CN117607454A - 一种检测α-突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒及应用 - Google Patents
一种检测α-突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于免疫检测领域，提供了一种α‑突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒、其制备方法及应用。本发明通过采用Simoa技术对样品中α‑突触核蛋白寡聚体进行检测，获得了一种灵敏度高、可自动化上机检测、线性范围宽、样品所需量低的免疫检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测α-突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒及应用，属于免疫检测领域。
背景技术
随着大多数国家的人口预期寿命的增长，神经退行性疾病的发病率也越来越高。有研究表明，目前全球有超过5000万人受到神经退行性(dementia)疾病的影响，而这一数值在2050年可能上升到1.3亿。常见的神经退行性疾病有阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化。其中，阿尔兹海默症是最常见的神经退行性疾病，占所有痴呆病例的60-70％。其次是帕金森病，全球患病人数超过150万。
帕金森病是第二常见的神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗方法。α-突触核蛋白(α-syn)是一种与帕金森病(PD)发病机制相关的蛋白质。近年来的研究表明，错误折叠的α-突触核蛋白寡聚体是路易小体的主要成分，可以通过多种方式产生细胞毒性，包括线粒体功能障碍、内质网(ER)应激、蛋白质平衡丧失、突触损伤、细胞凋亡和神经炎症，进而导致PD的病理性改变。因此，检测血浆促进α-突触核蛋白形成能力或α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率有助于了解α-突触核蛋白在帕金森病人神经组织易于聚集的机体内在环境因素的改变。
现有对血液中α-突触核蛋白的测定方法主要是利用ELISA方法直接检测血浆或血清中α-突触核蛋白及寡聚体的含量。但是血浆和血清中的α-突触核蛋白寡聚体浓度相当低，目前大部分检测方法的灵敏度都不超过10.0pg/mL，因此需要高灵敏度的检测平台。
单分子免疫阵列(single molecule array，Simoa)技术采用经典的双抗夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)实现了极低含量的蛋白的定量检测。Simoa技术是基于微阵列芯片的单分子免疫检测技术。该技术最早作为封面文章发表在2010年的nature biotechnology上，其工作原理为血清、血浆、脑脊液或者尿液中的分析物，与带有捕获抗体的磁珠进行结合，抗原的另外一端与生物素标记的检测抗体结合，然后加上链霉素标记的β-半乳糖苷酶(SBG)，加上底物，酶可以催化底物生成荧光。将免疫复合物捕获并密封在一个含有超过20万个飞升级别小孔的芯片中反应，以实现单个分子的检测。由于Simoa技术大幅提升了检测的灵敏度，因此又被称为数字式ELISA，比传统ELISA方法灵敏度高出1000倍。
然而，目前采用Simoa技术的检测试剂盒都是针对α-突触核蛋白的，针对错误折叠的α-突触核蛋白寡聚体尚无基于Simoa技术的检测试剂盒。因此，本领域迫切需要开发一种基于Simoa技术的灵敏度高且准确性好的α-突触核蛋白寡聚体检测试剂盒。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，利用Simoa技术，可以在外周血中检测到低丰度的α-突触核蛋白寡聚体，从而改变了脑损伤和神经退行性疾病的检测方式，可以应用于对神经退行性疾病的诊断。
为此，本发明一方面提供了一种α-突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒，其包含：
捕获抗体包被的磁珠；
偶联有第一标记物的检测抗体；
偶联有第二标记物的β-半乳糖苷酶(SBG)；和/或
酶反应发光底物；
其中，第一标记物用于与第二标记物连接。
在本发明优选的实施方案中，所述试剂盒进一步包含：
α-突触核蛋白寡聚体标准品。
在本发明更加优选的实施方案中，所述试剂盒进一步包含：
