CN117586408A - 一种结合tnfr2和b7h3的双特异性抗体 - Google Patents
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- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Abstract
本发明提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；(b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；其中：所述第一抗原为TNFR2，并且所述第二抗原为B7H3；或者，所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为TNFR2。本发明的双特异性抗体可以利用抗B7H3靶向肿瘤相关抗原，同时可以利用激动型抗TNFR2单抗刺激CD8+T细胞的增殖，活化CD8+T细胞，释放IFNγ和IL2等抗肿瘤因子；或利用TNFR2拮抗剂阻断TNF‑TNFR2，抑制Treg增殖。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种结合TNFR2和B7H3的双特异性抗体及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族1B(TNFRSF1B)和CD120b，是一种75-KDA型I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，其含有细胞外结构域(ECD，残留物1-257)和具有TRAF2结合结构域的细胞内结构域(ICD，残基288-461)。在正常的T细胞中，TNFA-TNFR2相互作用通过NFKB信号通路触发细胞存活信号。然而，在自身免疫T细胞中，TNFA-TNFR2相互作用通过Caspase途径触发凋亡信号。
目前，TNFR2已被证明能增强效应T细胞(Teff)的激活并减少调节T细胞(Treg)介导的抑制作用。TNFR2的活化通过有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号传导途径诱导信号传导，其协调通过TRAF2/3信号传导和NFκB介导的促进逃避细胞凋亡和细胞增殖的基因的转录。TNFR2不仅可以在癌细胞，浸润肿瘤的Treg上表达，还可以在效应Teff细胞上表达。研究表明，TNFR2的激动剂单抗能够刺激CD8+T细胞的增殖，活化CD8+T细胞，释放IFNγ和IL2等抗肿瘤因子；TNFR2的拮抗剂单抗则能够阻断TNF-TNFR2，抑制Treg增殖。
B7H3也被称为CD276，是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫共刺激和共抑制家族。B7H3包含氨基端的一个信号肽，一个细胞外的免疫球蛋白样可变区(IgV)和恒定区(IgC)、一个跨膜区和一个含有45个氨基酸的胞质尾区。B7-H3具有免疫抑制功能，可以减少T细胞释放的I型干扰素(IFN)、降低NK细胞的细胞毒性。
B7H3蛋白质在正常组织、细胞中不表达或极低表达，却高表达于多种肿瘤组织，并与肿瘤的进展、患者的生存及预后密切相关。研究表明，B7H3在许多癌症类型中、特别是在非小细胞肺癌、肾癌、泌尿道上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中过表达。此外，在前列腺癌中，B7H3的表达强度与临床病理学恶性(诸如肿瘤体积、前列腺外侵袭或Gleason评分)正相关，且也与癌症进展相关。因此，B7H3被认为是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。目前，B7-H3靶向免疫治疗策略已经在多种癌症类型中进行了测试，B7-H3靶向策略的广泛适用性还表现在所测试的多种效应器机制：阻断抗体、放射性同位素结合、ADC、双特异性、三特异性和Fc增强的B7-H3单抗，以及B7-H3特异性CAR-T细胞。
发明内容
在本申请中，发明人开发了具有良好性能的能够与TNFR2和B7H3结合的双特异性抗体，本发明的双特异性抗体可以利用抗B7H3靶向肿瘤相关抗原，同时可以利用激动型抗TNFR2单抗刺激CD8+T细胞的增殖，活化CD8+T细胞，释放IFNγ和IL2等抗肿瘤因子；或利用TNFR2拮抗剂阻断TNF-TNFR2，抑制Treg增殖。
本发明提供了一种能与TNFR2和B7H3特异性结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：(a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和(b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；其中，所述第一抗原为TNFR2，并且所述第二抗原为B7H3；或者，所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为TNFR2。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；所述第二抗体或其抗原结合片段包含scFv或VHH。
在一些实施方案中，所述第一抗体的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个所述的scFv。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的scFv，所述scFv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的scFv，所述scFv连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个所述的scFv。
在一些实施方案中，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链的N端。
在一些实施方案中，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链的C端。
在一些实施方案中，两个所述scFv分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的第一抗体和两个特异性结合B7H3的scFv，两个特异性结合B7H3的scFv分别连接于所述第一抗体两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的第一抗体和两个特异性结合B7H3的scFv，两个特异性结合B7H3的scFv分别连接于所述第一抗体两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的第一抗体和两个特异性结合B7H3的scFv，两个特异性结合B7H3的scFv分别连接于所述第一抗体两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合TNFR2的第一抗体和两个特异性结合B7H3的scFv，两个特异性结合B7H3的scFv分别连接于所述第一抗体两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的scFv，两个特异性结合TNFR2的scFv分别连接于所述第一抗体两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的scFv，两个特异性结合TNFR2的scFv分别连接于所述第一抗体两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的scFv，两个特异性结合TNFR2的scFv分别连接于所述第一抗体两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的scFv，两个特异性结合TNFR2的scFv分别连接于所述第一抗体两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链；和(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述scFv。
在一些实施方案中，其中所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述scFv；和(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体的两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个所述的VHH。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的VHH，所述VHH连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的VHH，所述VHH连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个所述的VHH。
在一些实施方案中，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链的N端。
在一些实施方案中，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条轻链的N端。
在一些实施方案中，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链的C端。
在一些实施方案中，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条轻链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的VHH，两个特异性结合TNFR2的VHH分别连接于所述第一抗体两条重链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的VHH，两个特异性结合TNFR2的VHH分别连接于所述第一抗体两条重链的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的VHH，两个特异性结合TNFR2的VHH分别连接于所述第一抗体两条轻链的N端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的VHH，两个特异性结合TNFR2的VHH分别连接于所述第一抗体两条轻链的C端。
