CN117568339A - CpG寡核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明大体涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种CpG寡核苷酸及其应用。该CpG寡核苷酸具有TLR9激动剂活性，并且相较于现有技术具有更佳的药用活性。

Description

CpG寡核苷酸及其应用

技术领域

本发明大体涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种CpG寡核苷酸及其应用。

背景技术

Toll样受体(TLR)是跨膜蛋白，主要充当微生物成分的传感器，识别细菌和病毒成分。在哺乳动物的感染和一些非感染性疾病中，TLRs构成了一种主要的防御机制。到目前为止，已经确定了10个人类(TLRs 1-10)和12个小鼠TLRs(TLRs 1-9和TLRs 11-13)。其中，TLR9在人类浆细胞样树突状细胞(pDC)和B细胞，以及小鼠髓系的多种细胞(包括单核细胞、巨噬细胞和常规树突状细胞)上表达。

TLR9特异性识别细菌、病毒、质粒或合成双链或单链寡核苷酸中所含的CpG基序。CpG ODN是免疫调节性的合成寡核苷酸，专门设计用于刺激TLR9。到目前为止，已经描述了四类合成的CpG ODN，包括K型ODN(也被称为B型)、D型ODN(也被称为A型)、C型ODN和P型ODN，每一类都有不同的结构和生物学特性。

目前已获批的CpG ODN只有CpG 1018，且含有该佐剂的疫苗种类较少，只有针对乙肝的疫苗和针对新冠的疫苗获得批准。而且目前尚未有应用于癌症治疗的CpG ODN获得批准。鉴于全球传染病和癌症的沉重负担，仍需要开发活性更好的TLR9激动剂，以将其应用于传染病和癌症的预防和治疗。

发明内容

在本发明的一个方面，涉及CpG寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一个方面，涉及包含如上所述CpG寡核苷酸的免疫刺激组合物。

在本发明的又一个方面，涉及一种递送系统，其包含i)如上所述CpG寡核苷酸或如上所述的免疫刺激组合物，以及ii)递送媒介物。

在本发明的又一个方面，涉及如上所述CpG寡核苷酸在制备调节免疫细胞活性的药物中的应用，所述应用于体内或体外进行。

在本发明的又一个方面，涉及如上所述CpG寡核苷酸在制备用于治疗和/预防有需要的受试者的肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、降低化疗副作用、抗疲劳或提升免疫力、促进受试者对于抗原的免疫反应中至少一种适应症的药物中的应用。

本发明所提供的新的CpG寡核苷酸，其具有TLR9激动剂活性，并且相较于现有技术具有更佳的药用活性。该CpG寡核苷酸具有广谱的调节免疫反应的能力，可增加IFN-α、IL-6、TNF-α等细胞因子的释放，并具备抗肿瘤和抗感染的能力，可用于抗肿瘤药物及疫苗等领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例所提供的CpG1具有小鼠TLR9激活作用。HEK-Blue mTLR9细胞(180μL，2-3×10⁵细胞/mL)接种于96孔板中，培养约1-24h。然后加入20μL的不同序列溶液(CpG1、CpG 2395、CpG 7909、CpG 1018、阴性对照FX-700)，终浓度为0、0.25、0.5、1、2、5、10、20、40μM，培养24小时。收集培养物上清液，加入QUANTI-Blue^TM检测溶液，继续孵育15min。用分光光度计测量630nm的OD值，定量胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平。通过检测HEK-Blue^TM mTLR9细胞系的SEAP分泌量来评价不同浓度的不同序列对小鼠TLR9的活化作用。

图2为本发明一个实施例所提供的显示了CpG1具有诱导小鼠脾脏细胞增殖的能力。小鼠脾脏细胞(2×10⁶细胞/100μL)接种于96孔板中，培养约1-24h。然后加入10μL不同序列溶液(CpG1、CpG 2395、CpG 7909、CpG 1018、阴性对照FX-700)，终浓度为0、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2μM，培养约72h。每孔加入10μL CCK-8溶液，继续孵育1-4h。使用酶标仪测量450nm的OD值，间接反映活细胞数量。

图3显示了序列1有效刺激人PBMC分泌IFN-α。人PBMC(1-2×10⁶细胞/1mL)接种于96深孔板中，培养至少1h。然后加入10μL不同序列溶液(序列1、CpG 2395、CpG 7909、CpG1018、阴性对照FX-700)，终浓度为0、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10μM，培养16-24h。取细胞上清，用试剂盒检测IFN-α含量。

图4显示了CpG1有效刺激人PBMC分泌IL-6。人PBMC(1-2×10⁶细胞/1mL)接种于96深孔板中，培养至少1h。然后加入10μL不同序列溶液(CpG1、CpG 2395、CpG 7909、CpG 1018、阴性对照FX-700)，终浓度为0、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10μM，培养16-24h。取细胞上清，用试剂盒检测IL-6含量。

图5显示了CpG1有效刺激人PBMC分泌TNF-α。人PBMC(1-2×10⁶细胞/1mL)接种于96深孔板中，培养至少1h。然后加入10μL不同序列溶液(序列1、CpG 2395、CpG 7909、CpG1018、阴性对照FX-700)，终浓度为0、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10μM，培养16-24h。取细胞上清，用试剂盒检测TNF-α含量。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语描述