质控样品。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述试剂盒进一步包含：
样品稀释液。
在本发明优选的实施方案中，捕获抗体为能与α-突触核蛋白特异性结合的抗体或能与α-突触核蛋白寡聚体特异性结合的抗体，检测抗体为能与α-突触核蛋白寡聚体特异性结合的抗体。
在本发明更加优选的实施方案中，捕获抗体和检测抗体为单克隆抗体。
在本发明进一步优选的实施方案中，捕获抗体为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1或抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A，检测抗体为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A、Oligomer-specific Syn33或MJFR-14-6-4-2。
在本发明最佳优选的实施方案中，捕获抗体为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1，检测抗体为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A。
在本发明优选的实施方案中，第一标记物为生物素或生物素衍生物。所述生物素衍生物为生物素与化学基团而结合形成，所述化学基团优选氨基(NH2)、活性酯(NHS)、二苯基环辛炔(DBCO)、叠氮化物(azide)、炔烃(alkyne)或聚乙二醇(PEG)中的任一种或多种。
在本发明更加优选的实施方案中，第一标记物为N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)或其衍生物。
在本发明进一步优选的实施方案中，第一标记物为NHS-PEG4-Biotin。
在本发明优选的实施方案中，第二标记物为亲和素。
在本发明更加优选的实施方案中，第二标记物选自卵白素、链霉素、卵黄素和类亲和素。
在本发明进一步优选的实施方案中，第二标记物为链霉素；
在本发明优选的实施方案中，酶反应发光底物包含邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)、氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷(CPRG)、荧光素二半乳糖苷(FDG)和吩噁嗪酮-β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)中的1种或多种。
在本发明更加优选的实施方案中，酶反应发光底物吩噁嗪酮-β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)。
在本发明优选的实施方案中，α-突触核蛋白寡聚体标准品包含1000pg/mL、250pg/mL、62.5pg/mL、16.0pg/mL、8.00pg/mL、4.00pg/mL、2.00pg/mL和1.00pg/mL 8个浓度点。
本发明另一方面提供了制备本发明所述的Simoa试剂盒的方法，其包括以下步骤：
1、捕获抗体包被的磁珠的制备；
2、偶联有第一标记物的检测抗体的制备；
3、偶联有第二标记物的β-半乳糖苷酶(SBG)溶液的配制；
其中，步骤1进一步包括：
A.清洗和置换捕获抗体溶液；
B.磁珠制备和活化；
C.捕获抗体与磁珠偶联；
D.封闭和清洗捕获抗体包被的磁珠；和/或，
步骤2进一步包括：
A.置换检测抗体的缓冲液；
B.偶联第一标记物与检测抗体；
C.纯化第一标记物偶联抗体。
在本发明优选的实施方案中，置换捕获抗体溶液前先测定捕获抗体的原液浓度，置换捕获抗体溶液后，将捕获抗体的浓度调整至0.1-0.3mg/mL，更加优选为0.2mg/mL。
在本发明优选的实施方案中，采用预冷的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，2-8℃，活化磁珠20-40分钟，更加优选30分钟。
在本发明优选的实施方案中，捕获抗体与磁珠在2-8℃偶联1-3小时，更加优选2小时。
在本发明优选的实施方案中，捕获抗体包被的磁珠室温封闭30-60分钟，更加优选45分钟。
在本发明优选的实施方案中，第一标记物与检测抗体的物质的量比例为30-50:1，更加优选为40:1，室温偶联20-40分钟，优选30分钟。
在本发明优选的实施方案中，使用前将捕获抗体包被的磁珠调整至1.5×107-2.5×107磁珠/mL，更加优选为2×107磁珠/mL，将生物素标记的检测抗体调整至0.5×10-3-1.5×10-3mg/mL，更加优选为1.0×10-3mg/mL，将SBG的浓度调整至0.10-0.30nM，更加优选为0.15nM。
