CN117597140A - 具有多种转录调控因子的杂合受体 - Google Patents

Abstract

本公开文本总体上涉及免疫学领域，并且具体地涉及被设计为将快速时间尺度胞内信号转导和长时间尺度转录调控相结合的杂合嵌合抗原受体。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码所述受体的核酸、用所述核酸基因修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗多种健康状况或疾病如癌症的方法。

Description

具有多种转录调控因子的杂合受体

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年3月24日提交的美国临时申请号63/165,428的权益，将所述临时申请通过引用并且出于所有目的以其整体并入本文。

关于联邦政府资助研发的声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的授权号OD025751下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本公开文本总体上涉及免疫学领域，并且具体地涉及被设计为将快速时间尺度胞内信号转导和长时间尺度转录调控相结合的杂合嵌合抗原受体。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、用所述核酸基因修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗多种健康状况或疾病如癌症的方法。

背景技术

Notch受体是跨膜蛋白，其介导细胞间接触信号传导并且在细胞与细胞间通讯的形成和其他方面发挥核心作用。Notch受体参与发育期间的多种细胞功能并且是所述细胞功能所需的，并且对于物种之间的众多种细胞类型的功能是重要的。

最近通过以下方式开发了Notch受体的许多现有第一代合成衍生物(其通常被称为“SynNotch”)：用抗体衍生物替代胞外配体结合结构域(其在野生型Notch中含有多个EGF样重复)，以及用所选转录激活因子替代胞质结构域，但是仍然依赖于Notch NRR(L.Morsut等人,Cell(2016)164:780-91)以及标准两步式蛋白水解。然而，NRR跨越大约160个氨基酸，使得仅这个结构域就具有一些成熟蛋白质(如胰岛素或表皮生长因子(EGF))的约三倍大小。这使得受体的表达不太有效，并且可能超出一些广泛使用的克隆和转染载体的容量。

此外，与嵌合抗原受体(CAR)形成对比，这些第一代SynNotch和第二代SynNotch受体不会经由激酶级联引发膜近端信号传导。作为替代，这些受体将配体结合转化为受体束缚的转录因子的释放，所述转录因子穿梭到细胞核以调节用户定义的转录回路。

具体地，这些受体缺乏启动快速时间尺度信号传导的能力，所述快速时间尺度信号传导调节诸如代谢重编程、增殖、生长因子产生或细胞毒性的细胞过程。

本公开文本尤其提供了一类新的杂合SynNotch受体，所述新的杂合SynNotch受体掺入了可以启动T细胞的激活同时伴随定制的转录调控的胞内信号传导结构域(例如，CAR的刺激结构域和共刺激结构域，例如来自4-1BB、CD28和CD3ζ的胞质尾的共刺激结构域等)。

发明内容

本文提供的尤其包括从N末端至C末端包含以下项的嵌合受体：a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；b)连接多肽；c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域(TMD)；和d)胞内结构域(ICD)。在一些实施方案中，所述ICD以任何顺序包含：(i)胞内信号传导结构域(SD)，其含有至少一个源自信号传导分子的共刺激结构域和激活结构域，以及(ii)转录调控因子。在某些实施方案中，所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在所述ICD与所述连接多肽之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割。在其他实施方案中，所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合通过胞内SD诱导近端信号传导级联。在一些实施方案中，所述嵌合受体不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。

在一些实施方案中，所述胞外结构域包含能够与细胞表面上的配体结合的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述细胞是致病细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是终末分化细胞。

在一些实施方案中，所述配体包括蛋白质或碳水化合物。在某些实施方案中，所述配体选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC-1、MAGE、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和信号调节蛋白α(SIRPα)。

在一些实施方案中，所述配体选自细胞表面受体、粘附蛋白、整合素、粘蛋白、凝集素、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，所述配体是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，所述胞外配体结合结构域包含受体的配体结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体、微型抗体、F(ab')2片段、F(ab)v片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)及其功能片段。在一些示例性实施方案中，所述抗原结合部分包含scFv。

在某些实施方案中，所述抗原结合部分与选自以下的肿瘤相关抗原特异性结合：CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、ALPPL2、CD123、CD171、CD179a、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Rα、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SIRPα、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet和Axl。在一些示例性实施方案中，所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、CEA、HER2、MUC1、CD20、ALPPL2、SIRPα或EGFR。

在其他示例性实施方案中，所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、HER2或ALPPL2。

在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体的连接多肽包括铰链结构域。在一些实施方案中，所述铰链结构域能够经由分子间二硫键键合促进所述嵌合多肽的寡聚体形成。

在一些实施方案中，所述铰链结构域源自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域、IgG1铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域或其任一种的功能变体。在某些示例性实施方案中，所述连接多肽源自下组，该组选自：CD8α铰链结构域或其功能变体、CD28铰链结构域或其功能变体、OX40铰链结构域或其功能变体和IgG4铰链结构域或其功能变体。

在一些实施方案中，所述连接多肽源自CD8α铰链结构域或其功能变体。在其他实施方案中，所述连接多肽源自CD28铰链结构域或其功能变体。在一些特定实施方案中，所述连接多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点包括γ分泌酶切割位点。在一些实施方案中，所述TMD包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开文本的嵌合受体进一步包含位于TMD与ICD之间的停止转移序列(STS)。在一些示例性实施方案中，所述停止转移序列包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述信号传导分子包括1类或3类人膜蛋白。在某些实施方案中，所述信号传导分子选自CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H、BTLA、B71、B7H1、CD226、CRTAM、TIGIT、CD96、TIM1、TIM2、TIM3、TIM4、CD2、SLAM、2B4、Ly108、CD84、Ly9、CRACC、BTN1、BTN2、BTN3、LAIR1、LAG3、CD160、4-1BB、OX40、CD27、GITR、CD30、TNFR1、TNFR2、HVEM、LT_R、DR3、DCR3、FAS、CD40、RANK、OPG、TRAILR1、TACI、BAFFR、BCMA、TWEAKR、EDAR、XEDAR、RELT、DR6、TROY、NGFR、CD22、SIGLEC-3、SIGLEC-5、SIGLEC-7、KLRG1、NKR-P1A、ILT2、KIR2DL1、KIR3DL1、CD94-NKG2A、CD300b、CD300e、TREM1、TREM2、ILT7、ILT3、ILT4、TLT-1、CD200R、CD300a、CD300f、DC-SIGN、B7-2、变应素-1、LAT、BLNK、LAYN、SLP76、EMB-LMP1、HIV-NEF、HVS-TIP、HVS-ORF5和HVS-stpC。在一些示例性实施方案中，所述信号传导分子选自OX40、ICOS、4-1BB、CTLA4、CD28、CD30、CD2、CD27和CD226。

在一些实施方案中，所述激活结构域包含一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述一个或多个ITAM源自CD3ζ、CD3σ、CD3/和CD3ε。在某些实施方案中，所述一个或多个ITAM与CD3ζITAM具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施方案中，所述转录调控因子包括转录激活因子或转录阻遏因子。在一些实施方案中，所述转录调控因子进一步包含源自选自Gal4、tetR、ZFHD1和HAP1的蛋白质的核定位序列(NLS)，并且其中所述转录调控因子包含源自选自VP64、VP65、KRAB和VP16的蛋白质的反式激活结构域。

在某些实施方案中，本文提供的嵌合受体包含与SEQ ID NO:15-31和34-45中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本文提供的嵌合受体进一步包含信号序列、可检测标记、肿瘤特异性切割位点、疾病特异性切割位点或其组合。

在其他方面，本公开文本还包括包含核苷酸序列的重组核酸，所述核苷酸序列编码本文所述的嵌合受体。在某些实施方案中，将所述核苷酸序列掺入表达盒或表达载体中。在某些实施方案中，所述表达载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述表达载体是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。

另外，本公开文本包括重组细胞，所述重组细胞包含本文所述的嵌合受体和/或重组核酸。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞或干细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或其他T细胞。

在一些实施方案中，本公开文本的重组细胞包含：a)本文所述的第一嵌合受体和第二嵌合受体；和/或b)本文所述的第一核酸和第二核酸。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体不含有相同的序列。在其他实施方案中，所述第一核酸或所述第二核酸不具有相同的序列。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体调节所述第二嵌合受体的表达和/或活性。

在一些实施方案中，本公开文本的重组细胞进一步包含可操作地连接至启动子的编码蛋白质的表达盒，其中所述蛋白质的表达受所述转录调控因子的调节。在一些实施方案中，所述蛋白质对于所述细胞是异源的。在一些实施方案中，所述启动子是酵母GAL4启动子。在一些实施方案中，所述蛋白质是细胞因子、细胞毒素、趋化因子、免疫调节剂、促凋亡因子、抗凋亡因子、激素、分化因子、去分化因子、免疫细胞受体(例如，TCR或CAR)或报告物。

本文进一步提供的包括用于制备本文所述的重组细胞的方法，所述方法包括：a)提供能够表达蛋白质的细胞；和b)使所提供的细胞与本文所述的重组核酸接触，使所述重组核酸进入所提供的细胞中。在一些实施方案中，通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞，并且离体接触所述细胞。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。

本公开文本的另一方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体以及以下中的一种或多种：a)本文所述的重组核酸；和b)本文所述的重组细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含本文所述的重组核酸以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，将所述重组核酸包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。

本文进一步提供的尤其包括一种用于在有需要的个体中调节细胞活性、抑制靶癌细胞或治疗健康状况的系统。在一些实施方案中，所述系统包含以下中的一种或多种：a)本文所述的嵌合受体；b)本文所述的重组核酸；c)本文所述的重组细胞；和d)本文所述的药物组合物。

在其他方面，本公开文本还提供了一种用于调节细胞的活性的方法，所述方法包括：a)提供本文所述的重组细胞；并且b)使所述重组细胞与选定的配体接触，其中所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并且释放所述转录调控因子，其中所释放的转录调控因子调节所述重组细胞的活性。

在一些实施方案中，所述接触在体内、离体或体外进行。

在一些实施方案中，待调节的细胞的活性选自：选定的基因的表达、增殖、凋亡、非凋亡性死亡、分化、去分化、迁移、分子的分泌、细胞粘附和细胞溶解活性。在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节细胞的基因产物的表达。

在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节异源基因产物的表达。在一些实施方案中，所述细胞的基因产物选自趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生的蛋白质、增殖诱导剂、受体、RNA指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、T细胞受体、毒素、毒素衍生的蛋白质、转录调控因子、转录激活因子、转录阻遏因子、翻译调控因子、翻译激活因子、翻译阻遏因子、激活性免疫受体、抗体、凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、工程化T细胞受体、免疫激活因子、免疫抑制剂和抑制性免疫受体。

在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节所述细胞的分化，并且其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。

本文进一步提供的尤其包括一种用于抑制个体的靶细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所述的重组细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞抑制所述个体中所述靶细胞的活性。

在一些实施方案中，所述靶细胞是致病细胞。在一些实施方案中，所述致病性细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是急性骨髓瘤白血病细胞、间变性淋巴瘤细胞、星形细胞瘤细胞、B细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周T细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞、间皮瘤细胞或肉瘤细胞。

在其他方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的个体的健康状况的方法，所述方法包括向所述个体施用包含有效数量的本文所述的重组细胞的第一疗法，其中所述重组细胞治疗所述个体的健康状况。

在一些实施方案中，所述用于治疗有需要的个体的健康状况的方法进一步包括向所述个体施用第二疗法。

在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法和毒素疗法。

在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法在同一组合物中一起施用或在分开的组合物中施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法同时施用。在其他实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在某些实施方案中，将所述第一疗法在所述第二疗法之前施用。在其他实施方案中，将所述第一疗法在所述第二疗法之后施用。在又另外的实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。

本公开文本还提供了以下中的一种或多种用于治疗健康状况一的用途：a)本文所述的嵌合受体；b)本文所述的重组核酸；c)本文所述的重组细胞；和d)本文所述的组合物。在一些实施方案中，本公开文本涉及上述中的任一种用于制造治疗健康状况的药剂的用途。在一些实施方案中，所述健康状况是癌症。在某些实施方案中，所述癌症是实体瘤、软组织肿瘤或转移性病变。

附图说明

图1A-图1C说明了根据本公开文本的一些实施方案的示例性杂合SynNotch CAR的设计和杂合SynNotch CAR回路的预测功能。图1A是所有可能的胞内结构域构型的图。图1B是杂合SynNotch CAR结构域的详图。图1C示出了由杂合SynNotch CAR诱导的假定的短期近端和长期转录信号传导。

图2A-图2D示意性地总结了为说明各种示例性杂合SynNotch CAR的表达和回路诱导而进行的实验的结果。将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活并用表达受体或转录报告物构建体的两种慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天分选具有41BB共刺激结构域(图2A)或CD28共刺激结构域(图2C)的杂合SynNotch CAR，从而纯化受体和报告物双重阳性群体。为了评估回路诱导，在初始T细胞刺激后第14天，将表达具有41BB共刺激结构域(图2B)或CD28共刺激结构域(图2D)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞与K562细胞(蓝色)或CD19+K562细胞(红色)共培养48小时。随后使用Fortessa X-50(BD)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。

图3A-图3B说明了杂合SynNotch CAR激活标记物表达。如图2所述产生表达具有41BB共刺激结构域(图3A)或CD28共刺激结构域(图3B)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。将转导的细胞与K562细胞(灰色)或CD19+K562细胞(蓝色或红色)共培养48小时。随后使用Fortessa X-50(BD)测量激活标记物CD25、CD39、CD69和PD-1的表达。

图4示意性地总结了为说明示例性杂合SynNotch CAR的增殖而进行的实验的结果。如图2所述产生表达具有41BB共刺激结构域或CD28共刺激结构域的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。将转导的细胞用Cell Trace Far Red(CTFR)染色，然后与K562细胞(灰色)或CD19+K562细胞(蓝色或红色)共培养5天。随后使用Fortessa X-50(BD)测量CTFR染料的稀释度。

图5A-图5B总结了为说明通过示例性杂合SynNotch CAR实现的细胞因子分泌而进行的实验的结果。如图2所述产生表达具有41BB共刺激结构域(图5A)或CD28共刺激结构域(图5B)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。将转导的细胞与K562细胞(灰色)或CD19+K562细胞(蓝色或红色)共培养。在48小时后，将布雷菲德菌素A、莫能菌素(Monesin)和第二批K562细胞(具有或不具有CD19+表达)添加到共培养物中。将共培养物再孵育6小时，然后使用Fortessa X50(BD)评估转导的细胞的细胞因子颗粒酶B、IFNy、IL-2和TNFa的细胞内表达。请注意，未收集具有ICD CD28-CD3ζ-Gal4VP64的杂合SynNotch CAR的数据。

图6A-图6B总结了为说明通过示例性杂合SynNotch CAR实现的靶标杀伤而进行的实验的结果。如图2所述产生表达具有41BB共刺激结构域(图6A)或CD28共刺激结构域(图6B)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。允许表达CD19配体和核染剂mkate2的A549细胞在96孔平底板上贴壁24小时，然后以1:1比例添加转导的T细胞。将板在Incucyte中孵育，Incucyte每2小时捕获一次板图像和荧光，持续5天。使用成像软件计算每个时间点处培养物中A549 CD19+mkate2+细胞的数量。对于每个实验组，将A549细胞计数相对于铰链Notch实验组的细胞计数归一化。

图7A-图7C说明了杂合SynNotch CAR的体内功效。图7A是实验时间线的描述。向NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rgtm1^Wjl/SzJ(NSG)小鼠静脉内给药0.5x 106个Nalm6-Luc-GFP肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用如图2所述的具有ICD CD3ζ-Gal4VP64-CD28的抗CD19杂合SynNotchCAR和BFP报告物共转导。在肿瘤注射后4天，经由眼眶后注射向动物给药0.5x106个转导的CD3+T细胞。图7B示出了如使用IVIS Spectrum经由萤光素酶分泌肿瘤细胞的生物发光成像测量的肿瘤负荷。图7C示出了存活曲线。

