CN117599214A - 一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物探针技术领域，涉及一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用。通过纳米沉淀法将磷脂‑聚乙二醇类化合物和NIR‑II区荧光探针IR1040制成IRNPs‑NH2纳米颗粒，IRNPs‑NH2纳米颗粒表面的氨基共价连接对磺酰胺苯甲酸、四价铂前药，形成靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs‑SBA/PtIV。该顺铂诊疗探针通过利用靶向碳酸酐酶及抑制碳酸酐酶活性的对磺酰胺苯甲酸基团与乏氧条件下细胞表面过表达的碳酸酐酶的强亲和力，可以增强顺铂诊疗探针在肿瘤细胞中的摄取，进一步改善肿瘤细胞的微酸性、乏氧微环境，这有利于抑制肿瘤细胞的迁移及克服顺铂化疗时的耐药性问题，并有效地杀死肿瘤细胞。

Description

一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物探针技术领域，涉及一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用。
背景技术
碳酸酐酶(CA)是细胞中的一类金属酶，在许多肿瘤细胞中过度表达，如胶质母细胞瘤、结直肠癌、乳腺癌、肾癌和胰腺癌等。CA参与缺氧和酸性肿瘤微环境的调节，已成为癌症诊断和治疗的重要靶点。因此，构建CA靶向药物应用于肿瘤成像和治疗意义重大。然而现有的CAs靶向治疗诊断药物的吸收和荧光并不在第二近红外窗口(NIR-II)区域，主要依赖于光动力治疗(PDT)，这可能会降低对深部和高度缺氧胰腺肿瘤成像和治疗的敏感性、有效性。
具有第二近红外窗口(NIR-II)吸收和荧光发射的光学活性纳米颗粒为癌症治疗诊断学提供了前景。与近红外第一窗口(NIR-I)的光相比，NIR-II区光具有组织散射低、组织穿透深度深和更高的激光最大许可照射剂量(MPE)的优点，这对于产生热量以改善肿瘤的光热治疗(PTT)至关重要。此外，与NIR-I荧光相比，NIR-II荧光可以增强穿透深度并减少背景信号，从而增强体内成像的信噪比(SBR)和灵敏度。由于肿瘤组织中存在缺氧和致密的基质肿瘤微环境(TME)，现有的NIR-II区光活性纳米剂在肿瘤治疗中的应用仍然具有挑战性。此外，将NIR-II光子和NIR-II光激发的纳米颗粒递送到深部肿瘤中效率不高，这在很大程度上降低了PTT对肿瘤的疗效。常用的高功率密度NIR-II光触发的肿瘤热疗，这可能对周围的正常组织造成损伤和炎症，从而引起不必要的副作用。目前为止，仍然缺乏能够有效进入肿瘤并以低功率NIR-II光激发实现较强PTT功效的高性能NIR-II光活性纳米颗粒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用。
发明思路：本发明将磷脂(DSPE-PEG2000-OCH3和DSPE-PEG2000-NH2)、NIR-II区荧光染料IR1040、对磺酰胺苯甲酸(SBA)及顺铂前药(PtIV-COOH)相结合，设计合成了具有如下特征的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV：首先，磷脂(DSPE-PEG2000-OCH3和DSPE-PEG2000-NH2)负载NIR-II区荧光染料IR1040，磷脂能够改善IR1040荧光分子的水溶性；接着磷脂表面的氨基可以共价连接特异性识别CA的对磺酰胺苯甲酸(SBA)和化疗顺铂前药PtIV-COOH。其中，(1)当SBA与细胞外CA的结合后，提高了IRNPs-SBA/PtIV在肿瘤部位的摄取，同时SBA能够抑制CA的活性，进一步改善肿瘤细胞的乏氧、微酸性环境以及抑制肿瘤细胞的迁移；(2)在低功率的NIR-II光激发下，产生的高光热转换效率可用于肿瘤的光热治疗，且IR1040荧光分子，能够产生NIR-II荧光用于NIR-II荧光成像，同时能够产生高效的光热转换效率用于光热治疗；(3)IRNPs-SBA/PtIV在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽(GSH)还原下，释放出二价顺铂原药用于活体内肿瘤的化疗。本发明制备的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV在NIR-II区荧光成像、制备抗肿瘤药物、制备肿瘤诊断成像造影剂中有很好的应用
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开了一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针，通过纳米沉淀法将磷脂-聚乙二醇类化合物和NIR-II区荧光探针IR1040制成IRNPs-NH2纳米颗粒，IRNPs-NH2纳米颗粒表面的氨基共价连接对磺酰胺苯甲酸、四价铂前药，形成靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针；
其中，
所述磷脂-聚乙二醇类化合物为DSPE-PEG2000-OCH3和DSPE-PEG2000-NH2；
所述NIR-II区荧光探针IR1040的结构式为：
所述四价铂前药为PtIV-COOH。
其中，通过纳米沉淀法将磷脂-聚乙二醇类化合物和NIR-II区荧光探针IR1040制成IRNPs-NH2纳米颗粒，荧光探针IR1040负载在磷脂-聚乙二醇类化合物中，顺铂诊疗探针中的NIR-II区荧光探针IR1040通过激光照射实现荧光成像，或通过激光照射将光能转化为热能实现对肿瘤细胞的光热治疗。
其中，所述碳酸酐酶为乏氧条件下Pan02细胞膜和/或Hela细胞膜表面的碳酸酐酶(CA)。
其中，所述四价铂前药，即PtIV-COOH的制备方法参考现有技术Chem.Sci.,2016,7,2864.
在一些实施例中，所述NIR-II区荧光探针IR1040由如下步骤制备得到：
1,8-萘内酰亚胺与5-氯戊炔在碘化钾的作用下进行取代反应，制得中间体1；中间体1与甲基格氏试剂在惰性气体保护、无水条件下进行格氏反应，格氏反应结束后加入碘化钾进行沉淀，制得中间体2；中间体2与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛在碱和酸酐的作用下进行偶联反应，即得NIR-II区荧光探针IR1040；
在一些实施例中，所述1,8-萘内酰亚胺与5-氯戊炔、碘化钾的摩尔比为1：1.0～2.0：3.0～4.5；所述取代反应，反应温度为120～150℃，反应时间为24～48h。
在一些实施例中，优选地，所述1,8-萘内酰亚胺与5-氯戊炔、碘化钾的摩尔比为1：1.5：3.7；所述取代反应，反应温度为140℃，反应时间为36h；其中，所述取代反应中所用的溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或丙酮，更优选为N,N-二甲基甲酰胺，溶剂的用量不限，将体系中的固体原料溶解且粘度适中即可。
在一些实施例中，所述甲基格氏试剂为甲基氯化镁；所述中间体1与甲基格氏试剂、碘化钾的摩尔比为1：3.5～5.5：1.5～3.5；所述格氏反应，反应温度为55～80℃，反应时间为1～2h；所述惰性气体为氮气。
在一些实施例中，优选地，所述甲基格氏试剂为甲基氯化镁；所述中间体1与甲基格氏试剂、碘化钾的摩尔比为1：4.5：2；所述格氏反应，反应温度为60℃，反应时间为1.5h；所述惰性气体为氮气；其中，所述甲基格氏试剂以溶液的形式存在，溶剂为无水四氢呋喃，甲基格氏试剂的浓度优选为3M；所述格氏反应中所用的溶剂优选为无水四氢呋喃，溶剂的用量不限，将体系中的固体原料溶解且粘度适中即可；所述格氏反应结束后需要加入盐酸中和未反应完全的甲基格氏试剂，所述中间体1与盐酸的摩尔比为1：8～12，优选为1：10，盐酸的存在形式为浓度为1mol/L的盐酸水溶液。
在一些实施例中，所述碱为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺；所述酸酐为乙酸酐；所述中间体2与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛的摩尔比为1～2.5：1；所述中间体2与碱、酸酐的摩尔体积比为0.65mmol：0.4～0.6mL：0.4～0.6mL；所述偶联反应，反应温度为50～70℃，反应时间为20～60min。
在一些实施例中，优选地，所述碱为三乙胺；所述酸酐为乙酸酐；所述中间体2与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛的摩尔比为1.3：1；所述中间体2与碱、酸酐的摩尔体积比为0.65mmol：0.5mL：0.5mL；所述偶联反应，反应温度为60℃，反应时间为30min；其中，所述偶联反应中所用的溶剂优选为乙酸，溶剂的用量不限，将体系中的固体原料溶解且粘度适中即可。
在一些实施例中，所述顺铂诊疗探针表面的对磺酰胺苯甲酸基团能够靶向肿瘤细胞表面高表达的碳酸酐酶，抑制碳酸酐酶的活性，从而缓解肿瘤细胞的乏氧环境、降低细胞外pH和抑制肿瘤细胞迁移；所述顺铂诊疗探针在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽还原下释放出二价铂原药，实现对肿瘤细胞的化疗；其中，所述二价铂原药为顺铂。
其中，肿瘤细胞乏氧环境的缓解促进了活性氧物种产生。
在一些实施例中，所述顺铂诊疗探针中的NIR-II区荧光探针IR1040通过第一激光照射实现荧光成像；其中，所述第一激光照射的波长为980nm或1064nm。
在一些实施例中，所述顺铂诊疗探针中的NIR-II区荧光探针IR1040通过第二激光照射将光能转化为热能，实现对肿瘤细胞的光热治疗；其中，所述第二激光照射，波长为1064nm，功率密度为0.5W·cm-2，照射时间为3～10min。