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

如本文所用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指的是线性或支化的、单链或双链或者其杂合体的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA杂合体。掺入CpG寡核苷酸中的杂环碱基或核酸碱基可以是天然存在的主要嘌呤和嘧啶碱基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤)，以及所述主要碱基的天然存在的和合成的修饰。因而，CpG-C寡核苷酸可以包括肌苷、2’-脱氧尿苷和2-氨基-2’-脱氧腺苷中的一个或多个。当以合成方式产生CpG时，不太常见的碱基也可用于合成。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”、“ODN”和“多核苷酸”在本文中还可互换使用。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以从左至右的5'至3'方向显示，并使用如世界知识产权组织(WIPO)ST.26标准中规定的用于表示核苷酸符号的标准代码来表示。

如本文所用的，术语“TLR9激动剂”一般指能够增强、诱导或调控由TLR9介导的免疫刺激的基于寡核苷酸的化合物。

如本文所用的，术语“CpG或CpG基序”是指具有以磷酸酯键连接的胞嘧啶和后面鸟嘌呤的核酸，其中胞嘧啶的嘧啶环是非甲基化的。“甲基化CpG”是指胞嘧啶的嘧啶环被甲基化，通常发生在嘧啶环的5位。CpG基序是一种碱基模式，包括一个非甲基化的中央CpG，在中央CpG的3'和5'侧至少有一个碱基。CpG的侧翼碱基赋予了CpG ODN很大一部分的活性。

如本文所用的，术语“CpG ODN”是指CpG寡脱氧核苷酸，其长度至少约十个核苷酸，包括一个非甲基化的CpG。CpG ODN是单链的。整个CpG ODN可以是非甲基化的，也可以是部分非甲基化的。CpG ODN包括D型(也被称为A型)、K型(也被称为B型)、C型、P型ODN。

如本文所用的，术语“患者”、“受试者”或“主体”是用来表示任何动物的，特别是哺乳动物，并且可以使用所公开的方法来治疗任何类型的禽类、哺乳动物或水生物种，特别包括人类和哺乳动物兽医学患者诸如牛、绵羊、山羊、马、狗、猪、猫、大熊猫、大象、兔子、大鼠、小鼠。

如本文所用的，“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)₂、Fd、Fv、Fab’-SH、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

发明详述

CpG寡核苷酸

本发明意外发现了一种性能优异的CpG寡核苷酸，并对其展开研究。

本发明的第一方面涉及CpG寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO：1所示。

本文所述的CpG寡核苷酸包括具有一种或多种包含化学修饰的CpG寡核苷酸。修饰包括但不限于3’OH或5’OH基团的修饰，核苷酸碱基的修饰，糖组分的修饰，骨架修饰和磷酸酯基团的修饰。此类修饰可使CpG寡核苷酸在某些条件下更稳定和/或更不易降解。例如，在一些实施方式中，CpG寡核苷酸是耐核酸酶的。此类修饰可在寡核苷酸的合成过程中进行或者在合成之后进行，并且所述修饰可发生在核苷之间的磷酸二酯桥键上、核糖单元上和/或天然核碱基(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)上。当在合成寡核苷酸的过程中进行修饰时，被修饰的碱基可被掺入寡核苷酸内部或位于寡核苷酸末端。当在合成寡核苷酸之后进行修饰时，所述修饰可通过使用活性基团进行，例如，通过氨基修饰成分进行，通过3’或5’OH进行，或通过磷酸酯基团进行。

CpG寡核苷酸可以含有天然存在的或经修饰的非天然存在的碱基，且可以含有经修饰的糖、磷酸酯和/或末端。例如，除了磷酸二酯键以外，磷酸酯修饰包括、但不限于：膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，且可以以任意组合使用。在某些实施方案中，CpG寡核苷酸具有仅硫代磷酸酯键、仅磷酸二酯键、或磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。

CpG寡核苷酸可以包含一个或多个核糖核苷酸(含有核糖作为唯一或主要的糖组分)、脱氧核糖核苷酸(含有脱氧核糖作为主要的糖组分)、经修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖外，糖部分还可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖类似物环戊基。所述糖可以呈吡喃糖基或呋喃糖基形式。在CpG寡核苷酸中，所述糖部分优选地是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，且所述糖可以连接至处于端基异构构型的各种杂环碱基。

也可以做出本领域中已知的糖修饰，诸如2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体和本文描述的其它，并与任意磷酸酯修饰组合。碱基修饰的例子包括、但不限于：吸电子部分向CpG寡核苷酸的胞嘧啶(例如，5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)的C-5和/或C-6和CpG寡核苷酸的尿嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶)的C-5和/或C-6的添加。碱基修饰在CpG寡核苷酸的回文序列中的应用不应当干扰在沃森-克里克碱基配对中涉及的碱基的自身互补性。但是，在回文序列之外，可以没有该限制地使用经修饰的碱基。例如，可以在回文序列之外使用2’-O-甲基-尿苷和2’-O-甲基-胞苷，然而，可以在回文序列内部和外部使用5-溴2’-脱氧胞苷。可以在回文序列内部和外部采用的其它经修饰的核苷酸包括7-脱氮-8-氮杂-dG、2-氨基-dA和2-硫-dT。