图8A-图8D说明了最小化的4-1BB变体改进NF-kB信号传导并且降低噪声。图8A是41BB变体的描述，其描绘了用于产生“noSTS”和“trunc”41BB共刺激结构域而缺失的氨基酸。图8B示出了将T细胞共转导以表达如图2所述的具有41BB变体的抗CD19杂合SynNotchCAR和BFP报告物。图8C示出了如图2所述评估回路诱导。图8D示出了被转导以在NfKB的共同启动子下表达mCherry报告物的Jurkat细胞系。然后将该NfKB报告细胞系用抗CD19杂合SynNotch CAR转导，并且与表达CD19的K562细胞共培养。经由流式细胞术在共培养后24、48和72小时评估mCherry表达，其作为NfKB活性的代替物。

图9A-图9D示出了对最小化的41BB变体的进一步迭代。图9A是41BB变体的描述，其描绘了用于产生“min”41BB共刺激结构域而缺失的氨基酸，以及用于产生“trunc41BBtrunc41BB”共刺激结构域而重复的氨基酸区域。图9B示出了将T细胞共转导以表达如图2所述的具有41BB变体的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物。图9C示出了如图2所述评估回路诱导。图9D示出了将Jurkat细胞系转导以在NfKB的共同启动子下表达mCherry报告物。然后将该NfKB报告细胞系用抗CD19杂合SynNotch CAR转导，并且与表达CD19的K562细胞共培养。经由流式细胞术在共培养后24、48和72小时评估mCherry表达，其作为NfKB活性的代替物。

图10A-图10B示出了Trunc41BB杂合SynNotch CAR体内功效。图10A示出了实验时间线的描述。向NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rgtm1^Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下给药4x 10⁶个表达CD19配体的M28肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用具有如图10B所指示的ICD的抗CD19杂合SynNotch CAR和如图2所述的BFP报告物共转导。在肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向动物给药6x 10⁶个转导的CD3+T细胞。图10B示出了每周经由卡尺测量评估的肿瘤体积。

图11A-图11C示出了最小化的CD28变体降低噪声。图11A是CD28变体的描述，其描绘了用于产生“noSTS”和“trunc”CD28共刺激结构域而缺失的氨基酸。图11B示出了被共转导以表达如图2所述的具有CD28变体的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物的T细胞。图11C示出了如图2所述评估的回路诱导。

图12A-图12C示出了对最小化的CD28变体的进一步迭代。图12A是CD28变体的描述，其描绘了用于产生“CD28ΔTPRRP”、“truncCD28ΔTPRRP”和“fullytruncCD28”共刺激结构域而缺失的氨基酸。图12B示出了被共转导以表达如图2所述的具有CD28变体的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物的T细胞。图12C示出了如图2所述评估的回路诱导。

图13A-图13C示出了“第三代”变体。图13A是“第三代”变体的描述，所述第三代变体包含附加到trunc41BB共刺激结构域的C末端的CD28信号传导基序中的一个。图13B示出了被共转导以表达如图2所述的具有第三代变体的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物的T细胞。图13C示出了如图2所述评估的回路诱导。

图14A-图14B示出了Trunc41BB杂合SynNotch CAR体内功效。图14A是实验时间线的描述。向NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rgtm1^Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下给药4x 10⁶个表达CD19配体的M28肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用具有如图14B所指示的ICD的抗CD19杂合SynNotch CAR和如图2所述的BFP报告物共转导。在肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向动物给药3x 10⁶个转导的CD3+T细胞。图14B示出了每周经由卡尺测量评估的肿瘤体积。

图15A-图15B示出了靶向BCMA和ALPPL2的杂合SynNotch CAR表达和回路诱导。如图2所述产生表达具有41BB共刺激结构域的抗BCMA受体和抗ALPPL2受体和BFP报告物的T细胞(图15A)。将转导的细胞与K562细胞(蓝色)或抗原阳性(BCMA或ALPPL2)K562细胞(红色)共培养48小时(图15B)。

图16示出了靶向ALPPL2的杂合SynNotch CAR体内功效。如图14所述向NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rgtm1^Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下给药4x 10⁶个M28肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用抗ALPPL2 CAR或具有如图所指示的ICD的抗ALPPL2杂合SynNotch CAR和如图2所述的BFP报告物共转导。在肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向动物给药3x 10⁶个转导的CD3+T细胞。每周经由卡尺测量来评估肿瘤体积。

具体实施方式

本公开文本总体上涉及被设计为将快速时间尺度胞内信号转导和长时间尺度转录调控相结合的一类新的嵌合受体。具体而言，本公开文本的一些实施方案提供了示例性嵌合受体(在本文中称为“杂合SynNotch CAR”)，其掺入了(i)CAR的共刺激结构域和刺激结构域(例如，CD3ζ链的胞质尾和转录调控因子)。这些新受体的胞质尾的结构(共刺激结构域、CD3ζ、转录因子)可以以多种方式配置。如下文更详细描述的，本公开文本还鉴定了杂合受体结构，其在靶细胞类型(如原代人T细胞)中可靠地诱导近端T细胞受体共刺激信号和基因调节。本文提供的新杂合SynNotch CAR可以同时刺激(i)快速时间尺度(例如，从秒到分钟)近端信号传导和(ii)长时间尺度转录调控，其通常花费几小时以诱导充足水平从而观察细胞的状态变化。

如本公开文本中的下文中详细示出的，杂合SynNotch CAR(例如，具有4-1BB或CD28共刺激结构域)的某些胞内构型(而不是其他的)展现出对诱导型转录报告元件的抗原非依赖性诱导。此外，本公开文本证明，胞内结构域的空间构型在存在和不存在配体的两种情况下都影响受体行为。另外，本公开文本举例说明了在与靶抗原接合后，杂合SynNotchCAR通过其胞内信号传导结构域(例如，4-1BB或CD28和CD3ζ)功能性地诱导信号传导，从而导致激活标记物的表达。在一些示例性实施方案中，本公开文本证明，在与抗原接合后，本文提供的杂合SynNotch CAR通过其胞内信号传导结构域(例如，4-1BB或CD28和CD3ζ)功能性地诱导短期信号传导级联，从而导致T细胞的增殖。此外，本公开文本证明，由本公开文本的杂合SynNotch CAR的共刺激结构域和激活结构域(例如，CD3ζ)诱导的信号传导在类型或机制、力度、强度或时间长度方面与CAR不同。同时，本公开文本证明，本文公开的杂合SynNotch CAR T细胞可以以与CAR T细胞相似的速率杀伤靶细胞。因此，本公开文本提供了杂合SynNotch CAR诱导T细胞激活和足以在较长的时间段(如多天)内引起靶细胞杀伤的细胞毒性程序。此外，本公开文本证明了杂合SynNotch CAR T细胞在体内有效地控制和清除肿瘤负荷。

本公开文本进一步尤其提供了共刺激结构域(例如，4-1BB共刺激结构域)的修饰可以优化具有抗原非依赖性活性的本文所述的杂合SynNotch CAR，从而导致能够实现抗原依赖性转录回路诱导和T细胞信号传导两者的改进设计。

尽管本公开文本的各种特征可以在单个实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独地或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独实施方案的上下文中描述本公开文本，但本公开文本也可以在单个实施方案中实现。将本文引用的任何公开的专利申请和任何其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献出于任何目的通过引用并入本文。另外，材料、方法和例子仅为说明性，并且不意图具有限制性。

在以下具体实施方式中，参考了附图(其构成本发明的一部分)。在附图中，除非上下文另外规定，否则相同的符号通常指示相同的部件。具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性替代方案并不意味着限制。可以使用其他替代方案，并且可以在不背离这里呈现的主题的精神或范围的情况下进行其他改变。将容易理解的是，如本文通常描述的并且在附图中示出的方面可以以各种不同的配置进行布置、替代、组合和设计，所有这些都是明确地预期的并且构成本申请的一部分。

定义

除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。在本文中使用“A和/或B”来包括所有以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。

如本文所用，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”是指通过施用途径递送组合物或配制品，所述施用途径包括但不限于静脉内、动脉内、大脑内、鞘内、肌内、腹膜内、皮下、肌内及其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。

术语“异源的”是指对于侧翼序列并非天然的多肽序列或结构域，例如，其中在自然界中未发现异源序列与在一端或两端存在的多肽序列偶联。

如本文所用的关于蛋白质或多肽的术语“衍生物”是指起源或来源，并且可以包括天然存在的、重组的、未纯化的或纯化的多肽，所述多肽是从来源或起源蛋白质或多肽获得的，是基于来源或起源的蛋白或多肽获得的。因此，源自起源蛋白质或多肽的蛋白质或多肽可以部分或全部包含原始蛋白质或多肽，并且可以是起源蛋白质或多肽的片段或变体。在一些情况下，源自来源或起源蛋白质的多肽序列或结构域可以是基因修饰或化学修饰的。

术语“宿主细胞”和“重组细胞”在本文中可互换使用。应理解的是，这样的术语以及“细胞”、“细胞培养物”、“细胞系”不仅指代特定的主题细胞或细胞系，还指代这样的细胞或细胞系的子代或潜在子代，不考虑转移次数。应当理解的是，并非所有子代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响而在后代中发生，使得子代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍被包括在如本文所用的所述术语的范围内，只要子代保留与原始细胞或细胞系相同的功能性即可。

如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以它们预期的方式操作。

如本文在两种或更多种核酸或蛋白质的上下文中所用，术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，在指定区域上的约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用采用下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测量的。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。然后此类序列被称为“基本上相同”。此定义也涉及或可以应用于测试序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。可以在长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在给定序列的整个长度上计算序列同一性。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J Mol Biol215:403,1990)。可以使用序列分析软件采用其默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如威斯康星大学生物技术中心(University of WisconsinBiotechnology Center)(大学大道1710号，威斯康星州麦迪逊，53705)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的序列分析软件包。

如本文所用，并且除非另外指定，否则药剂的“治疗有效量”是足以在健康状况如疾病(例如，癌症)的治疗或控制中提供治疗益处的量，或者足以延迟或最小化与癌症相关的一种或多种症状的量。治疗有效量的化合物是指单独或与其他治疗剂组合的一定量的治疗剂，其在治疗或控制癌症方面提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善癌症的整体疗法、减轻或避免癌症的症状或原因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以被称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,2010)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(2016)；Pickar,Dosage Calculations(2012)；以及Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第22版,2012,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。

如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人类个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的个体。因此，受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如，癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人类个体或个体。受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为有目的病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠)和非哺乳动物，如非人灵长类动物，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

在提供值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他陈述的或中间值都被涵盖在本公开文本内。这些更小范围的上限值和下限值可以独立地被包括在更小范围内，并且也被涵盖在本公开文本内，服从于在陈述的范围内任何确切排除的限值。在陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开文本中。

本文公开的所有范围还都涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被认为充分描述和使得能够将相同的范围分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等等。作为一个非限制性例子，本文所讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员将理解的，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞都包括所列举的数字并且涉及随后可以分解为如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个制品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等等。

应了解的是，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个组合都单独且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个这样的子组合都单独且明确地在本文中公开一样。

本领域技术人员将理解的是，本文所公开的嵌合受体提供具有一定范围的特征的信号，所述范围为从低至高配体诱导的转导和(独立地)低至中非诱导的信号转导。此活性范围是新特征，其可以用于增强并调整工程化细胞的作用。此外，如下文更详细地描述，与现有SynNotch受体相比，多种本文所公开的受体变体展现改进的表达。

Notch受体

Notch受体是大型跨膜蛋白，其通常在与相邻细胞上表达的表面结合的配体结合后传递信号。Notch信号依赖于细胞间通讯，例如，在两个接触细胞之间的通讯，其中一个接触细胞是“接收”细胞并且另一个接触细胞是“发送”细胞。接收细胞中表达的Notch受体识别它们的在发送细胞上表达的配体(delta/serrate/lag或“DSL”蛋白家族)。notch和delta在这些接触细胞上的接合导致notch受体的两步蛋白水解，其最终导致受体的胞内部分(“ICD”)从膜释放到细胞质中。Notch具有基质金属蛋白酶切割位点(表示为“S2”)，所述位点在所述受体没有激活时由Notch负调控区(“NRR”)保护免受切割。NRR由三个LIN-12-Notch重复(“LNR”)模块和一个异二聚化结构域(“HD”)组成。认为这种蛋白水解通过发送细胞施加的力来调控：DSL配体在Notch受体上牵拉，其改变NRR的构象并暴露金属蛋白酶位点。这是通过组成型活性蛋白酶(如ADAM10)切割，释放受体的胞外结合部分和负调控区。受体的配体结合部分的释放又暴露另一个切割位点(表示为“S3”)，所述切割位点被细胞膜内的γ-分泌酶切割：这种切割从细胞膜释放核归巢ICD。W.R.Gordon等人,Dev Cell(2015)33:729-36。这个释放的结构域通过调控转录来改变接收细胞行为。脊椎动物和无脊椎动物的进化趋异伴随Notch谱系中的至少两轮基因重复：苍蝇具有单一Notch基因，蠕虫具有两个(GLP-1和LIN-12)，并且哺乳动物具有四个(NOTCH1-4)。Notch信号的转导依赖于三个关键事件：(i)配体识别；(ii)配体依赖性切割位点的构象暴露；以及(iii)核转录激活复合物的组装。

规范的Notch信号通过称为调控的膜内蛋白水解的过程转导。在细胞表面上，Notch受体通常维持静止的蛋白水解抗性构象，但是配体结合启动蛋白水解级联，从而从膜释放所述受体的胞内结构域(ICD)。关键的调控的切割步骤受ADAM金属蛋白酶的影响，并且发生在紧邻质膜外部的称为S2的位点。这种截短的受体被称为NEXT(针对Notch胞外截短)，其保持膜栓系直至其在位点S3被γ-分泌酶(一种多蛋白酶复合物)加工。

在γ-分泌酶切割后，ICD最终进入细胞核，在其中ICD使转录激活复合物的组合体成核，所述转录激活复合物含有DNA结合转录因子和Mastermind家族的转录辅激活因子。然后这种复合物接合一种或多种另外的辅激活因子蛋白如p300，以募集基础转录机构并激活下游靶基因的表达。

Notch受体具有模块结构域组织。Notch受体的胞外域由负责配体结合的一系列N末端表皮生长因子(EGF)样重复组成。这些EGF重复的O-连接糖基化(包括由O-岩藻糖、Fringe和Rumi糖基转移酶修饰)还响应于蝇类和哺乳动物中的不同配体亚型调节Notch受体的活性。

在EGF重复之后是三个LIN-12/Notch重复(LNR)模块，它们是Notch受体特有的，并被广泛报道参与防止受体过早激活。通过弗林蛋白酶切割分裂Notch1的异二聚化(HD)结构域，使得其N末端部分终止胞外亚基，并且其C末端的一半构成跨膜亚基的开端。在胞外区域之后，受体具有跨膜区段和胞内结构域(ICD)，其包含转录调控因子。

本公开文本的组合物

本公开文本尤其提供了被设计为将快速时间尺度胞内信号转导和长时间尺度转录调控相结合的一类新的嵌合受体。具体而言，本公开文本的一些实施方案提供了新的杂合SynNotch受体结构，其掺入了可以启动T细胞激活同时伴随定制转录调控的信号传导结构域(例如，共刺激、CD3ζ等)。在一些实施方案中，本文提供的新受体具有线性氨基酸信号传导基序，以在所添加到的T细胞中介导向SynNotch受体的胞质尾中的信号传导。如实施例和附图所示，这些新受体可以刺激快速时间尺度(例如，从秒到分钟)近端信号传导以及长时间尺度转录调控，其花费数小时以诱导充足水平从而观察细胞状态变化。