在一些实施方案中，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的VH的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含特异性结合B7H3的第一抗体和两个特异性结合TNFR2的VHH，两个特异性结合TNFR2的VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的VH的C端。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链；和(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述VHH。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述VHH；和(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链。
在一些实施方案中，所述双特异性抗体的两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
在一些实施方案中，所述scFv的重链可变区与轻链可变区通过连接子L1连接。
在一些实施方案中，所述scFv通过连接子L2与所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端连接。
在一些实施方案中，所述VHH通过连接子L2与所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端连接，或所述VHH通过连接子L2连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的VH的C端。
在一些实施方案中，所述连接子L1和连接子L2相同或不同。在一些实施方案中，所述连接子L1和/或连接子L2具有如(G4S)x所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，所述连接子L1和/或连接子L2为(G4S)2、(G4S)3或(G4S)4。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一Fc区和第二Fc区。在一些实施方案中，第一Fc区和第二Fc区是相同的或不同的。一些实施方案中，所述Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其变体。在一些实施方案中，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。在一些实施方案中，所述Fc区包含一个或多个氨基酸突变，优选氨基酸置换、插入或缺失。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ ID NO:16所示，或为与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:17所示，或为与SEQ ID NO:17具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:18所示，或为与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的序列；LCDR1如SEQ ID NO:20所示，或为与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQIDNO:21所示，或为与SEQ ID NO:21具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:22所示，或为与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv特异性结合TNFR2，所述scFv的HCDR1如SEQ ID NO:2所示，或为与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:3所示，或为与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:4所示，或为与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的序列；以及，LCDR1如SEQ ID NO:6所示，或为与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:7所示，或为与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:8所示，或为与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述VHH特异性结合TNFR2，所述VHH的HCDR1如SEQ ID NO:12所示，或为与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:13所示，或为与SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:14所示，或为与SEQ IDNO:14具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ ID NO:16所示；HCDR2如SEQ ID NO:17所示；HCDR3如SEQ ID NO:18所示；LCDR1如SEQ ID NO:20所示；LCDR2如SEQ ID NO:21所示；LCDR3如SEQ ID NO:22所示。所述scFv特异性结合TNFR2，所述scFv的HCDR1如SEQ ID NO:2所示；HCDR2如SEQ ID NO:3所示；HCDR3如SEQ ID NO:4所示；LCDR1如SEQ ID NO:6所示；LCDR2如SEQ ID NO:7所示；LCDR3如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ ID NO:16所示；HCDR2如SEQ ID NO:17所示；HCDR3如SEQ ID NO:18所示；LCDR1如SEQ ID NO:20所示；LCDR2如SEQ ID NO:21所示；LCDR3如SEQ ID NO:22所示。所述VHH特异性结合TNFR2，所述VHH的HCDR1如SEQ ID NO:12所示；HCDR2如SEQ ID NO:13所示；HCDR3如SEQ ID NO:14所示。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合TNFR2，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ ID NO:2所示，或为与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:3所示，或为与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:4所示，或为与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的序列；LCDR1如SEQ ID NO:6所示，或为与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:7所示，或为与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:8所示，或为与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv特异性结合B7H3，所述scFv的HCDR1如SEQ ID NO:16所示，或为与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:17所示，或为与SEQ ID NO:17具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:18所示，或为与SEQ IDNO:18具有至少80％同一性的序列；LCDR1如SEQ ID NO:20所示，或为与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:21所示，或为与SEQ ID NO:21具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:22所示，或为与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合TNFR2，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ ID NO:2所示；HCDR2如SEQ ID NO:3所示；HCDR3如SEQ ID NO:4所示；LCDR1如SEQ ID NO:6所示；LCDR2如SEQ ID NO:7所示；LCDR3如SEQ ID NO:8所示。所述scFv特异性结合B7H3，所述scFv的HCDR1如SEQ ID NO:16所示；HCDR2如SEQ ID NO:17所示；HCDR3如SEQ ID NO:18所示；LCDR1如SEQ ID NO:20所示；LCDR2如SEQ ID NO:21所示；LCDR3如SEQ ID NO:22所示。