在本发明优选的实施方案中，还包括以下步骤：
4、α-突触核蛋白寡聚体标准品的配制，
其中，α-突触核蛋白寡聚体标准品包含1000pg/mL、250pg/mL、62.5pg/mL、16.0pg/mL、8.00pg/mL、4.00pg/mL、2.00pg/mL和1.00pg/mL 8个浓度点。
本发明另一方面提供了本发明所述的Simoa试剂盒在制备神经退行性疾病检测产品中的应用。
在本发明优选的实施方案中，神经退行性疾病为阿尔兹海默症，帕金森病、亨廷顿病或多发性硬化。
在本发明更加优选的实施方案中，神经退行性疾病为帕金森病。
本发明再一方面提供了一种检测样品中α-突触核蛋白寡聚体的方法，其采用本发明所述的Simoa试剂盒。
在本发明优选的实施方案中，所述样品为血浆、血清、脑脊液或者尿液。
在本发明更加优选的实施方案中，所述样品为血浆或血清。
在本发明优选的实施方案中，所述检测在单分子免疫阵列分析仪上进行，捕获抗体包被的磁珠、样品和生物素标记的检测抗体的反应时间为30-40分钟，更加优选为35分钟，SBG的反应时间为2-10分钟，更加优选为5分钟。
在本发明优选的实施方案中，在检测之前还包括RGP在20-40℃下活化20-40分钟，优选在30℃下活化30分钟，和/或震荡混匀捕获抗体包被的磁珠。
本发明通过采用上述技术方案，获得了以下的有益效果：
1、灵敏度高：本发明的最低检测限可以达到1.0pg/mL。而现有的方法，包括在ELISA和MSD平台上建立的方法，它们的最低检测限大都在250pg/mL以上。
2、可自动化上机检测：本发明自动化完成稀释、混合、孵育以及结果读出，更能节省人力和时间，避免人工误差，准确性更高，可重复性好。
3、线性范围宽：本发明的检测范围为1.0-1000pg/mL，应用范围广泛。
4、需要样品量低：本发明仅需要5μL的样品即可实现上机检测。
附图说明
图1为本发明α-突触核蛋白寡聚体Simoa试剂盒的标准曲线图。
其中，横轴代表标准品的浓度值；
纵轴代表信号值；
AEB(Average Number Enzymes per Bead)代表每一个磁珠上结合的β-半乳糖苷酶的数量。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的磁珠、捕获抗体、标准品、检测抗体、生物素化试剂、β-半乳糖苷酶SBG、荧光底物RGP、磁珠偶联缓冲液(Bead Conjugation Buffer)、磁珠洗液(Bead Wash Buffer)、磁珠封闭液(Bead Blocking Buffer)、磁珠稀释液(BeadDiluent)、生物素化反应缓冲液(Biotinylation Reaction Buffer)、样品稀释液(SampleDiluent)以及链霉素标记β-半乳糖苷酶稀释液(SBG Diluent)等原始材料均可通过购买获得。其中，捕获抗体为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1(厂家：Abcam，货号：ab138501)，检测抗体为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A(厂家：Biolegend；货号：864902)。
实施例1：包被α-突触核蛋白寡聚体捕获抗体的磁珠的制备
1、清洗和置换捕获抗体溶液
置换前先测定捕获抗体的原液浓度，然后将所需体积的抗体(使抗体总质量～80μg)加入Amicon离心柱中，使用磁珠偶联缓冲液(Bead Conjugation Buffer)进行换液处理。处理完后，测定捕获抗体的浓度，调整至0.2mg/mL。
2、制备磁珠
转移4.2×108磁珠至1.5mL离心管中，使用磁珠洗液(BeadWash Buffer)清洗2次；使用磁珠偶联缓冲液(Bead Conjugation Buffer)清洗2次。
3、活化磁珠
加入预冷的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)至步骤2中制备的磁珠中，离心管放在HulaMixerTM样品混合器上，2-8℃，活化30分钟。
4、捕获抗体与磁珠偶联
磁珠活化完成后，加入磁珠偶联缓冲液(Bead Conjugation Buffer)清洗，清洗完成后放到磁力架上吸附，弃上清；加入步骤1中置换完成的捕获抗体；放在HulaMixerTM样品混合器，2-8℃孵育2小时。
其中，捕获抗体的反应浓度为0.1-0.2mg/mL，活化的磁珠的反应浓度为2.1×109/mL。
5、封闭包被有捕获抗体的磁珠