在一方面，本公开文本提供了嵌合受体，所述嵌合受体从N末端至C末端包含：a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；b)连接多肽；c)含有一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及d)以任何顺序含有以下项的胞内结构域：(i)胞内信号传导结构域(SD)，其包含(1)至少一个源自信号传导分子的共刺激结构域和(2)激活结构域，以及(ii)转录调控因子。在一些实施方案中，所选定的配体与胞外配体结合结构域的结合诱导设置在胞内结构域和连接多肽之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割。此外，所选定的配体与胞外配体结合结构域的结合还可以通过胞内SD诱导近端信号传导级联。在一些实施方案中，所述近端信号传导级联是指快速时间尺度信号传导。例如，所述信号传导级联可以在数秒至数分钟内诱导。可替代地，所述信号传导级联可以持续秒至分钟。在一些实施方案中，此类近端信号传导级联通过T细胞受体共刺激信号诱导。另外，本文提供的嵌合受体不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。在一些实施方案中，所述连接多肽能够经由分子间二硫键键合促进嵌合受体的寡聚体形成。

胞外结构域(ECD)和配体

在一些实施方案中，本文公开的嵌合受体(例如，杂合SynNotch CAR)的ECD对一种或多种靶配体具有结合亲和力。靶配体可以在细胞表面上表达，或者以其他方式被锚定、固定或约束，从而可以在嵌合受体上施加机械力。所述细胞可以是致病细胞或人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞可以是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述人细胞可以是终末分化细胞。这样，不受任何特定理论的束缚，本文提供的嵌合受体的ECD与细胞表面配体的结合不一定从靶细胞表面去除靶配体，而是对所述嵌合受体产生机械拉力。例如，如果其他可溶性配体结合至表面或胞外基质中的分子，则所述其他可溶性配体可以被靶向。在一些实施方案中，所述靶配体是细胞表面配体。合适的配体类型的非限制性例子包括细胞表面受体；粘附蛋白；表面结合的碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白和脂多糖；整合素；粘蛋白；以及凝集素。在一些实施方案中，所述配体是蛋白质。在一些实施方案中，所述配体是碳水化合物。

在一些实施方案中，所述配体是分化簇(CD)标记物。在一些实施方案中，所述CD标记物选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC-1和MAGE。

在一些实施方案中，所述胞外结构域包含受体的配体结合部分。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含结合至一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括抗体或其功能性抗原结合片段的一种或多种抗原结合决定簇。本领域技术人员在阅读本公开文本后将容易理解的是，术语“其功能片段”或“其功能变体”是指与片段或变体所来源的野生型分子具有共同的定量和/或定性生物活性的分子。例如，抗体的功能片段或功能变体是保留与功能片段或功能变体所来源的抗体基本上相同的与相同表位结合的能力的功能片段或功能变体。例如，能够与细胞表面受体的表位结合的抗体可以在N末端和/或C末端处截短，并且可以使用本领域技术人员已知的测定评估其表位结合活性的保留。在一些实施方案中，所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab’)2片段、F(ab)片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)或其功能片段。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包括scFv。

所述抗原结合部分可以包含天然存在的氨基酸序列或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望的和/或改善的特性，例如结合亲和力。通常，抗原结合部分(例如，抗体)对靶抗原(例如，CD19抗原)的结合亲和力可以通过Frankel等人,Mol.Immunol,16:101-06,1979描述的斯卡查德(Scatchard)方法计算。在一些实施方案中，结合亲和力通过抗原/抗体解离速率测量。在一些实施方案中，结合亲和力通过竞争放射免疫测定测量。在一些实施方案中，结合亲和力通过ELISA测量。在一些实施方案中，抗体亲和力通过流式细胞术测量。“选择性结合”抗原(如CD19)的抗体是基本上不结合其他抗原但以高亲和力，例如以如下平衡常数(KD)结合所述抗原的抗原结合部分：100nM或更小，如60nM或更小，例如30nM或更小，如15nM或更小、或10nM或更小、或5nM或更小、或1nM或更小、或500pM或更小、或400pM或更小、或300pM或更小、或200pM或更小、或100pM或更小。

熟练技术人员可以基于被基因修饰以表达本公开文本的嵌合受体或杂合SynNotch CAR的细胞的期望定位或功能来选择ECD。例如，具有包含对HER2抗原具有特异性的抗体的ECD的嵌合受体或杂合SynNotch CAR可以将细胞靶向表达HER2的乳腺癌细胞。在一些实施方案中，所公开的杂合SynNotch CAR的ECD能够结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。熟练技术人员将理解的是，TAA包括存在于肿瘤细胞和正常细胞上或许多正常细胞上但浓度远低于在肿瘤细胞上的浓度的分子，例如蛋白质。相比之下，TSA通常包括存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上的分子，例如蛋白质。

在一些情况下，所述抗原结合部分对存在于由肿瘤细胞表达的抗原(即，肿瘤相关抗原)中的表位具有特异性。肿瘤相关抗原可以是与例如以下相关的抗原：乳腺癌细胞、B细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、髓细胞性白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌细胞等。还将理解的是，肿瘤相关抗原也可以由非癌细胞表达。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域对存在于组织特异性抗原中的表位具有特异性。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域对存在于疾病相关抗原中的表位具有特异性。

合适靶抗原的非限制性例子包括CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、信号调节蛋白α(SIRPα)、CD123、CD171、CD179α、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Rα、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet和Axl。

在一些实施方案中，所述靶抗原选自CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、ALPPL2、CD123、CD171、CD179α、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Ra、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet、Axl、GPC2、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7H3)、IL-13Rα1、IL-13Rα2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CD125、CD147(基础免疫球蛋白)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(异二聚IL-2受体的亚基)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整合素α4、整合素α4β7、LFA-1(CD11α)、肌生成抑制蛋白、OX-40、骨硬化蛋白(scleroscin)、SOST、TGFβ1、TNF-α、VEGF-A、丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1α、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、κ轻链、λ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、GD3、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、EGFR及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素。

合适抗原的另外的非限制性例子包括PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)、Ral-B、GPC2、CD276(B7H3)或IL-13Rα。在一些实施方案中，所述抗原是Her2。在一些实施方案中，所述抗原是ALPPL2。在一些实施方案中，所述抗原是BCMA。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分对报告蛋白(BFP、GFP和eGFP)有特异性。这种抗原结合部分的非限制性例子包括LaG17抗GFP纳米抗体。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分包含抗BCMA完全人源化VH结构域(FHVH)。在一些实施方案中，所述抗原是信号调节蛋白α(SIRPα)。

适合于由本文所公开的嵌合受体靶向的另外的抗原包括但不限于GPC2、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7H3)、IL-13Rα1、IL-13Rα2、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌症抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)。其他合适的靶抗原包括但不限于酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白质黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1。

适合于由本文公开的嵌合受体靶向的另外的抗原包括但不限于与炎性疾病相关的那些，如AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CD125、CD147(基础免疫球蛋白)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的异聚体的亚单位)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整合素α4、整合素α4β7、LFA-1(CD11α)、肌生成抑制蛋白、OX-40、骨硬化蛋白、SOST、TGFβ1、TNF-α和VEGF-A。

适合于由本文所公开的嵌合受体和杂合SynNotch CAR靶向的其他抗原包括但不限于丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1α、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、κ轻链、λ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、GD3、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、EGFR及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素。合适抗原的另外的非限制性例子包括PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)和Ral-B。在一些实施方案中，抗原是GPC2、CD19、Her2/neu、CD276(B7H3)、IL-13Rα1或IL-13Rα2。在一些实施方案中，所述抗原是Her2。在一些实施方案中，所述抗原是ALPPL2。在一些实施方案中，所述抗原是BCMA。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分对报告蛋白如GFP和eGFP具有特异性。这种抗原结合部分的非限制性例子包括LaG17抗GFP纳米抗体。在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分包含抗BCMA完全人源化VH结构域(FHVH)。

在一些实施方案中，适合于由本文公开的嵌合受体和杂合SynNotch CAR靶向的抗原包括源自病原体的配体。例如，所述抗原可以是由HER2阳性乳腺癌细胞产生的HER2。在一些实施方案中，所述抗原可以是在B细胞白血病上表达的CD19。在一些实施方案中，所述抗原可以是在多形性胶质母细胞瘤(GBM)上表达但在健康CNS组织上表达少得多的EGFR。在一些实施方案中，所述抗原可以是与成人癌症例如结肠癌相关的CEA。

在一些实施方案中，所述ECD的抗原结合部分对细胞表面靶标具有特异性，其中细胞表面靶标的非限制性例子包括CD19、CD30、Her2、CD22、ENPP3、EGFR、CD20、CD52、CD11α和α-整合素。在一些实施方案中，本文公开的嵌合受体和杂合SynNotch CAR包含具有抗原结合部分的胞外结构域，所述抗原结合部分结合CD19、CEA、HER2、MUC1、CD20、ALPPL2、BCMA或EGFR。在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体(例如，杂合SynNotch CAR)包含含有结合CD19的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体(例如，杂合SynNotch CAR)包含含有结合ALPPL2的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体(例如，杂合SynNotch CAR)包含含有结合BCMA的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体(例如，杂合SynNotch CAR)包含含有结合Her2的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文公开的嵌合受体和杂合SynNotch CAR包含含有结合CD19、ALPPL2、BCMA或Her2的抗原结合部分的胞外结构域。

在一些实施方案中，所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1、2、46和47中所示的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1、2、46和47中所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1、2、46和47中所示的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1、2、46和47中所示的序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含SEQ ID NO:1、2、46和47中所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、2、46和47的任一个中的一、二、三、四或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。

连接多肽

如上所述，本公开文本的嵌合受体包含设置在所述胞外结合结构域(ECD)与所述跨膜结构域(TMD)之间的连接多肽序列。现有“SynNotch”受体包含异源胞外配体结合结构域、具有与包含NRR的Notch受体JMD的基本序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。相比之下，所述嵌合受体和杂合SynNotch CAR包含异源胞外配体结合结构域、具有与Notch受体JMD的基本序列同一性但缺少NRR(LIN-12-Notch重复(LNR)模块和异二聚化结构域)的连接多肽、TMD和ICD。换句话说，在杂合SynNotch CAR中，所述连接多肽替代天然Notch的负调节区(NRR)和异二聚化(HD)结构域。三至50个氨基酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等的氨基酸残基)可以用作多肽接头。在一些实施方案中，可以优化接头多肽序列的长度和氨基酸组成以改变ECD和TMD相对于彼此的取向和/或接近度，以实现本公开文本的嵌合受体的期望活性。所有这些序列可以用作本公开文本的嵌合受体的连接多肽。

在一些实施方案中，本公开文本涵盖的连接多肽可以包括能够经由分子间二硫键键合促进所述嵌合受体的寡聚体形成的多肽(例如，铰链接头)。在一些实施方案中，本公开文本的铰链接头包含含有一个或多个多肽基序的寡聚化结构域(例如，铰链结构域)，所述多肽基序经由分子间二硫键键合促进嵌合受体的寡聚体形成。在这些情况下，在本文所公开的嵌合受体内，铰链结构域通常包含设置在ECD与TMD之间的柔性多肽连接区。因此，所述铰链结构域提供在ECD与TMD之间的柔性，并且还提供在两个或更多个嵌合受体单体之间的分子间二硫键键合的位点以形成寡聚复合物。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含促进本文公开的嵌合受体的二聚体形成的基序。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含促进本文公开的嵌合受体的三聚体形成的基序(例如，源自OX40的铰链结构域)。适合于本公开文本的组合物和方法的铰链多肽序列可以是天然存在的铰链多肽序列(例如，来自天然存在的免疫球蛋白的铰链多肽序列)，或者可以被工程化、设计或修饰以提供所需和/或改善的特性，例如调节转录。合适的铰链多肽序列包括但不限于源自IgA、IgD和IgG亚类的那些，如IgG1铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域或其功能变体。在一些实施方案中，所述铰链多肽序列含有一个或多个CXXC基序。在一些实施方案中，所述铰链多肽序列含有一个或多个CPPC基序。关于这方面的另外的信息可以参见例如G.Vidarsson等人,Frontiers Immunol(2014)5:520的近期综述(doi:10.3389/fimmu.2014.00520)，将所述文献通过引用以其整体特此并入。

铰链多肽序列还可以源自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域及其功能变体。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含源自CD8a铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含源自CD28铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含源自OX40铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，所述铰链结构域包含源自IgG4铰链结构域或其功能变体的铰链多肽序列。

铰链接头可以包含来自所选定的铰链结构域或与所选定的铰链结构域重叠的约5至约60个氨基酸，例如至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约12、至少约15、至少约17、至少约20、至少约22、至少约24、至少约26、至少约28、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55或至少约60个氨基酸。在本发明的实施方案中，铰链接头具有不超过约60个氨基酸、少于约55、少于约50、少于约45、少于约40、少于约35、少于约32、少于约30、少于约29、少于约28、少于约27、少于约26、少于约25、少于约24、少于约23、少于约22、少于约21、少于约20、少于约18、少于约16、少于约14、少于约12或少于约10个氨基酸。

在一些实施方案中，所述连接多肽序列包含与SEQ ID NO:3中所示的序列具有至少80％序列同一性(如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述连接多肽序列包含与SEQ IDNO:3中所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接多肽序列包含与SEQ ID NO:3中所示的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接多肽序列包含与SEQ ID NO:3中所示的序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述连接多肽序列包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3的任一个中的一、二、三、四或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。

跨膜结构域(TMD)

如上所述，本公开文本的嵌合受体包含含有一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的TMD。

Notch受体中的蛋白水解切割位点(例如，S2或S3)的例子如上所述。适合于本文公开的组合物和方法的另外的蛋白水解切割位点包括但不限于选自以下的MMP的金属蛋白酶切割位点：胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3(MMP-1、MMP-8和MMP-13)，明胶酶A和明胶酶B(MMP-2和MMP-9)，溶基质蛋白酶1、溶基质蛋白酶2和溶基质蛋白酶3(MMP-3、MMP-10和MMP-11)，基质溶解素(MMP-7)，和膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。例如，MMP-9的切割序列是Pro-X-X-Hy(其中，X表示任意残基；Hy表示疏水残基，如Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr、Val、Met和Pro)，例如Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)，例如Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr。合适的蛋白酶切割位点的另一个例子是纤溶酶原激活因子切割位点，例如，尿激酶纤溶酶原激活因子(uPA)或组织纤溶酶原激活因子(tPA)切割位点。合适的蛋白酶切割位点的另一个例子是催乳素切割位点。uPA和tPA的切割序列的具体例子包括包含Val-Gly-Arg的序列。蛋白水解可切割接头中可以包含的蛋白酶切割位点的另一个例子是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点，例如，Glu-Asn-Leu-Tyr-Thr-Gln-Ser，其中所述蛋白酶在谷氨酰胺与丝氨酸之间切割。蛋白水解可切割接头中可以包含的蛋白酶切割位点的另一个例子是肠激酶切割位点，例如，Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，其中切割发生在赖氨酸残基之后。蛋白水解可切割接头中可以包含的蛋白酶切割位点的另一个例子是凝血酶切割位点，例如Leu-Val-Pro-Arg。包含蛋白酶切割位点的另外的合适的接头包含可通过以下蛋白酶切割的序列：PreScission^TM蛋白酶(包含人鼻病毒3C蛋白酶和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白)、凝血酶、组织蛋白酶B、EB病毒(Epstein-Barr virus)蛋白酶、MMP-3(溶基质蛋白酶)、MMP-7(基质溶解素)、MMP-9；嗜热菌蛋白酶样MMP、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、组织蛋白酶L；组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶l(MMP-l)、尿激酶型纤溶酶原激活因子、膜1型基质金属蛋白酶(MT-MMP)、溶基质蛋白酶3(或MMP-11)、嗜热菌蛋白酶、成纤维细胞胶原酶和溶基质蛋白酶-1、基质金属蛋白酶13(胶原酶-3)、组织型纤溶酶原激活因子(tPA)、人前列腺特异性抗原、激肽释放酶(hK3)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以及钙蛋白酶(钙激活的中性蛋白酶)。对于其中表达受体的宿主细胞(例如，TEV)并非天然的蛋白酶可以用作另一种调控机制，其中在表达或以其他方式提供蛋白酶之前，所述受体的激活是降低的。另外，蛋白酶可以是肿瘤相关的或疾病相关的(表达程度显著高于在正常组织中的表达程度)，并且作为独立的调控机制。例如，一些基质金属蛋白酶在某些癌症类型中高度表达。

