CN117587102A - 一种具有智能形态重构的核壳结构的dna纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有智能形态重构的核壳结构的dna纳米探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及miRNA检测技术领域,特别是涉及一种具有智能形态重构的核壳结构的DNA纳米探针及其制备方法和应用。本发明提供的DNA纳米探针的外壳DNA四面体与中间层DNA三链体是通过修饰了二硫键的DNA序列连接,可由谷胱甘肽GSH诱导还原刺激响应;DNA三链体的脱氧核酶部分设计为miRNA‑21互补结合激活,恢复脱氧核酶链催化活性中心,切割底物,释放可检测的荧光信号;以胆固醇核心为内层疏水部分,与细胞膜接触时,DNA纳米探针发生智能形态重构,表现为疏水部分在外层和亲水部分在内层,进一步通过胆固醇依赖的摄取方式进入细胞。因此,该DNA纳米探针可用于体外和活细胞内miRNA的检测与成像。
Description
技术领域
本发明涉及miRNA检测技术领域,特别是涉及一种具有智能形态重构的核壳结构的DNA纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
miRNA是一类内源性非编码RNA,参与调节基因表达和多种细胞活动,其异常表达水平通常与包括癌症在内的多种疾病的发生有关。因此将miRNA作为肿瘤诊断和预后评估的有价值的生物标志物,开发便捷的探针,用于体外灵敏及特异性检测miRNA,特别是用于miRNA的细胞内成像成为当今生物技术与医药领域研究者的关注热点。
然而,miRNA尺寸小、丰度低以及同源性高等特征,使得miRNA细胞内成像变得困难。为了解决这个问题,开发了不同的扩增策略用于开发灵敏的检测系统,例如聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)以及基于切口/聚合的链置换反应。此外,不同的无机材料也参与信号的放大过程,如量子点,金纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒等。但是繁琐的操作步骤、严格的反应温度要求以及无机材料的生物安全问题限制了它们的广泛适用性,甚至无法实现在活细胞内成像。
DNA纳米材料因其优异的生物相容性,易修饰和功能化,高度可编程性满足了各种生物医学应用的需求,在细胞甚至活体成像和癌症靶向治疗等领域引起越来越多的关注。脱氧核酶是结合域和催化活性核心组成的一类基于DNA的生物催化剂,可被设计用于金属离子或活性生物分子的检测,优异的分析性格能使脱氧核酶具有广泛的应用前景。然而,易被内源性核酸酶降解以及负电荷性质带来的低细胞摄取成为重要挑战。将脱氧核酶与转染试剂和无机纳米材料结合来解决这一问题通常使程序复杂化和潜在的生物毒性。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种具有智能形态重构的核壳结构的DNA纳米探针及其制备方法和应用。本发明提供的DNA纳米探针具有无细胞毒性、耐核酸酶降解和无需转染试剂即可实现检测的优势。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明提供了一种具有核壳结构的DNA纳米探针,所述DNA纳米探针包括多个DNA四面体和多个DNA三链体;
所述DNA四面体是由三条线性序列和一个环状序列通过部分序列碱基互补配对形成的四面体结构;所述三条线性序列为Ta、Tb和S-Tc;所述Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述S-Tc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述S-Tc的第51位碱基T和第52位碱基T之间进行了二硫键修饰;所述环状序列由成环链和封口模板链制备得到;所述成环链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述封口模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