在一些实施方式中，所述的CpG寡核苷酸包含一个或多于一个磷酸酯基团的修饰。磷酸酯基团的修饰可以理解为核苷酸磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。

在一些实施方式中，在SEQ ID NO：1所示的CpG寡核苷酸中，50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上的核苷酸具有磷酸酯基团的修饰。

在一些实施方式中，所述磷酸酯基团的修饰包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基膦酸酯键以及硼烷磷酸酯键中的一种或多种。

在一些实施方式中，本公开的CpG寡核苷酸具有同质骨架(例如，完全磷酸二酯或完全硫代磷酸酯)或异质(或嵌合)骨架。硫代磷酸酯骨架修饰可使寡核苷酸对核酸酶的敏感性降低，从而在某些条件下更稳定(与天然磷酸二酯骨架核酸相比)。可为本公开的核酸提供更高稳定性的其他键包括但不限于二硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、硼膦酸酯键、肽键、烷基键和脱磷型键。因此，在一些实施方式中，CpG寡核苷酸具有非天然存在的骨架。在一些实施方式中，CpG寡核苷酸具有完全是硫代磷酸酯的骨架。

免疫刺激组合物

本发明的第二方面涉及包含如上所述CpG寡核苷酸的免疫刺激组合物。

在一些实施方式中，所述的免疫刺激组合物进一步包含所述CpG寡核苷酸以外的另外一种佐剂。

在一些实施方式中，所述佐剂包括明矾、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷、胞壁酰二肽、MF59、AS03、AS04、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、Poly(I：C)、铝盐以及钙盐中的一种或多种。

其中完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷和明矾一般不用于人。

优选佐剂包括铝盐或钙盐，铝盐可以为硫酸铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾等。

在一些实施方式中，所述的免疫刺激组合物还包含至少一种抗原。

此种免疫刺激组合物的典型代表产品形式为疫苗。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种，但本发明还考虑了口腔和皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

在一些实施方式中，所述抗原为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。

本文中，示例性的肿瘤抗原是本领域技术人员所公知的，其包括肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，例如选自以下抗原或其功能片段组成的组中的任一种或多种：α-甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、BMCA、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD21、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD37、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CLDN家族蛋白、、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GD2、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚单位、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、间皮素(MSLN)、胰腺癌粘蛋白、前列腺干细胞抗原(PSCA)、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、滋养层细胞表面抗原2(TROP2)、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物和致癌基因产物。较为优选的实体瘤特异性抗原选自CLDN家族蛋白、Ep-CAM、FAP、PSCA、TROP2和MSLN。CLDN家族蛋白可以选自CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN6、CLDN7、CLDN8、CLDN9、CLDN10、CLDN11、CLDN12、CLDN15、CLDN16、CLDN18(CLDN18.1或CLDN18.2)、CLDN20、CLDN23。

在某些实施方式中，所述肿瘤是癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型肿瘤。可以通过本文描述的方法和组合物治疗的肿瘤的非限制性实例包括来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌、或子宫。此外，所述癌症可以特别地属于以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病性腺癌；恶性类癌肿瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化型癌；肾上腺皮质癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；和恶性成纤维细胞瘤；支持细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂质肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；骨旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；原始神经外胚瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓性肉瘤；浆细胞瘤、直肠癌和毛细胞白血病。

本文中，示例性的病毒可以包括：腺病毒科(adenoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、星状病毒科(astroviridae)、本雅病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)、肝炎病毒科(hepeviridae)、单分子负链RNA病毒目(mononegavirales)、网巢病毒目(nidovirales)、小RNA病毒科(picornaviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、副黏液病毒科(paramyxovirinae)、疱疹病毒科(herpesviridae)或披膜病毒科(togaviridae)中的一种或多种。

本文中，示例性的细菌可以包括葡萄球菌属、链球菌属、李式杆菌属、丹毒丝菌属、肾杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、分支杆菌属、放线菌属、奴卡菌属、棒状杆菌属、红球菌属中的一种或多种；进一步可以包括炭疽杆菌、丹毒杆菌、破伤风杆菌、李氏杆菌、气肿疽杆菌结核杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉克氏菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌中的一种或多种。

本文中，示例性的真菌可以包括粗球孢子菌、普赛德斯球抱子菌、荚膜组织胞浆菌、杜氏组织胞浆菌、洛博芽生菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、申克氏孢子丝菌、马尔尼菲青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、葡萄牙假丝酵母、曲霉菌、甄氏外瓶霉、裴氏着色霉、紧密着色霉、疣状着色霉、皮炎着色霉、白地霉、波氏足肿菌、新型隐球菌、丝孢酵母菌、米根霉、印度毛霉、伞枝犁头霉、总状共头霉、蛙粪霉、冠状耳霉、异孢耳霉、西伯鼻孢子菌、透明丝孢霉、暗色丝孢霉中的一种或多种。