通常，适合于本文所公开的嵌合受体的TMD可以是包括至少一个γ-分泌酶切割位点的1型跨膜受体的任何跨膜结构域。γ-分泌酶复合物以及其底物蛋白(包括淀粉样前体蛋白(APP)和Notch)的结构和功能的详细描述可以例如参见Zhang等人,Frontiers CellNeurosci(2014)的近期综述。来自1型跨膜受体的非限制性的合适TMD包括来自CLSTN1、CLSTN2、APLP1、APLP2、LRP8、APP、BTC、TGBR3、SPN、CD44、CSF1R、CXCL16、CX3CL1、DCC、DLL1、DSG2、DAG1、CDH1、EPCAM、EPHA4、EPHB2、EFNB1、EFNB2、ErbB4、GHR、HLA-A和IFNAR2的那些，其中TMD包含至少一个γ分泌酶切割位点。适合于本文所述的组合物和方法的另外的TMD包括但不限于来自1型跨膜受体IL1R1、IL1R2、IL6R、INSR、ERN1、ERN2、JAG2、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNE4、KL、CHL1、PTPRF、SCN1B、SCN3B、NPR3、NGFR、PLXDC2、PAM、AGER、ROBO1、SORCS3、SORCS1、SORL1、SDC1、SDC2、SPN、TYR、TYRP1、DCT、VASN、FLT1、CDH5、PKHD1、NECTIN1、PCDHGC3、NRG1、LRP1B、CDH2、NRG2、PTPRK、SCN2B、Nradd和PTPRM的跨膜结构域。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体的TMD是源自钙同线蛋白家族成员如老年痴呆相关类钙粘蛋白(alcadein)α和老年痴呆相关类钙粘蛋白γ的TMD。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体的TMD是Notch受体的已知的TMD。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体的TMD是源自不同Notch受体的TMD。例如，在基于人Notch1的微型Notch中，Notch1 TMD可以被Notch2 TMD、Notch3 TMD、Notch4 TMD或来自非人动物(如斑马鱼(Danio rerio)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、光滑爪蟾(Xenopus laevis)或原鸡(Gallus gallus))的Notch TMD取代。

在一些实施方案中，所述TMD内的一个或多个氨基酸取代包括TMD的“GV”基序内的一个或多个取代。在一些实施方案中，至少一个这样的取代包括取代为丙氨酸。例如，序列FMYVAAAAFVLLFFVGCGVLL(SEQ ID NO:4)的一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4内“GV”基序的位置18和/或19处的氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的位置18处的甘氨酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的位置19处的缬氨酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，跨膜结构域包含具有对应于SEQ ID NO:4的序列的氨基酸序列，其在对应于SEQ ID NO:4的位置18的位置处具有突变，如G18A突变。在一些实施方案中，跨膜结构域包含具有对应于SEQ ID NO:4的序列的氨基酸序列，其在对应于SEQ ID NO:4的位置19的位置处具有突变，如V19A突变。TMD可以源自SEQ ID NO:4但比它更常或更短。例如，所述TMD可以比SEQ ID NO:4长或短一、二、三、四个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，所述TMD包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。

停止转移序列(STS)

本公开文本的嵌合受体包含STS，所述STS包含位于TMD与ICD之间的带电荷的亲水结构域。不受任何具体理论束缚，设置在TMD与ICD之间的这个结构域防止ICD进入质膜。在一些实施方案中，包含约1至约40个氨基酸残基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基)的单链肽可以用作STS，其中大多数残基在生理条件下具有带电荷的侧链。在短STS实施方案(例如，少于约6个氨基酸)中，约5或6个氨基酸将具有带电荷的侧链。在一些实施方案中，所述STS包含约1至15、约5至20、约8至25、约10至30、约12至35、约14至40、约5至40、约10至35、约15至30、约20至25、约20至40、约10至30、约4至20或约5至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述STS包含约4至10、约5至12、约6至14、约7至18、约8至20、约9至22、约10至24、或约11至26个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述STS包含约4至10个残基，如4、5、6、7、8、9至10个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述STS包含与1型受体的STS结构域具有至少约80％序列同一性(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述STS包含与1型受体的STS结构域具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述STS包含与来自Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、CSF1R、CXCL16、DAG1、GHR、PTPRF、AGER、KL、NRG1、LRP1B、Jag2、EPCAM、KCNE3、CDH2、NRG2、PTPRK、BTC、EPHA3、IL1R2或PTPRM的STS序列具有至少70％序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述STS包含在前4个残基中仅包含Lys(K)或Arg(R)的序列。在一些实施方案中，所述STS包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个碱性残基。在一些实施方案中，所述STS包含五个、四个、三个、两个、一个或零个芳族残基或具有疏水和/或庞大侧链的残基。

在一些实施方案中，所述STS包含与SKRKRKH(SEQ ID NO:5)具有至少80％序列同一性(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述STS包含与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。STS可以源自SEQ ID NO:5但比它更长或更短。例如，所述STS可以比SEQID NO:5长或短一、二、三、四个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，所述STS包含与SEQ IDNO:5具有至少80％序列同一性(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述STS包含与SEQ IDNO:5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述STS包含与SEQ IDNO:5具有至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述STS包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。

胞内结构域(ICD)

本公开文本的嵌合受体包含胞内结构域(ICD)，所述胞内结构域(ICD)以任何顺序包含：(i)胞内信号传导结构域(SD)，其含有至少一个源自信号传导分子的共刺激结构域和激活结构域，以及(ii)转录调控因子。换言之，本公开文本的嵌合受体的ICD可以具有至少三个不同的结构域，如图1A-图1B中所描绘的。三个不同的结构域可以按特定顺序排列，并且可以经由一个或多个接头可操作地彼此连接。在一些实施方案中，如图1B所示，所述三个不同的结构域经由(GS)n接头连接。n可以是选自1至100的任意数字。例如，n可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10。在其他实施方案中，n可以是11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。示例性GS接头可以具有3个GS重复和序列GSGSGSGS(SEQ ID NO:6)。本领域技术人员将知道如何修饰接头以适合特定用途。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体的胞内结构域进一步包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域可以具有至少两个不同结构域：至少一个共刺激结构域和一个激活结构域。

在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含源自信号传导分子的序列。所述信号传导分子可以是选自1类或3类人膜蛋白的蛋白质。在一些实施方案中，所述信号传导分子选自CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H、BTLA、B71、B7H1、CD226、CRTAM、TIGIT、CD96、TIM1、TIM2、TIM3、TIM4、CD2、SLAM、2B4、Ly108、CD84、Ly9、CRACC、BTN1、BTN2、BTN3、LAIR1、LAG3、CD160、4-1BB、OX40、CD27、GITR、CD30、TNFR1、TNFR2、HVEM、LT_R、DR3、DCR3、FAS、CD40、RANK、OPG、TRAILR1、TACI、BAFFR、BCMA、TWEAKR、EDAR、XEDAR、RELT、DR6、TROY、NGFR、CD22、SIGLEC-3、SIGLEC-5、SIGLEC-7、KLRG1、NKR-P1A、ILT2、KIR2DL1、KIR3DL1、CD94-NKG2A、CD300b、CD300e、TREM1、TREM2、ILT7、ILT3、ILT4、TLT-1、CD200R、CD300a、CD300f、DC-SIGN、B7-2、变应素-1、LAT、BLNK、LAYN、SLP76、EMB-LMP1、HIV-NEF、HVS-TIP、HVS-ORF5和HVS-stpC及其衍生物、突变体、变体、片段和组合。在其他实施方案中，所述信号传导分子选自OX40、ICOS、4-1BB、CTLA4、CD28、CD30、CD2、CD27和CD226及其衍生物、突变体、变体、片段和组合。在一些实施方案中，所述信号传导分子选自4-1BB、BAFF-R、BCMA、BTLA、CD2、CD200R、CD244、CD28、CD300a、CD300f、CD40、CD7、CD72、CD96、CRACC、CRTAM、CTLA4、CXADR、DC-SIGN、GITR、HAVCR2、ICOS、ILT2、ILT3、ILT4、KIR2DL1、KIR3DL1、KLRG1、LAG3、LAIR1、NKG2D、NKR-P1A、NTB-A、PD1、Siglec-3、TACI、TIGIT、TLT-1和TNR8(CD30)及其衍生物、突变体、变体、片段和组合。在其他实施方案中，所述信号传导分子是CD28或4-1BB。在一个示例性实施方案中，所述共刺激结构域包含源自CD28的序列。在另一个示例性实施方案中，所述共刺激结构域包含源自4-1BB的序列。在另一个实施方案中，所述共刺激结构域包含附加到trunc41BB共刺激结构域的C末端的CD28信号传导基序中的一个。

在一些实施方案中，所述激活结构域包含一个或多个保守氨基酸基序，所述一个或多个保守氨基酸基序充当磷酸化的底物(例如像，免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM))。在一些实施方案中，所述激活结构域包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个充当磷酸化的底物的选自以下的特定的基于酪氨酸的基序：ITAM基序、ITIM基序或相关胞内基序。在本公开文本的一些实施方案，所述胞内信号传导结构域的激活结构域包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个ITAM。总体上，包含ITAM的任何激活结构域都可以适当地用于如本文所述的嵌合受体的构建。ITAM通常包括时常存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部的保守蛋白质基序。所述基序可以包括被6-8个氨基酸分开的两个重复的氨基酸序列YxxL/I，其中每个x独立地是任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导而言很重要，细胞内的信号转导至少部分由信号传导分子激活后ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM也可以作为参与信号传导途径的其他蛋白质的停泊位点起作用。

在一些实施方案中，所述激活结构域源自CD3ζ、CD3σ、CD3/和CD3ε。例如，在一些实施方案中，所述ITAM源自CD3ζ、CD3σ、CD3/和CD3ε。在一个示例性实施方案中，所述ITAM源自CD3ζ。在某些实施方案中，所述ITAM包含与CD3ζITAM至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，所述激活结构域包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个ITAM，其独立地选自源自以下的ITAM：CD3ζ、FcRγ及其组合。在一些实施方案中，所述激活结构域包含CD3ζITAM。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体的胞内结构域进一步包含转录调控因子。转录调控因子是生化元件，其用以激活或阻遏启动子驱动的DNA序列的转录。适合于本公开文本的组合物和方法的转录调控因子可以是天然存在的转录调控因子或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望的和/或改进的特性，例如，调节转录。在一些实施方案中，转录调控因子直接调控细胞的分化中涉及的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，转录调控因子通过以下方式间接调节细胞的分化中涉及的一个或多个基因的表达：调节第二转录因子的表达，这又调节细胞的分化中涉及的一个或多个基因的表达。熟练技术人员将理解的是，转录调控因子可以是转录激活因子或转录阻遏因子。在一些实施方案中，所述转录调控因子是转录阻遏物。在一些实施方案中，所述转录调控因子是转录激活因子。在一些实施方案中，所述转录调控因子还可以包含核定位信号。在一些实施方案中，所述转录调控因子包含源自Gal4、tetR、ZFHD1或HAP1的核定位序列。在其他实施方案中，所述转录调控因子包含源自VP64、VP65、KRAB或VP16的转录调控因子的序列。在某些实施方案中，所述转录调控因子选自Gal4-VP16、Gal4-VP64、tetR-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB和HAP1-VP16。在一些实施方案中，所述转录调控因子是Gal4-VP64。

在一些实施方案中，所述ICD包含与SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个具有至少80％序列同一性(如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述ICD包含与SEQ IDNO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ICD包含与SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ICD包含与SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个具有至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ICD包含SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个中的一、二、三、四或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。

另外的结构域

在一些实施方案中，本文提供的嵌合受体可以进一步包含另外的区域或结构域。例如，在一些实施方案中，位于TMD的N末端的所述胞外结构域可以包含诸如CD8A信号的膜定位信号。在其他实施方案中，所述嵌合受体可以包含可检测的标记(如myc标签或His标签等)。在另外的实施方案中，本文提供的嵌合受体还可以包含肿瘤特异性切割位点或疾病特异性切割位点。在另外的实施方案中，本文提供的嵌合受体可以包含这些另外的区域的组合。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含：(a)连接多肽，所述连接多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(c)停止转移序列结构域，所述停止转移序列结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含：(a)胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域与SEQ ID NO:1、2、45和46中的任一个具有至少80％序列同一性；(b)连接多肽，所述连接多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(d)停止转移序列结构域，所述停止转移序列结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(e)胞内结构域，所述胞内结构域包含与SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个具有至少80％序列同一性的一个或多个氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含：(a)胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域与SEQ ID NO:1、2、45和46中的任一个具有至少80％序列同一性；(b)连接多肽，所述连接多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(d)停止转移序列结构域，所述停止转移序列结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(e)胞内结构域，所述胞内结构域包含由GS接头连接的三个氨基酸序列，所述三个氨基酸序列各自与SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的任一个具有至少80％序列同一性。

在一些示例性实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含：(a)胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域具有SEQ ID NO:1、2、45和46中所示的序列；(b)连接多肽，所述连接多肽包含具有SEQ ID NO:3中所示的序列的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:4中所示的序列的氨基酸序列；(d)停止转移序列结构域，所述停止转移序列结构域包含具有SEQ ID NO:5中所示的序列的氨基酸序列；和(e)胞内结构域，所述胞内结构域包含由GS接头连接的三个氨基酸序列，所述三个氨基酸序列具有SEQID NO:7-14、33、49-53和59-62中所示的序列。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含：(a)胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域与SEQ ID NO:1、2、45和46中的任一个具有至少80％序列同一性；(b)连接多肽，所述连接多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和(d)胞内结构域，所述胞内结构域包含与SEQ ID NO:7-14、33、49-53和59-62中的一个或多个具有至少80％序列同一性的一个或多个氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含与本文所公开的嵌合受体具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供了包含与SEQ ID NO:15-31、32-44、47-48、54-58和63-68中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的嵌合受体。

核酸分子

在另一方面，本文提供了包含编码本公开文本的嵌合受体和杂合SynNotch受体的核苷酸序列的各种核酸分子，包括含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，这些核酸分子可操作地连接至异源核酸序列，例如促进在宿主细胞中体内表达受体的调节序列。

本公开文本的核酸分子可以具有以下任何长度，包括例如在约1.5Kb与约50Kb之间、在约5Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约30Kb之间、在约5Kb与约20Kb之间、或在约10Kb与约50Kb之间，例如在约15Kb至30Kb之间、在约20Kb与约50Kb之间、在约20Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约25Kb之间、或在约30Kb与约50Kb之间。