所述DNA三链体是由序列S-BF、序列Chol-L和序列E通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构;所述序列S-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,所述序列S-BF的第19位碱基T进行了猝灭基团修饰,第41位碱基A进行了RNA修饰,3'端进行了荧光基团修饰;所述序列Chol-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述序列Chol-L的3'端进行了疏水基团修饰;所述序列E的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
每个DNA四面体通过顶点处的回文碱基序列以碱基互补配对的方式连接形成外壳;所述DNA三链体为内核;DNA四面体的部分序列与DNA三链体的部分序列以碱基互补配对方式连接。
优选的,所述疏水基团包括胆固醇。
优选的,所述荧光基团包括FAM;所述猝灭基团包括BHQ1。
优选的,所述DNA四面体和DNA三链体的摩尔比为1:1。
优选的,所述Ta、Tb、S-Tc和环状序列的摩尔比为1:1:1:1;所述成环链和封口模板链的摩尔比为1:1。
优选的,所述序列S-BF、序列Chol-L和序列E的摩尔比为1:1:1。
本发明提供了上述技术方案所述DNA纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
将所述成环链和封口模板链混合,依次进行加热变性、降温复性、DNA连接酶连接和核酸外切酶酶切,得到所述环状序列;所述核酸外切酶包括核酸外切酶I和核酸外切酶III;
将所述Ta、Tb、S-Tc和所述环状序列混合,进行第一加热变性和降温复性,得到所述DNA四面体;
将所述序列S-BF和序列Chol-L混合,进行第二加热变性和降温复性,得到连接产物;
将所述连接产物和所述序列E混合,得到所述DNA三链体;
将所述DNA四面体和DNA三链体混合,静置孵育,得到所述DNA纳米探针。
优选的,所述第一加热变性和所述第二加热变性的温度均为90℃,时间均为5min。
本发明提供了上述技术方案所述DNA纳米探针或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的DNA纳米探针在制备检测miRNA-21试剂中的应用。
优选的,所述检测miRNA-21试剂包括体内和/或体外成像试剂。
本发明提供了一种具有智能形态重构的DNA纳米探针的构建方法,包括以下步骤:
提供具有发卡结构的脱氧核酶序列,并在末端连接能识别待检测miRNA的序列;
构建DNA四面体;所述DNA四面体的三个顶点具有延伸的碱基序列,两个顶点延伸的碱基序列为回文碱基序列,第三个顶点延伸的碱基序列和所述脱氧核酶的部分序列互补配对;所述DNA四面体的序列中含有二硫键修饰;
构建DNA三链体;所述DNA三链体是由底物链分别与所述脱氧核酶序列和胆固醇修饰的连接链通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构;所述底物链为发卡结构,并在互补配对位置分别修饰有荧光基团和猝灭基团,且具有脱氧核酶酶切位点;
将所述DNA四面体和DNA三链体在缓冲液中进行自组装,得到以DNA四面体为外壳,DNA三链体为中间层,胆固醇为内层的DNA纳米探针。
有益效果:
本发明提供的DNA纳米探针具有以下优点:
1、高效自组装核壳结构。本发明涉及的核壳结构DNA纳米材料以DNA四面体为外壳,DNA三链体响应区为中间层,疏水性基团(胆固醇)为内层。其中每个DNA四面体有两个顶点处具有回文碱基序列可增强DNA四面体之间的聚集,且一个顶点末端延长的碱基序列用于与中间层的连接;内层胆固醇修饰的DNA可作为两亲性分子(DNA为亲水部分,胆固醇为疏水部分),在水溶液中的固有性质可介导自组装的发生。
2、无细胞毒性。本发明涉及的DNA纳米材料原材料均为DNA,具有良好的生物相容性。
3、耐核酸酶降解。外层的DNA四面体外壳可增强DNA纳米材料的耐核酸酶降解。
4、形态重构自主性细胞内化,无需转染试剂。整个DNA纳米材料外层为亲水部分,内层为疏水部分,外壳DNA四面体轴向旋转激活外壳形态重构,驱使内部胆固醇暴露,从而促进胆固醇依赖的细胞内化,无需借助任何转染试剂。
5、双重刺激响应。外壳DNA四面体与中间层DNA三链体是通过修饰了二硫键的DNA序列连接,可由谷胱甘肽GSH诱导还原刺激响应;DNA三链体的脱氧核酶部分设计为miRNA-21互补结合激活,恢复脱氧核酶链催化活性中心,切割底物导致非活性状态下序列牵引临近的荧光基团与荧光猝灭基团分离,释放可检测的荧光信号,可用于体外和活细胞内miRNA的检测与成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为DNA四面体的碱基互补配对示意图;