进一步地，本发明公开了上述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将IR1040储备溶液与DSPE-PEG2000-OCH3、DSPE-PEG2000-NH2、第一溶剂混合后加入到去离子水中，加入过程中超声，超声结束后将反应液洗涤、离心浓缩后，加入PBS缓冲液，得到含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液；
(2)将4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐混合，在-10～0℃下反应10～20分钟，得到第一混合液；将第一混合液与步骤(1)得到的含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液混合，加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌4～8小时，反应结束后将反应液离心浓缩后，加入PBS缓冲液，得到含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液；
(3)将顺铂前药储备溶液与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐混合，在-10～0℃下反应10～20分钟，得到第二混合液；将第二混合液与步骤(2)得到的含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液混合，加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌4～8小时，反应结束后将反应液离心浓缩后，加入PBS缓冲液，得到含有IR1040的IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒储备液，即靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针。
在一些实施例中，所述第一溶剂为四氢呋喃或乙醇；所述IR1040储备溶液中的溶剂为二甲基亚砜；所述IR1040储备溶液中的IR1040与DSPE-PEG2000-OCH3、DSPE-PEG2000-NH2的摩尔质量比为0.27μmol：8mg：2mg；所述DSPE-PEG2000-NH2与第一溶剂的质量体积比为2mg：0.5～1.5mL；所述第一溶剂与去离子水的体积比为0.5～1.5：8～10；所述超声，超声温度为室温，超声功率为40KHz，超声时间为10～15min；所述PBS缓冲液，1×，pH 7.4；所述含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，溶液中4-氨基磺酰基苯甲酸的溶度为1mg·mL-1；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的4-氨基磺酰基苯甲酸与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.05：0.8～1.0：9.0～10.0；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的4-氨基磺酰基苯甲酸与DSPE-PEG2000-NH2的质量比为0.05：2；所述含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L；所述顺铂前药储备溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，溶液中顺铂前药的浓度为1mg·mL-1；所述顺铂前药储备溶液中顺铂前药与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.05：0.8～1.0：9.0～10.0；所述顺铂前药储备溶液中顺铂前药与DSPE-PEG2000-NH2的质量比为0.05：2；所述含有IR1040的IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L。
在一些实施例中，优选地，在一些实施例中，所述第一溶剂为四氢呋喃；所述IR1040储备溶液中的溶剂为二甲基亚砜，进一步优选地，IR1040储备溶液中IR1040的浓度为50mmol/L；所述IR1040储备溶液中的IR1040与DSPE-PEG2000-OCH3、DSPE-PEG2000-NH2的摩尔质量比为0.27μmol：8mg：2mg；所述DSPE-PEG2000-NH2与第一溶剂的质量体积比为2mg：1mL；所述第一溶剂与去离子水的体积比为1：9；所述超声，超声温度为室温，超声功率为40KHz，超声时间为10min；所述PBS缓冲液，1×，pH 7.4；所述含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，溶液中4-氨基磺酰基苯甲酸的溶度为1mg·mL-1；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的4-氨基磺酰基苯甲酸与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.05：0.9：9.6；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的4-氨基磺酰基苯甲酸与DSPE-PEG2000-NH2的质量比为0.05：2；所述含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L；所述顺铂前药储备溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，溶液中顺铂前药的浓度为1mg·mL-1；所述顺铂前药储备溶液中顺铂前药与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.05：0.9：9.6；所述顺铂前药储备溶液中顺铂前药与DSPE-PEG2000-NH2的质量比为0.05：2；所述含有IR1040的IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L。
上述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述肿瘤为宫颈癌肿瘤或胰腺癌肿瘤，优选为胰腺癌肿瘤。
上述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤光热治疗和/或化疗药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述肿瘤为宫颈癌肿瘤或胰腺癌肿瘤，优选为胰腺癌肿瘤。
上述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述肿瘤为宫颈癌肿瘤或胰腺癌肿瘤，优选为胰腺癌肿瘤。
上述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤NIR-II区成像造影剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述肿瘤为宫颈癌肿瘤或胰腺癌肿瘤，优选为胰腺癌肿瘤。
上述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤NIR-II区荧光成像/光热成像造影剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述肿瘤为宫颈癌肿瘤或胰腺癌肿瘤，优选为胰腺癌肿瘤。
其中，本发明中所述“乏氧”、“常氧”条件，如无特殊说明，乏氧条件下含有1％v/vO2，常氧条件下含有20％v/v O2。
有益效果：
(1)本发明中，以NIR-II区光可激发的IR1040、CA靶向和临床一线化疗类抗癌药物顺铂前药为基础，设计并制备了CA靶向的NIR-II区顺铂诊疗纳米颗粒IRNPs-SBA/PtIV用于对胰腺癌的NIR-II区荧光成像指导下的PTT和化疗联合治疗。
(2)在本发明中，通过利用靶向CA及抑制CA活性的对磺酰胺苯甲酸基团(SBA)与乏氧条件下细胞表面过表达的碳酸酐酶(CA)的强亲和力，可以增强IRNPs-SBA/PtIV在肿瘤细胞中的摄取和IRNPs-SBA/PtIV在GSH还原下Pt(II)的释放。IRNPs-SBA/PtIV上的SBA在靶向乏氧肿瘤细胞表面过表达CA的同时，能够显著抑制CA的活性，进一步改善肿瘤细胞的微酸性、乏氧微环境，这有利于抑制肿瘤细胞的迁移及克服后续顺铂化疗时所面临的耐药性问题。
(3)与现有技术中小分子顺铂或预先制备的Pt(IV)纳米颗粒相比，本发明中将顺铂前药共价连接在IRNPs-SBA上，由于在肿瘤部位的高摄取，提高了在皮下胰腺癌肿瘤模型的治疗中显著的化疗作用。同时，顺铂前药需要在肿瘤部位高表达的GSH还原下才会释放出具有化疗效果的PtII，降低了对正常组织的毒副作用。
(4)与现有技术中靶向肿瘤处高表达生物标志物的纳米颗粒相比，本发明中诊疗探针具有靶向乏氧肿瘤表面高表达CA的SBA，在特异性靶向肿瘤的同时，能够明显抑制CA的活性，从而引起乏氧肿瘤微环境的改善，有利于肿瘤的高效治疗。
(5)与现有技术中光热治疗与化疗的联合治疗相比，本发明中在低功率激光照射下(0.5W/cm2)就能实现高效的光热转换效率(65.17％)，同时化疗前药的给药剂量(2.0mg/kg Pt)也低于现有技术中的化疗药物剂量。
(6)本发明中通过利用NIR-II区荧光成像，可以实现胰腺深部位的成像，克服了其它现有技术中的纳米颗粒对深组织穿透深度的病变组织成像时所面临的问题。本发明中提供的酶靶向诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV能够实现NIR-II荧光成像、光热成像，从而可以对乏氧肿瘤细胞进行高灵敏度和高穿透深度的检测及成像。并且通过利用抑制CA活性、低功率照射产生的PTT及GSH还原的顺铂化疗药物，从而实现对肿瘤区域NIR-II区荧光成像信号引导的“可视化”肿瘤治疗，进一步迅速有效地杀死肿瘤细胞。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为NIR-II区染料IR1040的合成路线图。