在一些实施方案中，本文提供了包含编码嵌合受体或杂合SynNotch受体的核苷酸序列的核酸分子，所述嵌合受体或杂合SynNotch受体从N末端到C末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)连接序列；(c)含有一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及(d)含有以下项的胞内结构域：(i)胞内信号传导结构域(SD)，其包含至少一个源自信号传导分子的共刺激结构域和激活结构域，和(ii)转录调控因子，其中所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在转录调控因子与铰链结构域之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割。

在一些实施方案中，将所述核苷酸序列掺入表达盒或表达载体中。将理解的是，表达盒通常包括遗传物质的构建体，其含有编码序列和足够的调节信息以指导编码序列在体内和/或离体地在受体细胞中正确地转录和/或翻译。通常，可以将表达盒插入用于靶向所需宿主细胞的载体中和/或个体中。这样，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含：如本文公开的嵌合受体的编码序列，所述编码序列可操作地连接至表达控制元件如启动子，以及任选的影响编码序列转录或翻译的其他核酸序列中的任一个或组合。

在一些实施方案中，将所述核苷酸序列掺入表达载体中。本领域技术人员将理解的是，术语“载体”通常是指如下重组多核苷酸构建体，其被设计用于在宿主细胞之间转移并且可以用于转化的目的，例如将异源DNA引入宿主细胞中。因此，在一些实施方案中，所述载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以将另一个DNA区段插入其中以导致所插入区段的复制。在一些实施方案中，所述表达载体可以是整合载体。

在一些实施方案中，所述表达载体可以是病毒载体。如本领域技术人员将了解的，术语“病毒载体”广泛用于指代包含通常促进核酸分子的转移或整合至细胞的基因组中的病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)，或者指代介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒将通常包含各种病毒组分，并且有时还包含除了一种或多种核酸之外的宿主细胞组分。术语病毒载体可以指代能够将核酸转移至细胞中的病毒或病毒颗粒或者指代所转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要源自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有主要源自慢病毒(其为逆转录病毒的属)的结构性和功能性遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。

在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与本文公开的嵌合受体具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-68中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:15-32、34-44、47-48、54-58和63-68中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1和2中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQID NO:4具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:5具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文提供了编码具有氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:7-14、33、49-53和59-62中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

可以针对在目的宿主细胞中的表达优化编码嵌合受体的核酸序列。例如，可以将序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如参考宿主细胞中表达的已知基因计算的。密码子使用优化的方法是本领域已知的。可以优化本文公开的嵌合受体的编码序列内的密码子使用以增强在宿主细胞中的表达，使得已经优化编码序列内的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或多达100％的密码子以用于在特定宿主细胞中表达。

本文公开的一些实施方案涉及载体或表达盒，所述载体或表达盒包含编码本文公开的嵌合受体的重组核酸分子。表达盒通常含有编码序列和足够的调控信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。可以将所述表达盒插入用于靶向所希望的宿主细胞的载体中和/或个体中。可以将表达盒插入源自能够进行基因组整合或自主复制的任何来源的质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体，作为线性或环状的单链或双链的DNA或RNA多核苷酸分子，包括已经以功能上操作性的方式连接(即，可操作地连接)一个或多个核酸序列的核酸分子。

本文还提供了含有编码本文公开的任何嵌合受体或杂合SynNotch受体的核酸分子中的一个或多个的载体、质粒或病毒。所述核酸分子可以含于载体内，所述载体能够引导它们在例如已经被所述载体转化/转导的细胞中的表达。用于真核和原核细胞中的合适的载体是本领域中已知的并且可商购的，或者由熟练技术人员容易地制备。参见例如，Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory，以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中联合称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.New York,NY:Wiley(包括至2014年的增刊)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.New York,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.San Diego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy and NeuroscienceApplications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The ImmunologyMethods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.San Diego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).New York,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols inNucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley(包括至2014年的增刊)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，将其披露内容通过引用并入本文。

可以经由常规转化或转染技术将DNA载体引入真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人(2012，同上)和其他标准分子生物学实验室手册中找到，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹道引入、核穿孔、流体力学冲击和感染。

可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，Gluzman(编辑),Eukaryotic Viral Vectors,CSH Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.)。例如，如本文公开的嵌合受体可以在真核宿主如哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。这些细胞可从许多来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在选择表达系统时，应注意确保组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。另外，如果在选择表达系统时需要指导，则熟练技术人员可以查询P.Jones,“Vectors:Cloning Applications”,John Wiley and Sons,NewYork,N.Y.,2009)。

所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的那些序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽(例如，抗体)的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA或合成DNA(如通过基于亚磷酰胺的合成产生的DNA))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。另外，所述核酸分子可以是双链的或单链的(例如，有义链或反义链)。

核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包括位于编码序列(例如，嵌合受体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)来产生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。

重组细胞和细胞培养物

可以将本公开文本的核酸引入宿主细胞，例如人T淋巴细胞，以产生含有所述核酸分子的重组细胞或工程化细胞。因此，本公开文本的一些实施方案涉及用于制备重组细胞或工程化细胞的方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的细胞以及(b)使所提供的细胞与本公开文本的重组核酸接触。

将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。

因此，在一些实施方案中，所述核酸分子可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物递送。例如，所述核酸分子可以稳定地整合在宿主基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于瞬时表达。因此，在一些实施方案中，所述核酸分子在所述重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定地整合到所述重组细胞的基因组中。稳定的整合可以使用经典随机基因组重组技术或用更精确的技术来实现，所述基因组编辑技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas9基因组编辑、或使用NgAgo(格式嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)Argonaute)的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑、或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应核酸酶)。在一些实施方案中，所述核酸分子作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于瞬时表达。

所述核酸分子可以被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法如电穿孔来递送。例如，将核酸引入细胞中可以通过病毒转导来实现。在一个非限制性例子中，腺相关病毒(AAV)被工程化以经由病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了若干种AAV血清型，并且所有已知的血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织，而没有毒性迹象，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫反应。

慢病毒来源的载体系统也可用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞两者；(iii)具有广泛的组织嗜性，包括重要的基因疗法靶细胞类型和细胞疗法靶细胞类型；(iv)在载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和产生的系统。

在一些实施方案中，可以用例如本申请的载体构建体对宿主细胞进行基因工程化(例如，转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如病毒载体或用于同源重组的载体(其包含与宿主细胞基因组的一部分同源的核酸序列)，或者可以是用于表达目的多肽的表达载体。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。

在一些实施方案中，所述重组细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞在体内。在一些实施方案中，所述细胞是离体的。在一些实施方案中，所述细胞在体外。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞或干细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是免疫系统细胞，例如淋巴细胞(例如，T细胞或NK细胞)或树突细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞(TH)、细胞毒性T细胞(TCTL)或其他T细胞。在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是T淋巴细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在细胞的一些实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是前体T细胞或T调节(Treg)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD34+、CD8+或CD4+细胞。在一些实施方案中，所述细胞是选自以下的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和大量CD8+T细胞。在细胞的一些实施方案中，所述细胞是选自以下的CD4+T辅助淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和大量CD4+T细胞。在一些实施方案中，可以通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞。在一些实施方案中，受试者是人类患者。

在一些实施方案中，所述重组细胞进一步包含如本文公开的第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子不具有相同的序列。在一些实施方案中，所述重组细胞进一步包含如本文所公开的第一和第二嵌合受体或杂合SynNotch受体，其中所述第一嵌合受体或杂合SynNotch受体和所述第二嵌合受体或杂合SynNotch受体不具有相同的序列。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体或杂合SynNotch受体调节所述第二嵌合受体或杂合SynNotch受体的表达和/或活性。

在一些实施方案中，所述重组细胞还包含编码目的蛋白的表达盒，所述目的蛋白可操作地连接至启动子，其中所述目的蛋白的表达受所述嵌合受体转录调控因子的调节。任何合适的启动子都可以与本公开文本结合使用。在一些实施方案中，所述启动子包括酵母GAL4启动子。在一些实施方案中，所述目的蛋白对于所述重组细胞是异源的。异源蛋白是通常在细胞中见不到的蛋白质，例如通常不是由细胞产生的蛋白质。原则上，对于其表达可以受嵌合受体转录调控因子调节的合适蛋白质没有特别限制。适合于与本文公开的组合物和方法一起使用的蛋白质的示例性类型包括细胞因子、细胞毒素、趋化因子、免疫调节剂、促凋亡因子、抗凋亡因子、激素、分化因子、去分化因子、免疫细胞受体或报告物。在一些实施方案中，所述免疫细胞受体是T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述免疫细胞受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，将编码目的蛋白的表达盒掺入编码本公开文本的嵌合受体的相同核酸分子中。在一些实施方案中，将编码目的蛋白的表达盒掺入与编码本公开文本的嵌合受体的核酸分子分离的第二表达载体中。

在另一方面，本文提供了包含至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基的细胞培养物。通常，所述培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化各种各样的上文提到的宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包含至少一种如本文所公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适用于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。

药物组合物

在一些实施方案中，可以将本公开文本的核酸和重组细胞掺入组合物(包括药物组合物)中。这样的组合物通常包含核酸和/或重组细胞，以及药学上可接受的赋形剂，例如载体。

适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物都应当是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，通常在所述组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文所列举成分的所需其他成分。

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体和Notch受体还可以使用本领域已知的方法通过转染或感染施用，所述本领域已知的方法包括但不限于以下文献中所述的方法：McCaffrey等人(Nature 418:6893,2002)，Xia等人(Nature Biotechnol.20:1006-10,2002)，或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53:151-60,1996,在Am.J.HealthSyst.Pharm.53:325,1996处勘误)。

本公开文本的方法

本文所述的治疗性组合物中的任一种(例如，核酸、重组细胞和药物组合物)的施用可以用于治疗患者的相关健康状况或疾病，如癌症和慢性感染。在一些实施方案中，可以将本文所述的核酸、重组细胞和药物组合物掺入治疗剂中以用于治疗患有、怀疑患有或者可能有高风险患上一种或多种与检查点抑制相关的自身免疫障碍或疾病的方法中。示例性的自身免疫障碍和疾病可以包括而不限于乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。

因此，在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于抑制个体中靶细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含如本文公开的核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种，其中所述第一疗法抑制所述靶细胞。例如，如果靶细胞的增殖减少，如果其病理或致病行为减少，如果它被破坏或杀死等，则可以抑制靶细胞。抑制包括所测量的病理或致病行为减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效数量的本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体中所述靶细胞的活性。通常，所公开的方法的靶细胞可以是个体中的任何细胞类型，并且可以是例如急性骨髓瘤白血病细胞、间变性淋巴瘤细胞、星形细胞瘤细胞、B细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周T细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞、间皮瘤细胞或肉瘤细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是致病细胞。

在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用包括包含如本文所公开的嵌合受体的重组细胞和/或如本文所公开的药物组合物中的一种或多种的第一疗法，其中所述第一疗法治疗所述个体的健康状况。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含有效数量的如本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述健康状况。

在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于辅助治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用第一疗法和第二疗法，所述第一疗法包含如本文公开的嵌合受体、铰链-Notch受体、核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种，其中所述第一疗法和所述第二疗法一起治疗所述个体的疾病。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含有效数量的如本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述健康状况。

向个体施用重组细胞

在一些实施方案中，本公开文本的方法涉及将有效量的本公开文本的重组细胞施用于需要这种治疗的个体。此施用步骤可以使用本领域的任何植入递送方法来完成。例如，可以将本公开文本的重组细胞直接输注到个体的血流中或以其他方式施用于所述个体。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括将重组细胞通过导致将所引入的细胞至少部分定位在所需部位从而产生一种或多种所需作用的方法或途径施用(所述术语与术语“引入”、“植入”和“移植”可互换使用)至个体。可以通过任何适当的途径施用所述重组细胞或其分化的子代，所述适当的途径导致递送至个体的所需位置，所施用的细胞或细胞组分的至少一部分在此位置处保持存活。在施用于个体后细胞的活力时间段可以短至数小时，例如二十四小时，至数天，至长至数年，或甚至个体的寿命，即长期移植。

当预防性提供时，可以将本文所述的重组细胞在待治疗的疾病或病症的任何症状出现之前施用于个体。因此，在一些实施方案中，重组细胞群体的预防性施用预防所述疾病或病症的症状的发生。

当在一些实施方案中治疗性地提供时，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)，例如在疾病或病症发作时，提供重组细胞。

为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文所公开的重组细胞的有效量可以是至少10²个细胞、至少5×10²个细胞、至少10³个细胞、至少5×10³个细胞、至少10⁴个细胞、至少5×10⁴个细胞、至少10⁵个细胞、至少2×10⁵个细胞、至少3×10⁵个细胞、至少4×10⁵个细胞、至少5×10⁵个细胞、至少6×10⁵个细胞、至少7×10⁵个细胞、至少8×10⁵个细胞、至少9×10⁵个细胞、至少1×10⁶个细胞、至少2×10⁶个细胞、至少3×10⁶个细胞、至少4×10⁶个细胞、至少5×10⁶个细胞、至少6×10⁶个细胞、至少7×10⁶个细胞、至少8×10⁶个细胞、至少9×10⁶个细胞或其倍数。所述重组细胞可以源自一个或多个供体，或者可以从自体来源获得。在一些实施方案中，将所述重组细胞在施用至有需要的个体之前在培养物中扩增。

在一些实施方案中，通过方法或途径将重组细胞组合物(例如，包含根据本文所述的任何细胞的多个重组细胞的组合物)递送至个体体内导致将细胞组合物至少部分定位于期望部位。可以通过任何导致个体中的有效治疗的适当途径施用包含重组细胞的组合物，例如，施用导致递送至个体中的期望位置，在该期望位置处所递送组合物的至少一部分例如至少1×10⁴个细胞被递送至期望部位保持一段时间。施用方式包括注射、输注、滴注。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，通过注射或输注进行递送是优选的施用方式。

在一些实施方案中，例如经由输注或注射全身施用所述重组细胞。例如，不是直接将重组细胞群施用于靶部位、组织或器官，而是使其进入个体的循环系统，从而进行代谢和其他类似的生物过程。

包括本文提供的任何组合物的用于治疗疾病或病症的治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，本领域技术人员将理解的是，如果疾病的任何一种或全部体征或症状或标记物得到改善或改进，则认为治疗是有效的。还可以通过如由减少住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的个体恶化的失败来测量疗效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中有描述。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。

如上文所讨论的，治疗有效量包括治疗性组合物当施用于个体时足以促进特定有益作用的量，所述个体如患有、怀疑患有或有风险患上疾病的个体。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。应理解的是，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员都可以使用常规实验确定适当的有效量。

在所公开的方法的一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述个体患有或怀疑患有与由细胞表面配体或抗原介导的细胞信号传导的抑制相关的疾病。适合于通过本公开文本的组合物和方法治疗的疾病包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病和感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症或慢性感染。

用于T细胞中的CAR设计、递送和表达以及制造临床级CAR-T细胞群体的方法是本领域已知的。参见例如，Lee等人,Clin Cancer Res(2012)18(10):2780-90，将其通过引用以其整体特此并入。例如，可以使用逆转录病毒将工程化CAR引入T细胞中，所述逆转录病毒将编码嵌合抗原受体的核酸序列高效且稳定地整合到靶细胞基因组中。示例性方法描述于以下的实施例2中。

本领域已知的其他方法包括但不限于慢病毒转导、基于转座子的系统、直接RNA转染和CRISPR/Cas系统(例如，使用诸如Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、CasX、CasY、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966等的合适的Cas蛋白的I型、II型或III型系统)。

在一些实施方案中，重组腺相关病毒(AAV)载体可以用于递送。产生rAAV颗粒的技术(其中向细胞提供包含要递送的多核苷酸、rep和cap基因的待包装的AAV基因组和辅助病毒功能)在本领域是标准的。rAAV的产生需要以下组分存在于单细胞(在此表示为包装细胞)内：rAAV基因组、分离自rAAV基因组(例如，不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因和辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任一种可以衍生重组病毒的AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh.74。假型化rAAV的产生披露于例如国际专利申请公开号WO 01/83692中。