图2为DNA纳米探针制备流程图;
图3为DNA纳米探针结构放大示意图;
图4为GSH与miRNA双重刺激响应释放荧光信号示意图;
图5为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳验证Tet逐步组装结果;
图6为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳验证Chol-E/S逐步组装结果;
图7为ES-NC的原子力显微镜图像及分析结果;
图8和图9为MCF-7,HeLa和L02细胞对F-ES-NC,F-ES-Tet,F-Chol-E/S和F-E/S的摄取能力验证结果;
图10为二氧化硅脂质双分子层膜模型验证ES-NC细胞内化过程示意图及结果;
图11为GSH触发ES-NC外层DNA四面体Tet解聚验证结果;
图12为GSH和miRNA-21双重刺激触发ES-NC的荧光信号放大验证结果。
具体实施方式
本发明提供了一种具有智能形态重构的DNA纳米探针的构建方法,包括以下步骤:
提供具有发卡结构的脱氧核酶序列,并在末端连接能识别待检测miRNA的序列;
构建DNA四面体;所述DNA四面体的三个顶点具有延伸的碱基序列,两个顶点延伸的碱基序列为回文碱基序列,第三个顶点延伸的碱基序列和所述脱氧核酶的部分序列互补配对;所述DNA四面体的序列中含有二硫键修饰;
构建DNA三链体;所述DNA三链体是由底物链分别与所述脱氧核酶序列和胆固醇修饰的连接链通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构;所述底物链为发卡结构,并在互补配对位置分别修饰有荧光基团和猝灭基团,且具有脱氧核酶酶切位点;
将所述DNA四面体和DNA三链体在缓冲液中进行自组装,得到以DNA四面体为外壳,DNA三链体为中间层,胆固醇为内层的DNA纳米探针。
本发明构建DNA纳米探针是一种具有智能形态重构的双重刺激响应型的DNA纳米探针。基于碱基互补配度原则,构建两个顶点延伸的碱基序列为回文碱基序列,第三个顶点延伸的碱基序列和所述脱氧核酶的部分序列互补配对的DNA四面体,可实现跨膜运输和增强稳定性。其次设计了具有靶标结合域的脱氧核酶链,修饰了荧光基团与荧光猝灭团且具有酶切位点的底物链和胆固醇修饰的DNA短链三条DNA序列组装得到的DNA三链体。通过碱基互补配对原则以及胆固醇修饰DNA两亲性分子的自组装性能,组装得到以DNA四面体为外壳、DNA三链体响应区为中间层及疏水性胆固醇为内层的具有核壳结构的DNA材料。以胆固醇核心为内层疏水部分,与细胞膜接触时,DNA纳米探针发生智能形态重构,表现为疏水部分在外层和亲水部分在内层,进一步通过胆固醇依赖的摄取方式进入细胞。以癌细胞中过量的谷胱甘肽(GSH)为第一阶段刺激,GSH还原DNA四面体上的二硫键导致DNA四面体外壳的解离,暴露出miRNA识别区域。以待检测miRNA为靶标作为第二阶段刺激,待检测miRNA与探针的结合,恢复脱氧核酶链催化活性中心,切割底物导致非活性状态下序列牵引临近的荧光基团与荧光猝灭基团分离,释放可检测的荧光信号(图4),可用于体外和活细胞内miRNA的检测与成像。
基于上述优势,本发明提供了一种具有核壳结构的DNA纳米探针,所述DNA纳米探针包括多个DNA四面体和多个DNA三链体;
所述DNA四面体是由三条线性序列和一个环状序列通过部分序列碱基互补配对形成的四面体结构(见图1);所述三条线性序列为Ta、Tb和S-Tc;
所述Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,具体如下:5'-TGCATTGTTC ATCGCATGCGTTTCCTCGTCACTCCTGATTCAGCAGTGCACATCG-3';
所述Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,具体如下:5'-TGCATTGACTCCACTTTCCACTTACGCATGCGATGAACTTATAGCACGTCCATCG-3';