图2为实施例1制备的中间体1的核磁氢谱图。
图3为实施例1制备的中间体1的核磁碳谱图。
图4为实施例1制备的中间体1的高分辨质谱图。
图5为实施例1制备的中间体2的高分辨质谱。
图6为实施例制备的NIR-II区荧光探针IR1040的核磁氢谱图。
图7为实施例制备的NIR-II区荧光探针IR1040的核磁碳谱图。
图8为实施例制备的NIR-II区荧光探针IR1040的Maldi-TOF谱。
图9为碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的设计及其作用机理图；其中，图9a为制备图，图9b为作用机理图，图9c为IR1040、PtIV-COOH、SBA、顺铂的化学结构和CA的卡通示意图。
图10为碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的TEM图、DLS分析和吸收/荧光光谱图；其中，图10a为TEM图，图10b为DLS分析图，图10c为吸收/荧光光谱图。
图11为碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的光热性能评估图。
图12为碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV与hCA I的结合常数及Pt释放的能力评估；其中，图12a为结合常数，图12b为Pt释放的能力评估。
图13为酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的NIR-II区荧光显微镜成像及细胞摄取能力数据图；其中，图13a为指定的探针在乏氧或常氧下孵育Pan02细胞后的NIR-II FLI；图13b为对照组、IRNPs-PtIV和IRNPs-SBA/PtIV孵育后细胞团的NIR-II FLI；图13c为对照组、IRNPs-PtIV和IRNPs-SBA/PtIV孵育后细胞团的NIR-II FLI对应的量化荧光信号；图13d为顺铂、IRNPs-PtIV和IRNPs-SBA/PtIV(20μM)分别在乏氧或氧下处理Pan02细胞后的细胞摄取情况。
图14为不同条件下纳米探针对Pan02细胞外环境pH值的影响及对Pan02细胞中HIF-1α表达的影响；其中，图14a为对pH值的影响，图14b为对HIF-1α表达的影响。
图15为乏氧下用指定探针处理Pan02细胞后产生ROS能力评估及其流式细胞分析；其中，图15a为ROS能力评估，图15b为流式细胞分析。
图16为乏氧下Pan02细胞的划痕实验。
图17为指定探针孵育Pan02细胞后的细胞存活率评估数据图；其中，I:IRNPs-SBA(Normoxia)；II:IRNPs-SBA+laser(Normoxia)；III:IRNPs-SBA+laser(Hypoxia)；IV:CisPt(Hypoxia)；V:IRNPs-SBA/PtIV+laser(Normoxia)；VI:IRNPs-SBA/PtIV+laser(Hypoxia)。
图18为乏氧下指定探针处理Pan02细胞后的细胞凋亡流式分析；其中，I：PBS；II：laser；III：IRNPs-SBA/PtIV；IV：IRNPs-SBA/PtIV+laser。
图19为小鼠皮下胰腺肿瘤模型在尾静脉注射指定探针后不同时间点的NIR-IIFLI及对应的荧光信号和信背比、以及肿瘤切片的NIR-II荧光显微镜成像。
图20为尾静脉注射IRNPs-SBA/PtIV后离体不同器官的NIR-II FLI及不同器官的摄取情况；其中，图20a为离体不同器官的NIR-II FLI，图20b为不同器官的摄取情况；其中，器官包括心脏(H)、肝脏(Li)、脾脏(Sp)、肺脏(Lu)、肾脏(Ki)和肿瘤(T)。
图21为尾静脉注射指定探针24h后1064nm激光照射的IR热成像和小鼠肿瘤处温度的变化曲线；其中，图21a为IR热成像，图21b为肿瘤处温度的变化曲线。
图22为肿瘤组织切片的CA IX表达、用哌莫硝唑(HP6)抗体和HIF-1α抗体的免疫荧光染色图；其中，I：saline；II：IRNPs-OCH3；III：IRNPs-SBA/PtIV，Scale bar:50μm。
图23为酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对肿瘤的PTT和化疗联合治疗数据图；其中，图23a为小鼠Pan02肿瘤治疗示意图，图23b为小鼠在治疗前(第0天)和治疗后(第21天)的照片，图23c为治疗期间小鼠的肿瘤体积变化，图23d为小鼠体重变化，图23e为Pan02肿瘤切片的H&E和TUNEL染色图；其中，I:saline；II:saline+laser；III:IRNPs-SBA/PtIV；IV:IRNPs-OCH3+laser；V:IRNPs-SBA+laser；VI:IRNPs-SBA/PtIV+laser；VII:IRNPs-SBA/PtIV+laser+IRNPs-SBA/PtIV(2doses)at 24h.Laser:1064nm,0.5W cm-2,10min。Scalebar:50μm。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下实施例中涉及到的小鼠胰腺癌Pan02细胞购自中国科学院上海干细胞研究所，并在DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)培养基中培养。培养基中添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)，每毫升培养基加入100单位青霉素和100单位链霉素。所有细胞均在37℃的湿润环境(5％ CO2)中培养。
下述实施例中所述“乏氧和常氧”条件，如无特殊说明，为乏氧(1％v/v O2)(Hypoxia)和常氧(20％v/v O2)(Normoxia)。
本发明中设计的碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的设计及其作用机理如图9所示。碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV通过纳米沉淀法和两步缩合反应制得。具体为将磷脂-聚乙二醇类化合物和制备的NIR-II区荧光探针IR1040通过纳米沉淀的方法先制成IRNPs-NH2，然后依次通过缩合反应将对磺酰胺苯甲酸和四价铂前药与IRNPs-NH2表面的NH2共价连接依次制成IRNPs-SBA和IRNPs-SBA/PtIV。当IRNPs-SBA/PtIV进入活体后，由于其表面的SBA和乏氧肿瘤细胞表面高表达的CA之间强烈的相互作用，IRNPs-SBA/PtIV能够选择性地靶向乏氧肿瘤细胞，提高其在肿瘤细胞上的富集。同时IRNPs-SBA/PtIV上的SBA与CA作用后，能够显著抑制CA的活性，进一步改善乏氧肿瘤细胞的微酸性环境和乏氧微环境。其中，肿瘤细胞的乏氧微环境改善有利于克服化疗过程中化疗药物的耐药性。当IRNPs-SBA/PtIV内吞到肿瘤细胞内后，一方面，在1064nm激光器的照射下，在实现NIR-II区荧光成像的同时，可以实施NIR-II区的光热治疗。另一方面，肿瘤细胞内高表达的GSH能够将Pt(IV)前药还原为具有化疗效果的Pt(II)。因此，NIR-II区光热治疗和Pt(II)化疗的联合治疗能够实现肿瘤细胞显著的治疗效果。
实施例1
1、NIR-II区荧光探针IR1040的合成
IR1040的合成路线如图1所示，具体合成步骤如下所示：
(a)中间体1的制备：
将1,8-萘内酰亚胺(1.0g，5.92mmol)和5-氯戊炔(0.906g，8.88mmol)溶解在20mLDMF溶液中，加入KI(3.66g，22mmol)，得到混合物，将混合物在140℃下进行取代反应回流36小时。反应结束后，将反应液过滤，滤液用乙酸乙酯(EA)萃取，并用无水硫酸钠干燥有机相，干燥的有机相在真空下除去溶剂后，用PE/EA(体积比10/1)的洗脱液通过硅胶快速色谱纯化残留物，得到中间体1(560mg，产率40％)，浅黄色固体。中间体1的核磁氢谱图如图2所示，核磁碳谱图如图3所示，高分辨质谱图如图4所示，[M+H]+Found 236.1062。
(b)中间体2的制备：
将中间体1(118mg，0.5mmol，步骤(a)制备得到)溶解在2mL无水THF溶液中，在N2保护下滴加0.75mL甲基氯化镁四氢呋喃溶液(浓度为3M，含有甲基氯化镁2.25mmol)，在N2保护、60℃下进行格氏反应1.5小时，反应结束后，反应液冷却至室温，并向反应液中滴加5mL盐酸水溶液(浓度为1M，含有盐酸5mmol)搅拌后处理，随后将反应液用旋转蒸发仪除去THF后，加入1mL的KI水溶液(浓度为1M，含有KI 1mmol)进行沉淀，过滤，得到红色沉淀，即中间体2。中间体2的高分辨质谱如图5所示，[M-I]+Found 234.1271。
(c)荧光探针IR1040的制备：
将中间体2(234.32mg，0.65mmol)和2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛(86.0mg，0.5mmol)溶解在1mL乙酸中，加入0.5mL三乙胺和0.5mL乙酸酐溶液，在60℃下进行偶联反应30分钟。反应结束后，将反应液冷却至室温，加入10mL乙酸乙酯，用EtOH重结晶并过滤，固体粗品经HPLC纯化，得到荧光探针IR1040(259.21mg，71％产率)，深绿色固体。NIR-II区荧光探针IR1040的核磁氢谱图如图6所示，核磁碳谱图如图7所示，Maldi-TOF谱如图8所示。
2、四价铂前药PtIV-COOH的制备
四价铂前药PtIV-COOH的制备具体合成步骤参见现有技术Chem.Sci.,2016,7,2864.