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:15所示，或为与SEQ ID NO:15具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:19所示，或为与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv特异性结合TNFR2，所述scFv重链可变区VH如SEQ IDNO:9所示，或为与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:10所示，或为与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述VHH特异性结合TNFR2，所述VHH重链可变区VH如SEQ IDNO:11所示，或为与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合TNFR2，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:1所示，或为与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:5所示，或为与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述scFv特异性结合B7H3，所述scFv重链可变区VH如SEQ IDNO:23所示，或为与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:24所示，或为与SEQ ID NO:24具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述的双特异性抗体的第一多肽链选自SEQ ID NO:26-33的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:26-33的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；所述双特异性抗体的第二多肽链选自SEQ ID NO:34-46的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:34-46的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的双特异性抗体包含：
(1)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:34所示的第二多肽链；或
(2)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:43所示的第二多肽链；或
(3)如SEQ ID NO:27所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链；或
(4)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:36所示的第二多肽链；或
(5)如SEQ ID NO:28所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链；或
(6)如SEQ ID NO:29所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:37所示的第二多肽链；或
(7)如SEQ ID NO:30所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:38所示的第二多肽链；或
(8)如SEQ ID NO:29所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:39所示的第二多肽链；或
(9)如SEQ ID NO:31所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:38所示的第二多肽链；或
(10)如SEQ ID NO:31所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:44所示的第二多肽链；或
(11)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:42所示的第二多肽链；或
(12)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:40所示的第二多肽链；或
(13)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:45所示的第二多肽链；或
(14)如SEQ ID NO:32所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链；或
(15)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:41所示的第二多肽链；或
(16)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:46所示的第二多肽链；或
(17)如SEQ ID NO:33所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链。
本发明提供一种分离的核酸分子，其包含编码上述任一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列。优选地，所述分离的核酸分子包含编码上述任一项所述的双特异性抗体的第一多肽链的核苷酸序列。优选地，所述分离的核酸分子包含编码上述任一项所述的双特异性抗体的第二多肽链的核苷酸序列。
本发明提供一种多功能融合蛋白，其包含上述任一项所述的双特异性抗体。
在一些实施方案中，所述多功能融合蛋白还包含一个或多个与其他抗原特异性结合的第三抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述结合第三抗体或其抗原结合部分的抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)或免疫检查点。在一些实施方案中，所述结合第三抗体或其抗原结合部分的抗原选自GPC3、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin18.2、AFP、ALK、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GloboH、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-12、MART-1、间皮素、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3、5T4、PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、4-1BB、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、ILT4、TREM2、LAG3、CD27或B7H4。
在一些实施方案中，所述多功能融合蛋白还包含细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-3、IL-3Rα、IL-4、IL-4Rα、IL-5、IL-5Rα、IL-6、IL-6Rα、IL-7、IL-7Rα、IL-8、IL-9、IL-9Rα、IL-10、IL-10R1、IL-10R2、IL-11、IL-11Rα、IL-12、IL-12Rα、IL-12Rβ2、IL-12Rβ1、IL-13、IL-13Rα、IL-13Rα2、IL-14、IL-15、IL-15Rαsushi、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-20R1、IL-20R2、IL-21、IL-21Rα、IL-22、IL-23、IL-23R、IL-27R、IL-31R、TGF、VEGF、IFNγ、IFNα或GM-CSF。
本发明还提供上述任一项所述的双特异性抗体或上述任一项所述的多功能融合蛋白在制备治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌选自人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌。
上述任一项所述的双特异性抗体或上述任一项所述的多功能融合蛋白在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、结肠炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症或I型糖尿病。
在一些实施方案中，所述用途通过肿瘤免疫疗法、细胞疗法或基因疗法中的一种或多种来实现。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述任一项所述的多功能融合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供一种抗体药物偶联物，其包含上述任一项所述的双特异性抗体。
在一些实施方案中，所述偶联药物选自细胞毒素、小分子化学药物或免疫毒素。
本发明提供了一些技术方案，具体如下：
1.一种能与TNFR2和B7H3特异性结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
(a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和
(b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；
其中：
所述第一抗原为TNFR2，并且所述第二抗原为B7H3；或者，所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为TNFR2。
2.根据方案1所述的双特异性抗体，
所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和
所述第二抗体或其抗原结合片段包含scFv或VHH。
3.根据方案1或2所述的双特异性抗体，所述第一抗体的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
4.根据方案2或3所述的双特异性抗体，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个所述的scFv或VHH。
5.根据方案4所述的双特异性抗体，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的scFv或一个所述的VHH，所述scFv或VHH连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。