偶联完成后，先用磁珠洗液(Bead Wash Buffer)清洗2次，然后加入磁珠封闭液(BeadBlocking Buffer)，离心管放在HulaMixerTM样品混合器，室温孵育45分钟。
6、清洗包被有捕获抗体的磁珠
使用磁珠洗液(BeadWash Buffer)清洗1次，然后加入磁珠稀释液(Bead Diluent)清洗2次，最后储存在磁珠稀释液(Bead Diluent)中，即获得包被有α-突触核蛋白寡聚体捕获抗体的磁珠，于4℃存储备用，避光保存。
7、制备包被有α-突触核蛋白寡聚体捕获抗体的磁珠溶液
使用前，用磁珠稀释液(Bead Diluent)将步骤6制备的包被有捕获抗体的磁珠(4.2×108磁珠/mL)稀释至2×107磁珠/mL，待用。
实施例2：生物素标记的α-突触核蛋白寡聚体的检测抗体的制备
1、置换检测抗体的缓冲液
在吸附柱中加入所需体积的检测抗体(使抗体总量为130μg)，然后使用生物素化反应缓冲液(Biotinylation Reaction Buffer)进行缓冲液置换，以去除微量的甘油和叠氮化钠。
2、偶联生物素与检测抗体
按照生物素与检测抗体的物质的量比例为40:1加入NHS-PEG4-Biotin，旋涡混合，瞬时离心，室温孵育30分钟。
3、纯化生物素偶联抗体
将生物素偶联抗体转移到吸附柱，使用生物素化反应缓冲液(BiotinylationReaction Buffer)清洗5次，最后储存在生物素化反应缓冲液(Biotinylation ReactionBuffer)中，即获得生物素标记的α-突触核蛋白寡聚体，测定纯化后的检测抗体的浓度，于4℃存储备用，避光保存。
4、配制生物素标记的α-突触核蛋白寡聚体的检测抗体溶液
用样品稀释液(Sample Diluent)稀释步骤3制备的生物素偶联抗体，至到1.0×10-3mg/mL，待用。
实施例3：β-半乳糖苷酶SBG溶液和荧光底物RGP的配制
β-半乳糖苷酶SBG母液的浓度为50nM，使用β-半乳糖苷酶稀释液(SBG Diluent)将其调整至0.15nM，储存备用。
荧光底物为吩噁嗪酮-β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)，将荧光底物溶液的浓度调整为100-120μmol/L。
实施例4：标准品溶液以及质控样品溶液的配制
1、标准品溶液的配制
将已知浓度的α-突触核蛋白寡聚体标准品(厂家：Biolegend，货号：864902)用稀释液(Sample Diluent)稀释至1000pg/mL、250pg/mL、62.5pg/mL、16.0pg/mL、8.00pg/mL、4.00pg/mL、2.00pg/mL和1.00pg/mL，共8个浓度点作为拟合曲线的α-突触核蛋白寡聚体标准品溶液。
2、质控样品溶液的配制
用稀释液(Sample Diluent)将质控样品稀释至10.0pg/mL和100pg/mL，作为质控样品溶液。
实施例5：α-突触核蛋白寡聚体Simoa试剂盒的使用
1、在单分子免疫阵列分析仪(Quanterix HD-X仪器)上导入HD-X HomebrewAssayDefinition 1文件。设置实验条件：两步法，即捕获抗体包被的磁珠、样品(质控样品和待测样品)、生物素标记的检测抗体的反应时间为35分钟，β-半乳糖苷酶SBG反应时间5分钟；设置标准曲线浓度点为1000pg/mL、250pg/mL、62.5pg/mL、16.0pg/mL、8.00pg/mL、4.00pg/mL、2.00pg/mL和1.00pg/mL。
2、根据布板图在96孔板的合适的孔中每孔加入300μL的标准品溶液，和经过2倍稀释的300μL质控样品和待测样品。
3、活化荧光底物RGP，将荧光底物RGP置于摇板机，30℃恒温孵育30分钟，800转/分。
4、震荡混匀包被有α-突触核蛋白寡聚体捕获抗体的磁珠，至少涡旋30秒。
5、取下瓶盖，点击加载试剂，扫描，将准备好的试剂(捕获抗体包被的磁珠、生物素标记的检测抗体和β-半乳糖苷酶SBG溶液)装入试剂舱，将荧光底物RGP装入底物舱。
6、在Simoa软件中建立检测程序，在软件上设置标准曲线、质控样品以及待测样品的相关参数，将96孔板装到载物架指定位置。
7、运行试验，待实验结束，导出试验结果。
仪器自动拟合曲线和计算样本结果，参见附图1。
拟合方程为四参数Logistic曲线拟合方程，具体为：
y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D。
实施例6捕获抗体和检测抗体组合筛选
通过Simoa技术对α-突触核蛋白寡聚体进行特异性检测，关键在于设计能特异识别α-突触核蛋白寡聚体的抗体组合，以及具有较高的灵敏度。
