4度的PBS缓冲液对细胞进行两次洗涤。根据蛋白质提取试剂盒中的说明，提取总蛋白(全蛋白提取试剂盒，百优时，中国)。使用BCA蛋白检测试剂盒(ThermoFisher Scientific,Inc.)蛋白样品与蛋白上样缓冲液混合，在95摄氏度的温度下孵育5分钟。WB实验按照传统方法进行。

5.4.免疫荧光染色

小鼠组织在4％多聚甲醛中固定24小时，然后在蔗糖溶液中脱水。随后，将组织包裹在OCT复合物(Sakura，4583)中进行冷冻切片。将包埋的组织切割并粘贴在切片上。对冷冻切片进行免疫荧光染色时，其余步骤按常规流程进行。

5.5.统计分析

统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，超过两组时采用Tukey-Kramer多重比较检验。使用Prism(GraphPad软件版本8)进行两组间的比较，采用学生t检验。P<0.05为差异显著。

四、结果和讨论

(1).关于SSK1

SSK1是一种衰老原药，可被溶酶体β-gal激活，而β-gal通常在衰老过程中上调，因此可选择性地诱导衰老细胞凋亡。

首先，评估了SSK1在衰老和正常神经细胞之间的选择性，用H₂O₂(200μm)处理小鼠神经元细胞系N2a细胞，孵育12小时，然后用指定浓度的SSK1处理，诱导N2a细胞的衰老。24小时后，测量细胞活力并将其标准化至初始时间点。(n＝3)。图2表明，SSK1能以浓度依赖的方式有效抑制H₂O₂诱导的衰老神经元细胞的生长，而本研究中即使使用最高浓度的SSK1，未诱导的对照N2a细胞的增殖也基本不受影响。

(2)关于SSK1-NPs

2.1.质谱表征

通过上述实验方法，将SSK1装入了神经递质(NT)衍生的合成脂质(NPs)中，生成了SSK1-NPs。简而言之，NT类脂质是通过在玻璃瓶中的70℃、48小时内对NT的伯胺和含丙烯酸酯的疏水尾部进行迈克尔加成反应而生成的。生成的NT类脂质包括作为前导成分的特定NT和作为后导成分的特定生物可再现疏水结构。随后，NT-类脂质通过闪速色谱进行纯化，并使用质谱(MS)对其进行表征，如图4(A)所示。质谱碎片谱证实，SSK1-NPs是通过溶剂注入技术成功制备的。

2.2.SSK1-NPs中的SSK1的活性变化

通过与200μm H₂O₂孵育12小时来诱导衰老的BV2细胞，然后以指定浓度处理游离形式的SSK1和破乳获得的SSK1。24小时后，测量细胞活力并将其标准化至初始时间点(n＝3)，结果如图4(B)所示，SSK1在组装前后没有任何差异。

2.3.制备条件比较

由于其两亲性，NT类脂质在水溶液中制备时会自组装成胶束(图5A)。为了获得更小、更均匀的纳米颗粒，我们制备了一种名为PBA-Q76-O16B的类脂质，用苯基硼酸季铵化来包裹SSK1。此外，我们还利用NT1-O12B作为掺杂剂，以改善纳米颗粒向大脑的输送。

为了提高纳米载体的稳定性，同时保留其在BBB中的穿透能力，研究了NT1-O12B和PBA-Q76-O16B的不同重量比(纯NT1-O12B、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9和纯PBA-Q76-O16B)，以提高其稳定性。随着NT1-012B类脂质的减少，混合溶液变得更加均匀和透明(图5B)。纳米载体的直径从大约600纳米减小到200纳米以下(图5C)。当质量比为3:7时，经动态光散射(DLS)测量，SSK1-NPs的最小直径为166±5nm。

接下来，研究了在这一质量比下，所产生的NT/PBA脂质是否继承了BBB穿透能力。纳米颗粒装载荧光染料(DiR)后进行静脉注射，按照"方法"中的描述，在用药1小时后测量DiR在大脑中的积累情况。如图5D和6所示，与PBS中的DiR相比，DiR-NPs处理后的小鼠脑内DiR荧光信号显著增加。这一结果表明，当质量比为3:7时，NT/PBA混合类脂质能很好地保持BBB穿透能力，即合成的纯脂质(PBA-76-O16B)无法将DiR运送到大脑中，而NT1-类脂质制剂能改善DiR向小鼠大脑的运送。