所述S-Tc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,具体如下:5'-TCAGGAGTGACGAGGTTGTGGAAAGTGGAGTCTTAGATATATCACATCGTTTACGTTGCATTACGAGTC-3',所述S-Tc的第51位碱基T和第52位碱基T之间进行了二硫键修饰(即通过二硫键连接第51位碱基T和第52位碱基T),修饰后的序列为:5'-TCAGGAGTGACGAGGTTGTGGAAAGTGGAGTCTTAGATATATCACATCGTT(-S-S-)TACGTTGCATTACGAGTC-3';
所述环状序列由成环链(p-Td)和封口模板链(Td-Temp)制备得到;所述成环链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,具体如下:5'-CGATGTGATATATCTTTCGATGGACGTGCTATTTCGATGTGCACTGCTGTT-3',所述所述成环链的5'进行了磷酸化修饰;所述封口模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,具体如下:5'-TATATCACATCGAACAGCAGTGCA-3';
所述DNA三链体是由序列S-BF、序列Chol-L和序列E通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构(见图2);
所述序列S-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,具体如下:5'-CAGATCACACTCGCTACGTCTGCTCGTTTTCTCTATCTATAGGAAGTACCGCCGCAGATGTTTACGAGCAGA-3',所述序列S-BF的第19位碱基T进行了猝灭基团修饰,第41位碱基A进行了RNA修饰,3'端进行了荧光基团修饰;所述荧光基团优选包括FAM;所述猝灭基团优选包括BHQ1,修饰后的序列优选为:5'-CAGATCACACTCGCTACG(BHQ1dT)CTGCTCGTTTTCTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCAGATGTTTACGAGCAGA-FAM-3';本发明所述RNA修饰优选由上海生工合成,所述RNA修饰是将腺嘌呤脱氧核苷酸(A)替换为腺嘌呤核糖核苷酸(rA),从而能被所述序列E特异性切割;
所述序列Chol-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,具体如下:5'-CGTAGCGAGTGTGATCTGTTTTT-3',所述序列Chol-L的3'端进行了疏水基团修饰,所述疏水基团优选包括胆固醇;
所述序列E的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,具体如下:5'-CTGCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAGTCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGTTGAAGACTCTATCTTTGACTCGTAATGCAACGTA-3';
每个DNA四面体通过顶点处的回文碱基序列以碱基互补配对的方式连接形成外壳;所述DNA三链体为内核;DNA四面体的部分序列与DNA三链体的部分序列以碱基互补配对方式连接(见图2和图3)。
在本发明中,所述DNA四面体和DNA三链体的摩尔比优选为1:1;所述Ta、Tb、S-Tc和环状序列的摩尔比优选为1:1:1:1;所述成环链和封口模板链的摩尔比优选为1:1;所述序列S-BF、序列Chol-L和序列E的摩尔比优选为1:1:1。
本发明所述DNA纳米探针是一种具有智能形态重构的双重刺激响应型的DNA纳米探针。基于碱基互补配度原则,首先在T4 DNA连接酶的作用下得到一条环状DNA,与两条DNA末端具有回文碱基序列的DNA链以及修饰二硫键的DNA链共四条DNA序列自组装形成DNA四面体结构,可实现跨膜运输和增强稳定性。其次设计了具有靶标结合域的脱氧核酶链,修饰了荧光基团与荧光猝灭团的具有酶切位点的底物链和胆固醇修饰的DNA短链三条DNA序列组装得到的DNA三链体。通过碱基互补配对原则以及胆固醇修饰DNA两亲性分子的自组装性能,组装得到以DNA四面体为外壳、DNA三链体响应区为中间层及疏水性胆固醇为内层的具有核壳结构的DNA材料。外层DNA四面体轴向旋转激活外壳形态重构而促使内部胆固醇暴露,增强细胞摄取。以癌细胞中过量的谷胱甘肽(GSH)为第一阶段刺激,GSH还原二硫键导致DNA四面体外壳的解离,暴露出miRNA识别区域。以miRNA-21为靶标作为第二阶段刺激,miRNA-21与探针的结合,恢复脱氧核酶链催化活性中心,切割底物导致非活性状态下序列牵引临近的荧光基团与荧光猝灭基团分离,释放可检测的荧光信号(图4),可用于体外和活细胞内miRNA的检测与成像。