3、诊疗探针的制备
3.1、IRNPs-OCH3纳米颗粒的制备
将5.4μL IR1040的DMSO储备溶液(50mM)与DSPE-PEG2000-OCH3(10mg)溶于1mL四氢呋喃(THF)中形成澄清溶液，然后在超声处理(超声温度为室温，超声功率为40KHz)下快速注入9mL去离子水中，超声10min。将所得水溶液用去离子水洗涤三次，用10KDa超滤管在4,000r.p.m离心下进一步浓缩15分钟。浓缩结束后加入1mL PBS缓冲液(1×，pH 7.4)以获得含有IR1040的IRNPs-OCH3储备溶液，储备溶液IR1040的浓度约为540μM，记为IRNPs-OCH3纳米颗粒。
3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备
本实施例“1”、“2”项下分别制备的IR1040和四价铂前药PtIV-COOH用于本步骤。
(1)IRNPs-NH2纳米颗粒的制备：
将5.4μL IR1040的DMSO储备溶液(50mM)与DSPE-PEG2000-OCH3(8mg)及DSPE-PEG2000-NH2(2mg)溶于1mL四氢呋喃(THF)中形成澄清溶液，然后在超声处理(超声温度为室温，超声功率为40KHz)下快速注入9mL去离子水中，超声10min。将所得水溶液用去离子水洗涤三次，用10KDa超滤管在4,000r.p.m离心下进一步浓缩15分钟。浓缩结束后加入1mL PBS缓冲液(1×，pH 7.4)以获得含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液，IR1040的浓度约为540μM，记为IRNPs-NH2纳米颗粒。
(2)IRNPs-SBA纳米颗粒的制备：
向50μL浓度为1mg·mL-1的4-氨基磺酰基苯甲酸(SBA)的DMF溶液中加入0.9mg O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，先在0℃下反应10分钟，得到第一混合液；然后将第一混合液加入步骤(1)制备的IRNPs-NH2纳米颗粒储备溶液(IRNPs-NH2纳米颗粒储备溶液中IR1040的浓度为540μM)中，再加入13μL的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，在室温下搅拌4小时，使IRNPs-NH2纳米颗粒中的NH2基团与SBA发生缩合反应。反应结束后，用10KDa超滤管离心去除未反应的SBA、DIPEA和HBTU后，浓缩结束后加入PBS缓冲液(1×，pH 7.4)得到IRNPs-SBA纳米颗粒储备液，储备液中IR1040浓度为540μM，记为IRNPs-SBA纳米颗粒。
(3)顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒的制备：
向50μL浓度为1mg·mL-1顺铂前药(PtIV-COOH)的DMF溶液中加入0.9mg HBTU，先在0℃下反应10分钟，得到第二混合液；然后将第二混合液加入步骤(2)制备的IRNPs-SBA纳米颗粒(IR1040浓度为540μM)，加入13μL的DIPEA，在室温下搅拌4小时，使IRNPs-SBA中游离的NH2基团与PtIV-COOH发生缩合反应。反应结束后，用10KDa超滤管离心去除未反应的PtIV-COOH、DIPEA和HBTU后，浓缩结束后加入PBS缓冲液(1×，pH 7.4)得到IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒储备液，储备液中IR1040浓度为540μM，记为IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒。
3.3、IRNPs-PtIV纳米颗粒的制备
向50μL浓度为1mg·mL-1顺铂前药(PtIV-COOH，本实施例“2”项制备)的DMF溶液中加入0.9mg HBTU，先在0℃下反应10分钟，得到混合液；然后将混合液加入制备的IRNPs-NH2纳米颗粒(IR1040浓度为540μM)(本实施例“3.2”项下步骤(2)中制备的IRNPs-NH2纳米颗粒)，再加入13μL的DIPEA，在室温下搅拌4小时，使IRNPs-NH2中的NH2基团与PtIV-COOH发生缩合反应。反应结束后，用10KDa超滤管去除未反应的PtIV-COOH、DIPEA和HBTU后，浓缩结束后加入PBS缓冲液(1×，pH 7.4)得到IRNPs-PtIV纳米颗粒储备液，储备液中IR1040浓度为540μM，记为IRNPs-PtIV纳米颗粒。
3.4、IR1048 NPs-SBA/PtIV纳米颗粒的制备
制备方法同本实施例中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下的制备方法，不同的是，将IR1040替换为IR1048，最终制得IR1048 NPs-SBA/PtIV纳米颗粒；其中，IR1048商业可购买，CAS号155613-98-2。
实施例2
本实施例中对碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV(实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下制备得到)进行了表征、探讨了其光学性质、光热性能评估、与CA的结合常数测定以及Pt的释放能力。
本实施例所用的IRNPs-SBA/PtIV由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下制备得到；本实施例使用的IR1048 NPs-SBA/PtIV由实施例1中“3.4、IR1048 NPs-SBA/PtIV纳米颗粒的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-SBA由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下的步骤(2)制备得到；所用的IRNPs-PtIV由实施例1中“3.3、IRNPs-PtIV纳米颗粒的制备”项下制备得到。并根据实验需要，使用PBS缓冲液(1×，pH 7.4)稀释至不同的浓度(基于IR1040的浓度)。
1、碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的表征和光学性质评估
(1)如图10a所示，透射电子显微镜(Transmission electron microscopy，TEM)图像表明，IRNPs-SBA/PtIV以球形存在。
(2)如图10b所示，动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)分析表明，IRNPs-SBA/PtIV在PBS缓冲液(pH＝7.4)中的水合平均粒径为62.1±1.2nm。
(3)本实施例为了评估IRNPs-SBA/PtIV的光学性质，将540μM(基于IR1040的浓度)的IRNPs-SBA/PtIV添加PBS缓冲液(1×，pH 7.4)稀释成20μM，测试其光谱性质。如图10c所示，由于IR1040的存在，IRNPs-SBA/PtIV在PBS缓冲液中显示蓝色，最大吸收和发射波长为1036和1060nm，在980nm光激发下发出明显的NIR-II荧光。
2、碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的光热性能评估
本实施例对IRNPs-SBA/PtIV在1064nm激发下的光热性能进行了测试。
(1)将540μM(基于IR1040的浓度)的IRNPs-SBA/PtIV添加PBS缓冲液(1×，pH 7.4)分别稀释成5μM、10μM、20μM和30μM，然后用功率密度为1.0W·cm-2的1064nm激光器照射不同浓度的IRNPs-SBA/PtIV的PBS溶液。结果如图11a所示，IRNPs-SBA/PtIV的PBS溶液温度随着IRNPs-SBA/PtIV浓度的增加而升高。在IRNPs-SBA/PtIV的浓度为30μM时，照射10min后，温度从25.2℃逐渐升至83.8℃。
(2)进一步保持IRNPs-SBA/PtIV的浓度为30μM，用不同功率的1064nm激光器(0.2、0.3、0.4、0.5W·cm-2)照射IRNPs-SBA/PtIV PBS溶液，如图11b所示，IRNPs-SBA/PtIV的PBS溶液温度随着激光功率密度的增加而升高。在0.5W/cm2功率密度的1064nm激光器连续照射10分钟后，温度从25.2℃逐渐升至54.3℃。
(3)如图11c所示，在功率密度为0.5W·cm-2、1064nm的激光照射下，IRNPs-SBA/PtIV(30μM，基于IR1040的浓度)的光热转换效率(PCE)为65.17％，优于IR1048 NPs-SBA/PtIV(IR1048NPs-SBA/PtIV的浓度为30μM(基于IR1048的浓度))的PCE(21.47％)，这可能是因为IR1040的摩尔消光系数比商用IR1048的高所引起的。