一旦CAR-T细胞响应于例如自身免疫性疾病抗原而离体扩增，就可以将CAR-T细胞以治疗有效量重新输注到受试者中。

医生可以考虑年龄、体重、受试者的疾病和病症的程度的个体差异来确定要施用的CAR T细胞的精确量。

T细胞疗法的施用可以通过每次输注的总细胞数量或每千克体重的细胞数量(特别是对儿童受试者(例如，患者))定义。随着T细胞在转移后复制并且扩增，所施用的细胞剂量可能与最终的稳态细胞数量不同。在一些实施方案中，包含CAR T细胞的本公开文本的药物组合物可以按104至1010个总细胞的剂量施用。在另一个实施方案中，包含CAR T细胞的本公开文本的药物组合物可以按103至108个细胞/kg体重(包括在该范围内的所有整数值)的剂量施用。

包含CAR T细胞的本公开文本的组合物还可以以这些剂量施用多次。可以通过使用本领域已知的输注技术施用细胞(参见例如，Rosenberg等人,New Engl J Med,(1988)319:1676)。特定受试者的最佳剂量和治疗方案可以由本领域技术人员通过监测受试者的疾病体征并相应地调整治疗来确定。

在一些实施方案中，施用任一种本文体现的组合物用于治疗例如自身免疫性或炎性疾病可以与其他基于细胞(例如，干细胞、抗原呈递细胞、胰岛等)的疗法组合。

本公开文本的组合物可以按本领域已知的方式并且以适合于肠胃外施用于哺乳动物(特别是人)的方式制备，包括单独的治疗有效量的组合物，以及与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂组合。

如本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指任何合适的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括可以含有抗氧化剂、缓冲液和溶质的所有水性和非水性等渗无菌注射溶液，其使组合物与预期接受者的血液等渗；水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含助悬剂和增稠剂、分散介质、抗真菌剂和抗细菌剂、等渗剂和吸收剂等。将理解的是，本公开文本的组合物还可以包含其他补充的生理活性剂。

在与组合物的其他成分相容且对受试者无害的意义上，载体必须是药学上“可接受的”。组合物包括适用于肠胃外施用(包括皮下、肌内、静脉内和皮内施用)的组合物。组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中熟知的任何方法制备。此类方法包括制备用于与CAR-T细胞缔合的载体。通常，通过使任何活性成分与液体载体均匀且密切地缔合来制备组合物。

在一些实施方案中，所述组合物适合于肠胃外施用。在另一个实施方案中，所述组合物适合于静脉内施用。

适合于肠胃外施用的组合物包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂和使组合物与预期受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含助悬剂和增稠剂。

另外的疗法

如上文讨论的，可以将如本文所公开的组合物中的任一种(例如，本文所述的嵌合受体、重组核酸、重组细胞、细胞培养物和药物组合物)作为单一疗法(例如，单药疗法)施用于有需要的受试者。另外地或可替代地，在本公开文本的一些实施方案中，可以将本文所述的嵌合受体、重组核酸、重组细胞、细胞培养物和药物组合物与一种或多种另外的疗法(例如，至少一、二、三、四或五种另外的疗法)组合施用于受试者。待与本公开文本的组合物组合施用的合适疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。其他合适的疗法包括治疗剂，如化学治疗剂、抗癌剂和抗癌疗法。

与一种或多种另外的疗法“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。如本文所用的术语化学疗法涵盖抗癌剂。各种类别的抗癌剂都可以适当地用于本文公开的方法。抗癌剂的非限制性例子包括：烷化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、鬼臼毒素、抗体(例如，单克隆或多克隆的)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(或/>))、激素治疗剂、可溶性受体和其他抗肿瘤药。

本公开文本还考虑了本公开文本的组合物与其他药物和/或加之其他治疗方案或模式(如手术)的组合。当将本公开文本的组合物与已知的治疗剂组合使用时，所述组合可以依次(连续地或被无治疗期打断)或并行或作为混合物施用。例如，在自身免疫性疾病的情况下，治疗包括向受试者施用本文体现的组合物，例如用本文体现的CAR转导的或与其接触的自体T细胞和一种或多种抗炎药和/或治疗剂。抗炎剂包括一种或多种抗体，其与促炎性细胞因子(例如，促炎性细胞因子，如IL-1、TNF、IL-6、GM-CSF和IFN-γ)特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体是抗TNFα、抗IL-6或其组合。在一些实施方案中，可以施用除抗体外的一种或多种减少促炎性细胞因子的药剂(例如，非甾体抗炎药(NSAID))。可以施用抗体与一种或多种减少促炎性细胞因子的药剂的任何组合。

组合治疗还考虑涵盖用本公开文本的组合物的治疗、之后是已知的治疗，或用已知药剂的治疗、之后是用本公开文本的组合物的治疗，例如作为维持疗法。例如，在自身免疫性疾病的治疗中，免疫细胞(如T淋巴细胞和B淋巴细胞)的过度且长期激活以及主要促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF)连同其他介质(如白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)和干扰素γ(IFN-γ))的过表达在类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)和强直性脊柱炎(AS)中的自身免疫性炎症反应的发病机制中发挥核心作用。

非甾体抗炎药(NSAID)、糖皮质激素、改变病情的抗风湿药(DMARD)传统地用于治疗自身免疫性炎性疾病。NSAID和糖皮质激素在减轻疼痛和抑制炎症方面有效，而DMARD具有减少由炎症反应引起的组织和器官损害的能力。最近，随着TNF在疾病的发展中至关重要的发现，对RA和其他自身免疫性疾病的治疗已经发生了革命性的巨变。抗TNF生物制剂(如英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗和培赛利珠单抗(certolizumabpegol))已经显著改善了自身免疫性炎性疾病的控制结局。

非甾体抗炎药具有镇痛、退热和抗炎效果，常用于治疗像关节炎和头痛的病症。NSAID通过阻断环氧合酶(COX)酶缓解疼痛。COX促进前列腺素(一种引起炎症和疼痛的介质)的产生。尽管NSAID具有不同的化学结构，但它们全部都具有相似的治疗效果(例如，抑制自身免疫性炎症反应)。通常，NSAID可以分为两大类：传统的非选择性NSAID和选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂(关于综述，参见P.Li等人,Front Pharmacol(2017)8:460)。

除了抗TNF剂之外，还已经广泛研究并且积极开发出靶向其他促炎性细胞因子或免疫活性分子的生物制剂。例如，阿巴西普(CTLA-4的胞外结构域与IgG1的Fc部分的完全人源化融合蛋白)已经被批准用于对抗TNF疗法反应不充分的RA患者。阿巴西普的主要免疫机制是选择性抑制共刺激途径(CD80和CD86)并且激活T细胞。托珠单抗(一种人源化抗IL-6受体单克隆抗体)被批准用于对DMARD和/或抗TNF生物制剂不耐受的RA患者。此治疗性mAb通过与可溶性形式和膜形式的IL-6受体结合来阻断IL-6的跨膜信号传导。靶向IL-1(阿那白滞素)、Th1免疫反应(IL-12/IL-23，优特克单抗(ustekinumab))、Th17免疫反应(IL-17，苏金单抗(secukinumab))和CD20(利妥昔单抗)的生物药物也已经被批准用于治疗自身免疫性疾病(关于综述，参见P.Li等人,Front Pharmacol(2017)8:460)。

因此，在一些实施方案中，本公开文本的方法包括将本文公开的组合物作为单一疗法(例如，单药疗法)向受试者单独施用。在一些实施方案中，将本公开文本的组合物施用于受试者作为第一疗法与第二疗法组合。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法伴随施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述第二疗法之前施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述第二疗法之后施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法在所述第二疗法之前和/或之后施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。

用于调节细胞的活性的方法

在另一方面，本文提供了用于调节细胞的活性的各种方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供有效量的任一种本文所提供的重组细胞，和(b)使其与选定的配体接触，其中所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并且释放包含所述胞内信号传导结构域的胞内结构域和所述转录调控因子，其中所释放的胞内信号传导结构域和所述转录调控因子调节所述重组细胞的活性。本领域技术人员在阅读本公开文本后将理解的是，所公开的方法可以在体内、离体或体外进行。

可以使用本文提供的方法调节的非限制性示例性细胞活性包括但不限于基因表达、增殖、凋亡、非凋亡性死亡、分化、去分化、迁移、基因产物的分泌、细胞粘附和细胞溶解活性。

在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节细胞的基因产物的表达。在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节细胞中异源基因产物的表达。异源基因产物是通常在天然细胞中见不到的基因产物，例如通常不是由细胞产生的基因产物。例如，可以用包含编码所述异源基因产物的核苷酸序列的核酸对细胞进行基因修饰。

在一些实施方案中，所述异源基因产物是分泌的基因产物。在一些实施方案中，所述异源基因产物是细胞表面基因产物。在一些情况下，所述异源基因产物是胞内基因产物。在一些实施方案中，所释放的转录调控因子同时调节细胞中两种或更多种异源基因产物的表达。

在一些实施方案中，所述细胞中的异源基因产物选自趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生的蛋白质、增殖诱导剂、受体、RNA指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、毒素、毒素衍生的蛋白质、转录调控因子、转录激活因子、转录阻遏因子、翻译调控因子、翻译激活因子、翻译阻遏因子、激活性免疫受体、抗体、凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、工程化T细胞受体、免疫激活因子、免疫抑制剂和抑制性免疫受体。

在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节所述细胞的分化，并且其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。

当使用相同的结合结构域和ICD时，本公开文本的嵌合受体与标准SynNotch受体相比提供更高程度的表达。根据配体/结合结构域对及其亲和力，本公开文本的嵌合受体或铰链-Notch受体与对应的SynNotch受体相比可以提供高约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的表达增强。

另外，本公开文本的嵌合受体可以提供转录调控，所述转录调控响应于T细胞激活的程度，而与配体结合无关。例如，当在T细胞中表达时，本公开文本的一些受体在T细胞被激活时提供的由配体诱导的信号比在T细胞未被激活时提供的由配体诱导的信号更强。这允许在使用中具有额外的灵活性，例如在尽管不存在嵌合受体配体但当被激活时仍期望增强或阻遏T细胞应答的情况下。

系统和试剂盒

本文还提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包含本文提供和描述的嵌合受体、铰链-Notch受体、重组核酸、重组细胞或药物组合物以及用于制备和使用它们的书面说明书。例如，在一些实施方案中，本文提供了包含以下中的一种或多种的系统和/或试剂盒：如本文所述的嵌合受体、如本文所述的铰链-Notch受体、如本文所述的重组核酸、如本文所述的重组细胞、或如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本公开文本的系统和/或试剂盒还包含用于向个体施用所提供的嵌合受体、铰链-Notch受体、重组核酸、重组细胞或药物组合物中的任一种的一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管(包括预填充注射器)。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述另外的治疗剂可以与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于期望目的，例如用于在有需要的个体中调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗健康状况(例如，疾病)。

任何上述系统和试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照多肽、阳性对照多肽、用于体外产生所述嵌合受体多肽的试剂。

在一些实施方案中，系统或试剂盒的组分可以在分开的容器中。在一些其他实施方案中，系统或试剂盒的组分可以组合在单个容器中。

在一些实施方案中，系统或试剂盒可以进一步包含使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在基材如纸或塑料等上。所述说明书可以作为药品说明书存在于试剂盒中、试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或分包装相关联)等。所述说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情形下，实际说明书不存在于所述试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由互联网)获得所述说明书的手段。此实施方案的例子是包括网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。

将本公开文本中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。

不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。将清楚地理解的是，尽管在本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。

本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。

在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。将本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物的披露内容出于所有目的特此通过引用以其整体并入。

不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。将清楚地理解的是，尽管在本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。

实施例

除非另外指示，否则本公开文本的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。在上面引用的文献中对此类技术进行了充分解释。

在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅通过说明的方式提供，并不旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。

实施例1：杂合SynNotch CAR回路的设计

本实施例示出了本文提供的示例性杂合SynNotch CAR的设计和构建。

将含有适当的共刺激结构域、CD3ζ结构域、Gal4-VP64和GS接头的胞内结构域合成为来自Twist的基因片段。通过将靶向CD19、BCMA或ALPPL2的scFv融合到相应的受体支架和胞内尾来构建受体。所有受体都含有用于膜靶向的n末端CD8α信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARP，SEQ ID NO:69)和用于容易用α-flag PE(Biolegend637310)确定表面表达的flag标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO:70)。对于所有原代T细胞实验，将所述受体克隆至含有PGK启动子的修饰的pHR’SIN:CSW载体中。

pHR’SIN:CSW载体也被修饰以制备应答元件质粒。将五个拷贝的Gal4 DNA结合结构域靶序列(GGAGCACTGTCCTCCGAACG，SEQ ID NO:71)克隆到最小pybTATA启动子的5’。应答元件质粒中还包含PGK启动子，该启动子组成性地驱动mCitrine表达以容易鉴定出转导的T细胞。对于所有诱导型BFP载体，经由在Gal4应答元件的3’侧的多克隆位点中的BamHI位点克隆BFP。所有构建体都经由无缝克隆(Clontech#ST0345)克隆。

图1A示出了所有可能的胞内结构域构型的图。图1B示出了杂合SynNotch CAR结构域的详图。此外，不受理论约束，图1C说明了由杂合SynNotch CAR诱导的短期近端和长期转录信号传导的原理。

包含4-1BB共刺激结构域的杂合SynNotch CAR的组分描述于下表1。本文测试的杂合SynNotch CAR的N-JMD包括由典型的CD8a铰链结构域的N末端片段构成的CD8a铰链的截短形式。

表1.4-1BB杂合SynNotch CAR的受体组分描述。

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另外，表1中列出的各组分所来源的参考序列列于下表2中。

表2：4-1BB杂合SynNotch CAR的序列参考。

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另外，包含CD28共刺激结构域的示例性杂合SynNotch CAR描述于下表3中。

表3：CD28杂合SynNotch CAR的受体组分描述

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表3(续)

另外，下表4提供了CD28杂合SynNotch CAR的受体组分的序列参考。

表4.CD28杂合SynNotch CAR的序列参考。

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表4.(续)

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另外，包含41BB和CD28共刺激结构域的示例性杂合SynNotch CAR描述于下表5中。

表5：41BB/CD28杂合SynNotch CAR的受体组分描述

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另外，下表6提供了41BB/CD28杂合SynNotch CAR的受体组分的序列参考。

表6.41BB/CD28杂合SynNotch CAR的序列参考。

表6.(续)

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实施例2：方法

本实施例描述了用于本公开文本的另外的方法。

原代人T细胞分离和培养

在通过阴性选择的单采术(STEMCELL Technologies#15062和15063)后，从匿名供体血液中分离原代CD4+和CD8+T细胞。血液获自太平洋血液中心(Blood Centers of thePacific)(加利福尼亚州旧金山市)，如大学机构审查委员会(University InstitutionalReview Board)批准的。将T细胞冷冻保存在具有20％人AB血清(Valley BiomedicalInc.，#HP1022)和10％ DMSO的RPMI-1640(UCSF细胞培养中心)中。解冻后，对于所有实验，在补充有30单位/mL IL-2(NCI BRB临床前储存库)的由X-VIVO 15(Lonza#04-418Q)、5％人AB血清和10mM中和的N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)组成的人T细胞培养基中培养T细胞。用以相似方式分离的大量CD3+细胞完成体内实验。