为此，本发明筛选了不同的捕获抗体和检测抗体组合。
使用实施例1中的方法制备了2种不同捕获抗体包被的磁珠，分别是抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1(厂家：Abcam，货号：ab138501)和抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A(厂家：Biolegend；货号：864902)；
使用实施例2中的方法制备了3种生物素标记的不同抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体，分别是A17183A(厂家：Biolegend；货号：864902)、Oligomer-specific Syn33(厂家：Merck Millipore，货号：ABN2265M)和MJFR-14-6-4-2(厂家：Abcam,货号：ab214033)；
使用实施例3中的方法分别配制了β-半乳糖苷酶SBG溶液和荧光底物RGP溶液；
使用实施例4的方法配制了标准品溶液；
使用实施例5中的方法进行上机分析。
结果如表1所示，通过比较最低检测限(LOD)，定量下限(LLOQ)以及定量上限(ULOQ)等参数，确定最优抗体组合为：捕获抗体为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1(厂家：Abcam，货号：ab138501)，检测抗体为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A(厂家：Biolegend；货号：864902)。
表1不同抗体组合的α-突触核蛋白寡聚体检测抗体工作浓度的测试结果
实施例7生物样本检测
采用实施例5所述的使用方法，采用实施例6中最优抗体组合(捕获抗体为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1(厂家：Abcam，货号：ab138501)，检测抗体为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A(厂家：Biolegend；货号：864902))，对正常人样本和帕金森病人的阳性样本进行检测，检出率达到100％，结果如表2所示。
表2.α-突触核蛋白寡聚体试剂盒检测样本的效果
综上可知，本发明制备的α-突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒用于α-突触核蛋白寡聚体的数字化ELISA检测，具有以下的优势：
1、灵敏度高，本发明最低检测限为1.0～4.0pg/ml,而传统方法ELISA为250～20000pg/ml，灵敏度有了非常显著地提高；
2、全自动化，自动化完成稀释、混合、孵育以及结果读出；
3、线性范围广，检测动态范围大于4个数量级；
4、标准曲线线性好，四参数拟合曲线的拟合常数R2大于0.994；
5、高精度，复孔CV值低于10％。
因此，本发明的试剂盒能够准确且快速地检测出外周血中低丰度的α-突触核蛋白寡聚体，从而改变了脑损伤和神经退行性疾病的检测方式，为神经退行性疾病的诊断提供了技术支持。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种α-突触核蛋白寡聚体的Simoa试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
捕获抗体包被的磁珠；
偶联有第一标记物的检测抗体；
偶联有第二标记物的β-半乳糖苷酶(SBG)；和/或
酶反应发光底物。
2.根据权利要求1所述的Simoa试剂盒，其中，
捕获抗体为能与α-突触核蛋白或α-突触核蛋白寡聚体特异性结合的抗体，检测抗体为能与α-突触核蛋白寡聚体特异性结合的抗体，捕获抗体和检测抗体优选为单克隆抗体，捕获抗体优选为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1或抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A，检测抗体优选为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A、Oligomer-specificSyn33或MJFR-14-6-4-2，捕获抗体更加优选为抗α-突触核蛋白单克隆抗体MJFR1，检测抗体更加优选为抗α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体A17183A；