(4)如图11d所示，在功率密度为0.5W·cm-2、1064nm的激光照射下，IRNPs-SBA/PtIV(30μM，基于IR1040的浓度)表现出良好的光热稳定性，在70min内光照产热可循环6次，产热最高温度基本保持不变。
上述的实验结果证实了IRNPs-SBA/PtIV表现出优异的光热性能，在体外和体内的PTT过程中具有一定的潜能。
3、碳酸酐酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV与hCA I结合能力及Pt释放能力的评估
(1)本实施例进一步探索了IRNPs-SBA/PtIV和CA之间亲和力。以丹酰胺(DNSA，一种基于磺酰胺的CA抑制剂)为人碳酸酐酶(hCA I)的靶标，首先与hCA I活性位点结合，结合后在458nm处表现出增强的荧光，对应的Kd值为1.32±0.35μM。然后分别用IRNPs-SBA/PtIV、IRNPs-SBA、SBA和IRNPs-PtIV滴定hCA I·DNSA溶液进行竞争实验，并计算对应的表观Kd值。Kd值通过以下公式来计算：
Ftotal：总荧光强度；Fobs：观察到的荧光强度；Fini：没有DNSA时的荧光强度；Fend：达到饱和时的荧光强度；
以及，
Ftotal：总荧光强度；Fobs：观察到的荧光强度；Fini：没有DNSA时的荧光强度；Fend：达到饱和时的荧光强度；Kprobe：指定探针的解离常数；KDNSA：DNSA的解离常数。
分析结果如图12a所示，与未连接SBA的IRNPs-PtIV相比，IRNPs-SBA/PtIV、IRNPs-SBA、SBA分别与hCA I的结合产生相似的Kd′值，分别为14.40±5.49nM、11.64±1.41nM、14.11±1.41nM。IRNPs-SBA/PtIV、IRNPs-SBA、SBA与CA这种高效的结合能力有利于它们在肿瘤细胞的特异性摄取。
(2)本实施例中为了评估Pt药物的释放能力，将IRNPs-SBA/PtIV(65μM，基于IR1040的浓度)分为三组：(1)不作任何处理组；(2)37℃下用GSH(10mM)处理组(IRNPs-SBA/PtIV中加入GSH，终浓度为10mM)；(3)先用功率密度为0.5W·cm-2的1064nm激光器照射5min后，再在37℃下用GSH(终浓度10mM)处理组。用ICP分别测定在处理0h、0.5h、1h、2h、4h、5h时Pt的释放量。
分析结果如图12b所示，IRNPs-SBA/PtIV在GSH存在下能够有效释放Pt药物。5h时，Pt累积释放量达到近92.98％。然而，在没有GSH存在和没有激光照射下，5小时内释放很少量的Pt药物(6.07％)。此外，在激光照射加GSH的共同作用下，Pt释放率高达98.02％，这可能是因为激光照射产生的热量促进了还原反应的动力学过程，有利于Pt释放。因此，NIR-II区可激发IRNPs-SBA/PtIV表现出良好的稳定性、高PCE、与hCA I的高结合力，在GSH和1064nm激光照射下快速释放Pt，能够进行更深入的体外和体内研究。
实施例3
本实施例中考察了酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对乏氧条件下CA过表达的肿瘤细胞的NIR-II区荧光显微镜成像、摄取能力、乏氧和微酸性环境的改善、产生ROS的能力及细胞迁移能力。
本实施例所用的IRNPs-SBA/PtIV由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-PtIV由实施例1中“3.3、IRNPs-PtIV纳米颗粒的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-OCH3由实施例1中“3.1、IRNPs-OCH3纳米颗粒的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-SBA由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下的步骤(2)制备得到。并根据实验需要，使用PBS缓冲液(1×，pH7.4)稀释至不同的浓度(基于IR1040的浓度)。
1、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的NIR-II区荧光显微镜成像及细胞摄取能力
本实施例中为了证明纳米探针对肿瘤细胞中CA的响应灵敏度，将Pan02细胞(约5×104)接种到玻璃底皿(In Vitro Scientific，D35-20-1-N)，并允许其过夜生长。空白对照组不加探针。在无FBS的DMEM中分别加入IRNPs-SBA/PtIV、IRNPs-PtIV、IRNPs-SBA/PtIV+SBA、IRNPs-OCH3四种探针(IR1040的浓度均为20μM)，分别在乏氧或常氧下，在37℃下孵育3小时。结果表明，与其它对照实验组相比，乏氧下IRNPs-SBA/PtIV孵育的细胞NIR-II荧光信号最强(图13a)，这是因为乏氧下肿瘤细胞表面CA高表达，IRNPs-SBA/PtIV上的SBA能够与CA特异性结合。而且，指定探针在乏氧或常氧下孵育细胞后收集的Pan02细胞团的NIR-II FLI也进一步证实了这一点(图13b和图13c)。此外，通过电感耦合等离子体质谱(ICP-OES)测定了乏氧或常氧下肿瘤细胞内的Pt摄取。Pan02细胞分别用CisPt、IRNPs-PtIV和IRNPs-SBA/PtIV(以Pt计，浓度为20μM)处理。分别在乏氧或常氧下，在37℃下孵育3小时。数据分析显示，与IRNPs-PtIV和顺铂相比，IRNPs-SBA/PtIV在乏氧下的细胞摄取分别提高了约2.6倍和12倍(图13d)。
2、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对Pan02细胞微酸性和乏氧微环境的改善效果评估
本实施例中研究了IRNPs-SBA/PtIV是否可以抑制CA活性，从而调节乏氧Pan02细胞中的肿瘤微环境。为了避免由Pt药物引起的细胞死亡，进一步改变肿瘤微环境及减缓肿瘤细胞的迁移，本实施例中用IRNPs-SBA代替IRNPs-SBA/PtIV来孵育乏氧Pan02细胞。
首先测量了细胞外pH值(pHe)。将Pan02细胞(约1×105)接种在24孔板中。并允许其过夜生长。移除DMEM培养基，PBS(1×，pH 7.4)清洗后，分别加入含PBS、IRNPs-OCH3、IRNPs-SBA(IR1040的浓度均为20μM)和SBA(SBA的浓度为20μM)的培养基，并在常氧或乏氧环境中，在37℃下孵育24小时。在每个实验的开始和结束时，将pH探针插入培养基中以测量细胞外pH值。分析结果如图14a所示，当Pan02细胞在乏氧下分别被IRNPs-SBA、SBA和IRNPs-OCH3孵育24小时后，IRNPs-SBA和SBA处理组的细胞培养基的pHe显着降低，乏氧Pan02细胞中pHe(ΔpHe)的变化为-0.28，与相同条件下游离SBA(ΔpHe＝-0.32)的相似。而PBS处理组的ΔpHe很高为-0.64，IRNPs-OCH3处理组的ΔpHe为-0.58，两者相近。上述结果表明，IRNPs-SBA可以有效地抑制乏氧Pan02细胞上的CA活性。随着IRNPs-SBA和SBA对CA活性的有效抑制，乏氧Pan02细胞中的HIF-1α表达显着下调；相比之下，IRNPs-OCH3孵育的乏氧Pan02细胞中的HIF-1α表达未受影响(图14b)，表明IRNPs-SBA可以通过抑制CA活性来有效缓解乏氧环境。
3、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对乏氧Pan02细胞产生ROS能力的评估
本实施例中测量了2',7'-二氯荧光素-二乙酸酯(DCFH-DA)的细胞内活性氧(ROS)水平。
将Pan02细胞(约5×104)接种到玻璃底皿(In Vitro Scientific，D35-20-1-N)，并允许其过夜生长。移除DMEM培养基，PBS(1×，pH 7.4)清洗后，分别用加入PBS(Control组)、IR/Rh6GNPs-OCH3、SBA、IR/Rh6G NPs-SBA、IR/Rh6G NPs-SBA/PtIV(Rh6G和SBA浓度分别为2μM和20μM，IR1040的浓度均为20μM)的DMEM培养基，在乏氧、37℃下孵育细胞24小时。移除DMEM培养基，PBS(1×，pH 7.4)清洗后，将细胞与含有DCFH-DA(20μM)的培养基一起在乏氧、37℃下孵育30分钟。移除培养基，PBS洗涤后加入一定量的新鲜培养基进行成像。
分析结果显示，与IRNPs-OCH3处理组相比，IRNPs-SBA和SBA处理的乏氧Pan02细胞中的DCF荧光更强(图15a)。进一步流式细胞术分析证实，与未处理的对照组或IRNPs-OCH3处理组相比，IRNPs-SBA或SBA处理的乏氧Pan02细胞中的DCF荧光显着更高(图15b)。这些结果表明，SBA和IRNPs-SBA上调了细胞内的ROS水平，这是由抑制CA活性所引起的乏氧环境的缓解促进了ROS的产生。此外，当用IRNPs-SBA/PtIV培养乏氧Pan02细胞时，对应的DCF荧光强度进一步提高，可能是由于GSH对PtIV的还原引起GSH的消耗进一步导致了ROS的积累。