其后，研究了该优化质量比下的货物装载能力。包裹效率用以下公式计算：包埋效率＝所包埋的药物÷理论药物含量×100％。使用0.2μM SSK1溶液将约0.1μM SSK1装入NPs，药物装载率约为50％(图7)。使用Malvern Zetasizer通过动态光散射(DLS)评估了平均粒度和粒度分布。在SSK1-NP和空纳米粒子组之间没有观察到明显的粒度差异(图5E)。透射电子显微镜(TEM)分析表明，纳米颗粒呈球形，表面光滑，几乎所有颗粒的尺寸都小于200nm(图5F)。

此外，与非季铵化脂质相比，季铵化脂质包裹的SSK1粒径更小，这表明其体内稳定性更好。

最后，还研究了SSK1-NPs在这种两种脂质质量比下的稳定性和药物释放情况，因为这些特征在纳米药物开发中起着至关重要的作用。在4℃的PBS或37℃的含10％血清的PBS中培养两周后，纳米颗粒的大小和电位均未发生明显变化，表明其具有良好的稳定性(图5G)。通过在37℃的PBS中进行透析实验，研究了SSK1-NPs的药物释放情况。结果(图5H)显示出典型的两相指数曲线，表明SSK1从纳米颗粒中的释放分为快慢两个阶段。SSK1-NPs在最初的2小时内释放了约50％的SSK1，而其余的有效载荷则在培养24小时后逐渐释放(约88％)。

总之，在3:7的比例下，纳米颗粒的尺寸相对较小(小于200nm)，溶液清澈，混合后的NPs具有良好的药物负载/释放和BBB穿透能力。因此，后续实验选择了这一质量比的纳米粒子。

2.4.SSK1-NPs的选择性

如图3所示，本实施例还探索了SSK1-NPs在原代星形胶质细胞和BV2细胞(一种小鼠小胶质细胞衍生细胞系)中的选择性。一致的是，SSK1-NPs对H₂O₂诱导的衰老星形胶质细胞和小胶质细胞有很强的抗增殖活性，而对未诱导细胞的干扰很小。

2.5.SSK1-NPs诱导衰老细胞的细胞毒性

为了研究SSK1-NPs的细胞毒性及其杀死衰老细胞的机制，我们使用CCK8试剂盒检测了SSK1-NPs对N2a细胞活力的影响，并通过流式细胞术和WB进一步验证了SSK1-NPs的活性(图8A)。

首先，测量了纳米颗粒在N2a细胞中的货物运输效率。将FITC标记的纳米颗粒(FITC-NPs)或FITC-PBS与N2a细胞培养4小时。应用FITC-NPs会诱导荧光染料在细胞质中的可见积累，其积累量明显高于FITC-PBS处理的细胞(图9)。

接下来，研究了SSK1-NP诱导的H₂O₂诱导衰老细胞的细胞毒性。结果显示，SSK1-NPs和SSK1 SSK1都能特异性地强力清除β-gal(+)衰老细胞(绿色)，而对非诱导对照N2a细胞(未染色)的增殖干扰极小(图8B)。

此外，还进行了流式细胞术分析，以研究SSK1-NP诱导的衰老细胞凋亡，衰老细胞由附件素V和碘化丙啶(PI)双阳性染色定义。数据显示，与基础细胞死亡(2.0％)相比，SSK1-NP处理显著增加了衰老N2a细胞的凋亡(66.5％)(图8C-D)。

此外，与NP增加SSK1吸收的发现一致，与SSK1相比，SSK1-NPs显著增加了凋亡的衰老N2a细胞数量(66.5％对23.3％)。

最后，从分子水平探讨了SSK1-NPs诱导衰老细胞凋亡的机制。由于吉西他滨可通过p38信号通路引发细胞死亡，因此我们通过WB检测了经SSK1-NP处理的衰老细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化状态。SSK1-NP处理可明显诱导衰老细胞中p38的磷酸化(图8E-F)，表明SSK1-NPs被加工成吉西他滨。此外，虽然SSK1单独诱导了p38磷酸化水平的明显增加，但在统计学上低于SSK1-NP，这再次表明NP封装后药物的吸收和可及性更好。这些结果证实，纳米粒子能有效增加神经细胞对SSK1的吸收，然后通过溶酶体β-gal激活SSK1，进而选择性地杀死衰老细胞，最终诱导细胞凋亡。