人T细胞的慢病毒转导

经由以下方法产生泛嗜性VSV-G假型化慢病毒：将Lenti-X 293T细胞(Clontech#11131D)用pHR’SIN:CSW转基因表达载体和病毒包装质粒pCMVdR8.91和pMD2.G使用MirusTransIT-Lenti(Mirus#MIR 6606)转染。将原代T细胞在同一天解冻，并且在培养24小时后，用人T激活因子CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies#11131D)以1:3的细胞:珠比例进行刺激。在48小时，收获病毒上清液，并且将原代T细胞暴露于病毒，持续24小时。在T细胞刺激后5天，去除Dynabeads，分选T细胞，并且将T细胞扩增直到第10-14天，此时使它们静息并且可以将它们用于体外或体内测定中。用Beckton Dickinson(BD)FACs ARIA II针对测定分选T细胞。

癌细胞系

使用的癌细胞系是K562髓细胞性白血病细胞(ATCC#CCL-243)、A549肺上皮癌细胞(ATCC#CCL-18)和M28人上皮型间皮瘤细胞。将K562、A549和M28用慢病毒转导以稳定表达人CD19。通过用α-CD19 APC(Biolegend#302212)或BV421(Biolegend#302234)给细胞染色来确定CD19水平。另外将A549转导以表达核染剂mkate2。针对转基因的表达分选所有细胞系。

回路诱导测定

为了评估回路诱导，将原代人T细胞用杂合SynNotch CAR和含有UAS促进的BFP基因的应答元件共转导，然后将转导的细胞与K562(具有或不具有CD19)以1:1比例共培养24-72小时。然后将共培养的细胞离心，用流式缓冲液(PBS+2％ FBS)洗涤两次，并且在具有稀释的DRAQ7的流式缓冲液中重悬以评估活力。立即在流式细胞仪上分析洗涤的细胞以评估BFP的表达。

体外激活测定

将表面激活标记物的表达用作CAR或杂合SynNotch CAR信号传导的短期激活的量度。为了确定激活，将转导的细胞与K562(具有或不具有CD19表达)以1:1比例共培养24-72小时。然后将共培养的细胞离心，用流式缓冲液(PBS+2％ FBS)洗涤两次，并且在50uL靶向表面激活标记物CD69、PD-1、CD25和CD39的抗体的预混液中染色。在用流式缓冲液染色后，将细胞洗涤两次并且在具有稀释的DRAQ7的流式缓冲液中重悬以评估活力。立即在流式细胞仪上分析染色的细胞以评估激活标记物的表达。

体外细胞因子分泌测定

为了评估细胞因子分泌，将转导的原代人T细胞与K562(具有或不具有CD19表达)以1:1比例共培养18-24小时(过夜)、48小时(短期)或96小时(长期)。过夜共培养物包含用于终止细胞因子分泌的布雷菲德菌素A(eBioscience#00-4506-51)和莫能菌素(VWR#420701-BL)。对于短期和长期共培养两者，在开始染色前，将布雷菲德菌素A和莫能菌素和第二批K562添加到共培养物中并且孵育另外的6小时。将共培养的细胞用PBS洗涤两次并且在黑暗中在室温下在50uL可固定的NEAR IR(Invitrogen#L34975)中染色20分钟。然后将50uL含有荧光标记的抗CD4或抗CD8抗体的预混液添加到细胞中，并且在黑暗中在室温下孵育20分钟。然后将染色的细胞用流式缓冲液(PBS+2％ FBS)洗涤两次。然后将染色的细胞重悬于100uL的IC Fix缓冲液(eBioscience#00-8222-49)中，并且在黑暗中在4℃下孵育45分钟。然后将固定的细胞用1X透化缓冲液(eBioscience#00-8333-56)洗涤两次。由在1X透化缓冲液中稀释的靶向细胞内细胞因子TNFa、IL-2、IFNy和颗粒酶B的荧光标记抗体制成细胞内细胞因子染色预混液。将洗涤的细胞在黑暗中在4℃下在50uL的该预混液中染色30分钟。将染色的细胞用1X透化缓冲液洗涤两次，并且重悬于100uL流式缓冲液中。立即在流式细胞仪上分析染色的细胞。

体外Incucyte靶标杀伤测定

将表达mkate2的CD19+A549细胞接种在平底96孔板中，并且孵育过夜以允许贴壁。将转导的原代人T细胞离心并且重悬在Jurkat培养基+30U/mL IL-2中；作为RPMI的Jurkat培养基(RPMI-1640培养基+10％ FBS+1％ PenStrep+1X Glutamax)比基于X-VIVO-15的培养基具有更少的荧光。从贴壁的A549细胞去除培养基，并且将转导的人T细胞以1:1比例添加到培养物中。在实验过程中，每2小时使用Incucyte软件拍摄图像(参见相关图的成像总测定时间，该时间在不同条件之间有所不同)。

体外增殖测定

将转导的人T细胞从培养物中取出，并且用稀释的CellTrace Far Red(CTFR)(Invitrogen#C34564)洗涤到PBS中。将细胞在黑暗中在37℃下染色20分钟，然后添加5x具有蛋白质的培养基的染色体积，并且将细胞在黑暗中在37℃下孵育另外的5分钟。将染色的细胞离心，洗涤到人T细胞培养基中。将具有和不具有CD19表达的K562细胞洗涤到人T细胞培养基中，并且以1:1比例添加到CTFR染色的T细胞中。将共培养物孵育5天，并且在孵育中途发生培养基变化。然后将共培养物离心，用流式缓冲液(PBS+2％ FBS)洗涤两次，并且在50μL含有荧光标记的抗CD8抗体的预混液中染色。在用流式缓冲液染色后，将细胞洗涤两次并且在具有稀释的DRAQ7的流式缓冲液中重悬以评估活力。立即在流式细胞仪上分析染色的细胞以评估CTFR染料的稀释度。

体外Nalm6研究

经由尾静脉向NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)(UCSF LARC育种中心)小鼠注射0.5x 106个表达萤光素酶的Nalm 6细胞。肿瘤注射后4天，经由眼眶后注射向荷瘤动物给药杂合SynNotch CAR或CAR转导的T细胞(参见各图细节中每个实验给药的T细胞数量)。在常规时间点使用IVIS Spectrum体内成像系统进行生物发光成像，以评估肿瘤负荷。经由腹膜内注射向动物给药200μL的15mg/mL萤光素，并且在捕获俯卧位和仰卧位图像之前允许其走动12-20分钟。根据生物发光强度调整图像捕获时间，并且将平均辐射度[p/s/cm²/sr]用作肿瘤负荷的衡量指标。在整个实验中，动物饮用水补充有Clavomox(Zoetis#55-101)以防止细菌感染。

体内M28研究

向NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠经由皮下注射给药4x 106个表达CD19配体的M28细胞。肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向荷瘤动物给药3x 106-6x106个杂合SynNotch CAR或CAR转导的T细胞。每周用卡尺测量肿瘤两次，并使用以下公式计算肿瘤体积：(长度x宽度2)/2。在整个实验中，动物饮用水补充有Clavomox以防止细菌感染。

实施例3：杂合SynNotch CAR表达和回路诱导

本实施例证明本文提供的示例性杂合SynNotch CAR能够诱导转录回路的表达并且激活人T细胞。

简言之，将原代人T细胞用抗CD3/抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活并且用表达受体或转录报告物构建体的两种慢病毒构建体转导。在初始T细胞刺激后第5天分选具有4-1BB共刺激结构域(图2A)或CD28共刺激结构域(图2C)的杂合SynNotch CAR，从而纯化受体和报告物双重阳性群体。为了评估回路诱导，在初始T细胞刺激后第14天，将表达具有4-1BB共刺激结构域(图2B)或CD28共刺激结构域(图2D)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞与K562细胞(顶部)或CD19+K562细胞(底部)共培养48小时。随后使用Fortessa X-50(BD)测量诱导型BFP报告基因的转录激活。

如所证明的，具有4-1BB或CD28共刺激结构域的杂合SynNotch CAR的一些细胞内构型展现出对诱导型转录BFP报告元件的抗原非依赖性诱导(例如，对于4-1BB构型1和4，对于CD28构型1、2、4、5和6)。然而，杂合SynNotch CAR的其他细胞内构型展现出BFP报告元件的抗原特异性诱导，仅在存在配体时才表达BFP(例如，对于4-1BB构型2、3、5和6，对于CD28构型3)。该数据集证明了掺入了4-1BB或CD28共刺激结构域的杂合SynNotch CAR回路的特定构型以抗原特异性方式诱导转录的能力。此外，该数据集表明，在存在和不存在配体的两种情况下，胞内结构域的空间构型都会影响受体行为。

实施例4：杂合SynNotch CAR激活标记物表达

本实施例示出了用示例性杂合SynNotch CAR转导的T细胞的激活标记物的表达。

如上所述产生表达具有4-1BB共刺激结构域(图3A)或CD28共刺激结构域(图3B)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。将转导的细胞与K562细胞(灰色)或CD19+K562细胞(浅灰色)共培养48小时。随后使用Fortessa X-50(BD)测量激活标记物CD25、CD39、CD69和PD-1的表达。如所证明的，与采用相同共刺激结构域的CAR对照相比，杂合SynNotch CAR T细胞以相似的平均荧光强度和总体百分比表达激活标记物。另外，杂合SynNotch CAR T细胞仅在配体存在时表达激活标记物。总之，该数据集表明，在与抗原接合后，杂合SynNotch CAR通过其胞内信号传导结构域(4-1BB或CD28和CD3ζ)功能性地诱导信号传导，从而导致激活标记物的表达。

实施例5：杂合SynNotch CAR增殖

本实施例示出了用示例性杂合SynNotch CAR转导的T细胞的增殖。

如上所述产生表达具有4-1BB共刺激结构域或CD28共刺激结构域的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。将转导的细胞用Cell Trace Far Red(CTFR)染色，然后与K562细胞(灰色)或CD19+K562细胞(蓝色或红色)共培养5天。随后使用Fortessa X-50(BD)测量CTFR染料的稀释度。

如图4所示，当与配体接合时，杂合SynNotch CAR以与单独的CAR相似的速率诱导T细胞增殖。此外，当抗原存在时，杂合SynNotch CAR T细胞特异性地广泛增殖，这表明杂合SynNotch CAR T细胞的增殖应答是抗原特异性的。总之，该数据集表明，在与抗原接合后，杂合SynNotch CAR通过其胞内信号传导结构域(4-1BB或CD28和CD3ζ)功能性地诱导短期信号传导级联，从而导致T细胞的增殖。

实施例6：杂合SynNotch CAR细胞因子分泌

本实施例示出了用示例性杂合SynNotch CAR转导的T细胞的细胞因子分泌。

如上产生表达具有4-1BB共刺激结构域(图5A)或CD28共刺激结构域(图5B)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。将转导的细胞与K562细胞(灰色)或CD19+K562细胞(蓝色或红色)共培养。在48小时后，将布雷菲德菌素A、莫能菌素和第二批K562细胞(具有或不具有CD19+表达)添加到共培养物中。将共培养物再孵育6小时，然后使用Fortessa X50(BD)评估转导的细胞的细胞因子颗粒酶B、IFNy、IL-2和TNFα的细胞内表达。如所证明的，与单独的CAR相比，杂合SynNotch CAR诱导更低的细胞因子(颗粒酶B除外)表达。该数据集表明，由杂合SynNotch CAR的共刺激结构域和CD3ζ结构域诱导的信号传导在类型或机制、力度、强度或时间长度方面与CAR不同。

实施例7：杂合SynNotch CAR靶标杀伤

本实施例示出了示例性杂合SynNotch CAR的细胞杀伤活性。

如上所述产生表达具有4-1BB共刺激结构域(图6A)或CD28共刺激结构域(图6B)的抗CD19受体和BFP报告物的T细胞。允许表达CD19配体和核染剂mkate2的A549细胞在96孔平底板上贴壁24小时，然后以1:1比例添加转导的T细胞。将板在Incucyte中孵育，Incucyte每2小时捕获一次板图像和荧光，持续5天。使用成像软件计算每个时间点处培养物中的A549CD19+mkate2+细胞的数量。对于每个实验组，将A549细胞计数相对于铰链Notch实验组的细胞计数归一化。如所证明的，杂合SynNotch CAR T细胞以与CAR T细胞相似的速率杀伤靶细胞。这表明，在这种体外环境中，杂合SynNotch CAR诱导T细胞激活和足以在多天的时间段内引起靶细胞杀伤的细胞毒性程序。

实施例8：杂合SynNotch CAR体内功效

本实施例示出了本文提供的示例性杂合SynNotch CAR的体内功效。

图7A描述了实验时间线。向NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠静脉内给药0.5x 106个Nalm6-Luc-GFP肿瘤细胞。如上所述，将大量CD3+T细胞用具有CD3ζ-Gal4VP64-CD28胞内结构域的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物共转导。简言之，在肿瘤注射后4天，经由眼眶后注射向动物给药0.5x 106个转导的CD3+T细胞。图7B示出了使用IVIS Spectrum对经由分泌萤光素酶的肿瘤细胞的生物发光成像测量的肿瘤负荷并且图7C示出了实验小鼠的存活曲线。该数据证明，与具有CD28共刺激结构域的CAR T细胞类似，杂合SynNotch CAR T细胞在体内可有效清除Nalm6肿瘤。如通过生物发光证明的，Nalm6肿瘤负荷最初在杂合SynNotch CAR和CAR T细胞治疗组两者中均增长，然而在肿瘤注射后大约第10天肿瘤负荷降低，并且最终在两个治疗组中清除。如存活曲线所示，杂合SynNotch CAR和CAR组中的动物存活到研究结束，而被给药未转导的T细胞的动物在肿瘤注射后第18-28天之间死于疾病。这些数据表明，杂合SynNotch CAR T细胞可有效控制并且清除体内肿瘤负荷。

类似地，图10A示出了实验时间线的描述。向NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下给药4x106个表达CD19配体的M28肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用具有如图10B所指示的ICD的抗CD19杂合SynNotch CAR和如上所述的BFP报告物共转导。简言之，在肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向动物给药6x 106个转导的CD3+T细胞。图10B示出了每周经由卡尺测量评估的肿瘤体积。这些数据表明，与PBS阴性对照相比，靶向CD19的杂合SynNotch CAR T细胞(特别是包含trunc41BB结构域的那些)可以诱导肿瘤耗竭。

此外，图14A示出了实验时间线的描述。向NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下给药4x 106个表达CD19的M28肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用具有如图14B所指示的ICD的抗CD19杂合SynNotch CAR和如上所述的BFP报告物共转导。简言之，在肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向动物给药3x 10⁶个转导的CD3+T细胞。图14B示出了每周经由卡尺测量评估的肿瘤体积。这些数据表明，第三代靶向CD19的杂合SynNotch CAR T细胞可以诱导与第二代靶向CD19的CAR相似的肿瘤耗竭。

最终，图16示出了靶向ALPPL2的杂合SynNotch CAR体内功效。如图14所述向NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下给药4x 106个M28肿瘤细胞。将大量CD3+T细胞用抗ALPPL2 CAR或具有如图所指示的ICD的抗ALPPL2杂合SynNotch CAR和如图2所述的BFP报告物共转导。在肿瘤注射后7天，经由眼眶后注射向动物给药3x 106个转导的CD3+T细胞。每周经由卡尺测量来评估肿瘤体积。这些数据表明，第三代靶向ALPPL2的杂合SynNotch CAR T细胞可以诱导与第二代靶向ALPPL2的CAR相似的肿瘤耗竭。