6.根据方案4所述的双特异性抗体，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个所述的scFv或两个所述的VHH。
7.根据方案6所述的双特异性抗体，两个所述的scFv或两个所述的VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端或C端。
8.根据方案6所述的双特异性抗体，两个所述的VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的VH的C端。
9.根据方案7或8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：
(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链；和
(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述scFv或VHH。
10.根据方案7或8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：
(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述scFv或VHH；和
(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链。
11.根据方案9或10所述的双特异性抗体，两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
12.根据方案2-11任一项所述的双特异性抗体，所述scFv的重链可变区与轻链可变区通过连接子L1连接。
13.根据方案2-11任一项所述的双特异性抗体，所述scFv通过连接子L2与所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端连接。
14.根据方案2-11任一项所述的双特异性抗体，所述VHH通过连接子L2与所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端连接，或所述VHH通过连接子L2连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的VH的C端。
15.根据方案13或14所述的双特异性抗体，所述连接子L1和连接子L2相同或不同。
16.根据方案12-15任一项所述的双特异性抗体，所述连接子L1和/或连接子L2具有如(G4S)x所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，所述连接子L1和/或连接子L2为(G4S)2、(G4S)3或(G4S)4。
17.根据方案1-16任一项所述的双特异性抗体，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
18.根据方案17所述的双特异性抗体，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一Fc区和第二Fc区。
19.根据方案18所述的双特异性抗体，第一Fc区和第二Fc区是相同的或不同的。
20.根据方案18或19所述的双特异性抗体，所述Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其变体。
21.根据方案20所述的双特异性抗体，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
22.根据方案20或21所述的双特异性抗体，所述Fc区包含一个或多个氨基酸突变，优选氨基酸置换、插入或缺失。
23.根据方案1-22任一项所述的双特异性抗体，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ IDNO:16所示，或为与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:17所示，或为与SEQ IDNO:17具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:18所示，或为与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的序列；LCDR1如SEQ ID NO:20所示，或为与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:21所示，或为与SEQ ID NO:21具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:22所示，或为与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。
24.根据方案23所述的双特异性抗体，所述scFv特异性结合TNFR2，所述scFv的HCDR1如SEQ ID NO:2所示，或为与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQID NO:3所示，或为与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:4所示，或为与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的序列；以及，LCDR1如SEQ ID NO:6所示，或为与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:7所示，或为与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:8所示，或为与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的序列。
25.根据方案23所述的双特异性抗体，所述VHH特异性结合TNFR2，所述VHH的HCDR1如SEQ ID NO:12所示，或为与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ IDNO:13所示，或为与SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:14所示，或为与SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的序列。
26.根据方案1-22任一项所述的双特异性抗体，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合TNFR2，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的HCDR1如SEQ ID NO:2所示，或为与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQ ID NO:3所示，或为与SEQ IDNO:3具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:4所示，或为与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的序列；LCDR1如SEQ ID NO:6所示，或为与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:7所示，或为与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:8所示，或为与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的序列。
27.根据方案26所述的双特异性抗体，所述scFv特异性结合B7H3，所述scFv的HCDR1如SEQ ID NO:16所示，或为与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的序列；HCDR2如SEQID NO:17所示，或为与SEQ ID NO:17具有至少80％同一性的序列；HCDR3如SEQ ID NO:18所示，或为与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的序列；LCDR1如SEQ ID NO:20所示，或为与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的序列；LCDR2如SEQ ID NO:21所示，或为与SEQ ID NO:21具有至少80％同一性的序列；LCDR3如SEQ ID NO:22所示，或为与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的序列。
28.根据方案1-22任一项所述的双特异性抗体，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:15所示，或为与SEQ ID NO:15具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:19所示，或为与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。
29.根据方案28所述的双特异性抗体，所述scFv特异性结合TNFR2，所述scFv重链可变区VH如SEQ ID NO:9所示，或为与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:10所示，或为与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的序列。
30.根据方案28所述的双特异性抗体，所述VHH特异性结合TNFR2，所述VHH重链可变区VH如SEQ ID NO:11所示，或为与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的序列。