2.6.SSK1-NPs可消除3TgAD小鼠大脑中的衰老细胞

在本实施例中，评估了SSK1-NPs在体内的抗衰老和抗AD活性。采用一周两次的给药计划向3Tg(APP/PS1/Tau)AD小鼠静脉注射载体、NPs、SSK1或SSK1-NPs，治疗8周后评估AD/衰老标记物(图10)。我们用免疫荧光法(IF)检测了AD小鼠大脑皮层和海马区的衰老标记物p21(红色)和AD病理标记物Aβ(绿色)。结果表明，SSK1-NP处理能诱导海马区p21和Aβ信号的明显降低，这表明SSK1-NP与其他处理相比能最大程度地清除衰老细胞和Aβ蛋白(图11A-B)。用SSK1-NPs处理的小鼠大脑皮层区域也呈现出同样的趋势，而且差异更大。

此外，还用WB检测了大脑中p21和Aβ的总含量。与IF结果一致的是，SSK1-NP处理后，衰老(p21)和AD病理(APP)标记物均显著减少。SSK1也降低了这些基因的表达，但效力明显较弱，这表明了NPs在SSK1递送中的重要作用(图11C-D)。

此外，SSK1-NPs还能诱导p38 MAPK的磷酸化，证实了SSK1能通过p38-p21轴诱导衰老细胞的消亡。有趣的是，通过分析Nakabeppu组(GSE173955)和Ma组(GSE184942)发表的AD患者的临床数据，发现β-gal与AD病理基因之间存在很强的共表达相关性。令人惊讶的是，在未出现AD症状的老年人中，传统衰老基因p21和p16的表达水平与AD基因呈一定的正相关，但在AD患者中却没有发现。这一发现表明，衰老在单组AD中起着重要作用，但在疾病发展过程中可能并不那么明显。

相比之下，AD患者的β-gal与tau和Aβ的正相关性要强于正常老人，这表明在AD的发展过程中，β-gal的表达可能会持续增加。虽然β-gal的平均水平在正常老人和AD老人之间没有统计学差异，但这可能受到小样本中个体差异的限制(图12)。尽管如此，β-gal的表达与AD的发展相关这一事实进一步暗示了SSK1-NPs在AD治疗中的高度临床价值。总之，我们的研究结果表明，SSK1-NPs可以消除AD小鼠大脑中的衰老细胞，从而减少淀粉样蛋白沉积。

由此表明，具有特异性靶向衰老细胞能力的衰老分解药物是治疗注意力缺失症的有前途的治疗方法。

2.7.SSK1-NP治疗可改善AD小鼠的认知功能

在使用SSK1-NPs、SSK1、NPs或载体治疗八周后，还通过莫里斯水迷宫试验评估了小鼠的学习和记忆功能(图13A)。用生理盐水治疗的小鼠作为阴性对照，其学习能力表现出典型的缺陷。治疗前，各组小鼠的认知障碍程度和游泳速度相似(图14)。与此形成鲜明对比的是，经SSK1-NP治疗的AD小鼠在治疗后学习和记忆功能有了显著改善(图13B)。在为期四天的训练过程中，接受SSK1-NPs治疗的小鼠的逃逸潜伏期和总飞行距离都显著缩短(图13C)。SSK1处理也减少了逃逸潜伏期，但其效果明显不如SSK1-NP处理。然而，SSK1处理未能减少小鼠逃跑的总距离。有趣的是，SSK1-和SSK1-NP处理的小鼠的游泳速度都在相似的水平上有显著提高，这表明解老药物治疗可以恢复老年AD小鼠的肌肉等生理功能。

此外，用SSK1治疗的小鼠游泳速度的增加可能解释了为什么这些小鼠的总距离没有减少，但逃逸潜伏期却减少了。因此，我们假设，单用SSK1对大脑的可及性可能较低，因此诱导消除大脑中衰老细胞的作用较弱。然而，它可能对位于肌肉中的衰老细胞具有良好的可及性。这一发现与目前人们对衰老在骨骼肌炎症和再生中的作用以及衰老疗法在治疗骨骼肌疾病中的潜力的认识是一致的。

NP封装能明显改善SSK1向大脑病变部位的输送，进而通过特异性地删除大脑中的衰老细胞，有效恢复AD小鼠的认知活动。此外，在训练结束移除逃生平台后，SSK1-NP处理的小鼠倾向于在平台原来所在的象限搜索平台，而其他方案的小鼠则表现出搜索活动的不集中(图13D-E)。与我们的假设一致的是，SSK1处理并没有显示出任何可检测到的平台搜索活动的改善，这有力地说明了使用SSK1-NPs在大脑病变处给药的重要性。