本文中，示例性的寄生虫可以包括消化道内寄生虫(如蛔虫、钩虫、绦虫、溶组织内阿米巴和雅尔氏鞭毛虫等)、腔道内寄生虫(如阴道毛滴虫)、肝内寄生虫(如肝吸虫、棘球蚴)、肺内寄生虫(如卫斯特曼氏并殖吸虫)、脑组织寄生虫(如猪囊尾蚴、弓形虫)、血管内寄生虫(如血吸虫)、淋巴管内寄生虫(如丝虫)、肌肉组织寄生虫(如旋毛虫幼虫)、细胞内寄生虫(如疟原虫、利什曼氏原虫)、骨组织寄生虫(如包虫；皮肤寄生虫，如疥螨、毛囊螨)、眼内寄生虫(如吸吮线虫、猪囊虫)中的一种或多种。

根据本发明的再一方面，所述的免疫刺激组合物为肿瘤治疗剂。

在一些实施方式中，所述的免疫刺激组合物还含有至少一种靶向肿瘤抗原的抗体。

肿瘤抗原可为如上所定义。

本发明所提供的免疫刺激组合物还可包含药学上可接受的赋形剂包括例如，溶剂、填充剂、缓冲剂、张度调节剂和防腐剂(参见，例如，Pramanick等人,Pharma Times,45:65-77,2013)。在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含作为溶剂、填充剂、缓冲剂和张度调节剂中的一种或多种起作用的赋形剂(例如，盐水中的氯化钠可以充当水性媒介物和张度调节剂)。

在一些实施方式中，所述的免疫刺激组合物还包含免疫细胞治疗药物、化学药物、促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质、免疫调节剂、模式识别受体的配体、药物可接受的盐或赋形剂中的一种或多种。

所述免疫细胞治疗药物可选自肿瘤浸润淋巴细胞、树突状细胞、细胞因子诱导杀伤细胞、树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞、自然杀伤细胞、γδT细胞、CD3AK、CAR-T和TCR-T中的一种或多种。

所述化学药物的例子包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素phiI1,参见，例如，Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇行菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

所述促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质可选自特种表面活性剂、螯合剂、粘合剂中的一种或多种，并进一步优选聚乳酸-羟基乙酸共聚物、右旋糖酐、多聚糖中的一种或多种。

所述免疫调节剂可以选自趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子中的一种或多种，并进一步优选集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种。

所述模式识别受体的配体可以选自TLR受体的配体、RLR受体的配体、CLR受体的配体、NLR受体的配体。

容易理解，本领域技术人员所熟知的CpG寡核苷酸的概念包含其药学上可接受的盐形式，除非另外指出。示例性的碱盐包括：铵盐，碱金属盐，例如钠、锂和钾盐，碱土金属盐，例如钙和镁盐，锌盐，与有机碱(例如，有机胺)、诸如N-Me-D-还原葡糖胺、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵、胆碱、氨丁三醇、二环己胺、叔丁基胺形成的盐，和与氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。此外，可以将CpG寡核苷酸提供在包含药学上可接受的赋形剂的药物溶液中。可替换地，可以将CpG寡核苷酸提供为冻干的固体，随后在施用之前将其在无菌水、盐水或药学上可接受的缓冲液中重构。

递送系统

根据本发明的再一方面，还涉及递送系统，其包含i)如上所述CpG寡核苷酸或如上所述的免疫刺激组合物，以及ii)递送媒介物。

在一些实施方式中，所述递送媒介物包括一种或多种脂质体、一种或多种外泌体、一种或多种微囊泡、一种或多种树状大分子、一种或多种纳米复合物、一种或多种纳米凝胶、一种或多种纳米金颗粒、聚乳酸乙醇酸、一种或多种细胞穿膜肽，以及它们所组成的组。

脂质体可以为阳离子脂质体或中性脂质体，其可通过公知的方法进行制备或修饰，例如加入聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体可以有效防止脂质体载体的聚集并增加其稳定性。脂质体或脂质转染配制品可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法描述于例如WO 2016205764和美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将各个文献通过引用以其全文并入本文。

树枝状大分子是一种具有明确的分子结构、可精确控制的化学结构和独特的多价性质的特殊聚合物家族，逐渐成为基因传递的非病毒载体。典型的树枝状大分子例如聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物，其可做进一步修饰，例如在PAMAM表面修饰核碱基类似物2-氨基-6-氯嘌呤构建衍生物AP-PAMAM，或者通过硫酸软骨素(CS)与PAMAM偶联制备CS-PAMAM等等。

纳米复合物优选的示例是CpG与聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)通过静电作用制备得到的纳米复合物。

纳米凝胶优选的示例是基于聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)的纳米凝胶。

递送系统通常能够达到提高CpG的稳定性和增强细胞内吞功能的作用，并一般能够增强CpG的免疫激活效果。

治疗方法及应用

本发明还涉及如上所述CpG寡核苷酸在制备调节免疫细胞活性的药物中的应用，所述应用于体内或体外进行。

在一些实施方式中，所述免疫细胞选自巨噬细胞、淋巴细胞和树突状细胞。

在一些实施方式中，所述免疫细胞存在于人PBMC。

在一些实施方式中，所述调节免疫细胞活性为促进所述免疫细胞释放炎症因子。

在一些实施方式中，所述炎症因子包括IFN-α、TNF-α和IL-6中的至少一种。

本发明还涉及如上所述CpG寡核苷酸在制备用于治疗和/预防有需要的受试者的肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、降低化疗副作用、抗疲劳或提升免疫力、促进受试者对于抗原的免疫反应中至少一种适应症的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述适应症与TLR9-介导的免疫应答相关。