31.根据方案1-22任一项所述的双特异性抗体，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合TNFR2，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH如SEQ ID NO:1所示，或为与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:5所示，或为与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的序列。
32.根据方案31所述的双特异性抗体，所述scFv特异性结合B7H3，所述scFv重链可变区VH如SEQ ID NO:23所示，或为与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的序列；轻链可变区VL如SEQ ID NO:24所示，或为与SEQ ID NO:24具有至少80％同一性的序列。
33.根据方案9-32任一项所述的双特异性抗体，所述的双特异性抗体的第一多肽链选自SEQ ID NO:26-33的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:26-33的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；所述双特异性抗体的第二多肽链选自SEQ ID NO:34-46的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO:34-46的任一氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
34.根据方案33所述的双特异性抗体，所述的双特异性抗体包含：
(1)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:34所示的第二多肽链；或
(2)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:43所示的第二多肽链；或
(3)如SEQ ID NO:27所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链；或
(4)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:36所示的第二多肽链；或
(5)如SEQ ID NO:28所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链；或
(6)如SEQ ID NO:29所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:37所示的第二多肽链；或
(7)如SEQ ID NO:30所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:38所示的第二多肽链；或
(8)如SEQ ID NO:29所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:39所示的第二多肽链；或
(9)如SEQ ID NO:31所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:38所示的第二多肽链；或
(10)如SEQ ID NO:31所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:44所示的第二多肽链；或
(11)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:42所示的第二多肽链；或
(12)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:40所示的第二多肽链；或
(13)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:45所示的第二多肽链；或
(14)如SEQ ID NO:32所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链；或
(15)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:41所示的第二多肽链；或
(16)如SEQ ID NO:26所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:46所示的第二多肽链；或
(17)如SEQ ID NO:33所示的第一多肽链，如SEQ ID NO:35所示的第二多肽链。
35.一种分离的核酸分子，其包含编码方案1-34任一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列；
优选地，所述分离的核酸分子包含编码方案9-34任一项所述的双特异性抗体的第一多肽链的核苷酸序列；
优选地，所述分离的核酸分子包含编码方案9-34任一项所述的双特异性抗体的第二多肽链的核苷酸序列。
36.一种多功能融合蛋白，其包含方案1-34任一项所述的双特异性抗体。
37.根据方案36所述的多功能融合蛋白，还包含一个或多个与其他抗原特异性结合的第三抗体或其抗原结合部分。
38.根据方案37所述的多功能融合蛋白，所述结合第三抗体或其抗原结合部分的抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)或免疫检查点。
39.根据方案38所述的多功能融合蛋白，所述结合第三抗体或其抗原结合部分的抗原选自GPC3、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin18.2、AFP、ALK、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GloboH、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-12、MART-1、间皮素、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3、5T4、PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、4-1BB、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、ILT4、TREM2、LAG3、CD27或B7H4。
40.根据方案36-39任一项所述的多功能融合蛋白，还包含细胞因子。
41.根据方案40所述的多功能融合蛋白，所述细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-3、IL-3Rα、IL-4、IL-4Rα、IL-5、IL-5Rα、IL-6、IL-6Rα、IL-7、IL-7Rα、IL-8、IL-9、IL-9Rα、IL-10、IL-10R1、IL-10R2、IL-11、IL-11Rα、IL-12、IL-12Rα、IL-12Rβ2、IL-12Rβ1、IL-13、IL-13Rα、IL-13Rα2、IL-14、IL-15、IL-15Rαsushi、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-20R1、IL-20R2、IL-21、IL-21Rα、IL-22、IL-23、IL-23R、IL-27R、IL-31R、TGF、VEGF、IFNγ、IFNα或GM-CSF。
42.方案1-34任一项所述的双特异性抗体或方案36-41任一项所述的多功能融合蛋白在制备治疗癌症的药物中的用途。
43.根据方案42所述的用途，所述癌选自人脑星形胶质母细胞瘤、人咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌。
44.方案1-34任一项所述的双特异性抗体或方案36-41任一项所述的多功能融合蛋白在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
45.根据方案44所述的用途，所述自身免疫性疾病选自移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、结肠炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症或I型糖尿病。
46.根据方案42-45任一项所述的用途，所述用途通过肿瘤免疫疗法、细胞疗法或基因疗法中的一种或多种来实现。
47.一种药物组合物，其包含方案1-34任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
48.一种药物组合物，其包含方案36-41任一项所述的多功能融合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
49.一种抗体药物偶联物，其包含方案1-34任一项所述的双特异性抗体。
50.根据方案49所述的抗体药物偶联物，所述偶联药物选自细胞毒素、小分子化学药物或免疫毒素。
缩写及术语定义
在本文中使用以下缩写。VH：抗体重链可变区；VL：抗体轻链可变区；CDR：免疫球蛋白可变区中的互补决定区；FR：抗体构架区，即抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基；IgG：免疫球蛋白G。
术语“抗体”是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成而制备的免疫球蛋白。抗体可从天然存在该抗体的血浆或血清等的天然资源、或者产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中、动物免疫血清中、噬菌体文库筛选进行重建得到分离。备选地，可通过使用基因重组等的技术部分或完全地合成。优选的抗体包括，例如，免疫球蛋白的同种型或这些同种型的亚类的抗体。已知人免疫球蛋白包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类别(同种型)。在这些同种型中，本发明的抗体可以包括IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4。