本发明还提供了上述技术方案所述DNA纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
将所述成环链和封口模板链混合,依次进行加热变性、降温复性、DNA连接酶连接和核酸外切酶酶切,得到所述环状序列;所述核酸外切酶包括核酸外切酶I和核酸外切酶III;
将所述Ta、Tb、S-Tc和所述环状序列混合,进行第一加热变性和降温复性,得到所述DNA四面体;
将所述序列S-BF和序列Chol-L混合,进行第二加热变性和降温复性,得到连接产物;
将所述连接产物和所述序列E混合,得到所述DNA三链体;
将所述DNA四面体和DNA三链体混合,静置孵育,得到所述DNA纳米探针。
在本发明中,所述第一加热变性和所述第二加热变性的温度均优选为90℃,时间均优选为5min;所述静置孵育的温度优选为室温。
基于上述优势本发明还提供了上述技术方案所述DNA纳米探针或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的DNA纳米探针在制备检测miRNA-21试剂中的应用。在本发明中,所述检测miRNA-21试剂优选包括体内和/或体外成像试剂。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的一种具有智能形态重构的核壳结构的DNA纳米探针及其制备方法和应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
准备例
实施例中的S-Tc序列购自福州生物基因技术有限公司,其余DNA序列均购自上海生工生物工程股份有限公司;所有DNA序列均使用1×B buffer(50mM Bis-Tris,1mMMgCl2·6H2O,pH=7.0)溶解。T4 DNA连接酶购自New England Biolabs Ltd.(中国北京);DMEM培养基,胎牛血清,青霉素,链霉素,4%多聚甲醛,PBS,Hochest荧光染料等试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
实施例1
一种谷胱甘肽(GSH)刺激响应型DNA纳米材料DNA四面体Tet,制备方法如下:
步骤1:将浓度为10μM的成环链p-Td(SEQ ID NO.4所示)和封口模板链Td-Temp(SEQ ID NO.5所示)各5μL,5μL T4 DNA连接酶缓冲液加入到34μL ddH2O中,充分混合后,将所得溶液在90℃退火5分钟,然后冷却至室温;随后,加入1μL 400U/μL T4 DNA连接酶,并在16℃下孵育16小时,然后在65℃下加热10分钟使T4 DNA连接酶变性。接着,加入1μL 5U/μL核酸外切酶I,1μL 100U/μL核酸外切酶III,7μL核酸外切酶I缓冲液和7μL核酸外切酶III缓冲液并在37℃下孵育4小时,然后再80℃下加热20分钟使外切酶变性,制得环状DNA链(Cir-d)。
步骤2:将3μL浓度为10μM Ta(SEQ ID NO.1所示),Tb(SEQ ID NO.2所示),S-Tc(如SEQ ID NO.3所示,第51位碱基T和第52位碱基T之间进行了二硫键修饰),步骤1制备的Cir-d和5μL 10×B缓冲液依次添加到33μL ddH2O中并充分混合,然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟,然后冷却至室温制得DNA纳米材料Tet。
使用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA纳米材料Tet逐步组装进行表征。首先制备跑胶体系样品,8μL样品溶液+2μL 6×Loading buffer+2μL 6×SYBR Green I。充分混匀后,吸取10μL上样。电泳缓冲液使用0.5×TBE,在凝胶电泳仪上以60V的恒定电压运行90分钟,随后在配备有采集和分析软件(Image Lab)的ChemiDOC XRS成像系统上成像。