在一些实施方式中，所述药物为注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。

在一些实施方式中，所述抗原包括肿瘤、病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原。

在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。

在一些实施方式中，所述受试者为灵长类动物。

在一些实施方式中，所述受试者为人类。

本发明还涉及如上所述CpG寡核苷酸作为TLR9激动剂的应用。

本发明进一步提供一种用于在受试者中引起TLR9-介导的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用有效量的如上所述的CpG寡核苷酸，或如上所述的免疫刺激组合物。

本发明中所述的术语“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明中所述疾病或病症的剂量。

在一些实施方式中，其中所述施用通过静脉内、肌内、乳房内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通过气溶胶、卵内、黏膜、经皮、通过浸入、口服、眼内、气管内或鼻内进行。

在一些实施方式中，其中所述施用通过如上所描述的递送系统进行。

递送或施用可以经由单剂量或多剂量进行。

在一些实施方式中，与TLR9-介导的免疫应答相关的疾病为肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、降低化疗副作用、抗疲劳或提升免疫力、促进受试者对于抗原的免疫反应中至少一种适应症。

在一些实施方式中，该受试者罹患传染病，且给予如上所述的CpG寡核苷酸，或如上所述的免疫刺激组合物激发免疫反应以对抗造成该传染病的病原体。

在一些实施方式中，所述方法可与手术、放疗、化疗以及各种免疫疗法联合使用，或与病毒感染患者、细菌感染患者、寄生虫感染患者也可以与传统疗法联合使用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制备

采用固相亚磷酰胺三酯法，合成表1所示的含CpG单链脱氧寡核苷酸(CpG-ODN)。

1、试剂和材料：

三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控固相载体、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四种核苷酸单体、DNA合成仪、纯化议、超滤、真空干燥机、高效液相色谱层析仪等。

2、方法：

脱保护基

用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控固相载体(ControlledPore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5′-羟基端，以供下一步缩合反应。

活化

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3′-端已被活化，但5′-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控固相载体上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

连接

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控固相载体上已脱保护基的核苷酸时，将与其5′-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

封闭

缩合反应后为了防止连在可控固相载体上的未参与反应的5′-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

氧化

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控固相载体上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控固相载体的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5′-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用氰乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

未硫化的CpG单链脱氧寡核苷酸在ABI 3900DNA合成仪上合成；全硫化及部分硫化CpG单链脱氧寡核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394DNA合成仪上合成。

表1：人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸

注：大写字母表示硫代磷酸酯骨架；小写字母表示磷酸二酯骨架。

实施例2活性CpG筛选

通过测试CpG对人PBMC和小鼠脾细胞T、B细胞的增殖作用，来筛选实施例1中制备的CpG1-15中的活性序列。A型CpG 2216、B型CpG 1018、C型CpG 2395分别做阳性对照，FX-700用作阴性对照。

1、试剂和材料：

人外周血浓缩白细胞、生理盐水(都邦，中国)、PBS(BI，以色列)、Ficoll-PaquePLUS(GE，美国)、RPMI-1640培养基(Corning，美国)、FBS(Clark，美国)、青霉素/链霉素(全式金，中国)、台盼蓝(Sigma，美国)、CellTrace^TM CFSE Cell Proliferation Kit(InvitroGen，美国)、Human TruStain FcX^TM(Fc receptor blocking solution)(BD，美国)、人CD45-PerCP-Cy5.5(BD，美国)、人CD3-APC(BD，美国)、人CD19-V450(BD，美国)；细胞滤网(BD Falcon，美国)、红细胞裂解液(BD，美国)、LIVE/DEAD^TM fixable aqua dead cellstain kit(InvitroGen，美国)、小鼠CD16/CD32抗体(2.5G2)(BD，美国)、小鼠CD45-PerCP-Cy5.5(30-F11)(BD，美国)、小鼠CD3e-PE-Cy7(145-2C11)(BD，美国)、小鼠CD19-APC(1D3)(BD，美国)；

RPMI-1640完全培养基：含10％胎牛血清、100U/mL-100μg/mL Pen-Strep(青链霉素)的RPMI-1640培养基。

红细胞裂解液：使用无菌水将10×红细胞裂解液稀释成1×，即500μL红细胞裂解液加入4500μL无菌水。

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)溶液：用DMSO将CFSE溶解成1mg/mL的储存液，使用时，用不含血清的PBS稀释，工作浓度为5μg/mL。

2、方法：

小鼠脾脏细胞的分离。BALB/c小鼠实施安乐死后，立即浸入75％乙醇中。超净台内，在小鼠左侧腹部剪开一个小口，用镊子剥离小鼠脾脏，放入盛有少量预冷的RPMI-1640培养基的培养皿中。用1mL注射器的活塞柄轻轻研磨脾脏至乳糜状液体。用100μm滤网过滤细胞。收集小鼠脾脏单细胞悬液，1500转离心5分钟。弃上清，加入2-3mL红细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育2分钟。加入15-20mL RPMI-1640完全培养基终止反应，1500转离心5分钟。弃上清，PBS重悬小鼠脾脏细胞，台盼蓝染色法细胞计数。加入10mL PBS，1500转离心5分钟。

hPBMC的分离。用生理盐水3倍稀释人外周血浓缩白细胞。按1:1比例将稀释后的人外周血浓缩白细胞缓慢加到Ficoll-Paque PLUS上层，升8降1，2500转离心25分钟。吸取白膜层，加入20mL生理盐水，1800转离心10分钟。弃上清，加入20mL生理盐水重悬细胞，1500转离心8分钟。弃上清，加入20mL生理盐水重悬细胞，1500转离心5分钟。弃上清，PBS重悬单个核细胞，台盼蓝染色法细胞计数。加入PBS定容至45mL，1500转离心5分钟。