4、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV在乏氧下对Pan02细胞迁移的抑制能力评估
本实施例中将Pan02细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在6孔的细胞培养板上，生长过夜后，用200μL移液枪枪头缓慢划痕，画成“井”字状，在白光显微镜下拍细胞成像。标记好每个孔板中成像的位置。然后分别加入含PBS、IRNPs-OCH3(IR1040的浓度均为20μM)和IRNPs-SBA(SBA的浓度20μM)的DMEM培养基，在乏氧、37℃下孵育24h后白光显微镜下拍细胞成像。实验分析结果标明，与PBS组或IRNPs-OCH3处理的乏氧Pan02细胞相比，IRNPs-SBA孵育的乏氧Pan02细胞中的伤口边界迁移速度要慢很多。相对于PBS组和IRNPs-OCH3处理组，IRNPs-SBA孵育的乏氧Pan02细胞迁移明显抑制～92.9％(图16)，表明IRNPs-SBA能够通过抑制CA活性来抑制肿瘤细胞的转移能力。
实施例4
本实施例中考察了酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对Pan02细胞的细胞存活率评估及细胞凋亡的流式细胞分析。
本实施例所用的IRNPs-SBA由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下的步骤(2)制备得到；所用的IRNPs-SBA/PtIV由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下制备得到。并根据实验需要，使用PBS缓冲液(1×，pH 7.4)稀释至不同的浓度(基于IR1040的浓度)。
1、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对Pan02细胞的细胞存活率评估
(1)本实施例中首先通过测定细胞的IC50值来考察探针IRNPs-SBA对Pan02细胞的细胞毒性情况，具体步骤为：
将细胞接种在平底96孔板上(每孔1×104个细胞)，并在37℃下孵育过夜。然后分别加入不同浓度的IRNPs-SBA(0、1、2、10、20、40、100μM)于DMEM培养基(100μL)。然后分为三组进行孵育，第一组为常氧下先用IRNPs-SBA培养在37℃下3小时，用PBS清洗，然后用新鲜培养基再培养48小时(I组)。第二组为常氧下先用IRNPs-SBA培养在37℃下3小时，用PBS清洗，然后用加入新鲜培养基后用1064nm(0.5W·cm-2)激光照射3min后再孵育48小时(II组)。第三组为乏氧下先用IRNPs-SBA培养在37℃下3小时，用PBS清洗，然后用加入新鲜培养基后用1064nm(0.5W·cm-2)激光照射3min后再孵育48小时(III组)。孵育结束后在每个孔中加入50μL MTT溶液(在PBS中为1mg/mL)。细胞在37℃下保持4小时，然后小心地除去每个孔中的溶液。加入150μL DMSO溶解孔中的紫色formazan晶体。在微孔板阅读器(Tcan)上获取每个孔中490nm处的吸光度(OD)。以空白细胞(OD对照)的吸光度作为对照，用OD除以OD对照计算各处理中细胞活力的百分比，通过Prism 7软件计算出相应的IC50值。实验结果如图17a所示，在常氧条件下，IRNPs-SBA(100μM)对Pan02细胞也几乎没有细胞毒性。然而，在1064nm激光照射下，IRNPs-SBA分别在常氧或乏氧下处理Pan02细胞后观察到剂量依赖性的细胞毒性。1064nm激光照射后IRNPs-SBA在常氧或乏氧下对Pan02细胞的IC50值分别为25.07±8.13μM和16.73±4.95μM(图17c)，表明在NIR-II光(1064nm)照射下IRNPs-SBA具有良好的PTT效果。
(2)为了研究PTT和化疗的联合治疗效果，进一步评估了IRNPs-SBA/PtIV对Pan02肿瘤细胞的细胞毒性。本实施例中将细胞接种在平底96孔板上(每孔1×104个细胞)，并在37℃下孵育过夜。然后加入不同浓度的顺铂(CisPt)或IRNPs-SBA/PtIV(0、0.5、1、5、10、20和50μM)于DMEM培养基(100μL)。然后分为三组进行孵育，第一组为乏氧下先用CisPt培养在37℃下3小时，用PBS清洗，然后用新鲜培养基再培养48小时(IV组)。第二组为常氧下先用IRNPs-SBA/PtIV培养在37℃下3小时，用PBS清洗，然后用加入新鲜培养基后用1064nm(0.5W·cm-2)激光照射3min后再孵育48小时(V组)。第三组为乏氧下先用IRNPs-SBA/PtIV培养在37℃下3小时，用PBS清洗，然后用加入新鲜培养基后用1064nm(0.5W·cm-2)激光照射3min后再孵育48小时(VI组)。孵育结束后在每个孔中加入50μL MTT溶液(在PBS中为1mg/mL)。细胞在37℃下保持4小时，然后小心地除去每个孔中的溶液。加入150μL DMSO溶解孔中的紫色formazan晶体。在微孔板阅读器(Tcan)上获取每个孔中490nm处的吸光度(OD)。以空白细胞(OD对照)的吸光度作为对照，用OD除以OD对照计算各处理中细胞活力的百分比，通过Prism 7软件计算出相应的IC50值。实验结果如图17b所示，在1064nm激光激发下，IR NPs-SBA/PtIV对乏氧Pan02细胞的IC50值为0.66±0.28μM，显著低于IRNPs-SBA+光照组(IC50＝16.73±4.95μM)或顺铂组(IC50＝13.44±2.83μM)，表明IRNPs的PTT和GSH还原后释放的顺铂联合治疗能够显著抑制肿瘤细胞的生长。值得一提的是，IRNPs-SBA/PtIV+光照在乏氧下对Pan02细胞的IC50比常氧下的(IC50＝1.57±0.73μM)低2倍以上，表明IRNPs-SBA/PtIV在杀死乏氧Pan02细胞方面更有效(图17c)。
2、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对Pan02细胞的细胞凋亡流式细胞分析
本实施例中将Pan02细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在6孔的细胞培养板上，生长过夜后，移除DMEM培养基，PBS(1×，pH 7.4)清洗后，分别用PBS、激光、IRNPs-SBA/PtIV、IRNPs-SBA/PtIV+激光在乏氧下(1％ O2)(IR1040的浓度均为20μM)、37℃下处理Pan02细胞24h。其中，激光照射条件为用1064nm激光(0.5W·cm-2)照射细胞3分钟。培育结束后，对细胞进行胰蛋白酶消化，并用膜联蛋白V-FITC(5.0μL)和碘化丙啶(PI)(5.0μL对细胞沉淀物进行染色。染色后，使用Coulter FC-500流式细胞仪使用FITC和PI通道分析细胞群。所有实验均使用至少10000个细胞进行检测。膜联蛋白V-碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术分析标明，用IRNPs-SBA/PtIV+光照处理Pan02细胞后，乏氧Pan02细胞中存在严重的细胞凋亡(图18)。上述的结果进一步证实了由IRNPs-SBA/PtIV的PTT和化疗同时对乏氧Pan02细胞的的联合治疗效果优于IRNPs-SBA的PTT和顺铂的化疗效果。
实施例5
本实施例中探究了酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对小鼠皮下Pan02癌的NIR-II区荧光成像及在小鼠不同器官的摄取情况。
本实施例所用的IRNPs-SBA/PtIV由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-OCH3由实施例1中“3.1、IRNPs-OCH3纳米颗粒的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-SBA由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下的步骤(2)制备得到。并根据实验需要，使用PBS缓冲液(1×，pH 7.4)稀释至不同的浓度(基于IR1040的浓度)。
1、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对小鼠皮下Pan02癌的NIR-II区荧光成像