实验结果如图5所示,随着组装链依次加入,5,6号泳道条带迁移率显著降低,且对应的单链泳道条带消失,表明了DNA四面体Tet的成功组装。
实施例2
一种脱氧核酶链(E)、底物链(S-BF)和胆固醇修饰的连接链(Chol-L)组成的miRNA刺激响应型DNA纳米材料DNA三链体(Chol-E/S),制备方法如下:
步骤1:将3μL浓度为10μM的S-BF(5'-CAGATCACACTCGCTACG(BHQ1dT)CTGCTCGTTTTCTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCAGATGTTTACGAGCAGA-FAM-3'),Chol-L(SEQID NO.7所示,3'端进行了胆固醇修饰)和5μL 10×B缓冲液依次添加到36μL ddH2O中并充分混合,然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟,然后冷却至室温。
步骤2:将3μL浓度为10μM的E(SEQ ID NO.8所示)加入到上述步骤1制得的溶液中并在室温下静置孵育2小时,制得DNA三链体(Chol-E/S)。
采用实例1中相同方法进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA三链体Chol-E/S逐步组装进行表征。
实验结果如图6所示,随着组装链依次加入,4号泳道条带迁移率显著降低,且对应的单链泳道调到减弱或消失,表明了DNA三链体Chol-E/S的成功组装。
实施例3
一种智能形态重构双重刺激响应型DNA纳米材料,制备方法如下:
50μL实施例1制备的DNA纳米材料Tet与50μL实施例2制备的DNA三链体(Chol-E/S)混合均匀,室温静置孵育2小时,制备得到DNA纳米探针ES-NC。
采用原子力显微镜对ES-NC进行形貌表征及分析。首先将制备好的15μL ES-NC滴在云母片的中心,并留待吸附15分钟。用100μL ddH2O洗涤两次,并从氮吹仪的氮气流中轻轻干燥。采用Multimode 8原子力显微镜采集样品的形貌图像。
实验结果如图7所示,观察到比较规则的球形纳米簇,其平均高度和宽度分别为11.5nm和38.2nm。
实施例4
外层四面体保护壳轴向旋转引起内核胆固醇外露诱导ES-NC细胞内化,实验方法如下:
步骤1:参考实施例1~3的方法制备DNA纳米材料F-ES-NC,F-ES-Tet,F-Chol-E/S和F-E/S共4种DNA纳米材料,其中4种DNA纳米材料均使用FAM荧光基团单标记底物链(S-F)代替FAM荧光基团和BHQ1荧光猝灭基团双标记底物链S-FB;所述S-F与S-BF相似,区别在于未进行BHQ1荧光猝灭基团标记。其中F-ES-NC的制备方法和实施例3相似;将F-ES-NC使用的胆固醇修饰的Chol-L替换为无胆固醇修饰的L(SEQ ID NO.7所示,3'端未进行了胆固醇修饰),即可得到F-ES-Tet;F-Chol-E/S的制备方法和实施例2相似;将F-Chol-E/S使用的胆固醇修饰的Chol-L替换为无胆固醇修饰的L,即可得到F-E/S。
步骤2:MCF-7、HeLa和L02细胞分别在24孔板内爬片(培养基成分为10%(v/v)胎牛血清(FBS),100U/mL青霉素(penicillin),100μg/mL链霉素(streptomycin),在37℃,5%的CO2环境下培养),培养24小时后加入步骤1制备的F-ES-NC,F-ES-Tet,F-Chol-E/S和F-E/S(浓度为300nM),然后在无胎牛血清与双抗(100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素)的DMEM培养基中37℃,5%的CO2环境下培养6小时,之后除去培养基,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15分钟用PBS清洗3次,Hochest荧光染料染核10分钟,PBS清洗3次,封片后在Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜仪器上进行避光共聚焦激光扫描成像。
实验结果如图8和图9所示,其中F-ES-NC显示出较高的荧光表明高的细胞摄取,F-Chol-E/S荧光大幅度减弱,而在F-ES-Tet和F-E/S处理的细胞观察不到信号表明无细胞摄取行为,且所有材料处理后的不同种类细胞之间无实质性差异。表明DNA四面体外壳Tet与内部胆固醇核心协同介导F-ES-NC的细胞摄取,即DNA四面体外壳Tet轴向旋转实现形态重构会引发内核胆固醇外露,最终诱导F-ES-NC细胞内化。