总之，上述数据表明，用SSK1-NPs消除AD小鼠大脑中的衰老细胞能显著恢复认知活动。即衰老细胞(如OPCs、星形胶质细胞和/或小胶质细胞)会导致AD的发生和发展，而消除这些衰老细胞可减轻AD症状。然而，在模型中，SSK1-NPs被设计为选择性诱导高β-gal表达细胞凋亡，而不考虑细胞类型(神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞在H2O2诱导衰老后对SSK1的反应，图2和9S)，这意味着衰老的神经元细胞、星形胶质细胞或OPCs/巨噬细胞是这种疗法的靶点。

此外，我们还观察到大脑皮层和海马中的Aβ斑块明显减少，这表明SSK1-NPs可直接消除产生Aβ斑块的衰老神经元细胞(图4A-4D)。尽管在现阶段，我们不能排除OPCs的清除可能为Aβ的积累提供了一个负反馈回路。此外，衰老细胞分泌的细胞因子、趋化因子、蛋白酶、生长因子和生物活性脂质等细胞外调节剂，即衰老相关分泌表型(SASP)，是衰老的标志之一。它促进了慢性炎症的发展，而慢性炎症又加速了细胞衰老，导致炎症和衰老的恶性循环。因此，清除衰老细胞，如高表达β-gal的细胞，可显著降低SASP，从而通过维持微环境的低炎症来防止接近衰老细胞的细胞衰老。

研究表明，利用神经递质衍生的纳米颗粒能有效地将抗衰老药物SSK1运送到AD小鼠的脑损伤处，在那里，该药物选择性地诱导衰老细胞凋亡和Aβ斑块清除，从而恢复认知活动。此外，SSK1-NPs还可能诱导肌肉中的衰老细胞凋亡，从而改善老年小鼠的生理功能。

2.8.SSK1-NPs在体内的毒性

本实施例研究了SSK1-NPs对AD小鼠的生物安全性。如图15A所述，对包括体重、组织病理学评估、血液和血清生化指标在内的毒理学参数进行了监测。与对照组相比，SSK1-NP处理后小鼠的大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏均未出现明显的组织病理学改变(图15B)。此外，使用SKK1-NPs治疗后，所检测的血液和血清生化值没有发生明显变化(图15C)。

总之，这些数据表明，在实验中使用的治疗浓度下，SSK1-NPs具有极佳的生物安全性。SSK1-NPs没有显示明显毒性的原因之一可能是，应用NPs运送SSK1大大降低了实现治疗反应所需的SSK1浓度(1毫克/千克)。相比之下，在大多数小鼠模型中，吉西他滨的治疗剂量为5mg/kg至25mg/kg，而最大耐受剂量(MTD)通常超过100mg/kg。此外，SSK1在正常组织中失活，而在高表达β-gal的衰老细胞中会选择性地转化为吉西他滨，从而进一步降低全身毒性。因此，研究表明，大量(100毫克/千克)频繁给药SSK1不会引起明显的生物安全问题。

最后，发现虽然大脑中的衰老细胞被消除了，但SSK1-NPs并没有明显干扰小鼠的大脑组织学和行为。因此，认为SSK1-NPs是一种安全的生物纳米药物，具有很大的临床开发潜力。

以上虽然以实施例为中心进行了说明，但这只是例示而已，并不限定本发明，本领域普通技术人员清楚，在不逸出本实施例的本质特性的范围内能够进行以上并未例示的各种变形和应用。例如，实施例中所具体示出的各构成要素能够经变形而实施。而且，与这种变形和应用相关的各种不同点应当解释为包括在所附的权利要求书中所规定的本发明的范围。

Claims (10)

1.一种负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备治疗和缓解阿尔茨海默病症状的药物上应用，其特征在于：

所述负载SSK1的神经递质衍生纳米载体通过SSK1、苯基硼酸季铵化的类脂质和NT类脂质混合后，经涡旋超声、透析后获得。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述NT类脂质与苯基硼酸季铵化的类脂质的质量比为3：7。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述SSK1的添加量为类脂质混合物总重量的10-100％。

4.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备特异性的清除衰老细胞的产品上应用。

5.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备清除经H₂O₂诱导衰老的细胞的产品上的应用。

6.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备诱导衰老细胞中p38的磷酸化的产品上的应用。

7.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备清除p21和Aβ蛋白的试剂上的应用。

8.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备改善和恢复AD患者认知能力的药物上的应用。

9.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备改善和恢复AD患者身体功能，生活质量的产品上的应用。

10.如权利要求1-3任一所述的负载SSK1的神经递质衍生纳米载体在制备检测衰老水平的试剂盒上的应用。