实施例9：最小化的4-1BB或CD28变体改进NF-kB信号传导并且降低噪声

本实施例示出了由4-1BB变体和CD28变体赋予的改进的NF-kB信号传导和降低的噪声。

图8A示出了野生型4-1BB和4-1BB变体的比对，其描绘了用于产生“noSTS”和“trunc”4-1BB共刺激结构域而缺失的氨基酸。图9A示出了野生型4-1BB和4-1BB变体的比对，其描绘了用于产生“trunc41BB”、“min41BB”和“trunc41BBtrunc41BB”共刺激结构域而缺失的氨基酸。图11A和图12A示出了野生型CD28和CD28变体的比对，其描绘了用于产生“noSTS”、“trunc”、“CD28ΔTPRRP”、“truncCD28ΔTPRRP”和“fullytruncCD28”CD28共刺激结构域而缺失的氨基酸。

将T细胞共转导以表达如上所述的具有4-1BB变体或CD28变体的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物。如上所述评估回路诱导。图8B、图9B、图11B和图12B证明，具有4-1BB变体或CD28变体的杂合SynNotch CAR在诱导后以与具有野生型4-1BB的杂合SynNotch CAR相似的速率在T细胞表面上表达。图8C、图9C、图11C和图12C证明，具有“noSTS”4-1BB、“trunc”4-1BB、“min41BB”、“trunc41bbtrunc41bb”、“noSTS”CD28、“trunc”CD28和“CD28ΔTPRRP”、“truncCD28ΔTPRRP”和“fullytruncCD28”的杂合SynNotch CAR具有较少的抗原非依赖性转录回路诱导，同时维持诱导型转录回路的抗原依赖性诱导。该数据集表明，可以通过修饰4-1BB或CD28共刺激结构域来减轻这些受体的抗原非依赖性转录调控，而不降低受体的抗原依赖性活性。

将Jurkat细胞系转导以在NF-κB的共同启动子下表达mCherry报告物。然后将该NF-κB报告细胞系用抗CD19杂合SynNotch CAR转导，并且与表达CD19的K562细胞共培养。经由流式细胞术在共培养后24、48和72小时评估mCherry表达，其作为NF-κB活性的代替物。图8D和图9D表明，在4-1BB结构域被修饰以去除STS(“noSTS”)、所述结构域的前17个氨基酸(“trunc”)或所述结构域的前17个氨基酸和所述结构域的后13个氨基酸(“min41BB”)时，由4-1BB共刺激结构域诱导的NF-κB信号传导的强度不受影响。这些数据结合回路诱导数据表明，对4-1BB共刺激结构域的修饰可以优化具有抗原非依赖性活性的杂合SynNotch CAR，从而导致能够实现抗原依赖性转录回路诱导和T细胞信号传导两者的改进设计。

下表8提供了上述杂合SynNotch CAR的表达和T细胞激活活性的总结。

表8.测试结果描述。

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实施例10：“第三代”变体

本实施例示出了由变体赋予的降低的噪声，所述变体包含附加到trunc41BB共刺激结构域的C末端的CD28信号传导基序中的一个。

图13A示出了野生型4-1BB和CD28和变体的比对，其描绘了用于产生“trunc41BBPYAP”、“trunc41BB_YMFM”、“trunc41BB YMFMTPRRP”和“trunc41BB AAYRS”共刺激结构域而缺失和/或添加的氨基酸。

将T细胞共转导以表达如上所述的具有“第三代”变体的抗CD19杂合SynNotch CAR和BFP报告物。如上所述评估回路诱导。图13B证明，具有附加到trunc41BB共刺激结构域的C末端的CD28信号传导基序中的一个的杂合SynNotch CAR在诱导后以与具有野生型4-1BB的杂合SynNotch CAR相似的水平在T细胞表面上表达。图13C证明了具有“trunc41BB PYAP”、“trunc41BB_YMFM”、“trunc41BB YMFMTPRRP”和“trunc41BB AAYRS”的杂合SynNotch CAR具有低的抗原非依赖性转录回路诱导并且维持诱导型转录回路的抗原依赖性诱导。这些数据表明，这些受体的抗原非依赖性和抗原依赖性转录调控不因添加CD28共刺激结构域的信号传导基序而受影响。

下表9提供了上述杂合SynNotch CAR的表达和T细胞激活活性的总结。

表9.测试结果描述。

实施例10：靶向BCMA和ALPPL2的变体

将T细胞共转导以表达如上所述的具有41BB共刺激结构域变体的抗BCMA或抗ALPPL2杂合SynNotch CAR和BFP报告物。如上所述评估回路诱导。图15A证明了抗BCMA和抗ALPPLS杂合SynNotch CAR在诱导后在T细胞表面上的表达。图15B证明了具有“trunc41BB”、“trunc41BB PYAP”的抗BCMA和抗ALPPLS杂合SynNotch CAR具有较少的抗原非依赖性转录回路诱导，同时维持诱导型转录回路的抗原依赖性诱导。该数据集表明，杂合SynNotch CAR支架可以与靶向其他抗原的scFv融合，并且维持回路的抗原依赖性转录调控和T细胞激活。

下表10提供了上述杂合SynNotch CAR的表达和T细胞激活活性的总结。

表10.测试结果描述。

序列表

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Claims (83)

1.一种嵌合受体，所述嵌合受体从N末端到C末端包含：

a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；

b)连接多肽；

c)含有一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域(TMD)；以及

d)胞内结构域(ICD)，所述胞内结构域(ICD)以任何顺序包含：

(i)胞内信号传导结构域(SD)，其含有至少一个源自信号传导分子的共刺激结构域和激活结构域，以及

(ii)转录调控因子，并且

其中所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在所述ICD与所述连接多肽之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，

其中所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合通过所述胞内SD诱导近端信号传导级联，并且

其中所述嵌合受体不包含Notch受体的LIN-12-Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。

2.根据权利要求1所述的嵌合受体，其中所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。

3.根据权利要求2所述的嵌合受体，其中所述细胞是致病细胞。

4.根据权利要求3所述的嵌合受体，其中所述细胞是人细胞。

5.根据权利要求4所述的嵌合受体，其中所述人细胞是肿瘤细胞。

6.根据权利要求4所述的嵌合受体，其中所述人细胞是终末分化细胞。

7.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述配体包括蛋白质或碳水化合物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述配体选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC-1、MAGE、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和信号调节蛋白α(SIRPα)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述配体选自细胞表面受体、粘附蛋白、整合素、粘蛋白、凝集素、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。

10.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述配体是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。

11.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述胞外配体结合结构域包含受体的配体结合部分。

12.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体、微型抗体、F(ab')2片段、F(ab)v片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)及其功能片段。

13.根据权利要求12所述的嵌合受体，其中所述抗原结合部分包括scFv。

14.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述抗原结合部分与选自以下的肿瘤相关抗原特异性结合：CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、ALPPL2、CD123、CD171、CD179a、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Rα、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SIRPα、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet和Axl。

15.根据权利要求14所述的嵌合受体，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、CEA、HER2、MUC1、CD20、ALPPL2、SIRPα或EGFR。

16.根据权利要求15所述的嵌合受体，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、HER2或ALPPL2。

17.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述连接多肽包括铰链结构域。

18.根据权利要求17所述的嵌合受体，其中所述铰链结构域能够经由分子间二硫键键合促进所述嵌合多肽的寡聚体形成。

19.根据权利要求17所述的嵌合受体，其中所述铰链结构域源自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域、IgG1铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域或其任一种的功能变体。

20.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述连接多肽源自下组，该组选自：CD8α铰链结构域或其功能变体、CD28铰链结构域或其功能变体、OX40铰链结构域或其功能变体和IgG4铰链结构域或其功能变体。

21.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述连接多肽源自CD8α铰链结构域或其功能变体。

22.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述连接多肽源自CD28铰链结构域或其功能变体。

23.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述连接多肽包含与SEQ IDNO:3具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

24.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点包括γ分泌酶切割位点。

25.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述TMD包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

26.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，所述嵌合受体进一步包含位于所述TMD与所述ICD之间的停止转移序列(STS)。

27.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述停止转移序列包含与SEQID NO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

28.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述信号传导分子包括1类或3类人膜蛋白。

29.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述信号传导分子选自CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H、BTLA、B71、B7H1、CD226、CRTAM、TIGIT、CD96、TIM1、TIM2、TIM3、TIM4、CD2、SLAM、2B4、Ly108、CD84、Ly9、CRACC、BTN1、BTN2、BTN3、LAIR1、LAG3、CD160、4-1BB、OX40、CD27、GITR、CD30、TNFR1、TNFR2、HVEM、LT_R、DR3、DCR3、FAS、CD40、RANK、OPG、TRAILR1、TACI、BAFFR、BCMA、TWEAKR、EDAR、XEDAR、RELT、DR6、TROY、NGFR、CD22、SIGLEC-3、SIGLEC-5、SIGLEC-7、KLRG1、NKR-P1A、ILT2、KIR2DL1、KIR3DL1、CD94-NKG2A、CD300b、CD300e、TREM1、TREM2、ILT7、ILT3、ILT4、TLT-1、CD200R、CD300a、CD300f、DC-SIGN、B7-2、变应素-1、LAT、BLNK、LAYN、SLP76、EMB-LMP1、HIV-NEF、HVS-TIP、HVS-ORF5和HVS-stpC。

30.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述信号传导分子选自OX40、ICOS、4-1BB、CTLA4、CD28、CD30、CD2、CD27和CD226。

31.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述激活结构域包含一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。

32.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述一个或多个ITAM源自CD3ζ、CD3σ、CD3/和CD3ε。

33.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述一个或多个ITAM与CD3ζITAM具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

34.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述转录调控因子包括转录激活因子或转录阻遏因子。

35.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，其中所述转录调控因子进一步包含源自选自Gal4、tetR、ZFHD1和HAP1的蛋白质的核定位序列(NLS)，并且其中所述转录调控因子包含源自选自VP64、VP65、KRAB和VP16的蛋白质的反式激活结构域。

36.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，所述嵌合受体包含与SEQ ID NO:15-32、34-44、47-48、54-58和63-68中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

37.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体，所述嵌合受体进一步包含信号序列、可检测标记、肿瘤特异性切割位点、疾病特异性切割位点或其组合。

38.一种重组核酸，所述重组核酸包含编码根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体的核苷酸序列。

39.根据权利要求38所述的重组核酸，其中将所述核苷酸序列掺入表达盒或表达载体中。

40.根据权利要求39所述的重组核酸，其中所述表达载体是病毒载体。

41.根据权利要求40所述的重组核酸，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。

42.一种重组细胞，所述重组细胞包含根据前述权利要求中任一项所述的嵌合受体和/或重组核酸。

43.根据权利要求42所述的重组细胞，其中所述重组细胞是真核细胞。

44.根据权利要求43所述的重组细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

45.根据权利要求44所述的重组细胞，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞或干细胞。

46.根据权利要求45所述的重组细胞，其中所述免疫细胞是B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞或其他T细胞。

47.根据前述权利要求中任一项所述的重组细胞，所述重组细胞包含：

a)根据权利要求1至37中任一项所述的第一嵌合受体和第二嵌合受体；和/或

b)根据权利要求38至41中任一项所述的第一核酸和第二核酸；

其中所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体不具有相同的序列，和/或所述第一核酸或所述第二核酸不具有相同的序列。

48.根据权利要求47所述的重组细胞，其中所述第一嵌合受体调节所述第二嵌合受体的表达和/或活性。

49.根据权利要求42-48中任一项所述的重组细胞，所述重组细胞进一步包含可操作地连接至启动子的编码蛋白质的表达盒，其中所述蛋白质的表达受所述转录调控因子的调节。

50.根据权利要求49所述的重组细胞，其中所述蛋白质对于所述细胞是异源的。

51.根据权利要求49所述的重组细胞，其中所述启动子是酵母GAL4启动子。

52.根据权利要求49-51中任一项所述的重组细胞，其中所述蛋白质是细胞因子、细胞毒素、趋化因子、免疫调节剂、促凋亡因子、抗凋亡因子、激素、分化因子、去分化因子、免疫细胞受体(例如，TCR或CAR)或报告物。

53.一种用于制备根据权利要求42至52中任一项所述的重组细胞的方法，所述方法包括：

a)提供能够表达蛋白质的细胞；

b)使所提供的细胞与根据权利要求38至41中任一项所述的重组核酸接触，使所述重组核酸进入所提供的细胞中。

54.根据权利要求53所述的方法，其中通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞，并且离体接触所述细胞。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。

56.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体以及以下中的一种或多种：

a)根据权利要求38-41中任一项所述的重组核酸；和

b)根据权利要求42-52中任一项所述的重组细胞。

57.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求38至41中任一项所述的重组核酸以及药学上可接受的载体。

58.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。

59.一种用于在有需要的个体中调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗健康状况的系统，所述系统包含以下中的一种或多种：

a)根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合受体；

b)根据权利要求38至41中任一项所述的重组核酸；

c)根据权利要求42至52中任一项所述的重组细胞；以及

d)根据权利要求56至58中任一项所述的药物组合物。

60.一种用于调节细胞的活性的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求42至52中任一项所述的重组细胞；以及

b)使所述重组细胞与选定的配体接触，其中所选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并释放所述转录调控因子，

其中所释放的转录调控因子调节所述重组细胞的活性。

61.根据权利要求60所述的方法，所述接触在体内、离体或体外进行。

62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中待调节的细胞的活性选自：选定的基因的表达、增殖、凋亡、非凋亡性死亡、分化、去分化、迁移、分子的分泌、细胞粘附和细胞溶解活性。

63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所释放的转录调控因子调节所述细胞的基因产物的表达。

64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所释放的转录调控因子调节异源基因产物的表达。

65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞的基因产物选自趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生的蛋白质、增殖诱导剂、受体、RNA指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、T细胞受体、毒素、毒素衍生的蛋白质、转录调控因子、转录激活因子、转录阻遏因子、翻译调控因子、翻译激活因子、翻译阻遏因子、激活性免疫受体、抗体、凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、工程化T细胞受体、免疫激活因子、免疫抑制剂和抑制性免疫受体。

66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所释放的转录调控因子调节所述细胞的分化，并且其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。

67.一种用于抑制个体中靶细胞的活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效数量的根据权利要求42至52中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体中所述靶细胞的活性。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述靶细胞是致病细胞。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述致病细胞是癌细胞。

70.根据权利要求63至69中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是急性骨髓瘤白血病细胞、间变性淋巴瘤细胞、星形细胞瘤细胞、B细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周T细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞、间皮瘤细胞或肉瘤细胞。

71.一种用于治疗有需要的个体的健康状况的方法，所述方法包括向所述个体施用包含有效数量的根据权利要求42至52中任一项所述的重组细胞的第一疗法，其中所述重组细胞治疗所述个体的健康状况。

72.根据权利要求71所述的方法，所述方法进一步包括向所述个体施用第二疗法。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法和毒素疗法。

74.根据权利要求71-73中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法在同一组合物中一起施用或在分开的组合物中施用。

75.根据权利要求74所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法同时施用。

76.根据权利要求71-75中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。

77.根据权利要求76所述的方法，其中将所述第一疗法在所述第二疗法之前施用。

78.根据权利要求76所述的方法，其中将所述第一疗法在所述第二疗法之后施用。

79.根据权利要求76所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。

80.以下中的一种或多种用于治疗健康状况的用途：

a)根据权利要求1至37中任一项所述的嵌合受体；

b)根据权利要求38至41中任一项所述的重组核酸；

c)根据权利要求42至52中任一项所述的重组细胞；以及

d)根据权利要求56至58中任一项所述的组合物。

81.根据前述权利要求中任一项所述的本发明用于制造治疗健康状况的药剂的用途。

82.根据权利要求80或81所述的用途，其中所述健康状况是癌症。

83.根据权利要求82所述的用途，其中所述癌症是实体瘤、软组织肿瘤或转移性病变。