术语“嵌合抗体”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
本文中所使用的部分抗体由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成，或者只有轻链恒定区(CL)。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
术语“双特异性抗体”是指能够与两个目标抗原或目标抗原表位特异性结合的蛋白分子。在本发明中，包含抗体或抗原结合片段(例如Fab、scFv等)的“双特异性抗原结合蛋白”与“双特异性抗体”、“双抗”可以互换使用。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的多肽片段，例如全长抗体的多肽片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(如技术来自Ablynx)、结构域抗体(如技术来自Domantis)、和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
术语“抗体药物偶联物”或“ADC”是指与一个或多个偶联药物(其可以任选地是治疗剂或细胞毒性剂)连接的结合蛋白(如抗体或其抗原结合片段)，其结构通常由三部分组成：抗体或抗体类配体、药物部分、以及将抗体或抗体类配体及药物偶联起来的连接子(linker)。ADC通常具有与抗体偶联的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个数的药物。
术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即是所利用的宿主细胞外来的，例如由细菌细胞产生的人多肽。本文将多肽公开为氨基酸残基序列。那些序列按氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列以三字母或单字母代码命名。
术语“scFv”指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH。合适的现有技术连接子由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-6个重复的GGGGS氨基酸序列或其变体。
术语“VHH”是指只包含一个重链可变区(VHH)的单一抗原结合多肽，其源自天然不含轻链的重链分子的可变结构域，以区别于四链免疫球蛋白的常规VH。这种VHH分子可以源自在骆驼科物种例如骆驼、美洲驼羊、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。骆驼科以外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子，并且这样的VHH在本申请的范围内。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达，本文称为“表达载体”。
术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，以及各种类型的润湿剂。
术语“同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与对照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST软件或FASTA程序包。
术语“至少80％同一性”是指候选序列中与对照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率为80％以上，包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
本领域中有多种方法/系统来定义和描述CDR，这些系统和/或定义已经开发和精制多年，包括Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact。Kabat是最常用的，基于序列变异性定义CDR；Chothia基于结构循环区域的位置基于序列变异性定义CDR；IMGT系统基于可变域结构内的序列变异性和位置定义CDR；AbM是基于牛津分子公司的AbM抗体建模软件进行定义，是Kabat和Chothia之间的折衷；Contact基于对复杂晶体结构的分析定义CDR，在多个方面与Chothia类似。本申请的CDR主要采用Kabat进行划分，部分CDR采用定义标准进行划分，如SEQ ID NO:2、12、16所示的HCDR1，其划分以重链可变区第一个半胱氨酸后的第四位开始，HCDR1长度一般为10-12，截止到色氨酸前一个氨基酸。
术语“特异性”表示参与特异性结合的分子之一不显示任何与不同于结合伙伴分子中的一个或数个的分子的显著结合。此外，在含抗体可变区的结构域对抗原中的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该术语。当含抗体可变区的结构域所结合的表位被包含在数个不同抗原中时，包含含抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以结合具有所述表位的各种抗原。
术语“表位”是指抗原中的抗原决定簇，并且是指在本说明书中公开的包含抗体可变区的抗原结合分子的结构域所结合的抗原位点。因此，可以根据其结构来定义表位。另外，也可以根据识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。当抗原是肽或多肽时，表位可以由形成表位的氨基酸残基指定；当表位是糖链时，表位可以通过其特定的糖链结构来确定。
术语“阳性对照”是指能够结合靶点蛋白或是表达靶点蛋白的天然或工程化细胞或抗体，本文所指的阳性对照是指单靶点阳性对照。
术语“阴性对照”是指在同一实验中，使用与实验样品相同种属来源、相同亚型、相同剂量、相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白、相同标记等，用于消除实验中非特异结合样品对实验数值产生的实验背景影响，作为一种更加说明实验效果的对照。
术语“Treg”、“Treg细胞”或“调节性T细胞”有时被称为抑制性T细胞，其特征在于表达生物标志物CD4、FOXP3和CD25，代表调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫疾病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制性的并且通常抑制或下调效应T(Teff)细胞的诱导和增殖。Treg可以在胸腺中发展(所谓的CD4+Foxp3+“天然”Treg)或从外周的幼稚CD4+T细胞中分化，例如，在暴露于TGFβ或视黄酸之后。
术语“Teff”、“Teff细胞”或“效应T细胞”是T细胞接受抗原刺激后，经过增殖，分化形成的细胞。效应T细胞具有释放淋巴因子的功能，在此过程中，有一小部分T细胞成为记忆T细胞。效应T细胞与靶细胞接触而激发颗粒胞吐，所释放的穿孔素通过聚合作用而在靶细胞表面形成小孔，从而介导杀伤作用，其靶细胞死亡过程类似于细胞凋亡。同时，效应T细胞还能释放出免疫活性物质-淋巴因子，如白细胞介素，干扰素等。
附图说明
图1为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条重链的C端。
图2为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条轻链的C端。
图3为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条重链的N端。
图4为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条轻链的N端。
图5为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别TNFR2的全长抗体和能够特异性识别B7H3的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条重链的C端。
图6为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别TNFR2的全长抗体和能够特异性识别B7H3的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条轻链的C端。
图7为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别TNFR2的全长抗体和能够特异性识别B7H3的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条重链的N端。
图8为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别TNFR2的全长抗体和能够特异性识别B7H3的scFv，所述scFv通过连接子连接到全长抗体的两条轻链的N端。
图9为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的VHH，所述VHH通过连接子连接到全长抗体的两条重链的C端。
图10为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的VHH，所述VHH通过连接子连接到全长抗体的两条轻链的C端。
图11为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的VHH，所述VHH通过连接子连接到全长抗体的两条重链的N端。
图12为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的VHH，所述VHH通过连接子连接到全长抗体的两条轻链的N端。
图13为描述示例性双特异性抗体，其包含能够特异性识别B7H3的全长抗体和能够特异性识别TNFR2的VHH，所述VHH通过连接子连接到全长抗体的VH的C端。
图14为抗体A1、B、C、D对TNFR2蛋白的结合活性。
图15为抗体E、F、G、H1对TNFR2蛋白的结合活性。
图16为抗体I、K、M1、N对TNFR2蛋白的结合活性。
图17为抗体I、J1对TNFR2蛋白的结合活性。
图18为抗体A2、H2对TNFR2蛋白的结合活性。