CFSE标记细胞。用PBS重悬人PBMC或小鼠脾脏细胞密度至1×10⁷个/mL。每1mL重悬液加入5μL CFSE进行染色。室温避光孵育7分钟(人PBMC)或5分钟(小鼠脾脏细胞)。加入预冷的RPMI-1640完全培养基终止反应，1500转离心5分钟。加入10-20mL PBS洗2次，1500转离心5分钟。弃上清，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞密度至5×10⁶个/mL。

CpG ODN刺激。将制备好的细胞悬液以100μL/孔(约5×10⁵个细胞)加入96孔U型板中，再以100μL/孔向96孔U型板中加入CpG 1-15、CpG 2216、CpG 1018、CpG 2395、FX-700溶液，使CpG终浓度为1μM。另设只有细胞和培养基的未刺激孔(刺激浓度为0)。将培养板置于37℃、5％ CO₂、饱和湿度的培养箱中培养5天(hPBMC)或3天(小鼠脾脏细胞)。

流式细胞术检测T、B细胞增殖。收集细胞于流式管中，1500转离心5分钟。弃上清，加入2mL PBS重悬细胞。加入2μL Human TruStain FcX^TM(针对hPBMC)或小鼠CD16/CD32抗体(针对小鼠脾脏细胞)，室温避光孵育10分钟进行非特异性阻断。加入0.5μL Aqua区分死活细胞。加入抗-CD45、抗-CD3和抗-CD19 mAb进行细胞表面染色，混匀后，在4℃下孵育25-30分钟。用1-2mL PBS洗涤细胞两次，1500转离心5分钟。弃上清，加入300μL PBS重悬细胞，并随后通过LSRFortessaTM流式细胞仪(BD，美国)检测T、B细胞的增殖情况。

3、结果：

结果见表2。

表2 CpG诱导人与小鼠B细胞增殖

从表2的结果可知，CpG1-15中只有CpG1具有刺激B细胞增殖活性，对人PBMC及小鼠脾脏细胞均有效。此外，所有CpG对人PBMC及小鼠脾脏细胞中T细胞增殖均无明显刺激作用。

实施例3HEK Blue mTLR9细胞检测CpG ODN生物学活性

通过检测HEK-Blue^TM mTLR9细胞系的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)分泌量来评价不同浓度的不同CpG对小鼠TLR9的活化作用。用一定浓度的CpG1、CpG 2395、CpG 7909、CpG 1018、阴性对照FX-700(非CpG)分别刺激HEK-Blue^TM mTLR9细胞(表达鼠源TLR9)，激活NF-κB和AP-1，从而诱导SEAP的产生，SEAP可通过Quanti-Blue^TM试剂来检测，Quanti-Blue^TM试剂与SEAP结合呈现蓝色，用分光光度计测量630nm的OD值定量SEAP的水平，从而评估不同CpG对小鼠TLR9的活化。

1、试剂和材料：

HEK-Blue^TM mTLR9细胞(WCB库细胞)；

DMEM(Gibco，11995-065)；FBS(Gibco，10099-141C)；Zeocin^TM(ant-zn-05，InvivoGen，美国)；Blasticidin(ant-b1-05，InvivoGen，美国)；Normocin^TM(ant-nr-1，InvivoGen，美国)，Pen-Strep(Gibco，15140-122)；Quanti-Blue(Invivogen，rep-qbl)；96孔板(Costar，3599)。

生长培养基：含4.5g/L葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、10％的热灭活胎牛血清、100μg/mL Normocin、Pen-Strep(100U/mL-100μg/mL)的DMEM培养基。复苏的细胞传代两次后需在生长培养基中补充选择性抗生素100μg/mL Zeocin和30μg/mL Blasticidin。

QUANTI-Blue^TM检测溶液：在一个250mL无菌培养瓶中加入1mL QB试剂和1mL QB缓冲液，用无菌水补足至100mL，涡旋混匀。室温孵育10min后使用。

待测样品溶液：称取适量的待测样品冻干粉(CpG1、CpG 2395、CpG 7909、CpG1018、阴性对照FX-700)，用无菌PBS溶解，再用没有补充选择性抗生素的生长培养基稀释至所需浓度。

2、方法：

在37℃、5％ CO₂的培养箱中，HEK-Blue mTLR9细胞系体外作为单层贴壁细胞培养在补充有选择性抗生素的生长培养基中。细胞一周换液两次，通常细胞一周以至少0.5×10⁶细胞/mL的密度进行传代(细胞密度不应超过6×10⁶细胞/mL)，不超过15代。