第一标记物为生物素或生物素衍生物，所述生物素衍生物为生物素与化学基团而结合形成，所述化学基团优选氨基(NH2)、活性酯(NHS)、二苯基环辛炔(DBCO)、叠氮化物(azide)、炔烃(alkyne)或聚乙二醇(PEG)中的任一种或多种，优选为N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-Biotin)或其衍生物，更加优选为NHS-PEG4-Biotin；
第二标记物为亲和素，优选选自卵白素、链霉素、卵黄素和类亲和素，更加优选为链霉素；
酶反应发光底物包含邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)、氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷(CPRG)、荧光素二半乳糖苷(FDG)和吩噁嗪酮-β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)中的1种或多种，优选为吩噁嗪酮-β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)。
3.制备权利要求1或2所述的Simoa试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)捕获抗体包被的磁珠的制备；
(2)偶联有第一标记物的检测抗体的制备；
(3)偶联有第二标记物的β-半乳糖苷酶(SBG)的配制；
其中，步骤(1)进一步包括：
A.清洗和置换捕获抗体溶液；
B.磁珠制备和活化；
C.捕获抗体与磁珠偶联；
D.封闭和清洗捕获抗体包被的磁珠；和/或，
步骤(2)进一步包括：
A.置换检测抗体的缓冲液；
B.偶联第一标记物与检测抗体；
C.纯化第一标记物偶联抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
置换捕获抗体溶液前先测定捕获抗体的原液浓度，置换捕获抗体溶液后，将捕获抗体的浓度调整至0.1-0.3mg/mL，优选为0.2mg/mL；
采用预冷的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，2-8℃，活化磁珠20-40分钟，优选30分钟；
捕获抗体与磁珠在2-8℃偶联1-3小时，优选2小时；
捕获抗体包被的磁珠室温封闭30-60分钟，优选45分钟；和/或
第一标记物与检测抗体的物质的量比例为30-50:1，优选为40:1，室温偶联20-40分钟，优选30分钟。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，
使用前将捕获抗体包被的磁珠调整至1.5×107-2.5×107磁珠/mL，优选为2×107磁珠/mL，将生物素标记的检测抗体调整至0.5×10-3-1.5×10-3mg/mL，优选为1.0×10-3mg/mL，将SBG的浓度调整至0.10-0.30nM，优选为0.15nM。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
(4)α-突触核蛋白寡聚体标准品的配制，
其中，α-突触核蛋白寡聚体标准品包含1000pg/mL、250pg/mL、62.5pg/mL、16.0pg/mL、8.00pg/mL、4.00pg/mL、2.00pg/mL和1.00pg/mL 8个浓度点。
7.权利要求1或2所述的Simoa试剂盒在制备神经退行性疾病检测产品中的应用，所述神经退行性疾病优选为阿尔兹海默症，帕金森病、亨廷顿病或多发性硬化，更加优选为帕金森病。
8.一种检测样品中α-突触核蛋白寡聚体的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的Simoa试剂盒，所述样品优选为血浆、血清、脑脊液或者尿液，更加优选为血浆或血清。
9.根据权利要求8所述的方法，所述检测在单分子免疫阵列分析仪上进行，捕获抗体包被的磁珠、样品和生物素标记的检测抗体的反应时间为30-40分钟，优选为35分钟，SBG的反应时间为2-10分钟，优选为5分钟。
10.根据权利要求8或9所述的方法，在检测之前还包括RGP在20-40℃下活化20-40分钟，优选在30℃下活化30分钟，和/或震荡混匀捕获抗体包被的磁珠。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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