图19为抗体J1、J2、M2对TNFR2蛋白的结合活性。
图20为抗体A1、B、C、D对B7H3蛋白的结合活性。
图21为抗体E、F、G、H1对B7H3蛋白的结合活性。
图22为抗体I、K、M1、N对B7H3蛋白的结合活性。
图23为抗体I、J1对B7H3蛋白的结合活性。
图24为抗体A2、J1对B7H3蛋白的结合活性。
图25为抗体H2、J2、M2对B7H3蛋白的结合活性。
图26为抗体A1、B、C、D、E、F的两端结合活性。
图27为抗体H1、I、K、M1、N的两端结合活性。
图28为抗体I、J1的两端结合活性。
图29为抗体A1、H1、I、M1、J1的两端结合活性。
图30为抗体J1、H2、J2、M2的抗肿瘤生长曲线。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。
实施例1不同结构的双特异性抗体的制备
TNFR2抗体作为全长抗体、scFv、VHH时的序列以及B7H3抗体作为全长抗体和scFv时的序列如表1所示。
表1TNFR2抗体和B7H3抗体序列表
由TNFR2抗体的序列和B7H3抗体的序列通过连接子按照一定的顺序连接，可形成表2中的肽链。其中，在本实施例中，双特异性抗体中使用的连接子2个GGGGS重复(即GGGGSGGGGS，下文简写为(G4S)2)或3个GGGGS重复(即GGGGSGGGGSGGGGS，下文简写为(G4S)3)，本实施例中使用的CL为kappa(κ)型，序列如SEQ ID NO:25所示。
表2肽链序列表
根据表2中的肽链组合，设计得到表3所示的双特异性抗体序列。
表3双特异性抗体序列
| 抗体 | 第一肽链的氨基酸序列 | 第二肽链的氨基酸序列 |
| 抗体A1 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:34 |
| 抗体A2 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:43 |
| 抗体B | SEQ ID NO:27 | SEQ ID NO:35 |
| 抗体C | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:36 |
| 抗体D | SEQ ID NO:28 | SEQ ID NO:35 |
| 抗体E | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:37 |
| 抗体F | SEQ ID NO:30 | SEQ ID NO:38 |
| 抗体G | SEQ ID NO:29 | SEQ ID NO:39 |
| 抗体H1 | SEQ ID NO:31 | SEQ ID NO:38 |
| 抗体H2 | SEQ ID NO:31 | SEQ ID NO:44 |
| 抗体I | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:42 |
| 抗体J1 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:40 |
| 抗体J2 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:45 |
| 抗体K | SEQ ID NO:32 | SEQ ID NO:35 |
| 抗体M1 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:41 |
| 抗体M2 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:46 |
| 抗体N | SEQ ID NO:33 | SEQ ID NO:35 |
将上述设计的不同结构的双特异性抗体各条链进行基因合成，而后利用分子克隆技术，将抗体片段插入PCDNA3.1载体中，构建成哺乳动物细胞表达质粒，利用脂质体转染方式，导入宿主细胞株CHO细胞，利用细胞Fed-batch获得发酵上清液，取发酵液上清进行亲和层析、离子交换层析等一系列步骤的纯化，最终纯化得到构建的抗体。对纯化后的抗体检测表达量、纯度、SDS-PAGE等，确认所述双特异性抗体。
实施例2ELISA检测抗体对TNFR2蛋白的结合活性
用包被液(1×PBS，pH7.4)将人-TNFR2-His(厂家：SINO，CAT：10417-H08H，LOT：LC12SE2902)稀释至0.3μg/mL，包被到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。倒掉包被液，1×PBST洗板每孔300μL，用洗板机洗涤4次，并在平板纸上拍干。用3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h，倒掉封闭液，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。设置阴性对照与阳性对照，阴性对照为市售所得注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)，阳性对照1的抗体序列可变区由SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:1组成，加入了人IgG1的恒定区(见SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)；阳性对照2的抗体序列可变区由SEQ ID NO:11组成。将阳性对照和抗体用3％脱脂奶粉稀释为10μg/mL，以此为初始浓度进行3倍稀释，共稀释11个梯度，另设1个空白孔，只加稀释液。100μL/孔，37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。用3％脱脂奶粉将山羊抗人IgG Fc按1:20000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板机洗涤6次，平板纸上拍干。加入TMB显色液，100μL/孔，并用铝箔纸包好，37℃避光显色8min。加入终止液1M HCl终止显色反应，100μL/孔。在酶标仪上450nm处进行读数。抗体分子的ELISA结果分别如图14-19所示，结果显示抗体均能与人TNFR2蛋白结合。
实施例3ELISA检测抗体对B7H3蛋白的结合活性
用包被液(1×PBS，pH7.4)将人-B7H3 His(厂家：Acro，CAT：TB73-H52E2，LOT：2052-21AXF1-YS)稀释为0.3μg/mL，包被到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。倒掉包被液，1×PBST洗板每孔300μL，用洗板机洗涤4次，并在平板纸上拍干。用3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h，倒掉封闭液，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。设置阴性对照与阳性对照，阴性对照为市售所得注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)，阳性对照的抗体序列可变区由SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:19组成，加入了人IgG1的恒定区(见SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)。将阳性对照和供试品用3％脱脂奶粉稀释为10μg/mL，以此为初始浓度进行3倍稀释，共稀释11个梯度，另设1个空白孔，只加稀释液。100μL/孔，37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。用3％脱脂奶粉将山羊抗人IgG Fc按1:20000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板机洗涤6次，平板纸上拍干。加入TMB显色液，100μL/孔，并用铝箔纸包好，37℃避光显色8min。加入终止液1M HCl终止显色反应，100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。抗体分子的ELISA结果分别如图20-25所示，结果显示，除抗体E、F、G外，其余抗体均能与人B7H3蛋白结合。
实施例4构建抗体双靶点结合活性
用包被液(1×PBS，pH7.4)将人-B7H3 Fc(厂家：Acro，CAT：B73-H5253，LOT：2053b-201XF1-UD)稀释为0.5μg/mL，包被到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。倒掉包被液，1×PBST洗板每孔300μL，用洗板机洗涤4次，并在平板纸上拍干。用3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h，倒掉封闭液，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。设置阴性对照，阴性对照为市售所得注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)。300nM起始，以此为初始浓度进行3倍稀释，共稀释8个梯度，另设1个空白孔，只加稀释液。100μL/孔，37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。将人-TNFR2-His(厂家：SINO，CAT：10417-H08H，LOT：LC12SE2902)稀释至0.5μg/mL，每孔加入100μL，室温孵育1h，再用PBST洗板3次，而后将HRP标记的his抗体用样品稀释液按1:10000稀释，每孔加入100μL，室温孵育1h。洗板机洗涤6次，平板纸上拍干。加入TMB显色液，100μL/孔，并用铝箔纸包好，37℃避光显色8min。加入终止液1M HCl终止显色反应，100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。抗体分子的ELISA结果分别如图26-28所示，结果显示，除抗体F和抗体G外，其余抗体均具有两端结合活性。
实施例5构建抗体双靶点结合活性