取对数生长期的HEK-Blue^TM mTLR9细胞，经清洗消化制备成单细胞，用补充有选择性抗生素的新鲜生长培养基重悬细胞，调整细胞密度至2-3×10⁵个/mL。

将制备好的细胞悬液以180μL/孔加入U型96孔板中。培养板置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养约1-24h，然后每孔补足液体至180μL。以20μL/孔将不同浓度的待测样品溶液加入U型96孔板相应孔中，终浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、5、10、20、40μM，每个浓度设置3个复孔，继续培养24h。

培养结束后，1000rpm、5min离心U型96孔板，每孔吸取上清40μL置于平底96孔板中，迅速加入160μL QUANTI-Blue^TM检测溶液，震荡片刻，置于37℃、5％ CO₂培养箱中继续孵育15min。取出96孔检测板，用分光光度计测量630nm波长下的OD值。

3、结果：

见图1。图1显示各条序列皆有明显响应，呈剂量正相关。其中，CpG1响应相对较强，CpG 2395、CpG 1018、CpG 7909响应次之，反向序列FX-700对mTLR9没有激活作用。

实施例4CCK-8测定CpG ODN刺激对小鼠脾细胞增殖的影响

采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法，利用多功能酶标仪检测不同CpG对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。检测原理为：WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)在电子藕合剂1-Methoxy PMS存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜(formazan)，生成的甲臜的颜色深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

1、试剂和材料：

96孔板(Costar，3599)；

CCK-8(同仁化学，CK04)；FBS(Gibco，10099-141C)；Pen-Strep(Gibco，15140-122)；RPMI-1640(Sigma，R8758-500 mL)；

RPMI-1640完全培养基：含10％胎牛血清、100U/mL-100μg/mL Pen-Strep(青链霉素)的RPMI-1640培养基。

2、方法：

小鼠脾脏细胞分离。采用颈椎脱臼处死小鼠，完全浸泡于含75％酒精容器中3min。将小鼠固定在生物安全柜内，打开腹腔，剪去脂肪和筋膜组织，取出脾脏，用生理盐水清洗血水。在一个培养皿中加入适量的生理盐水溶液，放一个100μm细胞筛，将脾脏取出放于细胞筛中。取干净10mL或20mL的注射器头部，用其按压处的末端对组织进行碾压。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中，生理盐水冲洗直至组织颜色变淡。将70μm孔径细胞筛网置于50mL离心管上，并用2mL生理盐水润洗70μm筛网。吸取细胞至70μm筛网中，过滤细胞，过滤后使用生理盐水冲洗筛网2次，每次2mL，收集全部细胞悬液到50mL离心管。室温下，319g，离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀。向细胞沉淀加入预冷的1X红细胞裂解液，轻轻吹散细胞，冰上孵育，期间每隔1min手动上下颠倒摇晃数次，5min后加入20mL生理盐水。319g，离心5分钟。离心后弃上清，收集细胞沉淀。

细胞种板。使用完全培养基重悬小鼠脾脏细胞，按细胞计数结果，调整细胞密度至2×10⁷细胞/mL，以100μL/孔加入96孔板内，于37℃、5％CO₂培养箱内静置培养约1-24h。

CpG ODN刺激。使用完全培养基稀释待测样品(CpG1、CpG 2395、CpG 7909、CpG1018、阴性对照FX-700)，加入96孔板内，每孔10μL，每个浓度设3个复孔。实验中每个细胞板同时设置有细胞而不加CpG ODN的对照孔3个和不含细胞和CpG的空白孔3个。CpG ODN工作浓度依次为0、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2μM。混匀后置于37℃、5％ CO₂培养箱内静置培养约72h。

CCK-8检测。向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1-4h，用酶标仪测定450nm处的吸光值。

3、结果

见图2。由图2可知，FX-700不能诱导小鼠脾细胞的增殖，且随着FX-700浓度的增加GC有抑制小鼠脾脏细胞增殖的现象。除FX-700外，其他被测试的CpG ODN均显示具有诱导小鼠脾脏细胞增殖的能力。且多数CpG ODN诱导能力峰值出现在0.25μM。在0.25μM浓度时，各CpG ODN诱导增殖能力从强到弱依次为：CpG1>CpG 1018>CpG 7909>CpG 2395。

实施例5不同CpG刺激人PBMC后细胞因子活性情况

用不同浓度的不同CpG分别体外刺激正常人PBMC 16-24h后，测定细胞上清中IFN-α，TNF-α，IL-6等细胞因子水平，评估免疫刺激活性。

1、试剂和材料：

RPMI-1640(Gibco，11875-093)；FBS(Gibco，10099-141C)；Pen-Strep(Gibco，15140-122)；Ficoll-Paque^TM PLUS(GE，17144003-1)；Human TNF-αPrecoated ELISA kit(达优，1117202)；Human IFN-αPrecoated ELISA kit(达优，1110012)；Human IL-6Precoated ELISA kit(达优，1110602)；