实施例5
构建二氧化硅脂质双分子层膜模型验证ES-NC细胞内化过程,实验方法如下:
步骤1:将5mg 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆酰(DOPC)溶解于5mL三氯甲烷中,并在45℃的真空干燥箱中孵育过夜,然后加入PBS,超声处理20分钟,形成DOPC脂质体双层膜(DLBM)。同时,将2mL质量浓度为2.5mg/mL二氧化硅微球溶液超声处理5分钟。随后,等体积(2mL)DOPC与二氧化硅微球溶液混合,在室温下孵育1小时,之后10000rpm离心10分钟,去除上清,500μL ddH2O重悬。重复洗涤两次,最后将得到的二氧化硅脂质双分子层膜模型分散在2mL 1×T4 DNA连接酶缓冲液中保存,每次使用之前超声5分钟。
步骤2:将5μL步骤1制备的二氧化硅脂质双分子层膜模型溶液与50μL实施例4中步骤1制备的F-ES-NC,F-ES-Tet,F-Chol-E/S和F-E/S在室温下孵育30分钟,之后10000rpm离心5分钟,去除上清,用50μL 1×B缓冲液洗涤两次,最后重悬于20μL 1×B缓冲液,取10μL样品溶液滴于激光共聚焦上,随后进行激光共聚焦成像。
实验结果如图10所示,F-ES-NC组观察到强的荧光信号,与其他实验组的差异表明了胆固醇确实促进了F-ES-NC与二氧化硅脂质双分子层膜模型的相互作用,由于疏水性的胆固醇基团最初聚集在内部,因此在F-ES-NC锚定到二氧化硅脂质双分子层膜模型的过程中,确实会重新配制其形貌并反转其两亲结构,即疏水性胆固醇基团可以翻转到外部与DOPC脂质体双层膜相互作用,这表明ES-NC的细胞内化分子机制是两亲性杂合体的翻转。
实施例6
GSH触发ES-NC外层DNA四面体Tet解聚
实验方法如下:
步骤1:ES-NC的制备方法如实施例3所述,并向ES-NC溶液中加入终浓度为10mMGSH,室温孵育2小时。将Tet组装使用到的S-Tc替换为P2Tc(SEQ ID NO.9),即可组装的到P2Tc-Tet(GSH还原产物之一);根据实施例2所述方法,在保持总体积不变的情况下,加入3μL 10μM P1Tc(SEQ ID NO.10),室温静置孵育2小时,即可得到Chol-E/S+P1Tc(GSH还原产物之一);SEQ ID NO.9如下所示:5'-TCAGGAGTGACGAGGTTGTGGAAAGTGGAGTCTTAGATATATCACATCGTT-3',SEQ ID NO.10如下所示:5'-TACGTTGCATTACGAGTC-3'。
步骤2:采用实例1中步骤3相同方法进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳对GSH触发ES-NC外层DNA四面体Tet解聚进行验证。
实验结果如图11所示,泳道4中GSH处理后的ES-NC与泳道1中未经GSH处理的EN-NC对比,出现了与泳道2和3对应的还原产物,表明了GSH确实触发ES-NC外层DNA四面体Tet解聚。
实施例7
GSH和miRNA-21双重刺激触发ES-NC的荧光信号放大
实验方法如下:
步骤1:ES-NC的制备方法如实施例3所述,并向ES-NC溶液中加入1μL 5M Na+,3μL5μM miRNA21D和2μL 1M GSH,最终用1×B缓冲液稀释至总体积为200μL。
步骤2:荧光分光光度计(日立F-7000)在492nm波长处激发样品并测定荧光光谱。
实验结果图12所示,只有样品f在GSH和miRNA-21D双重刺激下,触发了强烈的荧光信号释放。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种具有核壳结构的DNA纳米探针,其特征在于,所述DNA纳米探针包括多个DNA四面体和多个DNA三链体;
所述DNA四面体是由三条线性序列和一个环状序列通过部分序列碱基互补配对形成的四面体结构;所述三条线性序列为Ta、Tb和S-Tc;所述Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述S-Tc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述S-Tc的第51位碱基T和第52位碱基T之间进行了二硫键修饰;所述环状序列由成环链和封口模板链制备得到;所述成环链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述封口模板链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