在探究了IRNPs-SBA/PtIV在细胞层面上对不同肿瘤细胞的杀伤效果后，进一步开展了IRNPs-SBA/PtIV在BALB/C小鼠皮下胰腺癌的NIR-II区成像检测。为了建立小鼠皮下胰腺癌模型，取9只4～5周龄的雌性BALB/C裸鼠(购自南京大学模型动物研究中心(MARC)(中国，南京))，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)的规定使用。在右后大腿外侧皮下注射2×106Pan02细胞，建立异种移植Pan02肿瘤，当肿瘤的平均体积达到约120mm3时，将小鼠随机分为三组(n＝3)。为了对Pan02皮下肿瘤的小鼠进行活体荧光成像(980nm)，分别尾静脉注射IRNPs-OCH3、IRNPs-SBA和IRNPs-SBA/PtIV(探针的浓度均为540μM(基于IR1040)，探针均注射200μL)进小鼠体内。如图19a所示，24h时肿瘤处的NIR-II FL强度逐渐增大并达到最大值，持续时间超过48h。由于IRNPs-SBA/PtIV中的SBA与肿瘤上过表达CA之间的强亲和力，IRNPs-SBA和IRNPs-SBA/PtIV实验组在24h时的NIR-II FL强度分别比静脉注射IRNPs-OCH3的小鼠分别高3.37倍和3.49倍(图19b)。与之对应的信噪比(tumor-to-backgroundratio，TBR)，IRNPs-SBA/PtIV和IRNPs-SBA分别是IRNPs-OCH3组的3.08倍和2.97倍(图19c)。注射探针一天后，用激光照射10min后再隔一天取出肿瘤，离体肿瘤组织切片的NIR-II FL显微镜成像结果与NIR-II FLI非常匹配，其结果显示在IRNPs-SBA和IRNPs-SBA/PtIV实验组中有明显的IR1040荧光，表明由于SBA的靶向能力，静脉注射后可有效递送到肿瘤部位(图19d)。这些数据表明，CA靶向的主动递送可以大大提高IRNPs-SBA和IRNPs-SBA/PtIV的肿瘤摄取。
2、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV在小鼠不同器官的摄取情况
为了探究探针IRNPs-SBA/PtIV在小鼠不同器官的摄取情况，小鼠皮下胰腺癌模型的建立如本实施例“1”项下所述。尾静脉注射200μL的IRNPs-SBA/PtIV(540μM)到Pan02皮下肿瘤的小鼠体内，24h后收集小鼠肿瘤(T)和主要器官，包括心脏(H)、肝脏(Li)、脾脏(Sp)、肺脏(Lu)和肾脏(Ki)，进行NIR-II区荧光成像(980nm)。如图20a所示，IRNPs-SBA/PtIV主要分布在肿瘤(T)中，在其他器官中摄取很少，与在离体切除器官中观察到的强NIR-II FLI非常匹配。
进一步地，为了考察活体内不同器官的Pt分布，尾静脉注射200μL的IRNPs-SBA/PtIV(540μM)到Pan02皮下肿瘤的小鼠体内，小鼠在注射后24小时后收集肿瘤(T)和主要器官，包括心脏(H)、肝脏(Li)、脾脏(Sp)、肺脏(Lu)和肾脏(Ki)，并进行称重。将组织切成小块，在120℃下用浓HNO3消化过夜，然后用5mL 2wt％HNO3水溶液稀释每个器官中的残留物，用ICP-OES测定铂的浓度。计算出组织的摄取值表示为每克组织注射剂量的百分比％ID/g以进行比较，结果如图20b所示，探针IRNPs-SBA/PtIV在肿瘤组织中的蓄积量最高(～12.6％ID/g)，明显高于在其他器官的蓄积量。
实施例6
本实施例中探究了酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对小鼠皮下Pan02癌的NIR光热成像、肿瘤组织切片的免疫荧光染色及对肿瘤的PTT和化疗联合治疗。
本实施例所用的IRNPs-SBA/PtIV由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-OCH3由实施例1中“3.1、IRNPs-OCH3纳米颗粒的制备”项下制备得到；所用的IRNPs-SBA由实施例1中“3.2、靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV的制备”项下的步骤(2)制备得到。并根据实验需要，使用PBS缓冲液(1×，pH 7.4)稀释至不同的浓度(基于IR1040的浓度)。
1、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对小鼠皮下Pan02癌的NIR光热成像
在证实NIR-II FLI指导下，IRNPs-SBA/PtIV在肿瘤部位高效富集的基础上，对小鼠皮下胰腺癌模型进行了NIR-II区光热图像。小鼠皮下胰腺癌模型的建立如实施例5中“1”项下所述。分别尾静脉注射200μL生理盐水(saline)、IRNPs-OCH3和IRNPs-SBA/PtIV 24h后(探针的浓度均为540μM(基于IR1040)，探针均注射200μL)，各组用1064nm激光持续照射肿瘤部位10分钟，功率密度(0.5W·cm-2，为MPE剂量的一半)。光热成像(1064nm)结果显示，IRNPs-SBA/PtIV处理的肿瘤温度从32.8℃迅速增加到42.6℃，明显高于生理盐水处理(33.4℃)或IRNPs-OCH3处理的小鼠(38.7℃)(图21a和图21b)。值得一提的是，42.6℃的温度是温和的，这个温度足以引起肿瘤高热，但同时避免过热对周围正常组织造成损害。
2、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对肿瘤组织切片的免疫荧光染色
本实施例中研究了IRNPs-SBA/PtIV在活体上抑制CA活性和缓解肿瘤乏氧的能力。小鼠皮下胰腺癌模型的建立如实施例5中“1”项下所述。分别尾静脉注射200μL生理盐水、IRNPs-OCH3和IRNPs-SBA/PtIV 24h后(探针的浓度均为540μM(基于IR1040)，探针均注射200μL)，对于IRNPs-OCH3和IRNPs-SBA/PtIV实验组，分别进行1064nm激光照射10min(功率密度0.5W·cm-2)后取出肿瘤，并对其进行染色。肿瘤组织的免疫荧光染色图22显示，注射IRNPs-SBA/PtIV后的小鼠肿瘤组织CA表达显著下调，但注射生理盐水和IRNPs-OCH3的小鼠肿瘤组织CA的表达未下调。随着CA的抑制，注射IRNPs-SBA/PtIV后的小鼠肿瘤组织的HIF-1α表达也明显下调，肿瘤中相应的乏氧环境明显缓解。这些结果表明，IRNPs-SBA/PtIV可以有效抑制小鼠肿瘤处的CA活性，从而缓解肿瘤乏氧环境，这有利于克服顺铂化疗的耐药性。
3、酶靶向顺铂诊疗探针IRNPs-SBA/PtIV对肿瘤的PTT和化疗联合治疗
小鼠皮下胰腺癌模型的建立如实施例5中“1”项下所述。本实施例中将肿瘤大小为～120mm3的荷Pan02瘤BALB/C小鼠随机分为7组，每组5只小鼠。然后各组小鼠分别尾静脉注射生理盐水(I组)，生理盐水+光照(II组)，IRNPs-SBA/PtIV(III组)，IRNPs-OCH3+光照(IV组)，IRNPs-SBA+光照(V组)，IRNPs-SBA/PtIV+光照(VI组)和IRNPs-SBA/PtIV+光照+IRNPs-SBA/PtIV(2剂)(VII组)(生理盐水注射200μL，探针的浓度均为540μM(基于IR1040)，探针均注射200μL)。静脉注射一次生理盐水、IRNPs-SBA/PtIV、IRNPs-OCH3或IRNPs-SBA，24小时后用1064nm激光(0.5W·cm-2)照射10分钟，具体用药时间详见图23a。21天内测量每只小鼠的体重和肿瘤大小。
由图23b(1064nm激光)和图23c可知，对于生理盐水(I组)或生理盐水+光照(II组)处理的小鼠显示出快速的肿瘤生长速率，平均肿瘤大小在21天后分别增长了8.8倍和8.1倍，表明仅1064nm激光照射对肿瘤的PTT影响可以忽略不计。当小鼠用IRNPs-SBA/PtIV(III组)或IRNPs-OCH3+光照(IV组)治疗时，肿瘤生长比注射生理盐水组的慢。在第21天，III组和IV组的平均肿瘤大小分别增加了7.2倍和5.4倍，表明由IRNPs-SBA/PtIV产生的化疗或由IRNPs-OCH3产生的PTT效率不高。当小鼠用IRNPs-SBA+光照(V组)或IRNP-SBA/PtIV+光照(VI组)治疗时，两组的肿瘤体积在前10天内缩小，但随后开始缓慢生长。由于PTT和化疗的联合作用，IRNPs-SBA/PtIV+光照(VI组)治疗后第21天时小鼠的平均肿瘤大小明显小于IRNPs-SBA+光照(V组)，表明IRNPs-SBA/PtIV在治疗皮下Pan02肿瘤方面比IRNPs-SBA更有效。然而，由于只注射了IRNPs-SBA/PtIV一次，因此第21天时VI组中的肿瘤仍生长了2.1倍，可能是由于肿瘤细胞中顺铂剂量不足引起的。为了提高PTT和化疗的联合治疗效果，VI组小鼠在第10天和第13天进一步连续注射两次IRNPs-SBA/PtIV以补充化疗用Pt药物(VII组)，此种治疗组小鼠肿瘤体积在21天减少了12.3倍。在治疗期间，这些实验组的小鼠体重没有明显的变化(图23d)。这些研究表明IRNPs-SBA/PtIV通过结合IR1040的PTT与释放出的顺铂化疗的联合治疗对正常组织毒副作用低，但抗肿瘤活性强。这一结论与小鼠主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)和切除的肿瘤组织切片的苏木精和伊红(H&E)染色的结论非常吻合(图23e)。此外，当采用PTT和化疗的联合治疗来治疗小鼠肿瘤时，肿瘤组织的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色显示有明显的细胞凋亡现象，表明IRNPs-SBA/PtIV有望用于活体Pan02肿瘤的治疗。