包被：用包被液(1×PBS，pH7.4)将人-TNFR2 mFc(厂家：恺佧，CAT：TNF-HM3R2，LOT：031202)稀释为0.5μg/mL，包被到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。倒掉包被液，1×PBST洗板每孔300μL，用洗板机洗涤4次，并在平板纸上拍干。用3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h，倒掉封闭液，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。100nM起始，以此为初始浓度进行3倍稀释，共稀释11个梯度，另设1个空白孔，只加稀释液。100μL/孔，37℃孵育1h。弃去孔中液体，洗板机洗涤4次，平板纸上拍干。将人-B7H3 His(厂家：Acro，CAT：TB73-H52E2，LOT：2052-21AXF1-YS)蛋白稀释至0.5μg/mL，每孔加入100μL，室温孵育1h，再用PBST洗板3次，而后将HRP标记的his抗体用样品稀释液按1:10000稀释，每孔加入100μL，室温孵育1h。洗板机洗涤6次，平板纸上拍干。加入TMB显色液，100μL/孔，并用铝箔纸包好，37℃避光显色8min。加入终止液1M HCl终止显色反应，100μL/孔。在酶标仪上450nm处读数。抗体分子的ELISA结果分别如图29所示，结果显示，抗体A1、H1、J1、M1均具有两端结合活性。
实施例6CD8+T细胞激活实验
PBS稀释抗体至70nM(实验终浓度35nM，50μL/孔)；PBS稀释OKT3至10μg/mL(实验终浓度5μg/mL，50μL/孔)。50μLOKT3稀释液和50μL抗体稀释液，设置无关抗体，无关抗体为人IgG1 kappa Isotype control(HG1K，Sino Biological)，设置阴性对照组，包被到96孔平底板中，总体积100μL/孔，4℃孵育过夜。第二天，从冻存PBMC(ORiCELLS，ID:PCH20210300033，分离效率为30％)中阴性分离CD8+T细胞，分选出的CD8+T细胞进行纯度检测；CFSE以5μM的浓度标记CD8+T细胞，37℃孵育10min，加入完全培养基终止染色。将前述用来包被的板用PBS清洗一次，以2×105/孔，100μL/孔加入CFSE标记或未标记的T细胞，加入终浓度为1μg/mL的Anti-CD28，100μL/孔。实验总体系为200μL/孔。37℃共孵育96h；离心后收集上清液，用于IFNγ、IL2细胞因子的检测，细胞使用PBS清洗细胞后进行流式检测。结果如表4所示，激动剂抗体A1、B、C、D、H1均对CD8+T细胞有激活作用。
表4CD8+T细胞激活实验结果
实施例7BLI方法检测抗体对TNFR2蛋白的亲和力
在使用前以0.02％PBST(0.02％吐温20，pH7.4，1*PBS)作为缓冲液浸润AHC传感器600s，除去传感器表面覆盖的蔗糖。AHC传感器以0.02％PBST(0.02％吐温20，pH7.4，1*PBS)作为缓冲液平衡60s，固化样品板中的抗体300s，二次平衡缓冲液180s。100nM的人-TNFR2-His(厂家：SINO，CAT：10417-H08H，LOT：LC12SE2902)蛋白与抗体结合300s，然后解离600s。解离后以10mM甘氨酸(pH2.0)作为再生缓冲液，再生30s。用10mM甘氨酸(pH2.0)再生传感器。抗体分子的亲和力结果如表5所示，结果显示，抗体A1、H1、M1和J1的TNFR2端的亲和力均为纳摩尔级别或者亚纳摩尔级别。
表5抗体对TNFR2蛋白的亲和力
| 固化物 | KD(M) | Kon(1/Ms) | Kdis(1/s) |
| 抗体A1 | 2.34×10-10 | 2.23×105 | 5.22×10-5 |
| 抗体H1 | <1.0×10-12 | 3.38×105 | <1.0×10-7 |
| 抗体J1 | 2.89×10-9 | 2.30×105 | 6.65×10-4 |
| 抗体M1 | 1.35×10-9 | 3.94×105 | 5.31×10-4 |
实施例8BLI方法检测抗体对B7H3蛋白的亲和力
在使用前以0.02％PBST(0.02％吐温20，pH7.4，1*PBS)作为缓冲液浸润AHC传感器600s，除去传感器表面覆盖的蔗糖。AHC传感器以0.02％PBST(0.02％吐温20，pH7.4，1*PBS)作为缓冲液平衡60s，固化样品板中的抗体300s，二次平衡缓冲液180s。100nM的人-B7H3His(厂家：Acro，CAT：TB73-H52E2，LOT：2052-21AXF1-YS)蛋白与抗体结合300s，然后解离600s。解离后以10mM甘氨酸(pH2.0)作为再生缓冲液，再生30s。用10mM甘氨酸(pH2.0)再生传感器。抗体分子的亲和力结果如表6所示，结果显示，抗体A1、H1、M1和J1均对B7H3蛋白有亲和力。
表6抗体对B7H3蛋白的亲和力
| 固化物 | KD(M) | Kon(1/Ms) | Kdis(1/s) |
| 抗体A1 | 2.20×10-8 | 4.07×104 | 8.94×10-4 |
| 抗体H1 | 4.64×10-8 | 2.26×104 | 1.05×10-3 |
| 抗体J1 | 1.59×10-7 | 1.09×104 | 1.74×10-3 |
| 抗体M1 | 9.45×10-9 | 3.30×104 | 3.11×10-4 |
实施例9各候选受试物在hTNFR2小鼠皮下移植小鼠结肠癌细胞系MC38-hB7H3肿瘤模型中的药效学研究
选择6-7周龄的雌性C57BL/6-hTNFR2小鼠，分别皮下接种MC38-hB7H3肿瘤，待肿瘤体积约100±50mm3后随机分成五个小组。每组5只老鼠，分组包括：(1)G1：PBS组；(2)G2：对照抗体组，序列可变区由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成，加入了人IgG1的恒定区(见SEQID NO:47和SEQ ID NO:48)；(3)G3：抗体J1组；(4)G4：抗体H2组；(5)G5：抗体J2组。阴性对照组采用PBS进行瘤内给药，其余组样品以10mg/kg进行瘤内给药。给药频次为每周2次，连续给药4周，共给药8次；隔天测量小鼠肿瘤体积与体重，肿瘤体积计算，按照a·b2/2(a为长径，b为短径)计算。实验方案设计见表7。
表7实验方案设计
结果如图30所示，从肿瘤生长曲线可以看出，抗体J1、J2和H2有明显的的抗肿瘤作用。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (10)
1.一种能与TNFR2和B7H3特异性结合的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含：
(a)特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和
(b)特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；
其中：
所述第一抗原为TNFR2，并且所述第二抗原为B7H3；或者，所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为TNFR2。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，
所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和
所述第二抗体或其抗原结合片段包含scFv或VHH。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
4.根据权利要求2或3所述的双特异性抗体，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个所述的scFv或VHH。
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个所述的scFv或一个所述的VHH，所述scFv或VHH连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。
6.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个所述的scFv或两个所述的VHH。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，两个所述的scFv或两个所述的VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端或C端。
8.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，两个所述的VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的VH的C端。
9.根据权利要求7或8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：
(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链；和
(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述scFv或VHH。
10.根据权利要求7或8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：
(a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述scFv或VHH；和
(b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| CN2022113455 | 2022-08-19 | ||
| CNPCT/CN2022/113455 | 2022-08-19 |
Publications (1)
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2023
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