所述DNA三链体是由序列S-BF、序列Chol-L和序列E通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构;所述序列S-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,所述序列S-BF的第19位碱基T进行了猝灭基团修饰,第41位碱基A进行了RNA修饰,3'端进行了荧光基团修饰;所述序列Chol-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述序列Chol-L的3'端进行了疏水基团修饰;所述序列E的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
每个DNA四面体通过顶点处的回文碱基序列以碱基互补配对的方式连接形成外壳;所述DNA三链体为内核;DNA四面体的部分序列与DNA三链体的部分序列以碱基互补配对方式连接。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米探针,其特征在于,所述疏水基团包括胆固醇。
3.根据权利要求1或2所述的DNA纳米探针,其特征在于,所述荧光基团包括FAM;所述猝灭基团包括BHQ1。
4.根据权利要求1或2所述的DNA纳米探针,其特征在于,所述DNA四面体和DNA三链体的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求1或2所述的DNA纳米探针,其特征在于,所述Ta、Tb、S-Tc和环状序列的摩尔比为1:1:1:1;所述成环链和封口模板链的摩尔比为1:1;所述序列S-BF、序列Chol-L和序列E的摩尔比为1:1:1。
6.权利要求1~5任一项所述DNA纳米探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将所述成环链和封口模板链混合,依次进行加热变性、降温复性、DNA连接酶连接和核酸外切酶酶切,得到所述环状序列;所述核酸外切酶包括核酸外切酶I和核酸外切酶III;
将所述Ta、Tb、S-Tc和所述环状序列混合,进行第一加热变性和降温复性,得到所述DNA四面体;
将所述序列S-BF和序列Chol-L混合,进行第二加热变性和降温复性,得到连接产物;
将所述连接产物和所述序列E混合,得到所述DNA三链体;
将所述DNA四面体和DNA三链体混合,静置孵育,得到所述DNA纳米探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述第一加热变性和所述第二加热变性的温度均为90℃,时间均为5min。
8.权利要求1~5任一项所述DNA纳米探针或利用权利要求6或7所述制备方法制备得到的DNA纳米探针在制备检测miRNA-21试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述检测miRNA-21试剂包括体内和/或体外成像试剂。
10.一种具有智能形态重构的DNA纳米探针的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
提供具有发卡结构的脱氧核酶序列,并在末端连接能识别待检测miRNA的序列;
构建DNA四面体;所述DNA四面体的三个顶点具有延伸的碱基序列,两个顶点延伸的碱基序列为回文碱基序列,第三个顶点延伸的碱基序列和所述脱氧核酶的部分序列互补配对;所述DNA四面体的序列中含有二硫键修饰;
构建DNA三链体;所述DNA三链体是由底物链分别与所述脱氧核酶序列和胆固醇修饰的连接链通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构;所述底物链为发卡结构,在互补配对位置分别修饰有荧光基团和猝灭基团,且具有脱氧核酶酶切位点;
将所述DNA四面体和DNA三链体在缓冲液中进行自组装,得到以DNA四面体为外壳,DNA三链体为中间层,胆固醇为内层的DNA纳米探针。
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