本发明提供了一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针，其特征在于，通过纳米沉淀法将磷脂-聚乙二醇类化合物和NIR-II区荧光探针IR1040制成IRNPs-NH2纳米颗粒，IRNPs-NH2纳米颗粒表面的氨基共价连接对磺酰胺苯甲酸、四价铂前药，形成靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针；
其中，
所述磷脂-聚乙二醇类化合物为DSPE-PEG2000-OCH3和DSPE-PEG2000-NH2；
所述NIR-II区荧光探针IR1040的结构式为：
所述四价铂前药为PtIV-COOH。
2.根据权利要求1所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针，其特征在于，所述NIR-II区荧光探针IR1040由如下步骤制备得到：
1,8-萘内酰亚胺与5-氯戊炔在碘化钾的作用下进行取代反应，制得中间体1；中间体1与甲基格氏试剂在惰性气体保护、无水条件下进行格氏反应，格氏反应结束后加入碘化钾进行沉淀，制得中间体2；中间体2与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛在碱和酸酐的作用下进行偶联反应，即得NIR-II区荧光探针IR1040；
3.根据权利要求2所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针，其特征在于，所述1,8-萘内酰亚胺与5-氯戊炔、碘化钾的摩尔比为1：1.0～2.0：3.0～4.5；所述取代反应，反应温度为120～150℃，反应时间为24～48h；所述甲基格氏试剂为甲基氯化镁；所述中间体1与甲基格氏试剂、碘化钾的摩尔比为1：3.5～5.5：1.5～3.5；所述格氏反应，反应温度为55～80℃，反应时间为1～2h；所述惰性气体为氮气；所述碱为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺；所述酸酐为乙酸酐；所述中间体2与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛的摩尔比为1～2.5：1；所述中间体2与碱、酸酐的摩尔体积比为0.65mmol：0.4～0.6mL：0.4～0.6mL；所述偶联反应，反应温度为50～70℃，反应时间为20～60min。
4.根据权利要求1所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针，其特征在于，所述顺铂诊疗探针表面的对磺酰胺苯甲酸基团能够靶向肿瘤细胞表面高表达的碳酸酐酶，抑制碳酸酐酶的活性，从而缓解肿瘤细胞的乏氧环境、降低细胞外pH和抑制肿瘤细胞迁移；所述顺铂诊疗探针在肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽还原下释放出二价铂原药，实现对肿瘤细胞的化疗；其中，所述二价铂原药为顺铂。
5.根据权利要求1所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针，其特征在于，所述顺铂诊疗探针中的NIR-II区荧光探针IR1040通过第一激光照射实现荧光成像；其中，所述第一激光照射的波长为980nm或1064nm；所述顺铂诊疗探针中的NIR-II区荧光探针IR1040通过第二激光照射将光能转化为热能，实现对肿瘤细胞的光热治疗；其中，所述第二激光照射，波长为1064nm，功率密度为0.5W·cm-2，照射时间为3～10min。
6.权利要求1～5中任意一项所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将IR1040储备溶液与DSPE-PEG2000-OCH3、DSPE-PEG2000-NH2、第一溶剂混合后加入到去离子水中，加入过程中超声，超声结束后将反应液洗涤、离心浓缩后，加入PBS缓冲液，得到含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液；
(2)将4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐混合，在-10～0℃下反应10～20分钟，得到第一混合液；将第一混合液与步骤(1)得到的含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液混合，加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌4～8小时，反应结束后将反应液离心浓缩后，加入PBS缓冲液，得到含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液；
(3)将顺铂前药储备溶液与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐混合，在-10～0℃下反应10～20分钟，得到第二混合液；将第二混合液与步骤(2)得到的含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液混合，加入N,N-二异丙基乙胺，室温下搅拌4～8小时，反应结束后将反应液离心浓缩后，加入PBS缓冲液，得到含有IR1040的IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒储备液，即靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶剂为四氢呋喃或乙醇；所述IR1040储备溶液中的溶剂为二甲基亚砜；所述IR1040储备溶液中的IR1040与DSPE-PEG2000-OCH3、DSPE-PEG2000-NH2的摩尔质量比为0.27μmol：8mg：2mg；所述DSPE-PEG2000-NH2与第一溶剂的质量体积比为2mg：0.5～1.5mL；所述第一溶剂与去离子水的体积比为0.5～1.5：8～10；所述超声，超声温度为室温，超声功率为40KHz，超声时间为10～15min；所述PBS缓冲液，1×，pH 7.4；所述含有IR1040的IRNPs-NH2纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，溶液中4-氨基磺酰基苯甲酸的溶度为1mg·mL-1；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的4-氨基磺酰基苯甲酸与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.05：0.8～1.0：9.0～10.0；所述4-氨基磺酰基苯甲酸储备溶液中的4-氨基磺酰基苯甲酸与DSPE-PEG2000-NH2的质量比为0.05：2；所述含有IR1040的IRNPs-SBA纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L；所述顺铂前药储备溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，溶液中顺铂前药的浓度为1mg·mL-1；所述顺铂前药储备溶液中顺铂前药与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.05：0.8～1.0：9.0～10.0；所述顺铂前药储备溶液中顺铂前药与DSPE-PEG2000-NH2的质量比为0.05：2；所述含有IR1040的IRNPs-SBA/PtIV纳米颗粒储备液中IR1040的浓度为540μmol/L。
8.权利要求1～5中任意一项所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备抗肿瘤药物中的应用，优选地，所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤光热治疗和/或化疗药物中的应用。
9.权利要求1～5中任意一项所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
10.权利要求1～5中任意一项所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤NIR-II区成像造影剂中的应用，优选地，所述的靶向碳酸酐酶的顺铂诊疗探针在制备肿瘤NIR-II区荧光成像/光热成像造影剂中的应用。
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