新鲜健康人全血；

完全培养基：含10％胎牛血清、100U/mL-100μg/mL Pen-Strep的RPMI-1640培养基。

2、方法：

人PBMC分离。将30mL外周血转移至100mL无菌瓶中，按1：1加入30mL生理盐水，并混合均匀。取10支15mL无菌离心管，每只加入5mL Ficoll-Paque^TM PLUS，并在其上缓慢加入6mL稀释血液，注意不要破坏界面。转移至离心机内，960g，室温离心30min。吸取白膜层置于一个50mL离心管中，加入20mL生理盐水，319g，室温离心10min。弃上清，并使用40mL生理盐水重悬细胞，460g，室温离心5min。使用5mL完全培养基重悬细胞，按细胞数将悬液浓度调整到1-2×10⁶/mL备用。

细胞种板。将调整好浓度的细胞，按孔板布局设计，以1mL/孔加入96深孔板内，于37℃、5％ CO₂培养箱内静置培养至少1h。

CpG ODN刺激。使用完全培养基稀释CpG ODN，以每孔10μL加入上述96深孔板内，单个浓度不设复孔。CpG ODN的工作浓度为0、0.0156、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10μM。在37℃、5％ CO₂培养箱内静置培养约16-24h。

ELISA法细胞因子含量检测。按各试剂盒说明书提供的检测方法，检测细胞上清中IFN-α、IL-6、TNF-α的含量。

3、结果：

见图3-5。如图3所示，对于刺激人PBMC分泌IFN-α的能力，CpG1与CpG 2395相当，具有强烈刺激作用，显著优于CpG 1018和CpG 7909；如图4所示，对于刺激人PBMC分泌IL-6的能力，当CpG ODN浓度为0.25-2μM时，CpG1明显强于CpG 1018、CpG 2395、CpG 7909；如图5所示，对于刺激人PBMC分泌TNF-α的能力，与阴性对照相比，各个CpG ODN均具有一定的刺激作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (25)

1.CpG寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的CpG寡核苷酸，其包含化学修饰。

3.根据权利要求2所述的CpG寡核苷酸，其包含一个或多于一个磷酸酯基团的修饰。

4.根据权利要求3所述的CpG寡核苷酸，所述磷酸酯基团的修饰包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基膦酸酯键以及硼烷磷酸酯键中的一种或多种。

5.包含权利要求1～4任一项所述CpG寡核苷酸的免疫刺激组合物。

6.根据权利要求5所述的免疫刺激组合物，其进一步包含所述CpG寡核苷酸以外的另外一种佐剂。

7.根据权利要求6所述的免疫刺激组合物，所述佐剂包括明矾、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯、角鲨烷、胞壁酰二肽、MF59_、AS03、AS04、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、Poly(I：C)、铝盐以及钙盐中的一种或多种。

8.根据权利要求5～7任一项所述的免疫刺激组合物，其还包含至少一种抗原。

9.根据权利要求8所述的免疫刺激组合物，所述抗原为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。

10.根据权利要求5～7任一项所述的免疫刺激组合物，其为肿瘤治疗剂。

11.根据权利要求10所述的免疫刺激组合物，其还含有至少一种靶向肿瘤抗原的抗体。

12.根据权利要求9或11所述的免疫刺激组合物，所述肿瘤抗原选自以下抗原或其功能片段组成的组中的任一种或多种：

α-甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、BMCA、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD21、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD37、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CLDN家族蛋白、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p、CEA、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白α、纤维母细胞生长因子、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GD2、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素和它的亚单位、HMGB-1、缺氧诱导性因子、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、间皮素、胰腺癌粘蛋白、前列腺干细胞抗原、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、滋养层细胞表面抗原2、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6和Kras。

13.根据权利要求5～12任一项所述的免疫刺激组合物，其还包含免疫细胞治疗药物、化学药物、促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质、免疫调节剂、模式识别受体的配体、药物可接受的盐或赋形剂中的一种或多种。

14.递送系统，其包含i)权利要求1～4任一项所述CpG寡核苷酸或权利要求5～13任一项所述的免疫刺激组合物，以及ii)递送媒介物。

15.根据权利要求14所述的递送系统，所述递送媒介物包括一种或多种脂质体、一种或多种外泌体、一种或多种微囊泡、一种或多种树状大分子、一种或多种纳米复合物、一种或多种纳米凝胶、一种或多种纳米金颗粒、聚乳酸乙醇酸、一种或多种细胞穿膜肽，以及它们所组成的组。

16.权利要求1～4任一项所述CpG寡核苷酸在制备调节免疫细胞活性的药物中的应用，所述应用于体内或体外进行。

17.根据权利要求16所述的应用，所述免疫细胞选自巨噬细胞、淋巴细胞和树突状细胞。

18.根据权利要求16或17所述的应用，所述调节免疫细胞活性为促进所述免疫细胞释放炎症因子。

19.根据权利要求18所述的应用，所述炎症因子包括IFN-α、TNF-α和IL-6中的至少一种。

20.权利要求1～4任一项所述CpG寡核苷酸在制备用于治疗和/预防有需要的受试者的肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、降低化疗副作用、抗疲劳或提升免疫力、促进受试者对于抗原的免疫反应中至少一种适应症的药物中的应用。

21.根据权利要求20所述的应用，所述药物为注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。

22.根据权利要求20所述的应用，所述抗原包括肿瘤、病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原。

23.根据权利要求20～22任一项所述的应用，所述受试者为哺乳动物。

24.根据权利要求23所述的应用，所述受试者为灵长类动物。

25.根据权利要求24所述的应用，所述受试者为人类。